DE69632241T2 - Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Weizenmehls - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Weizenmehls.
  • BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN STANDS DER TECHNIK
  • Die Zahl der an Lebensmittelallergie leidenden Patienten ist weltweit steigend. Besonders die Getreideallergie wird als großes Problem angesehen, da Getreidearten, wie z. B. Reis und Weizen, in den meisten Ländern als Grundnahrungsmittel konsumiert werden.
  • Um dieses Problem zu lösen, entwickelten die vorliegenden Erfinder 1990 einen allergenarmen Reis (J. Food Sci., 55, S. 781, 1990; J. Food Sci., 55, S. 1105, 1990; J. Nutrition, 44, S. 51, 1991; Trends Food Sci., 4, 1993). Das entwickelte Produkt wurde 1993 vom Japanese Ministry of Health and Welfare als erstes physiologisch funktionelles Lebensmittel für bestimmte Gesundheitsanwendungen zugelassen, und Patienten mit Reisallergie werden nun in großem Umfang über den Handel damit versorgt.
  • Dagegen konnte bislang kein Erfolg bei der Erzeugung eines bei der Lebensmittelherstellung einsetzbaren hypoallergenen Weizenmehls verzeichnet werden, obwohl Weizenmehl in Mengen als Rohmaterial für Brot, Nudeln und Pasta verwendet wird. In dieser Beziehung isolierten die vorliegenden Erfinder ein Weizenantigenpeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ.-IDENT.-NR. 1 aus einem Chymotrypsinhydrolysat von Gluten, das ein Antigen für die meisten Weizenallergiepatienten ist (Biosci. Biotech. Biochem., 59, S. 1596–1607, 1995), und stellten fest, daß das Epitop dieses Peptids der in SEQ.-IDENT.-NR. 2 gezeigte Teil der Aminosäuresequenz ist und daß die für die Epitopfunktion wesentlichen Aminosäurereste der vom N-Ende aus erste Glutaminrest (Gln) und der vierte und der fünfte Prolinrest (Pro) sind (Proceedings of anual meeting of Jap. Agr. Chem., 1995). In der Absicht, das Epitop dieses Weizenallergens zu deaktivieren, erzeugten die vorliegenden Erfinder erfolgreich ein hypoallergenes Weizenmehl durch Behandeln des Mehls mit Kollagenase, die Prolinreste erkannte, und verarbeiteten das resultierende Weizenmehl zu Brot und Pasta (Biosci. Biotech. Biochem., 58, S. 388–390, 1994).
  • Da jedoch diese Kollagenase ein von einem anaeroben Bazillus, Clostridium, erzeugtes Enzym ist, ist sie als Lebensmittelzusatz nicht zugelassen und hat den entscheidenden Nachteil, daß mit Kollagenase behandeltes hypoallergenes Weizenmehl als Rohmaterial für die Lebensmittelherstellung nicht einsetzbar ist.
  • Das US-Patent Nr. 4 299 847 offenbart ein Verfahren zur Herstellung hypoallergener Getreideprodukte, bei dem ganze Körner in einer wäßrigen Lösung, die Bromelain oder Papain enthält, unter sauren Bedingungen (pH 3,9–5,4) eingeweicht und inkubiert werden. Die enzymbehandelten Körner werden anschließend gemahlen, um ein hypoallergenes Mehl zu erhalten.
  • Die EP 0452847 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Mehls, bei dem das Mehl mit Wasser oder einer Kochsalzlösung behandelt wird, um dessen lösliche Komponente zu entfernen. Zusätzlich kann eine Protease zugegeben werden, um die weitere Auflösung des Proteins zu fördern, wobei die Protease zum Beispiel Papain, Trypsin, Pepsin, Pankreatin, Actinase oder α-Chymotrypsin ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung eines bei der Lebensmittelherstellung einsetzbaren hypoallergenen Weizenmehls zur Verfügung zu stellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Weizenmehls zur Verfügung, das die Schritte des Vermischens von Wasser oder einer wäßrigen Ethanol lösung mit Weizenmehl und des anschließenden Vermischens einer Protease, die eine hohe kollagenaseartige Aktivität besitzt und bei der Lebensmittelherstellung einsetzbar ist, mit der Mischung, wobei die Protease Bromelain ist und das Bromelain unter neutralen pH-Bedingungen mit der Mischung reagiert. Bromelain ist aufgrund einer hohen kollagenaseartigen Aktivität und einer geringen Amylaseaktivität die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Protease.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform des obigen Verfahrens sollte darüber hinaus Wasser in 0,05- bis 100facher oder vorzugsweise 0,1- bis 10facher Menge oder eine wäßrige Ethanollösung mit einer Konzentration von bis zu 20% in 0,05- bis 100facher oder vorzugsweise 0,1- bis 10facher Menge mit dem Mehl vermischt werden, um eine Mischung herzustellen, und die Protease sollte in einer Menge von 0,01 bis 10 Gew.-% oder vorzugsweise 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das Weizenmehl, mit der Mischung vermischt werden.
  • Das obige Verfahren läßt sich mit sämtlichen verschiedenen Weizenmehlarten, wie z. B. Hartweizenmehl, Quasihartweizenmehl, Mittelhartweizenmehl und Weichweizenmehl, anwenden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 veranschaulicht ein Gelfiltrationsmuster eines chymotryptischen Hydrolysats von Gluten,
  • 2 veranschaulicht ein Chromatogramm (A) eines chymotryptischen Hydrolysats von Gluten und ein Chromatogramm (B) eines Antigenizitäts-Peaks,
  • 3 veranschaulicht konzentrationsabhängige Inhibierungs-ELSA-Werte eines Peptidderivats,
  • 4 veranschaulicht Änderungen der Menge an vom Peptidderivat freigesetztem Histamin,
  • 5 ist ein Histogramm, das die pH-Abhängigkeit der kollagenaseartigen Aktivität von Bromelain veranschaulicht,
  • 6 veranschaulicht die SDS-PAGE-Ergebnisse eines mit Bromelain behandelten hypoallergenen Weizenmehls (A) und eines unbehandelten Weizenmehls
  • 7 ist ein Resistogramm eines mit Bromelain behandelten hypoallergenen Weizenmehls (A) und eines unbehandelten Weizenmehls und
  • 8 ist ein Farinogramm des mit Bromelain behandelten hypoallergenen Weizenmehls.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Das Epitop von Weizenmehl, das die Grundlage des Verfahrens zur Erzeugung eines hypoallergenen Weizenmehls der vorliegenden Erfindung ist, wurde wie folgt ermittelt.
  • 1. Isolierung von Weizenantigenpeptid
  • Gluten aus Weichweizenmehl (Showa Sangyo Co.: Handelsbezeichnung: Cleopatra) wurde gefriergetrocknet und anschließend pulverisiert. Nach der Sterilisation wurde das Glutenpulver mit Hilfe von Chymotrypsin hydrolysiert. Speziell wurde α-Chymotrypsin (0,5 g, Sigma Chemical Co., Typ II, 40–60 Einheiten/mg Protein) in Wasser (10 ml) gelöst und anschließend durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert. Das Filtrat wurde in im Autoklaven behandeltem Wasser (2,5 1) gelöst und mit 50 g Glutenpulver vermischt. Die resultierende Mischung wurde mit 0,1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und 18 Stunden lang bei 37°C hydrolysiert. Das resultierende Reaktionsprodukt wurde fünf Minuten lang auf 60°C erwärmt, um das Enzym zu deaktivieren, und anschließend zentrifugiert (10 Minuten lang bei 1000 × g), um einen Überstand zu erhalten. Dieser Überstand wurde nach dem Einengen im Vakuum der Gelfiltration unterworfen.
  • Eine Sephadex-G-50-Säule (4,9 × 45 cm, VD = 255 ml) wurde für die Gelfiltration verwendet und das chymotryptische Hydrolysat mit 10%igem Ethanol eluiert. 1 zeigt ein typisches Gelfiltrationsmuster des chymotryptischen Hydrolysats. Das Eluat wurde in 50-ml-Portionen als eine Fraktion gesammelt. Jede Fraktion wurde gefriergetrocknet und das getrocknete Pulver (50 mg) in 0,1 N Tris-HCl (pH: 8,6), das 4 M Harnstoff enthielt, gelöst. Anschließend wurde die Lösung einer Allergenizitätsmessung durch das IgE-ELISA-Verfahren unterworfen, wobei das Serum eines Patienten mit Weizenallergie (zur Verfügung gestellt vom Urafune Hospital of Yokohama City University School of Medicine) verwendet wurde und die Bindungseigenschaft mit dem spezifischen IgE-Antikörper in dem Serum untersucht wurde. Die mit einem Sternchen in 1 gekennzeichnete Fraktion erwies sich als allergen.
  • Diese allergene Fraktion wurde der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit einer ODS-Säule bei 22°C unterworfen. Als Elutionslösung diente ein linearer Gradient von 0,1% Trifluoressigsäure-Methanol (Methanolkonzentration 0 bis 75%), und zur Detektion wurde UV-Licht mit 210 nm verwendet. Die ELISA-Daten aus den Peaks in 2A zeigen, daß die numerierten Peaks allergen waren. Peak 2 (mit höherer Allergenizität) in 2A wurde durch die zweite HPLC durch gradientenweise Modifizierung des Lösungsmittelsystems (45 bis 60% bezüglich der Methanolkonzentration) weiter fraktioniert. Der mit einem Sternchen gekennzeichnete Peak (2B), der bei der zweiten HPLC erhalten wurde, wurde als höchstgradig allergen eingestuft. Dieser Peak wurde dreimal chromatographiert, um das allergene Peptid zu isolieren.
  • Die Aminosäuresequenz des dabei erhaltenen allergenen Peptids wurde mittels eines Aminosäure-Sequenzierungsautomaten (Applied Biosystems Co., 477A) ermittelt. Das Ergebnis bestätigte, daß dieses Peptid die Aminosäuresequenz SEQ-IDENT.-NR. 1 besitzt. Das Peptid enthält viele Prolin- und Glutaminreste und besitzt eine einzigartige Wiederholungssequenz, die in SEQ.-IDENT.-NR. 4 gezeigt ist (hierin nachfolgend als "SQQQ(Q)PPF" bezeichnet). Ein Ähnlichkeitstest zeigte, daß die Aminosäuresequenz dieses Peptids Ähnlichkeiten von 70 bis 90% mit dem Gluteninvorläufer mit niedrigem Molekulargewicht besaß, und es wurde gefunden, daß das isolierte Allergenpeptid vom Glutenin mit niedrigem Molekulargewicht stammte.
  • Das obige allergene Peptid kann zur Identifizierung von allergenen Genen in Weizengenom verwendet werden, indem die DNA-Analyse davon angewandt wird, und somit trägt es wesentlich dazu bei, hypoallergenes Weizenmehl auf der Basis von Genmanipulation zu erzeugen.
  • 2. Ermittlung der Epitopstelle des allergenen Peptids
  • Um die Epitopstruktur des oben unter 1. erhaltenen allergenen Peptids zu ermitteln, wurde untersucht, ob das Motiv SQQQ(Q)PPF bei der Bindung an spezifische IgE-Antikörper in den Seren von auf Weizen allergischen Patienten beteiligt ist oder nicht. Speziell wurden die Peptide SQQQ(Q)PPF, (SQQQ(Q)PPF) × 2 und (SQQQ(Q)PPF) × 4 durch Anwendung der bekannten Festphasenpeptidsynthese (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, S. 3998–4002, 1984) synthetisiert, und die Bindungseigenschaft eines jeden Peptids mit IgE-Antikörper wurde durch das ELISA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt: Ungeachtet der Gegenwart einer Repetition, war die Antikörperbindungsfähigkeit in allen Fällen nahezu gleich. Es wurde auch fast kein Unterschied bei der Bindungsfähigkeit für SQQQPPF mit einer Glutaminzahl von weniger als 1 beobachtet.
  • Um zu prüfen, welche Aminosäurereste in dem Motiv wesentlich zur Bindung an IgE-Antikörper beitragen, wurde versucht, jeden der zur Struktur beitragenden Aminosäurereste durch Glycin (G) zu ersetzen und die Antikörperbindungsfähigkeit durch ELISA zu messen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, führte als Folge davon der Austausch des vom N-Ende der SQQQ(Q)PPF-Sequenz aus zweiten Glutaminrestes (Q) und zweier Prolinreste (P) zu einer bedeutenden Abnahme der Antikörperbindungsfähigkeit. Ferner wurde bewiesen, daß ein kürzeres Peptid QQQPP (SEQ.-IDENT.-NR. 2) eine genauso hohe Antikörperbindungsfähigkeit besaß. Da die vom N-Ende dieser QQQPP-Sequenz aus zweiten und dritten Glutaminreste mit anderen beliebigen Aminosäureresten ersetzt werden können, wurde außerdem bewiesen, daß das Epitop von Weizenantigenpeptid der QQQPP-Sequenzteil war und die für die Antikörperbindungsfähigkeit wesentlichen Aminosäurereste der vom N-Ende aus erste Glutaminrest und der vierte und der fünfte Prolinrest waren. Einen weiteren Beweis liefert die Tatsache, daß eine acetylierte Aminogruppe am N-Ende zu einer höheren Antikörperbindungsfähigkeit führt als eine freie Aminogruppe.
  • Tabelle 1
    Figure 00070001
  • 3. Beweis der Antigenizität des Peptidderivats
  • Ein Peptidderivat (Ac-QQQPP) wurde durch Acetylierung des N-terminalen Aminosäurerestes (Glutaminrest) des synthetischen Peptids QQQPP hergestellt, und durch Verwendung desselben wurde eine Inhibierungs-ELISA-Messung (J. Immunol., 151, S. 5354–5363, 1993) durchgeführt. Mit 4 M Harnstoff extrahiertes Gluten wurde als Antigen verwendet, und mit Ac-QQQPP behandeltes Serum eines auf Weizen allergischen Patienten wurde als Antikörper verwendet.
  • Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt: Ac-QQQPP bindet sich sehr gut an weizenspezifisches IgE in dem Serum des Patienten.
  • Um die Korrelation zwischen der Antikörperbindungsfähigkeit und der Fähigkeit zur Freisetzung eines Entzündungsvermittlers, wie z. B. Histamin, für dieses Ac-QQQPP zu untersuchen, wurde die Menge an von den basophilen Zellen freigesetztem Histamin in Gegenwart von Ac-QQQPP gemäß dem von Mita et al. (Prostaglandins, 31, S. 869–886, 1980) vorgeschlagenen Verfahren gemessen.
  • Wie aus den in 4 gezeigten Ergebnissen deutlich wird, löste Ac-QQQPP in keinem der untersuchten Fälle die Freisetzung von Histamin aus, wohingegen das als Kontrolle verwendete pankreatische Weizenmehlhydrolysat einen konzentrationsabhängigen Anstieg der Menge an freigesetztem Histamin hervorrief.
  • Daraus läßt sich schließen, daß das vom Weizenantigenpeptid abgeleitete acetylierte QQQPP-Derivat eine spezifische Bindungsfähigkeit bezüglich des Antikörpers eines auf Weizen allergischen Patienten besitzt, während bewiesen wurde, daß dieses Derivat selbst als Hapten dient, das keine Antigenreaktion, wie z. B. Entzündung, hervorruft. Dieses Peptidderivat stellt daher eine neue Möglichkeit zur Prävention oder Therapie einer Weizenallergie dar.
  • Es sollte in diesem Zusammenhang darauf hingewiesen werden, daß das Peptid mit der QQQPP-Sequenz auch nicht die Fähigkeit besitzt, Antigenizität zum Ausdruck zu bringen, daß es jedoch eine IgE-Antikörperbindungsfähigkeit besitzt. Der Grund dafür könnte sein, daß sich das Peptid an jedes der IgE-Moleküle binden kann. Es ist bekannt, daß ein Antigenprotein seine Antigenizität durch Bindung an wenigstens zwei IgE-Moleküle zum Ausdruck bringt. Daher bringen weder das Peptid noch das Peptidderivat, die sich an jedes IgE gebunden haben, Antigenizität zum Ausdruck, und sie können darüber hinaus die Bindung von Antigenprotein an die IgE-Moleküle verhindern.
  • Nachstehend wird nun das Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Weizenmehls der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das Verfahren umfaßt im wesentlichen die Schritte des Vermischens von Wasser oder einer wäßrigen Ethanollösung mit Weizenmehl, des anschließenden Vermischens einer Protease, die eine hohe kollagenaseartige Aktivität besitzt und bei der Lebensmittelherstellung einsetzbar ist, mit der Mischung und des Trocknens der Mischung, wobei die Protease Bromelain ist und das Bromelain unter neutralen pH-Bedingungen mit der Mischung reagiert.
  • Wenn Wasser mit Rohmaterial-Weizenmehl vermischt wird, sollte die Menge an zugegebenem Wasser innerhalb eines Bereichs des 0,05- bis 100fachen oder vorzugsweise des 0,1- bis 10fachen, bezogen auf das Weizenmehl, liegen. Wenn die wäßrige Ethanollösung vermischt wird, sollte die Menge an zugegebener wäßriger Ethanollösung mit einer Konzentration von bis zu 20% innerhalb eines Bereichs des 0,05- bis 100fachen oder vorzugsweise des 0,1- bis 10fachen, bezogen auf die Weizenmehlmenge, liegen. Die Proteasemenge, die mit der Mischung aus Mehl und Wasser oder Ethanollösung vermischt werden soll, sollte innerhalb eines Bereichs von 0,01 bis 10 Gew.-% oder vorzugsweise 0,1 bis 5 Gew.-% des Weizenmehls liegen.
  • Die zu verwendende Protease sollte eine Protease sein, die zusätzlich zu der obigen Bedingung eine niedrige Amylaseaktivität besitzt. Die Wirksamkeit der Protease mit einer hohen kollagenaseartigen Aktivität wird aus den Erkenntnissen offensichtlich, daß die Erkennung des Prolinrestes von Weizenmehlepitop (Peptid mit der SEQ.-IDENT.-NR. 2) durch Kollagenase die Erzeugung eines hypoallergenen Weizenmehls ermöglicht. Die Wirksamkeit der Protease mit einer niedrigen Amylaseaktivität ist der Tatsache zuzuschreiben, daß eine Zersetzung von Weizenstärke durch Amylase zu einem verringerten Weizenmehlvolumen und einer starken Beeinträchtigung der Verarbeitbarkeit führt, da Süße zugefügt wird, und ferner daß, da ein Amylaseinhibitor im Weizenprotein als ein Antigen für einen weizenempfindlichen allergischen Patienten wirkt, es unmöglich ist, die Zersetzung von Weizenstärke durch Zugabe eines Amylaseinhibitors zu inhibieren.
  • Der folgende Test 1 bewies, daß Bromelain die geeignetste Protease ist, um diese Bedingungen zu erfüllen.
  • Test 1
  • Dieser Test wurde durchgeführt, um eine Protease auszuwählen, die eine hohe kollagenaseartige Aktivität und eine niedrige Amylaseaktivität besitzt und bei der Lebensmittelherstellung einsetzbar ist.
  • (1) Proben
  • Weizenmehl: Weichweizenmehl (Showa Sangyo Co., Handelsbezeichnung: Cleopatra) wurde verwendet.
  • Enzyme: Protease A, Protease B, Protease S, Protease N, Proleather, Papain W-40 (hergestellt von Amano Seiyaku Co.), Bromelain (Reagenz: Bromelain, Wako Seiyaku Co.) und Maxrase (Riken Pharma Co.) wurden verwendet.
  • (2) Verfahren
  • Kollagenaseartige Aktivität: Die kollagenaseartige Aktivität wurde gemäß dem von Van Wart (Anal. Biochem., 113, S. 356–365, 1981) vorgeschlagenen Verfahren unter Verwendung von FALGPA als Substrat gemessen. Die FALGPA-Zersetzungsreaktion wurde bei 25°C unter Bedingungen, die eine Substratkonzentration von 0,05 mM, ein Lösungsmittel aus 0,4 M NaCl-10 mM CaCl2-50 mM Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH: 7,5) und eine Enzymkonzentration von 5 mg/ml umfaßten, herbeigeführt, um das Abklingen der Extinktion bei 324 nm einige Minuten lang zu messen. Die enzymatische Aktivität wurde in [Einheiten/mg Enzym] ausgedrückt, wobei 1 Einheit eine Aktivität zur Hydrolyse von 1 μmol FALGPA innerhalb einer Minute bedeutet und ΔA = 0,0025/Minute entspricht.
  • Amylaseaktivität: Das Substrat, eine 1%ige Kartoffelstärke, wurde 30 Minuten lang einer enzymatischen Reaktion bei 37°C unterworfen und die Menge an reduzierender Gruppe durch das von Luchsinger und Cornesky (Anal. Biochem., 4, S. 346–347, 1962) vorgeschlagene Verfahren ermittelt. Die enzymatische Aktivität wurde in [μmol Glucoseäquivalent/Minute/mg Enzym] ausgedrückt.
  • (3) Ergebnisse
  • Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 2 gezeigt. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, nahmen die Kollagenaseaktivitäten der getesteten Proteaseproben in der Reihenfolge Bromelain > Protease B > Protease A = Papin zu. Die Messung der Amylaseaktivitäten der vier Proteasepräparate verdeutlichte, daß, wie in Tabelle 2 gezeigt, die Amylaseaktivität bei Protease A und B höher ist und bei Bromelain und Papain niedriger, wobei letztere einen Wert von etwa einem Zehntel der ersteren besitzen.
  • Tabelle 2
    Figure 00110001
  • Anmerkung
    • a
    [Einheiten/mg],
    b
    [μmol Glucoseäquivalent/Minute/mg],
    c
    nicht erfaßt (< 0,008),
    d
    nicht gemessen
  • Aus den oben beschriebenen Testergebnissen wurde daher geschlossen, daß Bromelain die wünschenswerteste Protease für die Verwendung bei dem Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Weizenmehls der vorliegenden Erfindung ist.
  • Die kollagenaseartige Aktivität von Bromelain ist, wie in 5 gezeigt, bei einem pH-Wert von 9 am höchsten. Die Reaktion von Bromelain unter Bedingungen, die einen pH-Wert von 9 umfassen, kann daher die Antigenizität von Weizenmehl wirksam verringern. Bei diesen Bedingungen, die einen pH-Wert von 9 umfassen, färbt sich jedoch Flavonoid, das in dem Weizenmehl enthalten ist, aufgrund der Alkalinität gelb, und das Endprodukt kann eine Entfärbung erleiden. Obwohl die erste der von einem hypoallergenen Weizenmehl zu erfüllenden Bedingungen das Fehlen von Antigenizität ist, ist es auch notwendig, daß es mit gewöhnlichem Weizenmehl hinsichtlich der Qualität, einschließlich dem Farbton, gut übereinstimmt. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sollte daher das Weizenmehl unter neutralen pH-Bedingungen umgesetzt werden, wenn Bromelain verwendet wird.
  • Wie aus Test 1 deutlich wird, kann das hypoallergene Weizenmehl dieser Erfindung durch Verwendung von Bromelain unter neutralen pH-Bedingungen erzeugt werden. Das dabei erhaltene hypoallergene Weizenmehl kann zur Herstellung eines aus Weizenmehl gefertigten Lebensmittels, insbesondere eines hypoallergenen Brots, verwendet werden. Ein Verfahren zur Herstellung des Brots besteht im wesentlichen aus dem Vermischen eines Carbonats und einer Säure mit dem hypoallergenen Weizenmehl, wie es oben beschrieben ist, und dem Backen der Mischung. Ein beliebiges Carbonat und eine beliebige Säure, die zur Lebensmittelherstellung einsetzbar sind, wie z. B. Natriumhydrogencarbonat und Citronensäure, können verwendet werden. Durch Verwendung des Carbonats und der Säure ist es möglich, beim Backen aus der Mehlmischung Kohlendioxid zu erzeugen, ohne daß Bäckerhefe verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen und Tests detaillierter beschrieben. Es ist unnötig zu erwähnen, daß die vorliegende Erfindung nicht durch das Folgende eingeschränkt wird.
  • Beispiel 1
  • Zunächst wurde 1 Liter 10%iges Ethanol zu dem Weichweizenmehl (1 kg) hinzugegeben und damit vermischt, dann wurden 10 g Bromelain zugegeben und mit der resultierenden Mischung vermischt, und nach einer Wartezeit von acht Stunden bei 37°C wurde die Mischung gefriergetrocknet, um ein hypoallergenes Weizenmehl herzustellen.
  • Beispiel 2
  • Wasser in einer Menge von 1 l wurde zu Weichweizenmehl (1 kg) zugegeben und damit vermischt, zu der resultierenden Mischung wurden anschließend 10 g Bromelain zugegeben, und nach einer Wartezeit von acht Stunden bei 37°C wurde die Mischung gefriergetrocknet, um ein hypoallergenes Weizenmehl herzustellen.
  • Beispiel 3
  • Wasser in einer Menge von 0,6 l wurde zu Weichweizenmehl (1 kg) zugegeben und damit vermischt, zu der resultierenden Mischung wurden anschließend 10 g Bromelain zugegeben, und nach einer Wartezeit von einer, zwei, vier oder acht Stunden bei 37°C wurde die Mischung gefriergetrocknet, um ein hypoallergenes Weizenmehl herzustellen.
  • Test 2
  • Die Antigenizität der in den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellten hypoallergenen Weizenmehlproben wurde wie folgt durch das ELISA-Verfahren getestet.
  • (1) Verfahren
  • Das hypoallergene Weizenmehl wurde mittels einer 4 M harnstoffhaltigen Tris-Salzsäure(UTH)-Pufferlösung (pH: 8,6) extrahiert und anschließend zentrifugiert (1300 × g; fünf Minuten lang). Der resultierende Überstand wurde mit der UTH-Pufferlösung verdünnt, so daß eine Peptidkonzentration von etwa 100 bis 250 μg/ml erhalten wurde. Für 100 μl verdünnten Überstand wurde die Antigenizität durch das IgE-ELISA-Verfahren gemessen, wobei die Bindungsfähigkeit mit dem spezifischen IgE-Antikörper im Serum eines weizenempfindlichen allergischen Patienten (zur Verfügung gestellt vom Urafune Hospital of Yokohama City University School of Medicine) als Indikator herangezogen wurde.
  • (2) Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Wie aus den in Tabelle 3 gezeigten Ergebnissen deutlich wird, wiesen die durch Zugabe von 10%igem Ethanol oder Wasser in der gleichen Menge und acht Stunden lange Umsetzung von 1 Gew.-% Bromelain bei 37°C erhaltenen Weizenmehlproben (Beispiele 1 und 2) eine auf weniger als die Erfassungsgrenze verringerte Antigenizität auf.
  • Bei den durch Zugabe von Wasser in 0,6facher Menge des Mehls und Umsetzung mit 1 Gew.-% Bromelain bei 37°C erhaltenen Weizenmehlproben wurde die Antigenizität des nach achtstündiger Reaktion erhaltenen Produkts auf weniger als die Erfassungsgrenze gesenkt, während bei einer Reaktionszeit von ein bis vier Stunden die Antigenizität verbleibt.
  • Tabelle 3
    Figure 00140001
  • Test 3
  • Der folgende Test wurde mit der durch achtstündige Reaktion von Bromelain in Beispiel 3 hergestellten hypoallergenen Weizenmehlprobe durchgeführt.
  • (1) Verfahren
  • SDS-PAGE: 200 g hypoallergenes Weizenmehl und unbehandeltes Weizenmehl wurden mit 1 ml UTH-Pufferlösung extrahiert und zentrifugiert (1300 × g; fünf Minuten lang). Seprasol II (Daiichi Kagaku Co.) wurde in gleicher Menge zu dem resultierenden Überstand hinzugegeben, und nach 15minütigem Sieden wurde eine Elektrophorese mittels Polyacrylamidgel mit einem Konzentrationsgradienten von 10 auf 20% (Daiichi Kagaku Co.) gemäß dem von Laemmli (Nature, 227, S. 680–685, 1970) vorgeschlagenen Verfahren durchgeführt. Kaninchenmuskelphosphorylase b (MG 97 kDa), bovines Serumalbumin (MG, 67 kDa), Opalbumin (MG, 43 kDa), bovine Carbonatdehydratase (MG, 31 kDa), Sojabohnentrypsininhibitor (MG, 22 kDa) und Hühnereiweißlysozym (MG, 14 kDa) wurden als Molekulargewichtsmarkierungen verwendet. Nach der Elektrophorese wurden die Banden mit Coomassie Brilliant Blue (R-250; Sigma Co.) eingefärbt.
  • Resistographie: Wasser in einer Menge von 74 ml wurde zu gefriergetrocknetem hypoallergenem Weizenmehl in einer Menge von 86 g, umgewandelt in den trockenen Zustand, zugegeben und damit vermischt und 20 Minuten lang bei 30°C und 63 U/Minute unter Verwendung eines Resistographen (Brabender Instrument Co.) gerührt. Die gleichen Schritte wurden auch für eine Mischung aus unbehandeltem Weizenmehl (100 g) und Wasser (60 ml) durchgeführt.
  • Farinographie: Rohe Bäckerhefe (Oriental Kobo Kogyo Co.) wurde in einer Konzentration von 2 g/ml in Wasser suspendiert. Diese Hefesuspension (0,345 ml) wurde mit Rührteig aus hypoallergenem Weizenmehl (50 g), hergestellt durch Resistographie, oder einem Weizenmehlteig (50 g) vermischt, und die Menge an erzeugtem Kohlendioxid und die vom Teig zurückbehaltene Menge wurden durch Verwendung eines Farinographen (AR-1000, Art Co.) 90 Minuten lang bei 24°C gemessen.
  • (2) Ergebnisse
  • Eine SDS-PAGE, angewandt auf einen 4 M Harnstoffextrakt des hypoallergenen Weizenmehls, führte, wie in 6 gezeigt, bei den meisten der hypoallergenen Weizenmehlproben zur Hypoallergenizität, verglichen mit einer unbehandelten Weizenmehlprobe, so daß das meiste davon aus dem Gel heraus kam. Die Komponenten nahe 20 kDa bis 30 kDa, die selbst nach Beendigung der Reaktion verblieben, werden nicht als Antigenizität besitzend angesehen.
  • Wie in 7 gezeigt, ist das Resistogramm (A) des hypoallergenen Weizenmehls flacher als das des unbehandelten Weizenmehls, was nahelegt, daß sich kein Gluten gebildet hat. Wie jedoch in dem Farinogramm von 8 gezeigt ist, besitzt das hypoallergene Weizenmehl ein Kohlendioxid-Haltevermögen, und es wurde bewiesen, daß es möglich ist, durch dessen Verwendung Brot und andere aus Weizenmehl gefertigte Lebensmittel herzustellen.
  • Beispiel 4
  • Wasser in einer Menge von 0,6 1 wurde mit einem Weichweizenmehl (1 kg) vermischt, und anschließend wurden 10 g Bromelain zu der Mischung hinzugegeben und acht Stunden lang bei 37°C gehalten. Zum Bromelainprodukt wurden 10 g gewöhnliches Salz, 10 g Glucose, 13 g Citronensäure und 10 mg Sorbitanmonostearat (Handelsbezeichnung: Emasol S-10F, Kao Co.) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, während weiter 20 g Natriumhydrogencarbonat hinzugegeben wurden. Die Mischung wurde in einer Charge von 30 g rasch in einen 100-ml-Behälter oder eine Muffinform gegossen und 20 Minuten lang bei 180°C in einem Ofen gebacken, um Brot herzustellen.
  • Ein weiteres Stück Brot wurde aus dem durch Kollagenasebehandlung hypoallergen gemachten Weizenmehl gebacken (Biosci. Biotech. Biochem., 58, S. 388–390, 1994). Bäckerhefe wurde in den durch das obige Verfahren hergestellten Brotstücken nicht verwendet. Aufgrund der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz zwischen Bäckerhefe und Weizenallergen zeigt ein weizenempfindlicher allergischer Patient oft auch eine allergische Reaktion auf Bäckerhefe.
  • Deshalb wurde das Brot durch Erzeugung von Kohlendioxid aus Natriumhydrogencarbonat und Citronensäure anstelle von Bäckerhefe gebacken.
  • Test 4
  • Dieser Test untersuchte die Eigenschaften des in Beispiel 4 gebackenen Brots.
  • (1) Verfahren
  • Spezifisches Volumen: Das Laibvolumen wurde durch das Rapsverdrängungsverfahren (American Association of Cereal Chemists. in "Approved Methods of the AACC", B. Aufl., The Association, St. Paul. Method 10-10B, 1983) gemessen. Das spezifische Volumen wurde in Laibvolumen (ml)/Laibgewicht (g) ausgedrückt.
  • Farbtonbeurteilung. Die Farbparameter (L-, a- und b-Werte) des oberen Bereichs des Brots wurden mit einem Farbunterschiedsmesser (SC-2-XCH, Gas Testers Co.) gemessen.
  • (2) Ergebnisse
  • Die Testergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Wie aus Tabelle 4 deutlich wird, hat das aus dem mit Bromelain behandelten hypoallergenen Weizenmehl gebackene Brot ähnliche Eigenschaften wie das aus dem mit Kollagenase behandelten hypoallergenen Weizenmehl gebackene Brot, sowohl hinsichtlich des spezifischen Volumens als auch hinsichtlich des Farbtons. Es hat ein ähnliches spezifisches Volumen wie das des im Handel erhältlichen English Muffin.
  • Darüber hinaus wurden die äußere Erscheinung und der Querschnitt des hergestellten Brots begutachtet. Durch die Zugabe von Sorbitanmonostearat wurden feine und glatte Brotinnenschichten erhalten. Die Zugabe von Glucose führte zu einem Strecker-Abbau und einer Maillard-Reaktion, und deren Produkte ergaben eine sehr gute Brotfarbe und einen sehr guten Brotgeruch.
  • Tabelle 4
    Figure 00170001
  • Anmerkung
    • *
    Der CV-Wert der Messung betrug bis zu 10%. Ein im Handel erhältliches English Muffin hatte ein spezifisches Volumen von 3,0.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00180001
  • Figure 00190001

Claims (4)

  1. Ein Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Weizenmehls, umfassend die Schritte des Vermischens von Wasser oder einer wäßrigen Ethanollösung mit Weizenmehl und des anschließenden Vermischens einer Protease, die eine hohe kollagenaseartige Aktivität besitzt und bei der Lebensmittelherstellung einsetzbar ist, mit der Mischung, wobei die Protease Bromelain ist und das Bromelain unter neutralen pH-Bedingungen mit der Mischung reagiert.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Wasser in einer Menge innerhalb eines Bereichs des 0,05- bis 100fachen der Weizenmehlmenge zugegeben wird.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die wäßrige Ethanollösung mit einer Ethanolkonzentration von bis zu 20% in einer Menge innerhalb eines Bereichs des 0,05- bis 100fachen der Weizenmehlmenge zugegeben wird.
  4. Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Bromelain in einer Menge innerhalb eines Bereichs von 0,01 bis 10 Gew.-% des Weizenmehls mit der Mischung vermischt wird.
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