FI86194C - Foerfarandena foer framstaellning av polypeptidhomologer av tumoernekrosisfaktorer med stor utbyte. - Google Patents

Description

86194

MENETELMÄT KASVAINNEKROOSITEKIJOIDEN POLYPEPTIDIHOMOLOGIEN VALMISTAMISEKSI SUURELLA SAANNOLLA

KEKSINNÖN TEKNINEN TOIMINTA-ALA

Kyseessä oleva keksintö koskee yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka koodittavat kasvainnekroositekijöitä (TNF) sekä yhdisteitä, joilla on lisääntynyt sytotoksinen tai sytostaattinen aktiivisuus transformoitujen solujen suhteen. Kyseessä oleva keksintö koskee lähemmin menetelmää kasvainnekroositekijän kaltaisten polypeptidien valmistamiseksi suurina saantoina prokaryoottisissä isännissä. Aivan erityisesti kyseessä oleva keksintö koskee TNF:n kaltaisten polypeptidien valmistamista prokaryoottisilla isännillä, jotka on transformoitu yhdis-telmä-DNA-molekyyleillä, jotka käsittävät näitä polypeptidejä koodattavia DNA-sekvenssejä, jotka ovat kytketyt jompaan kumpaan ekspressiota kontrolloivista sekvensseistä, T4 tai pL-T4, sekä hoitomenetelmiä ja koostumuksia, joille ovat nuo TNF:n kaltaiset polypeptidit ominaisia. Nämä menetelmät ja vaikuttavat aineet ovat käyttökelpoisia monissa kasvaimen-vastaisissa, syövänvastaisissa ja malarianvastaisissa sovellutuksissa sekä niiden hoidossa. Ne ovat myös käyttökelpoisia syövän ja kasvaimen hoidossa interferoneihin, esim.

: · : IFN-(\:aan, IFN-/^:aan ja IFN-/laan yhdistettyinä, yhdessä ·;··· kemoterapian kanssa sekä yhdistettyinä antibiootteihin, kuten j .'. esimerkiksi aktinomysiiniin D.

TUTKIMUKSEN TAUSTA

[" Makrofaagit ja mononukleaariset fagosyytit valmistavat * TNF:a. Se on sytotoksinen tai sytostaattinen eläinperäisten : · : ja humaanisyöpäsolujen laajaa aluetta kohtaan in vitro, ja se saa aikaan verenvuotokuolion tietyissä eläinkasvaimissa ja 2 86194 heterotransplantoiduissa huroaanikasvaimissa in vivo [K. Haranaka ja N. Satoni, "Note: Cytotoxic Activity of Tumor Necrosis Factor (TNF) on Human Cancer Cells in vitro". Japan J. Exp. Med., 51, ss. 191-94 (1981); L. Old, “Cancer Immunology: The Search for Specificity - G.H.A - Clowes Memorial Lecture", Cancer Research. 41, ss. 361-75 (1981)].

Yhdisteet, joilla on TNF-aktiivisuutta, on saatu hiirien ja rottien seerumeista, jotka eläimet on infektoitu Bacillus-Calmette-Guerinilla (BCG) tai Corvnebacterjumilla sekä käsitelty Escherichia colin lipopolysakkaridilla (LPS) [E.A. Carswell et ai., “An Endotoxin-Induced Serum Factor that causes Necrosis of Tumors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72, ss. 3666-70 (1975)]. Ne ovat myös olleet peräisin makrofaa-gien suhteen rikastettujen, hiiren vatsakalvon tulehdussolujen elatusaineesta, kun kyseessä olevat hiiret on infektoitu BCG:1lä, sekä makrofaagien kaltaisista kasvainsoluista (PU5-1.8) sekä esikäsiteltyjen hiirien vatsakalvon makrofaa-geista, joita on lisätty in vitro makrofaagien kasvutekijän kanssa ja stimuloitu LPS-.llä [0. Mannel, R. Moore ja S. Mergenhagen, "Macrofages as a Source of Tumoricidal Activity (Tumor Necrotizing Factor)", Infect. Immun.. 30, ss. 523-30 (1980)].

Edelleen, kun eristetään ihmisen monosyyttejä, jotka ovat makrofaagien prekursoreita, esimerkiksi terveiden humaani luovuttajien verestä, ja joita stimuloidaan lymfokiineilla ja/tai LPSillä, ne valmistavat kemiallisia aineita, joilla on sytotoksisia ja sytostaattisia vaikutuksia hiiren kohdesolui-hin ja ihmisen transformoituihin soluihin.[N. Metthews, "Production of an Anti-tumor Cytotoxin by Human Monosytes: Comparison of Endotoxin, Interferons and Other Agents as Inducers", Br. J. Cancer. 45, ss. 615-17 (1982); J. Hammer-str0m, "Soluble Cytostatic Factor(s) Released from Human Monocytes: I. Production and Effect on Normal and Transformed Target Cells", Scand. J. Immunol. 15, ss. 311-18 (1982)]. Sen mukaisesti, koska monosyyteistä peräisin olevat solut valmistavat TNF.a (sopivan käsittelyn jälkeen), ainetta nimitetään 3 86194 joskus "monosyyttisytotoksiiniksi" D. S. Stone-Wolf et ai., "Interrelatiionships of Human Interferon-Gamma with Lymfo-toxin and HumanCytotoxin", J. Exp. Med., 159, ss. 820-43 (1984) .

o(i ~ °^2 -globuliinien, jotka ovat peräisin normaalien ihmisten seerumista, jakeen on myös osoitettu olevan toksisen kasvaimia kohtaan hiiressä ja inhiboivan ihmisen paksusuolen syöpää, melanomaa sekä neuroblastooma-solpolvia Yhdysvaltain patentti 4,309,418? S. Green et ai., Cancer Letters, 6, ss.

235-40 (1979); J. Cell. Biol. 79, s. 67 (1978) .

Kuitenkin, tällä hetkellä on eläin- ja ihmisperäisiä TNF:iä valmistettu vain erittäin pieniä määriä. Eläinperäisten TNF:ien valmistaminen tekee välttämättömäksi esikäsiteltyjen hiirien ja kaniinien suuren määrän tappamisen sekä niiden seerumin puhdistamisen TNF:ien saamiseksi tai niiden makro- faagien keräämisen, solujen stimuloinnin in vitro sekä muodostuneiden TNF:ien takaisinsaannin ja puhdistuksen super- natantista. Solujen kokoaminen humaani luovuttajilta in vitro ·** suoritettavaa inkubointia varten, TNF:ien valmistamiseksi, • · · :*.· sekä humaani luovuttajilta saadun seerumin 0(-globuliini- • · .... jakeen puhdistaminen kasvaimenvastaisten aineiden takaisin- . . saamiseksi eivät sen lisäksi ole käyttökelpoisia suuressa • · mittakaavassa. Lisäksi kaikki nämä menetelmät ovat aikaa vieviä, kalliita, ja ne antavat hyvin pienet saannot TNF:a.

• I

KEKSINNÖN TIEDOKSI TULO

• ·· Kyseessä oleva keksintö ratkaisee ongelmat, joihin yllä ;Y viitataan antamalla käyttöön menetelmän kaupallisesti merkit- tävien määrien valmistamiseksi TNF:n kaltaisia yhdisteitä • · [ sekä riittävän puhtaita TNF:iä käytettäviksi syövän- ja “·· kasvaimenvastaisissa koostumuksissa, menetelmissä ja hoidois- :*·. sa. Sen mukaisesti, kyseessä oleva menetelmä antaa käyttöön ·;·· TNF:ien ja TNF:n kaltaisten polypeptidien valmistuksen, määrinä ja menetelmin, jotka eivät tähän mennessä ole olleet 4 86194 saatavilla, syövän- ja kasvairaenvastaisissa koostumuksissa ja menetelmissä käytettäviksi.

Kyseessä olevan keksinnön muihin kohteisiin kuuluvat TNF:n kaltaisia polypeptidejä koodattavien DNA-sekvenssien identifiointi ja paikantaminen, erilaisten isäntien transformointi näillä DNA-sekvenseillä, jotka ovat kytketyt ekspression kontrollisekvenssiin, joka on valittu T4:n ja pL-T4:n muodostamasta ryhmästä, sekä TNF- tai TNF:n kaltaisten polypeptidi-en valmistaminen noissa transformoiduissa isännissä. Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti valmistettujen TNF:n kaltaisten polypeptidien ja TNF:ien joukossa ovat nisäkkäiden TNF:t, kuten esimerkiksi kaniinin, hiiren ja ihmisen TNF:t.

Kuten jäljempänä seraavasta julkaisusta on täysin ymmärrettävissä, kyseessä olevan keksinnön toisena kohteena TNF:n puhdistaminen luonnon lähteistä. Heti kun alkuperäinen TNF on puhdistettu, sen aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja DNA-koettimet voidaan syntetisoida tämän aminohapposekvenssin perusteella. Näitä DNA-koettimia voidaan sitten käyttää seulottaessa DNA-sekvenssien kokoelmia, jotka ovat peräisin erilaisista luonnon lähteistä ja synteettisistä lähteistä, TNF:ään kytkeytyvien DNA-sekvenssien valitsemiseksi myöhempää TNF:ien ja TNF:n kaltaisten yhdisteiden ekspressiota varten kyseessä olevan keksinnön menetelmien mukaisesti.

Tämä puhdistettu TNF on käyttökelpoinen myös eräässä toisessa kyseessä olevan keksinnön mukaisessa näkökohdassa, kasvain-solujen kasvun estämisen lisäämisessä tai kasvainsolujen tappamisessa, käyttämällä luonnosta saatujen tai yhdistelmä-TNF-.ien sekä antibiottien, kuten esimerkiksi aktinomysiini D:n yhdistelmiä. Tämän menetelmän mukaisesti kasvaimia kantavia eläimiä käsitellään farmaseuttisesti tehokkailla määrillä TNF:a sekä aktinomysiini D:ä TNF:ien vaikutuksen lisäämiseksi kasvainsoluja kohtaan.

Kuten on täysin ymmärrettävissä myöhemmin seuraavasta julkaisusta, kyseessä olevan keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNA- 5 86194 molekyylit, jotka käsittävät DNA-sekvenssejä, jotka ovat kytketyt joko T4-ekspression tai pL-T4-ekspression kontrolli-sekvenssiin, pystyvät sopivassa isännässä ohjaamaan TNF:ien tai TNF:n kaltaisten polypeptidien valmistusta. Näiden yhdis-telmä-DNA-molekyylien replikaatio sopivissa isännissä sallii näitä polypeptidejä koodittavien geenien valmistamisen suurina määrinä. Näiden polypeptidien ja geenien molekyyli-rakenne sekä ominaisuudet saattavat olla täten helposti määritettävissä. Polypeptidit ja geenit ovat käyttökelpoisia, joko sopivassa isännässä valmistettuina, sopivan johdannaisen tai muunnoksen muodostamisen jälkeen, koostumuksissa tai menetelmissä näiden tuotteiden itsensä havaitsemista tai niiden valmistamisen parantamista varten sekä syövänvastai-sissa, kasvaimenvastaisissa ja roalarianvastaisissa koostumuksissa ja menetelmissä suoritettavaa käyttöä varten.

Edellä esitetyn perusteella on täysin ymmärrettävää, että kyseessä olevan keksinnön perusnäkökohtana on toimittaa yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka käsittää DNA-?ekvenssin, jolle on ominaista, että se koodittaa TNF:a tai TNF:n kaltaista polypeptidiä, tai joka ainakin sallii DNA-sekvenssien kokoelmasta valittavan sellaiset DNA-sekvenssit jotka ovat kytketyt ekspression kontrollisekvenssiin. DNA-sekvenssit valitaan ryhmästä, johon kuuluvat (a) p-mTNF-3:n DNA-insertit; (b) p-hTNF-1:n insertit; (c) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat yhteen tai molempiin DNA-inserteistä (a) ja (b) ja jotka koodattavat TNF:n kaltaisten polypeptidien ekspressiota; ja (d) DNA-sekvenssit, jotka koodattavat polypeptidin ekspressiota, jonka ekspressiota koodittaa mikä tahansa edellä mainituista DNA-inserteistä ja sekvensseistä .

Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti DNA-sekvenssit ovat toiminnallisesti kytketyt T4:n tai pL-T4:n ekspression e 86194 kontrollijärjestelmään .

Kyseessä olevan keksinnön mukaisia yhdistelmä-DNA-molekyylejä luonnehditaan edelleen siten, että ne sallivat TNF:n polypep-tidihomologien valmistamisen vaatimuksissa tarkemmin kuvatulla tavalla suurina saantoina sopivissa isännissä, jotka on niillä transformoitu.

PIIRROKSIA KOSKEVA LYHYT KUVAUS

Kuva 1 esittää ihmisen (A) ja hiiren (B) mRNA-valmisteiden kahden tyypillisen sakkaroosigradientin OD-sivukuvaa. Ensimmäisessä gradientissa käytettiin 750 ug humaani poly A+ mRNA:a. Toisessa gradientissa käytettiin 200 ug hiiren poly A+ RNA:a. Kunkin jakeen biologinen aktiivisuus määritettiin Xenopus laeviksen oosyyteissä.

Kuva 2 esittää kaaviomaisesti kyseessä olevan keksinnön mukaisen menetelmän erästä suoritusmuotoa TNF:n kaltaisten polypeptidien puhdistamiseksi indusoidun kaniinin seerumista.

***; Kuva 3 esittää indusoidun kaniinin seerumista, kyseessä ole- van keksinnön puhdistusmenetelmän erään suoritusmuodon mukai-sesti puhdistetun kaniinin TNF:n SDS-PAGE (12% )-analyysiä .

• * • ·

Kuvat 4 ja 5 esittävät kyseessä olevan keksinnön mukaisilla • · » **'. menetelmillä puhdistetun, kaniinin TNF:n kahden osan — TNF- » · » fragmentin 3 ja 4 — aminohapposekvenssiä. Kuvat 4 ja 5 kuvaavat erilaisia nukleotidisekvenssejä, jotka koodittavat ' noita aminohapposekvenssiosia, sekä noista DNA-sekvensseistä * syntetisoituja erilaisten DNA-koettimien nukleotidisekvens- .·. : sejä.

• · · . Kuva 6 esittää hiiren TNF-RNA:n yleistä rakennetta ja klooni- ’. *: en p-mTNF-1, p-mTNF-2 sekä p-mTNF-3 cDNA:n asemaa. Kuva 6 "·** kuvaa myös näiden kolmen kloonin osittaista restriktiokart- taa. Lopuksi kuva 6 kuvaa p-mTNF-1:n kahta sisäistä restrik-tiofragmenttia sai sekä PvuII, joita käytettiin erilaisten 7 86194 DNA-kirjastojen myöhempään hybridisaatioseulontaan.

Kuva 7 esittää hiiren TNF eDNAm nukleotidisekv/enssiä sekä siitä johdettua aminohapposekvenssiä.

Kuva 8 esittää humaani TNF RNA:n yleistä rakennetta sekä kloonin p-hTNF-1:n cDNA:n asemaa. Kuva 8 esittää myös tuon kloonin osittaista restriktiokarttaa.

Kuva 9 esittää p-hTNF-1:n cDNA-insertin nukleotidisekvenssiä sekä siitä johdettua aminohapposekvenssiä.

Kuva 10 esittää kaaviomaisesti kyseessä olevan keksinnön mukaisen menetelmän erään suoritusmuodon TNF:n kaltaisten polypeptidien puhdistamiseksi indusoitujen humaani U-937-solujen elatusaineesta.

Kuva 11 esittää N-terminaalista aminohapposekvenssiä, joka on määritetty sekventoimalla kyseesä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä puhdistetun humaani TNF:n näyte.

Kuva 12 esittää kaaviomaisesti menetelmän erästä toista suoritusmuotoa muiden yhdistelmä-ekspressiovektoreiden konstruoimiseksi, joille on ominaista DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani TNF:n ekspressiota.

Kuva 13 esittää yhdistelmä-ekspressiovektoria 153-pL-T4-hTNF-CA3(13), jolle on ominaista DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani TNF:n ekspressiota.

Kuva 14 esittää yhdistelmä-eksperssiovektoria 153-T4-hTNF-CA5-T4ter, jolla on ominaista DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani TNF:n ekspressiota.

Kuva 15 esittää (A) plasmidin pL-pTAK-21 -CLA valmistusta plasmideista p236 ja pTAK 21Δ[K. Gorski et ai., Cell (1985) (painossa)]; (B) hTNF (G)n-johdannaisten konstruktiota; ja (C) T4-ter- ja pL-johdannaisten konstruktiota.

8 86194

Kuva 16 esittää DNA-sekvenssiä ja plasmidin 153-T4-hTNF-CA5-T4-ter johdettua aminohapposekvenssiä, DRAI AATTC EcoRI-kohdasta EcoRI-kohtaan. joka on paikannettu T4-ter hTNF-geenin päähän.

Kuva 17 esittää DNA-sekvenssiä ja plasmidin 153-pL-T4-CA3-cts-T4-ter johdettua aminohapposekvenssiä, Pstl-kohdasta EcoRI-kohtaan.

Kuvat 18-19 esittävät graafisesti aktinomysiini D:n ja TNF:n yhdistelmän vaikutusta kasvaimen kasvuun.

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Jotta keksintö voitaisiin ymmärtää täydellisesti, esitetään seuraava yksityiskohtainen kuvaus.

Kuvauksessa käytetään seuraavia termejä:

Nukleotidi -- DNA:n tai RNA:n monomeerinen yksikkö, joka sisältää sokeriosan (pentooosin), fosfaatin sekä typpeä sisältävän heterosyklisen emäksen. Emäs on glykosidisen hiilen (pentoosin 1'-hiili) välityksellä kytketty sokeri-osaan. Tätä emäksen ja sokerin yhdistelmää nimitetään mykleo-sidiksi. Kutakin nukleotidia luonnehtii sen emäs. Neljä DNA-emästä ovat adeniini ("A"), guaniini ("G"), sytosiini ("C") sekä tyrniini ("T"). Neljä RNA-emästä ovat A, G, C sekä urasiili ("U").

DNA-3ekvenssi — Vierekkäisten pentoosien 3'- ja 5'- hiilien välisten fosfodiesterisidosten toisiinsa kytkemien nukleotidien lineaarinen järjestys.

Kodoni — Kolmen nukleotidin DNA-sekvenssi (tripletti), joka koodittaa mRNA:n välityksellä aminohappoa, translaation aloitussignaalia tai translaation päätössignaalia.

9 86194

Geeni — DNA-sekvenssi, joka koodittaa templaattinsa tai lähetti-RNA:n ("mRNA") välityksellä spesifisen polypeptidin luonteenomaista aminohapposekvenssiä.

Transkriptio — mRNA:n valmistustapahtuma geenistä.

Translaatio — mRNA:n valmistustapahtuma mRNA:sta.

Ekspressio — Tapahtuma, jonka DNA-sekvanssi tai geeni käy läpi polypeptidin valmistamiseksi. Se on transkription ja translaation yhdistelmä.

Plasmidi — Ei kromosomiperäinen, kaksiksäikeinen DNA-sek-venssi, joka sisältää koskemattoman "replikonin", joka on sellainen, että plasmidi replikoituu isäntäsolussa. Kun plasmidi sijoitetaan yksisoluiseen organismiin, tämän organismin ominaisuudet saattavat muuttua tai transformoitua plasmidin DNA:n tuloksena. Esimerkiksi plasmidi, joka kantaa geeniä tetrasykliiniresistenssiä (Tet*) varten, transformoi aiemmin tetrasykliinille herkän solun sellaiseksi, joka on .**· resistentti tetrasykliinille. Plasmidilla transformoitua • · · ··.· solua nimitetään "transformantiksi" .

• · • · · · . . Faagi tai bakteriofaagi — Bakteeriperäinen virus, jollai- |·· sesta moni käsittää DNA-sekvenssejä, jotka ovat kapseloidut proteiinikapselin tai kuoren sisälle ("kapsidi").

Kloonausvehikkeli — Plasmidi, faagi-DNA tai muu DNA-sekvens-si, joka voi replikoitua isäntäsolussa, jolle on tunnusomaista yksi tai useampia endonukleaasin tunnistuskohtia, joissa • ·· sellainen DNA-sekvenssi saatetaan leikata määritettävissä . .' olevalla tavalla DNA:n oleellisen biologisen toiminnan, esi merkiksi replikaation, kuoriproteiinien valmistumisen tai • » : · promoottorin katoamisen tai sitoutumiskohtien häviämättä ja joka sisältää markkerin, joka soveltuu käytettäväksi trans-;*· formoitujen solujen identifiointiin, esim. tetrasykliini- • < · * 10 861 94 resistenssin tai ampisilliniresistenssin. Kloonausvehikkeliä nimitetään usein vektoriksi.

Kloonaus -- Menetelmä organismin populaation saamiseksi tai DNA-sekvenssien saamiseksi, jotka ovat peräisin tällaisesta organismista tai sekvenssistä, suvuttoman lisääntymisen avulla .

Yhdistelroä-DNA-molekyyli eli hvbridi-DNA -- Molekyyli, joka käsittää eri sukusolujen perintötekijästöstä peräisin olevia DNA-segmenttejä, jotka on päistään liitetty yhteen ja jotka pystyvät infektoimaan jonkin isäntäsolun ja säilymään siellä.

Ekspression kontrollisekvenssi -- Nukleotidien sekvenssi, joka kontrolloi ja säätelee geenien ekspressiota, kun se on toiminnallisesti liitetty näihin geeneihin. Niihin sisältyvät lac-järjestelmä, trp-järjestelmä. tae-järjestelmä, tre-iär-jestelmä, X-faagin pääoperaattori- ja promoottorialueet, fd-kuoriproteiinin säätelyalue, SV40:n aikaiset ja myöhäiset promoottorit, promoottorit, jotka ovat peräisin polyooma-virukselta, adenovirukselta ja ihmisapinan virukselta, promoottori 3-fosfoglyseraattikinaasia tai muita glykolyyttisiä entsyymejä varten, hiivan happamen fosfataasin promoottorit, esim. Pho 5, hiivan -X-pariutumistekijoiden promoottorit ja .···. muut sekvenssit, joiden tiedetään säätelevän prokayoottisten tai eukaryoottisten solujen tai niiden virusten geenien ekspressiota, tai niiden yhdistelmät.

·1 Lymfokiini -- Liukoinen, nestevälittäjä, jonka esikäsitellyt lymfosyytit vapauttavat, kun ne ovat kosketuksissa spesifis-ten antigeenien kanssa. Lymfokiineihin kuuluvat esimerkiksi interferonit ja makrofaagien aktivointitekijät.

TNF (Kasvainkuoliotekijä) — TNF on kasvua inhiboiva tai sytotoksinen lymf okiini. Tässä hakemuksessa käytettynä *..1 "TNF" .ään sisältyvät kaikki proteiinit, polypeptidit ja pep- • 1 • · · »«· • · ·

II

« · 11 86194 tidit, jotka ovat luonnonmukaisia tai yhdistelmä-TNF:ia tai niiden johdannaisia ja joille on ominaista kasvainperäinen aktiivisuus tai näiden TNF:ien kasvaimien kasvun inhibitio. Niihin sisältyy TNF:n kaltaisia yhdisteitä, jotka ovat peräisin erilaisista lähteistä, kuten esimerkiksi luonnonmukaiset TNF:t, yhdistelmä TNF:t ja synteettiset tai puolisynteettiset TNF:t.

TNF:n kaltainen pplypeptidi -- Polypeptidi, jolla on TNF:n biologista aktiivisuutta. Siihen kuuluvat nisäkkäiden TNF:t kuten esimerkiksi kaniinin, hiiren ja ihmisen TNF:t ja TNF:n kaltaiset polypeptidit.

Kasvain -- Kyseessä olevassa hakemuksessa käytettynä termi "kasvain" käsittää solujen minkä tahansa ei toivotun jakaantumisen. Sellaiseen jakaantumiseen sisältyvät pahanlaatuiset ja ei pahanlaatuiset, kiinteät ja nestemäiset kasvaimet, syövät, sarkoomat, luuydinkasvaimet, leukemiat, imukudoskasvai-met ja muut syöpää aiheuttavat, kasvain- tai kasvaimia aiheuttavat sairaudet.

Aktinomvsiini -- Aktinomysiinit ovat antibioottien luokka, joiden uskotaan ehkäisevän DNA:n transkriptiota estämällä RNA-polymeraasien toiminta. Kyseessä olevassa hakemuksessa käytettynä "aktinomysiiniin" sisältyvät yleisesti aktino-mysiininä tunnettujen antibioottien perheen läheiset jäsenet ____: sekä niiden johdannaiset. Termi sisältää esimerkiksi aktino- . · mysiini D:n.

LPS — Endotoksiini, joka käsittää lipopolysakkaridin, joka on peräisin E. colin seinämistä (0,55:B5) (Difco, Detroit, Michigan).

BCG — Bacillus Calmette-Guerin (Pasteur Institut, Bryssel) 12 861 94

Kyseessä oleva keksintö koskee TNF:n kaltaisten polypeptidien ekspressiota suurina saantoina prokaryootti-isännissä. Kyseessä oleva keksintö koskee myös puhdistusmenetelmää, jolle ovat ominaisia vaiheet, joissa TNF:n kaltaista polypep-tidiä sisältävä koostumus on kosketuksissa anioninvaihtajän kanssa, koostumuksen komponenttien poistaminen, jotka jäävät jäljelle sitoutumatta vaihtajaan, ja TNF:n kaltaisen polypep-tidin eluointi vaihtajasta.

Yleisesti, pääpiirteittäin, TNF:n kaltaisten polypeptidien kyseessä olevan puhdistusmenetelmän suoritusmuoto käsittää vaiheet, joissa kootaan eläinten seerumia, mieluummin kaniineilta, joita on käsitelty erityisesti TNF:n valmistumisen indusoimiseksi; aktiivisten komponenttien saostaminen seerumissa emäksellä, mieluummin ammoniumsulfaatilla, esim. noin 60 öiseen kyllästykseen; saostuman uudelleen liettäminen neutraaliin, heikosti emäksiseen puskuriin, mieluummin Tris-HCl:iin, ja proteiinien fraktiointi ioninvaihtopylväs-kromatografiaa, mieluummin DEAE-Sephaceliä käyttämällä, käyttäen suolagradienttia; TNF-aktiivisuutta sisältävien, yhdistettyjen jakeiden konsentrointi, mieluummin Amicon TCF-2 laitteella; konsentraatin fraktiointi molekyylipainon perusteella geelisuodatuskromatografiapylväässä, mieluummin AcA34:ssä; TNF-aktiivisuutta sisältävien jakeiden yhdistämi-nen ja niiden käsittely ioninvaihtokromatografiällä, mieluum-min Mono Q-pylväillä (Pharmacia), ensin heikosti emäksisellä pH: 11a, sitten heikosti happamella pH-.lla. Tulisi tietenkin . . olla ymmärrettävää, että tätä puhdistusmenetelmää ja ”*.* erityisesti anionivaihtajän käyttöä saatetaan käyttää hyväksi TNF:n kaltaisten polypeptidien puhdistamiseen, jotka ovat peräisin monista erilaisista luonnonmukaisista lähteistä sekä erilaisista prokaryootti-isännistä, jotka on transformoitu :/·· näitä polypeptidejä koodattavilla DNA-sekvensseillä.

Kuvatun menetelmän tuloksena saatujen puhdistettujen TNF:ien aminohapposekvenssit voidaan sitten määrittää. Saatuja amino- '3 861 94 happosekvenssejä voidaan käyttää monin tavoin kyseessä olevan keksinnön mukaisesti. Niitä voidaan käyttää DNA-koettimien sarjojen valmistamiseen, jotka ovat käyttökelpoisia seulottaessa luonnonmukaisten ja synteettisten, nisäkkäiden DNA:iden erilaisia kokoelmia DNA-sekvenssien, jotka koodittavat TNF:n kaltaisia polypeptidejä sekä kyseessä olevan keksinnön mukaisia TNF:iä, läsnäolon suhteen. Esimerkiksi DNA-sekvenssiä, joka on peräisin kaniinin TNF:n aminohapposekvenssistä, saatetaan käyttää seulomaan DNA-kirjastoja muiden DNA-sekvenssien suhteen, jotka koodittavat kaniinin tai muiden nisäkkäiden TNF:n kaltaisia polypeptidejä. Edelleen, sellaista DNA-sekvenssiä, tai mieluummin kaniinin tai hiiren DNA-sekvenssejä, jotka on sen avulla valittu, saatetaan käyttää seulottaessa DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat humaani TNF:n kaltaisia polypeptidejä, kaniinin, hiiren ja humaanin TNF:ien välisten, odotettujen homologioiden perusteella.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisia yhdistelmä-DNA-molekyylejä käytetään TNF:n kaltaisten polypeptidien valmistamiseksi näillä molekyyleillä transformoiduissa, erilaissa prokaryoot-ti-isännissä tapahtuvan ekspression avulla. Näitä TNF:n kaltaisia polypeptidejä saatetaan käyttää syövän ja kasvaimen vastaisissa sovellutuksissa sekä syövän ja kasvaimen hoidossa. Yleisesti, pääpiirteittäin, kyseessä olevan keksinnön tämä suoritusmuoto käsittää vaiheet, joissa viljellään sopi-vaa isäntää, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA-molekyylil-,...· lä, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa haluttua . . TNF:n kaltaista polypeptidiä, sekvenssin ollessa toiminnalli sesti kytketty yhdistelmä-DNA-molekyylissä joko ekspression kontrollisekvenssiin T4 tai ekspression kontrollisekvenssiin pL-T4. Jälleen, kaniinin TNF.n tai muiden nisäkäs-TNF:ien sekä humaani-TNF:n odotettujen samankaltaisuuksien vuoksi mikä tahansa niistä saattaa olla yhdenmukaisesti kyseessä i olevan keksinnön kanssa käyttökelpoinen hoidettaessa syöpiä, kasvaimia ja malariainfektioita ihmisillä.

86194

Lisäksi, puhdistettua TNF:a, joka on peräisin luonnonmukaisista tai yhdistelmälähteistä, voidaan käyttää kyseessä olevan keksinnön mukaisissa yhdistelmissä, kuten esimerkiksi TNF:n ja aktinomysiini D:n yhdistelmänä. Erityisemmin, kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, niitä voidaan käyttää, farmakologisesti tehokkaina määrinä yhdistelmissä farmaseuttisesti tehokkaiden määrien kanssa aktinomysiini D:ä, kasvaimien hoitoon.

Kasvaimien tavanomaiseen hoitoon kuuluvat ei kirurgiset hoidot, kuten esimerkiksi kemoterapia ja säteily, sekä kirurgiset hoidot. Tyypillisesti näille hoidoille ovat erilaiset ei toivotut sivuvaikutukset ominaisia. Ei kirurgiset hoidot, joilla on immunosupressiovaikutuksia, saattavat lisätä potilaiden herkkyyttä sekundaarisille infektioille. Kirurgisiin toimenpiteisiin transformoitujen solujen poistamiseksi sisältyy vaaroja, jotka liittyvät taudin leviämistapahtumiin eivätkä ne saata tehokkaasti poistaa tai eliminoida koko transformoitua solupopulaatiota. Syöpien ja ei pahanlaatuisten kasvaimien vaihtoehtoisiin hoitomenetelmiin on kytkeytynyt transformoitujen solujen pinnalla sijaitsevien, kasvain-spesifisten antigeenien monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö. Sellaisten hoitojen tehokkuutta, hoitojen käsittäessä luonteenomaisesti hiiren monoklonaalisia vasta-aineita, rajoittavat usein erilaiset tekijät, mukaanluettuina anti-vasta-ainevasteet, jotka ehkäisevät hiiren vasta-aineiden — lisäannostelujen tehokkuutta. [G.E.Goodman et ai., "Pilot ; Trial of Murine Monoclonal Antibodies In Patients With

Advanced MelanomaK", Journal of Clinical Oncology. 3, ss. 340-51 (1985)]. Muihin ilmoitettuihin monoklonaalisilla ‘ vasta-aineilla suoritettujen käsittelyjen sivuvaikutuksiin kuuluvat herkistyminen, kuume ja vilunväristykset. 1 I;

Sellaisten hoitojen haittojen vuoksi on erilaisia hoitoja suunnattu kehon immuunivasteen lisäämiseen kasvainsoluja kohtaan lisäämällä erilaisten lymfokiinien tasoja kehossa.

15 861 94

Esimerkiksi, TNF:n yksinään tiedetään inhiboivan kasvainsolu-jen kasvua tai kuolemista. Lisäksi, ihmisen lymfotoksiinin ja ihmisen gamma-interferonin yhdistelmien on ilmoitettu inhiboivan kasvaimen kasvua [Eurooppalainen patenttihakemus 128,009]. TNF:n ja ihmisten interferonin yhdistelmien on myös ilmoitettu havainnollistavan suurempaa kasvua estävää tai sy-totoksista vaikutusta humaanikasvaimien suhteen kuin niiden erillisten vaikutusten summan [L. Fransen et ai., "Recombinant Tumor Necrosis Factor: Its Effect And Its Synergism With Interferon- On Variety Of Normal And Transformed Human And Mouse Cell Lines", Eur. J. of Cancer and Clinical Oncology. (painossa); katso myös Eurooppalainen patenttihakemus 131,789]. Lopuksi, aktinomysiini D:n ja TNF:n yhdistelmien on esitetty havainnollistavan kasvainsolujen kasvun inhibitiota in vitro [J. M. Ostrone ja G. E. Gifford, "Stimulation Of RNA Synthesis In L-929 Cells By Rabbit Tumor Necrosis Factor (40449)", Proc. Soc. Exp. Biol. Med.. 160, ss. 354-58 (1978); M. R. Ruff ja G. E. Gifford, "Rabbit Tumor Necrosis Factor: Mechanism Of Action", Infection and Immunity. 31, ss. 380-85 (1985)].

Kyseessä olevan keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNÄ-molekyyleillä valmistamiseksi TNF:n kaltaisten polypeptidien valmistusta, valittiin ensimmäiset, kyseessä olevan keksinnön mukaista TNF:a koskevat DNA-sekvenssit käyttämällä DNA-koet-timia, jotka käsittivät sarjan synteettisiä DNA-fragmentteja, jotka oli valmistettu kyseessä olevan keksinnön mukaisilla • menetelmillä puhdistetun kaniinin TNF:n osittaisten aminohap- | : : posekvenssien perusteella. Tulisi olla ymmärrettävää, että monet kloonaus- ja valintatekniikat ovat saattaneet teoreettisesti olla käyttökelpoisia paikannettaessa ja identifioita-.1. r essa kyseessä olevan keksinnön mukaisia DNA-sekvenssejä, jot- ka koodittavat kyseessä olevan keksinnön mukaista TNF:a ja TNF:n kaltaisia polypeptidejä. Kyseessä olevassa keksinnössä valittuja DNA-sekvenssejä käytettiin sitten koettimina valit-semaan muita kaniinin tai nisäkkään DNA-sekvensse jä, jotka 16 86194 koodattavat TNF.-n kaltaisia polypeptidejä, sekä transformoimaan sopivia prokaryootti-isäntiä näiden DNA-sekvenssien koo-dittamien, TNF.-n kaltaisten polypeptidien valmistamiseksi. Edelleen, DNA-sekvenssejä, jotka oli valittu kyseessä olevan keksinnön mukaisilla kaniinin DNA-koettimilla, käytettiin sinänsä myös valitsemaan DNA:itä, jotka koodattavat nisäkkään TNF:ia ja TNFrien kaltaisia polypeptidejä, ja näitä viimeksi mainittuja DNA-sekvenssejä käytettiin näiden polypeptidien valmistamiseen sopivissa prokaryootti-isännissä.

Kyseessä olevan keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit olisi voitu ilmentää käyttämällä monia erilaisia isäntä/vektori-yhdistel-miä. Esimerkiksi käyttökelpoiset vektorit olisivat voineet koostua kromosomiperäisistä, ei kromosomiperäisistä sekä synteettisten DNA-sekvenssien osista, kuten esimerkiksi tunnettujen bakteeriperäisten plasmidien erilaisista tunnetuista johdannaisista, esimerkiksi E. colista saaduista plasmideis-ta, colEl, pCRl, pBR322, pMB9 sekä niiden johdannaiset mukaan luettuina, laajemman isäntäalueen käsittävistä plasmideista, esim. RP4, faagi-DNA:isistä, esim. faagirn monista johdannaisista, esim. NM 989; ja muista DNA-faageista, esim M13 ja Filameneous yksisäikeisistä DNA-faageista, sekä vektoreista, jotka ovat peräisin plasmidien ja faagi-DNA:iden yhdistelmistä, kuten esimerkiksi plasmideista, jotka on muunnettu faagi-···' DNA: n tai sen muiden johdannaisten hyväksi käyttämiseksi.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisiin DNA-molekyyleihin sisäl-: tyy tietty ilmentymistä säätelevä sekvenssi, joka on valittu . ryhmästä, johon kuuluvat pL-T4 sekä T4. Ilmentymistä kontrol- :V; loivan sekvenssin T4 yksinään havaittiin olevan erityisen käyttökelpoisen kyseessä olevan keksinnön mukaisissa yhdis-.·. ; telmä-DNA-molekyyleissä. Esimerkiksi saatetaan saada erityi- ...* sen tehokas TNF: n kaltaisten polypeptidien ilmentyminen käyt tämällä, ilmentymisjärjestelmän osana, plasmidia, joka käsit- tää DNA-sekvenssin, joka on peräisin bakteriofaagi T4:stä, : joka sisältää sekä promoottorin että ribosomia sisältävän i7 861 94 kohdan. Tämä sekvenssi on faagi T4 proteiini 32:a (gp32) vastaavan geenin deleetiojohdannainen H. M. Krisch ja B. Allet, "Nucleotide Sequences Involved In Bacteriophage T4 gene 32: Translational Self-Regulation", Proc. Natl. Acad. Sci., 79, ss. 4973-41 (1982) .

Uskotaan, että ainakin yksi syy, miksi T4 DNA-sekvenssin fragmentti kyseessä olevassa keksinnössä käytettynä on niin tehokas, on se, että kyseisessä fragmentissa on kolme tai neljä vierekkäistä segmenttiä, joista kukin saattaa toimia promoottorina (se on, aloittaa mRNA:n transkription), peräkkäin ja että nämä promoottorit saattavat erottaa useita RNA-polymeraasimolekyylejä, aloittaen useampia RNA:ita kuin yksi ainoa promoottori aloittaisi. Lopuksi, havaittiin, että mRNA, joka alkaa T4 DNA-sekvenssissä, on epätavallisen kestävä E. colissa. katso K. Gorski et ai. Cell (1985) (painossa) .

Kyseessä oleva keksintö koskee yhdistelmä-DNA-molekyyliä, joka käsittää seuraavan ilmentymistä kontrolloivan sekvenssin:

CGATGGTAAAGTATTTCAACTC AGGTTGGATACCTCTCGAAGACCCAGAG TATTGCGAATTATGCCAGCTATGAGGTAAAGTGTCATAGC ACCAACTGTTA : V ATTAAATTAAATTAAAAAGGAAATXATG

' '’f .

. jossa X on poissa (missä tapauksessa neljää viimeistä emästä • ^ voidaan merkitä ATATG:llä) tai X on 1 - 15 emäksen muodostama • * ryhmä. Mieluummin X valitaan ryhmästä, johon kuuluvat CGATACT, CGCGATACT, ATACTAAA, ATACT, CGCGATACTAAA ja CG ATACTAAA.

• ·

Ilmentymistä kontrolloiva sekvenssi, josta X puuttuu saatetaan esittää myös seuraavasti: / f* * 4·* ^ » · · ie 86194 CGATGGTAAAGTATTTCAACTCAGGTTGGATACCTCTCGAAG ACCCAGAGTATTGCGAATTATGCCAGCTATGAGGTAAAGTGTCATAGCACCA ACTGTTAATTAAATTAAATTAAAAAGGAAATATG.

Edulliset ilmentymistä kontrolloivat sekvenssit saatetaan esittää myös seuraavasti: CGATGGTAAAGTATTTCAACTCAGGTTGGATACCTCTCGAAG ACCCAGAGTATTGCGAATTATGCCAGCTATGAGGTAAAGTGTCATAGCACCA ACTGTTAATTAAATTAAATTAAAAAGGAAATCGATACTATG ;

CGATGGTAAAGTATTTCAACTCAGGTTGGATACCTCTCGAAG

ACCCAGAGTATTGCGAATTATGCCAGCTATGAGGTAAÄGTGTCATAGCACCA

ACTGTTAATTAAATTAAATTAAAAAGGAAATCGCGATACTATG; CGATGGTAAAGTATTTCAACTCAGGTTGGATACCTCTCGAAG AC C C AG AGT ATTGCG AATT ATGC C AGCT ATGAGGTAAAGTGTCATAGCACCA ACTGTTAATTAAATTAAATTAAAAAGGAAATATACTAAAATG ; CGATGGTAAAGTATTTCAACTCAGGTTGGATACCTCTCGAAG AC C C AGAGT ATTGCGAATT ATGCC AGCTATGAGGTAAAGTGTCAT AGC ACCA ACTGTTAATTAAATTAAATTAAAAAGGAAATATACTATG ; CGATGGTAAAGTATTTCAACTCAGGTTGGATACCTCTCGAAG ACC C AGAGT ATTGC G AATTATGC C AGCT ATG AGGT AAAGTGTC ATAGC ACCA ACTGTTAATTAAATTAAATTAAAAAGGÄAATCGCGATACTAAAATG; ja

CGATGGTAAAGTATTTCAACTCAGGTTGGATACCTCTCGAAG

ACCCAGAGTATTGCGAATTATGCCAGCTATGAGGTAAAGTGTCATAGCACCA

• *.’·* ACTGTTAATTAAATTAAATTAAAAAGGAAATC GATAC TAAAATG.

| Tähän ilmentymistä kontrolloivaan sekvenssiin saatetaan tehdä : .·. sopivia muunnoksia, jotta saadaan vieläpä korkeampia proteii- n^-n ilmentymisen tasoja, kun sekvenssiä käytetään ilmentymis-järjestelmän osana. Tätä sekvenssiä saatetaan muuntaa mene-. . telmillä, joita ovat esimerkiksi (1) paikan suhteen spesifi-nen mutaatio [katso B. A. Oostra et ai., Nature. 304. 456-’** ’ 459 ( 1983)]; (2) sijainnin manipulaatio £la.I-kohdassa (esim.

Klenow-fragmentin käyttö nukleotidien sijoittamiseksi tai :***: Sl/Bal-uutto nukleotidien poistamiseksi); sekä (3) synteet- tisten oligonukleotidifragmenttien insertio. Erityisesti on « · * 4 ·«« • * · 19 861 94 havaittu, että saatetaan muuntaa Claim sijaintia tai segmenttiä ATXATG. Sellaiset muunnetut sekvenssit sekä samalla tavalla muunnetut sekvenssit saattavat korvata tämän sekvenssin yh-distelmä-DNA-molekyyleissä, isännissä sekä kyseessä olevan keksinnön mukaisissa menetelmissä ja kaikkien katsotaan kuuluvan kyseessä olevan keksinnön piiriin. Samoin edellä mainitut tekniikat tämän järjestyksen muuntamiseksi ovat käyttökelpoisia muuntamaan tämän ketjun tietty jakso erilaiseksi jaksoksi. Myös aiheeseen perehtynyt saattaa valita emästen erilaisia yhdistelmiä X:n määritelmän piiristä optimoidakseen ilmentymisen tasot tietyissä paikoissa tai antaakseen muita haluttuja ominaisuuksia kyseessä olevan keksinnön mukaisille yhdistelmä-DNA-molekyyleille.

PL-T4:n käyttö antaa tulokseksi TNF:n kaltaisten polypepti-dien voimakkaan ilmentymisen. Yhdistelmä-DNA-molekyylejä,

Dotka sisältävät Ρι,-promoottorin, käytetään edullisesti χ-repressorin sisältävien isäntien transformoinein. Kyseessä olevan keksinnön eräässä suoritusmuodossa, yllä kuvattu ilmentymistä kontrolloiva sekvenssi insertoidaan Pi>pro-moottorin alapuolellel [katso H. Bernard et ai., Gene. 5., 59-76 (1979), sekä Eurooppalainen patenttihakemus numero 81.301413.1, Julkaisu numero 0041767].

• ·* Vaikka kyseessä olevan keksinnön mukaisiin yhdistelmä-DNA- * ' ‘ molekyyleihin sisältyy ekspressiota kontrolloiva sekvenssi, : joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat pL-T4 sekä T4, voi- ·.· } daan käyttää uusia ekspressiota kontrolloivia sekvenssejä : näihin sekvensseihin yhdistetyinä. Esimerkkejä tällaisista «* « ilmentymistä säätelevistä sekvensseistä ovat lac-iäriestelmäf ;*.J trp-järjestelmä, tae-järjestelmä, tre-järjestelmä, faagin pääoperaattori- ja promoottorialueet, fd-kuoriproteiinin säätelyalue, hiivan glykolyyttiset promoottorit, esim. promoot- • · · • « · : tori 3-fosfoglyseraattikinaasia varten, hiivan happamen fos- • · · fataasin promoottorit, esim. Pho5, sekä hiivan λ-pariutumis-tekijän promoottorit ja muut tunnetut sekvenssit, jotka sää- 20 86 1 94 televät prokaryoottisten solujen sekä niiden virusten geenien tai näiden yhdistelmien ekspressiota.

Käyttökelpoisen ilmentymisen isäntiin kuuluvat hyvin tunnetut prokaryoottiset isännät, joissa T4 ja pL-T4 ovat toimivia, kuten esimerkiksi E. colin kannat, esimerkiksi E. coli HB 101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI ( ) sekä ££li MRC1, Pseudopoftfls, Bacillus esim. Bacillus subtilis ja Streptomvces. On havaittu, että E. colin kanta W3110 on erityisen käyttökelpoinen kyseessä olevan keksinnön mukaisen TNF:n ekspressioon.

Kuitenkaan eivät kaikki isäntä/ekspressiovektori-yhdistelmät toimi yhtä tehokkaasti ilmennettäessä kyseessä olevan keksinnön mukaisia DNA-sekvenssejä tai valmistettaessa kyseessä olevan keksinnön mukaisia TNF:n kaltaisia polypeptidejä. Kuitenkin, aiheeseen perehtynyt saattaa valita tietyn isäntä/il-mentymis-vektori-yhdistelmän ottaen asiaankuuluvasti huomioon tässä yhteydessä esitetyt periaatteet poikkeamatta kyseessä olevan keksinnön piiristä. Esimerkiksi tulisi valinnan perustua monien tekijöiden tasapainottamiseen. Näihin kuuluvat esimerkiksi isännän ja vektorin yhteensopivuus, DNA-sekvens-.···. sin koodittamien proteiinien myrkyllisyys isännälle, halut- -*·# tujen proteiinien takaisin saannin helppous, DNA-sekvenssien ominaisuuksien ilmentyminen sekä ilmentymistä säätelevien sekvenssien toiminnallinen kytkentä niihin, biologinen tur- • · · vallisuus, kustannukset sekä halutun proteiinin taipuminen, : muoto ja mikä muu tahansa välttämätön, ilmentymisen jälkei- nen, halutun proteiinin modifikaatio.

Edelleen, kussakin spesifisessä ilmentymisvektorissa saate-: taan valita erilaisia kohtia kyseessä olevan keksinnön mukaisten, TNF:ään kytkeytyvien DNA-sekvenssien inversiota ~varten. Nämä kohdat konstruoidaan tavallisesti restriktio- endonukleaasilla, joka leikkaa ne. Aiheeseen perehtynyt tun-nistaa ne hyvin. On tietenkin selvää, ettei kyseessä olevassa • » · • · ii 21 86194 keksinnössä käyttökelpoisen ilmentymisvektorin tarvitse olla restriktioendonukleaasin kohta, valitun DNA-fragmentin inser-tiota varten. Sen sijaan, vektori voitaisiin kytkeä fragmenttiin vaihtoehtoisin keinoin. Ekspressiovektori ja erityisesti kohta, joka siinä on valittu valittua DNA-fragmentin inserti-ota varten, ja sen toiminnallinen kytkentä siinä ekspressiota kontrolloivaan sekvenssiin, määritetään monien tekijöiden avulla, esimerkiksi niiden kohtien lukumäärän perusteella, jotka ovat herkkiä tietylle restriktioentsyymille, ilmenet-tävän proteiinin koon perusteella, halutun proteiinin herkkyyden perusteella isäntäsolun entsyymeillä tapahtuvalle pro-teolyyttiselle hajoamiselle, ilmennettävän proteiinin konta-minoitumisen tai sitoutumisen perusteella isäntäsolun proteiineihin, jotka ovat vaikeasti poistettavissa puhdistuksen aikana; ekspression ominaisuuksien perusteella, kuten esimerkiksi aloitus- ja lopetuskodonien sijainnin perusteella vek-torisekvenssien suhteen ja muiden, alaan perehtyneille ymmärrettävien tekijöiden perusteella. Vektorin ja insertiokohdan valinta DNA-sekvenssiä varten suoritetaan näiden tekijöiden tasapainottamisen perusteella, kaikki valinnat eivät ole yhtä tehokkaita tietyn tapauksen suhteen.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisilla DNA-sekvensseillä trans-formoitujen prokaryoottisten isäntien viljelyn avulla valmis-- tetut TNF-polypeptidit ja TNF-.n kaltaiset polypeptidit sekä TNF:n kaltaiset polypeptidit, jotka on valmistettu ja puhdis- • ► : tettu kyseessä olevan keksinnön mukaisilla menetelmillä, ovat • · ; käyttökelpoisia monissa koostumuksissa ja menetelmissä syö- « · ί.’ί vänvastaisessa ja kasvaimenvastaisessa käsittelyssä ja hoi dossa. Ne ovat käyttökelpoisia myös malarian hoidossa ja j\· malarian vastaisissa menetelmissä.

» · • · · ^ Näiden polypeptidien, tai mahdollisesti peptidien, jotka ovat ·' niistä peräisin tai syntetisoitu niistä tai syntetisoitu käyttämällä niiden aminohapposekvenssejä, tai niiden suolojen tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten • · · • · 22 8 6 1 94 antaminen saatetaan suorittaa millä tahansa tavanomaisella, hyväksytyllä antamistavalla, jolla annetaan aineita, joilla on syövän-, kasvaimen- tai malarianvastaista aktiivisuutta. Näihin antotapoihin kuuluvat suun kautta tapahtuva, parente-raalinen, ihonalainen, laskimonsisäinen, vammansisäinen tai paikallinen antaminen. Paikallinen, vammansisäinen tai laskimonsisäinen injektio on edullinen.

Näissä hoitomuodoissa käytetyt koostumukset saattavat olla myös eri muodoissa. Näihin sisältyvät esimerkiksi kiinteät, puolikiinteät ja nestemäiset annosmuodot, kuten esimerkiksi tabletit, pillerit, jauheet, nestemäiset liuokset tai suspensiot, peräpuikot, ruiskutettavat tai infuusioliuokset. Edullinen muoto riippuu aiotusta antamistavasta ja hoitosovellu-tuksesta. Koostumukset sisältävät myös mieluummin tavanomaisia, farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantaja-aineita, ja ne saattavat sisältää muita lääkeaineita, kantaja-aineita, apuaineita, täyteaineita jne., esim, ihmisen seerumin albumiinia tai plasmavalmisteita. Mieluummin ovat kyseessä olevan keksinnön mukaiset koostumukset annosyksikön muodossa, ja niitä .··· annetaan tavallisesti kerran tai useampia kertoja päivässä.

Kerralla tai hoidon kuluessa annettavan aktiivisen aineen • · · määrä riippuu hoidettavasta kohteesta, kasvaimen tai syövän ,· : tai malariainfektion vakavuudesta ja etenemisestä, annostelu- *·· tavasta tai muodosta sekä hoitavan lääkärin ratkaisusta. Kui- ---. tenkin, tehokas annos saattaa olla alueella noin 0,005 - 5 ·.*. mg/kg/päivä, mieluummin noin 0,05 - 0,5 mg/kg/päivä; on huo- mättävä, että alemmat ja korkeammat annokset saattavat myös olla käyttökelpoisia.

• ·

Niinpä, kyseessä oleva keksintö antaa käyttöön syövän tai -V kasvainten hoitomenetelmän nisäkkäillä, ihmiset mukaan luet- :’·*·;· tuina, missä menetelmässä annetaan soluopillisesti tehokas määrä kyseessä olevan keksinnön mukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa tai johdannaisia. Olisi •V tietenkin ymmärrettävä, että kyseessä olevan keksinnön • * 23 861 94 mukaisia koostumuksia tai menetelmiä saatetaan käyttää muihin syövän ja kasvaimen hoitoihin yhdistettyinä, esimerkiksi yhdessä interferonien kanssa, kuten esimerkiksi IFN-x, IFN-i sekä IFN-J, yhdessä kemoterapian kanssa, nisäkkäissä esiintyvien syöpäin ja kasvaimien hoitamiseksi.

Kyseessä olevan keksinnön erään näkökohdan mukaisesti nisäkkäitä käsitellään yhdistelmällä, jossa on farmaseuttisesti tehokas määrä TNF:ä sekä antibioottia, niin pitkän aikaa, että se on riittävä lopettamaan tai estämään kasvaimen kasvua ja mieluummin tappamaan kasvainsolut. Nisäkkäitä käsitellään mieluummin koostumuksella, joka käsittää TNF:n ja aktinomy-siini D:n yhdistelmän. Vaihtoehtoisesti niitä voidaan käsitellä peräkkäin kahdella komponentilla. Kuitenkaan tietty hoitojärjestys ei näytä olevan tärkeä. Tarkemmin sanottuna, nisäkkäitä saatetaan käsitellä ihonalaisin, laskimonsisäisin, lihaksensisäisin tai vaurionsisäisin ruiskein annoksella, joka on noin 10 pg - 100 mg TNF:a potilasta kohti päivässä. Kuitenkin tulisi hoitavan lääkärin säätää tämä annos tunnettujen lääkenormien mukaisesti säätääkseen sen potilaan kunnon ja hyväksymistason mukaisesti. Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti potilaita voidaan myös hoitaa farmaseuttisesti te-.···. hokkaalla määrällä antibioottia, ennen TNFrllä suoritettua .ΓΙ hoitoa, samanaikaisesti sen kanssa tai sen jälkeen [katso A.

Goodman et ai.. The Pharmacological Basis of Therapeutics, ss. 1290-91 (1980)]. Aktinomysiini D pitäisi antaa vaurion- sisäisenä injektiona kasvaimeen.

• · W Kyseessä olevan keksinnön mukaisia aineita saatetaan käyttää myös parasiittien vastaisina aineina. Esimerkiksi tiedetään, että ihmisen malariaparasiitti Plasmodium falciparum on herkkä TNF: lie [Palyfair et ai., Tmm. Today. 5, ss. 165-66 ( 1984)].

• » • · « 24 861 94

Seuraavassa esitetään esimerkkejä, jotta tässä kuvattu, kyseessä oleva keksintö tulisi paremmin ymmärrettyä. Pitäisi olla selvää, että kyseisten esimerkkien tarkoituksena on ainoastaan valaista keksintöä.

ESIMERKKI 1 TNF:n kaltaisten yhdisteiden induktio ia määritys in vivo

On olemassa useita menetelmiä TNF:n muodostumisen indusoimi-seksi eläimissä. Eläinten infektio sellaisilla aineilla, kuten esimerkiksi BCGtllä, Corynebacterium-lajeilla ja tsymo-saanilla (Saccharomyces cerevisiae-hiivan seinästä), saa aikaan valtavan retikuloendoteelijärjestelmän (RES) liikakasvun in vivo. Endotoksiinia, joka on peräisin bakteereiden seinämistä (kuten esimerkiksi E. colilta) saatetaan sitten käyttää aiheuttamaan TNF:n vapautuminen aktivoiduilla makrofaageilla.

TNF:n kaltaisten yhdisteiden valmistumisen aikaansaamiseksi kyseessä olevan keksinnön mukaisissa menetelmissä suoritetta-*·. vaa myöhempää käyttöä varten valittiin kaniinien käyttö. Kui- * tenkin, olisi voitu valita monia muita eläimiä, kuten esimer kiksi hiiriä, rottia, koiria, apinoita, nautakarjaa, jne. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää perustettuja solusukupolvia (ih— - : minen, hiiri, jne.) (infra) . Kyseessä olevan patentin edulli- sessa suoritusmuodossa kaniineja käytettäessä ruiskutettiin V niihin laskimonsisäisesti ymppi, jossa oli 4 x 107 näkyvää BCG-organismia. BCG:ä käytettiin, koska sen tiedetään antavan .: käyttöön RES-järjestelmän suurimman mahdollisen stimuloinnin sekä suurimman mahdollisen herkistymisen andotoksiinille.

[E. Λ. Carswell et ai., "An Endotoxin-Induced Serum Factor That Causes Necrosis of Tumors", Proc. Natl. Acad. USA. 72, '-··* s. 3666 ( 1975)]. Noin 14 päivää myöhemmin, kun RES oli riit- tävästi aktivoitunut, kullekin kaniinille ruiskutettiin las- • m φ 25 86 1 94 kimonsisäisesti 100 ug LPS:a TNF:n muodostumisen alkuun saamiseksi. Eläimistä otettiin veri 2 tuntia myöhemmin, ja käsiteltyjen eläinten seerumi koottiin yhteen.

Sopivan kohdesolun valitsemiseksi kyseessä olevan keksinnön mukaista TNF-määritystä varten, tutkittiin monien solupolvien herkkyys in vitro indusoidun humaani TNF:n ja in vivo indusoidun kaniinin TNF:n sytotoksisen vaikutuksen suhteen. Kuten taulukossa I on esitetty yhteenvetona, kaikki transformoidut humaanisolusukupolvet olivat herkempiä TNF-aktiivisuuden suhteen kuin transformoimattomat tutkitut humaanisolut. 37oC:ssaf kaikkien transformoimattomien, tutkittujen solusukupolvien( 182 PF, E15M, WISH, HEK) herkkyys humaani TNF:a kohtaan oli 10 % L-929-solujen herkkyyden alapuolella 37oC:ssa. Oli myös mielenkiintoista, että yksi yhteen sopiva pari (A) (tu- ja tu+) hybridejä, joka oli peräisin Hela-soluista, yhdistyi normaalin fibroblastisolupolven kanssa, näytti synnyttävän kasvaimia, mikä oli korrelaatiossa herkkyyden kanssa kuoliota aiheuttavaa tekijää kohtaan. Kuitenkaan mitään eroa ei voitu nähdä sellaisten hybridien toisessa parissa (B). Edelleen, koska tutkitut humaanisolut ovat herkempiä humaani-TNF:lie kuin kaniinin TNF:lie, uskotaan, että TNF:n toiminnassa on eroa lajispesifisyydessä.

26 86154

Taulukko I: TNF:n svtotoksinen vaikutus humaani soluihin

___27ος_39.5oC

Soluta Kaniini^ Ihminen^ Kaniini Ihminen L-929 100d 100 300 250 KB 10 100 15 125 SV80 2.4 200 3.7 150

Hela 3.7 100 11.1 150 VA4 7.5 25.6 3.75 12.8 VAI3 12.5 75 25 50 HOS 2.5 12.8 5 38.4 MNNG-HOS 2.0 25 4.2 50

Hep 1.9 12.8 — — tu“ 0.8 3.7 1.2 11.1

Atu+ 1.2 100 1.2 100 tu“ 1.2 11.1 3.7 100

Btu+ 0.4 11.1 1.23 33.3 182PF < 0.05 < 3.7 < 0.05 < 3.7 FS4 < 0.05 < 6.3 < 0.05 < 3.7 E1SM 0.5 6.3 0.5 8.4 WISH < 0.05 < 3.7 < 0.05 < 3.7 HEK 0.5 6.3 0.5 6.3 a L-929: hiiren fibrosarkooma; KB: ihmisen ihoaiheinen rak-kulakasvainsyöpä; SV80: SV-40:llä transformoidut humaani-fibroplastit; Hela: humaani, epiteelimäinen syöpä, koh-. . dunkaula; VA-4: SV-40:llä transformoitu ihmisen keuhko; ; j : VA-13: SV-40:llä transformoitu ihmisen keuhko; HOS: ihmi sen luusarkooma; MNNG-HOS: kemiallisesti transformoitu ·'·· -' luusarkooma; Hep: ihmisen rakkulakasvainsyöpä, kurkunpää; tu-: hybridin tukahduttama kasvain (Hela x humaanifibro-bl. (GM0077); tu+: tu-:n palautuma in vivo [E.J. Stan- bridge et ai., Science. 215, ss. 252-259 (1982)]; 182PF: .·. : ihmisen paksusuolen ja peräsuolen limakalvon (skin) • perinnöllinen rauhaskudoksen liikakasvu (normaali liroa- kalvon koepala) ; FS4: diploidinen humaani fibroblasti; E1 SM: diploidinen humaanifibroblasti; WISH: humaani-I'·*; vesikalvo (amnion); HEK: ihmisen sikiön munuainen.

b seerumi kaniineista, jotka on ruiskutettu BCG:llä ja LPS:llä c elatusaine ihmisen istukkaperäiseltä M0:lta, joka on stimuloitu in vitro V-IF-.lla (24 tuntia) ja LPS: llä (3 tuntia) d ilmaistu L-929-solujen herkkyyden prosentteina, 37oC:Ssa 27 86194

Koska L-929-soluilla oli eräs korkeimmista, spesifisesti kasvaimen kanssa korreloivista herkkyyksistä kuolion aiheuttavaa tekijää kohtaan, joka on todiste TNF-aktiivisuudesta, valitaan nämä solut ja pidetään niitä edullisina kyseessä olevan määrityksen suhteen. Määritykseen käytettiin pääasiallisesti menetelmää, jota Ruff et ai. ovat kuvanneet, Lvmphokine Reports. osa II (1980).

Ensin valmistettiin otaksutun TNF:a sisältävän jakeen sarja-laimennukset ja lisättiin L-929-soluja (50 000 solua/kammio) sekä aktinomysiini D;tälopulliseksi konsentraatioksi 1 μς/ιηΐ. Tätä seosta inkuboitiin 37oC:ssa tai 39,5 oC:ssa 18 tunnin ajan (korkeammassa lämpötilassa L-929-kohdesolut ovat 2,5 - 3,0 kertaa herkemmät kuin alemmassa lämpötilassa). In-kubointijakson lopussa solut värjättiin ja laskettiin. Vaihtoehtoisesti värjätyt solut liuotettiin 33 %::iseen H0Ac:een ja vapautunut väri mitattiin Kontron-spektrofotometrillä (577 nm) .

Kyseessä olevissa määrityksissä TNF-yksikkö (U) millilitraa kohti merkitsee TNF-.n laimennuksen käänteisarvoa, joka tarvitaan vähentämään solujen henkiinjäämistä 50 %, 18 tunnissa, tappamismäärityksessä, joka suoritettiin aktinomysiini D:n läsnäollessa.

ESIMERKKI 2 • · • · ; ‘ TNF:n tai TNF:n kaltaisen aktiivisuuden induktio peruste- : tuissa solupolvissa .

TNF-aktiivisuus tai TNF:n kaltainen aktiivisuus voidaan saada ; '·· aikaan myös in vitro, perustetuissa soiusukirpolvissa, Humaani-TNF:n induktiota varten, esimerkiksi, valitaan humaanimono-- syyttien U-937-solupolvi [Human histiocytic lymphoma, C. Sundström ja K. Nilsson, Int. J. Cancer. 17, ss. 565-77 (1976)]. Kuitenkin, voitiin myös käyttää muita humaani 28 861 94 pre-monosyytti-solusukupolvia (esim, HL-60, Ml-1), humaanimono-syytti-solupolvia (esim, TPH-1, J—111) tai humaanimakrafaa-geja, jotka on eristetty esim. istukoista, indusoimaan kyseessä olevia TNF:n kaltaisia humaanipolypeptidejä.

Pitäisi tietenkin olla ymmärrettävää, että kukin näistä humaani-TNF:n lähteistä in vitro saataa edellyttää enemmän tai vähemmän spesifistä induktiojärjestelyä TNF:n tai TNF:n kaltaisen polypeptidin optimivalmistusta varten.

Valitsemassamme suoritusmuodossa humaani-TNF:n induktiota varten kasvatettiin U-937-solupolvia pyörijäpulloissa, RPMI-1640 elatusaineessa, jota oli rikastettu 5 \:illa, inaktivoi-mattorailla, esivalituilla-erillä vasikan sikiön seerumia (FCS, Gibco, Paisley, Skotlanti) sekä 5 \:lla hevosen seerumilla (Gibco). Kun solut saavuttivat tiheyden 1,5 x 106 solua/ral, niitä indusoitiin 24 tunnin ajan 32 nM:lla TPA:a (Sigma, St. Louis, USA) RPMI-1640: ssa, 0,1 yksiköllä millilitrassa härän kiteistä insuliinia (BDH, Poole, Englanti), 50 nM:lla retii-nihappoa (retinoic acid) (Calbiochem, Frankfurt, Länsi-Saksa), 1 %: 11a jättiläiskasvainsoluille (GTC) sovelletulla ela-tusaineella (Gibco), 0,5 mg:lla millilitrassa Cytodes 3:a (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), pyörivissä pulloissa, solu-tiheyden ollessa 1 x 106 solua/ml.

Hiiren TNF: n induktiota varten valitussa suoritusmuodossa valittiin hiiren kasvaimen makrofaagi-solulinja PU.5.1.8.

. . Cancer Res. 37, ss. 546-550 (1977). Kuitenkin saatettiin yhtä - hyvin valita muita hiiren makrofaagi-solupolvia, kuten esi-:: merkiksi J-774, RAW 309 sekä WR 19 M. PU 5.1.8.-solupolvi indusoitiin TNF : n vaJ niistämiseksi suurin piirtein Männel et ai.:n kuvaamalla tavalla, Inf. and Imm.. 30, ss. 523-530 (1980). Yleisesti pääpiirteissään, solut kasvatettiin RPMI-: 1640 elatusaineessa, joka oli rikastettu 10 \:lla FCS:a (309 Gibco 011-6309), pyöri jäpul loissa. Sitten soluja, joiden tiheys oli 3,5 x 106 solua/ml, indusoitiin 5 yg:llä LPS/ml, "· RPMI-1640:ssa, 4 tunnin ajan pyörijäpulloissa.

29 861 94

In vitro indusoidut solut (hiiren tai ihmisen) koottiin sentrifugoimalla ja niitä käytettiin lähteenä mRNA:lle, joka sisälsi TNF:a tai TNF:n kaltaista polypeptidiä koodattavan informaation. Niitä käytettiin myös hiiren ja ihmisen TNF:n lähteenä itsessään.

ESIMERKKI 3 TNF:n aktiivisuutta koodittavaa geneettistä informaatiota ai.sjitäyäp mRNft;n

Kyseessä olevassa esimerkissä käytettiin in vitro indusoituja U-937 (humaani) tai PU 5.1.8. (hiiri) soluja, jotka olivat edellä valmistetun TNF:n suhteen spesifisen mRNA:n lähteenä. Soluista uutettiin koko sytoplasmaperäinen RNA liuottamalla ne Nonidet p-40:ssä sekä tämän jälkeen fenoloimalla liuotus-tuote. Sitten liuotustuotteesta erotettiin polyadenyloitu RNA (poly A+ RNA) oligo dT-selluloosakromatografiän avulla (tyyppi 3, Collaborative Research). Poly A+ RNA fraktioitiin edelleen 15 \:isessa, jäädytetyssä sulatetussa sakkaroosi-gradientissa (joka vastaa sakkaroosigradienttia 5 V.sta 20 V.iin), käyttämällä Beckman SW41-roottoria, A°C,40K ja 19 h.

Kunkin jakeen biologinen aktiivisuus määritettiin suorittamalla jakeesta erän mikroinjektio Xenopus laeviksen oosyyt-teihin (50 pg mRNA:a oosyyttiä kohti; 15 oosyyttiä näytettä · kohti). Tämän jälkeen ruiskutettuja oosyyttejä inkuboitiin 24 . _ tunnin ajan oosyyttien haudeaineessa (joka sisälsi 0,1 % polypetyleeniglykoli 6000:a, 0,4 % Aprotininia (Sigma) sekä 1 mM CUSO4)' ja tnf;n aktiivisuus määritettiin väliaineessa, L-929-soluilla, 39,5°C:Ssa, käyttämällä aiemmin kuvattua in vitro määritysjärjestelmää. Määrityksissä havaittiin uusimis-kelpoista TNF:n biologista aktiivisuutta jakeissa, jotka : vastasivat mRNA:a, joka vastaavasti sedimentoitui 16S:llä ja 17S : llä, humaani sekä hiiren TNF-.ään kytkeytyvän RNA: n 30 861 94 suhteen. Kuva 1. esittää vastaavasti humaani-ja hiiren mRNA-valmisteiden kahta tyypillistä sakkaroosigradienttia.

ESIMERKKI 4

Hiiren- ia humaani cDNA-varastoien valmistaminen

Humaani- ja hiiren cDNA-varastoja koottiin suurin piirtein Wickensin et ai. kuvaamalla tavalla, "Synthesis of Double-Stanted DNA Complementary to Lysosyme, Ovomucoid and Ovalbumin mRNAs", J. Biol. Chem.. 253, ss. 2483-95 (1978), käyttämällä t 8 μς niitä poly A+ RNA-jakeita, joissa oli maksimaalinen biologinen aktiivisuus oosyytteihin suoritetun injektion jälkeen. Tietenkin tulisi ymmärtää, että kyseessä olevat, kloonatut cDNA-kirjastot olisi voitu valmistaa muista humaani- tai eläinlähteistä peräisin olevasta poly A+ RNA:sta tai kokonaisesta soluperäisestä RNA:sta ilman aiemmin kuvattua rikastusta tai koon suhteen suoritettua valintaa.

Vaikka olisimme voineet käyttää muita tavanomaisia menetelmiä, esimerkiksi menetelmiä, joita ovat kuvanneet Land et ai.. "5-Terminal Sequences of Eukaryotic mRNA Can Be Cloned With High Efficiency", Nucleic Acids Research. 9, ss. 2251-66 (1981); Okavoma ia Berg. "High Efficiency Cloning Of Full-Length cDNA, Mol, and Cell. Biol.. 2, ss. 161-70 (1982); tai Maniatis et ai. julkaisussa "Molecular Cloning" (julk. Cold . . Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), ss.

229-46 (1982), valittiin seuraavat menetelmät cDNA:n kloonaamista varten.

A, Ensimmäisen säikeen synteesi

' ' Ensimmäisen cDNA-säikeen synteesiin käytettiin i 80 fjg poly A RNA:/ml, 50 mM Tris-HCl-.a (pH 8,3), 50 mM KCl:a, 10 mM

MgC12:a, 10 mM DTT: a, 0,5 mM kutakin dNTP -. tä, 1/1000 dCTP:a korvattuna 32p-dCTP:llä (± 600 Ci/mmooli) (Amersham, 31 86194

Buckinghamshire, Englanti), P(dT)10.a 60 Hg/ml (Pharmacia-PL Biochemicals, Uppsala, Ruotsi), 750 yksikköä/ml ihmisen istukkaperäistä RNA:aasi-inhibiittoria (Amersham) sekä 1000 yksikköä/ml AMV-käänteistranskriptaasia (Anglian Biotechnology Ltd, Colchester, Englanti).

Reaktioon käytettiin 100 μ1:η kokonaistilavuutta, 41°C sekä 1 h. Tämän jälkeen reaktioseos uutettiin kaksi kertaa fenoli/ kloroformi/isoamyylialkoholi-seoksella (25/24/1), kaksi kertaa dietyylieetterillä, ja DNA saostettiin lisäämällä 1 tilavuus 4 M NH^0Ac:a sekä 4 tilavuutta etanolia. Saostaminen toistettiin kaksi kertaa. Tarvittaessa lisättiin reaktioseok-seen myös hiivan tRNA:a kantaja-aineena, ennen kuin lisättiin etanolia.

B. RNA-templaatin Poisto ia toisen säikeen synteesi

Saostettu DNA liuotettiin uudelleen 60 pl:aan 15 mM kaliumfosfaattia (pH 6,9), 0,25 mM EDTA:a, lisättiin 2 ^g RNA:aas± A:a (Boehringer Mannheim, Länsi-Saksa) sekä 250 yksikköä RNA:aasi T1:ä (BLR, Neu-Isenburg, Länsi-Saksa), ja seoksen annettiin seisoa 37öc-.ssa 30 minuutin ajan.

Sitten seosta käsiteltiin kiehuvassa vesihauteessa kahden minuutin ajan, ja se jäähdytettiin välittömästi jäillä. Tämän : " * jälkeen lisättiin kaliumfosfaattipuskuria (pH 6,9) (lopulli-seksi konsentraatioksi 100 mM) , MgCl2:a (lopulliseksi konsen-' traatioksi 10 mM), DDT:a (lopulliseksi konsentraatioksi 10 : . . mM), dNTPritä (kukin lopulliseksi konsentraatioksi 1 mM) sekä 330 yksikköä/ml E. colin DNA-polymeraasi I:ä (ilman endonulke-aasia) (Boehring Mannheim, Länsi-Saksa). Toinen säie synteti-. . soitiin 15°C:ssa, 6 tunnin aikana, 300 ui.n kokonaistilavuudessa. Sitten reaktio pysäytettiin lisäämällä EDTA (pH 8) 25 mM:n lopulliseksi konsentraatioksi, ja seosta uutettiin ja se saostettiin yllä kuvatulla tavalla.

32 8 6 1 94

Saostuma liuotettiin uudelleen 80 ^l:aan seosta, jossa oli 50 mM Tris-HCl:a (pH 8,3), 50 mM KCl:a, 10 mM MgCl2:af ίο mM DTT:a, 1 mM kutakin dNTP:a sekä 650 yksikköä/ml AMV-käänteis-kopioija (transkriptaasi)-entsyymiä (Anglian Biotechnology Ltd, Colchester, Englanti), ja seosta inkuboitiin 41°C:ssa 90 minuutin ajan toisen säikeen cDNA-synteesin tehokkuuden lisäämiseksi. DNA eristettiin jälleen uuttamalla ja saosta-raalla, kuten yllä kuvattu.

C. S1-nukleaasilla suoritettava käsittely DNA-saostuma liuotettiin 80 ^iltaan puskuria, joka sisälsi 125 mM NaClta, 25 mM NaOAc:a, 1 mM sinkkiasetaattia (pH 4,5), siihen lisättiin 20 yksikköä S1-nukleaasia (BRL, Neu-Isen-burg, Länsi-Saksa), ja seoksen annettiin seisoa 20 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä EDTA:a (pH 8) 20 mM:n lopulliseksi konsentraatioksi, ja reaktioseos neutraloitiin lisäämällä Tris-HCl:a (pH 8) 200 mM:n lopulliseksi konsentraatioksi. Sitten jälleen DNA uutettiin ja saostettiin yllä kuvatulla tavalla, liuotettiin uudelleen puskuriin, joka sisälsi 30 mM NaCl:a, 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA:a (pH 8), sekä fraktioitiin koon mukaan Sepharose SL 4B-pylväässä (0,8 x 12 cm) (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), tasapainotettiin samaa puskuria vastaan. Kahden pisaran suuruiset ...· jakeet koottiin ja yhdistettiin ne jakeet, jotka sisälsivät DNA: a ainakin 500 emäsparia tai enemmän ja yhdistetyt jakeet saostettiin yllä kuvatulla tavalla.

:'· D. Kaksi säikeisen cDNA:n ia Pstl-restriktionentsvvmillä . pilkotun pAT153:n kytkentä (tailing)

. Kyseessä olevan keksinnön mukainen, kaksisäikeinen cDNA lii-tettiin oligo-dC-häntien kanssa seuraavaa seosta käyttämällä: t 2,5 ug kaksisäikeistä cDNA/ml, 100 mM kakodylaattia (pH

: V 7,2), 2 mM CoCl2:a, 200 uM DTT:a, 40 uM deoksi-(5-3«)“ :**’· sytidiin-trifosfaattia (17 Ci/mmooli) (Amersham, 33 861 94

Buckinghamshire, Englanti), 400 yksikköä/ral terminaalista deoksinukleotiditransferaasia (Pharmacia-PL Biochemicals, Uppsala, Ruotsi). Reaktiota jatkettiin 37°C:ssa, kunnes 12-18 dC-tähdettä oli liitetty 30H-päätä kohti, ja sitten reaktio pysäytettiin lisäämällä EDTA:a (pH 8), siten että lopullinen konsentraatio oli 20 mM. Materiaali uutettiin sitten välittömästi fenolilla, sitten etyylieetterillä (kaksi kertaa), ja sidottu cDNA saostettiin yllä kuvatulla tavalla. Oligo dG-häntiä liitettiin myös Pstl-restriktioentsvvmillä käsiteltyyn plasmidiin pAT153 1) samankaltaisissa olosuhteissa, paitsi että (1) desoksi-(5-3h)-sytidiini-5-trifosfaatti korvattiin desoksi-(8-3h)-guanosiini-5-trifos£aatilla (25 Ci/mmooli, Amersham, Buchinghamshire, Englanti), 4 pM:n konsentraationa, ja (2) lineaariseksi tehtyä plasmidi-DNA:a käytettiin ± 61 pmoolia/ml.

E. Oligo dC:een liitetyn kaksisäikeisen cDNA:n lämpökäsittely (annealing) oliao dG:een liitetyn vektori -DNA:n kanssa

Kyseessä olevan keksinnön mukaista dC:een liitettyä, kaksi-säikeistä cDNA:a ja dG_een liitettyä, lineaariseksi tehtyä plasmidia käsiteltiin pääasiallisesti Maniatis et ai:n menetelmän mukaisesti, joka on esitetty julkaisussa "Molecular Cloning" (julk. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold --. Spring Harbor, N.Y.), s.242 (1982), paitsi että sen jälkeen kun seos oli kuumennettu 65^:een, se jäähdytettiin huoneen-: lämpötilaan 2-3 tunnin kuluessa.

pAT153 (hyvin tunnettu ja saatavissa oleva kloonausvekto-^ . ri) käsiteltiin restriktioentsyymillä PstI. toimittajan !..1 (Boehringer Mannheim, Länsi-Saksa) esittämien olosuhteiden mukaisesti, paitsi että entsyymiyksiköitä käytettiin kolme ; ‘ kertaa enemmän.

34 861 94 F. E.colin kannan DH1 (λ) transformaatio

Seuraavaksi E.colin DH1 (λ) transformoitiin [Hanahan, "Studies on Transformation of Escherichia coli with Plasmids", J. Mol. Biol.1. kyseessä olevan keksinnön mukaisella, lämpökäsittellyllä yhdistelmä-DNA:11a käyttämällä 10 ng vektori-DNA:a 100 jil:aa kohti vaadittuja soluja. Sitten transformaatioseos asetettiin Millipore HATF-(0,45 uM huokoskoko) suodattimille (Millipore Corp., Bedford,

Massachusetts), jotka oli kerrostettu Luria-lihaliemiagar-levyjen päälle, jotka sisälsivät 10 ^ug/ml tetrasykliiniä. Pesäkkeiden lisääntymisen jälkeen suodattimet asetettiin tuoreille levyille, jotka sisälsivät myös 20 % glyserolia, ja levyt varastoitiin -20oC:ssa.

Tätä menettelyä käyttämällä saatiin cDNA-varasto, jossa oli noin 60 000 kloonia sekä hiiren cDNA-varasto, jossa oli noin 30 000 kloonia.

ESIMERKKI 5 TNF:n puhdistaminen kaniinin seerumista

Kuvassa 2 esitetään kaaviomaisesti kyseessä olevan keksinnön ..." mukaisen menetelmän eräs suoritusmuoto TNF: n kaltaisten poly-peptidien puhdistamiseksi indusoidun kaniinin seerumista. Kuten on valaistu esimerkein kuvassa 2 esitetyssä, kyseessä • olevan keksinnön eräässä suoritusmuodossa, koottiin seerumi : 50 kaniinilta, joita oli käsitelty esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Eräässä tyypillisessä kokeessa, LPS-.n laskimonsisäi-sen injektion jälkeen, BCGtllä käsiteltyjen kaniinien seerumi . . (1800 ml) sisälsi noin 5,2 x 104 yksikköä TNF:a/ml, spesifi- ;sen aktiivisuuden ollessa noin 5,3 x 102 yksikköä/mg proteiinia.

; A. Proteiinin saostaminen kaniinin seervimista 35 86194

Eristetty kaniinin seerumi kyllästettiin ensin kiinteällä ammoniumsulfaatilla, lisäämällä sulfaattia hitaasti (noin 6 g/min), sekoittaen jatkuvasti 4ct:ssa, kunnes saavutettiin 35,9 %:inen ammoniumsulfaatin kyllästys. PH pidettiin 7,0:ssa ammoniakin avulla, ja liuos pidettiin 4dc:ssa, jatkuvasti sekoittaen, noin 18 tunnin ajan. Seuraavaksi saostuma poistettiin liuoksesta sentrifugoiden (30 minuuttia, 7500 kierrosta minuutissa, 4°C:ssa, Beckman JA 7,5 roottorissa). Sitten supernatanttiin lisättiin ammoniumsulfaattia samoissa olosuhteissa, kunnes saavutettiin 61,6 \:inen kyllästys. Sen jälkeen kun yllä kuvattua, kyllästettyä seerumia oli sekoitettu 5 tunnin ajan jatkuvasti, koottiin jälleen saostuma yllä kuvatulla tavalla ja tästä toisesta saostuksesta saatu sakka lietettiin uudelleen 600 ml:aan 50 mM Tris-HCl:a (pH 7,5), 4QC:ssa. Sitten liuosta dialysoitiin 40 tunnin ajan, 4 x 3000 ml:aa vastaan 50 mM Tris-HCl:a (pH 7,5) (4oc), ammoniumsulfaatin poistamiseksi. Tämä menetelmä antoi 760 ml pro-teiiniliuosta 50 mM Tris-HCl:ssä (pH 7,5). Tämä 35,9-61,6 \:inen ammoniumsulfaattijae nimitettiin jakeeksi A.

Koska 0-35,9 %:isesta ammoniumsulfaattijakeesta saatu saostuma sisälsi myös huomattavan määrän TNF-aktiivisuutta, se lietettiin noin 200 ml:aan 50 mM Tris-HCl:a (pH 7,5), ja tätä liuosta dialysoitiin 18 tunnin ajan 2000 ml:aa vastaan 30,8 ..." %:ista ammoniumsulfaattiliuosta, 4°C:ssa, jatkuvasti sekoit-: V taen. Sen jälkeen kun saostuma oli poistettu sentrifugoimal-la, samoin kuin aiemmin, supernatantti dialysoitiin 3 x 2000 : : : ml:aa vastaan 50 mM Tris-HCl:a (pH 7,5), 4QC:ssa, jatkuvasti sekoittaen, 3 x 2,5 tunnin ajan. Tämä dialyysi antoi 270 ml .·.'. prot.eiiniliuosta 50 mM Tris-HCl-liuoksessa (pH 7,5). Tämä 30,8 - 35,9 %:inen ammoniumsulfaatijae nimitettiin jakeeksi B.

Jakeet A ja B yhdistettiin ja sentrifugoinnin jälkeen (30 min, 7500 kierrosta/min, 4°C, Beckman JA 7,5 roottorissa) liuoksen annettiin läpäistä 0,45 jun:n nitroselluloosasuodatin 36 86194 (Millipore, Bedford, Massachusetts), jotta saatiin 1025 ml 30,8-61,5¾:ista ammoniumsulfaattijaetta. Tämä yhdistetty jae sisälsi n. 8,0 x 104 yksikköä TNF:a/ml — suurin piirtein kaniinin seerumin koko TNF-aktiivisuuden -- ja ainoastaan 55¾ sen kokonaisproteiinista. Jakeen spesifinen aktiivisuus oli 8,8 x 102 yksikköä TNF:a/mg proteiinia.

B. Ioninvaihtokromatoqrafia (heikosti alkalinen pH)

Kyseessä olevan keksinnön mukaisen yhdistetyn jakeen TNF-ak-tiivisuus erotettiin monista muista proteiineista käyttämällä hyväksi TNF:n voimakasta sitoutumisaffiniteettia anioninvaih-tajaan. Vaikka monet anioninvaihtokromatografiset menetelmät ovat tutkimustyössä tunnettuja, valittiin käyttöön DEAE-Sephacel-pylväs, 2,6 cm läpimitaltaan x 48 cm (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Tulisi tietenkin ymmärtää, että olisi voitu valita muita anioninvaihtopylväitä poikkeamatta kyseessä olevan keksinnön piiristä.

Valittua pylvästä, joka oli aiemmin tasapainotettu 50 mM Tris-HCl:lla (pH 7,5), ylikuormitettiin voimakkaasti kyseessä olevan keksinnön mukaisella TNF-.a sisältävällä liuoksella, antaen liuoksen virrata nopeudella 0,8 ml/min. Koska TNF syrjäytti muut aiemmin pylvääseen sitoutuneet proteiinit, tämä menettelytapa antoi pylväässä tulokseksi sen, että siihen si-| toutui suurin piirtein kaikki TNF, joka oli liuoksessa. Sen *:**: jälkeen kun pylväs oli pesty yhdellä pylvään tilavuudella 50

| mM Tris-HCl:a (pH 7,5) ja yhdellä pylvään tilavuudella 0,1 M

: .·. NaCl:a, joka oli 50 mM Tris-HCl:ssa (pH 7,5), virtausnopeu-della 0,8 ml/min, sitä eluoitiin lineaarisella suolagradien-tilla 0,1 M - 0,4 M NaCl:a, joka oli 50 mM Tris-HCl-.ssa (pH . . 7,5), samalla virtausnopeudella. Tämä eluointi antoi jakeiden

eluoitumisen, jotka sisälsivät TNF:n aktiivisuutta 0,1 M

* " NaCl-pesuvaiheen lopussa. Kuten kuvassa 2 on esitetty esi- • : merkkinä, tuloksena saatu liuos sisälsi 2,8 x 105 yksikköä TNF-.a/ml, spesifinen aktiivisuus oli 1,6 x 105 yksikköä/mg 37 861 94 proteiinia. Siis, tämä anioninvaihtoaine salli poistettavan 99\ proteiineista, jotka eivät olleet TNF-proteiineja, kun taas suurin piirtein kaikki TNF:n aktiivisuudesta säilyi.

C. Yhdistettyjen ioninvaihtoiakeiden väkevöiminen

Kuvan 2 mukaisesti, seuraavaksi yhdistettiin ja väkevöitiin TNF:a sisältävät jakeet, jotka eluoituvat DEAE-Sephacel-pyl-väästä. Yhdistetyt jakeet sentrifugoitiin (30 minuuttia, 13500 kierrosta minuutissa, 4°C, Beckman JA 14-roottorissa), ja sitten supernatantti väkevöitiin noin 17-kertaisesti Arai-con TCF-2-laitteella (kennoon kohdistettiin 151,988 kPa:n suuruinen paine sekä käytettiin Diaflo UM 10-membraania (Amicon, Danvers, Massachusetts, USA)). Muodostuva konsent-raatti sisälsi 2,6 x 106 yksikköä TNF:a/ml ja sen spesifinen aktiivisuus oli 1,2 x 105 yksikköä/mg (kuva 2).

D. Geelisuodatus

Edellä kuvatulla tavalla valmistettu väkevöite fraktioitiin seuraavaksi molekyylipainon perusteella, geelisuodatusta käyttäen. Vaikka tutkimustyön piirissä monet sopivat geeli-suodatusjärjestelmät ovat tunnettuja, käyttöön valittiin AcA 34 geeli (LKB, Bromma, Ruotsi), jonka fraktiointialue on ' ‘ 20000 - 350000 daltonia. Jälleen, pitäisi olla ymmärrettävää, !“·*: että muita suodatusjärjestelmiä olisi myös voitu käyttää.

: .·. Valittu geeli lietettiin 1 M NaCl:iin ja 50 mM Tris-HCl:iin : .·. (pH 7,5), geeli kaadettiin pylvääseen (2,5 cm läpimitaltaan x • 89 cm), ja se tasapainotettiin samalla puskurilla, virtausno peudella 0,5 ml/min. Ennen kuin TNF-konsentraatti kuormitettiin valmistettuun AcA 34 pylvääseen, Ami.eon-konsentraatin '·suolakonsentraatio yhtäläistettiin pylväänsä käytetyn pusku- t « · rin suolakonsentraation kanssa käyt.tämällä 5 M NaCl-liuosta 50 mM Tris-HCl:ssa (pH 7,5). Tämän menetelmän geelisuodatus- • <· jae, jossa oli TNF-aktiivisuus, vastasi noin 35000 daltonin molekyylipainoa.

3β 86194

Kuten kuvassa 2 on esitetty, 30 ml liuosta, joka jäi jäljelle geelisuodatuksen jälkeen, sisälsi 4,0 x 106 yksikköä TNF:a/ml, ja sen spesifinen aktiivisuus oli 9,3 x 106 yksikköä TNF:a/mg proteiinia. Tämä edustaa noin 20.000-kertaista TNF:n puhdistumista seerumista.

E. Ioninvaihtokromatografia (heikosti hapan pH)

Yhdistetyt geelisuodatusjakeet, jotka sisälsivät TNF-aktiivi-suuden, dialysoitiin seuraavaksi yön yli 4°C:ssa 2 x 750 ml:aa vastaan 0,1 M NaCl:a 20 mM histidiini-HCl-puskurissa (pH 5,8). Sitten kun preparatiivinen mono-Q-pylväs (1 cm läpimitaltaan x 11 cm, Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) oli tasapainotettu samalla puskurilla, dialysoitu, TNF:a sisältävä liuos fraktioitiin tässä pylväässä käyttämällä lineaarista gradienttia 0,1 M - 0,4 M NaCl:a, joka oli 20 mM histidiini-HCl-puskurissa (pH 5,8). TNF:a sisältävät jakeet eluoituivat gradientissa noin 0,26 M NaClrlla (jakeet 15 ja 16). Kuvan 2 mukaisesti nämä kromatografiavaiheet antoivat 4 ml liuosta, joka sisälsi 2,5 x 107 yksikköä TNF/ml ja jonka spesifinen aktiivisuus oli noin 4,5 x 107 yksikköä TNF/mg proteiinia.

··* Tämä jae edusti noin 100.000 kertaista TNF:n puhdistumista • seerumista. *) : : i Happamesta mono-Q-pylväästä eluoidut jakeet analysoitiin : SDS-PAGE:lla (12\). Kuten kuva 3 esittää, havaittiin, että yksi ainoa proteiinijae oli säilynyt aktiivisissa pylväs-jakeissa asemassa, joka oli ekvivalenttinen noin 18.000 • ♦ • · ♦ • * ♦ • · __ t « » • V ^Vaihtelut TNF:n kokonaisaktiivisuudessa, kuten kuvassa 2 on * : esitetty, johtuvat käytetyn TNF:n aktiivisuusmäärityksen epätarkkuudesta (kertoimen 2 verran) .

• · · « * · 39 861 94 daltonin suuruisen molekyylipainon kanssa. Tämän vyöhykkeen värjäävän Coomassie Brilliant Bluen (Serva R250) intensiteetti korreloi täsmälleen vastaavien pylväsjakeiden TNF:n aktiivisuuden kanssa. Vaikka SDS-PAGE denaturoi proteiineja, näistä geeliviipaleista eluoitu TNF:n aktiivisuus antoi SDS-poly-akryyliamidi-geelillä suoritetussa elektroforeesissa saman vyöhykkeen, varmistaen täten,että 18.000 daltonin vyöhyke edustaa TNF:n kaltaista polypeptidiä.

ESIMERKKI 6

Kaniinin puhdistetun TNF:n aminohapposekvenssin määrittäminen ia erilaisten DNA-koettimien konstruointi

Indusoitujen kaniinin seerumeista saatua, puhdistettua, kyseessä olevan keksinnön mukaista TNF:n kaltaista polypeptidiä käytettiin sen aminohapposekvenssin osien määrittämiseen. Tulisi kuitenkin olla myös selvää, että kyseessä olevaa, puhdistettua TNF:a saatetaan käyttää kliinisesti tutkittaessa TNF:n vaikutusta syöpään ja kavaimiin sekä malariainfektioihin sekä niiden vastaisessa hoidossa. Kyseessä olevaa puhdistettua TNF:a saatetaan myös käyttää TNF:n vasta-aineiden valmistamiseksi (polyklonaalisten sekä monoklonaalisten vasta-aineiden) ’**: ruiskuttamalla puhdistettua proteiinia sopiviin eläimiin.

Katso esimerkiksi, B.Benacerraf ja E.Unanue, "Textbook of Immunology", Williams & Williams (Baltimore, Md.) ss. 12-22 : (1979). Nämä vasta-aineet ovat sitten käyttökelpoisia esimer- ]“.* kiksi määritettäessä TNF:a sekä sitä puhdistettaessa.

Proteiinien ja niistä peräisin olevien peptidien aminohappo-sekvenssien määritysmenetelmät ovat tutkimustyössä sinänsä *. *: tunnettuja. Eräs saatavissa olevista automaattisista menetel- V : mistä valittiin^ aminohapposekvenssin määrittämiseksi esimer- kin 5 mukaisesti puhdistetun TNF-.n kaltaisen, kaniinilta peräisin olevan yhdisteen valittujen osien aminohapposekvens-*1* sin määrittämiseksi. Kyseessä olevasta puhdistetusta TNF-. stä 40 861 94 valmistettiin ensin CNBr-fragmentit standardiolosuhteissa. Sitten nämä jakeet erotettiin geelillä, yksityiset vyöhykkeet elektroeluoitiin, ne dialysoitiin ja pantiin suoraan Applied Biosystems Gas Phase Sequencerille (malli 470).

Kuvissa 4 ja 5 esitetään kyseessä olevan, puhdistetun, kaniinin TNF-polypeptidin kahden osan aminohapposekvenssi (TNF-fragmentit 3 ja 4). Näissä kuvissa esitetään myös erilaisia DNA-kodoneja, jotka koodittavat kutakin näihin £ragmentteihin sisältyvää aminohappoa. Erilaiset kodonit edustavat degeneroitunutta sarjaa, joka koodittaa määritettyjä aminohapposekvenssejä. Geneettisen koodin degeneroitumisen vuoksi, tiettyä aminohapposekvenssiä varten saatetaan syntetisoida useita mahdollisia nukleotidien paikanvaihdoksia. On tietenkin edullista valita DNA koettimen synteesiä varten aminohapposekvenssi, joka sisältää vähiten degeneroituneiden kodonien aminohappoja. Kuitenkin, kun on valittu riittävän pitkä koetin, kaikki mahdolliset yhteensopimattomuudet tasautuvat täydellisesti sopivien alueiden ansiosta, niin että havaittava hybridisaatio vielä tapahtuu, vieläpä erittäin degeneroiduilla koetti-mien sarjoilla.

Aminohapposekvenssit, jotka ovat peräisin kyseessä olevan keksinnön mukaisesti puhdistetusta kaniinin TNF:stä, ovat käyttökelpoisia syntetisoitaessa nukleotidi-(DNA)-koettimia käytettäviksi monien DNA-kirjastojen seulontaan, läheisten . . DNA-sekvenssien valitsemiseksi hybridisaation avulla. Näitä valittuja DNA-sekvenssejä saatetaan sitten käsitellä TNFin ·**_· ekspressiota varten prokaryoottisissa isännissä, jotka on "-*· niillä transformoitu. Ne ovat myös käyttökelpoisia seulonta-koettimina muiden läheisten DNA-sekvenssien valitsemiseksi, jotka koodittavat nisäkkäiden TNF:iä, esim. hiiren ja ihmisen : TNF: iä.

Sopivissa eläimissä tapahtuvaan, TNF-.n polyklonaalisten ja *!' raonoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen voidaan 41 86194 käyttää myös kyseessä olevan keksinnön mukaista, puhdistettua TNF:a sekä sen aminohapposekvenssien perusteella syntetisoituja peptidejä. Nämä vasta-aineet ovat sitten käyttökelpoisia TNF:n puhdistuksessa sekä TNF:n radioimmunologisessa määrityksessä, mukaanluettuna käyttö kyseessä olevan keksinnön mukaisilla menetelmillä valmistettujen, TNF:a ekspressoivien kloonien suorassa valinnassa. Edelleen, kyseessä olevat proteiinit ja synteettiset peptidit ovat käyttökelpoisia TNF:n aktiivisuuden kliinisissä arvioinneissa kasvaimissa, syövässä sekä malarian hoidossa sekä niihin liittyvissä käsittelyissä ja menetelmissä.

Jälleen kuvissa 4 ja 5 on esitetty erilaisia sarjoja degeneroituja TNF-DNA-koettimia, joita syntetisoitiin käyttämällä tavanomaista fosfoamidi-DNA-synteesitekniikkaa aminohapposekvenssien perusteellä, jotka määritettiin TNF-fragmenteille 3 ja 4. Katso esim. Tetrahedron Letters. 22, ss. 1859-62 (1981). Esimerkiksi TNF:n fragmentin 3 aminohapposekvenssin perusteella, joka ulottuu lysiinistä (AA #2) alaniiniin (AA #12), syntetisoitiin neljä 32 yksikön polymeeriä (RAB TNF3-I - RAB TNF3-IV), joissa on nukleotidin paikanvaihdokset asemissa 4-6-19-21. Katso kuva 4, paikanvaihdokset ovat alleviivatut. Konstruoitiin myös 60 oligonukleotidin mittainen, ·'*; pitemmältä matkalta päällekkäin menevä koetin. Katso kuva 4.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisen TNF: n fragmentin 4 amino- . . happosekvenssin perusteella, joka ulottui Trp:sta (AA #3)

Leu:iin (AA #9), syntetisoitiin neljä degeneroitunutta, 20 *;·/ yksikön mittaista sarjaa (RAB TNF4-A1 - RAB TNF4-A4). Katso • * · '·'·* kuva 5. Näillä 20 yksikön mittaisilla polymeereillä oli nukleotidien paikanvaihdos asemissa 12 (alleviivattu kuvassa ·.*·· 5). Myöhempien hybridisaatiotyyppien perusteella, jotka suo- ·.· : ritettiin kaniinin geenistöperäisen DNA:n Southern-bloteissa, kyseessä olevan keksinnön mukaisten erilaisten koetinsarjojen ... kanssa, RAB TNR4-A2-koetin jaettiin edelleen kolmeen alaryh- ; mään, asemassa 15 sijaitsevan nukleotidimuutoksen perusteella <2 86194 (katso kuva 5, paikanvaihdos on alleviivattu). Aminohapposekvenssin perusteella, joka ulottuu fragmentin 4 Phe:sta (AA #13) Asptiin (AA #19), konstruoitiin toinen kuuden sarja, joka käsitti 20 yksikköä (RAB TNF4-B1-RAB TNF4-B6). Lopuksi valmistettiin pitkä päällekkäin menevä koetin, joka käsittää kyseessä olevan keksinnön mukaisen TNF-proteiinin tämän osan lähes koko tunnetun aminohapposekvenssin. Katso kuva 5.

Ennen kyseessä olevan keksinnön mukaisten DNA-koettimien käyttöä seulontaan, kukin yksisäikeisistä DNA-koettimista merkattiin 5'-päässä T4-polynukleotidikinaasin avulla. Pitemmän matkaa päällekkäin menevät koettimet merkattiin korkeaan spesifiseen aktiivisuuteen (>108/ug koetin-DNA:a) täydentämällä, Klenow-polymeraasia käyttäen, kaikkien neljän t*32p-deoksinukleosidi-trifosfaatin läsnäollessa.

Esimerkki 7

Kaniinin geenikir taaton seulonta

Vaikka mikä tahansa DNA-kokoelma saatetaan seuloa käyttökel-poisesti yhdellä tai useammalla kyseessä olevan keksinnön mukaisista koettimista, on tavallisesti edullista seuloa ·“*. ensin DNA-kirjasto, joka on peräisin samalta eläimeltä, jota käytettiin eristettäessä polypeptidiä, jolle synteettinen DNA-koetin perustui. Samasta eläimestä peräisin olevan DNA-. kirjaston käyttö sallii hybridisaatio-olosuhteiden olevan ;*V enemmän täsmällisyyttä vaativia, koska koettimen ja geeni-··/ peräisen DNA : n vastaavien alueiden välinen homologia tulee *·’·' olemaan korkea. Saman eläinlähteen käyttö sekä DNA-koettimeen että DNA-kirjastoon on erityisen tärkeää, kun käytetään • · ·.*·* lyhyitä DNA-koettimia. Se on vastaavasti vähemmän tärkeää, ·*♦ *. .* : kun käytetään pitkiä DNA-koettimia. Sen jälkeen kun DNA on . valittu seulomalla sellaisten lyhyiden koettimien avulla, * ♦ » * sitä, joko yksinään tai yhdistelmätaagin tai -plasmidin muo- • · dossa, saatetaan sitten käyttää valitsemaan hybridisaation ·/ avulla läheisiä DNA:ita, DNA-kirjastoissa, jotka ovat peräi-: *: sin sameilta eläimeltä tai muilta eläimiltä, ihminen mukaan- 43 8 6 1 94 luettuna. Koska valittu DNA on pitempi kuin alkuperäiset synteettiset koettimet, joita on käytetty sen eristämiseen, ja siitä syystä se todennäköisemmin sisältää täydellisesti yhteensopivia alueita, on edullisempaa käyttää lyhyitä synteettisiä koettimia DNA-sekvenssien valitsemiseksi samoista lajeista ja näiden koettimien avulla valittujen DNA:iden käyttämiseksi lajien sisäisten DNA:iden valintaan.

Yllä esitettyjen periaatteiden mukaisesti seulottiin kaniinin geenistön DNA:n kloonattu kirjasto, joka oli oleellisesti konstruoitu Maniatus et al.:n esittämien menetelmien mukaisesti, "The Isolation Of Structural Genes From Libraries of Eukaryotic DNA", Cell 15, ss.687-701 (1978).

Kyseessä olevan keksinnön mukaista kirjastoa varten siirros-tettiin kaikkiaan noin 6 x 10^ faagia, ja ne siirrettin peräkkäin kahdelle nailonsuodattimelle (PAL) (käyttäen vastaavasti 5 ja 8 minuutin adsorptioaikoja). Denaturoinnin, neutraloinnin ja faagi-DNA:n kiinnittämisen jälkeen suodattimille, kirjasto seulottiin suurspesifisellä aktiivisuudella merkatulla (0,5-1,0 x 10? iskua minuutissa/ pikomooli DNA), '··· synteettisellä nukleotidikoettimella RAB TNF3-III (kuva 4) (tämä koetin on tällöin valittu esianalyysien perusteella, jotka on suoritettu Southern-pilkkomisen ja -hybridisaation

' avulla). Suodattimet esihybridisoitiin 4 x SSC:ssä, 15 mM

* * * « ' natriumfosfaatissa (pH 7), 10 x Denhardtin liuoksessa, t-RNA:ssa (250 ug/ml) sekä 7 %:isessa SDS:ssä, 50°C:ssa, 2 • * i \\ : tunnin ajan. Pesun jälkeen ne hybridisoitiin merkatun koet- timen kanssa 10 %:isessa dekstraanisulfaatissa, 5 x SSC:ssä, 10 x Denhardtin liuoksessa, 20 mM natriumfosfaatissa (pH 7), .·. : t-RNA: ssa (500 ug/ml) sekä 7 %:isessa SDS:ssä, 50cC:ssa, yli 4 .*« yön. Sen jälkeen kun suodattimet oli pesty 50°C:ssa, « t · 2 x SSC:ssä, 1 %:isessa SDS:ssä, suodattimet määritettiin : valokuvaamalla.

• · · ·· * ,· · · «#»« · ✓ .« • * 44 861 94 Tämän kloonauksen tuloksena saatiin 16 kaksinkertaista, positiivista hybridisaatiokloonia. Vastaavat plakit eristettiin näistä 16 positiivisesta kloonista, ja niiden DNA analysoitiin Southern-blottien avulla, käyttämällä DNA-koet-timia, jotka olivat peräisin molemmista TNF-fragmenteista 3 ja 4. Eräässä näistä analyyseistä havaittiin, että 16 faagin DNA:n tuotteiden, jotka oli saatu EcoRI-restriktioentsyymin avulla, Southern-blotit oligonukleotidikoettimen RAB TNF3-III:n ja RAB TNF4-A2-3:n kanssa antoivat yhden faagin, joka sisälsi EcoRI-vyöhykkeen. joka hybridisoitui molempien koettimien kanssa. Koska tämä tietty klooni sisältää DNA-segmenttejä, jotka hybridisoituvat koettimiin, jotka vastaavat kyseessä olevan keksinnön mukaisen, TNF:lie läheisen po-lypeptidin molempia fragmentteja 3 sekä 4, pääteltiin sen sisältävän hyvin todennäköisesti suurimman osan kaniinin TNF-geeniä tai, muutoin koko geenin.

ESIMERKKI 8

Hiiren ia humaani cDNA-kiriastoien Plus-miinus-seulonta Tämä seulonnan lähestymistapa perustui humaani ja hiiren DNA-koettimien kahden tyypin käyttöön rinnakkain, toisen ollessa syntetisoitu cDNA:n avulla poly A+ rnä:n sakkaroosi-gardientti-jakeista, joilla oli TNF:n maksimaalinen biologien aktiivisuus oosyytteihin suoritetun injektion jälkeen (katso esimerkki 3), toisen ollessa syntetisoitu cDNA:n avulla, vastaavalla (vastaavilla) jakeella (jakeilla), jotka oli saatu indusoimattomista viljelmistä. Ensimmäistä nimitettiin plus-koettimeksi, viimeksi mainittua miinus-koettimeksi.

Plus- ja miinus-koettimia varten cDNA syntetisoitiin oleellisesti esimerkissä 4, osassa a, kuvatulla tavalla, paitsi että käytettiin 0,2 mM deoksinukleosidi-trifosfaattia ja lisättiin

II

45 861 94 x32p~dATP:a (7000 Ci/mmooli, Amersham, Buckinghamshire, Englanti) konsentraatioon 2 juM saakka.

Käytettiin plus- ja miinus-, hiiren ja humaanin, koettimia rinnakkain, vastaavasti hiireltä ja ihmislähteistä peräisin olevien, kyseisen keksinnön mukaisten cDNA-kirjastojen satunnaisesti valittujen kopioiden kahden sarjan seulomiseksi (katso esimerkki 4). Kyseessä olevan keksinnön mukaisten cDNA-kirjastojen kopiot valmistettiin Hanahanin ja Meselsonin menetelmän mukaisesti "Plasmid Screening At High Colony Density", Gene 10 ss. 63-67 (1980). Bakteeriperäiset pesäkkeet liuotettiin suodattimilla (Millipore, HATF, 0,45 jum) , suurin piirtein Maniatis et ai. m, julkaisussa ''Molecular Cloning'' (julk. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y.), ss. 326-328 (1982), kuvaamalla tavalla.

Näiden kirjastojen, kyseessä olevan keksinnön mukaisen hybri-disaation seulomiseksi, käytettiin hiiren plus- ja miinus-koettimia hiiren cDNA-kirjaston seulomiseksi ja humaani plus-ja miinus-koettimia humaanikirjaston seulomiseksi. Kustakin kirjastosta tutkittiin ainoastaan ne kloonit, jotka olivat positiivisia plus-koettimella, mutta eivät miinus-koettimel-.··. la.

I I

Yllä kuvatun plus/miinus-seulonnan tuloksena, joka suoritettiin hiireltä peräisin olevan kirjaston 5000 kloonille, jotka i oli valittu satunnaisesti kyseessä olevan keksinnön mukaises ta, 30 000 kloonia käsittävästä kirjastosta, valittiin 55 positiivista kloonia lisäanalyysiä varten. Humaanikirjaston plus/miinus-seulonnan tulokset olivat epäselvät. Niinpä ei toimittu edelleen humaani cDNA-kirjaston tämän plus/miinus-seulonnan mukaisesti. Sen sijaan seulottiin kyseessä olevan keksinnön mukainen cDNA-kirjasto, kuten myöhemmin kuvataan.

« 86194 ESIMERKKI 9

Hiiren ja humaani TNF:n suhteen spesifisten cDNA-kloonien eristäminen a) uijyt-in jHE.-n guhtqfin.-spegi.fifiep cPNA.;n gyifii.äminan

Poimittiin ja valittiin 55 cDNA-kloonia, joita kuvattiin yllä plus/miinus-seulonnassa, ja niiden annettiin kasvaa yksittäisesti. Sitten plasmidi-DHA erotettiin yli yön kasvatetusta viljelmästä (kasvatettu 5 ml:ssa Luria-lihalientä, jossa oli 10 pg/ml tetrasykliiniä), suurin piirtein H.C. Birnboimin ja J. Dolyn kuvaamalla tavalla, Nucl. Acids. Res.. 7, ss. 1513-23 (1979), ja kustakin kloonista käytettiin 11 ryhmää jatkotutkimuksiin. Plamidien näistä ryhmistä erotettiin insertti-DNA:t käyttämällä Pst I-restriktiota, jota seurasi agaroosi-geelielektroforeesi. Tämän jälkeen, kloonien näistä 11 ryhmästä peräisin olevat insertti-DNA:t siirrettiin ja kiinnitettiin nitroselluloosamembraanisuodattimille (0,45 pm, Millipore), olennaisilta osiltaan E.M. Southernin kuvaamalla tavalla, J. Mol. Biol.. 98, ss. 503-17 (1975).

Sitten suodattimeen sidottuja DNA:itä seulottiin edellä kuva- .***. tulla tavalla, käyttämällä pitkiä, päällekkäin meneviä koet- timia, jotka olivat peräisin kaniinin TNF: n fragmenteista 3 \ ja 4. Katso kuvat 4 ja 5. Tätä hybridisaatioseulontaa varten . . suodattimet ensin esihybridisoitiin 42°C:ssa, yön ajan, 20 ♦ * · “/ %:isessa formamidissa (ionit poistettu käyttämällä hartsi- - seostäytettä) , 5 x SSC:ssa, 5 x Denhardtin liuoksessa, 5 mM • · · EDTA:ssa, 50 mM natriumfosfaattipuskurissa (pH 6,5) sekä 20 ug/ml E. colin DNA:ssa (denaturoitu keittämällä 7 minuutin *.**· ajan sekä äänikäsitelty käyttämällä MSE Soniprep 150 äänikä-: sittelylaitetta, 3x1 minuutin ajan, 25 -30 u) . Sitten suo- dattimia inkuboitiin 42°C:ssa 40 tunnin ajan, merkattujen • * · *..* koetin-DNA: iden läsnäollessa (katso esimerkki 6) (denaturoitu • · *;* keittämällä 7 minuutin ajan), 20 %:isen formamidin (ionit * · * • * · • · · 47 861 94 poistettu seoshartsitäytettä käyttämällä), 5 x SSC:n, 5 x Denhardtin liuoksen, 5 mM EDTArn, 25 mM natriumfosfaatti-puskurin (pH 6,5) sekä 20 ug/ml E.colin DNA:n (valmistettu kuten aiemmin on esitetty) läsnäollessa. Sen jälkeen kun suodattimet oli pestu kaksi kertaa, 1 tunnin ajan 35°C:ssa, 2 x SSC:n ja 0,1 \:isen SDS:n läsnäollessa, ne analysoitiin valokuvaamalla .

Yksi ryhmä (ryhmä 6) antoi yhden positiivisen kloonin käyttämällä koetinta, joka oli peräisin fragmentista 3. Niinpä, sitten seulottiin tämän ryhmän 5 yksittäistä jäsentä, suurin piirtein yllä kuvatulla tavalla, ja eristettiin kaksi positiivista kloonia -- molemmat identtisiä. Tätä kloonia nimitettiin p-mTNF-1:ksi.

Sitten seulottiin 55 positiivisen plus/miinus-kloonin kyseessä olevan keksinnön mukainen kokoelma p-mTNF-1:n Rsal-fraa-mentin kanssa, joka ensin oli radioaktiivisesti merkattu nick-translaation avulla, ja valittiin muut positiiviset kloonit -- p-mTNF-2 sekä p-mTNF-3.

Sitten varmistettiin näistä kolmesta kloonista kaikkien kolmen pystyvän valitsemaan TNF:n suhteen aktiivinen mRNA kyseessä olevan keksinnän mukaisesta poly A+ RNA:sta. Tämän suorittamiseksi poimittiin valitut kloonit ja niitä kasvatet-V tiin yksittäin. Sitten plasmidi-DNA eristettiin yön yli kas- vatetuista viljelmistä (kasvatettu 400 ml:ssa Luria-liha-: lientä, 10 pg/ml tetrasykliiniä), pääkohdittain Pullevblank et ai.;n kuvaamalla tavalla, "A Method For The Purification Of E, coli Plasmid DNA By Homogenous Lysis And Polyethylene-Glycol Precipitation", Molec. Biol. Rep. 9, ss. 191-195 . . (1983).

Noin 30 μg kutakin valmistetta puhdistettiin sitten NACS 32 Prepack -pylväässä (BRL, Neu-Isenberg, Länsi-Saksa) toimittajan suosittelemia olosuhteita käyttäen, DNA saostettiin 48 861 94 etanolilla, liuotettiin siihen uudelleen, pilkottiin Eco Rl:llä (Boehringer Mannheim, Länsi-Saksa), uutettiin fenolilla ja saostettiin.

Pilkottu plasmidi-DNA sidottiin sitten membraaniin, pääasiallisesti Katafos et ai.:n kuvaamalla tavalla, “Determination Of Nucleic Acid Sequence Homologies And Relative Concentrations By A Dot Hybridization Procedure"Nucl. Acid. Res., ss. 1541-1552 (1979), paitsi että (1) käytettiin geeniseulaa (Gene Screen, New England Nuclear, Boston, Massachusetts), nitroselluloosasuodattimien sijasta; (2) ammoniumasetaatin konsentraatiota nostettiin 1 M:sta 2 M:iin; ja (3) suodattimia ei käsitelty tyhjiössä, vaan sen sijaan niitä käsiteltiin UV:llä pääasiallisesti Churchin ja Gilbertin kuvaamalla tavalla, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 81, ss. 1991-95 (1984) .

Sitten seulottiin suodattimet, joihin EcoRI:llä pilkotut plasmidi-DNA:t olivat sidotut, hybridisoiraalla poly A+ RNA:n kanssa (sakkaroosi-gradienttijakeista, jotka olivat osoittaneet maksimaalista aktiivisuutta oosyytteihin suoritetun ruiskutuksen jälkeen, katso esimerkki 3). Sidottu RNA eluoi-tiin suurin piirtein Parnesin et ai.:n kuvaamalla tavalla, . "Mouse B2 Microglobulin cDNA Clones: A Screening Procedure

For cDNA Clones Corresponding To Rare mRNAs", Proc. Natl. Acad Sci. USA. 78, ss. 2253-2257 ( 1981 ), paitsi että (1) RNA . . eluoitiin 5 jjg: n läsnäollessa poly A- RNA:a (oligo dT:n ajo ;· * selluloosan läpi) ja (2) fenoloinnin sijasta RNA saostettiin :: kahdesti .

Takaisin saatu RNA ruiskutettiin Xenoous laevis-oosvvtteihin *.’· esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, ja sopivan inkubointiajän • : : jälkeen (katso esimerkki 3), elatusaine määritettiin TNF:n aktiivisuuden suhteen esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Yllä kuvattua hybridi-valintaa käyttäen määritettiin se, että ; P mTNF -1:n, p-mTNF-2:n ja p-mTNF-3:n insertit kukin valitsi- 49 861 94 vat TNF:n suhteen aktiivisen RNA:n kyseessä olevan keksinnön mukaisesta poly At RNA:sta.

Seuraavaksi analysoitiin restriktioanalyysin avulla kyseessä olevan keksinnön mukaiset kolme hiiren TNF-kloonia. Katso kuva 6. Sellainen analyysi havainnollisti, että kolme kloonia oli peräisin samasta RNA:sta ja sen tähden samasta geenistä. Näiden kloonien yksityiskohtainen restriktiokartta esitetään kuvassa 6. Kolmella kloonilla oli TNF:ään läheisesti yhteen kuuluvia inserttejä, joissa oli vastaavasti ±1550, ±350 sekä ±1000 emäsparia.

Määritettiin myös yhdistelmä-insertin täydellinen DNA-sek-venssi p-mTNF-3:sta, käyttämällä Maxam-Gilbert-tekniikkaa [A.M. Maxam ja W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. OSA. 74, ss. 560-64 (1977)]. Tämä sekvenssi sekä siitä johdettu aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 7.

Kuvassa 7 esitetään yhdistelmä-TNF:ään liittyvän DNA-sekvens-sin, joka on peräisin kloonien p-mTNF-1 ja p-mTNF-3 sekven-toinnista, 1644 nukleotidin nukleotidisekvenssi. (Kloonin p-mTNF-1 cDNA-insertti, johon sisältyy 3' koodittamaton alue ja joka ulottuu ATG-aloituskodoniin saakka (katso kuva 7)). p-mTNF-3:n cDNA-insertti sisälsi koko koodittavan sekvenssin hiiren esi-TNF:a varten sekä osan 5'koodittamatonta aluetta.

: ‘ : Katso kuva 6. Sekvenssi on numeroitu nukleotideiksi 1-1644.

*:**: Yhtenäisin viivoin kehystetyt alueet (ATG ja TGA merkitsevät ; hiiren oletettuja esi-TNF:n aloitus- ja lopetuskodoneja . Kat- : .·. koviivoin kehystetyt alueet (nukleotidit 1614-19 ja 1630-35) merkitsevät oletettuja AAUAAA-polyadenylointisignaale ja. Jatkuva lukuvaiheistus on olemassa aloitus-kodonin (ATG) ja lo-petus-kodonin (TGA) välillä. Aminohapot, joita koodittavat kodonit tuossa lukuvaiheistuksessa, on merkitty näiden kodo- nien alapuolelle käyttämällä tavanomaisia, yksinkertaisia ; : kirjainmerkintöjä. Hiiren TNF:n oletettu signaalisekvenssi (määritetty vertailemalla humaani TNF: n osittaisen, N-termi- 50 8 6 1 94 naalisen aminohapposekvenssin kanssa, kuvattu alempana) on merkitty katkoviivoin näiden aminohappojen alle. On kuitenkin tunnustettava, että koska hiiren TNF:llä on kaksi amino-happo-deleetiota verrattuna humaani TNF:ään, kypsän proteiinin N-päätteen lähellä tai N-päätteessä, kyseessä olevan keksinnön mukainen leusiinin merkintä hiiren kypsän TNF:n ensimmäiseksi N-terminaaliseksi aminohapoksi (kuva 7) edellyttää varmistusta hiiren puhdistetun, luonnonmukaisen TNF:n proteiinisekventoinnin avulla, kuten on kuvattu humaani TNF:n suhteen. Kuvassa esitetään oletettua kypsän TNF:n sekvenssiä yhtenäisellä viivalla. Yhtenäisin viivoin kehystetyt alueet tässä aminohapposekvenssissä merkitsevät glykosylointisig-naalia (N-X-S/T) sekä kahta kysteiinitähdettä (C), joiden uskotaan kytkeytyvän disulfidisiltaan.

b) Humaani TNF;lie spesifisen cDNA kloonin eristäminen

Humaani TNF:lie spesifisen cDNA-kloonin valitsemiseksi kasvatettiin ensin sarja kyseessä olevan keksinnön mukaisia humaani TNF cDNA-klooneja (jotka oli valittu satunnaisesti kyseessä olevan keksinnön mukaisesta, 60 000 cDNA-kloonia käsittävästä kirjastosta, kts. yllä) nitroselluloosasuodatti-milla (läpimitaltaan 0,45 um, Millipore) ja ne liuotettiin ja kiinnitettiin suodattimille suurin piirtein D. Hanahanin ja M. Meselsonin kuvaamalla tavalla, Gene. 10, ss. 63-67 (1980). Tämä kirjasto seulottiin käyttämällä PvuII-PvuII-res-triktiofragmenttia, joka oli saatu kyseessä olevan keksinnön mukaisesta hiiren TNF cDNA:sta (p-mTNF-1) (tämä fragmentti menee päällekkäin kypsää hiiren TNF:a koodittavan alueen osan kanssa, katso kuvat 6 ja 7). Tämä DNA-fragmentti puhdistettiin agaroosi-geelielektroforeesilla ja se radiomerkattiin nick-translaation avulla, suurin piirtein kuten P.W.J. Ringby et ai. ovat kuvanneet, J. Mul. Biol., 13, ss. 237-51 (1977). Tähän hybridisaatioon käytettiin olosuhteita, jotka olivat olennaisilta osiltaan samat kuin olosuhteet, joita käytettiin kyseessä olevan keksinnön mukaisen, hiiren TNF:lie spesifisen cDNA-kloonin p-mTNF-1:n eristämiseen.

si 86194

Vaikka havaittiin suhteellisen korkea tausta, eräs pesäke antoi huomattavasti voimakkaamman signaalin. Tämä tulos varmistettiin Southern-hybridisaation avulla, aiemmin kuvatulla tavalla. Tämä klooni nimitettiin p-hTNF-1:ksi. Ihmisen geenistön DNA-kirjastosta (joka oli valmistettu pääkohdittain samalla tavalla kuin on kuvattu kyseessä olevan keksinnön mukaisen, kaniinin geenistövaraston suhteen, yllä) valittiin myös muutamia positiivisia klooneja saman PvuII-PvuII-koettimen avulla.

Kuvassa 8 on esitetty p-hTNF-1:n osittainen restriktiokart-ta. TNF:ään läheisesti liittyvä insertti p-hTNF-1:ssä on 1650 emäsparin mittainen, kooltaan suunnilleen sellainen, mikä tarvitaan vastaamaan 16S humaani TNF mRNA-jakeesta peräisin olevan cDNA:n täyttä kökoa.

Kuvassa 9 on esitetty p-hTNF-1:n cDNA-insertin 1606 nukleotidin nukleotidisekvenssi. Sekvenssi on numeroitu nukleotideiksi 1-1606. Yhtenäisin viivoin kehystetyt alueet (ATG ja TGA) merkitsevät oletetun humaani esi-TNF:n aloitus- ja pää-töskodoneja. Aloituskodonin (ATG) ja päätöskodonin (TGA) välillä on olemassa jatkuva lukavaiheistus. Aminohapot, joita ...· kodonit koodittavat tässä lukuvaiheistuksessa, on merkitty kodonien alapuolelle käyttäen tavanomaisia kolmen kirjaimen lyhennyksiä. Humaani TNF:n oletettua signaalisekvenssiä (mää-: ritetty vertailemalla indusoiduista U937-soluista puhdiste- • tun, luonnonmukaisen humaani TNF:n osittaisen N-terminaalisen aminohapposekvenssin kanssa (jäljempänä)) merkitään katkoviivoin, jotka sijaitsevat näiden aminohappojen alla. Kypsää hu-. . maani TNF-.a merkitään yhtenäisellä viivalla. Kypsän humaani ./ TNF:n uskotaan olevan glykosyloitumaton. Tämä käsitys perus tuu glykosylointisignaalin puuttt.umiseen kyseessä olevan kek-| ' ' sinnän mukaista humaani TNF:a koodittavasta sekvenssistä.

Kuitenkin, kyseessä olevan keksinnön mukaisen humaani TNF: n 52 861 94 aminohapposekvenssissä on kaksi kysteiiniä (C). Näiden kys-teiinien uskotaan kytkeytyvän disulfidisillan muodostamiseen.

ESIMERKKI 10 TNF:n puhdistaminen humaanisoluista

Kuvassa 10 on kaaviomaisesti esitetty kyseessä olevan keksinnön mukaisen menetelmän eräs suoritusmuoto TNF:n kaltaisten polypeptidien puhdistamiseksi TNF:n valmistusta varten indusoitujen U-937-solujen elatusaineesta (katso esimerkki 2). Kuten kuvassa 10 esitetyssä, kyseessä olevan keksinnön eräässä suoritusmuodossa on havainnollistettu, yhdistettiin useiden ϋ-937-induktioiden elatusaine -80°C:ssa, kunnes saatiin 65 000 ml:aa, määrä jonka arveltiin antavan riittävästi humaani TNF:a aminohapposekventointia sekä vasta-aineen valmistusta varten. Yhdistetty liuos sisälsi noin 3,0 x 103 yksikköä TNF/ml ja sen spesifinen aktiivisuus oli noin 2,7 x 10^ yksikköä/rag proteiinia, TNF:n aktiivisuuden ollessa määritetty aiemmin kuvatulla tavalla. Katso esimerkki 1.

a) TNF:a sisältävän elatusaineen väkevöinti

Elatusaine sulatettiin lämpimässä huoneessa, 37°C:ssa, ja niin pian kuin se oli sulanut, se siirrettiin kylmähuoneeseen (4°C) . Pooli, jonka suuruus oli 65 000 ml, väkevöitiin noin 80-kertaisesti Pellicon-kasetti - järjestelmällä (Millipore, Bedford, Massachusetts). Elatusaine laskettiin peräkkäin V Pellicon -membraanikasetin läpi, jonka nimellinen molekyyli- painoraja (nmwl) oli 100 000 daltonia ja Pel1icon-membraani-kasetin läpi, jonka nmwl oli 30 000 daltonia. Paljon TNF-aktiivisuudesta kulki 100 000 daltonin kasetin läpi, mutta . · pidättyi 30 000 daltonin kasettiin. Vastasuodat.usta käyttä- ’ mällä, 30 000 daltonin pidättynyt elatusaine syrjäytettiin 20 mM:lla etarioliami ini-HCl (EA-C1) (pH 9,0) -puskurilla. Väke---· voinnin ja vastasuodatuksen jälkeen 8 10 ml liuosta sisälsi 53 861 94 6,0 x 104 yksikköä TNF/ml ja spesifinen aktiivisuus oli noin 6,8 x 104 yksikköä TNF/ml.

b) loninYaihtokromatografia

Kyseessä olevan keksinnön mukaisen, väkevöidyn elatusaineen humaani TNF-aktiivisuus erotettiin monista muista siihen sisältyvistä proteiineista käyttämällä TNF:n sitoutumisaffini-teettia anioninvaihtopylvääseen. Vaikka monet anioninvaihto-järjestelmät ovat tunnettuja, kyseessä olevaan käyttöön valittiin preparatiivinen mono-Q-pylväs (1 cm läpimitaltaan x 11 cm), Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Tämän suuruisen pylvään kuormituskapasiteetti on noin 200 mg proteiinia. Sen jälkeen kun pylväs on tasapainotettu 20 mM EA-Cl:lla (pH 9,0), siihen pantiin 200 ml kyseessä olevan keksinnön mukaista konsent-raattia, virtausnopeudella 2 ml/min. Sitten sidotut proteiinit fraktioitiin, käyttämällä lineaarista gradienttia 0 M -0,4 M NaCl, 10 mM EA-Cl:ssa (pH 9.0). Eluoitunut TNF-aktiivisuus saavuttaa huipun noin jakeessa 24, ja se eluoituu noin 0,16 M NaCl:n suolakonsentraatiolla. Tämä kuormitus- ja gra-dienttimenettely toistettiin uusimiskelpoisesti kolme kertaa, ja yhdistettiin jakeet, jotka sisälsivät TNF-aktiivisuutta. Yhdistetyt jakeet sisälsivät 3,0 x 106 yksikköä TNF/ml ja niiden spesifinen aktiivisuus oli 1,1 x 106 yksikköä TNF/ml proteiinia (katso kuva 10).

Koska kuormitetun proteiinin määrä kussakin ajossa oli juuri kyseessä olevan mono-Q-pylvään kuormitusrajojen sisällä, erottuminen ei ollut parasta mahdollista. Niinpä päätettiin laskea ensimmäisestä mono-Q-pylväästä saatu, TNF:a sisältävä pooli toisen mono-Q-pylvään läpi. Ensin pooli dialysoitiin yön yli 4eC:ssa, 2 x 1000 ml vastaan 10 mM EA-Cl:a (pH 9,0). Sitten kun pylväs oli tasapainotettu samalla puskurilla, pooli fraktioitiin pylväässä eluoimalla lineaarisella suolagra-dientilla, 0-0,2 M NaClra, 20 mM EA-Cl:ssa, (pH 9,0). Syntyvä liuos sisälsi 1,1 x 107 yksikköä TNF/ml, ja sen spesifinen aktiivisuus oli 2,3 x 106 yksikköä TNF/mg proteiinia (katso kuva 10).

s'· 86194 c) Geelisuodatus

Kyseessä oleva liuos fraktioitiin seuraavaksi käyttäen hyväksi molekyylipainojen välisiä eroja. Vaikka koko joukko sopivia geelisuodatusjärjestelmiä tunnetaan hyvin, kyseessä olevan keksinnön mukaiseen menetelmään valittiin käytettäväksi TSK-G 2000 SWG-pylväs (LKB, Bromina, Ruotsi) , jonka fraktioin-tialue proteiineille on 500-60 000 daltonia. Mono-Q poolia dialysoitiin yli yön, 4°C:ssa, 2 x 1000 ml:aa vastaan 1 M NaCl-.a, joka oli 50 mM Tris-HCl:ssä (pH 7,4), ja dialysaatin tilavuus vähennettiin 0,85 ml.-ksi nopeasti haihduttamalla, käyttämällä Speed Vac-konsentrointilaitetta (Savant, Hicks-ville, New York). Sen jälkeen kun geelisuodatuspylväs oli tasapainotettu 1 M NaCl-.lla, joka oli 50 mM Tris-HCl:ssa (pH 7,4), pooli laskettiin pylvään läpi virtausnopeudella 1 ml/minuutti. TNF-aktiivisuus havaittiin alueella, jossa noin 40 000 daltonin suuruiset proteiinit eluoituivat. Tämän frak-tioinnin jälkeen TNF:a sisältävä liuos sisälsi 3,4 x 106 yk-sikköä/ml, ja sen spesifinen aktiivisuus oli noin 1,1 x 107 yksikköä/mg proteiinia (katso kuva 10). Tämä puhdistus on karkeasti 400-kertainen kyseessä olevan keksinnön • * ♦ mukaisesta U-939-solun elatusaineesta.

Fraktioitu pooli analysoitiin SDS-PAGE:lla (12¾). Vallitseva f vyöhyke havaittiin asemassa, joka oli samanarvoinen noin [ 17 000 daltonin molekyylipainon kanssa. Havaittiin myös hi- ·.·. taammin liikkuva, heikompi vyöhyke noin 18 000 molekyylipainon kohdalla. Nämä tulokset tukevat voimakkaasti käsitystä, . . että luonnonmukainen humaani-TNF saattaa olla koostunut kah-desta proteiiniyksikostä.

: ‘ : Kyseessä olevan keksinnön mukaista, puhdistettua humaani TNF : a käytettiin osittaisen N-terminaal isen aminohapposek- 55 861 94 venssin määrittämiseen. Tätä sekvenssiä kuvataan kuvassa 11, sekvenssin muutokset, jotka on esitetty lisäyksinä yläpuolella, tai sen deleetiot, aminihapot, johdettiin DNA-sekvenssis-tä. Tätä sekvenssiä käytettiin määritettäessä oletettua sig-naalisekvenssiä sekä kypsää koodattavaa sekvenssiä, joita kyseessä olevan keksinnön mukainen humaani-TNF-klooni kantoi (yllä).

ESIMERKKI 11

Humaani-TNF:n kaltaisten polypeptidien ekspressio E. colissa

Kuten kuvassa 12 on esitetty, konstruoitiin yhdistelmä-DNA-molekyyli kyseessä olevan keksinnön mukaisen, TNF:n kaltaisen polypeptidin valmistamiseksi, käyttämällä -johdettua ekspression kontrollointisekvenssiä (katso kuva 12). Tätä konstruktiota varten ensin valmistettiin ja puhdistettiin humaani TNF:a koodattavan, kyseessä olevan keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin 578 emäspari Ava I - Hind III -fragmentti. Tämä fragmentti koodittaa humaani-TNF:a alkaen kypsän sekvenssin aminohaposta 8 (kuva 12) (kodoni aminohappoa 8 (Pro) varten on Ava I -restriktiokohdan esiinpistävä 5'-pää). Vaikka tämä TNF:n DNA fragmentti eristettiin cDNA-kloonista kyseessä olevan keksinnön mukaisessa lambda gt10 cDNA-kirjastossa : (yllä), olisi sama fragmentti voitu eristää p-hTNF-1:stä käyttämällä Aval : ä ja EcoRI: ä (katso esimerkki 9(b)).

: .·. Seuraavaksi valmistettiin Cla I - Ava T synteettinen kytkin, . - joka koodittaa puuttuvia TNF-aminohappoja (katso kuva 12).

;Tähän fragmenttiin sisältyy päällekkäin menevä Ava I 5'-pää, ' * joka on komplementaarinen 578 emäspari Ava I - Hind III TNF- fragmentin vastaavalle osalle. Valmistettiin ja puhdistettiin myös pBR322-trp-INF-: ksi nimitetyn plasmidin suurempi Cla I - Hind III -fragmentti (katso kuva 12).

56 861 94 Näiden kolmen DNA-fragmentin kytkemisen jälkeen transformoitiin E. colin kanta C600, syntyvän pBR322-trp-hTNF-yhdistel-mä-ekspressiovektorin kanssa (kuva 12). Sitten transformoitua isäntää kasvatettiin ravistellussa pullossa yön yli, 37°C:ssa rikkaassa, fosfaatilla puskuroidussa elatusaineessa ( 1 sero-li, hiivauute, kasaminohappoja). Käymisen jälkeen solut liuotettiin SDS-urea-puskurissa sekä analysoitiin solun valmistamien proteiinien suhteen SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesin avulla. Tällä geelillä havaittiin vyöhyke, joka vastasi hTNF:n aktiivisuutta. Tämä aktiivisuus vastasi noin 10 % E. colin valmistamien proteiinien kokonaismäärästä.

Sitten pL-T4:n ekpressiota kontrolloiva sekvenssi korvattiin pBR322-trp-hTNF:ssä sijaitsevalla trp-sekvenssillä eristämällä ja puhdistamalla pienempi pBR322-pL-T4-HIL-2:ksi nimitetyn plasmidin pienempi Pst I - Cla I restriktiofragmentti (1200 emäsparia) (kuva 12). Kuten kuvassa 12 on esitetty, tämä fragmentti sisältää osan geeniä, joka koodittaa ampisilliini-resistenssiä, sekä täydellistä pL-T4:ää säätelevän sekvenssin. pBR322-trp-hTNF:ää käsiteltiin rinnakkain restriktio-entsyymillä Pst I sekä Cla I, ja suurempi fragmentti, joka sisälsi hTNF:a koodittavan sekvenssin, eristettiin ja puhdistettiin. Sitten kaksi fragmenttia yhdistettiin pBR322-pL-T4-hTNF:n valmistamiseksi (kuva 12).

Ekspression määrittämiseksi E. colin kanta C600 transformoitiin pBR322-pL-T4-hTNF:llä, joka sisältää λcts-plasmidin, jonka kopioiden lukumäärä on alhainen. Käymisessä (1,5 litraa, 28°C, 24 h; sitten 42°C, 5 h) tämä konstruktio valmisti E. colin kokonaisproteiinien TNF-aktiivisuudesta 30 \.

Vaikka kyseessä olevassa pL-T4-järjestelmässä havaittiin korkea TNF:n kaltaisten polypeptidien ekspressio, valmiste oli t 57 861 94 mutantti-TNF, jossa oli histidiini toisena aminohappona luonnon mukaisen arginiinin tilalla. Ei tiedetä, mikä aiheutti yksinkertaisen emäsparin mutaation, jonka tuloksena syntyi kyseessä oleva mutantti-TNF. Kuitenkaan, paikan suhteen spesifisen mutaation jälkeen luonnon mukaiseksi TNF (arg)-sekvenssiksi (yksinkertainen emäsmutaatio), kyseessä olevalla konstruktiolla ei havaittu mitään TNF:n ekspressiota. RNA:n jonkin sekundaarisen muodon oletetaan vastaavan tästä ilmiöstä .

Niinpä yritettiin useita uusia konstruktioita. Kuvan 13 mukaisesti konstruoitiin plasmidi 153-pL-T4-hTNF-CA3(13), johon sisältyy pAT-153-deleetio (rop-). Tällä plasmidilla on synteettinen kytkijä Cla I - Ava I ("CA"), joka koodittaa oikean aminohapposekvenssin (se on, Aro on His:n tilalla) (katso kuva 13) ekspressiota. Se on olemassa yllä kuvatulla Xcts-repressorigeenillä varustettuna sekä ilman mainittua geeniä. Kuten kuvassa 13 on esitetty, suoritettiin Aco RI-kohdan de-leetio pBR322:ssa, nukleotidi 0, asemassa. Tämä plasmidi antoi TNF:n korkean saannon transformoidussa isännässä E. coli W3110 (katso taulukko 1). Kuitenkin, suoritetut käymiset ovat osoittaneet tämän konstruktion olevan epästabiilin varastointiolosuhteissa .

58 861 94

TAULUKKO I

Plasmidi : 153-pLT HNFT CA3

Kasvuolo- Ekspres-

IsäntäKanta-Mittakaava_suhteet__siotaso K12 lambda 1.5:1 37°C 24 h 4.3\ HB 101 (BA) 1.5:1 37°C yön yli 8.6\ HB 101 1.5:1 37°C yön yli 7.3\ MC1061 1.5:1 37°Cyönyli 8.3\ E.coli B 1.5:1 37°C yön yli 9.9\ W31 10 1.5:1 28°C yön yli, liuotus 22.0\ W3110 1.5:1 37°C yön yli, liuotus 18.0\ W3110 1.5:1 40°Cyönyli 11.7¾ W3110 1.5:1 43°Cyönyli 10.2% W3110 10.0:1 37eC yön yli 10.4% W3110 50.0:1 40°C yön yli 11.3¾ W3110 1.5:1 37°C yön yli 15.1¾ 37°C yön yli 0\ 37°C yön yli 5\ 37eC yön yli 0\

Luotiin myös plasmidi 153-pLT4-hTNH-CA3-cts-ter (DMS 3460), jolla on λ cts-repressoriaeeni. Tämän plasmidin muodostamiseksi suoritettiin deleetio 3' koodittamattomalle alueelle ja sisällytettiin synteettinen T4-päättäjä Hind III-asemassa. Tämä plasmidi antoi myös korkean ekspression, mutta se oli stabiilimpi kuin 153-pL-T4-hTNF-CA3(13) T4-päättäjän seurauksena (katso kuva 17). Tämä plasmidi pitäisi kasvattaa mieluummin 28*C:ssa, ja tuoreen elatusaineen lisäyksen jälkeen li 59 861 94 tulisi indusoida lämmön avulla 42°C:ssa.

Edullisemmassa suoritusmuodossa konstruoitiin 153-T4-hTNF-CA5-T4ter (DMS 3461), pL-osa on deleetion avulla poistettu, jolloin jäljelle jää ainoastaan eksperessiovektorin T4-osa (katso kuvat 14, 15 ja 16). Deleetion tuloksena oli hävinnyt sekvenssin osa, joka antoi antibioottiresistenssin ampisil-liinille. Sen tähden lisättiin antibioottiresistenssin mark-keri tetrasykliiniresistenssin suhteen, geenin päähän, ennen pl-sekvenssin postamista. Kyseessä olevan keksinnön mukaisella, edullisemmalla plasmidilla on synteettinen C5-kytkijä. Tämä kytkijä koodittaa luonnonmukaisen TNFrn seitsemää ensimmäistä aminohappoa (aina Aval-kohtaan saakka), ja sillä on seuraava sekvenssi: CGATACTAAA ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC GCTATGATTT TAC CAG TCT AGT AGA AGA GCT TGG Met Vai Arg Ser Ser Ser Ang Thr

Myös T4-päättäjällä on vaikutusta ekspression tasoon. Tämän tuloksena oli korkeata ekspressiota edustava vektori, joka valmistaa yli 25 % TNF:stä isäntäkannassa WA0O2 (katso taulukko 2) .

so 86194 TAULUKKO. ?

Plasaidi: 153-T4-hTNF CA5 T4ter

Isäntä- Kasvuolo- Ekspres- mittakaava_Mittakaava_suhteet_siotasjp W3110 1.5:1 37°C yön yli 25.5¾ W3110 1.5:1 37°C yön yli 6.9\ WA802 1.5:1 37°C yön yli 27.5¾ WA802 1.5:1 37°C yön yli 14.3¾ WA802 1.5:1 37°C yön yli 19.0¾ WA802 200.0:1 37°C yön yli 16.3¾

Muut TNF:t voidaan valmistaa käyttämällä yllä kuvattuja järjestelmiä. Esimerkiksi on konstruoitu hTNF-johdannainen, josta puuttuvat kypsän TNF:n ensimmäiset kaksi aminohappoa, -val-arg-,ja joka alkaa -met-ser-:illa, kun se ekspressoidaan E. colissa. Tätä johdannaista nimitetään pBR322-pL-T4 Δ2 hTNF-.ksi. Sen rakenne on muutoin sama kuin yllä kuvatulla pBR322-pL-T4 hTNF:llä (kuva 12).

pBR322-pL-T4 4 2 hTNF:n konstruoimiseksi valmistettiin synteettinen kytkijäfragmentti:

Aval 5'

CGATACTATGAGCAGCAGTCGTACC

TATGATACTCGTCGTCAGCATGGGGCT

Cla I

Tämä fragmentti kytkettiin suurempaan Clal-HindiI-fraament-tiin, joka saatiin pBR322-pL-T4 hTNF:stä (kuva 12) yllä kuva-

II

ei 86194 tun 578 bp AvaI-HindIII-fragmentin läsnäollessa.

Kalkissa yllä kuvatuissa konstruktioissa, pBR322-pL-T4-hTNF 153-pL-T4-hTNF-CA3(13), 153-pL-T4-hTNF-CA3-CTS-T4ter sekä 153-T4-hTNF CA5-T4ter, aloituskodoni ATG, joka on liitetty suoraan ensimmäiseen valiini-kodoniin, joka aloittaa kypsän humaani TNF:n (katso kuvat 12, 16 ja 17). pBR322-pL-T4- Δ2-hTNFrllä on ATG-kodoni liitetty Δ 2-TNF:n ensimmäiseen serii-ni-kodoniin. Niinpä, näiden konstruktioiden valmistama tuote on todennäköisesti Met-kypsä hTNF (tai pBR322-pL-T4-Δ 2-hTNF:n tapauksessa, Met-2-hTNF). Kuitenkin N-terminaalinen metioniini voidaan pilkkoa E.colin avulla kasvatuksen ja valmistuksen aikana, tai se saatetaan , jos on tarpeellista tai niin halutaan, pilkkoa tämän jälkeen valmistetusta proteiinista, käyttämällä saatavissa olevia entsyymejä sekä pilkko-mismenetelmiä.

Tulisi tietenkin ymmärtää, että kyseessä olevan keksinnön menetelmien mukaisesti olisi voitu käyttää myös muita TNF:a valmistavia konstruktioita sekä isäntiä. Esimerkiksi voitaisiin käyttää kaikkia yllä kuvattuja ekspressiovektoreita ja isäntiä poikkeamatta kyseessä olevan keksinnön piiristä. Ennen kaikkea voitaisiin muuntaa TNF:n kaltaisia polypeptidejä koodattavia DNA-sekvenssejä niiden ekspression tai tuotteen : puhdistamisominaisuuksien parantamiseksi. Esimerkiksi, ke- ..... miallisesti tai entsymaattisesti valmistettuja oligonukleoti- dejä voitaisiin insertoida TNF:n kaltaisen polypeptidin aloi-: tuskodonin eteen tai käyttää kodonien syrjäytystä tätä poly- peptidiä koodittavan DNA-sekvenssin N-terminaalisessa päässä. Tällä menetelmällä voitaisiin saada mRNA:n enemmän valin-. . nainen, primaarinen tai korkeamman kertaluokan rakenne. Vielä erityisesti, sekvenssi voidaan suunnitella siten, että aloittava AUG-kodoni on helposti luokse päästävässä asemassa ( ts.

se ei ole sekundaarisen rakenteen peitossa), joko hius-neularakenteen päässä tai muissa yksisäikeisissä alueissa. Lisäksi, Shine-Dalgarno-segmentin asema ja sekvenssit voidaan 62 861 94 samalla tavalla optimoida. Sellaisten rakenteellisten muunnosten tärkeyttä kuvaavat esimerkiksi D. Inserentant ja W. Riers julkaisussa, "Secondary Structure Of mRNA And Efficiency Of Translation Initiation", Gene. 9, ss. 1-12 (1980).

Muut lisäykset TNF .-n kaltaisten polypeptidien solusaannossa saatetaan saavuttaa lisäämällä geenien lukumäärää, jota voidaan solussa käyttää hyväksi, esim. käyttämällä suurkopio-plasmideja. Katso esimerkiksi, B. Uhlin et ai., "Plasmids With Temperature-Dependent Copy Number For Amplification of Cloned Genes And Their Products", Gene. 6, ss. 91-106 (1979).

Sen tähden, tulisi olla ymmärrettävää, että kyseessä olevan keksinnön mukaisia, TNF:iin liittyviä DNA-sekvenssejä saatetaan poistaa tässä yhteydessä kuvatuista vektoreista ja asettaa muihin vektoreihin ja isäntiin, niiden koodittamien valmisteiden lopullisen valmistuksen parantamiseksi.

Tulisi myös olla ymmärrettävää, että kyseessä olevan keksinnön mukaisia, TNF:n kaltaisia polypeptidejä saattaa myös sisältyä tuotteisiin yhteen liitettyjen proteiinien muodossa (esim. kytkettynä prokaryootista peräisin olevaan tai yhdis-telma-N-terminaaliseen segmenttiin, erittymisen suuntaamiseksi, stabiliteetin parantamiseksi, puhdistuksen tai muun N-terminaalisen segmentin N-terminaalisen metioniinin mahdollisen pilkkoutumisen parantamiseksi), esi-TNF:n muodossa : (esimerkiksi, aloittamalla nisäkäs TNF:n tai muun prokaryoot- ; tiperäisen signaalisekvenssin koko esisekvenssillä tai sen ' osalla, kypsän TNF:n kaltaisen polypeptidin muodossa tai f-met-TNF:n kaltaisen polypeptidin muodossa).

• · ”, Kyseessä olevan keksinnön mukaisen, TNF:n kaltaisen polypep tidin eräs erityisen käyttökelpoinen muoto, tai ainakin sen ·' prekursori, olisi kypsä TNF, jossa on sen N-päähän liittynee- .· nä helposti pilkottu aminohappo tai aminohappojen sarja. Sei- 63 861 94 lainen konstruktio sallisi proteiinin synteesin sopivassa prokaryootti-isännässä, jossa tarvitaan aloitussignaali, jota ei ole kypsässä TNF:ssä, sekä sellaisten ylimääräisten aminohappojen pilkkoutumisen in vivo sekä in vitro kypsän TNF: n valmistamiseksi. On olemassa sellaisia menetelmiä. Katso esimerkiksi Yhdysvaltain patentit 4,332,892, 4,338,397, 4,366,346 sekä 4,425,437.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisiin TNF-polypeptideihin sisältyy myös TNF:n kaltaisia polypeptidejä, joita ilmentymisessä koodittavat DNA-sekvenssit, joille ovat ominaisia erilaiset sekvenssit kuvattujen DNA-sekvenssien joidenkin tai kaikkien kodonien sijasta. Nämä substituoidut kodonit saattavat koodittaa aminohappoja, jotka ovat identtisiä niiden kanssa, joita syrjäytetyt kodonit koodittavat. Vaihtoehtoisesti, yhden kodonin tai kodonien yhdistelmän korvaaminen tai deleetio, joka johtaa yhden tai useamman aminohapon muunnokseen tai pitempään tai lyhyempään, TNF:n kaltaiseen polypep-tidiin, joka saattaa muuttaa valmistetun yhdisteen ominaisuuksia käyttökelpoisella tavalla (esim. lisätä kestävyyttä, lisätä liukoisuutta, lisätä terapeuttista aktiivisuutta tai pidentää puoliintumisaikaa), ovat osa tätä keksintöä.

.·". ESIMERKKI 12 TNF:n ia aktinomvsiini D.n yhdistelmien aktiivisuus in vivo '·* · Havainnollistettiin r-hTNF:n ja aktinomysiini D:n kliinisesti :·* · hyväksyttävien annosten vaikutus kasvaimien kasvunopeuteen jji vivo. Kolmelle ryhmälle, joihin kuhunkin kuului kahdeksan I’nude” hiirtä, ruiskutettiin ihonalaisesti 5 x 106 JAMA : (munasarjasyöpä) solua/hiiri, ja kasvaimien annettiin kasvaa seitsemän päivän ajan. Ryhmä I sai päivittäin vaurionsisäi-sesti ("i.l.") ruiskeen, joka sisälsi 1 x 105 yksikköä r-hTNF:a yksinään; ryhmä II sai saman päiväannoksen r-hTNF:a yhdistettynä 0,3 jug:n kanssa aktinomysiini D:ä, molemmat : : : i.l.; ryhmä III sai saman päivittäisen annoksen r-hTNF:a 64 861 94 (i.l.) yhdistettynä 0,3 ^ug:aan aktinomysiini D:ä, vatsakal-vonsisäisesti ruiskutettuna ("i.p."). Kahdeksan hiiren muodostama kontrolliryhmä ei saanut käsittelyä (ryhmä IV). Lopuksi, kuuden hiiren muodostama ryhmä (ryhmä V) sai päivittäisen annoksen, jonka suuruus oli 0,3 pg aktinomysiini D-.ä hiirtä kohti; kolme hiirtä ruiskutettiin i.l. ja kolme hiirtä ruiskutettiin i.p..

Päivittäisiä ruiskutuksia jatkettiin kolmen viikon ajan. Kukin kasvain mitattiin päivittäin, ennen käsittelyä. Kuten on esitetty kuvissa 18 ja 19, havaittiin jyrkkä kasvaimen kasvun estyminen ja vieläpä kasvaimen taantuminen ryhmässä II, jota oli käsitelty TNF:llä ja aktinomysiini D:llä (i.l.). Kaikki muut ryhmät havainnollistivat kasvaimen kasvun, joka oli samanlainen kuin kontrolliryhmällä oli osoitettu.

Esimerkkeinä mikro-organismeista ja yhdistelmä-DNA-molekyy-leistä, joita on valmistettu kyseessä olevan keksinnön mukaisilla menetelmillä, ovat viljelmät, jotka on tallennettu vil-jelmäkokoelmaan Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen, in Gottingen, Länsi-Saksa, joulukuun 17. päivänä, 1984 (A ja B) sekä joulukuun 27. päivänä, 1984 (C), ja ne ovat identifioidut TNF-A - C:nä: A: E. coli DH1 (a) (p-mTNF-3) B: E. COli DH1 (» (p-hTNF-1) C: E. coli C600 (pBR322-pL-T4-hTNF)

Viljelmäkokoelma on antanut näille vastaavasti seuraavat tu-: lonumerot, DSM 3159, 3160 sekä 3175.

Lisäksi, seuraavat mikro-organismit ja yhdistelmä-DNA-mole-kyylit on tallennettu viljelmäkokoelmaan, Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen, elokuun 29.päivänä, 1985.

D: E. coli W3110 (153-pL-T4-CA3-ctS-T4-ter) E: E. coli W3110 (153-T4-CA5-T4-ter) » 65 861 94 Näille tallennuksille on annettu vastaavasti seuraavat tulo-numerot: DSM 3460 ja 3461.

Vaikka kyseessä olevaa keksintöä on kuvattu viitaten erityisesti sen edulliseen suoritusmuotoon, on aiheeseen perehtyneille, joita keksintö koskee, selvää, että sen puitteissa saatetaan tehdä erilaisia muutoksia ja muunnoksia, poikkeamatta kyseessä olevan keksinnön hengestä ja piiristä, joka on määritelty keksinnön yhteyteen liitettyjen patenttivaatimusten avulla.

Claims (7)

66 861 94

1. Menetelmä TNF:n polypeptidihomologin valmistamiseksi, käsittäen vaiheen, jossa viljellään prokaryootti-isäntää, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA-molekyylillä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on operatiivisesti kytketty ilmentymiskontrollisekvenssiin, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat: (a) T4-ilmentymiskontrollisekvenssi, jolla on kaava: cgatggtaaagtatttcaactcaggttggatacctctcgaagacccagagtattg cgaattatgccagctatgaggtaaagtgtcatagcaccaactgttaattaaatta AATTAAAAAGGAAlATXATG, jossa X puuttuu tai on ryhmä, jossa on 1-15 emästä; ja (b) pL-T4-ilmentymiskontrollisekvenssi, jolla on kaava: cacgatgcg^ccggcgtagaggatctctcacctaccaaacaatgcccccctgcaa AAAATAAATTCATATAAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCT ctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggac gcactgaccaocaitgaaggtgacgctcttaaaattaagccctgaagaagggcagc attcaaagcagaaggctttggggtgtgtgatacgaaacgaagcattg : ja T4-ilmentymiskontrollisekvenssi, jolla on kaava: cgatggtaaagtatttcaactcaggttggatacctctcgaagacccagagtattg ....: cgaattatgccagCtatgaggtaaagtgtcatagcaccaactgttaattaaatta aättaaaaaggaaatxatg, 67 861 94 jolloin DNA-sekvenssi on valittu ryhmästä, johon kuuluvat: (a) p-mTNF-3:n DNA-insertti; (b) p-hTNF-l:n DNA-insertti; (c) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat toiseksi tai molem-miksi DNA-inserteiksi (a) ja (b) ja jotka koodaavat ilmentymistä TNF:n kaltaiseksi polypeptidiksi; ja (d) DNA-sekvenssit, jotka koodaavat ilmentymistä polypeptidiksi, jota koodaa mikä tahansa edellisistä DNA-inserteistä ja sekvensseistä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on valittu ryhmästä, johon kuuluvat : atgctcagatcatIcttctcaaaattcgagtgacaagcctgtagcccacgtcg TAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGCTGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAA CGCCCTCCTGGCÖAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTAGTGGTGCCA gccgatgggttgtaccttgtctActcccaggttctcttcaagggacaaggct gccccgactacgtgctcctcacccacaccgtcagccgatttgctatctcata ccaggagaaagtgaacctcctctctgccgtcaagagcccctgccccaaggac acccctgagggggctgagctoaaaccctggtatgagcccatatacctgggag gagtcttccagcuggagaagggggaccaactcagcgctgaggtcaatctgcc caagtacttagaqtttgcggagtccgggcaggtctactttggagtcattgct CTG Ja ctcagatcatcttIctcaaaattcgagtgacaagcctgtagcccacgtcgtag caaaccaccaagtiggaggagcagctggagtggctgagccagcgcgccaacgc cctcctggccaacggcatggatctcaaagacaaocaactagtggtgccagcc gatgggttgtacottgtctactcccaggttctcttcaagggacaaggctgcc ccgactacgtgctcctcacccacaccgtcagccgatttgctatctcatacca ggagaaagtcaaoctcctctctgccgtcaagagcccctgccccaaggacacc CCTGAGGGGGCTGiAGCTCAAACCCTGGTATGAGCCCATATACCTGGGAGGAG tcttccagctggagaagggggaccaactcagcgctgaggtcaatctgcccaa gtacttagactttgcggagtccgggcaggtctactttggagtcattgctctg. 68 861 94

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on valittu ryhmästä, johon kuuluvat:. ATGGTCAGATCATbTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTT gtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggcc aatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtg ccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaa GGCTGCCCCTÖCApCCATGTGCTCCTCACOCACACCATCAGCCGCATCGCC GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC cagagggagaGcöcagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatc tatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgag atcaatcggcgcGactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctacttt GGGATCATTGCCdTG ja gtcagatcatgtUctcgaaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgta gcaaaccctcäagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaat gccctcctgggcaiatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgcca tcagagggcctgoIacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggc tgcccctccaGcöatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtc tcctaccagaccaäggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccag agggagacccöagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctat ctgggaggggtjctitccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatc AATCGGCCCGACTjATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGG ATCATTGCCCtG.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu : siitä, että valmistetun TNF:n polypeptidihomologin kaava on valittu ryhmästä, johon kuuluvat: ValArgSerSelrskrArgThrProSerAepLysProValAlaHieValVal AlaAsnProGldnAtLaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsn A laLeuLeuAljaAönG 1 y Va 1G luLeuAr gAspAenG lnLeuVa IVa lPro SerGluGlyLeiuTVrLeuIleTyrSerGlnValLeuPheLyeGlyGlnGly CysProSerThrHILsValLeuLauThrHieThrlleSerArglleAlaVal SerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeuSerAlalleLysSerProCyeGln ArgGluThfPnoGlLuGlyAlaGluAlaLyeProTrpTyrGluProllaTyr LeuGlyGlyVallPheGlnLeuGluLyeGlyAspArgLeuSarAlaGluIla AsnArgProAspTyrLeuAspPheAlaGluSarGlyGlnValTyrPhaGly IlelleAlaLelu ja 69 861 94 MetValArgSecSerSerArgThrProSerAspLyeProValAlaHisVal ValAlaAsnPrloGlnAlaGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAla AsnAlaLeuLeUAlaAsnGlyValGluLeuArgAspAsnGlnLeuValVal ProSerGluGiyL^uTyrLeuIleTyrSerGlnValLeuPheLysGlyGln GlyCyeProSerTforHisValLeuLauThrHieThrl laSarArgl leAla ValSerTyrGlnTihrLyeValAsnLeuLeuSerAlalleLyeSerProCys GInArgGluThrPiroGluGlyAlaGluAlaLyaProTrpTyrGluProIle TyrLeuGlyGlyVhlPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGlu IleAenArtjPrnAppT’yrLeuA.epPheA.laCluSerClyClnValTyrPho GlyllelleAlaLau.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on operatiivisesti kytketty ilmentymistä kontrolloivaan sekvenssiin yhdistelmä-DNA-molekyylis-sä, jota käytetään transformoimaan prokaryoottista isäntää, jolloin ilmentymistä kontrolloiva sekvenssi on valittu ryhmästä, johon kuuluvat lac-systeemi, trp-systeemi, tac-systee-mi, trc-systeemi, ^-faagin pääoperaattori ja promoottorialueet, fd-kuoriproteiinin säätelyalueet, SV40:n varhaiset ja myöhäiset promoottorit, polyoomasta, adenoviruksesta ja simianviruksesta johdetut promoottorit, 3-fosfoglyseraatti-kinaasin tai muiden glykolyyttisten entsyymien promoottorit, hiivan -pariutumistekijän promoottorit ja muut sekvenssit, ‘ ' ' joiden tiedetään kontrolloivan prokaryoottisten ja eukaryoot- ·:·*: tisten solujen ja niiden virusten tai näiden yhdistelmägee- • nien ilmentymistä.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että prokaryoottisen isännän transformaatioon käytetty yhdistelmä- DNA-molekyyli on valittu ryhmästä, johon kuuluu pBR322-pL-T4-hTNF, pBR322-pL-T4-2-hTNF, 153-pL-T4-hTNF- CA3 (13 ), 153-pL-T4-hTNF-CA3-cts-T4ter ja 153-T4-hTNF-CA5-:*· " T4ter.

. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu • ; siitä, että transformoitu isäntä on valittu ryhmästä, johon kuuluu 70 86 1 94 E.coli C600 Acts KanR (pBR322-pL-T4-hTNF), E.coli W3110 (153-pL-T4-hTNF-CA3(13), E.coli W3110 (153-pL-T4-hTNF-CA3-cts-T4ter), E.coli W3110 (153-T4-hTNF CAS-T4ter) ja E.coli WA 802 (153-T4-hTNF CA5-T4ter). Il 71 86194