KR20240128067A - 랜딩 패드 세포주의 생성 - Google Patents

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KR20240128067A
KR20240128067A KR1020247025014A KR20247025014A KR20240128067A KR 20240128067 A KR20240128067 A KR 20240128067A KR 1020247025014 A KR1020247025014 A KR 1020247025014A KR 20247025014 A KR20247025014 A KR 20247025014A KR 20240128067 A KR20240128067 A KR 20240128067A
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plasmid
cell
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ssrs
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던컨 로키엘 맥베이
차루 가르그
차오제 왕
가브리엘레 트레믈
아누락 케탄
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

본 개시내용은, 예를 들어 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것을 포함하는, 표적화된 유전자 통합을 위한 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)는 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하며; 2개의 상동 재조합 부위는 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한다. 랜딩 패드 플라스미드의 2개의 상동 재조합 부위는 모 플라스미드 상의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 플라스미드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시킬 수 있다. 개시된 방법은 핫 세포주에서 표적화된-통합을 위한 핫 스팟을 확인함으로써 높은 발현 세포주의 생성을 허용한다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 랜딩 패드 세포의 생성을 위한 세포 및 이러한 세포 및/또는 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 또한 표적화된 통합을 위한 신규 핫 스팟이 제공된다.

Description

랜딩 패드 세포주의 생성
EFS-WEB를 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
전자적으로 제출된 서열 목록 (명칭: 3338_196PC02_Seqlisting_ST26.txt; 크기: 45,039,473바이트; 및 생성 날짜: 2022년 12월 27일)의 내용은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 표적화된 유전자 통합에 적합한 랜딩 패드 세포의 생성 방법을 제공한다.
역사적으로 세포주는 본질적으로 세포 게놈에 무작위 방식으로 통합되는, 통상적으로 선형화된 발현 플라스미드 DNA로 세포를 형질감염시킴으로써 만들어졌다. 플라스미드는 선택적인 이점, 예컨대 약물 내성 또는 영양요구체 상보성을 제공하기 때문에, 발현 플라스미드를 가진 세포만이 생존한다. 몇 가지 파라미터를 확인하는 바이오리액터에서의 허용되는 수준의 성능, 예컨대 높은 역가, 번역 후 변형, 발현 안정성, 세포 밀도 및 생존력을 유지하면서도 관심 생물학적 제제를 발현하는 세포주를 제조하는 데 걸리는 시간을 최소화하고 예측가능성을 증가시키고자 하는 요망이 있다.
이러한 목표를 달성하는 한 가지 방식은 발현 카세트(들) 또는 발현 플라스미드가 세포주의 동일한 유전자좌 내로 삽입되는, 세포주 발생 동안 표적화된 통합 (TI)이라는 기술을 사용하는 것이다. 표적화되는 유전자좌는 랜딩 패드로서 지칭되기도 하며 랜딩 패드가 있는 세포주는 랜딩 패드 세포주로서 지칭되기도 한다. 발현 카세트(들) 또는 발현 플라스미드(들)는 때때로 재조합 매개 카세트 교환 (RMCE) 또는 부위 특이적 재조합 (SSR)으로서 지칭되는 Cre/Lox 기술 등을 사용한 부위 지정 재조합에 의해; 또는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR), TALEN 또는 기타 이러한 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 자극된 상동 재조합을 사용함으로써 랜딩 패드에 통합될 수 있다.
TI의 주요 과제는 사용할 세포주와 유전자좌를 확인하는 것이다. 세포주 자체는 잘 수행될 수 있어야 하며 랜딩 패드는 높은 전사가 발생하고 생물학적 제제의 전사가 후생적 변형에 의해서와 같이 침묵되지 않는 유전자좌 ("핫 스팟")에 있어야 한다. TI 랜딩 패드 숙주 세포주는 높은 발현을 위해 염색체에 "핫 스팟"을 가져야 하지만, 이러한 "핫 스팟"은 생물학적 제제의 높은 단백질 발현에 필요한 모든 중간 단계를 지원하는 "핫 세포"의 맥락을 필요로 하는 것으로 이해된다. 랜딩 패드 세포주를 생성하고 확인할 수 있는 능력은 부분적으로 숙주 세포 게놈의 고유한 가소성으로 인한 가변성으로 인해 매우 어렵다.
따라서, 신뢰할 수 있고 재현가능한 단백질 발현이 가능한 랜딩 패드 세포를 생성하는 효율적인 방법이 필요하다.
본 개시내용은 (i) 관심 유전자 (GOI)의 발현 역가가 높은 세포주를 스크리닝하고 선택하는 단계; 및 (ii) (i)의 세포를 추가로 스크리닝하고 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 모 플라스미드의 카피 수가 적은 세포를 선택하는 단계이며, 여기서 카피 수는 1 또는 2개인 단계을 포함하는, 랜딩 패드 세포주의 발생에 적합한 모 세포를 선택하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 모 플라스미드는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하거나, 1개의 SSRS를 포함하거나, 또는 SSRS를 포함하지 않는다.
본 개시내용은 또한 (i) 모 세포주에서 모 플라스미드 또는 그의 일부분의 상실에 대해 스크리닝하고, 이러한 상실 (결실)이 있는 세포를 선택하는 단계; 및 (ii) (i)의 세포를 랜딩 패드의 존재에 대해 추가로 스크리닝하고, 랜딩 패드가 존재하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 선택하는 방법을 제공한다.
또한 (i) 모 세포주에서 적어도 하나의 모 플라스미드 또는 그의 일부분의 손실에 대해 스크리닝하고, 이러한 상실 (결실)이 있는 세포를 선택하는 단계; 및 (ii) (i)의 세포를 적어도 하나의 랜딩 패드의 존재에 대해 추가로 스크리닝하고, 랜딩 패드가 존재하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 선택하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 방법은 (i) 낮은 복잡성 또는 높은 복잡성의 영역의 존재 또는 부재; (ii) 레트로트랜스포손 서열의 존재 또는 부재; (iii) Alu 반복부의 존재 또는 부재; (iv) 길게 산재된 핵 요소 (LINE)의 존재 또는 부재; (v) CpG 섬의 존재 또는 부재; (vi) 시토신 메틸화의 수준; (vii) 히스톤 아세틸화의 수준; (viii) 활성 전사의 존재 또는 부재; 및 (ix) 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 특징에 대해 랜딩 패드 세포 내의 랜딩 패드 서열을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다.
또한 (i) 모 세포주에서 제1의 GOI를 포함하는 적어도 하나의 모 플라스미드 또는 그의 일부분을 결실시키는 단계; 및 (ii) 적어도 한 번의 결실 후에, 랜딩 패드를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 랜딩 패드를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분은 (i)의 결실 부위에 삽입된다. 일부 측면에서, 랜딩 패드를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분은 (i)의 결실 부위가 아닌 부위에 삽입된다.
본 개시내용은 또한 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 플라스미드에 위치하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 (1) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (2) (1)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및 (3) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위를 포함하며; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 상동 재조합 부위는 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시킨다. 일부 측면에서, 모 플라스미드는 하나 초과의 게놈 유전자좌에 위치한다.
본 개시내용은 또한 (1) 모 세포의 게놈 서열에 통합된 모 플라스미드로부터 제1의 GOI의 적어도 일부분을 제거하는 단계; (2) 대체 게놈 유전자좌에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계; (3) 적어도 하나의 대체 게놈 유전자좌에서 통합된 랜딩 패드 플라스미드의 적어도 하나의 카피를 포함하는 후보 세포의 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 랜딩 패드 세포주를 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 후보 세포주는 하기 특성: (a) 세포 역가가 미리 결정된 한계치 수준을 초과함; (b) 랜딩 패드 플라스미드 또는 랜딩 패드 카피 수가 미리 결정된 값임; (c) 미리 결정된 한계치 수준을 초과하는 RNA 발현 수준; (d) 존재하는 경우 다수의 플라스미드 카피는 특이적 플라스미드 구성을 가짐; (e) 모 플라스미드로부터 제1의 GOI의 적어도 일부분의 결실; 및 (f) 기능적 SSRS를 갖는 적어도 하나의 랜딩 패드의 존재 중 하나 이상에 대해 평가된다. 일부 측면에서, 모 세포는 히스토릭 세포주이다. 일부 측면에서, 후보 세포의 라이브러리는 모 세포 게놈 내의 다수의 위치에서 랜딩 패드 서열의 무작위 통합을 통해 생성된 라이브러리이다. 일부 측면에서, 방법은 핫 스팟에 통합된 랜딩 패드 서열을 갖는 핫 세포를 선택한다. 일부 측면에서, 모 세포주는 CHO 세포주이다.
본 개시내용은 또한 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용함으로써 상기 개시된 방법 중 임의의 것에 따라 랜딩 패드 세포의 게놈에 제2의 GOI 플라스미드를 통합시키는 단계를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 그 결과로 생성된 발현 플라스미드는 (1) 제2의 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (2) (1)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS를 포함하며; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 제2의 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포의 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시킨다.
또한, 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법이 개시된다:
(a) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 플라스미드에 위치하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분은 (1a) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (2a) (1a)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 SSRS; 및 (3a) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2a)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위를 포함하고; 여기서 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분의 상동 재조합 부위는 상이한 게놈 유전자좌에서 랜딩 패드 내의 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA 내의 상이한 게놈 유전자좌에서 랜딩 패드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 통합시키는 것인 단계; 및
(b) 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용하여 랜딩 패드 세포의 게놈에 제2의 GOI 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 발현 플라스미드는 (1b) GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (2b) (1b)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS를 포함하며; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포의 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계.
또한, 하기를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법이 제공된다:
(a) 모 세포주 내의 제1의 핫 스팟 위치로부터 모 플라스미드의 적어도 일부분을 제거하는 단계; 및
(b) 상동 재조합 또는 무작위 통합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포의 게놈 내의 제2의 핫 스팟 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합 또는 무작위 통합을 위해 표적화된 서열은 랜딩 패드 플라스미드에 존재하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 (1b) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (2b) (1b)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및 (3b) 모 세포주 게놈 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2b)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위를 포함하는 것인 단계.
또한, 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법이 제공된다:
(a) 모 세포주 내의 제1의 핫 스팟 위치로부터 모 플라스미드 또는 그의 일부분을 제거하는 단계,
(b) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포 게놈 내의 제2의 핫 스팟 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 세포주에 존재하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 (1b) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (2b) (1b)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및 (3b) 모 세포주 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2b)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위를 포함하며, 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 상동 재조합 부위는 모 세포주의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것인 단계; 및
(c) 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용하여 랜딩 패드 세포의 게놈에 GOI 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 발현 플라스미드는 (1c) 제1의 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (2c) (1c)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS를 포함하며; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포의 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계.
상기 개시된 방법의 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포는 하기 설명에 상응하는 토폴로지를 갖는 플라스미드를 포함한다:
CG1/-[P1]-[P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2]-[P1]-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-/CG2;
CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1])-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-[P2]-[P1]-/CG2;
CG1/-[P1]-/CG2;
CG1/-([P1]-([P2])n-[P1])-/CG2;
-[P1]-[P2]-[P1]-; 또는
-([P1]-([P2])n-[P1])-
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[M]은 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이다.
n은 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
상기 개시된 방법의 일부 측면에서, 발현 세포에 통합된 플라스미드의 토폴로지는 하기 설명에 상응한다:
CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2
CG1/-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P3]은 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이다.
n은 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
상기 개시된 방법의 일부 측면에서, 상동 재조합은 CRISPR/Cas 시스템, TALEN 시스템 또는 ZFN 시스템에 의해 매개된다. 일부 측면에서, CRISPR/Cas 시스템은 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 추가로 포함한다. 상기 개시된 방법의 일부 측면에서, 부위-특이적 레콤비나제 재조합 부위 (SSRS)는 Tyr-레콤비나제 부위, Tyr-인테그라제 부위, 세린-레졸바제/인버타제 부위, 또는 세린-인테그라제 부위이다. 일부 측면에서, Tyr-레콤비나제 부위는 Cre, Dre, Flp, KD, B3 또는 B3 Tyr-레콤비나제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, Tyr-인테그라제 부위는 λ (람다), HK022 또는 HP1 Tyr-인테그라제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 세린-레졸바제/인버타제 부위는 γδ (감마델타), ParA, Tn3, 또는 Gin 세린-레졸바제/인테그라제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 세린-인테그라제 부위는 PhiC31, Bxb1, 또는 R4 세린-인테그라제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, Tyr-레콤비나제 부위는 Cre Tyr-레콤비나제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS는 LoxP 부위이다. 일부 측면에서, LoxP 부위는 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1 (야생형 LoxP)에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, LoxP 부위는 돌연변이 LoxP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이 LoxP 부위는 서열식별번호: 2 (돌연변이 LoxP)에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이 LoxP 부위는 서열식별번호: 3 (Lox 511); 서열식별번호: 4 (Lox 5171); 서열식별번호: 5 (Lox 2272); 서열식별번호: 6 (Lox M2); 서열식별번호: 7 (Lox M3); 서열식별번호: 8 (Lox M7); 서열식별번호: 9 (Lox M11); 서열식별번호: 10 (Lox 71); 및 서열식별번호: 11 (Lox 66)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이 LoxP 부위는 본 명세서에 개시된 임의의 LoxP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, Tyr-레콤비나제 부위는 Flp Tyr-레콤비나제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS는 짧은 플립파제 인식 표적 (FRT) 부위이다. 일부 측면에서, SSRS는 본 명세서에 개시된 임의의 FRT 부위 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 세린-인테그라제 부위는 att 부위, 예를 들어 attP 또는 attB 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS는 본 출원에 개시된 임의의 att 부위를 포함한다.
상기 개시된 방법의 일부 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열은 글루타민 신테타제 (GS) 및/또는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열은 약물 내성 유전자이다. 일부 측면에서, 약물 내성 유전자는 항생제 내성 유전자이다. 일부 측면에서, 항생제 내성 유전자는 퓨로마이신 내성 유전자이다. 일부 측면에서, 퓨로마이신 내성 유전자는 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열은 단백질을 포함한다. 일부 측면에서, 단백질은 형광 단백질이다. 일부 측면에서, 형광 단백질은 mCherry이다. 일부 측면에서, 형광 단백질은 GFP, ZsGreen1, AcGFP1, EGFP, GFPuv, AcGFP, EBFP, EYFP, ECFP, tdTomato, mCherry, DsRed, AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed2, DsRed-Express, HcRed, AsRed, mOrange, mOrange2, mPlum, mStrawberry, mBanana, YFP, mRaspberry, HcRed1, E2-Crimson, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
상기 개시된 방법의 일부 측면에서, 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 일부 측면에서, 세포는 HEK293 또는 NS0이다.
상기 개시된 방법의 일부 측면에서, GOI를 코딩하는 핵산은 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 폴리펩티드는 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 측면에서, 발현 플라스미드는 GOI의 1개, 2개, 또는 2개 초과의 카피, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 상기 개시된 방법은 GOI, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, GOI의 발현은 정량적으로 및/또는 정성적으로 결정된다. 일부 측면에서, GOI의 발현은 세포 분류, FACS, 세포 표면 염색, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 컬럼 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 미세유체학, UV 흡광도, 면역조직화학, 세포 크기, 분비된 단백질 수준, 전사체 수준, 또는 그의 임의의 조합에 의해 결정된다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드 또는 발현 플라스미드는 세포의 게놈 내에 1개의 카피 수로 통합된다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드 또는 발현 플라스미드는 세포의 게놈 내에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 카피 수로 통합된다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서 (i) 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하고, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하거나; (ii) 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 114의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하고, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 115의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하거나; 또는 (iii) 5' 상동 재조합 부위 및 3' 상동 재조합 부위는 모 플라스미드에 플랭킹하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 모 플라스미드는 제1의 GOI, 예컨대 항체를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다.
본 개시내용은 하기 설명에 상응하는 토폴로지를 갖는 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공한다:
CG1/-[P1]-[P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2]-[P1]-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-/CG2;
CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1])-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-[P2]-[P1]-/CG2;
CG1/-[P1]-/CG2;
CG1/-([P1]-([P2])n-[P1])-/CG2;
-[P1]-[P2]-[P1]-; 또는
-([P1]-([P2])n-[P1])-
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[M]은 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이다.
n은 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
본 개시내용은 하기 설명에 상응하는 토폴로지를 갖는 플라스미드를 포함하는 발현 세포를 제공한다:
CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1]-/CG2;
CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG2;
CG1/-[P1]-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2; 또는
CG1/-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P3]은 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이다.
n은 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 세포주를 제공한다. 또한, 본원에 개시된 세포 또는 본원에 개시된 방법 중 임의의 것에 따라 생성된 세포 및 그의 사용 지침을 포함하는 키트가 제공된다.
본 개시내용은 또한 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 세포를 제공하며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열이다.
또한, 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 CHO 세포 내로 도입하는 단계 및 핵산이 CHO 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 CHO 세포를 수득하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열이다. 또한, 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 핵산은 CHO 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합되고, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열이다. 본원에 개시된 방법 또는 단리된 세포의 일부 측면에서 (i) 서열식별번호: 20 내의 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 21에 제시된 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 117에 제시된 서열을 포함한다. 본원에 개시된 방법 또는 단리된 세포의 일부 측면에서 (i) 서열식별번호: 20 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 21에 제시된 서열로 이루어지거나; 또는 (ii) 서열식별번호: 116 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 117에 제시된 서열로 이루어진다. 본원에 개시된 방법 또는 단리된 세포의 일부 측면에서 (i) 서열식별번호: 20 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 21에 제시된 서열에 대해 상류의 (서열식별번호: 20의 5' 말단 방향) 하위서열이거나; 또는 (ii) 서열식별번호: 116 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 117에 제시된 서열에 대해 상류의 (서열식별번호: 116의 5' 말단 방향) 하위서열이다. 본원에 개시된 방법 또는 단리된 세포의 일부 측면에서 (i) 서열식별번호: 20 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 21에 제시된 서열에 대해 하류의 (서열식별번호: 20의 3' 말단 방향) 하위서열이거나, 또는 (ii) 서열식별번호: 116 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 117에 제시된 서열에 대해 하류의 (서열식별번호: 116의 3' 말단 방향) 하위서열이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법, 세포, 세포주 또는 키트는 적어도 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 적어도 2개의 발현 플라스미드의 사용을 포함한다. 일부 측면에서, 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 2개의 발현 플라스미드는 헤드-투-헤드, 테일-투-테일, 테일-투-헤드, 및 헤드-투-테일로 이루어진 군으로부터 선택된 구성으로 존재한다. 일부 측면에서, 각각의 발현 플라스미드는 적어도 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 모든 GOI가 동일하다. 일부 측면에서, 모든 GOI가 상이하다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 GOI가 나머지와 상이하다. 일부 측면에서, 제1의 GOI는 항체의 중쇄 (HC)를 포함하고, 제2의 GOI는 항체의 경쇄 (LC)를 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 발현 플라스미드는 바이시스트론이다. 일부 측면에서, 바이시스트론 발현 플라스미드는 항체의 HC를 포함하는 제1의 GOI, 및 항체의 LC를 포함하는 제2의 GOI를 코딩한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 랜딩 패드 플라스미드는 어드레싱가능하다. 일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 Lox 부위를 포함한다. 일부 측면에서 Lox 부위는 Lox P 및 Lox 511이다. 일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 Lox 부위 및 Frt 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 1개 또는 2개의 aat 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 어드레싱가능하다. 일부 측면에서, 각각의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드는 랜딩 패드에 독특한 어드레싱가능한 SSRS 쌍을 포함한다. 일부 측면에서, 어드레싱가능한 SSRS 중 적어도 한 쌍은 Lox 부위 쌍이다. 일부 측면에서, Lox 부위 중 적어도 한 쌍은 Lox 511과 Lox P이다. 일부 측면에서, Lox 부위 중 적어도 한 쌍은 Lox m3과 Lox m7이다. 일부 측면에서, 제1의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드는 Lox 부위의 Lox 511과 Lox P 쌍을 포함하고, 제2의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드는 Lox 부위의 Lox m3과 Lox m7 쌍을 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드는 상호 호환불가능한 att 부위를 포함한다.
본 개시내용은 또한 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI), 선택 마커, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 제공하며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 또는 그의 오르토로고스 서열 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열이다. 또한, 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI), 선택 마커, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포가 제공되며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117 또는 그의 오르토로고스 서열 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열이다. 또한, 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI), 선택 마커, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포가 제공되며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 또는 그의 오르토로고스 서열과 중첩되거나 이를 포괄하는 폴리뉴클레오티드 하위서열이다. 또한, 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI), 선택 마커, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포가 제공되며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117 또는 그의 오르토로고스 서열과 중첩되거나 이를 포괄하는 폴리뉴클레오티드 하위서열이다. 일부 측면에서, 세포는 CHO 세포이다. 일부 측면에서, 오르토로고스 서열은 서열식별번호: 20, 21, 116, 117 또는 그의 하위서열과 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 측면에서, 서열 동일성은 니들만-운슈(Needleman-Wunsch) 알고리즘의 구현을 사용하여 쌍별 정렬을 통해 결정된다. 일부 측면에서, 세포는 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 2개의 발현 플라스미드를 포함한다. 일부 측면에서, 세포는 2개 초과의 랜딩 패드 플라스미드 또는 2개 초과의 발현 플라스미드를 포함한다. 일부 측면에서, 2개의 랜딩 패드 플라스미드는 어드레싱가능하다.
도 1은 세포가 발현 플라스미드로 형질감염되어 세포 게놈 내의 무작위 위치에 통합되는 표준 발현 세포주 발생 전략을 도시하는 도식적 표현이다.
도 2는 랜딩 패드 세포 발생에 적합한 2개의 모 세포주를 확인하는 데 사용되는 전략을 요약한다. 모 세포주 1과 2는 각각 단백질 1과 단백질 2를 대상으로 하는 모 플라스미드로부터의 모노클로날 항체를 발현하는 세포주이다. 화살표와 GS는 글루타민 신테타제 상보성을 나타낸다; mAb = 모노클로날 항체; LC = 경쇄; HC = 중쇄; 카피 수 = 세포주 내 발현 플라스미드 수 (각각의 발현 플라스미드는 LC 및 HC 발현 카세트를 함유한다. 카피 수는 GAPDH를 내부 대조군으로서 사용하여 qPCR에 의해 결정됨); spPCR = 스플링커렛 PCR (플라스미드 연접부 서열을 확인할 수 있는 기술). LC RNA 및 HC RNA의 수준은 단백질 1에 대항한 항체에서 발견된 수준으로 정규화되었다 (즉, 단백질 1에 대항한 항체 = 1.00).
도 3은 세포주 1과 세포주 2 둘 다에서 발견되는 구성을 보여주는 모 플라스미드의 단순화된 묘사이다. 두 세포주 내의 모 플라스미드는 헤드 투 테일 구성으로 존재한다. 세포주 1 및 세포주 2에서의 구성은 서던 블롯 분석 및 플라스미드-플라스미드 융합이 검출된 플라스미드 서열 연접부의 결정에 의해 확립되었다. 화살표와 GS는 글루타민 신테타제 상보성을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 부위 지정 재조합 부위, 예컨대 LoxP를 포함하는 랜딩 패드 세포주를 생성하기 위한 2가지 전략을 각각 보여준다. 두 전략 모두에서 랜딩 패드 플라스미드는 모 세포주의 게놈을 부위-특이적 뉴클레아제, 예를 들어 가위로서 나타낸 CRISPR-연관 뉴클레아제 (Cas)로 제한함으로써 자극된 상동 재조합에 의해 세포 내로 도입된다. 도 4a에서 모 세포주는 그의 성능 및 발현 플라스미드/카세트가 그의 게놈에서 발견되는 부위의 수에 기초하여 확인된다. 도 4b에서는 도 4a의 모 세포주를 랜딩 패드 세포주로서 사용하였다. 도 4a 및 4b 모두에서 세포 게놈의 서열에 대한 지식이 필요하며, 세포 게놈과 상동인 서열 (상동성 1, 상동성 2)이 발현 카세트에 플랭킹하기 위해 클로닝된다. mCherry는 형광 마커를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 나타내고, LoxP 부위는 Cre 레콤비나제에 의해 사용된 서열이며, 화살표와 GS는 글루타민 신테타제 상보성을 나타내고, 화살표와 Puro는 퓨로마이신 내성을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 본 개시내용의 보편적인 TI 전략을 개략적으로 제시한다. 본원에 개시된 TI 기술은 제2의 DNA와의 상동 재조합을 자극하기 위해 모 세포주 (도 5a) 또는 랜딩 패드 세포주 (도 5b) 내의 모 플라스미드 서열을 대상으로 하는 부위-특이적 엔도뉴클레아제(들)의 사용을 포함한다. (도 5a)에서의 모 세포주가 또한 랜딩 패드 세포주 역할을 할 수 있다 (도 5b). 이러한 전략은 게놈 서열에 대한 지식과 사용이 필요한 기술과 대조된다 (예를 들어, 도 4a 및 4b 참조). 게놈 서열 옆에 수직선과 물결선이 있는 박스는 상이한 플라스미드 간의 상동성 영역을 나타낸다. 각각의 상동성 영역 옆에 있는 실선 박스는 CRISPR/Cas에 의해 표적화된 도 5a의 모 세포주 또는 도 5b의 랜딩 패드 세포주에 존재하지만, 이들 세포주에 재조합될 플라스미드에는 존재하지 않는 서열을 나타낸다. 가위는 CRISPR/Cas를 나타내고, mCherry는 형광 마커를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 나타내고, LoxP 부위는 Cre 레콤비나제에 의해 사용된 서열이며, 화살표와 GS는 글루타민 신테타제 상보성을 나타내고, 화살표와 Puro는 퓨로마이신 내성을 나타낸다.
도 5c는 본원에 개시된 방법에 따라 생성된 발현 세포에서 발현 플라스미드 (P4)의 서열 조직을 도시한다. 다이어그램은 모 플라스미드 (P1), 랜딩 패드 플라스미드 (P2) 및 제2의 GOI 플라스미드 (P3)로부터 유래된 서열의 위치를 보여준다. "세포 게놈"은 플랭킹 게놈 서열을 나타낸다.
도 5d는 단일 SSRS 부위를 사용하는 보편적인 TI 전략을 보여준다. 여기서, 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 상동 재조합을 자극하기 위해 모 세포주 내의 모 플라스미드 서열을 대상으로 한다. 게놈 서열 옆에 수직선과 물결선이 있는 박스는 상이한 플라스미드 간의 상동성 영역을 나타낸다. 각각의 상동성 영역 옆에 있는 실선 박스는 서열 특이적 엔도뉴클레아제, 예를 들어, CRISPR/Cas에 의해 표적화된 모 세포주에 존재하지만, 이들 세포주에 재조합될 플라스미드에는 존재하지 않는 서열을 나타낸다. 단일 SSRS 부위는 랜딩 패드 세포주에 존재하며, 여기에서는 attB를 한 예로서 사용하여 표시되어 있다. 단일 SSRS 부위를 통해, GOI 플라스미드 (P3)가 표적화된 유전자좌에 삽입될 것이다. 가위는 서열 특이적 엔도뉴클레아제, 예를 들어, CRISPR/Cas를 나타내고, mCherry는 예시적인 형광 마커를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 나타내고, attB 및 attP 부위는 인테그라제에 의해 사용되는 서열이다. 화살표는 프로모터를 나타내고, GS는 글루타민 신테타제 상보성을 나타낸다. An은 폴리A 신호 서열이다. mAb는 자체 프로모터 및 폴리A 신호를 포함한 모노클로날 항체 발현 카세트이다.
도 5e는 상동 재조합을 위한 세포 게놈 서열을 사용하여 랜딩 패드를 생성하는 TI 전략을 보여준다. 여기서, 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 상동 재조합을 자극하기 위해 세포 게놈 서열을 대상으로 한다. 게놈 서열은 랜딩 패드 플라스미드와 모 세포 간의 상동성 영역을 나타낸다. 각각의 상동성 영역 옆에 있는 실선 박스는 CRISPR/Cas에 의해 표적화된 모 세포주에 존재하지만, 이들 세포주에 재조합될 플라스미드에는 존재하지 않는 서열을 나타낸다. 단일 SSRS 부위는 랜딩 패드 세포주에 존재하며, 여기에서는 attB를 한 예로서 사용하여 표시되어 있다. 단일 SSRS 재조합을 통해, GOI 플라스미드 (P3)가 표적화된 유전자좌에 삽입될 것이다. 가위는 CRISPR/Cas를 나타내고, mCherry는 형광 마커를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. attB 및 attP 부위는 인테그라제에 의해 사용되는 서열이다. 화살표는 프로모터를 나타내고, GS는 글루타민 신테타제 상보성을 나타낸다. An은 폴리A 신호 서열이다. mAb는 자체 프로모터 및 폴리A를 포함한 모노클로날 항체 발현 카세트를 나타낸다.
도 5f는 도 5e에 기재된 방법에 따라 생성되거나 새로운 게놈 유전자좌로의 무작위 통합을 사용하여 생성된 발현 세포주에서 발현 플라스미드 (P5)의 서열 조직을 도시한다. 다이어그램은 랜딩 패드 플라스미드 (P2) 및 제2의 GOI 플라스미드 (P3)로부터 유래하는 서열의 위치를 보여준다. "세포 게놈"은 플랭킹 게놈 서열을 나타낸다. 플라스미드 P1은 완전히 제거되거나 유전자좌에 존재하지 않기 때문에, 이러한 발현 플라스미드 구성에는 P1 부분이 없다.
도 6a 및 6b는 본 개시내용에 따른 랜딩 패드 세포주의 생성을 요약한다. 도 6a는 마커 (예를 들어, mCherry)를 발현하는 랜딩 패드 세포주를 생성하기 위해 모 세포주에서 모노클로날 항체 (mAb)를 코딩하는 플라스미드를 랜딩 패드 플라스미드의 일부분 (예를 들어, LoxP 부위에 의해 플랭킹된, mCherry를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 및 퓨로마이신 내성 유전자를 포함하는 선형 플라스미드)으로 대체하는 것을 보여준다. 도 6a에서의 성분에 대한 설명은 상기 도 5a 및 도 5b의 설명에서 찾아볼 수 있다. 도 6b는 CRISPR/Cas 기술에 필요한 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 존재에 의해 자극된 mCherry 랜딩 패드 세포주 생성의 빈도 증가를 보여준다. 클론 퍼센트 (대략 25%)는 단일 mCherry 발현 카세트의 원하는 표현형을 가지며 mAb는 존재하지 않는다. TI에 사용된 랜딩 패드 세포주는 그의 발현 수준 (평균 형광 강도 MFI), 전사체 수준, 및 세포 계대 시 이들 두 파라미터의 안정성에 의해 확인되었다.
도 7a 및 7b는 도 5a, 5b, 6a 및 6b 세포에 제시된 표적화된 통합을 위한 방법론의 실제 적용을 보여준다. 도 7a에서, mCherry 발현 카세트는 Cre 레콤비나제를 사용하여 단백질 3에 대항한 항체 (mAb 3)를 발현하는 것으로 교환된다. mAb 3만을 발현한 세포는 버클리 라이츠 (BL) 및 FACS 기술에 의해 클로닝된 단일 세포였다. 이러한 세포를 확장시키고 AMBR® 15, AMBR® 250 바이오리액터 시스템에서 및 24개의 딥 웰 공급 배치 (24DW FB)에 의해 단백질 발현에 대해 평가하였다. 도 7b는 GS 상보성에 대해 선택한 후 그 결과로 생성된 세포 집단을, 단백질 3의 세포 표면 발현 (수직 축) 및 mCherry의 발현 (수평 축)에 대해 FACS에 의해 스크리닝하였다는 것을 보여준다. 세포의 5.24%는 단백질 3만을 발현하였고, 90.06%는 두 단백질을 모두 발현하였으며, 4.12%는 mCherry만을 발현하였고, 0.68%는 두 단백질 모두를 발현하지 않았다. 단백질 3에 대항한 mAb (mAb3)의 세포 표면 염색만 있는 세포가 원하는 세포이다. 스크리닝된 클론으로부터 수득된 생산성은 FACS 데이터 옆에 있는 텍스트에 요약되어 있다.
도 8a 및 8b는 4가지 상이한 전략 (전략 A, 전략 B, 전략 C 및 전략 D)을 사용하여 구현될 수 있는 보편적인 표적화된 통합 (UTI) 기술을 요약한다. 본원에 개시된 보편적인 TI 기술은 랜딩 패드 플라스미드와의 상동 재조합을 자극하기 위해 랜딩 패드 플라스미드에 존재하지 않는 모 세포주 내의 모 플라스미드 서열을 대상으로 하는 부위-특이적 엔도뉴클레아제(들)의 사용을 포함한다. 이러한 전략의 이점은 플랭킹 게놈 DNA 서열에 대한 지식이 필요하지 않다는 것이다. 도 8a에 도시된 바와 같은 이러한 UTI 기술에서, 모 세포주 내의 모 발현 플라스미드는 랜딩 패드로 대체되거나 (전략 A), 모 발현 플라스미드가 결실되고 랜딩 패드가 세포 게놈 내의 대체 유전자좌(들)에 삽입된다 (전략 B). 두 경우 모두, 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 사용하여 재조합을 자극한다. 일단 랜딩 패드 세포주가 생성되면, 이를 사용하여 발현 세포주를 만들며, 여기서는 랜딩 패드가 Cre 레콤비나제를 사용하여 제2의 GOI로 대체된다. 도 8b에 도시된 바와 같은 이러한 UTI 기술에서는, 전략 C 및 전략 D에서 발현 세포주를 생성하기 위해 단일 SSRS 부위가 사용된다. 수직선과 물결선이 있는 박스는 상이한 플라스미드 간의 상동성 영역을 나타낸다. 실선 박스는, 예를 들어 CRISPR/Cas에 의해 표적화된 모 발현 플라스미드에 존재하지만, 이들 세포주에 재조합될 플라스미드에는 존재하지 않는 서열을 나타낸다. 가위는 CRISPR/Cas를 나타낸다. mCherry는 형광 마커를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. LoxP 및 Lox511 부위는 Cre 레콤비나제에 의해 사용된 서열이다. attB 및 attP 부위는 인테그라제에 의해 사용된 서열이다. 화살표와 GS는 GS 상보성을 코딩한다. 화살표와 Puro는 퓨로마이신 내성을 코딩한다. 이들 4가지 대체 전략의 묘사는 예시적이며, 도면에 표시된 성분들 (예를 들어, CRISPR/Cas, mCherry, Lox 부위, att 부위)은 본 명세서에 개시된 기능적 등가물로 대체될 수 있다.
도 9는 도 8a 및 8b에 예시된 전략을 사용하여 랜딩 패드 세포주를 제조할 때의 데이터 요약을 보여준다. 사진은 CRISPR/Cas 기술에 필요한 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 존재에 의해 자극된 mCherry 랜딩 패드 세포주 생성의 빈도 증가를 보여준다. 클론의 25%는 mCherry 발현 카세트가 있는 원하는 표현형을 가지며 모 세포주로부터의 mAb는 존재하지 않는다. TI에 사용된 랜딩 패드 세포주는 mCherry 유전자 카피 수, 발현 수준 (평균 형광 강도 MFI), 전사체 수준, 및 세포가 계대되었을 때 이들 두 파라미터의 안정성에 의해 확인되었다.
도 10은 mAb의 경쇄 2개 카피와 중쇄 2개 카피를 코딩하는 제2의 GOI 플라스미드와 Cre를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 발현 세포주를 구축하기 위해 12개의 랜딩 패드 세포주를 사용한 실험 결과를 요약한 것이다. 발현 세포주의 퍼센트는 선택 후 대량 배양에서 mCherry 음성 (Red(-)) 세포의 퍼센트이다.
도 11a 및 11b는 세포주 발생을 통해 채취한 5개의 랜딩 패드 세포주를 사용한 실험 결과를 요약한 것이다. 단일 세포 클로닝 후, 각각의 랜딩 패드 세포주로부터의 32개의 발현 세포주를 무작위로 선택하고, 확장하며 24 딥 웰 플레이트 (DWP) 14일 공급 배치 검정으로 시험하였다. 이를 통해 랜딩 패드 세포주의 잠재력을 포괄적으로 특징 규명할 수 있다. 데이터는 도 11a에 요약되어 있으며 도 11b에 박스 및 휘스커 그래프로 표시되어 있다.
도 12a는 헤드-투-헤드 듀오-랜딩 패드 구성을 보여준다. 각각의 랜딩 패드는 방향성 재조합을 위한 2개의 별개의 SSRS 부위를 함유한다. 하나의 GOI (mAb)가 재조합을 통해 각각의 랜딩 패드 유전자좌에 삽입되었다. 그 결과로 생성된 mAb 발현 플라스미드는 여전히 헤드-투-헤드 구성이다.
도 12b는 듀오-랜딩 패드 구성 및 Cre 레콤비나제의 듀오-랜딩 패드에 대한 효과를 도시한 것이다. 하나의 랜딩 패드는 대각선이 있는 화살표로서 표시되고 다른 랜딩 패드는 직조 패턴이 있는 화살표로서 표시된다. 두 랜딩 패드 모두는 LoxP와 Lox511을 사용한다. 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 구성은 Cre의 존재 하에 무손상으로 유지된다. 다른 2가지 구성에서는 랜딩 패드 중 하나를 영구적으로 결실시킬 수 있다. 2개 이상의 랜딩 패드를 갖는 목적은, 예를 들어 이중특이적 mAb를 만들고 역가를 증가시킬 수 있다는 것이다. 동일한 조절 서열 (예를 들어, 동일한 프로모터)이 제어되는 경우에는, 다수의 랜딩 패드가 동일한 활성을 가질 확률이 높다. 일부 측면에서, 다수의 랜딩 패드는, 예를 들어 3, 4개 또는 그 초과, 1:1 비율로, 또는 대안적인 비율, 예를 들어, 1:2 또는 2:1로 존재할 수 있다.
도 13은 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 듀오-랜딩 패드 구성에서 제2의 GOI의 TI 결과를 예시한다. 하나의 랜딩 패드는 대각선이 있는 화살표로서 표시되고 다른 랜딩 패드는 직조 패턴이 있는 화살표로서 표시된다. 두 랜딩 패드 모두는 LoxP와 Lox511을 사용한다. 제2의 GOI는 실선 직사각형으로서 표시된다. 두 경우 모두, 발현 세포주는 2개의 제2의 GOI를 갖는다.
도 14는 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일 듀오-랜딩 패드 구성에서 제2의 GOI의 TI 결과를 예시한다. 하나의 랜딩 패드는 대각선이 있는 화살표로서 표시되고 다른 랜딩 패드는 직조 패턴이 있는 화살표로서 표시된다. 두 랜딩 패드 모두는 LoxP와 Lox511을 사용한다. 제2의 GOI는 실선 직사각형으로서 표시된다. 두 경우 모두, 2개의 상이한 발현 세포주가 생성되는데, 하나는 1개의 제2의 GOI를 갖고 두번째는 2개의 제2의 GOI를 갖는다.
도 15는 Frt 및 Lox 부위를 갖는 듀오-랜딩 패드 구성 및 듀오-랜딩 패드에 대한 Cre 및 Flp 레콤비나제의 효과의 묘사를 보여준다. 하나의 랜딩 패드는 대각선이 있는 화살표로서 표시되고 다른 랜딩 패드는 직조 패턴이 있는 화살표로서 표시된다. 두 랜딩 패드 모두는 LoxP와 Frt를 사용한다. 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 구성은 Cre + Flp의 존재 하에 무손상으로 유지된다. 다른 2가지 구성에서는 랜딩 패드 중 하나를 영구적으로 결실시킬 수 있다. 이는 도 12b에서 관찰된 것과 동일하다.
도 16은 모든 랜딩 패드에 플랭킹하기 위해 동일한 aatP 부위를 사용하는 듀오-랜딩 패드 구성 및 제2의 GOI 플라스미드 및 Int가 세포에 형질감염된 후 결과의 묘사를 보여준다. 하나의 랜딩 패드는 대각선이 있는 화살표로서 표시되고 다른 랜딩 패드는 직조 패턴이 있는 화살표로서 표시된다. GOI는 실선 직사각형으로서 표시된다.
도 17a 및 17b는 듀오-랜딩 패드를 사용하여 원하는 복합 생물학적 제제를 제조하기 위해 어셈블리되는 상이한 서브유닛의 발현 다양성을 증가시킬 수 있다는 것을 개략적으로 제시한다. 실선과 점선 화살표는 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 상이한 성분을 나타낸다. 예시 목적을 위해, 복합 생물학적 제제에는 각각의 화살표 중 적어도 하나가 필요하다. 각각의 GOI 플라스미드는 복합 생물학적 제제의 각각의 서브유닛, 즉 복합 생물학적 제제의 화살표의 상이한 구성을 함유할 수 있다. 제2의 GOI는 상이한 순서의 여러 화살표로 구성되거나 각각의 화살표 자체로 구성될 수 있다. 제2의 GOI 플라스미드는 레콤비나제와 함께 듀오-랜딩 패드 세포주에 형질감염된다. 서브유닛 발현 수준을 변형시키기 위해, 제2의 GOI 플라스미드의 상이한 조합물을 듀오-랜딩 패드 세포주에 형질감염시킨다. TI가 완료된 후 실선 대 점선 화살표의 1:2, 1:1 및 2:1의 유전자 카피 비율을 수득하기 위해 제2의 GOI를 사용한 상이한 형질감염이 예시되어 있다. 예를 들어, 1:2 비율의 도 17a에서, 하나의 제2의 GOI는 점선 화살표의 하나의 카피를 함유하고 다른 제2의 GOI 플라스미드는 2가지 구성 중 하나에서 실선 및 점선 화살표를 함유한다. 도 17a에 나타낸 바와 같이, 이는 듀오-랜딩 패드 세포주의 2개의 독립적인 형질감염을 요구할 것이다. 이것이 가능한 결과 또는 입력의 완전한 목록이 아니라는 것은 분명하다. 또한, 서브세트만이 랜딩 패드에 통합되기 때문에 복합 생물학적 제제가 만들어지지 않는 구성, 즉 단 하나의 실선 또는 단지 점선 화살표만 예시되어 있지 않다. 도 17b는 독특한 SSRS를 갖는 어드레싱가능한 랜딩 패드를 사용하는 단순화된 예시를 보여준다. 하나의 랜딩 패드는 Lox 511과 Lox P로 구성되고, 제2의 랜딩 패드는 Lox 부위 2272와 M3으로 구성된다. 제2의 GOI 플라스미드는 상응하는 Lox 부위를 사용하여 하나의 랜딩 패드 또는 다른 랜딩 패드를 특이적으로 표적화한다.
도 18은 어드레싱가능한 랜딩 패드를 갖는 듀오-랜딩 패드의 유용성을 예시한다. 하나의 랜딩 패드는 대각선이 있는 화살표로서 표시되고 다른 랜딩 패드는 직조 패턴이 있는 화살표로서 표시된다. 제2의 GOI 플라스미드는 실선 직사각형 또는 수직선이 있는 직사각형으로서 표시된다. 이러한 예에서 각각의 랜딩 패드는 자신과만 재조합하는 Lox 부위의 독특한 조합에 의해 플랭킹된다. 이러한 예는 예시적이며 다른 레콤비나제와 그의 표적 부위를 사용할 수 있다. 어드레싱가능한 랜딩 패드를 가짐으로써 듀오-랜딩 패드의 4가지 구성 모두가 도 12b에 나타낸 바와 같이 테일 투 헤드 및 헤드 투 테일 구성에서 랜딩 패드 중 하나의 상실 없이 규정된 제2의 GOI를 갖도록 보장한다.
도 19는 각각의 랜딩 패드에 단일 aatB 부위가 있는 듀오-랜딩 패드를 갖는 것이 랜딩 패드 결실을 제거한다는 것을 명확하게 보여주는 예시를 나타낸다. 하나의 랜딩 패드는 대각선이 있는 화살표로서 표시되고 다른 랜딩 패드는 직조 패턴이 있는 화살표로서 표시된다. 제2의 GOI 플라스미드는 실선 직사각형으로서 표시된다. 사용된 attP 부위가 상호 호환불가능한 경우 듀오-랜딩 패드는 어드레싱가능해진다.
도 20은 듀오-랜딩 패드 세포주와의 표적화된 통합의 개념 증명 (POC)을 보여준다. mCherry 발현 카세트는 도 8b에 개요 서술된 바와 같이 Cre 레콤비나제를 사용하여 제2의 GOI mAb 발현 카세트로 교환된다. GS 상보성 선택 후 그 결과로 생성된 세포 집단은 mCherry의 발현 (수평 축) 및 mAb의 세포 표면 발현 (수직 축)에 대해 FACS에 의해 스크리닝되었다. 여기서 세포의 5.24%는 mAb만을 발현하고, 90.06%는 두 단백질 모두를 발현하고, 4.12%는 mCherry만을 발현하고, 0.68%는 두 단백질 모두를 발현하지 않는다.
도 21은 GOI의 표적화된 통합이 무작위 통합에 비해 더 높은 생산 세포를 산출한다는 것을 보여준다. 제2의 GOI 플라스미드 형태의 mAb A 및 B는 무작위 또는 표적화된 통합을 통해 숙주 세포에 통합되었다. 랜딩 패드 세포주는 무작위 통합에 사용된 세포주의 직계 후손이다. 단일 세포 클로닝에 사용된 세포 집단의 역가를 결정하였다. 표적화된 통합 집단은 무작위 통합에 대한 것보다 대략 3배 내지 4배 더 높은 역가를 가지며, 이는 무작위 통합의 산업 표준을 능가할 수 있는 랜딩 패드 세포주를 생성하는 이러한 기술의 가치를 입증해 준다
도 22는 1 LC + 1 HC 또는 2 LC + 2 HC를 함유하는 제2의 GOI 플라스미드를 사용하여 발현 세포주를 제조하기 위한 듀오-랜딩 패드 세포주의 사용 요약을 보여준다. mAb A 및 B에 대해 1 LC + 1 HC 또는 2 LC + 2 HC를 포함하는 제2의 GOI 플라스미드가 TI 세포주 발생에 사용되었다. 각각의 군으로부터의 상위 6개 클론의 생산성이 표시된다. 두 경우 모두, LC 및 HC 카피 수를 증가시키는 것이 평균 역가를 25% 내지 37%만큼 개선시켰고, 중앙값 역가를 35% 내지 37%만큼 개선시켰다.
본 개시내용은 선형 플라스미드, 예를 들어 관심 유전자 (예를 들어, 항체를 코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임)를 포함하는 선형 플라스미드가 표적화된 삽입을 위한 숙주 세포 게놈 서열에 관한 사전 지식을 요구하지 않으면서도 숙주 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있는 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 선형 플라스미드가 종종 선호되긴 하지만, 원형 플라스미드를 사용하여 랜딩 패드 세포를 생성할 수 있다.
용어 "표적화된 삽입" 및 "표적화된 통합"은 유전자 또는 핵산 서열의 직접 삽입 또는 통합이 게놈 상의 특이적 위치를 향하게 하는데 이용되는, 즉 유전자 또는 핵산 서열이 연속 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 두 뉴클레오티드 사이의 특이적 부위를 향하게 하는데 이용되는 유전자 표적화 방법을 지칭하기 위해 상호 교환가능하게 사용된다. 표적화된 삽입은 또한 소수의 뉴클레오티드를 도입하거나 또는 예를 들어, 다중 유전자, 조절 요소 및/또는 핵산 서열을 포함하는 전체 유전자 카세트를 도입하기 위해 수행될 수 있다. "삽입" 및 "통합" 및 그의 문법적 변형은 본 명세서 전반에 걸쳐 상호 교환가능하게 사용된다. 일부 측면에서, 표적화된 통합은 재조합, 예를 들어 부위-특이적 재조합, 상동 재조합, 또는 그의 조합을 통해 시행될 수 있다.
이들 방법에 따르면, 세포주, 예를 들어 관심 단백질의 발현과 관련하여 유리한 특성 (예를 들어, 높은 재조합 단백질 수율, 낮은 단백질 분해 또는 미스폴딩, 특이적 글리코실화 패턴 또는 번역 후 변형과 관련된 기타 특성)을 나타내는 것으로 히스토릭으로 공지된 세포주가 모 세포주로서 사용되어 다른 관심 유전자를 발현하는 데 사용될 수 있는 랜딩 패드 세포주를 생성할 수 있다. 모 세포주는 이상적으로는 핫 세포 (즉, 높은 역가의 재조합 단백질을 생산한다)이고, 하나 이상의 핫 스팟 (관심 단백질을 코딩하는 외래 핵산의 도입이 파괴적이지 않고 높은 수준의 재조합 단백질 발현을 초래하는 게놈 영역)을 갖는 세포이다. 본원에 개시된 모 세포 선택 프로세스의 일부로서, 2개의 핫 스팟이 확인되었다.
모 세포주의 게놈에 통합된 발현 카세트를 포함하는 모 세포 내의 플라스미드 (모 플라스미드)는 모 플라스미드 내부에 있는 2개의 위치 (예를 들어, 재조합 부위) 사이에서 이를 절제함으로써 (예를 들어, 상동 재조합을 통함) 부분적으로 제거되고 (즉, 모 세포 게놈 DNA를 커팅/붕괴시키지 않음), 또한 이와 같이 절제된 영역은 적어도 하나의 마커 (예를 들어, 선택가능한 및/또는 스크리닝가능한 마커)에 플랭킹하는 2개의 새로운 재조합 부위를 포함하는 또 다른 DNA 서열 (랜딩 패드 플라스미드)로 대체된다. 이러한 방법은 새로 도입된 2개의 재조합 부위에서의 재조합을 통해 상이한 관심 유전자 (즉, 모 세포에 존재하는 관심 유전자와 상이한 관심 유전자)를 포함하는 핵산 서열 (예를 들어, 발현 플라스미드 또는 관심 유전자 플라스미드)을 삽입하는 데 사용될 수 있는 랜딩 패드 세포를 생성한다. 이러한 일반적인 프로세스와 관련된 상이한 전략이 본 출원에 개시되어 있다.
이들 방법은 모 플라스미드의 서열에 대한 지식에 기초하여 랜딩 패드 세포주로서 임의의 특히 유리한 모 세포주의 사용을 가능하게 하는 본질적으로 보편적이다. 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 상업용 플라스미드인, 모 세포주에 존재하는 플라스미드 (모 플라스미드)에 대한 지식은 모 세포의 게놈에서 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분의 도입에 적합한 재조합 부위의 선택을 쉽게 허용한다. 순차적으로, 랜딩 패드 플라스미드에 새로 도입된 재조합 부위는 관심 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 그의 일부분, 예를 들어 선형 또는 원형 플라스미드를 모 세포의 게놈에 통합시켜, 발현 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 4a, 도 5a, 도 6a 및 도 8a를 참조한다. 보편적인 표적화된 통합 전략은, 예를 들어 도 8a (전략 A 및 전략 B) 및 도 8b (전략 C 및 전략 D)에 도시되어 있다. 또한, 상이한 구성의 다수의 랜딩 패드를 포함하는 구축물이 제공되며 (예를 들어, 도 12b 참조), 여기서 각각의 패드는 독특한 SSRS 조합을 사용함으로써 독특하게 확인될 수 있다 (예를 들어, 도 18 참조).
"핫 세포주" (즉, 재조합 단백질의 높은 수율 또는 또 다른 유리한 특성을 갖는다)인 모 세포주를 확인하고, 이어서 모 플라스미드가 삽입된 "핫 스팟"을 확인하는 것은, 랜딩 패드 세포를 제조하고 사용하는 방법을 지원해주고, 이러한 방법 및/또는 모 세포 게놈의 서열에 대한 지식이 필요하지 않은 랜딩 패드 세포를 사용하여 모노클로날 항체와 같은 대체 관련 생물학적 제제의 발현 개선을 지원해준다.
따라서, 본 개시내용은 또한 랜딩 패드 세포, 랜딩 패드 플라스미드, 및 예를 들어, 랜딩 패드 세포주를 생성하고/하거나 발현 세포주를 생성하기 위한 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 단일 랜딩 패드 플라스미드를 함유하는 랜딩 패드 세포를 제공하는 것 외에도, 본 개시내용은 다수의 랜딩 패드를 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 랜딩 패드 세포 내의 다수의 랜딩 패드는, 예를 들어 각각의 랜딩 패드를 독특하게 확인하는 부위-특이적 재조합 부위 또는 그의 조합을 함유함으로써 어드레싱가능할 수 있다.
I. 용어
본 개시내용을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어를 정의한다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 본원에 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기 각각의 용어는 하기에 제시된 의미를 갖는다. 부가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시되어 있다.
단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 명시하지 않는 한 복수의 지시 대상물을 포함한다. 용어 "하나" 뿐만 아니라 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 일반 용어는 "단일"을 의미한다. 다른 측면에서, 일반 용어는 "2개 이상" 또는 "다수"를 포함한다.
더욱이, 본원에 사용된 "및/또는"은 2개의 명시된 특색 또는 성분 중 다른 하나가 있거나 없는 각각의 특이적 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독) 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"는 하기 측면 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로, 그러한 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방식, 즉 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야에서 실시할 때마다 1 또는 1 초과의 표준 편차 내에 있다는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 최대 10%의 범위를 의미할 수 있다. 더욱이, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련해서는, 상기 용어가 특정 값의 최대 1 자릿수 또는 최대 5-배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그러한 특정한 값 또는 조성에 대한 허용되는 오차 범위 내에 있는 것으로 추정해야 한다.
본원에서 "포함하는"이라는 표현으로 측면을 설명할 하는 경우, "~로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어로 설명되는 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은, 하나 이상의 관심 값에 적용된 바와 같은 용어 "대략"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 측면에서, 용어 "대략"은 달리 언급되지 않거나 문맥상 달리 명백히 드러나지 않는 한 (그러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외) 언급된 참조 값의 어느 한 방향 (보다 크거나 보다 작은)으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같은, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한, 나열된 범위, 및 경우에 따라 그의 분율 (예컨대, 정수의 1/10 및 1/100) 내의 임의의 정수 값을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용과 관련된 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두사 및 부호는 국제 연합 시스템 (SI) 승인 형식으로 표시된다. 본원에 제공된 제목은 본 명세서 전체를 참조하여 가질 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니다. 따라서, 정의된 용어는 본 명세서 전체를 참조함으로써 보다 완전하게 정의된다.
본원에 사용된 약어는 본 개시내용 전반에 걸쳐 정의된다. 본 개시내용의 다양한 측면은 하기 하위 섹션에서 더 자세히 설명된다.
뉴클레오티드는 통상적으로 허용되는 단일 문자 코드로서 지칭된다. 달리 표시되지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 뉴클레오티드는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 통상적으로 공지된 한 문자 부호로서 본원에 지칭된다. 따라서, A는 아데닌을 나타내고, C는 시토신을 나타내며, G는 구아닌을 나타내고, T는 티민을 나타내며, U는 우라실을 나타낸다.
아미노산은 통상적으로 공지된 세 문자 부호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 한 문자 부호로서 본원에 지칭된다. 달리 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되며, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 그의 유사체, 또는 그의 혼합물을 포함한, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 이러한 용어는 분자의 1차 구조를 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 삼중, 이중 및 단일 가닥의 데옥시리보핵산 ("DNA")뿐만 아니라 삼중, 이중 및 단일 가닥의 리보핵산 ("RNA")을 포함한다. 이는 또한, 예를 들어 알킬화 및/또는 캡핑에 의해 변형된 형태와 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 보다 특히, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), 스플라이싱 여부에 관계없이 mRNA 및 gRNA를 포함한 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 노르뮤클레오티드 백본을 함유하는 기타 중합체, 예를 들어 폴리아미드 (예를 들어, 펩티드 핵산 "PNA") 및 폴리모르폴리노 중합체, 및 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기 쌍 형성 및 염기 스태킹을 허용하는 구성의 핵염기를 함유하는 중합체를 제공하는 기타 합성 서열 특이적 핵산 중합체를 포함한다.
용어 "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 상호 교환가능하게 사용되며 연속 핵산 서열을 지칭한다. 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 예를 들어, gRNA일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "하위서열"은 서열 (물리적 서열 또는 그의 상징적 표현)에서 연속 뉴클레오티드의 서브세트를 지칭한다.
본원에 개시된 방법은, 예를 들어 생물학적 제제, 예컨대 항체의 생산을 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체" (Ab)는 항원과 특이적으로 결합하는 당단백질 이뮤노글로불린을 포함할 것이나, 이에 제한되지는 않고, 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H)와 2개의 경쇄 (L), 또는 그의 항원-결합 부분을 포함한다. 각각의 H 쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 V H 로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인, 즉 C H 1, C H 2 및 C H 3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 V L 로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 불변 도메인, 즉 C L 을 포함한다. V H 및 V L 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된, 보다 보존되는 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 V H 및 V L 은 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함하며, 이들은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 체계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전통적 보체 시스템의 제1의 성분 (C1q)을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 따라서, 예를 들어 용어 "항-PD-1 항체"는 PD-1과 특이적으로 결합하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전체 항체 및 이러한 전체 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 항원-결합 부분의 비제한적인 예는 본원의 다른 곳에 제시되어 있다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙 또는 그의 항원-결합 부분이다.
일부 측면에서, 항체는 이중특이적 항체이다. "이중특이적 항체"는 "이중특이적 분자" 또는 "이중특이적 결합 분자"의 특정한 유형이다. 용어 "이중특이적 항체"는 2개의 상이한 항원-결합 부위를 통해 적어도 2개의 항원 결정인자 (예를 들어, 에피토프)와 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 특정 측면에서, 이중특이적 항체는 2개의 항원 결정인자 (예를 들어, 에피토프)와 공동으로 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 이중특이적 항체는 그의 결합 아암 (한 쌍의 중쇄/경쇄) 중 하나에서 하나의 항원 (또는 에피토프)과 결합하고, 그의 제2의 결합 아암 (상이한 쌍의 중쇄/경쇄)에서 상이한 항원 (또는 에피토프)과 결합한다. 일부 측면에서, 이중특이적 항체는 2개의 별개의 항원 결합 아암 (특이성과 CDR 서열 둘 다에 있어서)을 가질 수 있고, 그것이 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다. 이중특이적 항체는 예를 들어, 쿼드로마 기술에 의해 (문헌 [Milstein & Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40]), 2개의 상이한 모노클로날 항체의 화학적 접합에 의해 (문헌 [Staerz et al. (1985) Nature 314(6012):628-31]), 또는 Fc 영역에 돌연변이를 도입하는 놉-인투-홀 (knob-into-hole) 또는 유사한 접근 방식 (문헌 [Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14): 6444-6448])에 의해 생성된 것을 포함한다.
최근에는 다양한 재조합 항체 포맷, 예를 들어 3가 또는 4가 이중특이적 항체가 개발되었다. 그 예는 IgG 항체 포맷과 단일 쇄 도메인의 융합을 포함한다 (상이한 포맷에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997), 159-163; WO 2001/077342; Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007), 1233-1234; Holliger. P. et al., Nature Biotech. 23 (2005), 1 126-1 136; Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007), 3-14; Shen, J., et al., J. Immunol. Methods 318 (2007), 65-74; Wu, C, et al., Nature Biotech. 25 (2007), 1290-1297]을 참조한다). 이중특이적 항체는 WO2009/080251; WO2009/080252; WO 2009/080253; WO2009/080254; WO2010/112193; WO2010/115589; WO2010/136172; WO2010/145792; WO2010/145793 및 WO2011/117330 (이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 방법에 따라 생산된 3가 또는 4가 이중특이적 항체를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 더 높은 차수의 원자가가 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
최근에는 다양한 재조합 이중특이적 항체 포맷이, 예를 들어 IgG 항체 포맷과 단일 쇄 도메인의, 예를 들어 융합에 의해 개발되었다 (문헌 [Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16] 참조). 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교체되는 이중특이적 항체는 WO2009080251 및 WO2009080252에 기재되어 있다.
'놉-인투-홀'로서 공지되는 잘못 짝지워진 부산물의 문제를 회피하기 위한 접근 방식은 CH3 도메인 내로 돌연변이를 도입하여 접촉 경계면을 변형시킴으로써 2개의 상이한 항체 중쇄를 강제로 쌍을 이루게 하는 것을 목표로 한다. 하나의 쇄에서 부피가 큰 아미노산은, 짧은 측쇄를 가진 아미노산으로 대체되어 '홀'을 생성하였다. 반대로, 큰 측쇄를 가진 아미노산을 다른 CH3 도메인 내로 도입하여 '놉'을 생성하였다. 이들 2개의 중쇄 (및 두 중쇄 모두에 적절해야 하는 2개의 동일한 경쇄)를 공동 발현함으로써, 이종이량체 형성 ('놉-홀') 대 동종이량체 형성 ('홀-홀' 또는 '놉-놉')의 높은 수율이 관찰되었다 (Ridgway JB, Presta LG, Carter P; and WO1996027011). 이종이량체의 백분율은 파지 디스플레이 접근 방식을 사용하여 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면을 리모델링하고 이종이량체를 안정화하기 위한 디술피드 브리지를 도입함으로써 추가로 증가될 수 있었다 (Merchant A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Aτwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35). 놉-인투-홀 기술에 대한 새로운 접근 방식은 예를 들어, EP 1870459A1에 기재되어 있다. 문헌 [Xie, Z., et al., J Immunol Methods 286 (2005) 95-101]은 Fc 부분에 대한 놉-인투-홀 기술과 조합하여 scFv를 사용하는 이중특이적 항체 포맷을 지칭한다 (문헌 [Godar et al. (2018) "Therapeutic bispecific antibody formats: a patent applications review (1994-2017)" Expert. Opin. Ther. Pat. 28(3):251-276, and Brinkmann & Kontermann (2017) "The making of bispecific antibodies" mAbs 9:182-212] 참조; 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). 또한, 문헌 [Ridgway et al. (1996) Protein Eng 9:617-21; Atwell et al. (1997) J. Mol. Biol. 270:26-35; Merchant et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:677-681; Moore et al. (2011) MAbs 3:546-55; Von Kreudenstein et al. (2013) MAbs 5:646-54; Gunasekaran et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:19637-47; Geuijen et al. (2014) J. Clin. Oncology 32:suppl:560; Strop et al. (2012) J. Mol. Biol. 420:204-19; Choi et al. (2013) Mol. Cancer Ther. 12:2748-59; Choi et al. (2015) Mol. Immunol. 65:377-83; Labrijn et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:5145-50; Davis et al. (2010) Protein Eng. 23:195-202; Moretti et al. (2013) BMC Proceedings 7(Suppl 6):O9; and Leaver-Fey et al. (2016) Structure 24:641-51]을 참조한다 (이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). 경쇄 쌍 형성 전략은 예를 들어, 문헌 [Schaefer et al. (2011) Proc Natl Acad Sci U S A. 108(27):11187-92; Lewis et al. (2014) Nat Biotechnol. 32(2):191-8; Mazor et al. (2015) MAbs. 7(2):377-89; Liu et al. (2015) J Biol Chem. 290(12):7535-62; Dillon et al. (2017) MAbs. 9(2):213-230]; 및 미국 특허 번호 9,914,785에 개시되어 있다 (이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
이뮤노글로불린은 IgA, 분비성 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 통상적으로 공지된 이소형 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. IgG 서브클래스는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 또는 서브클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 용어 "항체"는, 예로서 자연 발생 항체와 비-자연 발생 항체 둘 다; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 또는 비-인간 항체; 완전한 합성 항체; 및 단일 쇄 항체를 포함한다. 비-인간 항체는 인간에서의 그의 면역원성을 저하시키기 위해 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 명확히 언급되지 않고, 문맥상 달리 표시하지 않는 한, 용어 "항체"는 또한, 전술된 이뮤노글로불린 중 임의의 것의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 부분을 포함하고, 1가 및 2가 단편 또는 부분, 및 단일 쇄 항체를 포함한다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, 항원, 예를 들어 PD-1과 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 PD-1 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, PD-1과 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 상이한 종으로부터의 PD-1 분자와 교차 반응성을 지닐 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "모노클로날 항체" (mAb)는 단일 분자 조성의 항체 분자, 즉 그의 1차 서열이 본질적으로 동일하고 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체 분자의 비-자연 발생 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체는 단리된 항체의 한 예이다. 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 트랜스제닉 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타 기술에 의해 생산될 수 있다.
"인간 항체" (HuMAb)는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다가 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 더욱이, 이러한 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 이러한 불변 영역 또한, 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본 개시내용의 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열을 인간 프레임워크 서열 상으로 이식시킨 항체를 포함하지는 않는다. 용어 "인간 항체" 및 "완전한 인간 항체"는 동의어로 사용된다.
"인간화 항체"는 비-인간 항체의 CDR 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두를 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 대체시킨 항체를 지칭한다. 인간화 형태의 항체의 한 측면에서, CDR 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 인간 이뮤노글로불린으로부터의 아미노산으로 대체시켰던 반면, 하나 이상의 CDR 내의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 변화시키지 않는다. 아미노산의 소규모 부가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 이들이 특정한 항원과 결합할 수 있는 항체의 능력을 폐기하지 않는 한은 허용된다. "인간화 항체"는 원래의 항체와 유사한 항원 특이성을 보유하고 있다.
"키메라 항체"는 가변 영역이 한 가지 종으로부터 유래되고, 불변 영역이 또 다른 종으로부터 유래되는 항체, 예컨대 가변 영역이 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
"항-항원 항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 항-PD-1 항체는 PD-1 항원과 특이적으로 결합하고, 항-PD-L1 항체는 PD-L1 항원과 특이적으로 결합한다.
항체의 "항원-결합 부분" ("항원-결합 단편"이라고도 함)은 전체 항체에 의해 결합된 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체, 예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 내에 포괄된 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편 (파파인 절단으로부터의 단편) 또는 VL, VH, LC 및 CH1 도메인으로 이루어진 유사한 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편 (펩신 절단으로부터의 단편) 또는 힌지 영역에서 디술피드 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 유사한 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되긴 하지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지됨)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 만들 수 있게 해주는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체는 또한, 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 이러한 단편을 무손상 항체에 대해서와 동일한 방식으로 유용성에 관하여 스크리닝한다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있거나, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
일부 측면에서, 생물학적 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 측면에서, 생물학적 제제는 효소, 수용체, 수용체 리간드, 단백질 항생제, 융합 단백질, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신, 성장 인자, 호르몬 또는 시토카인이다. 일부 측면에서, 생물학적 제제는 하나 이상의 이종 모이어티, 예를 들어 생물학적 제제의 혈장 반감기를 연장하기 위한 모이어티, 막 또는 뇌 혈액 장벽을 가로지르는 수송을 촉진하기 위한 모이어티, 제거율을 증가시키거나 감소시키기 위한 모이어티, 또는 생물학적 제제를 특정한 세포 또는 조직 유형으로 유도하기 위한 모이어티 (즉, 표적화 모이어티)를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 "단리된" 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 세포, 또는 임의의 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합을 포함한다. 또한 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비자연 아미노산, 예컨대 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산 및 크레아틴 포함)뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의에 포함된다.
2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 "서열 동일성 퍼센트"라는 용어는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야만 하는 부가 또는 결실 (즉, 갭)를 고려하여, 비교 창 전반에 걸쳐 상기 서열에 의해 공유된 동일한 일치된 위치의 수를 지칭한다. 일치된 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 표적 서열과 참조 서열 둘 다에 존재하는 임의의 위치이다. 갭은 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니기 때문에 표적 서열에 존재하는 갭은 계수되지 않는다. 마찬가지로, 참조 서열로부터의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아닌 표적 서열 뉴클레오티드 또는 아미노산이 계수되기 때문에, 참조 서열에 존재하는 갭은 계수되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민 (T)과 우라실 (U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다.
서열 동일성 백분율은 두 서열에서 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 이러한 일치하는 위치의 수를, 비교 창 내의 전체 위치 수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다. 두 서열 간의 서열 비교 및 서열 동일성 퍼센트 결정은 온라인 사용 및 다운로드 모두에서 쉽게 이용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 단백질과 뉴클레오티드 서열 모두의 정렬을 위해 다양한 공급처로부터의 적합한 소프트웨어 프로그램을 이용할 수 있다. 서열 동일성 퍼센트를 결정하는 데 적합한 프로그램 중 하나는 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용가능한 BLAST 프로그램 제품군의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어 생물정보학 프로그램의 EMBOSS 제품군의 일부인 니들(Needle), 스트레처(Stretcher), 워터(Water) 또는 마처(Matcher)이며 www.ebi.ac.uk/Tools/psa의 유럽 생물정보학 연구소 (EBI)로부터도 이용가능하다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 그 자신의 서열 동일성 퍼센트를 가질 수 있다. 서열 동일성 퍼센트 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림된다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 반올림되는 반면, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수라는 점에 유의해야 한다.
특정 측면에서, 제2의 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 제1의 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)의 동일성 백분율 "%ID"는 %ID = 100 x (Y/Z)로서 계산되며, 여기서 Y는 제1 및 제2의 서열의 정렬 (육안 검사 또는 특정한 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬된 바와 같음)에서 동일한 일치물로서 점수가 매겨진 아미노산 잔기 (또는 핵염기)의 수이고 Z는 제2의 서열에 있는 잔기의 총 수이다. 제1의 서열의 길이가 제2의 서열보다 긴 경우, 제2의 서열에 대한 제1의 서열의 동일성 퍼센트는 제1의 서열에 대한 제2의 서열의 동일성 퍼센트보다 높을 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 서열 동일성 퍼센트 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 1차 서열 데이터에 의해서만 구동되는 이원 서열-서열 비교에 제한되지 않는다는 것을 인지할 것이다. 이종 공급원로부터의 데이터, 예컨대 구조적 데이터 (예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터 (예를 들어, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생적 데이터와 서열 데이터를 통합함으로써 서열 정렬이 생성될 수 있다는 것이 또한 인지될 것이다. 이종 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 생성하는 적합한 프로그램은 T-Coffee이며, 이는 www.tcoffee.org에서 이용가능하고 대안적으로 예를 들어, EBI로부터 이용가능하다. 서열 동일성 퍼센트를 계산하는 데 사용되는 최종 정렬은 자동으로 또는 수동으로 선별될 수 있다는 것이 또한 인지될 것이다.
용어 "유전자", "코딩 서열", "핵산 코딩", "오픈 리딩 프레임", "ORF" 및 그의 문법적 변형은 본 개시내용에서 상호 교환가능하게 사용되며, 일반적으로 단백질, 예를 들어 생물학적 제제, 예컨대 항체인 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 지칭한다. 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개체 또는 포유동물의 세포에서의 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함한 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 코돈 최적화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "GOI"로서 약칭된 용어 "관심 유전자"는 본원에 개시된 세포에 의해 발현되는 외인성 단백질을 지칭한다. 일부 측면에서, GOI는 생물학적 제제, 예를 들어 항체 또는 그의 일부분이다. 일부 측면에서, GOI는 예를 들어 하나 이상의 프로모터 및/또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 세포는 제2의 GOI로 대체될 수 있는 제1의 GOI를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 제1의 GOI (예를 들어, 모 플라스미드에 위치한 GOI)와 제2의 GOI (예를 들어, 제2의 GOI 플라스미드에 위치한 GOI)는 동일한 분자 클래스에 속한다. 예를 들어, 제1의 GOI가 항체인 경우, 모 세포주가 그러한 유형의 재조합 단백질을 효율적으로 발현했기 때문에 제2의 GOI가 또한 항체일 수 있다. 일부 측면에서, GOI는 핵산, 예를 들어 치료 핵산이다. 일부 측면에서, 용어 GOI 및 ORF는, 특히 GOI가 단일 ORF에 의해 코딩되는 경우 상호 교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 측면에서, GOI는 하나 초과의 ORF에 의해 코딩될 수 있다. 일부 측면에서, GOI는 검출가능한 분자, 예를 들어 마커일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "보체" 또는 "상보적"은 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 간의 왓슨-크릭 (예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴 염기 쌍 형성을 지칭한다. "상보성"은 두 핵산 서열이 서로 역평행하게 정렬될 때, 각각의 위치에서의 뉴클레오티드 염기가 상보적이 되도록 두 핵산 서열 간에 공유되는 특성을 지칭한다.
용어 "벡터", "발현 벡터", "플라스미드" 및 그의 문법적 변형은 본 개시내용에서 상호 교환가능하게 사용되며, 숙주 세포의 게놈 내의 특정한 위치에 삽입되는, 숙주 세포 게놈에 외인성인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로, 플라스미드는 복수개의 요소, 예컨대 재조합 부위 (예를 들어, 상동 재조합 부위 및/또는 부위-특이적 재조합 부위), 마커 (예를 들어, 검출 마커 및/또는 선택 마커), 하나 이상의 발현 카세트, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 플라스미드는 선형 플라스미드일 수 있다. 다른 측면에서, 플라스미드는 원형 플라스미드, 예를 들어 무손상 원형 플라스미드일 수 있다.
"발현 카세트"는 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 코딩 서열을 포함한다. "작동가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분이 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 진핵 또는 원핵 세포가 이종 핵산에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 사용되어 재조합 숙주 세포가 되는, 생체내 또는 시험관내 진핵 세포, 원핵 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 고세균 세포), 또는 단세포 실체로서 배양된 다세포 유기체로부터의 세포 (예를 들어, 세포주)를 의미한다. 따라서, 용어 숙주 세포는 또한 이종 핵산에 의해 형질전환된 원래 숙주 세포 (즉, 이종 핵산을 수용하기 전의 숙주 세포)의 자손, 즉 재조합 숙주 세포를 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래의 부모와 형태 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체에 있어서 반드시 완전히 동일하지 않을 수도 있는 것으로 이해된다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "유전자 변형된 숙주 세포"는 이종 핵산, 예를 들어 발현 벡터가 도입된 숙주 세포이다. 예를 들어, 진핵 숙주 세포는 외인성 핵산을 진핵 숙주 세포 내로 도입함으로써 재조합 또는 유전자 변형된 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 포유동물 숙주 세포)가 된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "핫 세포", "핫 클론" 및 "핫 세포주"는 각각 유리한 특성을 갖는 세포, 클론 또는 세포주를 지칭하며, 예를 들어, 이들은 동일한 재조합 단백질을 발현하는 다른 세포, 클론 또는 세포주와 비교하여 높은 수율의 재조합 단백질을 가지고 있다. 예를 들어, 핫 세포, 핫 클론 또는 핫 세포주는 더 많은 양의 재조합 단백질을 발현할 수 있거나, 더 높은 수준의 올바르게 폴딩된 재조합 단백질을 발현할 수 있거나, 더 낮은 수준의 고분자량 응집체를 갖는 재조합 단백질을 발현할 수 있거나, 더 낮은 수준의 단편화를 갖는 재조합 단백질을 발현할 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합 또는 바람직한 일부 다른 특성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "핫 스팟"은 외인성 서열, 예를 들어 재조합 발현을 위한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드가 삽입될 수 있는 게놈 위치 (유전자좌)를 지칭하며, 여기서 (i) 외인성 서열의 전사는 침묵되지 않으며 (예를 들어, 후생적 변형에 의함) (ii) 외인성 서열의 전사는, 외인성 서열이 다른 위치 (예를 들어, 참조 위치)에 삽입될 때 관찰되는 전사 수준과 비교하여 높은 수준에서 발생한다. 일부 측면에서, 핫 스팟은 기능적 ORF를 함유하지 않는다. 따라서, 일부 측면에서, 핫 스팟은 활발하게 전사되는 유전자 또는 유전자들을 함유하지 않는다. 활발하게 전사되는 유전자가 결여된 핫 스팟은 외인성 유전자 (관심 유전자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 부분적 또는 전체적 결실이 내인성 단백질 생산을 방해하지 않기 때문에 특히 유리하다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 핫 스팟은 활발하게 전사되는 유전자에 인접하여 위치하거나 또는 2개의 활발하게 전사되는 유전자 사이에 위치하는데, 즉 핫 스팟은 2개의 활발하게 전사되는 유전자에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 핫 스팟에 외인성 유전자 (관심 유전자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는 것은 핫 스팟에 인접하거나 이에 플랭킹하는 하나 이상의 활발하게 전사되는 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 핫 스팟에 외인성 유전자 (관심 유전자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는 것은 핫 스팟에 인접하거나 이에 플랭킹하는 하나 이상의 활발하게 전사되는 유전자의 발현을 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만만큼 감소시킨다.
본원에 사용된 바와 같은, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 본원에 개시된 랜딩 패드 서열에 적용된 바와 같은 용어 "어드레싱가능한"은 독특한 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS) 또는 그의 조합의 존재에 의해 독특하게 확인되는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, Lox 511 및 Lox P 부위를 갖는 제1의 랜딩 패드와 Lox m3 및 Lox m7 부위를 갖는 제2의 랜딩 패드는 서로에 대해 어드레싱가능할 것이다. 따라서, 일부 측면에서, 2개의 SSRS의 특이적 조합의 존재로 인해 랜딩 패드가 어드레싱가능할 수 있다. 다른 측면에서, 랜딩 패드는 단일 SSRS를 통해 제2의 랜딩 패드에 대해 어드레싱될 수 있으며; 예를 들어, 제1의 랜딩 패드는 제1의 단일 aatP 부위를 가질 수 있고, 제2의 랜딩 패드는 제2의 단일 aatP 부위를 가질 수 있으며, 여기서 aatP 부위는 상호 호환불가능하다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 다수의 연결된 랜딩 패드가 존재할 수 있으며, 여기서 각각의 랜딩 패드는 주어진 랜딩 패드를 구체적으로 확인 (어드레싱)하는 독특한 SSRS 또는 그의 조합의 존재 덕분에 독특하게 어드레싱가능하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "어드레싱가능한 SSRS"는 재조합을 위해 특이적으로 표적화될 수 있는 독특한 SSRS 또는 그의 조합을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드"는 재조합을 위해 특이적으로 표적화될 수 있는 어드레싱가능한 SSRS 또는 그의 조합을 포함하는 랜딩 패드 플라스미드를 지칭한다.
한 쌍의 부위-특이적 재조합 부위에 적용될 때 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상호 호환불가능"은 대체 SSRS와의 재조합이 결핍된 부위, 즉 대체 SSRS와의 재조합이 불가능하거나 일부 잔류 교차 반응성만 있는 부위를 지칭한다. 예를 들어, 2개의 Lox 부위, 예컨대 LoxP 및 Lox511은 서로 재조합 가능성이 감소되어 상호 호환불가능한 것으로 간주된다. 유사하게, 서로 재조합 가능성이 감소된 두 attP-aatB 쌍의 부위는 상호 호환불가능한 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "헤드-투-헤드, "테일-투-테일", "테일-투-헤드", 및 "헤드-투-테일"은 본원에 개시된 유전자 구축물 내의 2개의 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 2개의 랜딩 패드, 랜딩 패드 플라스미드, 발현 플라스미드, 또는 관심 유전자의 상대적 배향을 지칭한다. 용어 "헤드"는 핵산 서열의 5' 말단을 지칭하고, 용어 "테일"은 핵산 서열의 3' 말단을 지칭한다. 따라서, 3'-5' 5'-3' 구성은 (구축물에 대한 5'에서 3' 말단을 고려하여) 원래 서열의 두 5' 말단 (헤드)이 서로 옆에 있기 때문에 헤드-투-헤드이다. 결과적으로, 5'-3' 3'-5' 구성은 테일-투-테일이고, 5'-3' 5'-3'은 테일-투-헤드이며, 3'-5' 3'-5'는 헤드-투-테일이 된다.
II. 랜딩 패드 세포
본 개시내용은 적어도 하나의 관심 유전자 (GOI)의 재조합 발현에 사용될 수 있는 랜딩 패드 세포를 제공한다. 일부 측면에서, 이들 세포주는 "랜딩 패드", 즉 모 세포의 게놈에 삽입된 특이적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열들을 포함하며, 이는 예를 들어, 재조합을 통해 적어도 하나의 GOI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또 다른 특이적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열들로 대체될 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 재조합을 통해 폴리뉴클레오티드 서열을 대체하는 것 대신, 적어도 하나의 GOI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열들은, 예를 들어 aat 부위를 통해 랜딩 패드 내의 위치에 삽입될 수 있다.
본원에 개시된 프로세스 중 하나에 대한 일반적인 설명으로서, 모 세포주 (예를 들어, 특정한 생물학적 제제를 효율적으로 발현하는 것으로 공지된 "히스토릭" 세포주)는 모 또는 제1의 GOI를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, "모 플라스미드")을 제2의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, "랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분")로 완전히 또는 부분적으로 대체함으로써 변형된다. 전체 모 플라스미드 대신 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 포함하는, 그 결과로 생성된 세포주는 "랜딩 패드 세포"가 될 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 랜딩 패드 플라스미드는 모 플라스미드로부터의 플랭킹 서열을 포함한다.
순차적으로, 랜딩 패드 세포 내의 랜딩 패드 플라스미드는 상이한 또는 제2의 GOI를 포함하는 또 다른 폴리뉴클레오티드 ("GOI 플라스미드")와의 재조합을 통해 (예를 들어, 부분적으로) 대체되어 "발현 세포"를 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 5a 및 도 5b, 및 표 1에 묘사된 프로세스를 참조한다.
<표 1>
요소 및 재조합 이벤트
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* 일부 측면에서, 모 플라스미드는 "제1의 GOI 플라스미드"로서 지칭된다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 게놈 서열에 통합된 적어도 하나의 발현 플라스미드(P4), 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 발현 세포를 제공하며, 여기서 각각의 발현 플라스미드는 하기를 포함한다:
(i) 관심 유전자 (제2의 GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 플라스미드 (P4)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열;
(ii) (i)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 SSRS (예를 들어, Lox와 같은 레콤비나제 시스템이 사용되는 경우), 또는 단일 SSRS (예를 들어, att와 같은 인테그라제 시스템이 사용되는 경우);
(iii) (i)의 폴리뉴클레오티드 및 (ii)의 SSRS에 대해 원위로 위치하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 (iii)의 플랭킹 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다는 랜딩 패드 플라스미드 (P2)로부터 유래됨;
(iv) (iii)의 폴리뉴클레오티드 서열을 원위로 플랭킹하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 (iv)의 플랭킹 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다는 모 플라스미드 (P1)로부터 유래됨.
본원에 사용된 바와 같은, "SSRS"로 약칭된 용어 "부위-특이적 재조합 부위"는 부위-특이적 레콤비나제에 의해 인식될 수 있고 재조합 이벤트에 대한 기질로서 기능할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 구축물 (예를 들어, 랜딩 패드 플라스미드 또는 발현 플라스미드)은 2개의 SSRS를 포함할 수 있는데, 하나는 GOI 또는 마커를 코딩하는 핵산에 대해 상류에 위치하고 하나는 하류에 위치한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 구축물 (예를 들어, 랜딩 패드 플라스미드 또는 발현 플라스미드)은 GOI 또는 마커를 코딩하는 핵산에 대해 상류 또는 하류에 위치하는 단일 SSRS를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 구축물 (예를 들어, 랜딩 패드 플라스미드 또는 발현 플라스미드)은 2개 초과의 SSRS를 포함할 수 있으며, 여기서 이들 모두는 GOI 또는 마커를 코딩하는 핵산에 대해 상류에 위치하거나, 이들 모두는 GOI 또는 마커를 코딩하는 핵산에 대해 하류에 위치하거나, 이들 중 일부는 GOI 또는 마커를 코딩하는 핵산에 대해 상류에 위치하고 이들 중 일부는 하류에 위치한다.
2개의 SSRS를 포함하는 본 출원에 개시된 식에서, 2개의 SSRS (예컨대 lox 또는 Frt)가 필요한 재조합 시스템 대신 단일 SSRS (예를 들어, att)가 필요한 시스템을 사용하여 재조합이 이루어지는 경우, 상기 식 내 2개의 SSRS 중 1개는 임의적이며 존재하지 않을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 상기 식 내 SSRS 부위 중 하나가 존재하지 않는 경우 단일 SSRS 부위는 [M] 또는 [P3] 성분에 대해 상류에 있는 SSRS 또는 하류에 있는 SSRS일 수 있다. 일부 측면에서, 단일 SSRS는 att 부위이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "부위-특이적 레콤비나제"는 "재조합 부위" 간에 재조합을 일으킬 수 있는 효소 군을 포함하며, 여기서 2개의 재조합 부위는 단일 핵산 분자 내에 위치하거나 별도의 핵산 분자에 위치한다. "부위-특이적 레콤비나제"의 예는 Cre, Flp 및 Dre 레콤비나제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 부위-특이적 레콤비나제는 인테그라제, 예를 들어 λ (람다) 인테그라제이다. 일부 측면에서, 부위-특이적 레콤비나제는 Bxb 인테그라제, 예를 들어 Bxb1 인테그라제이다. 미코박테리오파지 Bxb1에 의해 코딩된 인테그라제인 Bxb1은 세린-레콤비나제 패밀리의 구성원이며 파지와 박테리아 숙주에 대한 부착 부위인 attP와 attB 간의 가닥 교환을 각각 촉매한다.
본 개시내용은 게놈 서열에 통합된 적어도 하나의 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드 또는 원형 플라스미드 또는 그의 조합을 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공하며, 여기서 각각의 플라스미드는 하기를 포함한다:
(i) 적어도 하나의 마커 및 이러한 적어도 하나의 마커에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS) (Lox와 같은 레콤비나제 시스템이 사용되는 경우; 또는 att와 같은 인테그라제 시스템이 사용되는 경우에는 단일 SSRS)를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드 (P2)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(ii) (i)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 (ii)의 플랭킹 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다는 모 플라스미드 (P1)로부터 유래되는 것.
단일 SSRS가 존재하는 경우, 그의 위치가 식에서 또 다른 요소, 예를 들어, [P2] o [P3] 요소 (즉, 마커 또는 GOI를 코딩하는 요소)를 "플랭킹"한다는 설명은, 이와 같이 플랭킹된 요소에 대해 상류 또는 하류에 있는 SSRS의 바로 앞 위치를 지칭한다는 것을 이해해야 한다. 한 예로서, 식 CG1/-[P1]-[P2]-[SSRS]-[P3]-[P2]-[P1]-/CG2 내의 [SSRS]는 GOI를 코딩하는 [P3]에 플랭킹한다.
본 개시내용은 게놈 서열에 삽입된 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 발현 세포를 제공하며, 여기서 플라스미드의 토폴로지는 하기 식에 상응한다:
CG1/-[P1]-[P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2]-[P1]-/CG2
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 선형 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P3]은 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 제2의 GOI 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이다.
본 개시내용은 또한 다수의 플라스미드, 예를 들어 랜딩 플라스미드 또는 그의 일부분을 포함하는 랜딩 패드 세포를 고려한다. 따라서, 본 개시내용은 또한 게놈 서열에 통합된 적어도 하나의 플라스미드, 예를 들어 1개, 2개, 3개 또는 그 초과의 선형 플라스미드 또는 원형 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공하며, 여기서 각각의 플라스미드는 적어도 하나의 마커 및 이러한 적어도 하나의 마커에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드 (P2)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (i)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 (ii)의 플랭킹 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다는 모 플라스미드 (P1)로부터 유래되는 것을 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 게놈 서열에 삽입된 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 발현 세포를 제공하며, 여기서 플라스미드의 토폴로지는 하기 식에 상응한다:
CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG2
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 선형 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P3]은 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이고;
n은 1 내지 10의 정수이다.
일부 측면에서, [P3]은 단일 GOI 또는 다수의 GOI를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 5' [SSRS] 또는 3' [SSRS] 중 하나는 임의적이다. 일부 측면에서, 발현 세포는 플라스미드를 포함하며, 여기서 플라스미드는 발현 플라스미드이다.
일부 측면에서, n은 1이다. 일부 측면에서, n은 2이다. 일부 측면에서, n은 3이다. 일부 측면에서, n은 4이다. 일부 측면에서, n은 5이다. 일부 측면에서, n은 6이다. 일부 측면에서, n은 7이다. 일부 측면에서, n은 8이다. 일부 측면에서, n은 9이다. 일부 측면에서, n은 10이다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 동일하다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 상이하다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 플라스미드는 상이하다.
일부 측면에서, CG1은 서열식별번호: 18의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 측면에서, CG2는 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 측면에서, CG1은 서열식별번호: 114의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 측면에서, CG2는 서열식별번호: 115의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
본 개시내용은 게놈 서열에 통합된 적어도 하나의 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공하며, 여기서 플라스미드는 하기를 포함한다:
a. 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열;
b. a의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 SSRS; 및
c. 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, b의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위.
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포 내의 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드의 토폴로지는 하기 식에 상응한다:
CG1/-[P1]-[P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2]-[P1]-/CG2
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 선형 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[M]은 적어도 하나의 마커, 예를 들어 스크리닝가능한, 선택가능한 마커, 또는 그의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포 내의 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드의 토폴로지는 하기 식에 상응한다:
CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG2
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 선형 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[M]은 적어도 하나의 마커, 예를 들어 스크리닝가능한, 선택가능한 마커, 또는 그의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이며;
n은 1 내지 10의 정수이다.
일부 측면에서, n은 1이다. 일부 측면에서, n은 2이다. 일부 측면에서, n은 3이다. 일부 측면에서, n은 4이다. 일부 측면에서, n은 5이다. 일부 측면에서, n은 6이다. 일부 측면에서, n은 7이다. 일부 측면에서, n은 8이다. 일부 측면에서, n은 9이다. 일부 측면에서, n은 10이다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 동일하다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 상이하다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 플라스미드는 상이하다.
본 개시내용은 또한 게놈 서열에 삽입된 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공하며, 여기서 플라스미드의 토폴로지는 하기 설명에 상응한다:
CG1/-[P1]-[P2]-[P1]-/CG2
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 적어도 하나의 마커 및 이러한 적어도 하나의 마커에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 개시내용은 또한 게놈 서열에 삽입된 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공하며, 여기서 플라스미드의 토폴로지는 하기 설명에 상응한다:
CG1/-[P1*]-/CG2
CG3/-[P2]-/CG4
여기서:
CG1 및 CG2는 제1의 핫 스팟에 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
CG3 및 CG4는 제2의 핫 스팟에 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이며;
[P1*]은 적어도 부분적인 결실이 있는 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 적어도 하나의 마커 및 이러한 적어도 하나의 마커에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 개시내용은 또한 게놈 서열에 삽입된 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공하며, 여기서 플라스미드의 토폴로지는 하기 설명에 상응한다:
CG1/-([P1]-([P2])n-[P1])-/CG2
여기서:
CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
[P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 적어도 하나의 마커 및 이러한 적어도 하나의 마커에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 측면에서, n은 1이다. 일부 측면에서, n은 2이다. 일부 측면에서, n은 3이다. 일부 측면에서, n은 4이다. 일부 측면에서, n은 5이다. 일부 측면에서, n은 6이다. 일부 측면에서, n은 7이다. 일부 측면에서, n은 8이다. 일부 측면에서, n은 9이다. 일부 측면에서, n은 10이다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 동일하다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 상이하다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 플라스미드는 상이하다.
본 개시내용은 또한 게놈 서열에 삽입된 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드 세포를 제공하며, 여기서 플라스미드의 토폴로지는 하기 설명에 상응한다:
CG1/-([P1*]-/CG2
CG3/-([P2])n-/CG4
여기서:
CG1 및 CG2는 제1의 핫 스팟에 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
CG3 및 CG4는 제2의 핫 스팟에 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이며;
[P1*]은 적어도 부분적인 결실이 있는 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 적어도 하나의 마커 및 이러한 적어도 하나의 마커에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 측면에서, n은 1이다. 일부 측면에서, n은 2이다. 일부 측면에서, n은 3이다. 일부 측면에서, n은 4이다. 일부 측면에서, n은 5이다. 일부 측면에서, n은 6이다. 일부 측면에서, n은 7이다. 일부 측면에서, n은 8이다. 일부 측면에서, n은 9이다. 일부 측면에서, n은 10이다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 동일하다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 상이하다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 플라스미드는 상이하다.
일부 측면에서, CG1은 서열식별번호: 18의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 측면에서, CG2는 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 측면에서, CG3은 서열식별번호: 114의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 측면에서, CG4는 서열식별번호: 115의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 측면에서, 예를 들어, 선형 플라스미드가 모 세포주 내의 원래 핫 스팟과 상이한 핫 스팟 내로 삽입되는 경우, CG1 및 CG2 게놈 서열 (삽입된 선형 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열)은 대체 핫 스팟에 삽입된 선형 플라스미드에 플랭킹하는 게놈 서열에 상응하는 CG3 및 CG4 게놈 서열로 각각 대체된다.
본 개시내용은 또한 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 숙주 세포의 게놈으로의 표적화된 통합을 위한 랜딩 패드 플라스미드를 제공하며, 여기서 플라스미드의 토폴로지는 하기 식에 상응한다:
-[P1]-[P2]-[P1]-
여기서:
[P1]은 상동 재조합 부위를 포함하는 숙주에 통합된 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
[P2]는 적어도 하나의 마커 및 이러한 적어도 하나의 마커에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 개시내용은 또한 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 포함하는 숙주 세포의 게놈으로의 표적화된 통합을 위한 랜딩 패드 플라스미드를 제공하며, 여기서 플라스미드의 토폴로지는 하기 식에 상응한다:
-([P1]-([P2])n-[P1])-
여기서:
[P1]은 상동 재조합 부위를 포함하는 숙주에 통합된 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고; [P2]는 적어도 하나의 마커 및 이러한 적어도 하나의 마커에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이며; n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 측면에서, n은 1이다. 일부 측면에서, n은 2이다. 일부 측면에서, n은 3이다. 일부 측면에서, n은 4이다. 일부 측면에서, n은 5이다. 일부 측면에서, n은 6이다. 일부 측면에서, n은 7이다. 일부 측면에서, n은 8이다. 일부 측면에서, n은 9이다. 일부 측면에서, n은 10이다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 동일하다. 일부 측면에서, 모든 플라스미드는 상이하다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 플라스미드는 상이하다.
본원에 개시된 플라스미드의 약식 토폴로지 (예를 들어, -[P1]-[P2]-[P1]-)는 용어 "설명" 또는 "식"을 상호 교환가능하게 사용하여 설명될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용은 또한 하기를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
(a) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 통합시키는 단계이며, 여기서 랜딩 패드 플라스미드는
(1) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열;
(2) (1)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 SSRS; 및
(3) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위
를 포함하며; 여기서, 랜딩 패드 플라스미드의 상동 재조합 부위는 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것인 단계.
본원에 개시된 표적화된 통합 프로세스는 플라스미드 내 2개의 재조합 부위 사이에 위치한 폴리뉴클레오티드 하위서열을, 또 다른 플라스미드 내 2개의 상응하는 재조합 부위 사이에 위치한 또 다른 폴리뉴클레오티드 하위서열로 대체하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 도 4a, 5a, 8a 및 8b에 예시된 바와 같이 모 플라스미드 내 랜딩 패드 플라스미드의 표적화된 통합은 모 플라스미드의 하위서열을 랜딩 패드 플라스미드로부터의 상응하는 하위서열로 대체하여, 게놈 서열에 있는 재조합 부위 사이에 모 플라스미드 서열로부터의 잔여물을 남긴다. 이러한 표적화된 통합에는 플라스미드를 또 다른 플라스미드로 완전히 대체할 필요가 없다.
유사하게, 제2의 GOI 플라스미드가 랜딩 패드 플라스미드와 재조합되는 경우, SSRS (예를 들어, LoxP 부위) 사이의 하위서열은 교환되지만, 랜딩 패드 플라스미드의 잔여물은 재조합 부위와 게놈 서열 사이에 남게 된다. 이러한 경우, 제2의 GOI 플라스미드로부터 유래된 서열은 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 서열에 의해 플랭킹될 것이고, 이는 순차적으로 모 플라스미드로부터 유래된 서열에 의해 플랭킹될 것이다.
이러한 설명으로부터, 본 출원을 통한 플라스미드의 또 다른 플라스미드 내로의 삽입에 대한 언급은 일반적으로 하나의 플라스미드를 다른 플라스미드로 완전히 대체하는 것을 수반하지 않는다는 사실이 이어진다. 대신, 플라스미드가 완전히 또는 부분적으로 또 다른 플라스미드로 대체되거나, 또는 절제된 플라스미드가 완전히 또는 부분적으로 절제된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
(a) 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 본 개시내용의 랜딩 패드 세포의 게놈에 제2의 GOI 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 발현 플라스미드 (P4)는
(1) GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(2) (1)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS
를 포함하고; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 레콤비나제 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 레콤비나제 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포 게놈 DNA에 삽입된 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계.
본 개시내용은 또한 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
(a) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 플라스미드를 포함하는 모 세포의 게놈에 제2의 GOI 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 발현 플라스미드는
(1) GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(2) (1)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS
를 포함하고; 여기서 모 플라스미드의 부위-특이적 레콤비나제 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 레콤비나제 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계.
본 개시내용은 또한 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 플라스미드를 포함하는 모 세포의 게놈에 제2의 GOI 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 그 결과로 생성된 발현 플라스미드는 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고;
여기서 모 플라스미드는 GOI 플라스미드와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계.
본 개시내용은 또한 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 플라스미드를 포함하는 모 세포의 게놈에 제2의 GOI 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 모 플라스미드는 플랭킹 게놈 서열과 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계.
본원에 개시된 방법은 2개의 중첩된 뉴클레아제 매개 재조합 이벤트, 예를 들어 모 세포 내의 모 플라스미드와 랜딩 패드 플라스미드 간의 상동 재조합, 및 랜딩 패드 세포 내의 랜딩 패드 플라스미드와 제2의 GOI 플라스미드 간의 부위-특이적 레콤비나제 재조합에 관한 것이긴 하지만, 재조합 이벤트의 다른 조합, 예를 들어 P1과 P2 간의 제1의 상동 재조합 이벤트 및 P2와 P3 간의 제2의 상동 재조합이 동일하게 적용가능한 것으로 이해되어야 한다.
또한 본 개시내용의 맥락에서 플라스미드의 통합과 관련된 교시, 예를 들어 랜딩 패드 플라스미드 또는 GOI 플라스미드는 동일하거나 상이할 수 있고, 또한 최종 구축물에서의 배향과 관련하여 상이한 (예를 들어, 최종 구축물 내의 각각의 하나의 플라스미드가 원래 구축물 내 및 최종 구축물 내의 다른 플라스미드에 대해 5'-3' 배향인지 3'-5' 배향인지의 여부) 다수의 플라스미드 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 삽입을 포괄하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
상동 재조합을 사용하여 모 세포의 게놈에 GOI 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 발현 플라스미드는 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고;
여기서 GOI 플라스미드는 핫 스팟에 상응하는 것으로 결정된 위치에서 상동 재조합을 통해 통합되는 것인 단계. 일부 측면에서, 모 플라스미드의 적어도 일부분이 제거된다. 일부 측면에서, 전체 모 플라스미드가 제거된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 효율적인 방식으로 출발 세포 (모 세포주)를 확인하여 높은 역가를 생성할 수 있는 랜딩 패드 세포주를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 개시내용은, 예를 들어 실시예 1 및 실시예 2에 개시된 바와 같이, 발현 세포를 생성하기 위해 모 세포를 선택하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 모 플라스미드의 적어도 일부분을 제거하고 랜딩 패드가 있는 하나 이상의 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 세포 게놈 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 모 플라스미드의 일부분만을 제거하고 랜딩 패드가 있는 하나 이상의 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 세포 게놈 내로 도입하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 랜딩 세포주의 발생에 적합한 모 세포주를 선택하는 방법은 하기를 포함한다:
(i) 관심 유전자의 높은 발현 역가를 갖는 세포주를 선택하는 단계;
(ii) 관심 유전자를 코딩하는 ORF의 낮은 카피 수를 갖는 세포를 추가로 선택하는 단계.
일부 측면에서, 모 세포는 관심 유전자를 코딩하는 ORF의 1개 또는 2개의 카피를 갖는다. 일부 측면에서, 모 세포는 관심 유전자를 코딩하는 ORF의 2개 초과의 카피를 갖는다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주를 선택하는 방법은 모 플라스미드 또는 그 위의 일부분의 상실을 스크리닝하는 것, 및 이러한 상실 (결실)이 있는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 모 세포주를 선택하는 방법은 랜딩 패드의 존재에 대하여 스크리닝하는 것, 및 랜딩 패드가 존재하는 세포를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 낮은 복잡성 또는 높은 복잡성 영역의 존재 또는 부재, 레트로트랜스포손 서열의 존재 또는 부재, Alu 반복부의 존재 또는 부재, 길게 산재된 핵 요소 (LINE)의 존재 또는 부재, 섬의 존재 또는 부재, 시토신 메틸화의 수준, 히스톤 아세틸화의 수준, ORF의 존재 또는 부재, 및 그의 임의의 조합과 같은 특징에 대하여 랜딩 패드를 스크리닝하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 세포는 CHO 세포이다. 일부 측면에서, 핫 스팟 위치는 서열식별번호: 18 또는 그의 단편 및 서열식별번호: 19 또는 그의 단편으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핫 스팟 위치는 서열식별번호: 114 또는 그의 단편 및 서열식별번호: 115 또는 그의 단편으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, GOI 플라스미드는 서열식별번호: 18의 게놈 서열 내의 위치에서 상동 재조합 또는 무작위 통합을 통해 통합되어 삽입된다. 일부 측면에서, GOI 플라스미드는 서열식별번호: 19의 게놈 서열 내의 위치에서 상동 재조합 또는 무작위 통합을 통해 통합되어 삽입된다. 일부 측면에서, GOI 플라스미드는 서열식별번호: 114의 게놈 서열 내의 위치에서 상동 재조합 또는 무작위 통합을 통해 통합되어 삽입된다. 일부 측면에서, GOI 플라스미드는 서열식별번호: 115의 게놈 서열 내의 위치에서 상동 재조합 또는 무작위 통합을 통해 통합되어 삽입된다.
일부 측면에서, GOI 플라스미드는 게놈 서열 내의 위치에서 상동 재조합을 통해 통합되며, 여기서 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하고/하거나 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함한다.
일부 측면에서, GOI 플라스미드는 게놈 서열 내의 위치에서 상동 재조합을 통해 통합되며, 여기서 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 114의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하고/하거나 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 115의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 114로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 또는 적어도 약 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 115로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 또는 적어도 약 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 114로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 또는 적어도 약 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 115로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 또는 적어도 약 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, GOI는 항체이다. 일부 측면에서, GOI는 항체의 중쇄 (HC)를 포함한다. 일부 측면에서, GOI는 항체의 경쇄 (LC)를 포함한다. 일부 측면에서, GOI는 항체의 HC 및 LC를 포함한다. 일부 측면에서, GOI는 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 플라스미드는 GOI의 1개, 2개 또는 그 초과의 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 발현 플라스미드는 1개, 2개 또는 그 초과의 발현 카세트를 포함한다. 일부 측면에서, 발현 플라스미드는 바이시스트론이다. 일부 측면에서, 발현 플라스미드는 멀티시스트론이다.
일부 측면에서, 발현 플라스미드는 발현 세포의 게놈에서 적어도 1개의 카피 수로 통합된다. 일부 측면에서, 발현 플라스미드는 발현 세포의 게놈에서 1개의 카피 수로 통합된다. 다른 측면에서, 발현 플라스미드는 발현 세포의 게놈에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30개 카피의 카피 수로 통합된다. 일부 측면에서, 발현 세포의 게놈에는 30개 초과의 카피가 있다.
다른 측면에서, 발현 플라스미드는 발현 세포의 게놈에서 약 1 내지 약 3, 약 3 내지 약 6, 약 6 내지 약 9, 약 9 내지 약 12, 약 12 내지 약 15, 약 15 내지 약 18, 약 18 내지 약 21, 약 21 내지 약 24, 약 24 내지 약 27, 약 27 내지 약 30, 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 약 25 내지 약 30, 약 1 내지 약 10, 약 5 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 약 1 내지 약 15, 약 5 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 1 내지 약 20, 약 5 내지 약 25, 약 10 내지 약 30개 카피의 카피 수로 통합된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 발현 플라스미드 (P4; 예를 들어, 도 5a 참조)를 생성하기 위해 랜딩 패드 세포주에서 제2의 GOI 플라스미드 (P3; 예를 들어, 도 5a 참조)의 표적화된 통합 후 숙주 세포에 의해 생산된 GOI의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 수준은 정량적으로 결정된다. 다른 측면에서, 발현은 정성적으로 결정된다. GOI의 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 세포 분류, FACS, 세포 표면 염색, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 컬럼 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 미세유체학, UV 흡광도, 세포 크기, 분비된 단백질 수준, 전사체 수준, 면역조직화학, 또는 그의 임의의 조합을 사용함으로써 결정될 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 제2의 GOI의 재조합 발현 수준은 본 개시내용의 방법에 따라 생성된 발현 세포를 사용하여 단일 발현 카세트로부터의 발현 또는 다수의 발현 카세트로부터의 발현에 상응할 수 있다. 일부 측면에서, GOI의 발현은 동일한 부위에 삽입된 GOI를 포함하는 다수의 카세트에 상응할 수 있다.
본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 랜딩 패드 세포 및 발현 세포를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 방법에 따라 생성된 발현 세포를 사용할 때 수득된 제2의 GOI (예를 들어, 제2의 생물학적 제제, 예컨대 제2의 항체)의 재조합 단백질 발현 수준은, 모 세포가 동일한 조건 하에 배양될 때 관찰된 제1의 GOI (예를 들어, 제1의 생물학적 제제, 예컨대 제1의 항체)의 재조합 단백질 발현 수준의 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 125%, 적어도 약 130%, 적어도 약 135%, 적어도 약 140%, 적어도 약 145%, 적어도 약 150%, 적어도 약 155%, 적어도 약 160%, 적어도 약 165%, 적어도 약 170%, 적어도 약 175%, 적어도 약 180%, 적어도 약 185%, 적어도 약 190%, 적어도 약 195%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700%, 적어도 약 800%, 적어도 약 900%, 또는 적어도 약 1000%이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 랜딩 패드 세포 및 발현 세포를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 방법에 따라 생성된 발현 세포를 사용할 때 수득된 제2의 GOI (예를 들어, 제2의 생물학적 제제, 예컨대 제2의 항체)의 재조합 단백질 발현 수준은, 모 세포가 동일한 조건 하에 배양될 때 관찰된 제1의 GOI (예를 들어, 제1의 생물학적 제제, 예컨대 제1의 항체)의 재조합 단백질 발현 수준의 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 125%, 약 130%, 약 135%, 약 140%, 약 145%, 약 150%, 약 155%, 약 160%, 약 165%, 약 170%, 약 175%, 약 180%, 약 185%, 약 190%, 약 195%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900%, 약 1000% 또는 1000% 초과이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 랜딩 패드 세포 및 발현 세포를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 방법에 따라 생성된 발현 세포를 사용할 때 수득된 제2의 GOI (예를 들어, 제2의 생물학적 제제, 예컨대 제2의 항체)의 재조합 단백질 발현 수준은, 모 세포가 동일한 조건 하에 배양될 때 관찰된 제1의 GOI (예를 들어, 제1의 생물학적 제제, 예컨대 제1의 항체)의 재조합 단백질 발현 수준의 약 50% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 60%, 약 65% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 110%, 약 110% 내지 약 120%, 약 120% 내지 약 125%, 약 125% 내지 약 130%, 약 130% 내지 약 135%, 약 135% 내지 약 140%, 약 140% 내지 약 145%, 약 145% 내지 약 150%, 약 150% 내지 약 155%, 약 155% 내지 약 160%, 약 160% 내지 약 165%, 약 165% 내지 약 170%, 약 170% 내지 약 175%, 약 175% 내지 약 180%, 약 180% 내지 약 185%, 약 185% 내지 약 190%, 약 190% 내지 약 195%, 약 195% 내지 약 200%, 약 200% 내지 약 300%, 약 300% 내지 약 400%, 약 400% 내지 약 500%, 약 500% 내지 약 600%, 약 600% 내지 약 700%, 약 700% 내지 약 800%, 약 800% 내지 약 900%, 약 900% 내지 약 1000%, 또는 1000% 초과이다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 본원에 개시된 세포는 세포주, 즉 단일 세포로부터 발생되므로 특정 조건 하에서 세포가 실험실에서 무한히 증식하는 균일한 유전자 구성을 갖는 세포로 이루어진 세포 배양물로서 확립될 수 있으며, 발현 세포주의 경우, 관심 유전자 또는 유전자들이 세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 하기를 포함하는, 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) (차이니즈 햄스터)의 염색체 3으로부터의 폴리뉴클레오티드로서 정의된, "Chr3 TI contig" 또는 염색체 3 표적화된 통합 유전자좌 내에 위치한다: (i) 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에서 서열식별번호: 23 (gi|1497155598|ref|NW_020822499.1 26 Mbase contig로부터의 5' 말단 5 kb 서열)과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 96.6% 동일한 서열 및 (ii) 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에서 서열식별번호: 24 (gi|1497155598|ref|NW_020822499.1 26 Mbase contig로부터의 3' 말단 5 kb 서열)와 적어도 96.6% 동일한 서열, 여기서 폴리뉴클레오티드는 25 Mbase (메가염기) 내지 26.5 Mbase (메가염기) 길이이다
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 하기를 포함하는, 크리세툴루스 그리세우스 (차이니즈 햄스터)의 염색체 5로부터의 폴리뉴클레오티드로서 정의된, "Chr5 TI contig" 또는 염색체 5 표적화된 통합 유전자좌 내에 위치한다: (i) 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에서 서열식별번호: 119 (NW_020822577.1 18 Mbase contig로부터의 5' 말단 5 kb 서열)와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 96.6% 동일한 서열 및 (ii) 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에서 서열식별번호: 120 (NW_020822577.1 18 Mbase contig로부터의 3' 말단 5 kb 서열)과 적어도 96.6% 동일한 서열, 여기서 폴리뉴클레오티드는 17 Mbase (메가염기) 내지 19 Mbase (메가염기) 길이이다.
서열식별번호: 22 (Refseq NW_020822499.1; ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_020822499.1?report=genbank 및 ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_020822499.1?report=fasta에서 이용가능함)의 핫 스팟 및 서열식별번호: 118 (Refseq NW_020822577.1; ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_020822577.1?report=genbank 및 ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_020822577.1?report=fasta에서 이용가능함)의 핫 스팟) 내에는, CHO RNA-seq 데이터 세트 (문헌 [Singh et al. Biotechnol J. 2018 Oct;13(10):e1800070, and Lin et al. PLoS Comput Biol 16(12): e1008498] 참조; 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있고 본 출원인이 실험적으로 확인한 활발하게 전사되는 유전자가 존재한다. NW_020822499.1의 제1의 핫 스팟의 경우, 랜딩 패드가 상주하는 결실의 5' 측에서 가장 가까운 유전자는 269 kb 상류의 Prkg1이고, 랜딩 패드가 상주하는 결실의 3'에서 가장 가까운 유전자는 43 kb 하류의 Mbl2이다. 본 출원인에 의해 또는 CHO RNA-seq 데이터 세트에서도 Prkg1과 Mbl2 간에 다른 활성 전사체가 확인되지 않았다. NW_020822577.1의 제2의 핫 스팟의 경우, 랜딩 패드가 상주하는 결실의 5'에서 가장 가까운 유전자는 209 kb 상류의 Ackr1이고, 랜딩 패드가 상주하는 결실의 3'에서 가장 가까운 유전자는 170 kb 하류의 Crp이다. 본 출원인에 의해 또는 CHO RNA-seq 데이터 세트에서는 Ackr1과 Crp 사이에 다른 활성 전사체가 확인되지 않았다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 활발하게 전사되는 유전자 또는 유전자들의 발현에 영향을 주지 않는 위치에서 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 118 내에 위치한다. 일부 측면에서, 활발하게 전사되는 유전자 또는 유전자들은 서열식별번호: 22의 핫 스팟 또는 서열식별번호: 118의 핫 스팟 내에 위치한다. 일부 측면에서, 활발하게 전사되는 유전자 또는 유전자들은 서열식별번호: 22의 핫 스팟 또는 서열식별번호: 118의 핫 스팟의 5' 말단에 근접하여 위치한다. 일부 측면에서, 활발하게 전사되는 유전자 또는 유전자들은 서열식별번호: 22의 핫 스팟 또는 서열식별번호: 118의 핫 스팟에 근접하여 위치한다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 활발하게 전사되는 유전자가 본원에 개시된 핫 스팟의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 약 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb, 50 kb, 75 kb, 100 kb, 125 kb, 150 kb, 175 kb, 200 kb, 225 kb, 250 kb, 275 kb, 300 kb, 325 kb, 350 kb, 375 kb, 400 kb, 425 kb, 450 kb, 475 kb, 또는 500 kb의 거리에 위치하는 경우, 활발하게 전사되는 유전자는 본원에 개시된 핫 스팟의 5' 말단 또는 3' 말단에 근접한 것으로 간주된다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 특이적 위치에 위치한다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22의 뉴클레오티드 위치 1 (5' 시작 위치) 및 26,290,500 (3' 말단 위치) 내에서, 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 특이적 위치에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 특이적 위치에 위치한다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118의 뉴클레오티드 위치 1 (5' 시작 위치) 및 18,231,092 (3' 말단 위치) 내에서, 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 특이적 위치에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "특이적 위치"는, 예를 들어 통합이 일어날 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 특이적 위치 (예를 들어, 단일 염기)를 지칭하며; 예를 들어 위치 100에서의 특이적 위치는 뉴클레오티드 100과 101 사이의 삽입에 의해 통합이 일어난다는 것을 의미한다. 일부 측면에서, 용어 "특이적 위치"는 통합이 일어날 때 절단될 두 위치 간의 특이적 범위의 뉴클레오티드를 지칭하며; 예를 들어, 위치 100과 200 사이의 특이적 위치는 뉴클레오티드 101 내지 199를 포함하는 원래 서열이 결실되고 통합된 서열로 대체된다는 것을 의미한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 (서열식별번호: 21의 예시적인 표적화된-통합 부위에 상응함) 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열, 또는 서열식별번호: 118 (서열식별번호: 117의 예시적인 표적화된-통합 부위에 상응함) 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 위치 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 박스 내에 있는 서열, 즉 표적화된-통합 부위에 상응하는 서열은 발현 플라스미드 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 모 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드)로 대체된다. 일부 측면에서, 발현 플라스미드 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 모 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드)는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열에 상응하는 음성 가닥에 통합된다. 따라서, 일부 측면에서, 박스 내에 있는 서열로부터 상류 (5') 및 하류 (3')에 있는 밑줄친 서열은 각각 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열에 상응하는 음성 가닥에 통합된 통합 발현 플라스미드의 3' 및 5' 연접부에 상응한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열의 위치 1 내지 1,000,000; 위치 1,000,000 내지 2,000,000; 위치 2,000,000 내지 3,000,000; 위치 3,000,000 내지 4,000,000; 위치 4,000,000 내지 5,000,000; 위치 5,000,000 내지 6,000,000; 위치 6,000,000 내지 7,000,000; 위치 7,000,000 내지 8,000,000; 위치 8,000,000 내지 9,000,000; 위치 9,000,000 내지 10,000,000; 위치 10,000,000 내지 11,000,000; 위치 11,000,000 내지 12,000,000; 위치 12,000,000 내지 13,000,000; 위치 13,000,000 내지 14,000,000; 위치 14,000,000 내지 15,000,000; 위치 15,000,000 내지 16,000,000; 위치 16,000,000 내지 17,000,000; 위치 17,000,000 내지 18,000,000; 위치 18,000,000 내지 19,000,000; 위치 19,000,000 내지 20,000,000; 위치 20,000,000 내지 21,000,000; 위치 21,000,000 내지 22,000,000; 위치 22,000,000 내지 23,000,000; 위치 23,000,000 내지 24,000,000; 위치 24,000,000 내지 25,000,000; 위치 25,000,000 내지 26,000,000; 또는 위치 26,000,000 내지 26,294,056이다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열의 위치 1-100,000; 100,000-200,000; 200,000-300,000; 300,000-400,000; 400,000-500,000; 500,000-600,000; 600,000-700,000; 700,000-800,000; 800,000-900,000; 900,000-1,000,000; 1,000,000-1,100,000; 1,100,000-1,200,000; 1,200,000-1,300,000; 1,300,000-1,400,000; 1,400,000-1,500,000, 1,500,000-1,600,000; 1,600,000-1,700,000; 1,700,000-1,800,000; 1,800,000-1,900,000; 1,900,000-2,000,000; 2,000,000-2,100,000; 2,100,000-2,200,000; 2,200,000-2,300,000; 2,300,000-2,400,000; 2,400,000-2,500,000, 2,500,000-2,600,000; 2,600,000-2,700,000; 2,700,000-2,800,000; 2,800,000-2,900,000; 2,900,000-3,000,000; 3,000,000-3,100,000; 3,100,000-3,200,000; 3,200,000-3,300,000; 3,300,000-3,400,000; 3,400,000-3,500,000, 3,500,000-3,600,000; 3,600,000-3,700,000; 3,700,000-3,800,000; 3,800,000-3,900,000; 3,900,000-4,000,000; 4,000,000-4,100,000; 4,100,000-4,200,000; 4,200,000-4,300,000; 4,300,000-4,400,000; 4,400,000-4,500,000, 4,500,000-4,600,000; 4,600,000-4,700,000; 4,700,000-4,800,000; 4,800,000-4,900,000; 4,900,000-5,000,000; 5,000,000-5,100,000; 5,100,000-5,200,000; 5,200,000-5,300,000; 5,300,000-5,400,000; 5,400,000-5,500,000, 5,500,000-5,600,000; 5,600,000-5,700,000; 5,700,000-5,800,000; 5,800,000-5,900,000; 5,900,000-6,000,000; 6,000,000-6,100,000; 6,100,000-6,200,000; 6,200,000-6,300,000; 6,300,000-6,400,000; 6,400,000-6,500,000, 6,500,000-6,600,000; 6,600,000-6,700,000; 6,700,000-6,800,000; 6,800,000-6,900,000; 6,900,000-7,000,000; 7,000,000-7,100,000; 7,100,000-7,200,000; 7,200,000-7,300,000; 7,300,000-7,400,000; 7,400,000-7,500,000, 7,500,000-7,600,000; 7,600,000-7,700,000; 7,700,000-7,800,000; 7,800,000-7,900,000; 7,900,000-8,000,000; 8,000,000-8,100,000; 8,100,000-8,200,000; 8,200,000-8,300,000; 8,300,000-8,400,000; 8,400,000-8,500,000, 8,500,000-8,600,000; 8,600,000-8,700,000; 8,700,000-8,800,000; 8,800,000-8,900,000; 8,900,000-9,000,000; 9,000,000-9,100,000; 9,100,000-9,200,000; 9,200,000-9,300,000; 9,300,000-9,400,000; 9,400,000-9,500,000, 9,500,000-9,600,000; 9,600,000-9,700,000; 9,700,000-9,800,000; 9,800,000-9,900,000; 9,900,000-10,000,000; 10,000,000-10,100,000; 10,100,000-10,200,000; 10,200,000-10,300,000; 10,300,000-10,400,000; 10,400,000-10,500,000, 10,500,000-10,600,000; 10,600,000-10,700,000; 10,700,000-10,800,000; 10,800,000-10,900,000; 10,900,000-11,000,000; 11,000,000-11,100,000; 11,100,000-11,200,000; 11,200,000-11,300,000; 11,300,000-11,400,000; 11,400,000-11,500,000, 11,500,000-11,600,000; 11,600,000-11,700,000; 11,700,000-11,800,000; 11,800,000-11,900,000; 11,900,000-12,000,000; 12,000,000-12,100,000; 12,100,000-12,200,000; 12,200,000-12,300,000; 12,300,000-12,400,000; 12,400,000-12,500,000, 12,500,000-12,600,000; 12,600,000-12,700,000; 12,700,000-12,800,000; 12,800,000-12,900,000; 12,900,000-13,000,000; 13,000,000-13,100,000; 13,100,000-13,200,000; 13,200,000-13,300,000; 13,300,000-13,400,000; 13,400,000-13,500,000, 13,500,000-13,600,000; 13,600,000-13,700,000; 13,700,000-13,800,000; 13,800,000-13,900,000; 13,900,000-14,000,000; 14,000,000-14,100,000; 14,100,000-14,200,000; 14,200,000-14,300,000; 14,300,000-14,400,000; 14,400,000-14,500,000, 14,500,000-14,600,000; 14,600,000-14,700,000; 14,700,000-14,800,000; 14,800,000-14,900,000; 14,900,000-15,000,000; 15,000,000-15,100,000; 15,100,000-15,200,000; 15,200,000-15,300,000; 15,300,000-15,400,000; 15,400,000-15,500,000, 15,500,000-15,600,000; 15,600,000-15,700,000; 15,700,000-15,800,000; 15,800,000-15,900,000; 15,900,000-16,000,000; 16,000,000-16,100,000; 16,100,000-16,200,000; 16,200,000-16,300,000; 16,300,000-16,400,000; 16,400,000-16,500,000, 16,500,000-16,600,000; 16,600,000-16,700,000; 16,700,000-16,800,000; 16,800,000-16,900,000; 16,900,000-17,000,000; 17,000,000-17,100,000; 17,100,000-17,200,000; 17,200,000-17,300,000; 17,300,000-17,400,000; 17,400,000-17,500,000, 17,500,000-17,600,000; 17,600,000-17,700,000; 17,700,000-17,800,000; 17,800,000-17,900,000; 17,900,000-18,000,000; 18,000,000-18,100,000; 18,100,000-18,200,000; 18,200,000-18,300,000; 18,300,000-18,400,000; 18,400,000-18,500,000, 18,500,000-18,600,000; 18,600,000-18,700,000; 18,700,000-18,800,000; 18,800,000-18,900,000; 18,900,000-19,000,000; 19,000,000-19,100,000; 19,100,000-19,200,000; 19,200,000-19,300,000; 19,300,000-19,400,000; 19,400,000-19,500,000, 19,500,000-19,600,000; 19,600,000-19,700,000; 19,700,000-19,800,000; 19,800,000-19,900,000; 19,900,000-20,000,000; 20,000,000-20,100,000; 20,100,000-20,200,000; 20,200,000-20,300,000; 20,300,000-20,400,000; 20,400,000-20,500,000, 20,500,000-20,600,000; 20,600,000-20,700,000; 20,700,000-20,800,000; 20,800,000-20,900,000; 20,900,000-21,000,000; 21,000,000-21,100,000; 21,100,000-21,200,000; 21,200,000-21,300,000; 21,300,000-21,400,000; 21,400,000-21,500,000, 21,500,000-21,600,000; 21,600,000-21,700,000; 21,700,000-21,800,000; 21,800,000-21,900,000; 21,900,000-22,000,000; 22,000,000-22,100,000; 22,100,000-22,200,000; 22,200,000-22,300,000; 22,300,000-22,400,000; 22,400,000-22,500,000, 22,500,000-22,600,000; 22,600,000-22,700,000; 22,700,000-22,800,000; 22,800,000-22,900,000; 22,900,000-23,000,000; 23,000,000-23,100,000; 23,100,000-23,200,000; 23,200,000-23,300,000; 23,300,000-23,400,000; 23,400,000-23,500,000, 23,500,000-23,600,000; 23,600,000-23,700,000; 23,700,000-23,800,000; 23,800,000-23,900,000; 23,900,000-24,000,000; 24,000,000-24,100,000; 24,100,000-24,200,000; 24,200,000-24,300,000; 24,300,000-24,400,000; 24,400,000-24,500,000, 24,500,000-24,600,000; 24,600,000-24,700,000; 24,700,000-24,800,000; 24,800,000-24,900,000; 24,900,000-25,000,000; 25,000,000-25,100,000; 25,100,000-25,200,000; 25,200,000-25,300,000; 25,300,000-25,400,000; 25,400,000-25,500,000, 25,500,000-25,600,000; 25,600,000-25,700,000; 25,700,000-25,800,000; 25,800,000-25,900,000; 25,900,000-26,000,000; 26,000,000-26,100,000; 26,100,000-26,200,000; 26,200,000-26,294,056이다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열의 범위 1-100,000 내지 26,200,000-26,294,056 중 임의의 것의 위치 1-1,000; 1,000-2,000; 2,000-3,000; 3,000-4,000; 4,000-5,000; 5,000-6,000; 6,000-7,000; 7,000-8,000; 8,000-9,000; 9,000-10,000; 10,000-11,000; 11,000-12,000; 12,000-13,000; 13,000-14,000; 14,000-15,000; 15,000-16,000; 16,000-17,000; 17,000-18,000; 18,000-19,000; 19,000-20,000; 20,000-21,000; 21,000-22,000; 22,000-23,000; 23,000-24,000; 24,000-25,000; 25,000-26,000; 26,000-27,000; 27,000-28,000; 28,000-29,000; 29,000-30,000; 30,000-31,000; 31,000-32,000; 32,000-33,000; 33,000-34,000; 34,000-35,000; 35,000-36,000; 36,000-37,000; 37,000-38,000; 38,000-39,000; 39,000-40,000; 40,000-41,000; 41,000-42,000; 42,000-43,000; 43,000-44,000; 44,000-45,000; 45,000-46,000; 46,000-47,000; 47,000-48,000; 48,000-49,000; 49,000-50,000; 50,000-51,000; 51,000-52,000; 52,000-53,000; 53,000-54,000; 54,000-55,000; 55,000-56,000; 56,000-57,000; 57,000-58,000; 58,000-59,000; 59,000-60,000; 60,000-61,000; 61,000-62,000; 62,000-63,000; 63,000-64,000; 64,000-65,000; 65,000-66,000; 66,000-67,000; 67,000-68,000; 68,000-69,000; 69,000-70,000; 70,000-71,000; 71,000-72,000; 72,000-73,000; 73,000-74,000; 74,000-75,000; 75,000-76,000; 76,000-77,000; 77,000-78,000; 78,000-79,000; 79,000-80,000; 80,000-81,000; 81,000-82,000; 82,000-83,000; 83,000-84,000; 84,000-85,000; 85,000-86,000; 86,000-87,000; 87,000-88,000; 88,000-89,000; 89,000-90,000; 90,000-91,000; 91,000-92,000; 92,000-93,000; 93,000-94,000; 94,000-95,000; 95,000-96,000; 96,000-97,000; 97,000-98,000; 98,000-99,000; 또는 99,000-100,000이다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 상기 나타낸 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열의 하위범위 1-1,000 내지 99,000-100,000 중 임의의 것의 위치 1-10; 10-20; 20-30; 30-40; 40-50; 50-60; 60-70; 70-80; 80-90; 90-100; 100-110; 110-120; 120-130; 130-140; 140-150; 150-160; 160-170; 170-180; 180-190; 190-200; 200-210; 210-220; 220-230; 230-240; 240-250; 250-260; 260-270; 270-280; 280-290; 290-300; 300-310; 310-320; 320-330; 330-340; 340-350; 350-360; 360-370; 370-380; 380-390; 390-400; 400-410; 410-420; 420-430; 430-440; 440-450; 450-460; 460-470; 470-480; 480-490; 490-500; 500-510; 510-520; 520-530; 530-540; 540-550; 550-560; 560-570; 570-580; 580-590; 590-600; 600-610; 610-620; 620-630; 630-640; 640-650; 650-660; 660-670; 670-680; 680-690; 690-700; 700-710; 710-720; 720-730; 730-740; 740-750; 750-760; 760-770; 770-780; 780-790; 790-800; 800-810; 810-820; 820-830; 830-840; 840-850; 850-860; 860-870; 870-880; 880-890; 890-900; 900-910; 910-920; 920-930; 930-940; 940-950; 950-960; 960-970; 970-980; 980-990; 990-1000; 1-100; 100-200; 200-300; 300-400; 400-500; 500-600; 600-700; 700-800; 800-900; 또는 900-1000이다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117에 제시된 서열로부터의 위치 약 1 내지 약 10; 약 10 내지 약 20; 약 20 내지 약 30; 약 30 내지 약 40; 약 40 내지 약 50; 약 50 내지 약 60; 약 60 내지 약 70; 약 70 내지 약 80; 약 80 내지 약 90; 약 90 내지 약 100; 약 100 내지 약 110; 약 110 내지 약 120; 약 120 내지 약 130; 약 130 내지 약 140; 약 140 내지 약 150; 약 150 내지 약 160; 약 160 내지 약 170; 약 170 내지 약 180; 약 180 내지 약 190; 약 190 내지 약 200; 약 200 내지 약 210; 약 210 내지 약 220; 약 220 내지 약 230; 약 230 내지 약 240; 약 240 내지 약 250; 약 250 내지 약 260; 약 260 내지 약 270; 약 270 내지 약 280; 약 280 내지 약 290; 약 290 내지 약 300; 약 300 내지 약 310; 약 310 내지 약 320; 약 320 내지 약 330; 약 330 내지 약 340; 약 340 내지 약 350; 약 350 내지 약 360; 약 360 내지 약 370; 약 370 내지 약 380; 약 380 내지 약 390; 약 390 내지 약 400; 약 400 내지 약 410; 약 410 내지 약 420; 약 420 내지 약 430; 약 430 내지 약 440; 약 440 내지 약 450; 약 450 내지 약 460; 약 460 내지 약 470; 약 470 내지 약 480; 약 480 내지 약 490; 약 490 내지 약 500; 약 500 내지 약 510; 약 510 내지 약 520; 약 520 내지 약 530; 약 530 내지 약 540; 약 540 내지 약 550; 약 550 내지 약 560; 약 560 내지 약 570; 약 570 내지 약 580; 약 580 내지 약 590; 약 590 내지 약 600; 약 600 내지 약 610; 약 610 내지 약 620; 약 620 내지 약 630; 약 630 내지 약 640; 약 640 내지 약 650; 약 650 내지 약 660; 약 660 내지 약 670; 약 670 내지 약 680; 약 680 내지 약 690; 약 690 내지 약 700; 약 700 내지 약 710; 약 710 내지 약 720; 약 720 내지 약 730; 약 730 내지 약 740; 약 740 내지 약 750; 약 750 내지 약 760; 약 760 내지 약 770; 약 770 내지 약 780; 약 780 내지 약 790; 약 790 내지 약 800; 약 800 내지 약 810; 약 810 내지 약 820; 약 820 내지 약 830; 약 830 내지 약 840; 약 840 내지 약 850; 약 850 내지 약 860; 약 860 내지 약 870; 약 870 내지 약 880; 약 880 내지 약 890; 약 890 내지 약 900; 약 900 내지 약 910; 약 910 내지 약 920; 약 920 내지 약 930; 약 930 내지 약 940; 약 940 내지 약 950; 약 950 내지 약 960; 약 960 내지 약 970; 약 970 내지 약 980; 약 980 내지 약 990; 약 990 내지 약 1000; 약 1,000 내지 약 2,000; 약 2,000 내지 약 3,000; 약 3,000 내지 약 4,000; 약 4,000 내지 약 5,000; 약 5,000 내지 약 6,000; 약 6,000 내지 약 7,000; 약 7,000 내지 약 8,000; 약 8,000 내지 약 9,000; 약 9,000 내지 약 10,000; 약 10,000 내지 약 11,000; 약 11,000 내지 약 12,000; 약 12,000 내지 약 13,000; 약 13,000 내지 약 14,000; 약 14,000 내지 약 15,000; 약 15,000 내지 약 16,000; 약 16,000 내지 약 17,000; 약 17,000 내지 약 18,000; 약 18,000 내지 약 19,000; 약 19,000 내지 약 20,000; 약 20,000 내지 약 21,000; 약 21,000 내지 약 22,000; 약 22,000 내지 약 23,000; 약 23,000 내지 약 24,000; 약 24,000 내지 약 25,000; 약 25,000 내지 약 26,000; 약 26,000 내지 약 27,000; 약 27,000 내지 약 28,000; 약 28,000 내지 약 29,000; 약 29,000 내지 약 30,000; 약 30,000 내지 약 31,000; 약 31,000 내지 약 32,000; 약 32,000 내지 약 33,000; 약 33,000 내지 약 34,000; 약 34,000 내지 약 35,000; 약 35,000 내지 약 36,000; 약 36,000 내지 약 37,000; 약 37,000 내지 약 38,000; 약 38,000 내지 약 39,000; 약 39,000 내지 약 40,000; 약 40,000 내지 약 41,000; 약 41,000 내지 약 42,000; 약 42,000 내지 약 43,000; 약 43,000 내지 약 44,000; 약 44,000 내지 약 45,000; 약 45,000 내지 약 46,000; 약 46,000 내지 약 47,000; 약 47,000 내지 약 48,000; 약 48,000 내지 약 49,000; 약 49,000 내지 약 50,000; 약 50,000 내지 약 51,000; 약 51,000 내지 약 52,000; 약 52,000 내지 약 53,000; 약 53,000 내지 약 54,000; 약 54,000 내지 약 55,000; 약 55,000 내지 약 56,000; 약 56,000 내지 약 57,000; 약 57,000 내지 약 58,000; 약 58,000 내지 약 59,000; 약 59,000 내지 약 60,000; 약 60,000 내지 약 61,000; 약 61,000 내지 약 62,000; 약 62,000 내지 약 63,000; 약 63,000 내지 약 64,000; 약 64,000 내지 약 65,000; 약 65,000 내지 약 66,000; 약 66,000 내지 약 67,000; 약 67,000 내지 약 68,000; 약 68,000 내지 약 69,000; 약 69,000 내지 약 70,000; 약 70,000 내지 약 71,000; 약 71,000 내지 약 72,000; 약 72,000 내지 약 73,000; 약 73,000 내지 약 74,000; 약 74,000 내지 약 75,000; 약 75,000 내지 약 76,000; 약 76,000 내지 약 77,000; 약 77,000 내지 약 78,000; 약 78,000 내지 약 79,000; 약 79,000 내지 약 80,000; 약 80,000 내지 약 81,000; 약 81,000 내지 약 82,000; 약 82,000 내지 약 83,000; 약 83,000 내지 약 84,000; 약 84,000 내지 약 85,000; 약 85,000 내지 약 86,000; 약 86,000 내지 약 87,000; 약 87,000 내지 약 88,000; 약 88,000 내지 약 89,000; 약 89,000 내지 약 90,000; 약 90,000 내지 약 91,000; 약 91,000 내지 약 92,000; 약 92,000 내지 약 93,000; 약 93,000 내지 약 94,000; 약 94,000 내지 약 95,000; 약 95,000 내지 약 96,000; 약 96,000 내지 약 97,000; 약 97,000 내지 약 98,000; 약 98,000 내지 약 99,000; 약 99,000 내지 약 100,000; 약 100,000 내지 약 200,000; 약 200,000 내지 약 300,000; 약 300,000 내지 약 400,000; 약 400,000 내지 약 500,000; 약 500,000 내지 약 600,000; 약 600,000 내지 약 700,000; 약 700,000 내지 약 800,000; 약 800,000 내지 약 900,000; 약 900,000 내지 약 1,000,000; 약 1,000,000 내지 약 1,100,000; 약 1,100,000 내지 약 1,200,000; 약 1,200,000 내지 약 1,300,000; 약 1,300,000 내지 약 1,400,000; 약 1,400,000 내지 약 1,500,000; 약 1,500,000 내지 약 1,600,000; 약 1,600,000 내지 약 1,700,000; 약 1,700,000 내지 약 1,800,000; 약 1,800,000 내지 약 1,900,000; 약 1,900,000 내지 약 2,000,000; 약 2,000,000 내지 약 2,100,000; 약 2,100,000 내지 약 2,200,000; 약 2,200,000 내지 약 2,300,000; 약 2,300,000 내지 약 2,400,000; 약 2,400,000 내지 약 2,500,000; 약 2,500,000 내지 약 2,600,000; 약 2,600,000 내지 약 2,700,000; 약 2,700,000 내지 약 2,800,000; 약 2,800,000 내지 약 2,900,000; 약 2,900,000 내지 약 3,000,000; 약 3,000,000 내지 약 3,100,000; 약 3,100,000 내지 약 3,200,000; 약 3,200,000 내지 약 3,300,000; 약 3,300,000 내지 약 3,400,000; 약 3,400,000 내지 약 3,500,000; 약 3,500,000 내지 약 3,600,000; 약 3,600,000 내지 약 3,700,000; 약 3,700,000 내지 약 3,800,000; 약 3,800,000 내지 약 3,900,000; 약 3,900,000 내지 약 4,000,000; 약 4,000,000 내지 약 4,100,000; 약 4,100,000 내지 약 4,200,000; 약 4,200,000 내지 약 4,300,000; 약 4,300,000 내지 약 4,400,000; 약 4,400,000 내지 약 4,500,000; 약 4,500,000 내지 약 4,600,000; 약 4,600,000 내지 약 4,700,000; 약 4,700,000 내지 약 4,800,000; 약 4,800,000 내지 약 4,900,000; 약 4,900,000 내지 약 5,000,000; 약 5,000,000 내지 약 5,100,000; 약 5,100,000 내지 약 5,200,000; 약 5,200,000 내지 약 5,300,000; 약 5,300,000 내지 약 5,400,000; 약 5,400,000 내지 약 5,500,000; 약 5,500,000 내지 약 5,600,000; 약 5,600,000 내지 약 5,700,000; 약 5,700,000 내지 약 5,800,000; 약 5,800,000 내지 약 5,900,000; 약 5,900,000 내지 약 6,000,000; 약 6,000,000 내지 약 6,100,000; 약 6,100,000 내지 약 6,200,000; 약 6,200,000 내지 약 6,300,000; 약 6,300,000 내지 약 6,400,000; 약 6,400,000 내지 약 6,500,000; 약 6,500,000 내지 약 6,600,000; 약 6,600,000 내지 약 6,700,000; 약 6,700,000 내지 약 6,800,000; 약 6,800,000 내지 약 6,900,000; 약 6,900,000 내지 약 7,000,000; 약 7,000,000 내지 약 7,100,000; 약 7,100,000 내지 약 7,200,000; 약 7,200,000 내지 약 7,300,000; 약 7,300,000 내지 약 7,400,000; 약 7,400,000 내지 약 7,500,000; 약 7,500,000 내지 약 7,600,000; 약 7,600,000 내지 약 7,700,000; 약 7,700,000 내지 약 7,800,000; 약 7,800,000 내지 약 7,900,000; 약 7,900,000 내지 약 8,000,000; 약 8,000,000 내지 약 8,100,000; 약 8,100,000 내지 약 8,200,000; 약 8,200,000 내지 약 8,300,000; 약 8,300,000 내지 약 8,400,000; 약 8,400,000 내지 약 8,500,000; 약 8,500,000 내지 약 8,600,000; 약 8,600,000 내지 약 8,700,000; 약 8,700,000 내지 약 8,800,000; 약 8,800,000 내지 약 8,900,000; 약 8,900,000 내지 약 9,000,000; 약 9,000,000 내지 약 9,100,000; 약 9,100,000 내지 약 9,200,000; 약 9,200,000 내지 약 9,300,000; 약 9,300,000 내지 약 9,400,000; 약 9,400,000 내지 약 9,500,000; 약 9,500,000 내지 약 9,600,000; 약 9,600,000 내지 약 9,700,000; 약 9,700,000 내지 약 9,800,000; 약 9,800,000 내지 약 9,900,000; 약 9,900,000 내지 약 10,000,000; 약 10,000,000 내지 약 10,100,000; 약 10,100,000 내지 약 10,200,000; 약 10,200,000 내지 약 10,300,000; 약 10,300,000 내지 약 10,400,000; 약 10,400,000 내지 약 10,500,000; 약 10,500,000 내지 약 10,600,000; 약 10,600,000 내지 약 10,700,000; 약 10,700,000 내지 약 10,800,000; 약 10,800,000 내지 약 10,900,000; 약 10,900,000 내지 약 11,000,000; 약 11,000,000 내지 약 11,100,000; 약 11,100,000 내지 약 11,200,000; 약 11,200,000 내지 약 11,300,000; 약 11,300,000 내지 약 11,400,000; 약 11,400,000 내지 약 11,500,000; 약 11,500,000 내지 약 11,600,000; 약 11,600,000 내지 약 11,700,000; 약 11,700,000 내지 약 11,800,000; 약 11,800,000 내지 약 11,900,000; 약 11,900,000 내지 약 12,000,000; 약 12,000,000 내지 약 12,100,000; 약 12,100,000 내지 약 12,200,000; 약 12,200,000 내지 약 12,300,000; 약 12,300,000 내지 약 12,400,000; 약 12,400,000 내지 약 12,500,000; 약 12,500,000 내지 약 12,600,000; 약 12,600,000 내지 약 12,700,000; 약 12,700,000 내지 약 12,800,000; 약 12,800,000 내지 약 12,900,000; 약 12,900,000 내지 약 13,000,000; 약 13,000,000 내지 약 13,100,000; 약 13,100,000 내지 약 13,200,000; 약 13,200,000 내지 약 13,300,000; 약 13,300,000 내지 약 13,400,000; 약 13,400,000 내지 약 13,500,000; 약 13,500,000 내지 약 13,600,000; 약 13,600,000 내지 약 13,700,000; 약 13,700,000 내지 약 13,800,000; 약 13,800,000 내지 약 13,900,000; 약 13,900,000 내지 약 14,000,000; 약 14,000,000 내지 약 14,100,000; 약 14,100,000 내지 약 14,200,000; 약 14,200,000 내지 약 14,300,000; 약 14,300,000 내지 약 14,400,000; 약 14,400,000 내지 약 14,500,000; 약 14,500,000 내지 약 14,600,000; 약 14,600,000 내지 약 14,700,000; 약 14,700,000 내지 약 14,800,000; 약 14,800,000 내지 약 14,900,000; 약 14,900,000 내지 약 15,000,000; 약 15,000,000 내지 약 15,100,000; 약 15,100,000 내지 약 15,200,000; 약 15,200,000 내지 약 15,300,000; 약 15,300,000 내지 약 15,400,000; 약 15,400,000 내지 약 15,500,000; 약 15,500,000 내지 약 15,600,000; 약 15,600,000 내지 약 15,700,000; 약 15,700,000 내지 약 15,800,000; 약 15,800,000 내지 약 15,900,000; 약 15,900,000 내지 약 16,000,000; 약 16,000,000 내지 약 16,100,000; 약 16,100,000 내지 약 16,200,000; 약 16,200,000 내지 약 16,300,000; 약 16,300,000 내지 약 16,400,000; 약 16,400,000 내지 약 16,500,000; 약 16,500,000 내지 약 16,600,000; 약 16,600,000 내지 약 16,700,000; 약 16,700,000 내지 약 16,800,000; 약 16,800,000 내지 약 16,900,000; 약 16,900,000 내지 약 17,000,000; 약 17,000,000 내지 약 17,100,000; 약 17,100,000 내지 약 17,200,000; 약 17,200,000 내지 약 17,300,000; 약 17,300,000 내지 약 17,400,000; 약 17,400,000 내지 약 17,500,000; 약 17,500,000 내지 약 17,600,000; 약 17,600,000 내지 약 17,700,000; 약 17,700,000 내지 약 17,800,000; 약 17,800,000 내지 약 17,900,000; 약 17,900,000 내지 약 18,000,000; 약 18,000,000 내지 약 18,100,000; 약 18,100,000 내지 약 18,200,000; 약 18,200,000 내지 약 18,300,000; 약 18,300,000 내지 약 18,400,000; 약 18,400,000 내지 약 18,500,000; 약 18,500,000 내지 약 18,600,000; 약 18,600,000 내지 약 18,700,000; 약 18,700,000 내지 약 18,800,000; 약 18,800,000 내지 약 18,900,000; 약 18,900,000 내지 약 19,000,000; 약 19,000,000 내지 약 19,100,000; 약 19,100,000 내지 약 19,200,000; 약 19,200,000 내지 약 19,300,000; 약 19,300,000 내지 약 19,400,000; 약 19,400,000 내지 약 19,500,000; 약 19,500,000 내지 약 19,600,000; 약 19,600,000 내지 약 19,700,000; 약 19,700,000 내지 약 19,800,000; 약 19,800,000 내지 약 19,900,000; 약 19,900,000 내지 약 20,000,000; 약 20,000,000 내지 약 20,100,000; 약 20,100,000 내지 약 20,200,000; 약 20,200,000 내지 약 20,300,000; 약 20,300,000 내지 약 20,400,000; 약 20,400,000 내지 약 20,500,000; 약 20,500,000 내지 약 20,600,000; 약 20,600,000 내지 약 20,700,000; 약 20,700,000 내지 약 20,800,000; 약 20,800,000 내지 약 20,900,000; 약 20,900,000 내지 약 21,000,000; 약 21,000,000 내지 약 21,100,000; 약 21,100,000 내지 약 21,200,000; 약 21,200,000 내지 약 21,300,000; 약 21,300,000 내지 약 21,400,000; 약 21,400,000 내지 약 21,500,000; 약 21,500,000 내지 약 21,600,000; 약 21,600,000 내지 약 21,700,000; 약 21,700,000 내지 약 21,800,000; 약 21,800,000 내지 약 21,900,000; 약 21,900,000 내지 약 22,000,000; 약 22,000,000 내지 약 22,100,000; 약 22,100,000 내지 약 22,200,000; 약 22,200,000 내지 약 22,300,000; 약 22,300,000 내지 약 22,400,000; 약 22,400,000 내지 약 22,500,000; 약 22,500,000 내지 약 22,600,000; 약 22,600,000 내지 약 22,700,000; 약 22,700,000 내지 약 22,800,000; 약 22,800,000 내지 약 22,900,000; 약 22,900,000 내지 약 23,000,000; 약 23,000,000 내지 약 23,100,000; 약 23,100,000 내지 약 23,200,000; 약 23,200,000 내지 약 23,300,000; 약 23,300,000 내지 약 23,400,000; 약 23,400,000 내지 약 23,500,000; 약 23,500,000 내지 약 23,600,000; 약 23,600,000 내지 약 23,700,000; 약 23,700,000 내지 약 23,800,000; 약 23,800,000 내지 약 23,900,000; 약 23,900,000 내지 약 24,000,000; 약 24,000,000 내지 약 24,100,000; 약 24,100,000 내지 약 24,200,000; 약 24,200,000 내지 약 24,300,000; 약 24,300,000 내지 약 24,400,000; 약 24,400,000 내지 약 24,500,000; 약 24,500,000 내지 약 24,600,000; 약 24,600,000 내지 약 24,700,000; 약 24,700,000 내지 약 24,800,000; 약 24,800,000 내지 약 24,900,000; 약 24,900,000 내지 약 25,000,000; 약 25,000,000 내지 약 25,100,000; 약 25,100,000 내지 약 25,200,000; 약 25,200,000 내지 약 25,300,000; 약 25,300,000 내지 약 25,400,000; 약 25,400,000 내지 약 25,500,000; 약 25,500,000 내지 약 25,600,000; 약 25,600,000 내지 약 25,700,000; 약 25,700,000 내지 약 25,800,000; 약 25,800,000 내지 약 25,900,000; 약 25,900,000 내지 약 26,000,000 상류 또는 하류에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117에 제시된 서열로부터의 적어도 약 10; 적어도 약 20; 적어도 약 30; 적어도 약 40; 적어도 약 50; 적어도 약 60; 적어도 약 70; 적어도 약 80; 적어도 약 90; 적어도 약 100; 적어도 약 110; 적어도 약 120; 적어도 약 130; 적어도 약 140; 적어도 약 150; 적어도 약 160; 적어도 약 170; 적어도 약 180; 적어도 약 190; 적어도 약 200; 적어도 약 210; 적어도 약 220; 적어도 약 230; 적어도 약 240; 적어도 약 250; 적어도 약 260; 적어도 약 270; 적어도 약 280; 적어도 약 290; 적어도 약 300; 적어도 약 310; 적어도 약 320; 적어도 약 330; 적어도 약 340; 적어도 약 350; 적어도 약 360; 적어도 약 370; 약 380; 적어도 약 390; 적어도 약 400; 적어도 약 410; 적어도 약 420; 적어도 약 430; 적어도 약 440; 적어도 약 450; 적어도 약 460; 적어도 약 470; 적어도 약 480; 적어도 약 490; 적어도 약 500; 적어도 약 510; 적어도 약 520; 적어도 약 530; 적어도 약 540; 적어도 약 550; 적어도 약 560; 적어도 약 570; 적어도 약 580; 적어도 약 590; 적어도 약 600; 적어도 약 610; 적어도 약 620; 적어도 약 630; 적어도 약 640; 적어도 약 650; 적어도 약 660; 적어도 약 670; 적어도 약 680; 적어도 약 690; 적어도 약 700; 적어도 약 710; 적어도 약 720; 적어도 약 730; 적어도 약 740; 적어도 약 750; 적어도 약 760; 적어도 약 770; 적어도 약 780; 적어도 약 790; 적어도 약 800; 적어도 약 810; 적어도 약 820; 적어도 약 830; 적어도 약 840; 적어도 약 850; 적어도 약 860; 적어도 약 870; 적어도 약 880; 적어도 약 890; 적어도 약 900; 적어도 약 910; 적어도 약 920; 적어도 약 930; 적어도 약 940; 적어도 약 950; 적어도 약 960; 적어도 약 970; 적어도 약 980; 적어도 약 990; 적어도 약 1,000; 적어도 약 2,000; 적어도 약 3,000; 적어도 약 4,000; 적어도 약 5,000; 적어도 약 6,000; 적어도 약 7,000; 적어도 약 8,000; 적어도 약 9,000; 적어도 약 10,000; 적어도 약 11,000; 적어도 약 12,000; 적어도 약 13,000; 적어도 약 14,000; 적어도 약 15,000; 적어도 약 16,000; 적어도 약 17,000; 적어도 약 18,000; 적어도 약 19,000; 적어도 약 20,000; 적어도 약 21,000; 적어도 약 22,000; 적어도 약 23,000; 적어도 약 24,000; 적어도 약 25,000; 적어도 약 26,000; 적어도 약 27,000; 적어도 약 28,000; 적어도 약 29,000; 적어도 약 30,000; 적어도 약 31,000; 적어도 약 32,000; 적어도 약 33,000; 적어도 약 34,000; 적어도 약 35,000; 적어도 약 36,000; 적어도 약 37,000; 적어도 약 38,000; 적어도 약 39,000; 적어도 약 40,000; 적어도 약 41,000; 적어도 약 42,000; 적어도 약 43,000; 적어도 약 44,000; 적어도 약 45,000; 적어도 약 46,000; 적어도 약 47,000; 적어도 약 48,000; 적어도 약 49,000; 적어도 약 50,000; 적어도 약 51,000; 적어도 약 52,000; 적어도 약 53,000; 적어도 약 54,000; 적어도 약 55,000; 적어도 약 56,000; 적어도 약 57,000; 적어도 약 58,000; 적어도 약 59,000; 적어도 약 60,000; 적어도 약 61,000; 적어도 약 62,000; 적어도 약 63,000; 적어도 약 64,000; 적어도 약 65,000; 적어도 약 66,000; 적어도 약 67,000; 적어도 약 68,000; 적어도 약 69,000; 적어도 약 70,000; 적어도 약 71,000; 적어도 약 72,000; 적어도 약 73,000; 적어도 약 74,000; 적어도 약 75,000; 적어도 약 76,000; 적어도 약 77,000; 적어도 약 78,000; 적어도 약 79,000; 적어도 약 80,000; 적어도 약 81,000; 적어도 약 82,000; 적어도 약 83,000; 적어도 약 84,000; 적어도 약 85,000; 적어도 약 86,000; 적어도 약 87,000; 적어도 약 88,000; 적어도 약 89,000; 적어도 약 90,000; 적어도 약 91,000; 적어도 약 92,000; 적어도 약 93,000; 적어도 약 94,000; 적어도 약 95,000; 적어도 약 96,000; 적어도 약 97,000; 적어도 약 98,000; 적어도 약 99,000; 적어도 약 100,000; 적어도 약 200,000; 적어도 약 300,000; 적어도 약 400,000; 적어도 약 500,000; 적어도 약 600,000; 적어도 약 700,000; 적어도 약 800,000; 적어도 약 900,000; 적어도 약 1,000,000; 적어도 약 1,100,000; 적어도 약 1,200,000; 적어도 약 1,300,000; 적어도 약 1,400,000; 적어도 약 1,500,000; 적어도 약 1,600,000; 적어도 약 1,700,000; 적어도 약 1,800,000; 적어도 약 1,900,000; 적어도 약 2,000,000; 적어도 약 2,100,000; 적어도 약 2,200,000; 적어도 약 2,300,000; 적어도 약 2,400,000; 적어도 약 2,500,000; 적어도 약 2,600,000; 적어도 약 2,700,000; 적어도 약 2,800,000; 적어도 약 2,900,000; 적어도 약 3,000,000; 적어도 약 3,100,000; 적어도 약 3,200,000; 적어도 약 3,300,000; 적어도 약 3,400,000; 적어도 약 3,500,000; 적어도 약 3,600,000; 적어도 약 3,700,000; 적어도 약 3,800,000; 적어도 약 3,900,000; 적어도 약 4,000,000; 적어도 약 4,100,000; 적어도 약 4,200,000; 적어도 약 4,300,000; 적어도 약 4,400,000; 적어도 약 4,500,000; 적어도 약 4,600,000; 적어도 약 4,700,000; 적어도 약 4,800,000; 적어도 약 4,900,000; 적어도 약 5,000,000; 적어도 약 5,100,000; 적어도 약 5,200,000; 적어도 약 5,300,000; 적어도 약 5,400,000; 적어도 약 5,500,000; 적어도 약 5,600,000; 적어도 약 5,700,000; 적어도 약 5,800,000; 적어도 약 5,900,000; 적어도 약 6,000,000; 적어도 약 6,100,000; 적어도 약 6,200,000; 적어도 약 6,300,000; 적어도 약 6,400,000; 적어도 약 6,500,000; 적어도 약 6,600,000; 적어도 약 6,700,000; 적어도 약 6,800,000; 적어도 약 6,900,000; 적어도 약 7,000,000; 적어도 약 7,100,000; 적어도 약 7,200,000; 적어도 약 7,300,000; 적어도 약 7,400,000; 적어도 약 7,500,000; 적어도 약 7,600,000; 적어도 약 7,700,000; 적어도 약 7,800,000; 적어도 약 7,900,000; 적어도 약 8,000,000; 적어도 약 8,100,000; 적어도 약 8,200,000; 적어도 약 8,300,000; 적어도 약 8,400,000; 적어도 약 8,500,000; 적어도 약 8,600,000; 적어도 약 8,700,000; 적어도 약 8,800,000; 적어도 약 8,900,000; 적어도 약 9,000,000; 적어도 약 9,100,000; 적어도 약 9,200,000; 적어도 약 9,300,000; 적어도 약 9,400,000; 적어도 약 9,500,000; 적어도 약 9,600,000; 적어도 약 9,700,000; 적어도 약 9,800,000; 적어도 약 9,900,000; 적어도 약 10,000,000; 적어도 약 10,100,000; 적어도 약 10,200,000; 적어도 약 10,300,000; 적어도 약 10,400,000; 적어도 약 10,500,000; 적어도 약 10,600,000; 적어도 약 10,700,000; 적어도 약 10,800,000; 적어도 약 10,900,000; 적어도 약 11,000,000; 적어도 약 11,100,000; 적어도 약 11,200,000; 적어도 약 11,300,000; 적어도 약 11,400,000; 적어도 약 11,500,000; 적어도 약 11,600,000; 적어도 약 11,700,000; 적어도 약 11,800,000; 적어도 약 11,900,000; 적어도 약 12,000,000; 적어도 약 12,100,000; 적어도 약 12,200,000; 적어도 약 12,300,000; 적어도 약 12,400,000; 적어도 약 12,500,000; 적어도 약 12,600,000; 적어도 약 12,700,000; 적어도 약 12,800,000; 적어도 약 12,900,000; 적어도 약 13,000,000; 적어도 약 13,100,000; 적어도 약 13,200,000; 적어도 약 13,300,000; 적어도 약 13,400,000; 적어도 약 13,500,000; 적어도 약 13,600,000; 적어도 약 13,700,000; 적어도 약 13,800,000; 적어도 약 13,900,000; 적어도 약 14,000,000; 적어도 약 14,100,000; 적어도 약 14,200,000; 적어도 약 14,300,000; 적어도 약 14,400,000; 적어도 약 14,500,000; 적어도 약 14,600,000; 적어도 약 14,700,000; 적어도 약 14,800,000; 적어도 약 14,900,000; 적어도 약 15,000,000; 적어도 약 15,100,000; 적어도 약 15,200,000; 적어도 약 15,300,000; 적어도 약 15,400,000; 적어도 약 15,500,000; 적어도 약 15,600,000; 적어도 약 15,700,000; 적어도 약 15,800,000; 적어도 약 15,900,000; 적어도 약 16,000,000; 적어도 약 16,100,000; 적어도 약 16,200,000; 적어도 약 16,300,000; 적어도 약 16,400,000; 적어도 약 16,500,000; 적어도 약 16,600,000; 적어도 약 16,700,000; 적어도 약 16,800,000; 적어도 약 16,900,000; 적어도 약 17,000,000; 적어도 약 17,100,000; 적어도 약 17,200,000; 적어도 약 17,300,000; 적어도 약 17,400,000; 적어도 약 17,500,000; 적어도 약 17,600,000; 적어도 약 17,700,000; 적어도 약 17,800,000; 적어도 약 17,900,000; 적어도 약 18,000,000; 적어도 약 18,100,000; 적어도 약 18,200,000; 적어도 약 18,300,000; 적어도 약 18,400,000; 적어도 약 18,500,000; 적어도 약 18,600,000; 적어도 약 18,700,000; 적어도 약 18,800,000; 적어도 약 18,900,000; 적어도 약 19,000,000; 적어도 약 19,100,000; 적어도 약 19,200,000; 적어도 약 19,300,000; 적어도 약 19,400,000; 적어도 약 19,500,000; 적어도 약 19,600,000; 적어도 약 19,700,000; 적어도 약 19,800,000; 적어도 약 19,900,000; 적어도 약 20,000,000; 적어도 약 20,100,000; 적어도 약 20,200,000; 적어도 약 20,300,000; 적어도 약 20,400,000; 적어도 약 20,500,000; 적어도 약 20,600,000; 적어도 약 20,700,000; 적어도 약 20,800,000; 적어도 약 20,900,000; 적어도 약 21,000,000; 적어도 약 21,100,000; 적어도 약 21,200,000; 적어도 약 21,300,000; 적어도 약 21,400,000; 적어도 약 21,500,000; 적어도 약 21,600,000; 적어도 약 21,700,000; 적어도 약 21,800,000; 적어도 약 21,900,000; 적어도 약 22,000,000; 적어도 약 22,100,000; 적어도 약 22,200,000; 적어도 약 22,300,000; 적어도 약 22,400,000; 적어도 약 22,500,000; 적어도 약 22,600,000; 적어도 약 22,700,000; 적어도 약 22,800,000; 적어도 약 22,900,000; 적어도 약 23,000,000; 적어도 약 23,100,000; 적어도 약 23,200,000; 적어도 약 23,300,000; 적어도 약 23,400,000; 적어도 약 23,500,000; 적어도 약 23,600,000; 적어도 약 23,700,000; 적어도 약 23,800,000; 적어도 약 23,900,000; 적어도 약 24,000,000; 적어도 약 24,100,000; 적어도 약 24,200,000; 적어도 약 24,300,000; 적어도 약 24,400,000; 적어도 약 24,500,000; 적어도 약 24,600,000; 적어도 약 24,700,000; 적어도 약 24,800,000; 적어도 약 24,900,000; 적어도 약 25,000,000; 적어도 약 25,100,000; 적어도 약 25,200,000; 적어도 약 25,300,000; 적어도 약 25,400,000; 적어도 약 25,500,000; 적어도 약 25,600,000; 적어도 약 25,700,000; 적어도 약 25,800,000; 적어도 약 25,900,000, 적어도 26,000,000 핵염기 하류 또는 상류에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117에 제시된 서열로부터의 약 10; 약 20; 약 30; 약 40; 약 50; 약 60; 약 70; 약 80; 약 90; 약 100; 약 110; 약 120; 약 130; 약 140; 약 150; 약 160; 약 170; 약 180; 약 190; 약 200; 약 210; 약 220; 약 230; 약 240; 약 250; 약 260; 약 270; 약 280; 약 290; 약 300; 약 310; 약 320; 약 330; 약 340; 약 350; 약 360; 약 370; 약 380; 약 390; 약 400; 약 410; 약 420; 약 430; 약 440; 약 450; 약 460; 약 470; 약 480; 약 490; 약 500; 약 510; 약 520; 약 530; 약 540; 약 550; 약 560; 약 570; 약 580; 약 590; 약 600; 약 610; 약 620; 약 630; 약 640; 약 650; 약 660; 약 670; 약 680; 약 690; 약 700; 약 710; 약 720; 약 730; 약 740; 약 750; 약 760; 약 770; 약 780; 약 790; 약 800; 약 810; 약 820; 약 830; 약 840; 약 850; 약 860; 약 870; 약 880; 약 890; 약 900; 약 910; 약 920; 약 930; 약 940; 약 950; 약 960; 약 970; 약 980; 약 990; 약 1,000; 약 2,000; 약 3,000; 약 4,000; 약 5,000; 약 6,000; 약 7,000; 약 8,000; 약 9,000; 약 10,000; 약 11,000; 약 12,000; 약 13,000; 약 14,000; 약 15,000; 약 16,000; 약 17,000; 약 18,000; 약 19,000; 약 20,000; 약 21,000; 약 22,000; 약 23,000; 약 24,000; 약 25,000; 약 26,000; 약 27,000; 약 28,000; 약 29,000; 약 30,000; 약 31,000; 약 32,000; 약 33,000; 약 34,000; 약 35,000; 약 36,000; 약 37,000; 약 38,000; 약 39,000; 약 40,000; 약 41,000; 약 42,000; 약 43,000; 약 44,000; 약 45,000; 약 46,000; 약 47,000; 약 48,000; 약 49,000; 약 50,000; 약 51,000; 약 52,000; 약 53,000; 약 54,000; 약 55,000; 약 56,000; 약 57,000; 약 58,000; 약 59,000; 약 60,000; 약 61,000; 약 62,000; 약 63,000; 약 64,000; 약 65,000; 약 66,000; 약 67,000; 약 68,000; 약 69,000; 약 70,000; 약 71,000; 약 72,000; 약 73,000; 약 74,000; 약 75,000; 약 76,000; 약 77,000; 약 78,000; 약 79,000; 약 80,000; 약 81,000; 약 82,000; 약 83,000; 약 84,000; 약 85,000; 약 86,000; 약 87,000; 약 88,000; 약 89,000; 약 90,000; 약 91,000; 약 92,000; 약 93,000; 약 94,000; 약 95,000; 약 96,000; 약 97,000; 약 98,000; 약 99,000; 약 100,000; 약 200,000; 약 300,000; 약 400,000; 약 500,000; 약 600,000; 약 700,000; 약 800,000; 약 900,000; 약 1,000,000; 약 1,100,000; 약 1,200,000; 약 1,300,000; 약 1,400,000; 약 1,500,000; 약 1,600,000; 약 1,700,000; 약 1,800,000; 약 1,900,000; 약 2,000,000; 약 2,100,000; 약 2,200,000; 약 2,300,000; 약 2,400,000; 약 2,500,000; 약 2,600,000; 약 2,700,000; 약 2,800,000; 약 2,900,000; 약 3,000,000; 약 3,100,000; 약 3,200,000; 약 3,300,000; 약 3,400,000; 약 3,500,000; 약 3,600,000; 약 3,700,000; 약 3,800,000; 약 3,900,000; 약 4,000,000; 약 4,100,000; 약 4,200,000; 약 4,300,000; 약 4,400,000; 약 4,500,000; 약 4,600,000; 약 4,700,000; 약 4,800,000; 약 4,900,000; 약 5,000,000; 약 5,100,000; 약 5,200,000; 약 5,300,000; 약 5,400,000; 약 5,500,000; 약 5,600,000; 약 5,700,000; 약 5,800,000; 약 5,900,000; 약 6,000,000; 약 6,100,000; 약 6,200,000; 약 6,300,000; 약 6,400,000; 약 6,500,000; 약 6,600,000; 약 6,700,000; 약 6,800,000; 약 6,900,000; 약 7,000,000; 약 7,100,000; 약 7,200,000; 약 7,300,000; 약 7,400,000; 약 7,500,000; 약 7,600,000; 약 7,700,000; 약 7,800,000; 약 7,900,000; 약 8,000,000; 약 8,100,000; 약 8,200,000; 약 8,300,000; 약 8,400,000; 약 8,500,000; 약 8,600,000; 약 8,700,000; 약 8,800,000; 약 8,900,000; 약 9,000,000; 약 9,100,000; 약 9,200,000; 약 9,300,000; 약 9,400,000; 약 9,500,000; 약 9,600,000; 약 9,700,000; 약 9,800,000; 약 9,900,000; 약 10,000,000; 약 10,100,000; 약 10,200,000; 약 10,300,000; 약 10,400,000; 약 10,500,000; 약 10,600,000; 약 10,700,000; 약 10,800,000; 약 10,900,000; 약 11,000,000; 약 11,100,000; 약 11,200,000; 약 11,300,000; 약 11,400,000; 약 11,500,000; 약 11,600,000; 약 11,700,000; 약 11,800,000; 약 11,900,000; 약 12,000,000; 약 12,100,000; 약 12,200,000; 약 12,300,000; 약 12,400,000; 약 12,500,000; 약 12,600,000; 약 12,700,000; 약 12,800,000; 약 12,900,000; 약 13,000,000; 약 13,100,000; 약 13,200,000; 약 13,300,000; 약 13,400,000; 약 13,500,000; 약 13,600,000; 약 13,700,000; 약 13,800,000; 약 13,900,000; 약 14,000,000; 약 14,100,000; 약 14,200,000; 약 14,300,000; 약 14,400,000; 약 14,500,000; 약 14,600,000; 약 14,700,000; 약 14,800,000; 약 14,900,000; 약 15,000,000; 약 15,100,000; 약 15,200,000; 약 15,300,000; 약 15,400,000; 약 15,500,000; 약 15,600,000; 약 15,700,000; 약 15,800,000; 약 15,900,000; 약 16,000,000; 약 16,100,000; 약 16,200,000; 약 16,300,000; 약 16,400,000; 약 16,500,000; 약 16,600,000; 약 16,700,000; 약 16,800,000; 약 16,900,000; 약 17,000,000; 약 17,100,000; 약 17,200,000; 약 17,300,000; 약 17,400,000; 약 17,500,000; 약 17,600,000; 약 17,700,000; 약 17,800,000; 약 17,900,000; 약 18,000,000; 약 18,100,000; 약 18,200,000; 약 18,300,000; 약 18,400,000; 약 18,500,000; 약 18,600,000; 약 18,700,000; 약 18,800,000; 약 18,900,000; 약 19,000,000; 약 19,100,000; 약 19,200,000; 약 19,300,000; 약 19,400,000; 약 19,500,000; 약 19,600,000; 약 19,700,000; 약 19,800,000; 약 19,900,000; 약 20,000,000; 약 20,100,000; 약 20,200,000; 약 20,300,000; 약 20,400,000; 약 20,500,000; 약 20,600,000; 약 20,700,000; 약 20,800,000; 약 20,900,000; 약 21,000,000; 약 21,100,000; 약 21,200,000; 약 21,300,000; 약 21,400,000; 약 21,500,000; 약 21,600,000; 약 21,700,000; 약 21,800,000; 약 21,900,000; 약 22,000,000; 약 22,100,000; 약 22,200,000; 약 22,300,000; 약 22,400,000; 약 22,500,000; 약 22,600,000; 약 22,700,000; 약 22,800,000; 약 22,900,000; 약 23,000,000; 약 23,100,000; 약 23,200,000; 약 23,300,000; 약 23,400,000; 약 23,500,000; 약 23,600,000; 약 23,700,000; 약 23,800,000; 약 23,900,000; 약 24,000,000; 약 24,100,000; 약 24,200,000; 약 24,300,000; 약 24,400,000; 약 24,500,000; 약 24,600,000; 약 24,700,000; 약 24,800,000; 약 24,900,000; 약 25,000,000; 약 25,100,000; 약 25,200,000; 약 25,300,000; 약 25,400,000; 약 25,500,000; 약 25,600,000; 약 25,700,000; 약 25,800,000; 약 25,900,000, 26,000,000 핵염기 하류 또는 상류에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 높은 복잡성 서열에 위치한다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 높은 복잡성 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 높은 복잡성 서열에 위치한다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 높은 복잡성 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 낮은 복잡성 서열에 위치하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 레트로트랜스포손 서열 내에 위치하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 Alu 반복부 (CHO Alu-등가물) 등 내에 위치하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 길게 산재된 핵 요소 (LINE) 내에 위치하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된 통합 부위/유전자좌는 CHO Alu-등가물 서열을 함유하지 않는다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 낮은 복잡성 서열에 위치하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 레트로트랜스포손 서열 내에 위치하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 Alu 반복부 (CHO Alu-등가물) 등 내에 위치하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 길게 산재된 핵 요소 (LINE) 내에 위치하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된 통합 부위/유전자좌는 CHO Alu-등가물 서열을 함유하지 않는다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 다수의 낮은 복잡성 서열로 구성되지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 레트로트랜스포손 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 Alu 반복부를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 길게 산재된 핵 요소 (LINE)를 포함하지 않는다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 다수의 낮은 복잡성 서열로 구성되지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 레트로트랜스포손 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 Alu 반복부를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 길게 산재된 핵 요소 (LINE)를 포함하지 않는다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 낮은 복잡성 서열에 의해 플랭킹되지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 레트로트랜스포손 서열에 의해 플랭킹되지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 Alu 반복부에 의해 플랭킹되지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 길게 산재된 핵 요소 (LINE)에 의해 플랭킹되지 않는다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 낮은 복잡성 서열에 의해 플랭킹되지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 레트로트랜스포손 서열에 의해 플랭킹되지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 Alu 반복부에 의해 플랭킹되지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 길게 산재된 핵 요소 (LINE)에 의해 플랭킹되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "낮은 복잡성 서열"은 반복 요소, 반복 단위 또는 반복부로서 공지되기도 한 반복 서열의 존재를 특징으로 하는 핵산 서열을 지칭한다. 반대로, 용어 "높은 복잡성 서열"은 다수의 반복 서열이 없는 것을 특징으로 하는 핵산 서열을 지칭한다. 반복 서열의 주요 유형은 직렬 반복부, 및 산재 반복부이며, 이는 전위 요소, 예컨대 레트로트랜스포손을 포함한다.
레트로트랜스포손 (클래스 I 전위 요소 또는 RNA 중간체를 통한 트랜스포손이라고도 함)은 RNA 전위 중간체를 사용하는 역전사 프로세스를 통해 RNA를 다시 DNA로 전환시킴으로써 자신을 복사하여 상이한 게놈 위치에 붙여넣는 유전자 성분 (트랜스포손)의 유형이다. 레트로트랜스포손에는 2가지 주요 유형, 즉 긴 말단 반복부 (LTR)와 비-긴 말단 반복부 (비-LTR)가 있다. 레트로트랜스포손은 서열 및 전위 방법에 기초하여 분류된다. 비-LTR은 주로 2가지 유형, 즉 LINE (길게 산재된 핵 요소)과 SINE (짧게 산재된 핵 요소)로 분류된다. Alu는 영장류에서 가장 흔한 SINE이다.
Alu 패밀리는 인간 게놈을 포함한 영장류 게놈 내의 반복적 요소의 패밀리이다. Alu 요소는 원래 아르트로박터 루테우스(Arthrobacter luteus) (Alu) 제한 엔도뉴클레아제의 작용을 특징으로 하는 짧은 DNA 연장물이다. Alu 요소는 인간 게놈 전체에 분산된 백만 개 초과의 카피를 함유하는, 가장 풍부한 전위 요소이다. 현대의 Alu 요소는 약 300개 염기쌍 길이이므로, 반복 DNA 요소 클래스 중 짧게 산재된 핵 요소 (SINE)로서 분류된다. 전형적인 구조는 5'-파트 A-A5TACA6-파트 B-폴리A 테일-3' (서열식별번호: 25)이며, 여기서 파트 A 및 파트 B ("왼쪽 아암" 및 "오른쪽 아암"으로서 공지되기도 함)는 유사한 뉴클레오티드 서열이다. Alu에서는 2개의 주요 프로모터 "박스": 컨센서스 TGGCTCACGCC (서열식별번호: 26)가 있는 5' A 박스 및 컨센서스 GWTCGAGAC (IUPAC 핵산 표기법)가 있는 3' B 박스가 발견된다.
본 개시내용의 맥락에서, 본원에 개시된 크리세툴루스 그리세우스 서열에 적용된 바와 같은 Alu 요소에 대한 언급은 CHO Alu-등가물, 즉 문헌 [Haynes et al. (1981) Molecular and Cellular Biology 1(7):573-583]에 기재된 바와 같은 크리세툴루스 그리세우스의 게놈에 존재하는 Alu-유사 요소를 지칭한다. 상기 문헌 [Haynes et al.]에는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)의 게놈에 산재된 주요 데옥시리보핵산 반복부에 대한 컨센서스 서열이 기재되었으며, 이는 인간 Alu 서열 및 마우스 B1 산재된 반복 서열과 광범위하게 상동이다. CHO 컨센서스 서열은 인간 Alu 서열과 상당한 상동성을 나타내기 때문에 CHO Alu-등가물 서열이라 불린다. CHO Alu-등가물 패밀리 구성원을 둘러싼 보존된 구조를 인식할 수 있다. 이는 인간 Alu 및 마우스 Bi 서열을 둘러싸는 것과 유사하며 하기와 같이 표시된다: 직접 반복부 CHO-Alu-A-풍부 서열-직접 반복부. CHO Alu-등가물 서열의 컨센서스 서열은 상기 문헌 [Haynes et al.] (이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)의 도 1에 개시되어 있다.
길게 산재된 핵 요소 (LINE) (길게 산재된 뉴클레오티드 요소 또는 길게 산재된 요소로서 공지되기도 함)는 많은 진핵생물의 게놈에 널리 퍼져 있는 비-LTR (긴 말단 반복부) 레트로트랜스포손 군이다. 이들은 인간 게놈의 약 21.1%를 구성한다. LINE는 트랜스포손 패밀리를 구성하며, 여기서 각각의 LINE는 약 7,000개 염기쌍 길이이다. 인간에게 풍부한 LINE은 LINE1뿐이다. 인간 게놈은 추정 100,000개의 말단절단된 요소와 4,000개의 전체 길이의 LINE-1 요소를 함유한다. 무작위 돌연변이의 축적으로 인해, 많은 LINE의 서열이 더 이상 전사되거나 번역되지 않을 정도로 퇴화되었다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 CpG 섬을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열의 CpG 섬 내에 있지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열 내의 CpG 섬에 의해 플랭킹되지 않는다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 CpG 섬을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열의 CpG 섬 내에 있지 않는다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열 내의 CpG 섬에 의해 플랭킹되지 않는다.
CpG 섬 (또는 CG 섬)은 CpG 부위의 빈도가 높은 영역이다. CpG 섬에 대한 객관적인 정의는 제한되어 있지만, 통상의 식 정의는 적어도 200 bp, 50% 초과의 GC 백분율, 및 60% 초과의 관찰된 CpG 대 예상된 CpG 비율을 갖는 영역이다. "관찰된 CpG 대 예상된 CpG 비율"은 관측 결과를 하기와 같이 계산하여 도출할 수 있다: (CpG의 수) 및 예상되는 값은 (C의 수 * G의 수)/서열 길이 또는 ((C의 수 + G의 수)/2)2/서열 길이이다.
포유동물 게놈에서, CpG 섬은 전형적으로 300-3,000개 염기쌍 길이이며, 포유동물 유전자의 프로모터의 대략 40% 또는 그 근처에서 발견되었다. 인간 유전자의 60% 초과와 거의 모든 하우스키핑 유전자가 CpG 섬에 내재된 프로모터를 가지고 있다.
인간 염색체 21번과 22번의 전체 서열에 대한 광범위한 조사에 따르면, 500 bp보다 큰 DNA 영역은 GC 함량이 55%보다 크고 관찰된 CpG 대 예상된 CpG 비율이 65%인 경우 유전자의 5' 영역과 연관된 "진정한" CpG 섬일 가능성이 더 높다.
CpG 섬은 통계적으로 예상되는 것 (대략 4-6%)의 적어도 60%인 CpG 디뉴클레오티드 함량을 특징으로 하는 반면, 나머지 게놈은 훨씬 더 낮은 CpG 빈도 (대략 1%)를 가지며, 이러한 현상을 CG 억제라고 한다. 유전자의 코딩 영역 내의 CpG 부위와 달리, 대부분의 경우 프로모터의 CpG 섬에 있는 CpG 부위는 유전자가 발현되는 경우 메틸화되지 않는다. 조직 간 또는 정상 샘플과 암 샘플 간의 메틸화 차이의 대부분은 섬 자체가 아닌 CpG 섬으로부터 짧은 거리 ("CpG 섬 해안")에서 발생한다.
히스톤 아세틸화 및 시토신 탈메틸화가 전사를 향상시키기 때문에, 표적화된-통합 부위는, 예를 들어 평균 수준 초과의 아세틸화 히스톤 및/또는 평균 수준 초과의 비메틸화 시토신이 있는 유전자좌 내에 위치한다.
따라서, 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 평균 수준 초과의 비메틸화 시토신을 특징으로 하는, 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시되거나, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열의 하위서열 내에 위치하거나, 이를 포함하거나, 또는 이에 의해 플랭킹된다. 본원에 사용된 바와 같은, 평균 수준 초과의 비메틸화 시토신은 특정 폴리뉴클레오티드 길이에 걸쳐, 예를 들어 킬로염기당 비메틸화 시토신의 수에 대해 고려된다. 따라서, 비메틸화 시토신의 백분율을, 예를 들어 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 118에 제시된 서열에 대해 계산하여 평균 수준의 비메틸화 시토신을 수득할 수 있다. 그런 다음, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 118 내의 하위서열은 이러한 하위서열 (예를 들어, 10 nt, 100 nt, 1000 nt, 10000 nt 또는 그 초과) 내의 비메틸화 시토신의 백분율이 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 118에 제시된 전체 서열에 대해 계산된 비메틸화 시토신의 평균 수보다 높은지 아니면 낮은지 여부에 따라 점수를 매길 수 있다.
유사하게, 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 평균 수준 초과의 아세틸화를 갖는 히스톤과 연합되는 것을 특징으로 하는, 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시되거나, 또는 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열의 하위서열 내에 위치하거나, 이를 포함하거나, 또는 이에 의해 플랭킹된다. 본원에 사용된 바와 같이, 평균 수준 초과의 히스톤 아세틸화는 특정 폴리뉴클레오티드 길이에 걸쳐, 예를 들어, 킬로염기당 아세틸화된 히스톤의 수에 대해 고려된다. 따라서, 아세틸화 히스톤의 백분율을, 예를 들어 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 118에 제시된 서열에 대해 계산하여 평균 수준의 아세틸화 히스톤을 수득할 수 있다. 그런 다음, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 118 내의 하위서열은 이러한 하위서열 (예를 들어, 10 nt, 100 nt, 1000 nt, 10000 nt 또는 그 초과) 내의 아세틸화 히스톤의 백분율이 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 118에 제시된 전체 서열에 대해 계산된 아세틸화 히스톤의 평균 수보다 높은지 아니면 낮은지 여부에 따라 점수를 매길 수 있다.
메틸화의 마커 및 전사 또는 열린 염색질의 경계를 확인하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Sharmin et al. (2016) BMC Cancer 16:88; Wang et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:511-29; Papin et al. (2020) J. Mol. Biol. doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.018; Li et al. (2013) BMC Genomics 14:553; Butcher & Beck (2015) Methods 72:21-8; Chen et al. (2020) Epigenetics 22:1-22; Keller et al. (2016) Mol. Biol. Evol. 33:1019-28; Symmons et al. (2014) Genome Res. 24:390-400; or Mifsud et al. (2015) Nat. Genet. 47:598-606; Collings & Anderson (2017) Epigenetics and Chromatin 10 doi.org/10.1186/s13072-017-0125-5] (이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 제공된다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 복제가 조기 개시되는 영역인 것을 특징으로 하는, 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시된 서열의 하위서열 내에 위치하거나, 이를 포함하거나, 또는 이에 의해 플랭킹된다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 복제가 조기 개시되는 영역인 것을 특징으로 하는, 서열식별번호: 118 또는 Chr5 TI contig에 제시된 서열의 하위서열 내에 위치하거나, 이를 포함하거나, 또는 이에 의해 플랭킹된다.
복제의 조기 개시는 열린 염색질 및 전사 영역과 연관되어 있다. 복제 기점과 염색질 상태 및 전사와의 연관성을 확인하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Smith & Aladjem (2014) J. Mol. Biol. 426:3330-41; Dellino et al. (2013) Genome Res. 23: 1-11; Boos & Ferreira (2019) Genes 10:199; Boulos et al. (2015) FEBS Lett. 489:2944-57; or Gomez & Brockdorff (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6923-6928] (이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 제공된다. 이러한 방법을 기반으로 하여, 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시되거나, 또는 서열식별번호: 118 또는 Ch5 TI contig에 제시된 서열 내의 복제 기점을 복제 영역의 초기, 중기 및 후기 개시로서 분류하고 순위를 매길 수 있다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 복제 개시 영역의 상위 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 내에 있는 것을 특징으로 하는, 서열식별번호: 22 또는 Chr3 TI contig에 제시되거나, 또는 서열식별번호: 118 또는 Ch5 TI contig에 제시된 서열의 하위서열 내에 위치하거나, 이를 포함하거나, 또는 이에 의해 플랭킹된다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 20의 위치 20,002-20,019에 위치한, 서열식별번호: 21에 제시된 서열, 또는 그의 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 20 내의 서열식별번호: 21의 서열의 하위서열 내에 위치하거나 이를 포함한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 117에 제시된 서열, 또는 그의 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 116 내의 서열식별번호: 117의 서열의 하위서열 내에 위치하거나 이를 포함한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117로부터의 상류에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117로부터의 하류에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117로부터의 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 약 2000, 약 2100, 약 2200, 약 2300, 약 2400, 약 2500, 약 2600, 약 2700, 약 2800, 약 2900 또는 약 3000 nt 상류에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117로부터의 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 약 2000, 약 2100, 약 2200, 약 2300, 약 2400, 약 2500, 약 2600, 약 2700, 약 2800, 약 2900 또는 약 3000 nt 하류에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 20에 제시된 서열, 또는 그의 단편, 예를 들어, 서열식별번호: 21에 대해 오르토로고스인 서열 내에 위치한다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 20에 제시된 서열, 또는 그의 단편, 예를 들어, 서열식별번호: 21과 유사한 서열 내에 위치한다.
일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 116에 제시된 서열, 또는 그의 단편, 예를 들어, 서열식별번호: 117에 대해 오르토로고스인 서열 내에 위치한다. 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 116에 제시된 서열, 또는 그의 단편, 예를 들어, 서열식별번호: 117과 유사한 서열 내에 위치한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 20 내에 위치한다. 서열식별번호: 20은 서열식별번호: 21의 통합 부위의 각각의 부위에 20 Kb를 포함하는 서열식별번호: 22의 하위서열 (크리세툴루스 그리세우스, 차이니즈 햄스터의 염색체 3으로부터의 26 Mbase 서열)이다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 표적화된-통합 부위는 서열식별번호: 116 내에 위치한다. 서열식별번호: 116은 서열식별번호: 117의 통합 부위의 각각의 부위에 20 Kb를 포함하는 서열식별번호: 118의 하위서열 (크리세툴루스 그리세우스, 차이니즈 햄스터의 염색체 Chr5로부터의 18 Mbase 서열)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포 게놈의 특이적 유전자좌 내에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 (외인성 핵산)을 포함하는 단리된 세포를 제공하며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 116, 또는 그의 하위서열과 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에 개시된 서열은 크리세툴루스 그리세우스로부터 유래된 반면, 본 개시내용은 또한 다른 종, 예를 들어 인간, 마우스, 토끼, 래트, 돼지 또는 개로부터의 오르토로고스 서열을 또한 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 서열식별번호: 14-24 및 110-120에 제시된 서열 중 임의의 것에 대한 언급은 또한, 예를 들어 니들만-운슈 알고리즘의 구현을 사용한 쌍별 정렬을 통해 결정된 바와 같이, 상응 모 또는 참조 서열 (즉, 서열식별번호: 14-24 및 110-120에 제시된 임의의 서열 또는 그의 단편 또는 하위서열)과 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체 서열을 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "오르토로고스"는 종분화 이벤트에 의해 분리되었기 때문에 유사한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는데, 즉 이는 조상 관계로 인해 상이한 유기체에서 상동 서열을 나타내고, 따라서 상이한 유기체에서 유사한 기능을 제공한다. 따라서, 본원에 개시된 서열 (또는 하위서열)과 오르토로고스인 서열 (또는 하위서열)은 기능적으로 동등한 것으로 간주되는데, 즉 본원에 개시된 크리세툴루스 그리세우스로부터의 공지된 서열과 표적화된 통합을 위한 특이적 유전자좌를 동일하게 사용할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포 게놈의 특이적 유전자좌 내에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 (외인성 핵산)을 포함하는 단리된 세포를 제공하며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 116 또는 그의 하위서열과 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 측면에서, 하위서열은 약 18, 약 20, 약 25, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225, 약 250, 약 275, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 또는 약 2000개 뉴클레오티드 길이이며, 여기서 하위서열은 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117에 제시된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 하위서열은 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117에 제시된 서열에 대해 상류에 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225, 약 250, 약 275, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 또는 약 2000개 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 하위서열은 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117에 제시된 서열에 대해 하류에 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225, 약 250, 약 275, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 또는 약 2000개 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포 게놈의 특이적 유전자좌 내에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 (외인성 핵산)을 포함하는 단리된 세포를 제공하며, 여기서 유전자좌 (예를 들어, 본 개시내용의 표적화된-통합 부위)는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 뉴클레오티드 서열이다. 본 개시내용은 또한 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 (외인성 핵산)을 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포 내로 도입하고 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포를 수득하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 외인성 핵산은 CHO 세포의 게놈의 특이적 유전자좌 내로 통합되고, 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 뉴클레오티드 서열이다. 또한 (a) 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 (외인성 핵산)을 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 측면에서, 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116과 부분적으로 중첩된다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116의 임의의 위치에서 특이적 부위에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 특이적 부위는 위치 번호 1-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001-4000, 4001-5000, 5001-6000, 6001-7000, 7001-8000, 8001-9000, 9001-10000, 10001-11000, 11001-12000, 12001-13000, 13001-14000, 14001-15000, 15001-16000, 16001-17000, 17001-18000, 18001-19000, 190001-20000, 20001-21000, 21001-22000, 22001-23000, 23001-24000, 24001-25000, 25001-26000, 26001-27000, 27001-28000, 28001-29000, 29001-30000, 30001-31000, 31001-32000, 32001-33000, 33001-34000, 34001-35000, 35001-36000, 36001-37000, 37001-38000, 38001-39000, 39001-40000, 또는 40001-40020 전역에 걸쳐 있는 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 20 내의 위치에 있다.
일부 측면에서, 특이적 부위는 위치 번호 1-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001-4000, 4001-5000, 5001-6000, 6001-7000, 7001-8000, 8001-9000, 9001-10000, 10001-11000, 11001-12000, 12001-13000, 13001-14000, 14001-15000, 15001-16000, 16001-17000, 17001-18000, 18001-19000, 190001-20000, 20001-21000, 21001-22000, 22001-23000, 23001-24000, 24001-25000, 25001-26000, 26001-27000, 27001-28000, 28001-29000, 29001-30000, 30001-31000, 31001-32000, 32001-33000, 33001-34000, 34001-35000, 35001-36000, 36001-37000, 37001-38000, 38001-39000, 39001-40000, 40001-41000, 410001-42000, 42001-43000, 43001-44000, 44001-45000, 45001-46000, 46001-47000, 47001-48000, 49001-50000, 50001-51000, 51001-52000, 52001-53000, 53001-54000, 54001-55000, 55001-56000, 56001-5700. 57001-58000, 58001-59000, 59001-60000, 60001-61000, 61001-62000, 62001-63000, 63001-64000, 64001-65000, 65001-66000, 66001-67000, 67001-68000, 68001-69000, 69001-70000, 70001-71000, 71001-72000, 72001-7300, 73001-74000, 74001-75000, 75001-76000, 76001-77000, 77001-78000, 78001-79000, 79001-80000, 80001-81000, 81001-82000, 82001-83000, 83001-84000, 84001-85000, 85001-86000, 86001-87000, 87001-88000, 88001-89000, 89001-90000, 90001-91000, 91001-92000, 92001-93000, 93001-94000, 94001-95000, 95001-96000, 96001-97000, 97001-98000, 98001-99000, 99001-100000, 100001-101000, 101001-102000, 102001-103000, 103001-104000, 104001-105000, 105001-106000, 106001-107000, 107001-108000, 108001-109000, 109001-110000, 110001-111000, 111001-112000, 112001-113000, 113001-114000, 114001-115000, 115001-116000, 116001-117000, 117001-118000, 118001-119000, 119001-120000, 120001-121000, 121001-122000, 122001-123000, 123001-124000, 124001-125000, 125001-126000, 126001-127000, 127001-128000, 128001-129000, 129001-130000, 130001-131000, 131001-132000, 132001-133000, 133001-134000, 134001-135000, 135001-136000, 136001-137000, 137001-138000, 138001-139000, 139001-140000, 140001-141000, 141001-142000, 142001-143000, 143001-144000, 144001-145000, 145001-146000, 146001-147000, 147001-148000, 148001-149000, 149001-150000, 150001-151000, 151001-152000, 152001-153000, 153001-154000, 154001-155000, 155001-156000, 156001-157000, 157001-158000, 158001-159000, 159001-160000, 160001-161000, 161001-162000, 162001-163000, 163001-164000, 164001-165000, 165001-166000, 166001-167000, 167001-168000, 168001-169000, 169001-170000, 170001-171000, 171001-172000, 172001-173000, 173001-174000, 174001-175000, 175001-176000, 176001-177000, 177001-178000, 178001-179000, 179001-180000, 180001-181000, 181001-182000, 182001-183000, 183001-184000, 또는 184001-185000 전역에 걸쳐 있는 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 116 내의 위치에 있다.
일부 측면에서, 특이적 부위는 위치 번호 19000-21000, 18000-22000, 17000-23000, 16000-24000, 15000-25000, 14000-26000, 13000-27000, 12000-28000, 11000-29000, 10000-30000, 9000-31000, 8000-32000, 7000-33000, 6000-34000, 5000-35000, 4000-36000, 3000-37000, 2000-38000, 1000-39000, 또는 1-40020 전역에 걸쳐 있는 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 20 내의 위치에 있다.
일부 측면에서, 특이적 부위는 위치 번호 19000-19100, 19100-19200, 19200-19300, 19300-19400, 19400-19500, 19500-19600, 19600-19700, 19700-19800, 19800-19900, 19900-20000, 20000-20100, 20100-20200, 20200-20300, 20300-20400, 20400-20500, 20500-20600, 20600-20700, 20700-20800, 20800-20900, 또는 20900-21000 전역에 걸쳐 있는 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 20 내의 위치에 있다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 20의 임의의 위치에서 특이적 부위에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 특이적 부위는 위치 번호 20000-20020, 19990-20030, 19980-20040, 19970-20050, 19960-20060, 19950-20070, 19940-20080, 19930-20090, 19920-20100, 19910-20110, 19900-20120, 19890-20120, 19880-20130, 19870-20140, 19860-20150, 19850-20160, 19840-20170, 19830-20180, 19820-20190, 19810-20200, 19800-20210, 19790-20220, 19780-20230, 19770-20230, 19760-20240, 19750-20250, 19740-20260, 19730-20270, 19720-20280, 19710-20290, 19700-20300, 19690-20310, 19680-20320, 19670-20330, 19660-20340, 19650-20350, 19640-20360, 19630-20370, 19620-20380, 19610-20390, 19600-20400, 19590-20410, 19580-20420, 19570-20430, 19560-20440, 19550-20450, 19540-20460, 19530-20470, 19520-20480, 19510-20490, 또는 19500-20500 전역에 걸쳐 있는 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 20 내의 위치에 있다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 20 (핫 스팟 1을 포함하는 게놈 서열) 내의 또는 서열식별번호: 116 (핫 스팟 2를 포함하는 게놈 서열) 내의 임의의 위치에서 특이적 부위 (핫 스팟)에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하거나, 또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116과 부분적으로 중첩되는 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 서열식별번호: 20 내의 위치에 있는 특이적 부위는 위치 번호 20,002-20,019 (서열식별번호: 21에 제시된 18량체 서열에 상응함) 전역에 걸쳐 있는 뉴클레오티드 위치 또는 하위서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 특이적 부위는 뉴클레오티드 위치 19900, 19901, 19902, 19903, 19904, 19905, 19906, 19907, 19908, 19909, 19910, 19911, 19912, 19913, 19914, 19915, 19916, 19917, 19918, 19919, 19920, 19921, 19922, 19923, 19924, 19925, 19926, 19927, 19928, 19929, 19920, 19921, 19922, 19923, 19924, 19925, 19926, 19927, 19928, 19929, 19930, 19931, 19932, 19933, 19934, 19935, 19936, 19937, 19938, 19939, 19949, 19941, 19942, 19943, 19944, 19945, 19946, 19947, 19948, 19949, 19950, 19951, 19952, 19953, 19954, 19955, 19956, 19956, 19958, 19959, 19960, 19961, 19962, 19963, 19964, 19965, 19966, 19967, 19968, 19969, 19970, 19971, 19971, 19972, 19973, 19974, 19975, 19976, 19977, 19978, 19979, 19980, 19981, 19982, 19983, 19984, 19985, 19986, 19987, 19988, 19989, 19990, 19991, 19992, 19993, 19994, 19995, 19996, 19997, 19998, 19999, 20000, 20001, 20002, 20003, 20004, 20005, 20006, 20007, 20008, 20009, 20010, 20011, 20012, 20013, 20014, 20015, 20016, 20017, 20018, 20019, 20020, 20021, 20022, 20023, 20024, 20025, 20026, 20027, 20028, 20029, 20030, 20031, 20032, 20033, 20034, 20035, 20036, 20037, 20038, 20039, 20040, 20041, 20042, 20043, 20044, 20045, 20046, 20047, 20048, 20049, 20050, 20051, 20052, 20053, 20054, 20055, 20056, 20057, 20058, 20059, 20060, 20061, 20062, 20063, 20064, 20065, 20066, 20067, 20068, 20069, 20070, 20071, 20072, 20073, 20074, 20075, 20076, 20077, 20078, 20079, 20080, 20081, 20082, 20083, 20084, 20085, 20086, 20087, 20088, 20089, 20090, 20091, 20092, 20093, 20094, 20095, 20096, 20097, 20098, 20099, 또는 20100으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 20 내의 위치에 있다.
본 개시내용은 또한 랜딩 패드 세포주 및 발현 세포주의 생성뿐만 아니라 모 플라스미드를 둘러싸는 게놈 서열에 대한 어떤 사전 지식 없이도 모 세포주의 게놈에서 부가의 핫 스팟의 확인을 가능하게 하는 방법을 제공한다. 이러한 보편적인 TI 기술은 랜딩 패드 플라스미드에 존재하지 않는 모 세포주의 모 플라스미드 서열을 대상으로 한 부위-특이적 엔도뉴클레아제(들)를 사용한다. 이러한 전략의 이점은 플랭킹 게놈 DNA 서열에 대한 지식이 필요하지 않다는 것이다. 예를 들어, 도 4a는 CRISPR/Cas를 나타내는 가위 옆의 실선 박스로 표시된, CRISPR/Cas에 의해 표적화된 게놈 서열을 알아야 한다는 요구 사항을 보여준다. 대조적으로, 도 8a 및 8b는 CRISPR/Cas에 의해 표적화된 서열이 모 플라스미드 내부에 있다는 것을 보여준다. 수직선과 물결선이 있는 박스는 상이한 플라스미드 간의 상동성 영역을 나타낸다.
이들 새로운 전략에 따르면, 예를 들어, 도 2 및 관련 개시내용에 나타낸 바와 같이, 높은 발현 역가 (예를 들어, 항체의 경우 3-4 g/L) 및 낮은 카피 수 (예를 들어, 2)를 갖는 모 세포주가 먼저 선택될 것이다. 일단 이러한 세포주, 즉 "핫 세포주"가 확인되면, 핫 세포주는 2가지 상이한 전략에 따라 사용될 수 있다. 두 전략 모두에서, 랜딩 패드 플라스미드는 마커 예를 들어, 형광 마커, 에컨대 b1mCherry를 코딩하고, 모 세포주에 존재하는 모 플라스미드와 상이한 선택 마커, 예를 들어, 퓨로마이신 내성을 발현하며, 이러한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 이종 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)에 의해 플랭킹된다. 도 12a, 12b, 13 및 14에 나타낸 예시적인 SSRS는 Cre 레콤비나제의 표적인 2개의 Lox 부위 (LoxP 및 Lox511)이다. 그러나, 대체 SSRS, 예를 들어 Lox, Frt, att 또는 그의 조합을 사용하여 하기에 개시된 바와 같이 이들 전략을 실시할 수 있다. 예를 들어, Lox 및 Frt 조합은 도 15에 도시되어 있고 att 부위 (부착 부위)의 사용은, 예를 들어 도 19에 나타나 있다.
부위 특이적 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR/Cas)와 랜딩 패드 플라스미드의 존재 하에, 모 세포주 내의 제1의 GOI (예를 들어, mAb 발현 카세트)는 Lox 부위에 의해 플랭킹된 mCherry로서 표시된 랜딩 패드로 대체되거나 (전략 A), 또는 결실되고 랜딩 패드 플라스미드는 핫 세포주의 게놈 내 대체 유전자좌에 통합된다 (전략 B). 따라서, 전략 A에서는, 랜딩 패드 플라스미드가 높은 발현을 지원하는 핫 스팟에 삽입되며, 이는 모 세포주에서 사용되는 것과 동일한 핫 스팟이 된다. 전략 B에서는, 모 세포주 내의 제1의 GOI (예를 들어, mAb 발현 카세트)가 제거되고, 랜딩 패드 플라스미드가 모 세포주의 게놈 내의 대체 위치에 삽입된다. 모 세포주는 핫 세포이므로, 부가의 핫 스팟을 확인하면 랜딩 패드 세포주가 높은 역가와 같은 선호하는 속성을 가진 발현 세포주를 생성할 수 있게 된다. 도 8a를 참조한다.
본 개시내용은 하기를 포함하는, 랜딩 패드 세포주를 확인하는 방법을 제공한다:
(1) 모 세포 (예를 들어, 핫 세포)의 게놈 서열에 통합된 플라스미드로부터 제1의 GOI를 제거하여, 제1의 GOI가 없는 모 세포 집단을 생성하는 단계;
(2) (1)의 모 세포 집단 내의 대체 게놈 유전자좌에 적어도 하나의 마커 (예를 들어, Cherry)를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드를 통합시켜, 라이브러리 또는 후보 세포를 생성하는 단계; 및
(3) 적어도 하나의 대체 게놈 유전자좌가 통합된 랜딩 패드 플라스미드의 적어도 하나의 카피를 포함하는 후보 세포의 라이브러리를 스크리닝하는 단계이며, 여기서 후보 세포주는 원하는 속성, 예컨대 (a) 미리 결정된 한계치 수준을 초과하는 세포 역가; (b) 미리 결정된 값인 플라스미드 카피 수; (c) 미리 결정된 한계치 수준을 초과하는 RNA 발현 수준; 또는 (d) 존재하는 경우, 특이적 플라스미드 구성을 갖는 다수의 플라스미드 카피를 충족하는 경우에 선택되는 것인 단계.
일부 측면에서, 새로 확인된 핫 스팟에 랜딩 패드 플라스미드를 함유하는 세포만이 선택된다. 일부 측면에서, 새로 확인된 핫 스팟에 하나 초과의 랜딩 패드 플라스미드를 함유하는 세포가 선택된다. 일부 측면에서, 모 세포는 히스토릭 세포주, 예를 들어 GOI, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 발현에서 높은 역가를 특징으로 하는 세포주이다. 일부 측면에서, 후보 세포의 라이브러리는, 예를 들어 관심 단백질, 예컨대 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 발현 카세트를 결실/절제/제거함으로써 변형된 모 세포 게놈의 여러 위치에서 랜딩 패드 서열의 무작위 통합을 통해 생성된 라이브러리이다. 일부 측면에서, 방법은 새로운 핫 스팟에 통합된 적어도 하나의 랜딩 패드 플라스미드를 갖는 핫 세포를 선택한다. 일부 측면에서, 모 세포주는 CHO 세포주이다.
본 개시내용은 상동 재조합 (예를 들어, CRISPR/Cas를 사용함)을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포 (예를 들어, CHO 핫 세포)의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것을 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 플라스미드에 위치하는데, 즉 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 게놈 서열이 아니며, 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 상동 재조합 부위는 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시킨다.
일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 (i) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (ii) (i)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및 (iii) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (ii)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위를 포함한다.
본 개시내용은 또한 부위-특이적 레콤비나제 재조합 (예를 들어, Cre/Lox 시스템을 사용함)을 사용하여 GOI 플라스미드 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 플라스미드)를 상기 개시된 랜딩 패드 세포 (예를 들어, CHO 핫 세포)의 게놈에 통합시키는 것을 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 GOI를 통합시킨다. 일부 측면에서, 그 결과로 생성된 발현 플라스미드는 (i) 적어도 하나의 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (ii) (i)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS를 포함한다.
또한 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법이 제공된다: (a) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포 (예를 들어, 모 핫 세포)의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 플라스미드에 위치하고, 여기서 랜딩 패드 플라스미드 내의 상동 재조합 부위는 상이한 게놈 유전자좌에서 랜딩 패드 내의 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA의 상이한 게놈 유전자좌에서 랜딩 패드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것인 단계; 및 (b) 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용하여 랜딩 패드 세포의 게놈에 GOI 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포의 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계. 이러한 방법의 일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 (i) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열; (ii) (i)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 SSRS; 및 (iii) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (ii)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위를 포함한다. 이러한 방법의 일부 측면에서, 그 결과로 생성된 발현 플라스미드는 (i) 적어도 하나의 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (ii) (i)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS를 포함한다.
또한, 하기를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법이 제공된다: (a) 모 세포주 내의 제1의 핫 스팟 위치로부터 모 플라스미드 또는 그의 일부분을 제거하는 단계; 및 (b) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포 게놈 내의 제2의 핫 스팟 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 플라스미드에 존재하고, 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 상동 재조합 부위는 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것인 단계. 이러한 방법의 일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드는 (i) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (ii) (i)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및 (iii) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (ii)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위를 포함한다. 단계 (a)는 제1의 GOI (예를 들어, 모 세포주에서 높은 발현 수준을 갖는 항체) 없이 모 세포주 (예를 들어, 핫 세포주)로부터 유래된 세포 집단을 생성한다. 단계 (b)에서, 단계 (a)의 세포 집단의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드를 삽입하면, 다수의 위치에 통합된 그 랜딩 패드 세포를 함유하는 세포 집단이 생성되며, 이는 순차적으로 새로운 핫 세포와 그의 상응하는 핫 스팟을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다.
또한, 하기를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법이 제공된다: (a) 모 세포주 내의 제1의 핫 스팟 위치로부터 모 플라스미드를 제거하는 단계, (b) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포 게놈 내의 제2의 핫 스팟 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 플라스미드에 존재하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 예를 들어, (i) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; (ii) (i)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및 (iii) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (ii)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위를 포함하고, 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 상동 재조합 부위는 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것인 단계, 및 (c) 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용하여 랜딩 패드 세포의 게놈에 GOI 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 발현 플라스미드는 예를 들어, (i) GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (ii) (1)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS를 포함하고; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포의 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계.
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포는 하기 설명에 상응하는 토폴로지를 갖는 플라스미드를 포함한다:
CG/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG;
CG/-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG;
CG/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-[P1]-/CG;
CG/-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-/CG,
CG/-[P1]-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG; 또는
CG/-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG
여기서 CG는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고; [P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고; [P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고; [M]은 적어도 하나의 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이고; [SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이고, n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 측면에서, n은 1이다. 일부 측면에서, n은 2이다. 일부 측면에서, n은 3이다. 일부 측면에서, n은 4이다. 일부 측면에서, n은 5이다. 일부 측면에서, n은 6이다. 일부 측면에서, n은 7이다. 일부 측면에서, n은 8이다. 일부 측면에서, n은 9이다. 일부 측면에서, n은 10이다.
본 개시내용의 식 중 임의의 것에서 표지 [P1], [P2] 및 [SSRS]는 단지 구축물의 토폴로지를 나타내는 성분의 유형 또는 기원에 대한 설명일 뿐이라는 점에 유의해야 한다. 각각의 [P1] 및 [P2] 성분의 핵산 서열은 상이한데, 즉 제1의 [P1]의 핵산 서열은 제2의 [P1]의 핵산 서열과 상이하지만, 공통 기원, 즉 모 플라스미드를 공유한다. 유사하게, 제1의 [P2]의 핵산 서열은 제2의 [P2]의 핵산 서열과 상이하지만, 공통 기원, 즉 랜딩 패드 플라스미드를 공유한다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포 내의 CG 서열은 모 세포주 내의 CG 서열과 상이한데, 즉 플라스미드는 모 세포주 내의 원래 핫 스팟과 상이한 핫 스팟에 위치한다.
[SSRS] 성분은, 예를 들어 Cre/Lox 부위이며, 각각의 성분은 상이한 서열을 가질 수 있다. 그러나, 일부 측면에서, [SSRS] 쌍을 포함하는 본 개시내용 전반에 걸쳐 제시된 임의의 식에서, 표시된 [SSRS] 중 하나는 임의적이다. 예를 들어, 세린-인테그라제를 사용하여 통합을 시행하는 경우, 단일 [SSRS]가 필요하다. 따라서, 이러한 구체적 측면에서, 단일 att 부위, 예를 들어 attP 부위가 [SSRS] 쌍 대신 존재할 수 있다.
일부 측면에서, 발현 세포에 통합된 플라스미드의 토폴로지는 하기 설명에 상응한다:
CG/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG;
CG/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG;
CG/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1]-/CG;
CG/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG;
CG/-[P1]-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG; 또는
CG/-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG
여기서 CG는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고; [P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고; [P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고; [P3]은 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고; [SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이고, n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 측면에서, n은 1이다. 일부 측면에서, n은 2이다. 일부 측면에서, n은 3이다. 일부 측면에서, n은 4이다. 일부 측면에서, n은 5이다. 일부 측면에서, n은 6이다. 일부 측면에서, n은 7이다. 일부 측면에서, n은 8이다. 일부 측면에서, n은 9이다. 일부 측면에서, n은 10이다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포 내의 CG 서열은 모 세포주 내의 CG 서열과 상이한데, 즉 플라스미드는 모 세포주 내의 원래 핫 스팟과 상이한 핫 스팟에 위치한다.
일부 측면에서, 상동 재조합은 하기에 상세히 기재되는 CRISPR/Cas 시스템, TALEN 시스템 또는 ZFN 시스템에 의해 매개된다. 일부 측면에서, 상동 재조합 시스템, 예를 들어 CRISPR/Cas 시스템은 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 추가로 포함한다. 사용된 상동 재조합에 따라, 하기에 자세히 개시된 바와 같은 부가의 성분이 필요할 수 있다.
일부 측면에서, 부위-특이적 레콤비나제 재조합 부위 (SSRS)는 Tyr-레콤비나제 부위, Tyr-인테그라제 부위, 세린-레졸바제/인버타제 부위, 세린-인테그라제 부위, 또는 그의 조합이다. 일부 측면에서, Tyr-레콤비나제 부위는 Cre, Dre, Flp, KD, B3 또는 B3 Tyr-레콤비나제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, Tyr-인테그라제 부위는 λ (람다), HK022 또는 HP1 Tyr-인테그라제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 세린-레졸바제/인버타제 부위는 γδ (감마델타), ParA, Tn3, 또는 Gin 세린-레졸바제/인테그라제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 세린-인테그라제 부위는 PhiC31, Bxb1, 또는 R4 세린-인테그라제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, Tyr-레콤비나제 부위는 Cre Tyr-레콤비나제 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS는 LoxP 부위이다. 일부 측면에서, LoxP 부위는 서열식별번호: 1 (야생형 LoxP)에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, LoxP 부위는 돌연변이 LoxP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이 LoxP 부위는 서열식별번호: 2 (돌연변이 LoxP)에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 돌연변이 LoxP 부위는, 예를 들어, 서열식별번호: 3 (Lox 511); 서열식별번호: 4 (Lox 5171); 서열식별번호: 5 (Lox 2272); 서열식별번호: 6 (Lox M2); 서열식별번호: 7 (Lox M3); 서열식별번호: 8 (Lox M7); 서열식별번호: 9 (Lox M11); 서열식별번호: 10 (Lox 71); 및 서열식별번호: 11 (Lox 66)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, Tyr-레콤비나제 부위는 Flp Tyr-레콤비나제 부위를 포함한다. 일부 측면에서 SSRS는 짧은 플립파제 인식 표적 (FRT) 부위이다. 일부 측면에서, 세린-인테그라제 부위는 att 부위, 예를 들어 attP 또는 attB 부위를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 플라스미드 내 SSRS 쌍의 각각의 SSRS는 상이한 클래스에 속할 수 있다. 예를 들어, 제1의 SSRS는 예를 들어 Tyr-레콤비나제 부위일 수 있고, 제2의 SSRS는 예를 들어 Ser-인테그라제 부위일 수 있다. 일부 측면에서, SSRS 쌍은 야생형 LoxP, 돌연변이 LoxP 부위, Lox 511 부위, Lox 5171 부위, Lox 2272 부위, Lox M2 부위, Lox M3 부위, Lox M7 부위, Lox M11 부위, Lox 71 부위, Lox 66 부위, 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된 2개의 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS 쌍은 Lox P 부위와 Lox 511 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS 쌍은 Lox P 부위와 Frt 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS 쌍은 2개의 aat 부위, 예를 들어 2개의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS 쌍은 2개의 aat 부위, 예를 들어 2개의 attR 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS 쌍은 Lox 2272 부위와 Lox M3 부위를 포함한다. 일부 측면에서, SSRS 쌍은 Lox m3 부위와 Lox m7 부위를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 플라스미드는 적어도 하나의 단일 선택 마커를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 플라스미드는 단일 선택 마커를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 플라스미드는 하나 초과의 단일 선택 마커, 예를 들어 2개의 선택 마커를 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커는 글루타민 신테타제 (GS)이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커는 글루타민 신테타제 (GS) 마커 및 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 마커를 포함한다. 안정적으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 생성하는 데 적합한 여러 가지 선택 마커가 있다. 상이한 작용 모드로 인해, 각각의 선택 마커는 높은 생산성을 수득하기 위해 상이한 숙주 세포에서 최적의 선택 엄격성을 갖는다 (문헌 [Yeo et al. (2017) Biotechnol J 12(12)] 참조: 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
일부 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커는 약물 내성 유전자, 예를 들어 항생제 내성 유전자이다. 일부 측면에서, 항생제 내성 유전자는 악티노마이신 D 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, G418 내성 유전자, 히드로마이신 내성 유전자, 미토마이신 C 내성 유전자, 미코페놀산 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 항생제 내성 유전자는 퓨로마이신 내성 유전자이다. 일부 측면에서, 퓨로마이신 내성 유전자는 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제이다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 검출가능한 마커는 단백질, 예를 들어 형광 단백질을 포함한다. 일부 측면에서, 형광 단백질은 mCherry이다. 일부 측면에서, 형광 단백질은 GFP, ZsGreen1, AcGFP1, EGFP, GFPuv, AcGFP, EBFP, EYFP, ECFP, tdTomato, mCherry, DsRed, AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed2, DsRed-Express, HcRed, AsRed, mOrange, mOrange2, mPlum, mStrawberry, mBanana, YFP, mRaspberry, HcRed1, E2-Crimson, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 모 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK293 세포, 및 NS0 세포, 또는 그의 유도체 또는 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, CHO 세포는 CHO DG44 세포 또는 CHO K1 세포이다.
일부 측면에서, GOI는 적어도 하나의 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 융합 단백질을 코딩한다. 일부 측면에서, 항체는 T 세포 이뮤노글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질 3 (TIM3), 타우 단백질, 예컨대 타우의 N-말단 단편 (eTau), 또는 면역 체크포인트 단백질, 예컨대 PD-L1의 PD-1과 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, 항체는 니볼루맙이다. 일부 측면에서, GOI는 항체의 중쇄 (HC)이다. 일부 측면에서, GOI는 항체의 경쇄 (LC)이다. 일부 측면에서, GOI는 항체의 HC 및 LC를 포함한다 (예를 들어, 바이시스트론 구축물에서). 일부 측면에서, GOI는 이중특이적 항체 또는 그의 일부분, 예를 들어 이중특이적 항체의 HC 또는 LC 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 발현 플라스미드는 GOI의 1개, 2개 또는 2개 초과의 카피를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 GOI 또는 마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, GOI 또는 마커의 발현은 정량적으로 및/또는 정성적으로 결정된다. 일부 측면에서, GOI 또는 마커의 발현은, 예를 들어, 세포 분류, FACS, 세포 표면 염색, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 컬럼 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 미세유체학, UV 흡광도, 면역조직화학, 세포 크기, 분비된 단백질 수준, 전사체 수준, 또는 그의 임의의 조합에 의해 결정된다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드 (제2의 GOI 플라스미드) 또는 발현 플라스미드 (P4)는 세포 게놈에서 1개의 카피 수로 통합된다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드 (제2의 GOI 플라스미드) 또는 발현 플라스미드 (P4)는 세포 게놈에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 카피 수로 통합된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 플라스미드의 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하고, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 플라스미드의 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 114의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하고, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 115의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 단리된 세포 또는 단리된 세포의 집단은 세포 게놈의 특이적 유전자좌 내에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 116으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포, 예를 들어 CHO 세포 또는 또 다른 적합한 세포주 내로 도입하는 단계 및 세포, 예를 들어 CHO 세포를 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 외인성 핵산은 세포, 예를 들어 CHO 세포의 게놈의 특이적 유전자좌 내로 통합되고, 유전자좌는 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 116으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 (a) 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계이며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 116으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열을 포함하는 것인 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 20으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 21에 제시된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 116으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 117에 제시된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 20으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 21에 제시된 서열로 이루어진다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 116으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 117에 제시된 서열로 이루어진다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 20으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 21에 제시된 서열에 대해 상류의 (서열식별번호: 20의 5' 말단 방향) 하위서열이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 20으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 21에 제시된 서열에 대해 하류의 (서열식별번호: 20의 3' 말단 방향) 하위서열이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 116으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 117에 제시된 서열에 대해 상류의 (서열식별번호: 116의 5' 말단 방향) 하위서열이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 116으로부터 선택된 뉴클레오티드 하위서열은 서열식별번호: 117에 제시된 서열에 대해 하류의 (서열식별번호: 116의 3' 말단 방향) 하위서열이다.
본 개시내용은 단일 랜딩 패드 플라스미드를 함유하는 랜딩 패드 세포주를 제공한다. 그러나, 하나 초과의 랜딩 패드 플라스미드가 있는 랜딩 패드 세포주는 다중 서브유닛 생물학적 제제, 예컨대 이중특이적 모노클로날 항체 (mAb)의 발현을 더욱 정제할 수 있는 기회를 제공한다. 따라서, 본원에 개시된 세포 스크리닝 방법은 동일한 유전자좌에 2개의 랜딩 패드 플라스미드를 갖는 랜딩 패드 세포주, 즉 듀오-랜딩 패드 세포를 확인하는 데 사용될 수 있다. 이는 동일한 게놈 유전자좌에 상주하므로 두 랜딩 패드 플라스미드로부터의 동일한 발현을 보장한다.
본 개시내용의 듀오-랜딩 패드는 헤드-투-헤드, 테일-투-테일, 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일의 4가지 상이한 배향으로 통합될 수 있다. 단일 부위 지정 레콤비나제, 예컨대 Cre/Lox 또는 Flp/Frt를 사용하는 경우, 이들은 기능적으로 서로 구별할 수 없기 때문에 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 구성이 일반적으로 사용된다. Cre/Lox의 존재 하에 랜딩 패드 중 하나가 결실될 수 있는 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일 구성에서와 달리, 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 구성은 단순히 역전을 거쳐 동일한 시작 구성이 된다.
제2의 GOI 플라스미드가 4가지 듀오-랜딩 패드 구성 (헤드-투-헤드, 테일-투-테일, 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일) 각각과 함께 사용되는 경우, 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 구성은 각각, 플라스미드 연접부에 플랭킹하는 2개의 재조합 부위 사이의 서열이 역전될 수 있는 2개의 세포주를 생성할 수 있으며, 그렇지 않은 경우 2개의 세포주는 동일하다. 헤드-투-테일 또는 테일-투-헤드 구성이 제2의 GOI 플라스미드와 함께 사용되는 경우, 2개의 제2의 GOI 플라스미드가 있는 세포주가 생산된다. 그러나, 충분한 양의 Cre 활성이 존재하는 경우, 제2의 GOI 플라스미드 중 하나가 제거되어 단일 제2의 GOI 플라스미드가 있는 제2의 GOI 플라스미드 세포주가 생성될 수 있다.
랜딩 패드가 Lox 부위, 예를 들어, Lox 511 대신 Flp에 대한 Frt 인식 부위를 사용하고 Cre/Lox와 Flp 둘 다가 사용되는 경우, 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일 배향으로 결실되는 반면, 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 배향은 역전되는 동일한 결과가 발생할 것이다. 그러나, 테일-투-테일 및 헤드-투-헤드 구성에서 인테그라제가 포함된 attP/attB를 사용하여 제2의 GOI 플라스미드를 듀오-랜딩 패드에 재조합하면 역전이 발생하지 않지만, 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일 구성에서는 랜딩 패드 중 하나의 결실이 여전히 발생할 수 있다. 각각의 랜딩 패드가 단일 attP 부위를 갖는 경우, 단일 attB 부위와 제2의 GOI 플라스미드의 단일 통합이 발생하여, 4가지 듀오-랜딩 패드 구성 중 임의의 것에서 결실이 발생하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "단일 랜딩 패드"는 단일 랜딩 패드 플라스미드 또는 제2의 GOI 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "듀오-랜딩 패드"는 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 제2의 GOI 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드를 지칭한다.
듀오-랜딩 패드의 사용은 상이한 GOI를 포함하는 생물학적 제제, 예를 들어 중쇄와 경쇄를 포함하는 항체를 생산하는 대체 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 제2의 GOI 플라스미드가, 예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 다수의 발현 카세트를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 각각의 발현 카세트는 상이한 제2의 GOI 플라스미드에 있을 수 있으며, 제2의 GOI 플라스미드 둘 다는 듀오-랜딩 패드에 위치할 수 있다.
듀오-랜딩 패드 세포주의 사용은 단일 랜딩 패드 (즉, 단일 제2의 GOI 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드)가 있는 랜딩 패드 세포주에 비해 이점이 있다. 단일 랜딩 패드 세포주의 경우, 세포주는 단일 제2의 GOI만 수용하므로 다성분 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 모든 발현 카세트는 단일 제2의 GOI 플라스미드에 배치되어야만 한다. 듀오-랜딩 패드 세포주의 경우는 그렇지 않다. 듀오-랜딩 패드 세포주는 더 높은 발현 다양성 수준으로 설계할 수 있는 기회를 제공하여, 우수한 특징을 지닌 발현 세포주를 생성할 수 있는 기회를 제공한다. 제2의 GOI 플라스미드의 상이한 구성을 사용하여 여러 방식으로 다양성을 생성할 수 있다. 한 경우에는, 제2의 GOI 플라스미드가 독특한 구성으로 복합 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 모든 발현 카세트를 함유한다. 두 번째 경우에는, 제2의 GOI 플라스미드가 발현 세포주를 제조하기 위해 동일한 세포에 상주할 필요가 있는 발현 카세트의 서브세트를 함유할 수 있다. 세 번째 경우에는, 독특한 구성(들)의 모든 발현 카세트의 서브세트를 함유하는 제2의 GOI 플라스미드 세트와 함께 복합 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 독특한 구성의 모든 발현 카세트를 갖는 하나 이상의 제2의 GOI 플라스미드가 이전 두 경우의 조합이다.
듀오-랜딩 패드를 생성하기 위해 본원에 개시된 동일한 방법을 사용하여, 랜딩 패드 플라스미드의 고차 조합을 갖는 세포주를 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핫 스팟 내에 2개의 랜딩 패드 플라스미드가 있는 랜딩 패드 세포주를 확인하기 위해 본원에 개시된 방법을 사용하여 3개, 4개 또는 그 초과의 랜딩 패드 플라스미드를 갖는 랜딩 패드 세포주를 선택할 수 있다. 2개 초과의 랜딩 패드 플라스미드를 함유하는 핫 스팟을 갖는 랜딩 패드 세포주 및 발현 세포는, 예를 들어 2개 초과의 상이한 서브유닛을 포함하는 생물학적 제제를 생산하는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서 듀오-랜딩 패드 구성은 동일한 레콤비나제 또는 Int 인식 서열을 갖는 두 랜딩 패드 플라스미드를 모두 포함할 수 있지만, 독특한 재조합 "어드레스"를 갖는 각각의 랜딩 패드 플라스미드를 제조하는 것이 가능한데, 즉 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 어드레싱가능해진다. 레콤비나제, 예컨대 Cre 및 Flp의 경우에는 4가지 독특한 인식 서열을 사용할 수 있다. 따라서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 독특한 인식 부위 쌍을 갖게 된다. 일부 측면에서, 호환불가능한 4개의 Lox 부위를 사용할 수 있다 (문헌 [Langer, S.J., Ghafoori, A.P., Byrd, M. and Leinwand, L. (2002) A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites. Nucleic Acids Res., 30, 3067-3077; Missirlis, P.I., Smailus, D.E. and Holt, R.A. (2006) A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics, 7, 73.; and Siegel, R.W., Jain, R. and Bradbury, A. (2001) Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences. FEBS Lett., 505, 467-473] 참조).
부가의 전략의 예는 2개의 Lox 부위를 2개의 호환불가능한 Frt 부위로 교체하고 Cre를 Frt와 함께 사용하는 것 (문헌 [Lauth, M., Spreafico, F., Dethleffsen, K. and Meyer, M. (2002) Stable and efficient cassette exchange under non-selectable conditions by combined use of two site-specific recombinases. Nucleic Acids Res., 30, e115] 참조), 2개 내지 4개의 호환불가능한 aat 부위와 인테그라제를 사용하는 것 (문헌 [Jusiak, B., Jagtap, K., Gaidukov, L., Duportet, X., Bandara, K., Chu, J., Zhang, L., Weiss, R. and Lu, T.K. (2019) Comparison of Integrases Identifies Bxb1-GA Mutant as the Most Efficient Site-Specific Integrase System in Mammalian Cells. ACS Synth Biol, 8, 16-24] 참조), 하나 초과의 인테그라제, 예를 들어 BxB1, 및 phiC3의 것을 사용하는 것 (문헌 [Smith, M.C., Brown, W.R., McEwan, A.R. and Rowley, P.A. (2010) Site-specific recombination by phiC31 integrase and other large serine recombinases. Biochem. Soc. Trans., 38, 388-394] 참조), 및 그의 조합을 포함한다. 각각의 랜딩 패드에 단일 att 부위를 사용하는 것이, 제2의 GOI 플라스미드를 각각의 랜딩 패드에 삽입하기에 충분하다. 이러한 경우, 선형 플라스미드가 염색체를 효과적으로 제한하므로 제2의 GOI 플라스미드는 원형이어야 한다. 또한 랜딩 패드는 여러 개의 att 부위를 함유할 수 있으므로, 각각이 독특한 어드레스를 함유하는 것은 명백하다.
독특한 어드레스가 있는 랜딩 패드가 있는 듀오-랜딩 패드 구성은 또한, 어드레싱이 불가능한 경우와 비교하여 더 규정된 다양성의 발현 세포주를 생성하고 단일 랜딩 패드가 있는 랜딩 패드 세포주에 대한 더 높은 다양성을 생성하는 데 사용될 수 있다.
어드레싱가능한 랜딩 패드의 부가의 적용은 각각 자신의 독립적인 기능을 가지고 발현되는 2개의 독립적인 생물학적 제제를 갖는 옵션이다. 생물학적 제제 중 하나는 발현 세포주가 제2의 생물학적 제제를 발현하는 데 도움이 될 수 있거나, 제1의 생물학적 제제는 제2의 생물학적 제제의 특정한 번역 후 변형을 일으키거나 발현 세포주의 일부 다른 성분을 변형시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법, 세포, 세포주 또는 키트는 적어도 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 적어도 2개의 발현 플라스미드를 직렬로 포함한다. 다시 말해서, 일부 측면에서, 하기 식 내의 n 값 또는 n 값을 함유하는 본원에 개시된 임의의 다른 식은 2 이상일 수 있다:
CG/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG;
CG/-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG;
CG/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-[P1])-/CG;
CG/-([P1]-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG;
CG/-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-/CG;
CG/-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG;
CG/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG;
CG/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG;
CG/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1])-/CG;
CG/-([P1]-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG;
CG/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG; 또는
CG/-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG
일부 구체적 측면에서, n은 2이다. 따라서, 일부 측면에서, 직렬로 배열된 적어도 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 적어도 2개의 발현 플라스미드가 본원에 개시된 구축물에 존재한다. 일부 측면에서, n은 정수, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 일부 측면에서, n은 10 초과, 예를 들어 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30이다.
일부 측면에서, 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 2개의 발현 플라스미드는 헤드-투-헤드, 테일-투-테일, 테일-투-헤드, 및 헤드-투-테일로 이루어진 군으로부터 선택된 구성으로 존재한다. 일부 측면에서, 각각의 발현 플라스미드는 적어도 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 모든 GOI가 동일하다. 일부 측면에서, 모든 GOI가 상이하다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 GOI가 나머지와 상이하다. 일부 측면에서, 제1의 GOI는 항체의 HC이고, 제2의 GOI는 항체의 LC이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 발현 플라스미드는 바이시스트론 또는 폴리시스트론이다. 일부 측면에서, 바이시스트론 발현 플라스미드는 항체의 HC를 포함하는 제1의 GOI, 및 항체의 LC를 포함하는 제2의 GOI를 코딩한다.
일부 측면에서, 듀오-랜딩 패드 내의 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 어드레싱가능하다. 일부 측면에서, 각각의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드는 독특하거나 호환불가능할 수 있는 SSRS 쌍을 포함한다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 Lox 부위를 포함한다. 일부 측면에서, Lox 부위는 Lox P 및 Lox 511이다. 일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 Lox 부위 및 Frt 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 1개 또는 2개의 aat 부위, 예를 들어 2개의 aatP 부위를 포함한다.
일부 측면에서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드는 어드레싱가능하다. 일부 측면에서, 각각의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드는 랜딩 패드에 독특한 어드레싱가능한 SSRS 쌍을 포함한다. 일부 측면에서, 어드레싱가능한 SSRS 중 적어도 한 쌍은 Lox 부위 쌍이다. 일부 측면에서, Lox 부위 중 적어도 한 쌍은 Lox 511 및 Lox P이다. 일부 측면에서, Lox 부위 중 적어도 한 쌍은 Lox m3 및 Lox m7이다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법, 세포주, 세포 또는 키트는 Lox 부위의 Lox 511 및 Lox P 쌍을 포함하는 제1의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드, 및 Lox 부위의 Lox m3 및 Lox m7 쌍을 포함하는 제2의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드를 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드는 상호 호환불가능한 attP 부위를 포함한다.
일부 측면에서, LoxP 부위는 서열식별번호: 1-11 및 28-82 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, Frt 부위는 서열식별번호: 12 및 83-91 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 어드레싱가능한 패드는 서열식별번호: 1-13 및 28-109, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 SSRS 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, att 부위는 서열식별번호: 92 내지 109 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 92의 attB 부위 및 서열식별번호: 93의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 94의 attB 부위 및 서열식별번호: 95의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 96의 attB 부위 및 서열식별번호: 97의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 98의 attB 부위 및 서열식별번호: 99의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 100의 attB 부위 및 서열식별번호: 101의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 102의 attB 부위 및 서열식별번호: 103의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 104의 attB 부위 및 서열식별번호: 105의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 106의 attB 부위 및 서열식별번호: 107의 attP 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 한 쌍의 att 부위는 서열식별번호: 108의 attB 부위 및 서열식별번호: 109의 attP 부위를 포함한다.
뉴클레아제
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레아제"는 DNA 절단에 대한 촉매 활성을 보유하는 효소를 지칭한다.
일부 측면에서, 뉴클레아제 작용제는 본원에 개시된 2개의 플라스미드, 예를 들어 선형 플라스미드, 예를 들어 모 플라스미드와 랜딩 패드 플라스미드 간의 상동 재조합을 촉진시킬 수 있다. 일부 측면에서, 모 세포주의 게놈에 통합된 플라스미드 (모 플라스미드, P1) 및 랜딩 패드 플라스미드 (P2)는 상동성 영역을 함유하고, 각각의 상동성 영역 다음에는 뉴클레아제, 예를 들어 CRISPR/Cas 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이, 모 세포주에 통합된 모 플라스미드에 존재하지만 모 세포주에 재조합되는 랜딩 패드 플라스미드에는 존재하지 않는다.
상동 재조합을 매개하는 뉴클레아제에 대한 인식 부위의 크기는 다양할 수 있고, 예를 들어 적어도 약 4, 적어도 약 6, 적어도 약 8, 적어도 약 10, 적어도 약 12, 적어도 약 14, 적어도 약 16, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 21, 적어도 약 22, 적어도 약 23, 적어도 약 24, 적어도 약 25, 적어도 약 26, 적어도 약 27, 적어도 약 28, 적어도 약 29, 적어도 약 30, 적어도 약 31, 적어도 약 32, 적어도 약 33, 적어도 약 34, 적어도 약 35, 적어도 약 36, 적어도 약 37, 적어도 약 38, 적어도 약 39, 적어도 약 40, 적어도 약 41, 적어도 약 42, 적어도 약 43, 적어도 약 44, 적어도 약 45, 적어도 약 46, 적어도 약 47, 적어도 약 48, 적어도 약 49, 적어도 약 50, 적어도 약 51, 적어도 약 52, 적어도 약 53, 적어도 약 54, 적어도 약 55, 적어도 약 56, 적어도 약 57, 적어도 약 58, 적어도 약 59, 적어도 약 60, 적어도 약 61, 적어도 약 62, 적어도 약 63, 적어도 약 64, 적어도 약 65, 적어도 약 66, 적어도 약 67, 적어도 약 68, 적어도 약 69, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 적어도 약 600, 적어도 약 610, 적어도 약 620, 적어도 약 630, 적어도 약 640, 적어도 약 650, 적어도 약 660, 적어도 약 670, 적어도 약 680, 적어도 약 690, 적어도 약 700, 적어도 약 710, 적어도 약 720, 적어도 약 730, 적어도 약 740, 적어도 약 750, 적어도 약 760, 적어도 약 770, 적어도 약 780, 적어도 약 790, 적어도 약 800, 적어도 약 810, 적어도 약 820, 적어도 약 830, 적어도 약 840, 적어도 약 850, 적어도 약 860, 적어도 약 870, 적어도 약 880, 적어도 약 890, 적어도 약 900, 적어도 약 910, 적어도 약 920, 적어도 약 930, 적어도 약 940, 적어도 약 950, 적어도 약 960, 적어도 약 970, 적어도 약 980, 적어도 약 990, 적어도 약 1000, 적어도 약 1010, 적어도 약 1020, 적어도 약 1030, 적어도 약 1040, 적어도 약 1050, 적어도 약 1060, 적어도 약 1070, 적어도 약 1080, 적어도 약 1090, 적어도 약 1100, 적어도 약 1110, 적어도 약 1120, 적어도 약 1130, 적어도 약 1140, 적어도 약 1150, 적어도 약 1160, 적어도 약 1170, 적어도 약 1180, 적어도 약 1190, 적어도 약 1200, 적어도 약 2010, 적어도 약 2020개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이인 인식 부위를 포함한다.
상동 재조합을 매개하는 뉴클레아제에 대한 인식 부위의 크기는 다양할 수 있고, 예를 들어 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 약 300, 약 310, 약 320, 약 330, 약 340, 약 350, 약 360, 약 370, 약 380, 약 390, 약 400, 약 410, 약 420, 약 430, 약 440, 약 450, 약 460, 약 470, 약 480, 약 490, 약 500, 약 510, 약 520, 약 530, 약 540, 약 550, 약 560, 약 570, 약 580, 약 590, 약 600, 약 610, 약 620, 약 630, 약 640, 약 650, 약 660, 약 670, 약 680, 약 690, 약 700, 약 710, 약 720, 약 730, 약 740, 약 750, 약 760, 약 770, 약 780, 약 790, 약 800, 약 810, 약 820, 약 830, 약 840, 약 850, 약 860, 약 870, 약 880, 약 890, 약 900, 약 910, 약 920, 약 930, 약 940, 약 950, 약 960, 약 970, 약 980, 약 990, 약 1000, 약 1010, 약 1020, 약 1030, 약 1040, 약 1050, 약 1060, 약 1070, 약 1080, 약 1090, 약 1100, 약 1110, 약 1120, 약 1130, 약 1140, 약 1150, 약 1160, 약 1170, 약 1180, 약 1190, 약 1200, 약 2010, 약 2020개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이인 인식 부위를 포함한다.
상동 재조합을 매개하는 뉴클레아제에 대한 인식 부위의 크기는 다양할 수 있고, 예를 들어 약 4 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 125, 약 125 내지 약 150, 약 150 내지 약 175, 약 175 내지 약 200, 약 200 내지 약 225, 약 225 내지 약 250, 약 250 내지 약 275, 약 275 내지 약 300, 약 300 내지 약 325, 약 325 내지 약 350, 약 350 내지 약 375, 약 375 내지 약 400, 약 400 내지 약 425, 약 425 내지 약 450, 약 450 내지 약 475, 약 475 내지 약 500, 약 500 내지 약 525, 약 525 내지 약 550, 약 550 내지 약 575, 약 575 내지 약 600, 약 600 내지 약 625, 약 625 내지 약 650, 약 650 내지 약 675, 약 675 내지 약 700, 약 700 내지 약 725, 약 725 내지 약 750, 약 750 내지 약 775, 약 775 내지 약 800, 약 800 내지 약 825, 약 825 내지 약 850, 약 850 내지 약 875, 약 875 내지 약 900, 약 900 내지 약 925, 약 925 내지 약 950, 약 950 내지 약 975, 약 975 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1100, 약 1100 내지 약 1200, 약 1200 내지 약 1300, 약 1300 내지 약 1400, 약 1400 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 1600, 약 1600 내지 약 1700, 약 1700 내지 약 1800, 약 1800 내지 약 1900, 약 1900 내지 약 2000, 또는 약 2000 내지 약 2100개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이인 인식 부위를 포함한다.
한 측면에서, 뉴클레아제 작용제의 각각의 단량체는 적어도 9개 뉴클레오티드의 인식 부위를 인식한다. 다른 측면에서, 인식 부위는 약 9 내지 약 12개 뉴클레오티드 길이, 약 12 내지 약 15개 뉴클레오티드 길이, 약 15 내지 약 18개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 18 내지 약 21개 뉴클레오티드 길이, 및 이러한 하위범위의 임의의 조합 (예를 들어, 9-18개 뉴클레오티드)이다. 인식 부위는 회문식일 수 있는데, 즉 한 가닥 상의 서열이 상보적 가닥 상의 반대 방향에서도 동일하게 판독된다. 주어진 뉴클레아제 작용제는 인식 부위와 결합하여 그 결합 부위를 절단할 수 있거나, 또는 대안적으로 뉴클레아제 작용제는 인식 부위와 상이한 서열과 결합할 수 있는 것으로 인식된다. 더욱이, 용어 인식 부위는 닉/절단 부위가 뉴클레아제 작용제 결합 부위 내부에 있는지 외부에 있는지에 관계없이 뉴클레아제 작용제 결합 부위와 닉/절단 부위 둘 다를 포함한다. 또 다른 변형에서, 뉴클레아제 작용제에 의한 절단은 서로 바로 반대쪽의 뉴클레오티드 위치에서 발생하여 무딘 말단 커트를 생산할 수 있거나, 또는 다른 경우에는 절개를 엇갈리게 하여 "점착성 말단"이라고도 불리는 단일 가닥 오버행을 생산할 수 있으며, 이는 5' 오버행이거나 3' 오버행일 수 있다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드에서 누락된 모 플라스미드 내의 서열 중 하나는 서열식별번호: 14이고, 다른 하나는 서열식별번호: 15이다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드에서 누락된 모 플라스미드 내의 서열 중 하나는 서열식별번호: 14이다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드에서 누락된 모 플라스미드 내의 서열 중 하나는 서열식별번호: 15이다.
원하는 인식 부위에 닉 또는 이중 가닥 파손을 유도하는 임의의 뉴클레아제 작용제가 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 뉴클레아제 작용제가 원하는 인식 부위에 닉 또는 이중 가닥 파손을 유도하는 한, 자연 발생 또는 천연 뉴클레아제 작용제가 이용될 수 있다. 대안적으로, 변형되거나 조작된 뉴클레아제 작용제를 이용할 수 있다. "조작된 뉴클레아제 작용제"는 원하는 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 파손을 특이적으로 인식하고 유도하도록 그의 천연 형태로부터 조작 (변형 또는 유래)되는 뉴클레아제를 포함한다. 따라서, 조작된 뉴클레아제 작용제는 천연의 자연 발생 뉴클레아제 작용제로부터 유래될 수 있거나 인공적으로 생성되거나 합성될 수 있다. 뉴클레아제 작용제의 변형은 단백질 절단제에서의 하나의 아미노산 또는 핵산 절단제에서의 하나의 뉴클레오티드만큼 적을 수 있다. 일부 측면에서, 조작된 뉴클레아제는 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 파손을 유도하며, 여기서 인식 부위는 천연 (조작되지 않거나 또는 변형되지 않은) 뉴클레아제 작용제에 의해 인식되었을 서열이 아니었다. 인식 부위 또는 다른 DNA에 닉 또는 이중 가닥 파손을 초래하는 것은 본원에서 인식 부위 또는 다른 DNA를 "커팅" 또는 "절단"하는 것으로서 지칭될 수 있다.
상동 재조합 시스템
본 개시내용의 일부 측면에서, 상동 재조합은 CRISPR/Cas 시스템, TALEN 시스템, ZFN 시스템, 메가 뉴클레아제, 또는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 매개된다.
CRISPR/Cas
일부 측면에서, 본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에서 상동 재조합을 위해 이용되는 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템을 포함할 수 있다. 본 도면에서 CRISPR/Cas를 "디폴트" 상동 재조합 시스템으로서 묘사한 것은 단지 예시적이며, 본 도면에 도식화된 프로세스는 대안적인 상동 재조합 시스템, 예를 들어 TALEN 시스템, ZFN 시스템, 메가 뉴클레아제, 또는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행될 수 있다는 것을 참고한다. 이러한 CRISPR/Cas 시스템은, 예를 들어 Cas9 뉴클레아제를 이용할 수 있으며, 이는 일부 경우에는 발현될 원하는 세포 유형에 대해 코돈 최적화된다. 이러한 시스템은 또한 2개의 별도의 분자를 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 이용할 수 있다. 예시적인 2-분자 gRNA는 crRNA-유사 ("CRISPR RNA" 또는 "표적제-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복") 분자 및 상응하는 tracrRNA-유사 ("트랜스-작용 CRISPR RNA" 또는 "활성화제-RNA" 또는 "tracrRNA" 또는 "스캐폴드") 분자를 포함한다.
crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 세그먼트 (단일 가닥)와 gRNA의 단백질-결합 세그먼트의 이중 가닥 RNA (dsRNA) 듀플렉스의 절반을 형성하는 뉴클레오티드의 연장물을 모두 포함한다. 상응하는 tracrRNA (활성화제-RNA)는 gRNA의 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스의 나머지 절반을 형성하는 뉴클레오티드의 연장물을 포함한다. 따라서, crRNA의 뉴클레오티드 연장물은 tracrRNA의 뉴클레오티드 연장물에 상보적이고 이와 혼성화하여 gRNA의 단백질-결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스를 형성한다. 이와 같이, 각각의 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 갖고 있다고 할 수 있다. crRNA는 부가적으로, 단일 가닥 DNA-표적화 세그먼트를 제공한다. 따라서, gRNA는 표적 서열과 혼성화되는 서열, 및 tracrRNA를 포함한다. 따라서, crRNA와 tracrRNA (상응하는 쌍으로서)가 혼성화되어 gRNA를 형성한다. 세포 내 변형을 위해 사용되는 경우, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열 및/또는 길이는 RNA 분자가 사용될 종에 특이적이도록 설계될 수 있다.
3가지 요소 (Cas9, tracrRNA 및 crRNA)를 코딩하는 자연 발생 유전자는 전형적으로 오페론으로 조직된다. 자연 발생 CRISPR RNA는 Cas9 시스템 및 유기체에 따라 상이하지만 종종 21 내지 72개 뉴클레오티드 길이의 표적화 세그먼트를 함유하고, 21 내지 46개 뉴클레오티드 길이의 2개 직접 반복부 (DR)에 의해 플랭킹된다 (예를 들어, WO2014/131833 참조). 에스. 피오게네스(S. pyogenes)의 경우, DR은 36개 뉴클레오티드 길이이고 표적화 세그먼트는 30개 뉴클레오티드 길이이다. 3' 위치된 DR은 상응하는 tracrRNA에 상보적이고 이와 혼성화되며, 이는 순차적으로 Cas9 단백질과 결합한다.
대안적으로, 시스템은 코돈-최적화된 Cas9와 함께 기능하는 융합된 crRNA-tracrRNA 구축물 (즉, 단일 전사체)을 추가로 이용한다. 이러한 단일 RNA는 종종 가이드 RNA 또는 gRNA로서 지칭된다. gRNA 내에서, crRNA 부분은 주어진 인식 부위에 대한 "표적 서열"로서 확인되며 tracrRNA는 종종 "스캐폴드"로서 지칭된다. 간단히 언급하면, 표적 서열을 함유하는 짧은 DNA 단편이 가이드 RNA 발현 플라스미드 내로 삽입된다. gRNA 발현 플라스미드는 표적 서열 (일부 측면에서 약 20개의 뉴클레오티드), tracrRNA 서열의 형태 (스캐폴드)뿐만 아니라 세포에서 활성인 적합한 프로모터 및 진핵 세포에서 적당한 프로세싱을 위해 필요한 요소를 포함한다. 많은 시스템은 어닐링되어 이중 가닥 DNA를 형성한 다음, gRNA 발현 플라스미드로 클로닝되는 맞춤형 상보적 올리고뉴클레오티드에 의존한다.
그런 다음 gRNA 발현 카세트와 Cas9 발현 카세트를 세포 내로 도입한다. 예를 들어, 문헌 [Mali P et al. (2013) Science 2013 Feb. 15; 339(6121):823-6; Jinek M et al. Science 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21; Hwang W Y et al. Nat Biotechnol 2013 March; 31(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol 2013 March; 31(3):233-9; and Cong L et al. Science 2013 Feb. 15; 339(6121):819-23] (이들 각각은 본원에 참조로 포함된다)을 참조한다. 또한 예를 들어, WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2, WO/2014/099750A2, 및 WO/2013142578A1 (이들 각각은 본원에 참조로 포함된다)을 참조한다.
일부 측면에서 Cas9 뉴클레아제는 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 일부 측면에서, Cas9 단백질은 gRNA와의 복합체의 형태로 제공될 수 있다. 다른 측면에서, Cas9 뉴클레아제는 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 제공될 수 있다. Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 RNA (예를 들어, 메신저 RNA (mRNA)) 또는 DNA일 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 RNA의 형태로 제공될 수 있다. 다른 측면에서, gRNA는 RNA를 코딩하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 별도의 crRNA 및 tracrRNA 분자, 또는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 코딩하는 별도의 DNA 분자의 형태로 제공될 수 있다.
한 측면에서, 본원에 개시된 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법은 세포 내로 하기를 도입하는 것을 추가로 포함한다: (a) CRISPR-연관 (Cas) 단백질을 코딩하는 제1의 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1의 프로모터를 포함하는 제1의 발현 구축물; (b) 가이드 RNA (gRNA)에 연결된 게놈 표적 서열에 작동가능하게 연결된 제2의 프로모터를 포함하는 제2의 발현 구축물이며, 여기서 게놈 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프에 의해 플랭킹되는 것이다. 임의로, 게놈 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열의 3' 말단에 플랭킹된다.
일부 측면에서, gRNA는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 코딩하는 제3의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, Cas 단백질은 유형 I Cas 단백질이다. 한 측면에서, Cas 단백질은 유형 II Cas 단백질이다. 한 측면에서, 유형 II Cas 단백질은 Cas9이다. 한 측면에서, 유형 II Cas, 예를 들어 Cas9는 인간 코돈-최적화된 Cas이다.
특정 측면에서, Cas 단백질은 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 두 가닥을 모두 커팅하지 않고서도 표적 부위에서 단일 가닥 파손부 (즉, "닉")을 생성할 수 있는 "닉카제"이다. Cas9는 예를 들어, 반대편 DNA 가닥의 절단을 담당하는 2개의 뉴클레아제 도메인 - RuvC-유사 뉴클레아제 도메인과 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 - 을 포함한다. 이들 도메인 중 하나에서의 돌연변이가 닉카제를 생성할 수 있다. 닉카제를 생성하는 돌연변이의 예는, 예를 들어 WO/2013/176772A1 및 WO/2013/142578A1에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
특정 측면에서, dsDNA의 각각의 가닥 상의 표적 부위에 특이적인 2개의 별도의 Cas 단백질 (예를 들어, 닉카제)은 또 다른 핵산 상의 오버행 서열에 상보적인 오버행 서열, 또는 동일한 핵산 상의 별도의 영역을 생성할 수 있다. dsDNA의 양쪽 가닥 상의 표적 부위에 특이적인 2개의 닉카제와 핵산을 접촉시킴으로써 생성된 오버행 말단은 5' 또는 3' 오버행 말단일 수 있다. 예를 들어, 제1의 닉카제는 dsDNA의 제1의 가닥에 단일 가닥 파손부를 생성할 수 있는 반면, 제2의 닉카제는 dsDNA의 제2의 가닥에 단일 가닥 파손부를 생성하여 오버행 서열이 생성될 수 있도록 한다. 단일 가닥 파손부를 생성하는 각각의 닉카제의 표적 부위는, 생성된 오버행 말단 서열이 상이한 핵산 분자 상의 오버행 말단 서열에 상보적이도록 선택될 수 있다. 2개의 상이한 핵산 분자의 상보적인 오버행 말단은 본원에 개시된 방법에 의해 어닐링될 수 있다. 일부 측면에서, 제1의 가닥 상의 닉카제의 표적 부위는 제2의 가닥 상의 닉카제의 표적 부위와 상이하다.
일부 측면에서, 제1의 핵산은 Cas 단백질 내의 뉴클레아제 활성 부위의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 파괴하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이 Cas 단백질은 표적 DNA 영역의 단 하나의 가닥에서만 파손부를 생성하고, 여기서 돌연변이는 표적 DNA 영역에서의 비-상동 재조합을 감소시킨다. 한 측면에서, Cas 단백질을 코딩하는 제1의 핵산은 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 핵 국재화 신호는 SV40 핵 국재화 신호이다.
TALEN
일부 측면에서, 본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에서 상동 재조합을 위해 이용되는 뉴클레아제 작용제는 TALEN 시스템을 포함할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 뉴클레아제 작용제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 원핵생물 또는 진핵생물 유기체 게놈 내의 특이적 표적 서열에서 이중 가닥 파손부를 제조하는 데 사용될 수 있는 서열 특이적 뉴클레아제 클래스이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 천연 또는 조작된 전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터, 또는 그의 기능적 부분을 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인, 예컨대 예를 들어 FokI와 융합시킴으로써 생성된다.
독특한 모듈형 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 통해 잠재적으로 임의의 주어진 DNA 인식 특이성을 갖는 단백질을 설계할 수 있다. 따라서, TAL 이펙터 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 특이적 DNA 표적 부위를 인식하도록 조작될 수 있으며, 따라서 원하는 표적 서열에서 이중 가닥 파손부를 제조하는 데 사용될 수 있다. 문헌 [WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; and Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148] (이들 모두는 본원에 참조로 포함된다)을 참조한다.
적합한 TAL 뉴클레아제의 예, 및 적합한 TAL 뉴클레아제를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 출원 번호 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1, 및 2006/0063231 A1에 개시되어 있다 (각각은 본원에 참조로 포함됨).
다양한 측면에서, TAL 이펙터 뉴클레아제는 예를 들어, 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 핵산 서열에서 커팅되거나 그 근처에서 커팅되도록 조작되며, 여기서 표적 핵산 서열은 표적화 벡터에 의해 변형될 서열 또는 그 근처에 있다. 본원에 제공된 다양한 방법 및 조성물과 함께 사용하기에 적합한 TAL 뉴클레아제는 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터에 의해 변형될 표적 핵산 서열에서 또는 그 근처에서 결합하도록 특이적으로 설계된 것을 포함한다.
한 측면에서, TALEN의 각각의 단량체는 12-25개의 TAL 반복부를 포함하며, 여기서 각각의 TAL 반복부는 1 bp 하위 부위와 결합한다. 한 측면에서, 뉴클레아제 작용제는 독립적인 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 TAL 반복부 기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 한 측면에서, 독립적인 뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 한 측면에서, 뉴클레아제 작용제는 제1의 TAL-반복부 기반 DNA 결합 도메인 및 제2의 TAL-반복부 기반 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 제1의 및 제2의 TAL-반복부 기반 DNA 결합 도메인 각각은 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 제1의 및 제2의 TAL-반복부 기반 DNA 결합 도메인은 약 6 bp 내지 약 40 bp 절단 부위에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각각의 가닥 내의 2개의 연속 표적 DNA 서열을 인식하고, 여기서 FokI 뉴클레아제는 이량체화하여 표적 서열에서 이중 가닥 파손부를 만든다.
한 측면에서, 뉴클레아제 작용제는 제1의 TAL-반복부 기반 DNA 결합 도메인 및 제2의 TAL-반복부 기반 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 제1의 및 제2의 TAL-반복부 기반 DNA 결합 도메인 각각은 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 제1의 및 제2의 TAL-반복부 기반 DNA 결합 도메인은 5 bp 또는 6 bp 절단 부위에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각각의 가닥 내의 2개의 연속 표적 DNA 서열을 인식하고, 여기서 FokI 뉴클레아제는 이량체화되어 이중 가닥 파손부를 만든다.
아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)
일부 측면에서, 본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에서 상동 재조합을 위해 이용되는 뉴클레아제 작용제는 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템을 포함할 수 있다. 한 측면에서, ZFN의 각각의 단량체는 3개 이상의 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인은 3 bp 하위 부위와 결합한다. 다른 측면에서, ZFN은 독립적인 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 한 측면에서, 독립적인 엔도뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 한 측면에서, 뉴클레아제 작용제는 제1의 ZFN 및 제2의 ZFN을 포함하며, 여기서 제1의 ZFN 및 제2의 ZFN 각각은 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 제1의 및 제2의 ZFN은 약 6 bp 내지 약 40 bp 절단 부위 또는 약 5 bp 내지 약 6 bp 절단 부위에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각각의 가닥 내의 2개의 연속 표적 DNA 서열을 인식하고, 여기서 FokI 뉴클레아제는 이량체화되어 이중 가닥 파손부를 만든다. 예를 들어, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; 및 WO/2011/017293A2을 참조한다 (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨).
메가뉴클레아제
일부 측면에서, 본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에서 상동 재조합을 위해 이용되는 뉴클레아제 작용제는 메가뉴클레아제 시스템을 포함할 수 있다. 메가뉴클레아제는 보존된 서열 모티프를 기반으로 4가지 패밀리로 분류되었으며, 그러한 패밀리는 "LAGLIDADG", "GIY-YIG", "H-N-H" 및 "His-Cys box" 패밀리이다. 이들 모티프는 금속 이온의 배위 및 포스포디에스테르 결합의 가수분해에 참여한다.
HEase는 긴 인식 부위와 DNA 기질의 일부 서열 다형성을 허용하는 것으로 유명하다. 메가뉴클레아제 도메인, 구조 및 기능은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; and Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764] 참조).
일부 예에서 자연 발생 변이체 및/또는 조작된 유도체 메가뉴클레아제가 사용된다. 동역학, 보조인자 상호작용, 발현, 최적의 조건 및/또는 인식 부위 특이성을 변형시키고, 활성에 대해 스크리닝하는 방법이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; 및 WO2004031346] 참조).
하기를 포함하나 그에 제한되지는 않는 임의의 메가뉴클레아제가 본원에 사용될 수 있다: I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SecVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, 또는 그의 임의의 활성 변이체 또는 단편.
한 측면에서, 메가뉴클레아제는 12 내지 40개 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열을 인식한다. 한 측면에서, 메가뉴클레아제는 본원에 기재된 이종 플라스미드 중 하나에서 완벽하게 일치하는 하나의 표적 서열을 인식한다. 한 측면에서, 메가뉴클레아제는 귀소 뉴클레아제이다. 한 측면에서, 귀소 뉴클레아제는 귀소 뉴클레아제의 "LAGLIDADG" 패밀리이다. 한 측면에서, 귀소 뉴클레아제의 "LAGLIDADG" 패밀리는 I-SceI, I-CreI 및 I-Dmol로부터 선택된다.
제한 엔도뉴클레아제
일부 측면에서, 본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에서 상동 재조합을 위해 이용되는 뉴클레아제 작용제는 유형 I, 유형 II, 유형 III 및 유형 IV 엔도뉴클레아제를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 유형 I 및 유형 III 제한 엔도뉴클레아제는 특이적 인식 부위를 인식하지만, 전형적으로 절단 부위 (인식 부위)로부터 수백 염기쌍 떨어져 있을 수 있는 뉴클레아제 결합 부위로부터의 가변 위치에서 절단된다. 유형 II 시스템에서, 제한 활성은 임의의 메틸라제 활성과 무관하며, 절단은 전형적으로 결합 부위 내부 또는 그 근처의 특이적 부위에서 발생한다. 대부분의 유형 II 효소는 회문식 서열을 커팅하지만, 유형 IIa 효소는 비-회문식 인식 부위를 인식하여 인식 부위 외부를 절단하고, 유형 IIb 효소는 인식 부위 외부의 두 부위 모두에서 서열을 2회 커팅하며, 유형 IIs 효소는 비대칭 인식 부위를 인식하고 인식 부위로부터 약 1-20개 뉴클레오티드의 규정된 거리와 한쪽에서 절단한다. 유형 IV 제한 효소는 메틸화된 DNA를 표적으로 한다. 제한 효소는, 예를 들어 REBASE 데이터베이스 (rebase.neb.com의 웹페이지; 문헌 [Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20]), 문헌 [Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, and Belfort et al., (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, D.C.)]에 추가로 기재되고 분류된다.
뉴클레아제 작용제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 뉴클레아제 작용제를 코딩하는 폴리펩티드는 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 작용제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 뉴클레아제 작용제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되는 경우, 뉴클레아제 작용제는 세포 내에서 일시적으로, 조건부로 또는 구성적으로 발현될 수 있다. 따라서, 뉴클레아제 작용제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에 함유될 수 있고 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 관심 프로모터는 본원의 다른 곳에서 추가로 자세히 논의된다. 대안적으로, 뉴클레아제 작용제는 이러한 뉴클레아제 작용제를 코딩하거나 포함하는 mRNA로서 세포 내로 도입된다.
뉴클레아제 작용제의 활성 변이체 및 단편 (즉, 조작된 뉴클레아제 작용제)이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 천연 뉴클레아제 작용제와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 여기서 활성 변이체는 원하는 인식 부위에서 커팅할 수 있는 능력을 유지하고, 따라서 닉 또는 이중 가닥 파손 유도 활성을 유지한다. 예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제 중 임의의 것은 천연 엔도뉴클레아제 서열로부터 변형될 수 있고, 천연 뉴클레아제 작용제에 의해 인식되지 않은 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 파손을 인식하고 유도하도록 설계될 수 있다. 따라서 일부 측면에서, 조작된 뉴클레아제는 상응하는 천연 뉴클레아제 작용제 인식 부위와 상이한 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 파손을 유도하는 특이성을 갖는다. 닉 또는 이중 가닥 파손 유도 활성에 대한 검정은 공지되어 있으며 일반적으로 인식 부위를 함유하는 DNA 기질에 대한 엔도뉴클레아제의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
뉴클레아제 작용제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입을 통해 뉴클레아제 작용제를 세포에 제공하는 경우, 뉴클레아제 작용제를 코딩하는 이러한 폴리뉴클레오티드는 뉴클레아제 작용제를 코딩하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 서열과 비교 시, 관심 세포에서 사용 빈도가 더 높은 코돈을 대체하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 작용제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 서열과 비교 시, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 비-래트 진핵 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 비-래트 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포를 포함한, 주어진 관심 원핵 또는 진핵 세포에서 사용 빈도가 더 높은 코돈으로 대체되도록 변형될 수 있다.
상동 재조합 서열
본 개시내용의 방법 및 조성물의 중요한 이점은 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분이 삽입될 게놈 상황에 관한 정보를 필요로 하지 않으면서 랜딩 패드 세포를 생성할 수 있다는 것이다. 이는 본원에 개시된 방법이 모 플라스미드가 차지하는 위치에 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분의 표적화된 통합에 의존하기 때문에 가능하다. 모 플라스미드에 관한 서열 정보는 일반적으로 입수가능하거나 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 상업용 플라스미드). 따라서, 상동 재조합을 통해 모 플라스미드의 내부 하위서열과 랜딩 패드 플라스미드 서열 또는 그의 일부분의 교환을 가이드하는 상동 재조합 서열을 생성하기 위해 그러한 정보에 의존하는 것이 가능하다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 16으로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 550, 또는 적어도 약 553개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 17로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 적어도 약 600, 적어도 약 610, 적어도 약 620, 적어도 약 630, 적어도 약 640, 적어도 약 650, 적어도 약 660, 적어도 약 670, 적어도 약 680, 적어도 약 690, 적어도 약 700, 적어도 약 710, 적어도 약 720, 적어도 약 730, 적어도 약 740, 적어도 약 750, 적어도 약 760, 적어도 약 770, 적어도 약 780, 적어도 약 790, 적어도 약 800, 적어도 약 810, 적어도 약 820, 적어도 약 830, 적어도 약 840, 적어도 약 850, 적어도 약 860, 적어도 약 870, 적어도 약 880, 적어도 약 890, 적어도 약 900, 적어도 약 1000, 적어도 약 1010, 적어도 약 1020, 적어도 약 1030, 적어도 약 1040, 적어도 약 1050, 적어도 약 1060, 적어도 약 1070, 적어도 약 1080, 적어도 약 1090, 적어도 약 1100, 적어도 약 1110, 적어도 약 1120, 적어도 약 1130, 적어도 약 1140, 적어도 약 1150, 적어도 약 1160, 적어도 약 1170, 적어도 약 1180, 적어도 약 1190, 적어도 약 1200, 적어도 약 1210, 적어도 약 1220, 또는 적어도 약 1221개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 16로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 550, 또는 적어도 약 553개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고; 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 17로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 적어도 약 600, 적어도 약 610, 적어도 약 620, 적어도 약 630, 적어도 약 640, 적어도 약 650, 적어도 약 660, 적어도 약 670, 적어도 약 680, 적어도 약 690, 적어도 약 700, 적어도 약 710, 적어도 약 720, 적어도 약 730, 적어도 약 740, 적어도 약 750, 적어도 약 760, 적어도 약 770, 적어도 약 780, 적어도 약 790, 적어도 약 800, 적어도 약 810, 적어도 약 820, 적어도 약 830, 적어도 약 840, 적어도 약 850, 적어도 약 860, 적어도 약 870, 적어도 약 880, 적어도 약 890, 적어도 약 900, 적어도 약 1000, 적어도 약 1010, 적어도 약 1020, 적어도 약 1030, 적어도 약 1040, 적어도 약 1050, 적어도 약 1060, 적어도 약 1070, 적어도 약 1080, 적어도 약 1090, 적어도 약 1100, 적어도 약 1110, 적어도 약 1120, 적어도 약 1130, 적어도 약 1140, 적어도 약 1150, 적어도 약 1160, 적어도 약 1170, 적어도 약 1180, 적어도 약 1190, 적어도 약 1200, 적어도 약 1210, 적어도 약 1220, 또는 적어도 약 1221개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 114의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 115의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 114의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 115의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 114로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 또는 적어도 약 508개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 115로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 또는 적어도 약 298개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 5' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 114로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 또는 적어도 약 508개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고; 3' 상동 재조합 부위는 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 115로부터의 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 또는 적어도 약 298개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 상동 재조합 서열 (즉, 유리 플라스미드, 예를 들어 도 5a의 랜딩 패드 플라스미드 또는 제2의 GOI 플라스미드가, 통합된 플라스미드, 예컨대 도 5a의 모 플라스미드 또는 통합된 랜딩 패드 플라스미드로 표적으로 하는 DNA-표적화 세그먼트)은 약 12개 뉴클레오티드 내지 약 100개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 상동 재조합 서열은 약 12 뉴클레오티드 (nt) 내지 약 80 nt, 약 12 nt 내지 약 50 nt, 약 12 nt 내지 약 40 nt, 약 12 nt 내지 약 30 nt, 약 12 nt 내지 약 25 nt, 약 12 nt 내지 약 20 nt, 또는 약 12 nt 내지 약 19 nt의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 상동 재조합 서열은 약 19 nt 내지 약 20 nt, 약 19 nt 내지 약 25 nt, 약 19 nt 내지 약 30 nt, 약 19 nt 내지 약 35 nt, 약 19 nt 내지 약 40 nt, 약 19 nt 내지 약 45 nt, 약 19 nt 내지 약 50 nt, 약 19 nt 내지 약 60 nt, 약 19 nt 내지 약 70 nt, 약 19 nt 내지 약 80 nt, 약 19 nt 내지 약 90 nt, 약 19 nt 내지 약 100 nt, 약 20 nt 내지 약 25 nt, 약 20 nt 내지 약 30 nt, 약 20 nt 내지 약 35 nt, 약 20 nt 내지 약 40 nt, 약 20 nt 내지 약 45 nt, 약 20 nt 내지 약 50 nt, 약 20 nt 내지 약 60 nt, 약 20 nt 내지 약 70 nt, 약 20 nt 내지 약 80 nt, 약 20 nt 내지 약 90 nt, 또는 약 20 nt 내지 약 100 nt, 약 100 nt 내지 약 125 nt, 약 125 nt 내지 약 150 nt, 약 150 nt 내지 약 175 nt, 약 175 nt 내지 약 200 nt, 약 200 nt 내지 약 225 nt, 약 225 nt 내지 약 250 nt, 약 250 nt 내지 약 300 nt, 약 300 nt 내지 약 350 nt, 약 350 nt 내지 약 400 nt, 약 400 nt 내지 약 450 nt, 약 450 nt 내지 약 500 nt, 약 500 nt 내지 약 600 nt, 약 600 nt 내지 약 700 nt, 약 700 nt 내지 약 800 nt, 약 800 nt 내지 약 900 nt, 약 900 nt 내지 약 1000 nt, 약 1000 nt 내지 약 1100 nt, 약 1100 nt 내지 약 1200 nt, 약 1200 nt 내지 약 1300 nt, 약 1300 nt 내지 약 1400 nt, 또는 약 1400 nt 내지 약 1500 nt의 길이를 가질 수 있다.
일부 측면에서, 통합된 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 유리 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 12 nt, 적어도 약 15 nt, 적어도 약 18 nt, 적어도 약 19 nt, 적어도 약 20 nt, 적어도 약 21 nt, 적어도 약 25 nt, 적어도 약 30 nt, 적어도 약 35 nt, 적어도 약 40 nt, 적어도 약 45 nt, 적어도 약 50 nt, 적어도 약 55 nt, 적어도 약 60 nt, 적어도 약 65 nt, 적어도 약 70 nt, 적어도 약 75 nt, 적어도 약 80 nt, 적어도 약 85 nt, 적어도 약 90 nt, 적어도 약 95 nt, 적어도 약 100 nt, 적어도 약 200 nt, 적어도 약 300 nt, 적어도 약 400 nt, 적어도 약 500 nt, 적어도 약 600 nt, 적어도 약 700 nt, 적어도 약 800 nt, 적어도 약 900 nt, 적어도 약 1000 nt, 적어도 약 1100 nt, 적어도 약 1200 nt, 적어도 약 1300 nt, 적어도 약 1400 nt, 또는 적어도 약 1500 nt의 길이를 가질 수 있다.
일부 측면에서, 통합된 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 유리 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열은 약 12 뉴클레오티드 (nt) 내지 약 100 nt, 약 12 nt 내지 약 90 nt, 약 12 nt 내지 약 80 nt, 약 12 nt 내지 약 70 nt, 약 12 nt 내지 약 60 nt, 약 12 nt 내지 약 50 nt, 약 12 nt 내지 약 45 nt, 약 12 nt 내지 약 40 nt, 약 12 nt 내지 약 35 nt, 약 12 nt 내지 약 30 nt, 약 12 nt 내지 약 25 nt, 약 12 nt 내지 약 20 nt, 약 12 nt 내지 약 19 nt, 약 19 nt 내지 약 20 nt, 약 19 nt 내지 약 25 nt, 약 19 nt 내지 약 30 nt, 약 19 nt 내지 약 35 nt, 약 19 nt 내지 약 40 nt, 약 19 nt 내지 약 45 nt, 약 19 nt 내지 약 50 nt, 약 19 nt 내지 약 60 nt, 약 20 nt 내지 약 25 nt, 약 20 nt 내지 약 30 nt, 약 20 nt 내지 약 35 nt, 약 20 nt 내지 약 40 nt, 약 20 nt 내지 약 45 nt, 약 20 nt 내지 약 50 nt, 약 20 nt 내지 약 60 nt, 또는 약 12 nt 내지 약 20 nt의 길이를 가질 수 있다.
일부 측면에서, 통합된 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 유리 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열은 약 12 뉴클레오티드 (nt) 내지 약 100 nt, 약 12 nt 내지 약 90 nt, 약 12 nt 내지 약 80 nt, 약 12 nt 내지 약 70 nt, 약 12 nt 내지 약 60 nt, 약 12 nt 내지 약 50 nt, 약 12 nt 내지 약 45 nt, 약 12 nt 내지 약 40 nt, 약 12 nt 내지 약 35 nt, 약 12 nt 내지 약 30 nt, 약 12 nt 내지 약 25 nt, 약 12 nt 내지 약 20 nt, 약 12 nt 내지 약 19 nt, 약 19 nt 내지 약 20 nt, 약 19 nt 내지 약 25 nt, 약 19 nt 내지 약 30 nt, 약 19 nt 내지 약 35 nt, 약 19 nt 내지 약 40 nt, 약 19 nt 내지 약 45 nt, 약 19 nt 내지 약 50 nt, 약 19 nt 내지 약 60 nt, 약 20 nt 내지 약 25 nt, 약 20 nt 내지 약 30 nt, 약 20 nt 내지 약 35 nt, 약 20 nt 내지 약 40 nt, 약 20 nt 내지 약 45 nt, 약 20 nt 내지 약 50 nt, 약 20 nt 내지 약 60 nt, 또는 약 12 nt 내지 약 20 nt의 길이를 가질 수 있다.
일부 측면에서, 통합된 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 유리 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, 1200, 1210, 1220, 1230, 1240, 1250, 1260, 1270, 1280, 1290, 1300, 1310, 1320, 1330, 1340, 1350, 1360, 1370, 1380, 1390, 1400, 1410, 1420, 1430, 1440, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 또는 5500개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
유리 플라스미드 내의 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열과 통합된 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 서열의 뉴클레오티드 서열 간의 상보성 퍼센트는 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 상보적 (즉, 전체 상보적)일 수 있다.
일부 측면에서, 통합된 플라스미드 내의 상동 재조합 서열과 인접 게놈 서열 간의 거리는 적어도 1 nt, 적어도 2 nt, 적어도 3 nt, 적어도 4 nt, 적어도 5 nt, 적어도 6 nt, 적어도 7 nt, 적어도 8 nt, 적어도 9 nt, 적어도 10 nt, 적어도 11 nt, 적어도 12 nt, 적어도 13 nt, 적어도 14 nt, 적어도 15 nt, 적어도 16 nt, 적어도 17 nt, 적어도 18 nt, 적어도 19 nt, 적어도 20 nt, 적어도 21 nt, 적어도 22 nt, 적어도 23 nt, 적어도 24 nt, 적어도 25 nt, 적어도 26 nt, 적어도 27 nt, 적어도 28 nt, 적어도 29 nt, 적어도 30 nt, 적어도 31 nt, 적어도 32 nt, 적어도 33 nt, 적어도 34 nt, 적어도 35 nt, 적어도 36 nt, 적어도 37 nt, 적어도 38 nt, 적어도 39 nt, 적어도 40 nt, 적어도 41 nt, 적어도 42 nt, 적어도 43 nt, 적어도 44 nt, 적어도 45 nt, 적어도 46 nt, 적어도 47 nt, 적어도 48 nt, 적어도 49 nt, 적어도 50 nt, 적어도 51 nt, 적어도 52 nt, 적어도 53 nt, 적어도 54 nt, 적어도 55 nt, 적어도 56 nt, 적어도 57 nt, 적어도 58 nt, 적어도 59 nt, 적어도 60 nt, 적어도 61 nt, 적어도 62 nt, 적어도 63 nt, 적어도 64 nt, 적어도 65 nt, 적어도 66 nt, 적어도 67 nt, 적어도 68 nt, 적어도 69 nt, 적어도 70 nt, 적어도 71 nt, 적어도 72 nt, 적어도 73 nt, 적어도 74 nt, 적어도 75 nt, 적어도 76, 적어도 77 nt, 적어도 78 nt, 적어도 79 nt, 적어도 80 nt, 적어도 81 nt, 적어도 82 nt, 적어도 83 nt, 적어도 84 nt, 적어도 85 nt, 적어도 86 nt, 적어도 87 nt, 적어도 88 nt, 적어도 89 nt, 적어도 90 nt, 적어도 91, 적어도 92 nt, 적어도 93 nt, 적어도 94 nt, 적어도 95 nt, 적어도 96, 적어도 97 nt, 적어도 98 nt, 적어도 99 nt, 적어도 100 nt, 적어도 150 nt, 적어도 200 nt, 적어도 250 nt, 적어도 300 nt, 적어도 350 nt, 적어도 400 nt, 적어도 450 nt, 적어도 500 nt, 약 least 550 nt, 적어도 600 nt, 적어도 650 nt, 적어도 700 nt, 적어도 750 nt, 적어도 800 nt, 적어도 850 nt, 적어도 900 nt, 적어도 950 nt, 적어도 1000 nt, 적어도 1100 nt, 적어도 1200 nt, 적어도 1300 nt, 적어도 1400 nt, 적어도 1500 nt, 적어도 1600 nt, 적어도 1700 nt, 적어도 1800 nt, 적어도 1900 nt, 적어도 2000 nt, 적어도 2100 nt, 적어도 2200 nt, 적어도 2300 nt, 적어도 2400 nt, 적어도 2500 nt, 적어도 3000 nt, 적어도 3500 nt, 적어도 4000 nt, 적어도 4500 nt, 적어도 5000 nt, 또는 적어도 5000 nt이다.
일부 측면에서, 통합된 플라스미드 내의 상동 재조합 서열과 인접 게놈 서열 간의 거리는 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt, 5 nt, 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt, 32 nt, 33 nt, 34 nt, 35 nt, 36 nt, 37 nt, 38 nt, 39 nt, 40 nt, 41 nt, 42 nt, 43 nt, 44 nt, 45 nt, 46 nt, 47 nt, 48 nt, 49 nt, 50 nt, 51 nt, 52 nt, 53 nt, 54 nt, 55 nt, 56 nt, 57 nt, 58 nt, 59 nt, 60 nt, 61 nt, 62 nt, 63 nt, 64 nt, 65 nt, 66 nt, 67 nt, 68 nt, 69 nt, 70 nt, 71 nt, 72 nt, 73 nt, 74 nt, 75 nt, 76, 77 nt, 78 nt, 79 nt, 80 nt, 81 nt, 82 nt, 83 nt, 84 nt, 85 nt, 86 nt, 87 nt, 88 nt, 89 nt, 90 nt, 91, 92 nt, 93 nt, 94 nt, 95 nt, 96, 97 nt, 98 nt, 99 nt, 100 nt, 150 nt, 200 nt, 250 nt, 300 nt, 350 nt, 400 nt, 450 nt, 500 nt, 55 nt, 600 nt, 650 nt, 700 nt, 750 nt, 800 nt, 850 nt, 900 nt, 960 nt, 1000 nt, 1100 nt, 1200 nt, 1300 nt, 1400 nt, 1500 nt, 1600 nt, 1700 nt, 1800 nt, 1900 nt, 2000 nt, 2100 nt, 2200 nt, 약 2300 nt, 약 2400 nt, 2500 nt, 3000 nt, 3500 nt, 4000 nt, 4500 nt, 5000 nt, 또는 5000 nt이다.
일부 측면에서, 통합된 플라스미드 내의 상동 재조합 서열과 인접 게놈 서열 간의 거리는 약 10 nt 내지 약 20 nt, 약 10 nt 내지 약 20 nt, 약 20 nt 내지 약 30 nt, 약 30 nt 내지 약 40 nt, 약 40 nt 내지 약 50 nt, 약 50 nt 내지 약 60 nt, 약 60 nt 내지 약 70 nt, 약 70 nt 내지 약 80 nt, 약 80 nt 내지 약 90 nt, 약 90 nt 내지 약 100 nt, 약 100 nt 내지 약 200 nt, 약 200 nt 내지 약 300 nt, 약 300 nt 내지 약 400 nt, 약 400 nt 내지 약 500 nt, 약 500 nt 내지 약 600 nt, 약 600 nt 내지 약 700 nt, 약 700 nt 내지 약 800 nt, 약 800 nt 내지 약 900 nt, 약 900 nt 내지 약 1000 nt, 약 1000 nt 내지 약 1100 nt, 약 1100 nt 내지 약 1200 nt, 약 1200 nt 내지 약 1300 nt, 약 1300 nt 내지 약 1400 nt, 약 1400 nt 내지 약 1500 nt, 약 1500 nt 내지 약 1600 nt, 약 1600 nt 내지 약 1700 nt, 약 1700 nt 내지 약 1800 nt, 약 1800 nt 내지 약 1900 nt, 약 1900 nt 내지 약 2000 nt, 약 2000 nt 내지 약 2100 nt, 약 2100 nt 내지 약 2200 nt, 약 2200 nt 내지 약 2300 nt, 약 2300 nt 내지 약 2400 nt, 약 2400 nt 내지 2500 nt, 약 2500 nt 내지 약 3000 nt, 약 3000 nt 내지 약 3500 nt, 약 3500 nt 내지 약 4000 net, 약 4000 nt 내지 약 4500 nt, 약 4500 nt 내지 약 5000 nt, 또는 약 5000 nt 내지 약 5000 nt이다.
부위-특이적 재조합 시스템
본 개시내용의 일부 측면에서, 예를 들어 랜딩 패드 플라스미드와 제2의 GOI 플라스미드 간의 재조합 이벤트에서, 재조합 프로세스는 부위-특이적 재조합 시스템의 사용을 통해 일어난다.
부위-특이적 레콤비나제는 레콤비나제 폴리펩티드를 세포 내로 도입하거나 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 임의의 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 부위-특이적 레콤비나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 삽입 핵산 내에 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 내에 위치할 수 있다. 부위-특이적 레콤비나제는 예를 들어, 유도성 프로모터, 세포에 대해 내인성인 프로모터, 세포에 대해 이종인 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 발달 단계-특이적 프로모터를 포함한, 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 측면에서, 부위-특이적 재조합 부위는 삽입 핵산 내에 함유된 선택 마커 및/또는 리포터 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 플랭킹한다. 이러한 경우, 예를 들어 CRISP/Cas 매개 상동 재조합을 통해 모 세포 내의 표적화된 유전자좌에 랜딩 패드 플라스미드 핵산을 통합한 후, 부위-특이적 재조합 부위 (예를 들어, LoxP 부위) 사이의 서열은 부위-특이적 재조합을 통해 제거되거나 제2의 GOI 플라스미드 내의 부위-특이적 재조합 부위 사이에 위치한 GOI의 상응하는 서열과 교환될 수 있다.
보존적 부위-특이적 재조합으로서 공지되기도 한 부위-특이적 재조합은 적어도 특정 정도의 서열 상동성을 보유하는 세그먼트 간에 DNA 가닥 교환이 일어나는 유전자 재조합의 한 유형이다. 부위-특이적 레콤비나제 (SSR)는 짧은 DNA 서열 (부위)을 인식하고 이와 결합함으로써 DNA 세그먼트의 재배열을 수행하며, 여기서 이들은 DNA 백본을 절단하고, 관련된 2개의 DNA 나선을 교환하고 DNA 가닥을 다시 연결한다. 일부 부위-특이적 재조합 시스템에서는 레콤비나제와 재조합 부위만으로도 이러한 모든 반응을 수행하기에 충분하지만, 다른 시스템에서는 다수의 보조 단백질 및/또는 보조 부위도 필요하다. 미리 결정된 게놈 유전자좌 내로 전사 단위를 표적화 도입하기 위한 고급 접근 방식인, 레콤비나제 매개 카세트 교환 (RMCE) 중에서 다중 게놈 변형 전략은 SSR의 용량에 의존한다.
부위-특이적 재조합 시스템은 복잡한 진핵 게놈을 다루는 경우에도 고도로 특이적이고, 빠르며 효율적이다.
재조합 부위는 전형적으로 30 내지 200개 뉴클레오티드 길이이고 부분 역위 반복 대칭을 갖는 2개의 모티프로 이루어지며, 이들과 레콤비나제가 결합하고, 재조합이 일어나는 중앙 교차 서열에 플랭킹한다. 그 사이에서 재조합이 일어나는 부위 쌍은 통상적으로 동일하지만, 예외도 있다 (예를 들어, λ 인테그라제의 attP 및 attB).
일부 측면에서, 부위-특이적 레콤비나제 재조합은 Tyr-레콤비나제 매개 시스템, Tyr-인테그라제 매개 시스템, 세린-레졸바제/인버타제 매개 시스템, 또는 세린-인테그라제 매개 시스템에 의해 매개된다. 일부 측면에서, Tyr-레콤비나제 매개 시스템은 Cre, Dre, Flp, KD, B3, 또는 B3 Tyr-레콤비나제를 포함한다. 일부 측면에서, Tyr-인테그라제 매개 시스템은 λ (람다), HK022 또는 HP1 Tyr-인테그라제를 포함한다. 일부 측면에서, 세린-레졸바제/인버타제 매개 시스템은 γδ (감마델타), ParA, Tn3, 또는 Gin 세린-레졸바제/인테그라제를 포함한다. 일부 측면에서, 세린-인테그라제 매개 시스템은 PhiC31, Bxb1, 또는 R4 세린-인테그라제를 포함한다.
일부 구체적 측면에서, Tyr-레콤비나제 매개 시스템은 Cre Tyr-레콤비나제를 포함한다. Cre-Lox 재조합은 세포 DNA 내의 특이적 부위에서 결실, 삽입, 전위 및 역위를 수행하는 데 사용되는 부위-특이적 레콤비나제 기술이다. 이를 통해 DNA 변형이 특이적 세포 유형을 표적으로 하거나 특이적 외부 자극에 의해 촉발될 수 있다. 이러한 시스템은 Lox 서열이라고 불리는 한 쌍의 짧은 표적 서열을 재조합하는 단일 효소인 Cre 레콤비나제로 이루어진다. 이러한 시스템은 임의의 추가의 지원 단백질 또는 서열을 삽입하지 않고서도 구현될 수 있다. Cre 효소와 LoxP 서열이라고 불리는 원래 Lox 부위는 박테리오파지 P1로부터 유래된다.
LoxP (X-over P1의 유전자좌)는 34 bp로 이루어진 박테리오파지 P1 상의 부위이다. 이러한 부위는 2개 세트의 대칭 13 bp 서열 사이에 중간 2개의 염기를 제외하고 가변적인 비대칭 8 bp 서열을 포함한다. 정확한 서열은 하기에 제공된다: 'N'은 다양할 수 있는 염기를 나타내고, 소문자는 야생형으로부터 돌연변이된 염기를 나타낸다. 13 bp 서열은 회문식이지만, 8 bp 스페이서는 그렇지 않으므로, loxP 서열에 특정 방향을 제공한다. 통상적으로 loxP 부위는 유전자 조작을 위해 쌍으로 구성된다. 2개의 loxP 부위가 동일한 배향으로 있는 경우, 플록스드 서열 (2개의 loxP 부위에 의해 플랭킹된 서열)이 절제되지만; 2개의 loxP 부위가 반대 배향으로 있는 경우에는, 플록스드 서열이 역전된다. 플록스드 공여자 서열이 존재하는 경우, 이러한 공여자 서열을 원래 서열로 교환할 수 있다. 레콤비나제 매개 카세트 교환으로 불리는 이러한 기술은 랜딩 패드 플라스미드 내의 2개의 LoxP 부위 사이에 위치한 폴리뉴클레오티드 서열을 제2의 GOI 플라스미드 내의 2개의 LoxP 부위 사이에 위치한 폴리뉴클레오티드 서열로 교환하기 위해 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, SSRS는 LoxP 부위이다.
일부 측면에서, LoxP는 서열식별번호: 1의 핵산 서열, 즉 야생형 LoxP 부위를 포함한다. 다른 측면에서, LoxP 부위는 서열식별번호: 2에 상응하는 돌연변이 LoxP 부위이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드 (예를 들어, A, T, C 또는 G)일 수 있다.
일부 측면에서, 돌연변이 LoxP 부위는 서열식별번호: 3 (lox 511); 서열식별번호: 4 (lox 5171); 서열식별번호: 5 (lox 2272); 서열식별번호: 6 (M2); 서열식별번호: 7 (M3); 서열식별번호: 8 (M7); 서열식별번호: 9 (M11); 서열식별번호: 10 (lox 71); 서열식별번호: 11 (lox 66); 및 서열식별번호: 28 내지 82로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용에 따라 사용되는 2개의 LoxP 부위는 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 28-82 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 LoxP 부위일 수 있다. 일부 측면에서, LoxP 부위 쌍 내의 LoxP 부위는 동일하다. 일부 측면에서, LoxP 부위 쌍 내의 LoxP 부위는 상이하다.
일부 측면에서, 2개의 LoxP 부위는 모두 야생형 LoxP 부위이다 (문헌 [Araki, K (1997). "Targeted integration of DNA using mutant lox sites in embryonic stem cells". Nucleic Acids Research. 25 (4): 868-872] 참조; 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
다른 측면에서, Tyr-레콤비나제 매개 시스템은 Flp Tyr-레콤비나제를 포함한다. Flp-FRT 재조합은 부위 지정 재조합 기술이며, 생체내 제어된 조건 하에서 유기체의 DNA를 조작하는 데 점점 더 많이 사용된다. 이는 Cre-lox 재조합과 유사하지만, 빵 효모 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)의 2 μ 플라스미드로부터 유래된 레콤비나제 플립파제 (Flp)에 의한 플립파제 인식 표적 (FRT) 부위 사이의 서열의 재조합을 수반한다.
기본 화학 반응은 티로신과 세린 레콤비나제 둘 다에 대해 동일하지만, 그들 사이에는 일부 차이점이 있다. 티로신 레콤비나제, 예컨대 Cre 또는 FLP는 6-8 bp만큼 엇갈린 지점에서 한 번에 하나의 DNA 가닥을 절단하여, 가닥의 3' 말단을 티로신 친핵체의 히드록실 기에 연결한다. 그런 다음 가닥 교환은 단 한 쌍의 가닥만 교환된 홀리데이 연접부와 유사한 교차 가닥 중간체를 통해 진행된다. 세린 레콤비나제의 메커니즘과 제어는 널리 이용되고 있지 않다. 이러한 효소 군은 1990년대 중반에야 발견되었으며 여전히 상대적으로 작다. 현재의 전통적인 구성원인 감마-델타 및 Tn3 리졸바제뿐만 아니라 φC31-, Bxb1- 및 R4 인테그라제와 같은 새로운 부가 요소는 2 bp만큼 엇갈린 지점에서 4개의 DNA 가닥을 모두 동시에 커팅한다. 절단 동안, 단백질-DNA 결합은 에스테르 교환 반응을 통해 형성되며, 여기서 포스포디에스테르 결합은 절단 부위에서 5' 포스페이트와 보존된 세린 잔기의 히드록실 기 간의 포스포세린 결합으로 대체된다 (레졸바제 내의 S10). Tyr-클래스의 구성원과 달리, 재조합 경로는 2개의 상이한 기질 부위 (attP 및 attB)를 부위-하이브리드 (attL 및 attR)로 전환시킨다. 이는 보조적인 "재조합 방향성 인자" (RDF)에 의해서만 극복될 수 있는, 이러한 특정한 재조합 경로의 비가역적 특성을 설명해준다.
일부 측면에서, SSRS는 플립파제 인식 표적 (FRT) 부위이다. 34 bp 최소 FRT 부위 서열은 서열식별번호: 12에 제시된 서열을 가지며, 이에 대해 플립파제 (Flp)는 8 bp 스페이서에 플랭킹하는 서열식별번호: 13의 13 bp 아암 둘 다와 결합하는데, 즉 역방향의 부위-특이적 재조합 (교차 영역)이다. FRT 매개 절단은 상단 가닥 상의 비대칭 8 bp 코어 영역 (5'-tctagaaa-3') 바로 앞에서 발생하고 하단 가닥 상의 이러한 서열 뒤에서 발생한다. 여러 변이체 FRT 부위가 존재하지만, 재조합은 통상적으로 2개의 동일한 FRT 사이에서만 발생할 수 있지만 일반적으로 동일하지 않은 ("이종특이적") FRT 사이에서는 발생할 수 없다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FRT 부위는 서열식별번호: 12, 13, 및 83 내지 91로부터 선택된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 FRT 부위 쌍은 서열식별번호: 12, 13, 및 83 내지 91로부터 선택된다. 일부 측면에서, FRT 부위 쌍 내의 FRT 부위는 동일하다. 일부 측면에서, FRT 부위 쌍 내의 FTR 부위는 상이하다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 att 부위는 서열식별번호: 92 내지 109로부터 선택된다. 일부 측면에서, att 부위는 attB 부위이다. 일부 측면에서, att 부위는 attP 부위이다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 단일 SSRS를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 하나 초과의 SSRS를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 SSRS를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 동일한 부위-특이적 레콤비나제 시스템에 상응하는 2개의 SSRS를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 Tyr-레콤비나제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 Tyr-인테그라제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 세린-레졸바제/인버타제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 세린-인테그라제 부위를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 상이한 부위-특이적 레콤비나제 시스템에 상응하는 2개의 SSRS를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 Tyr-레콤비나제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 Tyr-인테그라제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 세린-레졸바제/인버타제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 2개의 세린-인테그라제 부위를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 Tyr-레콤비나제 부위 및 Tyr-인테그라제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 Tyr-레콤비나제 부위 및 세린-레졸바제/인버타제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 Tyr-레콤비나제 부위 및 세린-인테그라제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 Tyr-인테그라제 부위 및 세린-레졸바제/인버타제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 Tyr-인테그라제 부위 및 세린-인테그라제 부위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 플라스미드, 예를 들어 GOI 플라스미드 또는 랜딩 패드 플라스미드는 세린-레졸바제/인버타제 부위 및 세린-인테그라제 부위를 포함할 수 있다.
<표 2>
예시적인 SSRS. 각각의 LoxP 서열은 왼쪽 역위 반복 서열 (위치 1-13), 스페이서 (위치 14-21) 및 오른쪽 역위 반복 서열 (위치 22-34)을 포함한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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마커
일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드 내의 부위-특이적 재조합 부위는 마커 (예를 들어, 선택 또는 선택가능한 마커 및/또는 검출가능한 또는 스크리닝가능한 마커, 예컨대 리포터 유전자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 플랭킹한다. 이러한 경우, 제2의 GOI 플라스미드로부터 삽입 핵산 (두 SSRS 사이에 위치하는 영역)을 통합한 후, 랜딩 패드 플라스미드 상의 부위-특이적 재조합 부위 사이의 서열이 제거된다.
마커 시스템은 선택가능한 마커와 스크리닝가능한 마커라는 2가지 광범위한 범주로 존재한다. 선택가능한 마커는 전형적으로 항생제 내성 유전자이며, 이는 형질전환된 유기체 (통상적으로 단일 세포)에 항생제의 존재 하에서 생존할 수 있는 능력을 제공한다. 리포터 유전자라고도 불리는 스크리닝가능한 마커는 전형적으로, 형질전환된 유기체의 세포에서의 색상 변화 또는 기타 눈에 보이는 변화를 유발한다. 이를 통해 조사자는 형질전환된 세포에 대해 대규모 세포 군을 신속하게 스크리닝할 수 있다.
일부 측면에서, 선택 마커는 선택 카세트에 함유되어 있다. 한 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커는 글루타민 신테타제 (GS) 및/또는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)이다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 선택 마커는 약물 내성 유전자이다. 일부 측면에서, 약물 내성 유전자는 항생제 내성 유전자, 예를 들어 퓨로마이신 내성 유전자, 예컨대 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제이다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 선택 마커가 본 개시내용의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 선택 마커는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neo), 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (hyg), 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제 (puro), 블라스티시딘 S 데아미나제 (bsr), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (gpt), 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-k), 또는 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 선택 마커는, 예를 들어 퓨로마이신, 네오마이신, 히그로마이신 B, 블라스티시딘 S, 플레오마이신, ZEOCIN™ (플레오마이신 D1) 또는 G418 (제네티신)에 대한 내성 유전자일 수 있다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 플라스미드는 단백질을 코딩하는 검출가능한 마커 (예를 들어, 리포터 유전자)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 검출가능한 마커를 코딩하는 핵산 서열은 선택 카세트에 함유되어 있다. 일부 측면에서, 검출가능한 마커를 코딩하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 측면에서, 단백질은 리포터 단백질, 예를 들어 형광 단백질이다. 특정한 측면에서, 형광 단백질은 mCherry이다. 일부 측면에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), ZsGreen1, AcGFP1, 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP), GFPuv, AcGFP, 강화된 청색 형광 단백질 (EBFP), 강화된 황색 형광 단백질 (EYFP), 강화된 청록색 형광 단백질 (ECFP), tdTomato, mCherry, DsRed, AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed2, DsRed-Express, HcRed, AsRed, mOrange, mOrange2, mPlum, mStrawberry, mBanana, 황색 형광 단백질 (YFP), mRaspberry, HcRed1, E2-Crimson, J-Red, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, Cerulean, 청록색 형광 단백질 (CFP), T-Sapphire 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 리포터 단백질은 루시페라제 또는 알칼리성 포스파타제이다.
이러한 리포터 유전자는 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성 프로모터, 리포터 유전자 또는 세포에 대해 내인성인 프로모터, 리포터 유전자 또는 세포에 대해 이종인 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 발달 단계-특이적 프로모터일 수 있다.
세포
원칙적으로, 본원에 개시된 방법은 임의의 진핵 세포의 게놈으로의 표적화된 유전자 통합에 사용될 수 있다. "진핵 세포"는, 예를 들어 포유동물 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 예를 들어 개구리 난모세포, 어류 세포, 진균 및 효모 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포유동물 세포"는 돼지, 양, 소, 설치류, 유제류, 돼지, 양, 새끼 양, 염소, 소, 사슴, 노새, 말, 원숭이, 개, 고양이, 래트 및 마우스를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 인간 또는 비-인간 포유동물로부터 수득된 임의의 세포를 포함하는 것을 의미한다.
일부 측면에서, 세포는 하이브리도마 세포, 모노클로날 항체 생산 세포, 바이러스 생산 세포, 형질감염된 세포, 암 세포 및/또는 재조합 펩티드 생산 세포이다.
구체적인 포유동물 세포는, 예를 들어, Cos, CHO (예를 들어, CHO-K1), MDCK, HEK293, HEK293T (큰 T-세포 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포), NIH3T3, Swiss3T3, BHK (예를 들어, BHK-21), L929 마우스 섬유모세포 세포, AHT-107 하이브리도마 세포, 마우스 골수종 세포, 원숭이 섬유모세포 세포, X63 골수종 세포, HeLa 세포, NSO 하이브리도마 세포, U-937 세포, MK2.7 세포, PER-C6 세포, 5L8 하이브리도마 세포, Daudi 세포, El4 세포, HL-60 세포, K562 세포, Jurkat 세포, THP-1 세포, Sp2/0 세포, 또는 본원에 개시되거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 세포 유형을 포함한다.
부가의 포유동물 세포 유형은 1차 상피 세포 (예를 들어, 각질세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 확립된 세포주 및 그의 계통 (예를 들어, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK (NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CHO 세포, BeWo 세포, Chang 세포, 디트로이트 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS 180 세포, LS 174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK.sub.2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK.sub.1 세포, PK(15) 세포, GH.1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH.sub.1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포 또는 그의 유도체), 임의의 조직 또는 기관 [심장, 간, 신장, 결장, 내장, 식도, 위, 신경 조직 (뇌, 척수), 폐, 혈관 조직 (동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직 (림프선, 아데노이드, 편도선, 골수 및 혈액), 비장을 포함하나 이에 제한되지는 않음]으로부터의 섬유모세포, 및 섬유모세포 및 섬유모세포-유사 세포주 (예를 들어, CHO 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀시 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl.sub.1 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, Vero 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDM.sub.1C3 세포, KLN205 세포, McCoy 세포, 마우스 L 세포, 계통 2071 (마우스 L) 세포, L-M 계통 (마우스 L) 세포, L-MTK (마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, Swiss/3T3 세포, 인디언 문택 세포, SIRC 세포, CII 세포 및 Jensen 세포, 또는 그의 유도체)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
임의의 수의 암 세포주는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 본 발명의 방법에 의해 배양될 수 있는 암 세포주의 대표적인 예는 하기 암 세포주를 포함하나 그에 제한되지는 않는다: 인간 골수종 (예를 들어, KMM-1, KMS-11, KMS-12-PE, KMS-12-BM, KMS-18, KMS-20, KMS-21-PE, U266, RPMI8226); 인간 유방암 (예를 들어, KPL-1, KPL4, MDA-MB-231, MCF-7, KPL-3C, T47D, SkBr3, HS578T, MDA4355, Hs 606 (CRL-7368), Hs 605.T (CRL-7365), Hs 742.T (CRL-7482), BT474, HBL-100, HCC202, HCC1419, HCC1954, MCF7, MDA-361, MDA436, MDA453, SK-BR-3, ZR-75-30, UACC-732, UACC-812, UACC-893, UACC-3133, MX-1 및 EFM-192A); 유관 (유방) 암종 (예를 들어, HS 57HT (HTB-126), HCC1008 (CRL-2320), HCC1954 (CRL-2338; HCC38 (CRL-2314), HCC1143 (CRL-2321), HCC1187 (CRL-2322), HCC1295 (CRL-2324), HCC1599 (CRL-2331), HCC1937 (CRL-2336), HCC2157 (CRL-2340), HCC2218 (CRL-2343), Hs574.T (CRL-7345), Hs 742.T (CRL-7482); 피부암 (예를 들어, COLO 829 (CRL-1974), TE 354.T (CRL-7762), Hs 925.T (CRL-7677)); 인간 전립선암 (예를 들어, MDA PCa 2a 및 MDA PCa 2b); 뼈 암 (예를 들어, Hs 919.T (CRL-7672), Hs 821.T (CRL-7554), Hs 820.T (CRL-7552), Hs 704.T (CRL-7444), Hs 707(A).T (CRL-7448), Hs 735.T (CRL-7471), Hs 860.T (CRL-7595), Hs 888.T.(CRL-7622); Hs 889.T (CRL-7626); Hs 890.T (CRL-7628), Hs 709.T (CRL-7453)); 인간 림프종 (예를 들어, K562); 인간 자궁경부 암종 (예를 들어, HeLA); 폐 암종 세포주 (예를 들어, H125, H522, H1299, NCI-H2126 (ATCC CCL-256), NCI-H1672 (ATCC CRL-5886), NCI-2171 (CRL-5929); NCI-H2195 (CRL05931); 폐 선암종 (예를 들어, NCI-H1395 (CRL-5856), NCI-H1437 (CRL-5872), NCI-H2009 (CRL-5911), NCI-H2122 (CRL-5985), NCI-H2087 (CRL-5922); 전이성 폐암 (예를 들어, 뼈) (예를 들어, NCI-H209 (HTB-172); 결장 암종 세포주 (예를 들어, LN235, DLD2, Colon A, LIM2537, LIM1215, LIM1863, LIM1899, LIM2405, LIM2412, SK-CO1 (ATCC HTB-77), HT29 (ATCC HTB38), LoVo (ATCC CCL-229), SW1222 (ATCC HB-11028), 및 SW480 (ATCC CCL-228); 난소암 (예를 들어, OVCAR-3 (ATCC HTB-161) 및 SKOV-3 (ATCC HTB-77); 중피종 (예를 들어, NCI-h2052 (CRL-5915); 신경내분비 암종 (예를 들어, HCI-H1770 (예를 들어, CRL-5893); 위암 (예를 들어, LIM1839); 신경교종 (예를 들어, T98, U251, LN235); 두경부 편평 세포 암종 세포주 (예를 들어, SCC4, SCC9 및 SCC25); 수모세포종 (예를 들어, Daoy, D283 Med 및 D341 Med); 고환 비-정상피종 (예를 들어, TERA1); 전립선암 (예를 들어, 178-2BMA, Du145, LNCaP, 및 PC-3). 기타 암 세포주는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
일부 측면에서, 세포는 미국 공개 번호 2006/0073591 (그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)의 표 2에 개시된 하이브리도마이다.
일부 측면에서, 진핵 세포는 포유동물 세포, 섬유모세포, 다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 설치류 다능성 세포, 마우스 또는 래트 배아 줄기 (ES) 세포, 인간 다능성 세포, 인간 성체 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 전구 세포, 또는 인간 유도 다능성 줄기 (iPS) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
발현에 유용한 효모는 예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces), 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula) [예를 들어, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)], 칸디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 야로위아(Yarrowia), 피키아(Pichia) [예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 길레르모르디이(Pichia guillermordii), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 이노시토베라(Pichia inositovera)]를 포함한다.
세포는 관련 기술분야에 공지된 표준 방법, 예컨대 Ca2+ 인산염 또는 지질 기반 시스템 (이에 제한되지는 않음)을 사용하여 형질감염될 수 있다.
관심 유전자
일부 측면에서, 관심 유전자 (GOI)는, 예를 들어 하나 이상의 프로모터 및/또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 일부 측면에서, 제1의 GOI (모 플라스미드에 위치한 관심 유전자)와 제2의 GOI (제2의 GOI 플라스미드에 위치한 관심 유전자)는 동일한 분자 클래스에 속한다. 예를 들어, 제1의 GOI가 항체인 경우, 모 세포주가 그러한 유형의 재조합 단백질을 효율적으로 발현했기 때문에 제2의 GOI가 항체일 수도 있다.
일부 측면에서, GOI는 생물학적 제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 측면에서, GOI는 하기 단백질 중 하나의 전부 또는 일부와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다: 종양 괴사 인자 (TNF), flt3 리간드 (WO 94/28391), 에리스로포에이틴, 트롬보포에이틴, 칼시토닌, IL-2, 안지오포이에틴-2 (문헌 [Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60]), NF-카파 B의 수용체 활성화제에 대한 리간드 (RANKL, WO 01/36637), 종양 괴사 인자 (TNF) 관련 아폽토시스 유도 리간드 (TRAIL, WO 97/01633), 흉선 간질 유래 림포포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF, 호주 특허 번호 588819), 비만 세포 성장 인자, 줄기 세포 성장 인자 (미국 특허 번호 6,204,363), 표피 성장 인자, 각질세포 성장 인자, 거핵생물 성장 및 발달 인자, RANTES, 인간 피브리노겐-유사 2 단백질 (FGL2; NCBI 수탁 번호 NM-00682; 문헌 [Ruegg and Pytela (1995), Gene 160:257-62]) 성장 호르몬, 인슐린, 인슐린 자극 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자, 부갑상선 호르몬, α-인터페론, γ-인터페론 및 컨센서스 인터페론을 포함한 인터페론 (미국 특허 번호 4,695,623 및 4,897471), 신경 성장 인자, 뇌 유래 신경 영양 인자, 시냅토타그민-유사 단백질 (SLP 1-5), 뉴로트로핀-3 , 글루카곤, 인터루킨, 콜로니 자극 인자, 림포톡신-β, 백혈병 억제 인자 및 온코스타틴-M. 예를 들어, 문헌 [Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, all volumes (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, Mass., 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); and The Cytokine Handbook, Vols. 1 and 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, Calif., 2003); 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다]을 참조한다.
일부 측면에서, GOI는 상기 언급된 단백질 중 임의의 것에 대한 수용체의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질, 이러한 수용체 또는 상기 언급된 단백질 중 임의의 것에 대한 길항제, 및/또는 이러한 수용체 또는 길항제와 실질적으로 유사한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이들 수용체 및 길항제는 두 가지 형태의 종양 괴사 인자 수용체 (p55 및 p75로서 지칭된 TNFR, 미국 특허 번호 5,395,760 및 미국 특허 번호 5,610,279), 인터루킨-1 (IL-1) 수용체 (유형 I 및 II; EP 특허 번호 0460846, 미국 특허 번호 4,968,607 및 미국 특허 번호 5,767,064), IL-1 수용체 길항제 (미국 특허 번호 6,337,072), IL-1 길항제 또는 억제제 (미국 특허 번호 5,981,713, 6,096,728 및 5,075,222), IL-2 수용체, IL-4 수용체 (EP 특허 번호 0 367 566 및 미국 특허 번호 5,856,296), IL-15 수용체 , IL-17 수용체, IL-18 수용체, Fc 수용체, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체, 과립구 콜로니 자극 인자 수용체, 온코스타틴-M 및 백혈병 억제 인자에 대한 수용체, NF-카파 B의 수용체 활성화제 (RANK, WO 01/36637 및 미국 특허 번호 6,271,349), 오스테오프로테게린 (미국 특허 번호 6,015,938), TRAIL에 대한 수용체 (TRAIL 수용체 1, 2, 3 및 4 포함), 및 사멸 도메인을 포함하는 수용체, 예컨대 Fas 또는 아폽토시스 유도 수용체 (AIR)를 포함한다.
일부 측면에서, GOI는 분화 항원 (CD 단백질로서 지칭됨)의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질 또는 그의 리간드 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 항원의 예는 CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 및 이에 대한 리간드 (CD27 리간드, CD30 리간드 등)를 포함한다. CD 항원 중 몇몇은 41BB 및 OX40을 또한 포함하는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이다. 리간드는 종종 41BB 리간드 및 OX40 리간드와 마찬가지로 TNF 패밀리의 구성원이다.
일부 측면에서, GOI는 효소적으로 활성인 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그의 리간드는 또한 본원에 개시된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 그 예는 하기 단백질 중 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질 또는 그의 리간드 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질을 포함한다: TNF-알파 전환 효소, 다양한 키나제, 글루코세레브로시다제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인자 VIII, 인자 IX, 아포지단백질 E, 아포지단백질 A-I, 글로빈, IL-2 길항제, 알파-1 항트립신을 포함한 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인 패밀리 구성원; 상기 언급된 효소 중 임의의 것에 대한 리간드; 및 수많은 기타 효소 및 그의 리간드.
일부 측면에서, GOI는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 항체의 예는 상기 언급된 단백질 및/또는 하기 항원을 포함하나 그에 제한되지는 않는 단백질 중 어느 하나 또는 그의 조합을 인식하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 서브유닛, FGL2, PDGF-β 및 그의 유사체 (미국 특허 번호 5,272,064 및 5,149,792 참조), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, EGF 수용체 (미국 특허 번호 6,235,883 참조), VEGF 수용체, 간세포 성장 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인터페론 감마, B 림프구 자극인자 (BlyS; BAFF, THANK, TALL-1 및 zTNF4로서 공지되기도 함; 문헌 [Do and Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25] 참조), C5 보체, IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, LCG (폐암과 연관되어 발현되는 유전자 산물), HER-2, HER-3, RAS (예를 들어, K-RAS), 종양 연관 당단백질 TAG-72; 결장암 및/또는 췌장암 환자의 혈청에서 상승된 수준으로 존재하는 종양 연관 에피토프인 SK-1 항원; 유방암, 결장암, 편평 세포암, 전립선암, 췌장암, 폐암 및/또는 신장암 세포 및/또는 흑색종, 신경교종 또는 신경모세포종 세포에서 발현되는 암 연관 에피토프 또는 단백질; 종양의 괴사 코어, 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, TRAIL 수용체 1, 2, 3 및 4, RANK, RANK 리간드, TNF-α, 접착 분자 VAP-1, 상피 세포 접착 분자 (EpCAM), 세포간 접착 분자-3 (ICAM-3), 류코인테그린 접착인자, 혈소판 당단백질 gp IIb/IIIa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, rNAPc2 (인자 VIIa-조직 인자의 억제제), MHC I, 암배아 항원 (CEA), 알파-태아단백질 (AFP), 종양 괴사 인자 (TNF), CTLA-4 (세포독성 T 림프구 연관 항원), Fc-γ-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, 스클레로스틴, L-셀렉틴, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), B형 간염 바이러스 (HBV), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphlycoccus aureus). 본 발명의 방법을 사용하여 생산될 수 있는 공지된 항체의 구체적인 예는 아달리무맙, 베바시주맙, 인플릭시맙, 압식시맙, 알렘투주맙, 바피뉴주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 브리아키누맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 코나투무맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 젬투주맙 오조가미신, 골리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 라베투주맙, 마파투무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 니모투주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 로벨리주맙, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 베돌리조맙, 잘루투무맙 및 자놀리무맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, GOI는 예를 들어, 상기 언급된 단백질 중 임의의 것을 포함하는 재조합 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 언급된 단백질 중 하나와 다량체화 도메인, 예컨대 류신 지퍼, 코일드 코일, 이뮤노글로불린의 Fc 부분, 또는 실질적으로 유사한 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질이 본 발명의 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hakansson et al. (1999), Structure 7:255-64]을 참조한다. 이러한 재조합 융합 단백질 중에는 수용체의 일부분이 항체의 Fc 부분과 융합되는 단백질, 예컨대 에타네르셉트 (p75 TNFR:Fc), 아바타셉트 또는 벨라타셉트 (CTLA4:Fc)가 구체적으로 포함된다. 일부 측면에서, GOI는 마커, 예를 들어 상기 개시한 스크리닝가능한 마커, 예컨대 GFP 또는 루시페라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
랜딩 패드 세포주를 생성하는 데 적합한 후보 모 세포를 확인하는 방법
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 방법에 따라 랜딩 패드 세포를 생성하는데 적합한 후보 모 세포를 효율적으로 확인하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 방법은 관심 생물학적 제제, 예를 들어 항체의 발현에 적합한 세포의 선택 및 발생을 크게 단순화한다. 예를 들어, 전형적인 선택 프로세스에는 최대 10개 이상의 상이한 세포주 생성 워크플로우가 필요할 수 있으며, 이는 각각의 세포주에 대해 최고 생산 클론 (예를 들어, 5-10개 클론)을 확인하고, 서던 블롯 및/또는 유전자 카피 수 결정을 통해 각각의 클론을 특징 규명한 다음, 상위 후보(들)를 모 세포주(들)로서 선택한다.
일부 측면에서, 방법은 플라스미드를 포함하는 세포주의 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함하며, 여기서 플라스미드는 GOI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 함유한다 (모 플라스미드). 일부 측면에서, 모 플라스미드는 모 세포의 게놈 내의 상이한 게놈 위치에 통합될 수 있다.
일부 측면에서, 세포주 라이브러리는 히스토릭 세포주 세트, 즉 모 플라스미드를 통합함으로써 이전에 변형된 세포, 예를 들어 생물학적 제제, 예컨대 항체를 발현하도록 발생된 세포주이다. 다른 측면에서, 세포주 라이브러리는, 예를 들어 모 세포의 게놈 내의 다수의 위치에서 모 플라스미드의 무작위 통합을 통해 생성된다.
다음으로, 후보 세포, 즉 라이브러리 내의 세포를 특이적 기준의 존재에 대해 스크리닝할 수 있으며, 그 목표는 (i) "핫 세포"인 세포주, 즉 유리한 특성을 갖는 세포주, 예를 들어 동일한 GOI를 발현하는 다른 세포와 비교하여 재조합 단백질의 높은 수율을 갖는 세포주; 및 (ii) "핫 스팟", 즉 모 플라스미드가 높은 수준으로 전사되는 게놈 위치 (유전자좌)에 삽입된 모 플라스미드를 갖는 세포주, 또는 일부 다른 바람직한 특징을 갖는 세포주를 선택하는 것이다
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포를 발생시키기 위해 적합한 모 세포로서 라이브러리 내의 세포를 선택하기 위해 고려되는 특이적 기준은 하기를 포함한다:
(a) 세포 역가: 후보 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 양 (일반적으로 그램/L);
(b) 모 플라스미드 카피 수: 예를 들어, 내부 대조군으로서 GAPDH를 사용한 qPCR을 사용하여 측정된, 후보 세포에 통합된 모 플라스미드의 카피 수;
(c) RNA 발현 수준: 예를 들어, 서던 블롯을 사용하여 결정된, 후보 세포에 의해 발현된 RNA의 양;
(d) 플라스미드 구성: 예를 들어, 플라스미드 연접부 서열의 확인을 허용하는 기술인 spPCR (스플링커렛 PCR)을 사용하여 측정된 후보 세포의 게놈 내의 모 플라스미드의 배향;
(e) 발현된 산물의 특이적 특성 (예를 들어, GOI에 의해 코딩된 재조합 단백질): 예를 들어, 특이적 글리코실화 패턴, 면역원성, 친화성, 결합 특이성, 응집, 열 안정성 등; 또는
(f) 그의 임의의 조합.
일부 측면에서, 세포 역가가 한계치 수준보다 높은 경우 랜딩 패드 세포주의 생성을 위해 후보 세포가 선택된다. 세포 역가는 발현된 관심 유전자에 따라 달라지는 양이므로; 특정 관심 유전자에 대해 높은 것으로 간주될 수 있는 양이 또 다른 관심 유전자에 대해 낮은 것으로 간주될 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 예를 들어, 일부 측면에서 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 적어도 약 1 g/L, 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5 g/L, 적어도 약 6 g/L, 적어도 약 7 g/L, 적어도 약 8 g/L, 적어도 약 9 g/L, 적어도 약 10 g/L, 적어도 약 11 g/L, 적어도 약 12 g/L, 적어도 약 13 g/L, 적어도 약 14 g/L, 적어도 약 15 g/L, 적어도 약 16 g/L, 적어도 약 17 g/L, 적어도 약 18 g/L, 적어도 약 19 g/L 또는 적어도 약 20 g/L이다. 일부 측면에서 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 약 1 g/L, 약 2 g/L, 약 3 g/L, 약 4 g/L, 약 5 g/L, 약 6 g/L, 약 7 g/L, 약 8 g/L, 약 9 g/L, 약 10 g/L, 약 11 g/L, 약 12 g/L, 약 13 g/L, 약 14 g/L, 약 15 g/L, 약 16 g/L, 약 17 g/L, 약 18 g/L, 약 19 g/L 또는 약 20 g/L이다. 일부 측면에서 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 약 1 g/L 내지 약 2 g/L, 약 2 g/L 내지 약 3 g/L, 약 3 g/L 내지 약 4 g/L, 약 4 g/L 내지 약 5 g/L, 약 5 g/L 내지 약 6 g/L, 약 6 g/L 내지 약 7 g/L, 약 7 g/L 내지 약 8 g/L, 약 8 g/L 내지 약 9 g/L, 약 9 g/L 내지 약 10 g/L, 약 10 g/L 내지 약 11 g/L, 약 11 g/L 내지 약 12 g/L, 약 12 g/L 내지 약 13 g/L, 약 13 g/L 내지 약 14 g/L, 약 14 g/L 내지 약 15 g/L, 약 15 g/L 내지 약 16 g/L, 약 16 g/L 내지 약 17 g/L, 약 17 g/L 내지 약 18 g/L, 약 18 g/L 내지 약 19 g/L, 또는 약 19 g/L 내지 약 20 g/L이다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 동일한 관심 유전자를 발현하는 참조 세포주에서 관찰된 역가보다 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 또는 적어도 약 200% 더 높다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 동일한 관심 유전자를 발현하는 참조 세포주에서 관찰된 역가보다 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 또는 약 200% 더 높다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 동일한 관심 유전자를 발현하는 참조 세포주에서 관찰된 역가보다 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 110%, 약 110% 내지 약 120%, 약 120% 내지 약 130%, 약 130% 내지 약 140%, 약 140% 내지 약 150%, 약 150% 내지 약 160%, 약 160% 내지 약 170%, 약 170% 내지 약 180%, 약 180% 내지 약 190%, 또는 약 190% 내지 약 200% 더 높다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 동일한 관심 유전자를 발현하는 참조 세포주에서 관찰된 역가보다 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 16배, 적어도 약 17배, 적어도 약 18배, 적어도 약 19배, 또는 적어도 약 20배 더 높다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 동일한 관심 유전자를 발현하는 참조 세포주에서 관찰된 역가보다 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 또는 약 20배 더 높다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 세포 역가 한계치는 동일한 관심 유전자를 발현하는 참조 세포주에서 관찰된 역가보다 약 2배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 5배, 약 5배 내지 약 6배, 약 6배 내지 약 7배, 약 7배 내지 약 8배, 약 8배 내지 약 9배, 약 9배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 11배, 약 11배 내지 약 12배, 약 12배 내지 약 13배, 약 13배 내지 약 14배, 약 14배 내지 약 15배, 약 15배 내지 약 16배, 약 16배 내지 약 17배, 약 17배 내지 약 18배, 약 18배 내지 약 19배, 또는 약 19배 내지 약 20배 더 높다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 카피 수 한계치는 모 플라스미드의 단 하나의 카피의 존재이다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 카피 수 한계치는 모 플라스미드의 2개 카피의 존재이다.
일부 측면에서, 특히 후보 세포 게놈 내의 한 위치에 통합된 모 플라스미드의 1개 초과의 카피가 존재하는 경우, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 플라스미드 구성은 헤드-투-테일 구성인데, 즉 모 플라스미드의 카피 둘 다가 동일한 배향에 있다.
일부 측면에서, 모 플라스미드의 RNA 발현 수준이 한계치 수준보다 높은 경우, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포가 선택된다. 일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 RNA 발현 수준 한계치는 동일한 관심 유전자를 발현하는 참조 세포주에서 관찰된 RNA 발현 수준보다 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 또는 적어도 약 200% 더 높다.
일부 측면에서, 랜딩 패드 세포주의 생성을 위한 후보 세포를 선택하기 위한 RNA 발현 수준 한계치는 동일한 관심 유전자를 발현하는 참조 세포주에서 관찰된 RNA 발현 수준보다 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 16배, 적어도 약 17배, 적어도 약 18배, 적어도 약 19배, 또는 적어도 약 20배 더 높다.
적합한 세포주의 확인을 통해 모 플라스미드 내의 잠재적인 상동 재조합 위치를 확인할 수 있었으며, 이는 이후 모 계통으로부터 랜딩 패드 세포주를 유도하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 방법론을 사용하면 무작위 통합 세포주 발생 프로그램으로부터 표적화된 통합 전략으로 전환할 수 있다.
키트
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 방법 중 임의의 것을 실시하기 위한 키트 및 제조품을 제공하며, 예를 들어 키트 및 제조품은 세포 (예를 들어, 랜딩 패드 세포 또는 모 세포), 랜딩 패드 플라스미드, 본원에 개시된 방법에 따라 생성된 발현 세포를 제조하는 데 사용될 제2의 GOI 플라스미드를 제조하기 위한 플라스미드, 또는 그의 임의의 조합, 및 임의로 사용 지침을 포함한다. 일부 측면에서, 키트는 적어도 하나의 가이드 RNA, 부위-특이적 레콤비나제를 발현하는 플라스미드, 레콤비나제 단백질 자체, 레콤비나제를 코딩하는 전사체를 제조하기 위한 플라스미드, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
실시예
실시예 1
랜딩 패드 세포주를 생성하기 위한 모 세포주의 확인
새로운 세포주를 구축할 필요 없이 랜딩 패드 세포주로서 사용될 하나 이상의 적합한 모 세포주를 확인하기 위한 전략이 사용되었다. 이는 발현 카세트가 게놈 내의 단 하나의 유전자좌에만 통합되는 원하는 생산성 및 성능 능력을 위해 기존의 무작위 통합으로 생성된 히스토릭 세포주 세트를 분석함으로써 달성되었다. 이러한 분석은 생물학적으로 관련된 관심 단백질을 사용하여 "핫 세포"와 그들 각각의 "핫 스팟" (게놈 위치)을 효율적으로 확인하였다.
서던 블롯 데이터, 및 다수의 세포주 발생 프로젝트에 대해 qPCR에 의해 결정된 발현 플라스미드 카피 수 데이터를 스크리닝하여 낮은 카피 수 1-2 발현 플라스미드를 함유하는 단일 통합 부위를 갖는 모 세포주를 확인하였다.
2개의 적합한 세포주 확인의 예가 도 2에 제시되어 있으며, 이는 2개의 적합한 세포주를 찾는 데 사용된 전략을 요약한다. 모 세포주인 세포주 1과 세포주 2는 각각 특이적 표적을 대상으로 한 mAb를 발현하는 세포주이다. LC = 경쇄, 및 HC = 중쇄. 카피 수 = 세포주 내의 발현 플라스미드 수. 각각의 발현 플라스미드는 LC 및 HC 발현 카세트를 함유하였다. 내부 대조군으로서 GAPDH를 사용하여 qPCR에 의해 카피 수를 결정하였다. spPCR = 스플링커렛 PCR. 이러한 기술을 통해 플라스미드 연접부 서열을 확인할 수 있었다. LC RNA 및 HC RNA의 수준은 세포주 1에서 발견된 수준으로 정규화되었다. 따라서 세포주 2의 전사체 수준은 세포주 1의 전사체 수준보다 20% 더 높았다.
각각의 세포주에서 관찰된 모노클로날 항체 발현 플라스미드의 구성은 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 3은 세포주 1과 세포주 2 둘 다에서 발견되는 구성을 보여주는 모 플라스미드의 단순화된 묘사이다. 두 세포주 내의 모 플라스미드는 헤드-투-테일 구성으로 존재한다. 세포주 1 및 세포주 2에서의 구성은 서던 블롯 분석 및 플라스미드-플라스미드 융합이 검출된 플라스미드 서열 연접부의 결정에 의해 확립되었다. 도 3에서 화살표 및 GS는 글루타민 신테타제 상보성을 나타낸다.
적합한 세포주의 확인을 통해 모 플라스미드 내의 잠재적인 상동 재조합 위치를 확인할 수 있었으며, 이는 이후 모 계통으로부터 랜딩 패드 세포주를 유도하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 방법론을 사용하면 무작위 통합 세포주 발생 프로그램으로부터 표적화된 통합 전략으로 전환할 수 있다.
모 세포주 1에 대한 5' 및 3' 플라스미드 서열 연접부가 확인되었다. 5' 연접부에 상응하는 CHO 게놈 서열은 서열식별번호: 18에 제시된 서열에 제공되고, 3' 연접부에 상응하는 CHO 게놈 서열은 서열식별번호: 19에 제시된 서열에 제공된다.
실시예 2
후보 모 세포주로부터 랜딩 패드 세포주의 생성
상기 기재된 바와 같이 세포주가 확인되면, 원하는 것은 모 세포주 내의 발현 카세트를 대체 플라스미드, 예컨대 랜딩 패드 플라스미드로 대체하거나 (도 4a) 또는 이를 랜딩 패드 세포주로서 직접 사용하는 것이다 (도 4b). 이러한 접근방식을 사용하면, 모 세포주의 등가물에서 원래 플라스미드에 플랭킹하는 서열을 사용함으로써 상동 재조합 반응이 발생하므로 세포 (게놈) 플랭킹 서열에 대한 지식이 필요하다. 도 4b의 모 세포주는 낮은 카피 수의 발현 플라스미드로부터 높은 발현을 지원하는 것으로 확립되었다.
실시예 3
보편적인 랜딩 패드 세포
관련 기술분야에 공지된 바와 같이 상동 재조합에 의해 발현 또는 랜딩 패드 플라스미드를 세포 게놈에 직접 삽입하려면 상동 재조합에 사용될 세포 서열의 확인이 필요하다. 이러한 전략은 종종 잠재적으로 유해한 효과를 초래할 수 있는 부위 특이적 뉴클레아제(들)에 의해 제한되는 동일한 서열을 가진 자매 염색체(들)가 있기 때문에 잠재적으로 좋은 모 세포주를 놓칠 위험이 있다.
세포 (게놈) 플랭킹 서열에 관한 지식과 무관한 랜딩 패드 세포를 제조하고 모 세포주 내의 모 플라스미드를 랜딩 패드 자체로 사용하기 위한 대체 방법이 개발되었다. 이러한 전략은 (1) 적합한 부위 특이적 엔도뉴클레아제의 설계를 허용하기에 충분한 플랭킹 세포 서열을 확인하고, (2) 상동 재조합을 위한 영역을 랜딩 패드 상에 생성 및 클로닝하고, (3) 잠재적으로 유해한 자매 염색분체 제한을 피할 필요가 없기 때문에 현재의 산업 전략에 비해 여러 가지 이점을 제공한다. 이러한 방법은 (4) 모든 발현 세포주에 적용가능하므로 본질적으로 보편적이며, (5) 대체 게놈 의존적 전략보다 더 빠르고 저렴하다. 상기 개시된 모 세포 선택 방법을, 본원에 제공된 보편적인 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법을 조합하면, 랜딩 패드 및 랜딩 패드 세포로서 사용하기 위한 그와 연관된 "핫 클론" 또는 "핫 세포주"의 생성 및 검증을 위한 특히 효율적인 전략이 초래된다. 이러한 전략을 사용하면, 플랭킹 염색체 영역을 확인할 필요 없이 동일한 플라스미드 벡터 설정이 사용된다.
예시적인 개략적 방법이 도 5a에 제시되어 있다. 본 발명자들은 모노클로날 항체를 발현하는 모 세포주를 사용하고 상동 재조합 부위로서 모 세포주 내의 발현 카세트에 플랭킹하는 플라스미드 서열을 사용하였다. 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 모 세포주 내의 플라스미드 서열을 표적으로 하며, 그에 의해 자매 염색체 내의 부위를 피하였다. 부위 지정 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 서열은 제2의 플라스미드 (랜딩 패드 플라스미드)에는 존재하지 않았다. 표적화된 서열이 랜딩 패드 플라스미드에 있는 경우, 이들은 제거된다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 제2의 플라스미드 (P2)는 형광 마커 (b1mCherry)에 대해 코딩된 Lox 부위를 보유하고, 모 세포주에 존재하는 원래 발현 플라스미드와 상이한 선택 마커 (퓨로마이신 내성)를 발현하였다.
부위 특이적 엔도뉴클레아제 (CRISPR/Cas) 및 제2의 플라스미드의 존재 하에, 랜딩 패드 세포주가 생성되었다 (도 6a). 랜딩 패드 세포주에 존재하는 Lox 부위를 사용하여, Lox 부위에 의해 플랭킹된 생물학적 제제에 대한 발현 카세트가 있는 제3의 플라스미드 (P3)를 사용하여, Cre 지정 재조합에 의해 mCherry/퓨로마이신 코딩 서열을 대체하였다 (도 7a).
따라서, 도 5a에 나타난 모든 단계는 실시예 1에서 시험된 2개의 모 세포주 중 하나로부터 선택된 모 세포주로 시작함으로써 시행되었으며, 이는 항체 (제1의 관심 유전자)를 발현하고, mAb3 항체를 코딩하는 유전자 (제2의 관심 유전자)를 >2.5 g/L로 발현할 수 있는 발현 세포주를 제조하는 것이었다 (도 7a 및 7b). 제2의 모 세포주를 사용하여 랜딩 패드 세포주를 생성하였다.
제시된 실험 데이터에서는, 도 5a에 제시된 전체 프로세스가 시행되었다. 그러나, mCherry/퓨로마이신 중간 랜딩 패드 세포주를 생성하는 데 필요한 단계는 도 5b에 나타낸 바와 같이 완전히 건너뛸 수 있다. 이러한 경우, 모 세포주의 mAb 발현 플라스미드는 랜딩 패드로서 기능한다. 따라서, 랜딩 패드로서 기능하는 mAb 발현 플라스미드는 이러한 경우 부위 특이적 엔도뉴클레아제에 의해 자극된 상동 재조합에 의해 직접적으로 상이한 mAb 발현 플라스미드로 대체된다. 이러한 방법은 도 5a에 개시된 것보다 시간이 덜 걸리며 표적화된 통합에 대한 모 세포주의 적합성을 직접 평가할 수 있다.
추정 발명에서 부위 특이적 재조합을 사용하는 2가지 대체 포맷의 개략도가 도 8a에 나타나 있다. 두 버전 모두에서, 랜딩 패드 플라스미드는 형광 마커 (b1mCherry)를 코딩하고, 모 세포주에 존재하는 모 플라스미드와 상이하며 예를 들어, 이종 부위 특이적 재조합 부위 (SSRS)에 의해 플랭킹되는 선택 마커 (퓨로마이신 내성)를 발현한다. 부위-특이적 재조합 부위는 Cre 레콤비나제의 표적인 도 8a에서 Lox P 및 Lox 511로서 표시된다. 부위 특이적 엔도뉴클레아제 (CRISPR/Cas)와 랜딩 패드 플라스미드의 존재 하에, 모 세포주 내의 mAb 발현 카세트는 Lox 부위에 의해 플랭킹된 mCherry로서 표시된 랜딩 패드로 대체되거나 또는 결실되고 랜딩 패드는 대체 유전자좌에 통합된다 (각각 도 8a 및 8b). 도 8a의 포맷에서는, 랜딩 패드가 높은 발현을 지원하는 핫 스팟에 있다. 도 8b의 포맷에서는, 대체 핫 스팟이 확인될 수 있다. 모 세포주는 핫 세포이므로 부가의 핫 스팟을 확인하면 랜딩 패드 세포주가 높은 역가와 같은 선호 속성을 가진 발현 세포주를 생성할 수 있게 된다.
도 8a 및 8b에 나타낸 랜딩 패드 세포주를 확인하기 위한 스크리닝 전략이 확립되었다 (도 9). CRISPR/Cas 부위-특이적 엔도뉴클레아제와 함께 랜딩 패드 플라스미드를 모 세포주에 형질감염시키고 그에 대한 퓨로마이신 내성 세포를 선택하였다. CRISPR/Cas의 사용은 재조합을 촉진함으로써 랜딩 패드 세포주의 생성을 자극할 수 있다. 도 9에서 각각 왼쪽 및 오른쪽 사진에 sgRNA가 있는 경우 (+) 및 없는 경우 (-)를 비교한 것을 참조한다. sgRNA의 존재는 재조합 자극을 나타내는 mCherry 양성 세포의 수를 증가시켰다. FACS를 사용하여, mCherry 양성 (Red+) 퓨로마이신 내성 세포를 단일 세포 클로닝하였다. 모 세포주의 mAb를 더 이상 발현하지 않는 세포를 확장시키고 PCR 기반 정량적 유전자 카피 수 검정을 통해 랜딩 패드 및 임의의 잔류 경쇄 및 중쇄 유전자의 존재 여부를 스크리닝하였다. mAb 서열이 없고 단지 1-2개의 랜딩 패드 카피만 있는 세포를 추가로 평가하였다. 퓨로마이신 내성 세포의 대략 25%는 랜딩 패드 세포주이다. 중간 형광 강도 (MFI)와 mCherry의 전사체 수준이 반드시 일정하게 유지되도록 세포를 계대배양하였다. 스크리닝된 28개의 클론 중 14개는 연접부 특이적 PCR에 의해 결정된 바와 같이 도 8a에 도시된 바와 같은 mAb 서열을 대체하는 단일 랜딩 패드 및 ddPCR에 의해 평가된 유전자 카피 수를 가졌다. 랜딩 패드 세포주의 나머지는 도 8b에 도시된 바와 같이 대체 유전자좌에 있었다.
도 8a 및 도 8b의 전략 A, B, C 및 D에 나타낸 모든 단계가 성공적으로 시행되었다. mAb를 만들기 위해 2개의 경쇄 발현 카세트와 2개의 중쇄 발현 카세트로 구성된 제2의 GOI 플라스미드를 사용하여 12개의 랜딩 패드 세포주의 성능을 평가하였다. 평가된 제1의 파라미터는 Cre 재조합 후 발현 세포의 퍼센트였다. 이는 선택 후 단일 세포 클로닝 단계 이전에 대량 집단에 존재하는 Red(-) 세포의 퍼센트를 측정함으로써 수행되었다. Red(-) 발현 세포의 퍼센트는 시험된 12개 랜딩 패드 세포주에 대해 평균 24로 11 내지 39의 범위였다 (도 10). Cre의 부재 하에, 거의 모든 랜딩 패드 세포주는 >99% Red(+)이다. 이는 랜딩 패드 세포주와 그의 Lox 부위가 Cre 지정 재조합에 기능적이라는 것을 명확하게 보여준다.
도 8a를 대표하는 발현 세포주는 Red(-) 세포에 대한 FACS 분류에 의해 12개의 랜딩 패드 세포주 중 5개로부터 생성되었다. 랜딩 패드 세포주당 32개의 발현 세포주를 무작위로 골라 확장시키고, 24 딥 웰 플레이트 (DWP) 공급 배치 검정을 사용하여 생산성을 결정하였으며, 그 결과는 도 11a 및 11b에 제시되어 있다. 모든 랜딩 패드 세포주는 중앙값 역가가 > 1.69 g/L인 다수의 발현 세포주를 생성하였으며, 다수의 클론 각각은 역가가 > 3 g/L이고 몇몇 클론은 역가가 > 4 g/L이었고, 이는 모든 랜딩 패드 세포주가 제조 목적에 적합한 발현 세포주를 생성할 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.
이러한 높은 발현 세포주는 단지 32개의 무작위로 선택된 클론으로부터 단일 세포 클로닝 후 개입 스크리닝 없이 확인되었으며, 이는 몇 주간의 시간을 절약하고 스크리닝에 필요한 클론의 수를 대폭 감소시켰으며, 2가지 모두 높은 가치를 가지고 있다. 또한, 시험된 5개의 랜딩 패드 세포주는 통계적으로 서로 구별할 수 없다. 이들 데이터는 모 플라스미드 유전자좌가 핫 스팟임을 입증해 주고, 상대적으로 최소한의 스크리닝으로 이러한 하나의 유전자좌로부터 다수의 랜딩 패드 세포주가 생성되었기 때문에 도 8a 및 8b에 개요 서술된 보편적인 TI 전략이 유효하다는 것을 입증해 준다.
도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이 발현 세포주를 생산하는 기술은 랜딩 패드의 적어도 일부분을 대체한다. 하기를 포함하여, 대체가 필요하지 않는 랜딩 패드 기술이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Thyagarajan, B., Olivares, E.C., Hollis, R.P., Ginsburg, D.S. and Calos, M.P. (2001) Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phage phiC31 integrase. Mol. Cell. Biol., 21, 3926-3934; Gaidukov, L., Wroblewska, L., Teague, B., Nelson, T., Zhang, X., Liu, Y., Jagtap, K., Mamo, S., Tseng, W.A., Lowe, A. et al. (2018) A multi-landing pad DNA integration platform for mammalian cell engineering. Nucleic Acids Res., 46, 4072-4086; Sauer, B. and Henderson, N. (1990) Targeted insertion of exogenous DNA into the eukaryotic genome by the Cre recombinase. New Biol, 2, 441-449; Fukushige, S. and Sauer, B. (1992) Genomic targeting with a positive-selection lox integration vector allows highly reproducible gene expression in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 7905-7909). 이러한 대체 랜딩 패드 및 연관 기술은 도 8a에 개시된 Cre/Lox 랜딩 패드 설계 대신 사용될 수 있다.
실시예 4
듀오-랜딩 패드 세포
상기에는 단일 랜딩 패드를 함유하는 랜딩 패드 세포주가 기재되어 있다. 그러나, 하나 초과의 랜딩 패드가 있는 랜딩 패드 세포주는 다중 서브유닛 생물학적 제제, 예컨대 이중특이적 모노클로날 항체의 발현을 더욱 정제할 수 있는 기회를 제공한다. 따라서 본 발명자들은 동일한 유전자좌에 2개의 랜딩 패드, 즉 듀오-랜딩 패드를 갖는 랜딩 패드 세포주에 대해 스크리닝하였다. 이렇게 하면 두 랜딩 패드가 동일한 유전자좌에 상주하므로 이들 패드로부터 동일한 발현이 보장된다. 듀오-랜딩 패드는 헤드-투-헤드, 테일-투-테일, 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일의 4가지 상이한 배향으로 통합될 수 있다 (도 12b). 단일 부위 지정 레콤비나제, 예컨대 Cre 또는 Flp가 사용되는 경우, 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 구성이 선호되며 기능적으로 서로 구별할 수 없다. Cre의 존재 하에 랜딩 패드 중 하나의 결실을 초래할 수 있는 테일 투 헤드 및 헤드 투 테일 구성과 달리, 다른 2가지 구성은 단순히 역전을 거쳐 동일한 시작 구성이 된다 (도 12b). 본 발명자들은 헤드-투-헤드 구성에서 이러한 듀오-랜딩 패드 세포주를 생성하였다. 이는 도 8b에 기재된 바와 같이 모 세포주의 mAb가 상주하는 유전자좌 이외의 대체 유전자좌에 있다.
제2의 GOI 플라스미드가 도 12b의 4가지 듀오-랜딩 패드 구성 각각과 함께 사용되는 경우, 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 구성은 각각 플라스미드 연접부에 플랭킹하는 2개의 재조합 부위 사이의 서열이 역전될 수 있는 2개의 세포주를 생성할 수 있으며, 그렇지 않은 경우 2개의 세포주는 동일하다 (도 13). 헤드-투-테일 또는 테일-투-헤드 구성을 제2의 GOI 플라스미드와 함께 사용하는 경우, 2개의 제2의 GOI가 있는 세포주가 생산된다. 그러나, 충분한 양의 Cre 활성이 존재하는 경우, 제2의 GOI 중 하나가 제거되어 단일 제2의 GOI가 있는 제2의 GOI 플라스미드 세포주가 생성될 수 있다 (도 14).
랜딩 패드가 도 12b에서 Lox 511 대신 Flp에 대한 Frt 인식 부위를 사용하고 Cre와 Flp 둘 다가 사용되는 경우, 동일한 결과가 나올 것이며, 도 12a를 도 15와 비교하면, 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일 배향은 결실되는 반면, 헤드-투-헤드 및 테일-투-테일 배향은 역전된다 (도 15). 그러나, 테일-투-테일 및 헤드-투-헤드 구성으로 인테그라제와 함께 attP/attB를 사용하여 제2의 GOI를 듀오-랜딩 패드에 재조합하면 역전이 초래되지 않지만, 테일-투-헤드 및 헤드-투-테일 구성에서는 랜딩 패드 중 하나의 결실이 여전히 발생할 수 있다 (도 16). 각각의 랜딩 패드가 하나의 attP 부위만 갖고 있는 경우, 단일 attB 부위를 갖는 원형 제2의 GOI 플라스미드의 단일 통합이 발생하여, 도 16의 4가지 듀오-랜딩 패드 구성 중 어떤 것에서도 결실이 발생하지 않는다.
듀오 랜딩 패드는 다수의 상이한 GOI 플라스미드와 동시에 사용될 수 있다. 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 다수의 상이한 발현 카세트를 갖는 단일 랜딩 패드가 있는 랜딩 패드 세포주의 사용이 개시되었다. 듀오-랜딩 패드 세포주를 사용하면 단일 랜딩 패드가 있는 랜딩 패드 세포주에 비해 이점이 있다. 단일 랜딩 패드 세포주의 경우, 세포주는 단일 제2의 GOI만 수용하므로 다성분 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 모든 발현 카세트는 단일 제2의 GOI 플라스미드에 배치되어야만 한다. 듀오-랜딩 패드 세포주의 경우는 그렇지 않다. 듀오-랜딩 패드 세포주는 더 높은 발현 다양성 수준으로 설계할 수 있는 기회를 제공하여, 우수한 특징을 지닌 발현 세포주를 생성할 수 있는 기회를 제공한다.
제2의 GOI 플라스미드의 상이한 구성을 사용하여 여러 방식으로 다양성을 생성할 수 있다. 한 경우에, 제2의 GOI 플라스미드는 독특한 구성으로 복합 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 모든 발현 카세트를 함유한다. 제2의 경우, 제2의 GOI 플라스미드는 발현 세포주를 만들기 위해 동일한 세포에 있을 필요가 있는 발현 카세트의 서브세트를 함유할 수 있다. 제3의 경우, 독특한 구성(들)의 모든 발현 카세트의 서브세트를 함유하는 제2의 GOI 플라스미드 세트와 함께 복합 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 독특한 구성의 모든 발현 카세트를 갖는 하나 이상의 제2의 GOI 플라스미드가 이전 두 경우의 조합이다.
단지 예시의 목적으로, 달성될 수 있는 다양성의 단순화된 표현이 도 17a에 나타나 있다. 각각의 랜딩 패드는 Lox 511과 Lox P 쌍 형성으로 구성된다. 여기서 복합 생물학적 제제를 제조하는 데 필요한 발현 카세트는 2가지 세트로 나누어지며, 하나는 실선 화살표로 표시되고 다른 하나는 점선 화살표로 표시된다. 두 세트가 단일 제2의 GOI 플라스미드에서 발견되는 경우, 이들은 실선-점선 및 점선-실선 배열의 직렬 화살표로서 예시된 바와 같이 상이한 구성이 될 수 있다. 또한 2가지 세트의 발현 플라스미드 중 단 하나만 함유하는 제2의 GOI 플라스미드가 단일 화살표로서 표시된다. 각각의 랜딩 패드에는 단일 실선 및 점선 화살표가 표시되지 않는다. 2가지 세트의 발현 카세트를 상이하게 조합한 7개의 상이한 발현 세포주가 표시된다. 발현 세포주 내의 2개 세트의 비율은 왼쪽에 표시된다. 쉽게 알 수 있듯이 단일 랜딩 패드를 갖는 것과 비교하여 복잡성이 크게 증가한다. 이러한 다양한 발현 세포주 세트를 쉽게 스크리닝하여 우수한 특징 중 하나를 찾는 것이 가능하다 (Altamura, R., Doshi, J. and Benenson, Y. (2022) Rational design and construction of multi-copy biomanufacturing islands in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 50, 561-578).
도 12a 내지 17a에서는 두 랜딩 패드 모두가 동일한 레콤비나제 또는 Int 인식 서열을 갖는 듀오-랜딩 패드 구성을 보여주지만, 각각의 랜딩 패드가 독특한 재조합 "어드레스"를 갖도록 제조하는 것이 가능하다. 레콤비나제, 예컨대 Cre 및 Flp의 경우, 4개의 독특한 인식 서열이 사용된다. 각각의 랜딩 패드는 독특한 인식 부위 쌍 형성을 갖는다. 4개의 호환불가능한 Lox 부위를 사용한 예가 도 18에 나타나 있다 (Langer, S.J., Ghafoori, A.P., Byrd, M. and Leinwand, L. (2002) A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites. Nucleic Acids Res., 30, 3067-3077; Missirlis, P.I., Smailus, D.E. and Holt, R.A. (2006) A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics, 7, 73; Siegel, R.W., Jain, R. and Bradbury, A. (2001) Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences. FEBS Lett., 505, 467-473). 부가 전략의 예는 도 18의 2개의 Lox 부위를 2개의 호환불가능한 Frt 부위로 대체하는 것 및 Cre를 Frt와 함께 사용하는 것 (문헌 [Lauth, M., Spreafico, F., Dethleffsen, K. and Meyer, M. (2002) Stable and efficient cassette exchange under non-selectable conditions by combined use of two site-specific recombinases. Nucleic Acids Res., 30, e115]), 인테그라제를 2개 내지 4개의 호환불가능한 aat 부위와 함께 사용하는 것 (문헌 [Jusiak, B., Jagtap, K., Gaidukov, L., Duportet, X., Bandara, K., Chu, J., Zhang, L., Weiss, R. and Lu, T.K. (2019) Comparison of Integrases Identifies Bxb1-GA Mutant as the Most Efficient Site-Specific Integrase System in Mammalian Cells. ACS Synth Biol, 8, 16-24.]), 예를 들어 BxB1의 인테그라제 (문헌 [Jusiak, B., Jagtap, K., Gaidukov, L., Duportet, X., Bandara, K., Chu, J., Zhang, L., Weiss, R. and Lu, T.K. (2019) Comparison of Integrases Identifies Bxb1-GA Mutant as the Most Efficient Site-Specific Integrase System in Mammalian Cells. ACS Synth Biol, 8, 16-24]) 및 phiC31의 인테그라제 (문헌 [Smith, M.C., Brown, W.R., McEwan, A.R. and Rowley, P.A. (2010) Site-specific recombination by phiC31 integrase and other large serine recombinases. Biochem. Soc. Trans., 38, 388-394])를 하나 초과 사용하는 것, 및 그의 조합을 포함한다. 각각의 랜딩 패드에 단일 att 부위를 사용하는 것이 제2의 GOI 플라스미드를 각각의 랜딩 패드에 삽입하는 데 충분하다 (도 19). 이러한 경우, 선형 플라스미드가 염색체를 효과적으로 제한하므로 제2의 GOI 플라스미드는 원형이어야 한다. 또한 랜딩 패드는 다수의 att 부위를 함유하여 각각이 독특한 어드레스를 함유할 수 있도록 하는 것은 명백하다. 이러한 예는 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
독특한 어드레스가 있는 랜딩 패드가 있는 듀오-랜딩 패드 구성은 또한, 어드레싱이 불가능한 경우와 비교하여 보다 잘 정의된 다양한 발현 세포주를 생성하고 (도 17a 및 17b 참조), 단일 랜딩 패드가 있는 랜딩 패드 세포주에 대한 더 높은 다양성을 생성하는 데 사용될 수 있다. 독특한 어드레스를 가진 랜딩 패드를 사용한 단순화된 예시가 도 17b에 제시된다. 하나의 랜딩 패드는 Lox 511과 Lox P로 구성되고, 제2의 랜딩 패드는 Lox 부위 2272와 M3으로 구성된다. 화살표에 대한 설명은 상기 제공된 도 17a에 대한 설명과 동일하다. 본 실시예에서는, 특정한 제2의 GOI가 요망되는 것으로 공지되어 있지만, 복합 생물학적 제제를 발현하는 데 필요한 나머지는 명확히 정의되어 있지 않으므로, 4가지 상이한 제2의 GO가 인접한 랜딩 패드에 배치되어 4가지 상이한 발현 세포주가 생성된다. 이러한 다양한 발현 세포주 세트를 쉽게 스크리닝하여 우수한 특징 중 하나를 찾는 것이 가능하다 (Altamura, R., Doshi, J. and Benenson, Y. (2022) Rational design and construction of multi-copy biomanufacturing islands in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 50, 561-578).
어드레싱가능한 랜딩 패드의 부가의 적용은 각각 자체 독립적인 기능을 가지고 발현되는 2개의 독립적인 생물학적 제제를 갖는 옵션이다. 생물학적 제제 중 하나는 발현 세포주가 제2의 생물학적 제제를 발현하는 데 도움이 될 수 있거나, 또는 제1의 생물학적 제제는 제2의 생물학적 제제의 특정한 번역 후 변형을 일으키거나 발현 세포주의 일부 다른 성분을 변형시킬 수 있다. 이는 단순한 예이며 본질적으로 제한하려는 의도가 아니다. 2개의 랜딩 패드가 도 17a에서와 같이 독특한 어드레스를 갖지 않는 경우에도 이러한 동일한 사용이 적용된다는 것은 명백하며 단지 더 높은 수준의 다양성이 수득된다.
듀오-랜딩 패드 세포주의 유용성은 모 세포주의 모 플라스미드에 대한 대체 유전자좌에서 헤드-투-헤드 구성을 사용하여 실시하는 것으로 감소되었다. 제2의 GOI 플라스미드는 도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이 경쇄 및 중쇄 유전자의 단일 카피, 및 GS 선택 카세트를 함유한다. Cre 재조합 후 발현 세포의 퍼센트를 결정하였다. 이는 mAb 발현이 IgG 세포 표면 염색에 의해 검출된 Red(-) mAb(+) 세포의 수를 측정함으로써 수행되었으며, 그 결과는 (도 20)에 나타나 있다. 선택으로부터 복구된 후, 두 랜딩 패드의 6.24%가 제2의 GOI로 교체되었다. 본질적으로 모든 Red(-) 세포는 mAb(+)이므로, 예를 들어 FACS에 의한 Red(-) 세포 상의 단일 세포 클로닝을 통해 발현 세포주만 단리할 수 있다.
이를 통해 선택 단계 동안 확장 및 C50 생산성 스크리닝을 제거할 수 있고, 세포주 발생에 있어서 클론 발생 동안 정적 스크리닝을 제거할 수 있다 (도 1). 이는 또한 클론 발생 단계에서 스크리닝해야 하는 발현 세포주의 수를 감소시킨다 (도 1). 도 1은 무작위 통합을 사용한 히스토릭 세포주 발생을 도시한다. 이는 세포주를 선형화된 발현 플라스미드로 형질감염시켜 세포 게놈 내의 무작위 위치에 통합시키는 표준 세포주 발생 전략이었다. 형질감염 후 세포를 플레이트로 세분하고 약물 (퓨로마이신) 또는 영양요구체 상보성 (글루타민 신테타제 (GS))과 같은 선택을 실시하였다. 발현 플라스미드가 있는 세포만 생존하고 마스터 웰 발생 중에 확장되었다. 최고 생산성 마스터 웰로부터의 수천 개의 세포는 높은 발현 클론을 찾을 수 있도록 클론 발생을 위해 클로닝된 단일 세포였다. 클론을 확장시키고 최고의 후보 클론이 확인될 때까지 여러 차례의 스크리닝을 거쳤다. 제조 목적에 대한 적합성에 대해 상위 6개 클론을 확인하고 (상위 6개 RCB) 추가 평가 (RCB 클론 선택)를 수행한 후, 최종적으로 상위 클론이 확인되었다.
무작위 통합에 비해 표적화된 통합의 가치는 2개의 mAb에 대한 발현 세포주를 만들어 평가되었다. 듀오-랜딩 패드 세포주 및 CHO 숙주 세포주를 각각 Cre 레콤비나제가 있거나 없는 각각의 제2의 GOI 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 세포는 선택을 거쳐 c50 튜브에 시딩하고 생산성을 시험하기에 충분한 세포가 확보될 때까지 확장되었다. 그 결과가 도 21에 제시되어 있다. 표적화된 통합은 무작위 통합된 세포의 역가의 3배를 초과하는 역가를 생성하였다. 이는 전체 집단이기 때문에, 평균적으로 표적화된 통합이 무작위 통합과 비교하여 세포주 발현을 상당히 더 높게 만든다는 것을 명확하게 보여준다.
듀오-랜딩 패드 세포주는 관련 수준에서 생물학적 제제를 생산할 수 있다. 1개의 LC와 1개의 HC, 또는 2개의 LC와 2개의 HC 발현 카세트를 갖는 2가지 상이한 제2의 GOI 플라스미드 구성을 듀오-랜딩 패드 세포주와 함께 사용하여 mAb A 및 mAb B를 제조하였다. 제조용 바이오리액터의 축소 모델에서 각각으로부터 상위 6개 클론을 각각의 mAb에 대해 평가하였다 (도 22). 역가의 범위는 1개의 LC 및 1개의 HC 구성의 경우 각각 mAb A 및 mAb B에 대해 3.1 내지 5.7 g/L 및 3.5 내지 4.8 g/L이었다. 2개의 LC와 2개의 HC의 제2의 GOI 플라스미드를 사용한 경우에는 mAb A 및 mAb B 둘 다에 대한 역가가 증가하여, 각각 3.8 내지 6.6 g/L 및 4.3 내지 6.7 g/L 범위의 역가를 생성하였다. 이는 mAb A 및 mAb B에 대한 평균 역가 증가가 각각 25% 및 38%임을 나타내며, 이는 GOI 플라스미드 구성에 있어서의 변화가 역가를 증가시킬 수 있다는 것을 입증해 준다. 이러한 데이터는 또한 듀오-랜딩 패드가 높은 역가의 발현 세포주를 재현성있게 생성한다는 것을 명확하게 보여준다. 12개 발현 세포주의 서던 블롯 및 긴 판독 DNA 시퀀싱에 의한 유전자 특징 규명은, 이들 모두가 랜딩 패드로의 Cre 지정 재조합으로부터 발생했다는 것을 명확하게 보여주었다 (데이터는 표시되지 않음).
이들 데이터는 명확한 유용성으로 도 5b 및 8에 개요 서술된 바와 같은 TI 랜딩 패드 세포주를 제조하여, 무작위 통합 기술과 비교하여 발현 세포주를 더 많이 발현하는 집단을 생성하고, 관련 생산성을 갖는 발현 세포주를 제조하는 데 걸리는 시간을 단축시키는 보편적인 전략을 검증해 준다. 또한 듀오-랜딩 패드 설계의 기능성과, 듀오-랜딩 패드가 핫 스팟으로서 상주하는 유전자좌를 검증해 준다.
실시예 5
랜딩 패드 핫 스팟
이전 개시내용 외에도, 본 발명자들은 확인된 "핫 스팟"의 유전자좌를 또한 제공한다. 이러한 "핫 스팟" 유전자좌는 독특하며 하나 또는 다수의 랜딩 패드를 삽입할 수 있는 위치를 제공한다. 유전자좌는 서로 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 본 개시내용은 2개의 랜딩 패드 핫 스팟 (핫 스팟 1 및 핫 스팟 2)을 제공한다.
핫 스팟 1은 크리세툴루스 그리세우스 (서열식별번호: 22)로부터의 gi|1497155598|ref|NW_020822499.1 내에 위치한다. 일부 측면에서, 핫 스팟 1은 서열식별번호: 20 내에 위치한다. 상동 재조합에 적합한 5' 서열은 서열식별번호: 16 및 18에 제공된다. 상동 재조합에 적합한 3' 서열은 서열식별번호: 17 및 19에 제공된다. 일부 측면에서, 핫 스팟 1 내의 통합 부위는 서열식별번호: 21에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
핫 스팟 2는 크리세툴루스 그리세우스 (서열식별번호: 118)로부터의 ref|NW_020822577.1 내에 위치한다. 일부 측면에서, 핫 스팟 2는 서열식별번호: 116 내에 위치한다. 상동 재조합에 적합한 5' 서열은 서열식별번호: 112 및 114에 제공된다. 상동 재조합에 적합한 3' 서열은 서열식별번호: 113 및 115에 제공된다. 일부 측면에서, 핫 스팟 2 내의 통합 부위는 서열식별번호: 117에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 핫 스팟 2는 오픈 리딩 프레임이 그의 서열에 포함되어 있지 않기 때문에 특히 유리하다.
발명의 내용 및 요약서 섹션이 아닌 발명을 실시하기 위한 구체적 내용 섹션이 청구범위를 해석하는 데 사용되도록 의도된 것임을 인지해야 한다. 발명의 내용 및 요약서 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려된 바와 같은 본 발명의 예시적인 모든 실시양태의 전부는 아니지만 하나 이상을 제시할 수 있으며, 따라서 본 발명과 첨부된 청구범위를 어떤 방식으로든 제한하려는 의도는 없다.
본 발명은 명시된 기능 및 그의 관계의 구현을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 상기에 기재되었다. 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 본 설명의 편의를 위해 본원에서 임의로 정의되었다. 지정된 기능과 그의 관계가 적절하게 수행되는 한 대체 경계를 정의할 수 있다.
구체적 실시양태에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 성질을 완전히 드러낼 것이며, 다른 사람들은 본 기술분야 내의 지식을 적용함으로써, 과도한 실험 없이, 본 발명의 일반적인 개념에서 벗어나지 않고서도 이러한 구체적 실시양태와 같은 다양한 적용을 위해 쉽게 변형 및/또는 적응할 수 있다. 따라서, 그러한 적응 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 실시양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본원에서의 용어 또는 문구는 설명을 위한 것이지 제한을 위한 것이 아니므로, 본 명세서의 용어 또는 문구는 교시 및 지침에 비추어 통상의 기술자에 의해 해석되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 폭과 범위는 상기 기재된 예시적인 실시양태 중 임의의 것에 의해 제한되어서는 안되며, 하기 청구범위와 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용 참고문헌 (참고 문헌, 특허, 특허 출원 및 웹사이트 포함)의 내용은 2022년 11월 15일에 공개적으로 입수가능한 버전에 인용된 참고문헌과 마찬가지로, 어떤 목적으로든 그 전체 내용이 명시적으로 본원에 참조로 포함된다. 데이터베이스 등록 번호로서 확인된 단백질 및 핵산 서열, 및 대상 데이터베이스 항목에 함유된 기타 정보 (예를 들어, 구체적인 진뱅크 수닥 번호에 상응하는 데이터베이스 항목 내의 비-서열 관련 내용)는 참조로 포함되어 있으며, 2022년 11월 15일에 공개적으로 입수가능한 상응하는 데이터베이스 출시에 상응한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (100)

  1. (i) 관심 유전자 (GOI)의 발현 역가가 높은 세포주를 스크리닝하고 선택하는 단계; 및
    (ii) (i)의 세포를 추가로 스크리닝하고 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 모 플라스미드의 카피 수가 적은 세포를 선택하는 단계이며, 여기서 카피 수는 1 또는 2개인 단계
    를 포함하는, 랜딩 패드 세포주의 발생에 적합한 모 세포를 선택하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 모 플라스미드가 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)를 포함하거나, 1개의 SSRS를 포함하거나, 또는 SSRS를 포함하지 않는 것인 방법.
  3. (i) 모 세포주에서 모 플라스미드 또는 그의 일부분의 상실에 대해 스크리닝하고, 이러한 상실 (결실)이 있는 세포를 선택하는 단계; 및
    (ii) (i)의 세포를 랜딩 패드의 존재에 대해 추가로 스크리닝하고, 랜딩 패드가 존재하는 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 선택하는 방법.
  4. (i) 모 세포주에서 적어도 하나의 모 플라스미드 또는 그의 일부분의 상실에 대해 스크리닝하고, 이러한 상실 (결실)이 있는 세포를 선택하는 단계; 및
    (ii) (i)의 세포를 적어도 하나의 랜딩 패드의 존재에 대해 추가로 스크리닝하고, 랜딩 패드가 존재하는 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 선택하는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    (i) 낮은 복잡성 또는 높은 복잡성의 영역의 존재 또는 부재;
    (ii) 레트로트랜스포손 서열의 존재 또는 부재;
    (iii) Alu 반복부의 존재 또는 부재;
    (iv) 길게 산재된 핵 요소 (LINE)의 존재 또는 부재;
    (v) CpG 섬의 존재 또는 부재;
    (vi) 시토신 메틸화의 수준;
    (vii) 히스톤 아세틸화의 수준;
    (viii) 활성 전사의 존재 또는 부재; 및
    (ix) 그의 임의의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 특징에 대해 랜딩 패드 세포 내의 랜딩 패드 서열을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. (i) 모 세포주에서 제1의 GOI를 포함하는 적어도 하나의 모 플라스미드 또는 그의 일부분을 결실시키는 단계; 및
    (ii) 적어도 한 번의 결실 후에, 랜딩 패드를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 세포 내로 도입하는 단계
    를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 랜딩 패드를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분이 (i)의 결실 부위에 삽입되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 랜딩 패드를 포함하는 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분이 (i)의 결실 부위가 아닌 부위에 삽입되는 것인 방법.
  9. 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법으로서, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 플라스미드에 위치하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드는
    (1) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    (2) (1)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및
    (3) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위
    를 포함하며; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 상동 재조합 부위는 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA에 삽입된 모 플라스미드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것인 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모 플라스미드가 하나 초과의 게놈 유전자좌에 위치하는 것인 방법.
  11. (1) 모 세포의 게놈 서열에 통합된 모 플라스미드로부터 제1의 GOI의 적어도 일부분을 제거하는 단계;
    (2) 대체 게놈 유전자좌에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계;
    (3) 적어도 하나의 대체 게놈 유전자좌에 통합된 랜딩 패드 플라스미드의 적어도 하나의 카피를 포함하는 후보 세포의 라이브러리를 스크리닝하는 단계이며, 여기서 후보 세포주는 하기 특성:
    (a) 세포 역가가 미리 결정된 한계치 수준을 초과함;
    (b) 랜딩 패드 플라스미드 또는 랜딩 패드 카피 수가 미리 결정된 값임;
    (c) 미리 결정된 한계치 수준을 초과하는 RNA 발현 수준;
    (d) 존재하는 경우 다수의 플라스미드 카피는 특이적 플라스미드 구성을 가짐;
    (e) 모 플라스미드로부터 제1의 GOI의 적어도 일부분의 결실; 및
    (f) 기능적 SSRS를 갖는 적어도 하나의 랜딩 패드의 존재
    중 하나 이상에 대해 평가되는 것인 단계
    를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 확인하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 모 세포가 히스토릭 세포주인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 후보 세포의 라이브러리가 모 세포 게놈 내의 다수의 위치에서 랜딩 패드 서열의 무작위 통합을 통해 생성된 라이브러리인 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 핫 스팟에 통합된 랜딩 패드 서열을 갖는 핫 세포를 선택하는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 모 세포주가 CHO 세포주인 방법.
  16. 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용하여 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라 랜딩 패드 세포의 게놈에 제2의 GOI 플라스미드를 통합시키는 단계를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법으로서, 여기서 그 결과로 생성된 발현 플라스미드는
    (1) 제2의 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (2) (1)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS
    를 포함하며; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 제2의 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포의 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 방법.
  17. (a) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포의 게놈에 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 플라스미드에 위치하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분은
    (1a) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    (2a) (1a)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 SSRS; 및
    (3a) 모 플라스미드 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2a)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위
    를 포함하고; 여기서 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분의 상동 재조합 부위는 상이한 게놈 유전자좌에서 랜딩 패드 내의 모 플라스미드의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA 내의 상이한 게놈 유전자좌에서 랜딩 패드 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드 또는 그의 일부분을 통합시키는 것인 단계; 및
    (b) 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용하여 랜딩 패드 세포의 게놈에 제2의 GOI 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 발현 플라스미드는
    (1b) GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (2b) (1b)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS
    를 포함하며; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포의 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계
    를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법.
  18. (a) 모 세포주 내의 제1의 핫 스팟 위치로부터 모 플라스미드의 적어도 일부분을 제거하는 단계; 및
    (b) 상동 재조합 또는 무작위 통합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포의 게놈 내의 제2의 핫 스팟 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합 또는 무작위 통합을 위해 표적화된 서열은 랜딩 패드 플라스미드에 존재하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드는
    (1) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    (2) (1)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및
    (3) 모 세포주 게놈 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위
    를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는, 랜딩 패드 세포를 생성하는 방법.
  19. (a) 모 세포주 내의 제1의 핫 스팟 위치로부터 모 플라스미드 또는 그의 일부분을 제거하는 단계,
    (b) 상동 재조합을 사용하여 표적화된-통합 부위에서 모 세포 게놈 내의 제2의 핫 스팟 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 상동 재조합을 위해 표적화된 서열은 모 세포주에 존재하고, 여기서 각각의 랜딩 패드 플라스미드는
    (1b) 적어도 하나의 선택 마커를 코딩하는 핵산 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    (2b) (1b)의 폴리뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 2개의 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS); 및
    (3b) 모 세포주 내의 상응하는 상동 재조합 부위와 상동인, (2b)의 SSRS에 대해 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 상동 재조합 부위
    를 포함하며, 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 상동 재조합 부위는 모 세포주의 상응하는 상동 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 모 세포 게놈 DNA 내의 내부 위치에 랜딩 패드 플라스미드를 통합시키는 것인 단계; 및
    (c) 부위-특이적 레콤비나제 재조합을 사용하여 랜딩 패드 세포의 게놈에 GOI 플라스미드를 통합시키는 단계이며, 여기서 발현 플라스미드는
    (1c) 제1의 GOI를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (2c) (1c)의 폴리뉴클레오티드에 플랭킹하는 2개의 SSRS
    을 포함하며; 여기서 랜딩 패드 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 GOI 플라스미드의 상응하는 부위-특이적 재조합 부위와 재조합하고, 그에 의해 랜딩 패드 세포의 랜딩 패드 플라스미드 내의 내부 위치에 GOI 플라스미드를 통합시키는 것인 단계
    를 포함하는, 발현 세포를 생성하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 랜딩 패드 세포가 하기 설명에 상응하는 토폴로지를 갖는 플라스미드를 포함하는 것인 방법:
    CG1/-[P1]-[P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2]-[P1]-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1])-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-[P2]-[P1]-/CG2;
    CG1/-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P1]-([P2])n-[P1])-/CG2;
    -[P1]-[P2]-[P1]-; 또는
    -([P1]-([P2])n-[P1])-
    여기서:
    CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
    [P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [M]은 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이고;
    n은 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임.
  21. 제16항, 제17항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 세포에 통합된 플라스미드의 토폴로지가 하기 설명에 상응하는 것인 방법:
    CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[P3]-[=SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2
    CG1/-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2
    여기서:
    CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
    [P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [P3]은 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이고;
    n은 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임.
  22. 제9항 및 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상동 재조합이 CRISPR/Cas 시스템, TALEN 시스템 또는 ZFN 시스템에 의해 매개되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, CRISPR/Cas 시스템이 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 추가로 포함하는 것인 방법.
  24. 제2항 및 제9항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 부위-특이적 레콤비나제 재조합 부위 (SSRS)가 Tyr-레콤비나제 부위, Tyr-인테그라제 부위, 세린-레졸바제/인버타제 부위, 또는 세린-인테그라제 부위인 방법.
  25. 제24항에 있어서, Tyr-레콤비나제 부위가 Cre, Dre, Flp, KD, B3 또는 B3 Tyr-레콤비나제 부위를 포함하는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, Tyr-인테그라제 부위가 λ (람다), HK022 또는 HP1 Tyr-인테그라제 부위를 포함하는 것인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 세린-레졸바제/인버타제 부위가 γδ (감마델타), ParA, Tn3, 또는 Gin 세린-레졸바제/인테그라제 부위를 포함하는 것인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 세린-인테그라제 부위가 PhiC31, Bxb1, 또는 R4 세린-인테그라제 부위를 포함하는 것인 방법.
  29. 제24항에 있어서, Tyr-레콤비나제 부위가 Cre Tyr-레콤비나제 부위를 포함하는 것인 방법.
  30. 제24항에 있어서, SSRS가 LoxP 부위인 방법.
  31. 제30항에 있어서, LoxP 부위가 서열식별번호: 1 (야생형 LoxP)에 제시된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, LoxP 부위가 돌연변이 LoxP 부위를 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 돌연변이 LoxP 부위가 서열식별번호: 2 (돌연변이 LoxP)에 제시된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 돌연변이 LoxP 부위가 서열식별번호: 3 (Lox 511); 서열식별번호: 4 (Lox 5171); 서열식별번호: 5 (Lox 2272); 서열식별번호: 6 (Lox M2); 서열식별번호: 7 (Lox M3); 서열식별번호: 8 (Lox M7); 서열식별번호: 9 (Lox M11); 서열식별번호: 10 (Lox 71); 및 서열식별번호: 11 (Lox 66)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 것인 방법.
  35. 제24항에 있어서, Tyr-레콤비나제 부위가 Flp Tyr-레콤비나제 부위를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, SSRS가 짧은 플립파제 인식 표적 (FRT) 부위인 방법.
  37. 제24항에 있어서, 세린-인테그라제 부위가 attP 또는 attB 부위를 포함하는 것인 방법.
  38. 제9항, 제10항 및 제17항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 글루타민 신테타제 (GS) 및/또는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)인 방법.
  39. 제9항, 제10항 및 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 약물 내성 유전자인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 약물 내성 유전자가 항생제 내성 유전자인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 항생제 내성 유전자가 퓨로마이신 내성 유전자인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 퓨로마이신 내성 유전자가 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제인 방법.
  43. 제9항, 제10항 및 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 단백질을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 단백질이 형광 단백질인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 형광 단백질이 mCherry인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 형광 단백질이 GFP, ZsGreen1, AcGFP1, EGFP, GFPuv, AcGFP, EBFP, EYFP, ECFP, tdTomato, mCherry, DsRed, AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed2, DsRed-Express, HcRed, AsRed, mOrange, mOrange2, mPlum, mStrawberry, mBanana, YFP, mRaspberry, HcRed1, E2-Crimson, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 방법.
  48. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 HEK293 또는 NS0인 방법.
  49. 제1항, 제2항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제17항, 및 제19항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, GOI를 코딩하는 핵산이 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 적어도 하나의 폴리펩티드가 항체 또는 융합 단백질인 방법.
  51. 제16항, 제17항 및 제19항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 플라스미드가 GOI의 1개, 2개, 또는 2개 초과의 카피, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, GOI, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, GOI의 발현이 정량적으로 및/또는 정성적으로 결정되는 것인 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, GOI의 발현이 세포 분류, FACS, 세포 표면 염색, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 컬럼 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 미세유체학, UV 흡광도, 면역조직화학, 세포 크기, 분비된 단백질 수준, 전사체 수준, 또는 그의 임의의 조합에 의해 결정되는 것인 방법.
  55. 제3항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 랜딩 패드 플라스미드 또는 발현 플라스미드가 세포의 게놈 내에 1개의 카피 수로 통합되는 것인 방법.
  56. 제3항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 랜딩 패드 플라스미드 또는 발현 플라스미드가 세포의 게놈 내에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 카피 수로 통합되는 것인 방법.
  57. 제9항 내지 제10항 및 제17항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 5' 상동 재조합 부위가 서열식별번호: 18의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하고, 3' 상동 재조합 부위가 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하거나;
    (ii) 5' 상동 재조합 부위가 서열식별번호: 114의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하고, 3' 상동 재조합 부위가 서열식별번호: 115의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 하위서열을 포함하거나; 또는
    (iii) 5' 상동 재조합 부위 및 3' 상동 재조합 부위가 모 플라스미드에 플랭킹하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 모 플라스미드가 제1의 GOI, 예컨대 항체를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 것인 방법.
  59. 하기 설명에 상응하는 토폴로지를 갖는 플라스미드를 포함하는 랜딩 패드 세포:
    CG1/-[P1]-[P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2]-[P1]-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[M]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1])-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-([P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1])-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[M]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-[P2]-[P1]-/CG2;
    CG1/-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P1]-([P2])n-[P1])-/CG2;
    -[P1]-[P2]-[P1]-; 또는
    -([P1]-([P2])n-[P1])-
    여기서:
    CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
    [P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [M]은 적어도 하나의 선택 마커 및/또는 검출가능한 마커를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이고;
    n은 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임.
  60. 하기 설명에 상응하는 토폴로지를 갖는 플라스미드를 포함하는 발현 세포:
    CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-[P1]-/CG2;
    CG1/-([P2]-[SSRS]-[P3]-[P2])n-/CG2;
    CG1/-[P1]-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-[P1]-/CG2; 또는
    CG1/-([P2]-[P3]-[SSRS]-[P2])n-/CG2
    여기서:
    CG1 및 CG2는 삽입된 플라스미드에 플랭킹하는 모 세포 게놈 서열이고;
    [P1]은 모 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [P2]는 랜딩 패드 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [P3]은 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열이고;
    [SSRS]는 부위-특이적 재조합 부위 (SSRS)이고;
    n은 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임.
  61. 제3항 내지 제60항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포주.
  62. 제61항의 세포 또는 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 세포 및 그의 사용 지침을 포함하는 키트.
  63. 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 세포로서, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열인 단리된 세포.
  64. 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 CHO 세포 내로 도입하는 단계 및 핵산이 CHO 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 CHO 세포를 수득하는 단계를 포함하는 방법으로서, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열인 방법.
  65. 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함하는 방법으로서, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 핵산은 CHO 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합되고, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열인 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열식별번호: 20 내의 뉴클레오티드 하위서열이 서열식별번호: 21에 제시된 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 서열식별번호: 116 내의 뉴클레오티드 하위서열이 서열식별번호: 117에 제시된 서열을 포함하는 것인 단리된 세포 또는 방법.
  67. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열식별번호: 20 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열이 서열식별번호: 21에 제시된 서열로 이루어지거나; 또는 (ii) 서열식별번호: 116 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열이 서열식별번호: 117에 제시된 서열로 이루어지는 것인 단리된 세포 또는 방법.
  68. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열식별번호: 20 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열이 서열식별번호: 21에 제시된 서열에 대해 상류의 (서열식별번호: 20의 5' 말단 방향) 하위서열이거나; 또는 (ii) 서열식별번호: 116 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열이 서열식별번호: 117에 제시된 서열에 대해 상류의 (서열식별번호: 116의 5' 말단 방향) 하위서열인 단리된 세포 또는 방법.
  69. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열식별번호: 20 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열이 서열식별번호: 21에 제시된 서열에 대해 하류의 (서열식별번호: 20의 3' 말단 방향) 하위서열이거나, 또는 (ii) 서열식별번호: 116 내로부터의 뉴클레오티드 하위서열이 서열식별번호: 117에 제시된 서열에 대해 하류의 (서열식별번호: 116의 3' 말단 방향) 하위서열인 단리된 세포 또는 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 적어도 2개의 발현 플라스미드를 포함하는 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  71. 제70항에 있어서, 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 2개의 발현 플라스미드가 헤드-투-헤드, 테일-투-테일, 테일-투-헤드, 및 헤드-투-테일로 이루어진 군으로부터 선택된 구성으로 존재하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 각각의 발현 플라스미드가 적어도 관심 유전자 (GOI)를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  73. 제72항에 있어서, 모든 GOI가 동일한 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  74. 제72항에 있어서, 모든 GOI가 상이한 것인 방법, 세포주, 키트, 또는 단리된 세포.
  75. 제72항에 있어서, 적어도 하나의 GOI가 나머지와 상이한 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 제1의 GOI가 항체의 중쇄 (HC)를 포함하고, 제2의 GOI가 항체의 경쇄 (LC)를 포함하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  77. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 발현 플라스미드가 바이시스트론인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  78. 제77항에 있어서, 바이시스트론 발현 플라스미드가 항체의 HC를 포함하는 제1의 GOI, 및 항체의 LC를 포함하는 제2의 GOI를 코딩하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  79. 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 랜딩 패드 플라스미드가 어드레싱가능한 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  80. 제70항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드가 2개의 Lox 부위를 포함하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  81. 제80항에 있어서, Lox 부위가 Lox P 및 Lox 511인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  82. 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드가 Lox 부위 및 Frt 부위를 포함하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  83. 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드가 1개 또는 2개의 aat 부위를 포함하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  84. 제70항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 랜딩 패드 플라스미드가 어드레싱가능한 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  85. 제84항에 있어서, 각각의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드가 랜딩 패드에 독특한 어드레싱가능한 SSRS 쌍을 포함하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  86. 제85항에 있어서, 어드레싱가능한 SSRS 중 적어도 한 쌍이 Lox 부위 쌍인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  87. 제86항에 있어서, Lox 부위 중 적어도 한 쌍이 Lox 511과 Lox P인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  88. 제86항에 있어서, Lox 부위 중 적어도 한 쌍이 Lox m3과 Lox m7인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  89. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, Lox 부위의 Lox 511과 Lox P 쌍을 포함하는 제1의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드, 및 Lox 부위의 Lox m3과 Lox m7 쌍을 포함하는 제2의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드를 포함하는 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  90. 제84항에 있어서, 각각의 어드레싱가능한 랜딩 패드 플라스미드가 상호 호환불가능한 att 부위를 포함하는 것인 방법, 세포, 세포주 또는 키트.
  91. 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI), 선택 마커, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포로서, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 또는 그의 오르토로고스 서열 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열인 세포.
  92. 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI), 선택 마커, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포로서, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117 또는 그의 오르토로고스 서열 내의 뉴클레오티드 위치 또는 폴리뉴클레오티드 하위서열인 세포.
  93. 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI), 선택 마커, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포로서, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 116 또는 그의 오르토로고스 서열과 중첩되거나 이를 포괄하는 폴리뉴클레오티드 하위서열인 세포.
  94. 세포 게놈의 특이적 유전자좌에 통합된 관심 유전자 (GOI), 선택 마커, 검출가능한 마커, 또는 그의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포로서, 여기서 유전자좌는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 117 또는 그의 오르토로고스 서열과 중첩되거나 이를 포괄하는 폴리뉴클레오티드 하위서열인 세포.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, CHO 세포인 세포.
  96. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 오르토로고스 서열이 서열식별번호: 20, 21, 116, 117 또는 그의 하위서열과 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 것인 세포.
  97. 제98항에 있어서, 서열 동일성이 니들만-운슈 알고리즘의 구현을 사용하여 쌍별 정렬을 통해 결정되는 것인 세포.
  98. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 랜딩 패드 플라스미드 또는 2개의 발현 플라스미드를 포함하는 세포.
  99. 제91항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 초과의 랜딩 패드 플라스미드 또는 2개 초과의 발현 플라스미드를 포함하는 세포.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 2개의 랜딩 패드 플라스미드가 어드레싱가능한 것인 세포.
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