DE69632828T2

DE69632828T2 - Peptide des antisekretorischen faktors, welches krankhafte permeabilitätsanderungen reguliert

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Publication number: DE69632828T2
Application number: DE69632828T
Authority: DE
Inventors: Ivar Lönnroth; Stefan Lange; Eva Johansson; Eva Jennische; Christina Lönnroth
Original assignee: Rural Patent Svenska AB
Current assignee: Rural Patent Svenska AB
Priority date: 1995-08-24
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2016-08-24
Also published as: KR19990044110A; DK0851876T3; KR100552947B1; EA199800221A1; BG102280A; US6344440B1; NZ337380A; CA2230111A1; EE04501B1; AU6893296A; BR9610308A; HU224971B1; TR199800304T1; SE9502936D0; EE9800055A; CN1208420A; CZ295444B6; NO980743L; NO320560B1; BG63209B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue antisekretorische Faktoren, die Flüssigkeitstransport und/oder Entzündungsreaktionen regulierende Eigenschaften sowie polynukleinregulierende Eigenschaften aufweisen, und Polynukleinsäuren, die dafür kodieren, und deren Verwendung.
Alle Zellen und Gewebe des Körpers sind entscheidend von einer konstanten und normalen Flüssigkeitsumgebung in Kombination mit einer adäquaten Blutzufuhr abhängig. Die Störung eines oder beider dieser unterstützenden Systeme kann schnell verhängnisvoll werden. Was das Flüssigkeitsungleichgewicht betrifft, bestehen zwei unterschiedliche Systeme:

A. Ödem, das durch die abnormale Ansammlung von Flüssigkeit in den interzellularen Gewebezwischenräumen oder Körperhohlräumen gekennzeichnet ist, oder
B. Dehydratisierung, was im strengen Sinn nur den Verlust von Wasser bedeutet, aber tatsächlich allgemein verwendet wird, um den gemeinsamen Verlust von Wasser und Ionen zu beschreiben.

Die häufigsten Formen entweder von Ödem oder von Dehydratisierung sind:
Durchfälle, entzündliche Darmerkrankungen, Gehirnödem, Asthma, Rhinitis, Konjunktivitis, Arthritis, Glaukom, verschiedene Formen von pathologischem intrakranialem Druck (Zunahme oder Abnahme), Druckänderungen im Mittelohr wie etwa Morbus Ménière, Dermatitis, chemische oder physikalische Störungen der Haut oder der an Drüsen angrenzenden Haut wie etwa Mastitis, verschiedene Formen von endokrinen Störungen wie etwa Diabetes Insipidus. Conn-Syndrom, Cushing-Syndrom und Morbus Addison, Nierenerkrankungen wie etwa Pyelonephritis und Glomerulonephritis, Stoffwechselstörungen wie etwa Myxödem und akute intermittierende Porphyrie, Nebenwirkungen während der Behandlung mit verschiedenen Arzneien wie etwa Antidiabetika, trizyklischen Antidepressiva, Zytostatika, Barbituraten, Narkotika und Narkotika-Analoga.
Durchfall wird durch eine Veränderung in der Permeabilität im Darm für Elektrolyte und Wasser verursacht. Diese Störung wird häufig durch bakterielle Enterotoxine wie etwa jene, die von Escerichia coli, Camphylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae und Clostridium difficile. Die Störung könnte auch durch intestinale Entzündung verursacht werden. Da die Abgabe von Wasser an die Abgabe von Elektrolyten und Nährstoffen gekoppelt ist, leiden Tiere mit häufigem Durchfall an Mangelernährung, was zur Retardierung der täglichen Gewichtszunahme bei heranwachsenden Tieren führt. Der Körper wirkt diesen Reaktionen durch neuro-hormonale Mechanismen entgegen, wie etwa der Freisetzung von Somatostatin und Opiat-Peptiden aus Interneuronen in der intestinalen Schleimhaut. Diese Polypeptide sind in der Lage, Flüssigkeitssekretion und Durchfall rückgängig zu machen.
Der vorhin beschriebene antisekretorische Faktor (AF) ist teilweise aus Schweinehirnanhangdrüse gereinigt worden und hat eine Umkehrung durch verschiedene Enterotoxine hervorgerufener pathologischer Sekretion gezeigt. Hohe Pegel von AF in Mutterschweinmilch schützen die säugenden Ferkel gegen neonatalen Durchfall.
Antimikrobielle Arzneimittel sind sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin verbreitet bei der Behandlung von Durchfall verwendet worden. Sie werden auch als Futteradditive für Schweine, Kälber und Hühner verwendet, Infolge der raschen Entwicklung von resistenten Bakterien im Darm ist die Verwendung von Antibiotika gegen Enteritis jedoch im Allgemeinen in der Humanmedizin nicht zugelassen und ihre Verwendung geht auch in der Veterinärmedizin zurück.
Andere antidiarrhoische Arzneimittel wirken der Sekretion in der Darmschleimhaut entgegen. Da diese Arzneimittel gegen das Wirtstier gerichtet sind, ist es unwahrscheinlich, dass sich Resistenz gegen diese Arzneimittel entwickeln wird. Diese Typen von Arzneimitteln schließen nervenaktive Arzneimittel wie etwa Phenothiazine und Thioxanthene ein. Infolge einiger ernsthafter Nebenwirkungen sind diese Typen von Arzneimitteln in den meisten Ländern nicht zur Behandlung von Durchfall zugelassen worden. Andere Arzneimittel sind Derivate von Opiaten wie Codein und Loperamid. Da diese Arzneimittel hauptsächlich durch Inhibierung der intestinalen Mobilität wirken, inhibieren sie auch die Entleerung der pathogenen Bakterien aus dem Darm und sollten definitiv nicht gegen dysenterische Ruhrbakterien oder Parasiten empfohlen werden. Kürzlich sind Derivate von Somatostatin eingeführt worden, haben aber bis jetzt infolge von Schwierigkeiten bei der Verabreichung der Arzneimittel und möglicher Wechselwirkungen mit der endokrinen Regulation von Wachstum beschränkt Verwendung gefunden.
Der antisekretorische Faktor (AF) ist infolge der mit dem Erlangen eines reinen Präparats dieses Proteins verbundenen Schwierigkeiten bislang nicht direkt zur Behandlung von Durchfall oder Mangelernährung verwendet worden. Es ist jedoch möglich geworden, ähnliche Proteine in Haustieren hervorzurufen, denen ein spezielles Futter gegeben worden ist (SE-Patent Nr. 9000028-2). Schweine, denen dieses Futter gegeben wurde, erzielten hohe Pegel von AF-artigen Proteinen und wiesen im Vergleich mit Kontrollen eine signifikante Zunahme in der täglichen Wachstumsrate auf. AF in Ratten, die mit Toxin A aus C. difficile konfrontiert wurden, schützt nicht nur vor intestinaler Sekretion sondern auch vor Entzündung und Blutung im Darm.
Es ist eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues rekombinantes Protein und Homologe und Fragmente (Peptide) davon zur Verwendung beim Normalisieren pathologischen Flüssigkeitstransports bereitzustellen. Diese Proteine und Peptide werden gemeinsam antisekretorische Faktoren (AF) genannt. Die Verwendung von AF inhibiert zudem teilweise die Entwicklung von Entzündungsreaktionen verschiedener Ursachen oder beseitigt sie vollständig. Durch die Verwendung der Proteine oder Peptide wird Wiederherstellung auf Normal (Flüssigkeitstransport oder Entzündung) erreicht. Des Weiteren werden die AF-Proteine oder -Peptide effektiv über verschiedene Schleimhäute absorbiert, ohne an Wirksamkeit zu verlieren (im Vergleich zur intravenösen Verabreichung). Folglich existiert eine Vielzahl von Behandlungsvorschriften und ein korrekt verabreichtes Protein oder Peptid macht es möglich, schnell ein gestörtes Flüssigkeitsgleichgewicht (Wasser und Ionen), eine Entzündungsreaktion oder beides zu rekonstituieren.
Zusammenfassend könnten die rekombinanten AF (rAF) und die Homologen und Fragmente davon zur Immundetektion, als Futteradditive für heranwachsende Tiere und als Antidiarrhoikum und Arzneimittel gegen Krankheiten verwendet werden, die mit Ödem, Dehydratisierung und/oder Entzündung einhergehen.
Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind die folgenden:
Ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon.
Ein Fragment des in SEQ ID Nr. 1 gezeigten rekombinanten Proteins, welches Fragment aus der Gruppe ausgewählt ist, die

a) die Aminosäuren Nr. 35–42
b) die Aminosäuren Nr. 35–46
c) die Aminosäuren Nr. 36–51
d) die Aminosäuren Nr. 36–80
e) die Aminosäuren Nr. 1–80

Ein dem Fragment, das die Aminosäuren Nr. 35–42 des in SEQ ID Nr. 1 gezeigten rekombinanten Proteins umfasst, entsprechendes Peptid X₁VCX₂X₃KX₄R, wobei X₁ für I steht oder fehlt, X₂ für H, R oder K steht, X₃ für S, L oder eine andere neutrale Aminosäure steht und X₄ für T oder A steht.
Antikörper gegen ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon.
Ein Protein, das an Antikörper bindet, die für ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon spezifisch sind.
Eine Zubereitung zur Normalisierung von pathologischem Flüssigkeitstransport und/oder entzündlichen Reaktionen, die als Wirkprinzip eine wirksame Menge des rekombinanten Proteins, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon umfasst.
Verwendung eines rekombinanten Proteins, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologen oder Fragmenten davon zur Herstellung einer Zubereitung zur Normalisierung von pathologischem Flüssigkeitstransport und/oder Entzündungsreaktionen.
Futtermittel zur Normalisierung von pathologischem Flüssigkeitstransport und/oder Entzündungsreaktionen in Wirbeltieren, das als Wirkstoff ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon oder einen Organismus umfasst, der in der Lage ist, solch ein Protein oder Homologe oder Fragmente davon herzustellen.
Einen Prozess des Normalisierens pathologischem Flüssigkeitstransports und/oder Entzündungsreaktionen in Wirbeltieren, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines rekombinanten Proteins, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, oder von Homologen oder Fragmenten davon oder eines Organismus, der das Protein oder Homologe oder Fragmente produziert, an das Wirbeltier.
Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon, um das Protein oder Fragmente in Organismen nachzuweisen.
Nukleinsäuren, die für ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon kodieren.
Verwendung von Nukleinsäuren, die für ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon kodieren, zur Herstellung von entsprechenden Proteinen oder Homologen oder Fragmenten.
Verwendung von Sonden oder Primern, die aus Nukleinsäuren erhalten wurden, welche für ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon kodieren, um die Anwesenheit von Nukleinsäuren in Organismen nachzuweisen.
Vektor, der Nukleinsäuren umfasst, die für ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon kodieren.
Wirt ausschließlich Mensch, umfassend einen Vektor, der Nukleinsäuren beinhaltet, die für ein rekombinantes Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon kodieren.
Einen Stamm eines Organismus ausschließlich Mensch, der in der Lage ist, ein Protein, das im Wesentlichen die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon zu produzieren.
Als Organismus, der in der Lage ist, das rekombinante Protein zu produzieren, kann von verschiedenen Typen von Organismen Gebrauch gemacht werden, wie etwa rekombinante Bakterien und eukaryotische Organismen, wie etwa Hefe, Pflanzen und Wirbeltiere ausschließlich Menschen.
Trotz zehnjähriger Versuche, AF durch herkömmliche biochemische Techniken zu reinigen, ist es nicht möglich gewesen, AF in einer homogenen Form zu erhalten. Mittels einer neuen Prozedur zur Herstellung eines halbreinen AF zur Immunisierung und Antiserumauswahl mittels eines immunhistochemischen Verfahrens wurde ein geeignetes Antiserum ausgewählt. Mit diesem Antiserum ist es nun möglich geworden, rekombinantes menschliches cDNA zu klonen, das AF in E. coli exprimiert.
Die Sequenz des neuen cDNA wurde bestimmt und gezeigt, dass sie einzigartig ist. Durch Kenntnis dieser Sequenz wurden Oligonukleotidsonden konstruiert, die mit Menschen- und Schweine-Hypophysen-RNA hybridisieren. Die Größe dieser RNA, ungefähr 1400 Basenpaare, entspricht der Größe der sequenzierten cDNA, die 1309 Basenpaare plus einen Poly(A)-Schwanz umfasst. Es ist gezeigt worden, dass eine partielle cDNA-Sequenz aus Ratten-Hirnanhangdrüse identisch ist mit der der menschlichen cDNA, was eine ubiquitäre Struktur widerspiegelt, die in AF-Genen von unterschiedlichen Arten konserviert wurde. Diese Ähnlichkeit macht es möglich, die gleichen Oligonukleotidsonden zu verwenden, um AF-kodierende RNA und DNA von unterschiedlichen Arten zu identifizieren.
Es ist darüber hinaus möglich geworden, den rAF in einer biologisch aktiven Form zu exprimieren. Das AF-Protein in Form eines Fusionsproteins mit Glutathion-S-Transferase wurde in großen Mengen in E. coli exprimiert und durch Affinitätschromatographie zur Homogenität gereinigt. Nach Abspaltung des Fusionsproteins mit Thrombin erwies sich der rekombinante AF (rAF) als äußerst wirksam, 44 ng (10^–12 mol) geben eine halb-maximale Inhibierung der durch Choleratoxin hervorgerufenen Sekretion in Rattendarm.
Durch Gentechnik wurden kleinere Fragmente von rAF hergestellt. Es zeigte sich, dass die Wirksamkeit von einer kleinen Sequenz herrührt, die aus 7 bis 8 Aminosäuren besteht. Das wurde mit Hilfe von chemischer Festphasensynthese bestätigt, durch welche Technik ein Oktapeptid hergestellt und gezeigt wurde, dass es nahezu so biologisch wirksam ist wie rAF auf molarer Basis. Mit Hilfe zielgerichteter Synthese wurde eine Vielzahl von Sequenzen innerhalb der aktiven Stelle aufgebaut und es wurde gezeigt, dass die Ersetzung bestimmter Aminosäuren möglich ist, ohne die biologische Wirksamkeit aufzuheben.
Die Flüssigkeitssekretion wurde durch das Darmschlingenmodell gemessen: ein Abschnitt (Schlinge) des Dünndarms wird mittels zweier Nähte ligiert; in die Schlinge wird eine bestimmte Menge von Enterotoxin injiziert. Wenn antisekretorische Arzneimittel getestet werden, werden sie zwischen eine Stunde vor und zwei Stunden nach Toxinreizung injiziert. Die Injektion wurde auf drei verschiedenen Wegen durchgeführt; intravenös, intraintestinal und intranasal. Die Flüssigkeit wird in der Schlinge 5 Stunden nach Toxinreizung angesammelt. Die Sekretion wird aus dem Gewicht der angesammelten Flüssigkeit pro cm Darm berechnet.
Die Sequenz des Proteins wurde sowohl direkt durch Aminosäuresequenzierung als auch indirekt durch Deduktion aus der cDNA-Sequenz bestimmt.
Rekombinanter AF scheint sehr geringe toxische oder systemische Wirkungen auszuüben, da keine offensichtlichen toxischen Reaktionen in Ratten beobachtet wurden, denen 100-fach höhere Dosen gegeben wurden als die, die halb-maximale Inhibierung verursachen. Da es wirksam ist, wenn es in den Dünndarm injiziert wird, könnte es peroral verabreicht werden.
Der rekombinante AF inhibiert Sekretion auch wenn er nach Toxinreizung injiziert wird, im Gegensatz zu den getesteten Zubereitungen von natürlichem AF, welche nur wirksam erscheinen, wenn sie vor dem Toxin injiziert werden. Demgemäß könnte rAF sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch angewendet werden.
Darüber hinaus zeigte sich, dass rAF und seine Peptidfragmente cytotoxische Reaktionen und Entzündungen im Darm inhibiert, die durch Toxin A von Clostridium difficile verursacht werden. Mit Hilfe eines Farbstoff-Permeabilitätstests wurde gezeigt, dass rAF und seine Fragmente durch Choleratoxin hervorgerufene pathologische Permeabilitätsänderungen nicht nur in der Darmschleimhaut sondern auch in Plexus choroides rückgängig macht, welches den Flüssigkeitsdruck im Gehirn reguliert.
Antisera gegen rAF wurden in Kaninchen produziert und in enzyme-linked Immunoassays (ELISA) verwendet. Dieser Assay kann zum Messen von AF in Körperflüssigkeiten oder Futter verwendet werden.
Über ein Verfahren zum Reinigen von Antikörpern gegen AF (natürlich oder rekombinant) mittels Affinitätschromatographie an Säulen mit Agarose, die mit rAF gekoppelt ist, wird unten berichtet.
Die Antikörper erwiesen sich auch als wirksam für die Detektion von AF in Gewebeschnitten mittels immunhistochemischer Techniken und für die Detektion von AF im Western-Blot.
Die Erfindung wird nun weiter mittels der folgenden nicht einschränkenden Beispiele zusammen mit der beigefügten Zeichnung beschrieben.
Beispiel 1. Antikörper gegen AF, produziert zum Klonen von cDNA
Antisekretorischer Faktor wurde aus Schweineblut mittels Affinitätschromatographie an Agarose und isoelektrische Fokussierung hergestellt. Zu einem Liter Schweineblut (das antikoagulierende Substanzen enthält) wurden 1 g Natriumthiosulfat und 1 mg Phenylmethylsulfonylfluorid zugegeben. Die Blutzellen wurden durch Zentrifugation separiert und das klare Plasma wurde durch eine Säule aus Sepharose 6B (Pharmacia LKB Biotechnology Stockholm) eluiert, wobei das Gelvolumen etwa 10% des Volumens der Lösung entspricht. Nach Waschen mit drei Bettvolumina von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS = 0.15 M NaCl, 0.05 M Natriumphosphat, pH 7.2) wurde die Säule mit zwei Bettvolumina von 1 M α-Methyl-D-glucosid, gelöst in PBS, eluiert. Das Eluat wurde einkonzentriert und an einem „Omega 10k flow through" Ultrafilter (Filtron Technology Corp.) gegen Wasser dialysiert. Die Fraktion wurde anschließend durch isoelektrisches Fokussieren in einem Ampholingradienten (Pharmacia) pH 4 bis 6 an einer 400 ml Isoelektrofokussierungssäule (LKB, Schweden) fraktioniert. Eine Fraktion, die einen isoelektrischen Punkt zwischen 4.7 und 4.9 aufweist, wurde gesammelt und gegen PBS dialysiert. Entsprechend wurde partiell gereinigter AF in kleine Aliquote aufgeteilt und zur Produktion von Antiserum in Kaninchen gemäß einem kürzlich beschriebenen Verfahren verwendet.
Die Kaninchen wurden immunisiert und die Sera wurden auf ihr Vermögen zum Anfärben intrazellulären Materials in Schnitten von Human-Hirnanhangdrüse getestet (in Beispiel 6 beschriebenes Verfahren). Nur eines der Sera zeigte spezifisches und ausgeprägtes intrazellulares Anfärben ohne extrazelluläre Matrixproteine anzufärben. Dieses Antiserum wurde zum Screening einer cDNA/Lambda-Phage-GT11-Bibliothek aus Human-Hirnanhangdrüse, die Proteine in E. coli exprimiert, verwendet.
Beispiel 2. Screening von cDNA-Bibliotheken aus Human-Hirnanhangdrüse und -Gehirn
Eine 5'-Stretch-cDNA-Bibliothek aus normaler menschlicher Hirnanhangdrüse, erhalten aus Geweben, die aus einem Pool von neun Kaukasiern erhalten wurden, wurde von Clontech Laboratories bezogen. Für das Screening der Bibliothek wurden Phagen auf 3 × 10⁴ Plaque bildende Einheiten pro 150 mm-Schale auf E. coli Y1090-Lysat plattiert. Das kürzlich beschriebene Kaninchen-Antiserum gegen Schweine-AF wurde 4 Stunden lang bei 23°C in 0.5 Volumina von E. coli Y1090-Lysat aufgenommen und auf ein Verhältnis von 1 : 400 verdünnt und das Screening nach Young und Davis (1) durchgeführt. Alkalisch-phosphatasekonjugierte Ziegen-Antikaninchen-Antikörper wurden als zweite Antikörper verwendet (Jackson). Positive Plaques wurden aufgesammelt, in Phagen-Suspensionsmedium [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄, 2% Gelatine] eluiert, replattiert und gescreent, bis alle getesteten Plaques positiv waren.
cDNA-Umklonieren – Phagen-DNA aus AF-Rekombinanten wurden mit Wizard Lambda Preps (Promega) isoliert und mit EcoR1 digeriert. Die Inserts wurden mit Sephaglas BandPrep Kits (Pharmacia) gereinigt, in pGex-1λT-Vektor (Pharmacia) wie vom Hersteller beschrieben umkloniert und in Epicurian Coli XL1-Blue, Top 1-Zellen oder BL21-Zellen (alle drei von Stratagen) transfiziert. Wenn nicht anders angegeben, wurden rAF oder rPeptide in BL21-Zellen bereitet (2).
Amplifikation von cDNA durch PCR – Um die fehlenden 5'-Enden der cDNA zu erhalten, wurde ein PCR-basiertes Verfahren namens RACE (rapid amplification of cDNA ends = schnelle Amplifikation von cDNA-Enden) durchgeführt. Ein modifiziertes RACE-Verfahren, das 5'-RACE-Ready-cDNA mit einem an den 3'-Enden des Humanhirn-cDNA-Moleküls ligiertem Anker-Oligonukleotid erzeugt, wurde von Clontech Laboratories bezogen. Das 5'-Ende wurde von einem Abschnitt der 5'-RACE-Ready-cDNA in zwei PCR-Amplifizierungsschritten unter Verwendung eines 5'-Primers amplifiziert, der komplementär zu dem Anker und zwei ineinander gesetzten genspezifischen 3'-Primern A und B ist (A = Base 429 bis 411 und B = Base 376 bis 359; 1a). Verschiedene kleinere Abschnitte des RACE-Fragments wurde weiter amplifiziert, um die entsprechenden Peptide zu exprimieren und ihre biologischen Eigenschaften zu testen. Die Position der Base und der Aminosäure am Start und am Ende dieser Oligonukleotidfragmente und ihrer entsprechenden Peptide werden in Tabelle 1 gezeigt. Schweine- und Rinder-cDNA (Clontech Laboratories) wurde als Templet zum Amplifizieren der N3 in Tabelle 1 entsprechenden Fragmente verwendet. Variation der Sequenz wurde auch künstlich durch zielgerichtete Mutagenese eingefügt, in welchem Verfahren verschiedene Oligonukleotide entsprechend den Positionen 168 bis 193 synthetisiert wurden, um eine Aminosäure 35 bis 42 (Positionen, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt sind) nach der anderen zu ersetzen. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in pGex-1λT-Vektor durch Verwendung der EcoR1-Stelle kloniert, die im Anker und im genspezifischen Primer gebildet wurde. Um die Sequenz, die durch das RACE-Verfahren erhalten wurde, zu verifizieren, wurden doppelsträngige cDNA aus Human-Hirnanhangdrüse und -gehirn (Clontech) mit Primerpaar C/D amplifiziert, das eine zusätzliche EcoR1-Spaltstelle (1) enthält. Die Primer wurden so entworfen, dass sie das Amplifizieren des ganzen offenen Leserasters (ORF) erlauben. Die Hypophysen- und Gehirn-PCR-Produkte von erwarteter Größe wurden mit EcoR1 digeriert, isoliert und in den Plasmid-Vektor pGex-1λT kloniert.
DNA-Sequenzierung und Oligonukletide – DNA vom Plasmid pGex-1λT wurde als eine Matrize zum Sequenzieren der Inserts durch das Dideoxy-Kettenabbruchverfahren (15) unter Verwendung des Sequenase Version 2.0 Kit (U.S. Biochemical Corp.) verwendet. Ausgangs-Vorwärts- und -Rückwärtsprimer, die Bereiche des pGex-1λT unmittelbar stromaufwärts und stromabwärts der eingesetzten DNA kopieren, wurden von Pharmacia erhalten. Folgeprimer wurden auf der Grundlage der erhaltenen Sequenzinformation synthetisiert (Scandinavian Gene Synthesis AB). Es wurden drei unterschiedliche PCR-Klone sequenziert, um Basenaustausch durch Taq-Polymerase beim 5'-RACE-Verfahren zu vermeiden.
Nukleotidsequenz- und die abgeleiteten Proteinsequendaten wurden zusammengestellt und durch Verwendung von MacVentor 4.1 (Eastman Chemical Co.) analysiert. Um die entsprechende Aminosäuresequenz der cDNA-Inserts vorherzusagen, wurde die Kodonverwendung verschiedener Leseraster verglichen und gaben ein großes offenes Leseraster. Abfrage von DNA- und Proteinsequenzdaten wurde unter Verwendung einer Entrez-CD-ROM-Speicherplatte (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) durchgeführt.
Molekulares Klonen und Sequenzanalyse von cDNA – Zum Screening von cDNA aus Human-Hirnanhangdrüse wurden polyvalente Antisera gegen AF-Protein vom Schwein verwendet. Zwei Klone, die immunreaktive AF exprimieren, wurden isoliert, von Lamda-Phage befreit und in die EcoR1-Stelle des Vektors pGex-1λT umkloniert, wie es im von Pharmacia bereitgestellten Kit beschrieben wurde. Restriktionsanalyse gab Insertgrößen von 1100 bzw. 900 bp. DNA-Sequenzierung der zwei Klone deckte auf, dass die Homologie vollständig ist, mit Ausnahme einer Substitution (1, C ersetzt T an der Position 1011). Eine Sequenz stromaufwärts vom 5'-Ende von Klon 2 wurde mittels des RACE-Verfahrens erhalten. Das Fragment hatte eine Gesamtlänge von 376 bp (nicht den synthetischen Nukleotidarm am 5'-Ende einschließend). Die vollständig rekonstruierte cDNA enthielt 1309 Basenpaare, gefolgt von einem Poly-A-Schwanz, dem ein Poly-A-Signal vorausging (1, Positionen 1289 bis 1295). Es wurde ein offenes Leseraster (ORF) von 1146 bp (Positionen 63 bis 1208) identifiziert.
Beispiel 3. Expression von Säugetier-AF-Protein aus rekombinanten Plasmiden
Aufbau und Reinigung von Fusionsproteinen – Die cDNA-Klone, die durch immunologisches Screening und durch PCR-Amplifizierung der gesamten cDNA erhalten wurden, wurden an pGex-1λT ligiert. Dieser Vektor erlaubt die Expression von fremden Proteinen in E. coli als Fusionen an den C-Terminus der Schistosoma japonicum 26 kDa Gluthathion-S-Transferase (GST), welche mit Hilfe des von Pharmacia bereitgestellten Kits unter nichtdenaturierenden Bedingungen gereinigt werden können. Kurz, Übernachtkulturen von E. coli, transformiert mit rekombinanten pGex-1λT-Plasmiden, wurden in frischem Medium verdünnt und weitere 3 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Proteinexpression wurde durch 0.1 mM IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosid) induziert und nach weiteren 4 Stunden Züchtung bei 30°C wurden die Zellen pelletiert und in PBS resuspendiert. Zellen wurden durch Beschallung aufgelöst, mit 1% Triton X-100 behandelt und 10 min lang bei 12000 g zentrifugiert; der die exprimierten Fusionsproteine enthaltende Überstand wurde durch Durchlaufen durch Glutathionagarose (Pharmacia) gereinigt. Die Fusionsproteine wurden entweder durch Verdrängung durch freies Glutathion eluiert oder wurden über Nacht mit 10 U Rinderthrombin gespalten, um das AF-Protein vom GST-Affinitätsschwanz zu entfernen. Das gesamte Verfahren der Verwendung des pGex-Plasmids und des Reinigens des rekombinanten Proteins oder Peptids wurde mittels der von Pharmacia bereitgestellten Kits durchgeführt.
Sequenz und Größe des rekombinanten AF-Proteins – Um die kodierende Sequenz zu bestätigen, wurde das Transkript voller Länge durch Verwendung der PCR-Amplifizierung von Hypophysen- und Gehirn-cDNA isoliert. Unter Verwendung des Primerpaars C/D, wurden 1215 pb isoliert, die mit der Sequenz von Klon-4 (1) identisch sind. Das offene Leseraster kodierte 382 Aminosäuren mit einer berechneten molekularen Masse von 41.14 kDa und einem berechneten pI von 4.9.
Die AF-Klone-1, 2 und 3 sowie die Oligonukleotide N1 bis N15 (1 und Tabelle 1) wurden so in den pGex-1λT-Plasmid-Vektor ligiert, dass das ORF im Raster mit dem Glutathion-S-Transferaseprotein (GST-Protein) war. Die Konstrukte wurden in E. coli transformiert und die Expression des Fusionsproteins wurde mit IPTG induziert. Die gereinigten Fusionsproteine und das thrombingespaltene AF-Protein oder -Peptid wurden SDS-PAGE und Western-Blotting unterzogen, wobei Antiserum gegen antisekretorischen Faktor vom Schwein verwendet wurde. Anfärben der Proteine mit Coomassie Brillantblau deckte für jedes Protein diskrete Banden auf, mit Ausnahme für das GST-AF-1-Protein, was den Abbau in kleinere Komponenten offenbarte.
Festphasenpeptidsynthese- Kleinere Peptide (P₇ bis P₁₈ in Tabelle 1) wurden auf fester Phase in einem Applied Biosystems Peptide-Synthesiser hergestellt (K. J. Ross-Petersen AS). Die Reinheit eines jeden Peptids betrug 93 bis 100%, wie durch Umkehrphasen-HPLC an Deltapak C18, 300 A unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser/Acetonitril evaluiert wurde.
Aminosäuresequenzierung – Proteinsequenzanalyse wurde durchgeführt, um das identifizierte ORF weiter zu validieren. Die reinen AF-Proteine wurden in 10% Macro-Slab-Gel SDS-PAGE (14) laufen gelassen und die Proteine durch Electroblotting (Bio-Rad) auf eine Problot-Membran (Applied Biosystems) transferiert. Stellen, die durch Anfärben mit Ponceau S sichtbar gemacht wurden, wurden aus dem Blot exzidiert und die ersten 20 Aminosäuren des Proteins wurden durch automatischen Edman-Abbau auf einem automatischen Sequenzer (Applied Biosystems) sequenziert.
Es wurden die N-terminalen Sequenzen von Klon-2 und Klon-3 bestimmt und gezeigt, dass sie perfekt mit den Aminosäuren 63 bis 75 bzw. 130 bis 140 der vorhergesagten Sequenz (1) übereinstimmen.
Vergleich mit anderen, von GenBank erhältlichen Proteinsequenzen zeigte, dass die Sequenz von rAF (1) in all seinen Teilen einzigartig ist und keine vergleichbare Sequenz berichtet worden ist.
Die ersten zehn Reste des Proteins erscheinen als relativ hydrophob, wenn sie nach Kyte-Doolittle (22) analysiert werden, und können ein Signalpeptid bilden, das vor der Exozytose des Proteins heraus gespalten wird. Diese Interpretation wird durch Western-Blot-Analyse (3) unterstützt, bei der das rekombinante Protein als eine geringfügig höhere Molekularmasse aufweisend erscheint als das Proteinextrakt aus Hirnanhangdrüse. Einige dieser Unterschiede könnten auch eine Folge der zusätzlichen fünf Aminosäuren in dem rekombinanten Protein sein, die die Thrombin-Spaltstelle des Fusionsproteins bilden.
Beispiel 4. Herstellung und Testen von Antisera gegegn rAF
Atitsera gegen rekombinantes GST-AF-Fusionsprotein – Antikörper gegen die gereinigten Fusionsproteine GST-AF-1, GST-AF-2 und thrombingespaltenes reines AF-1-Protein (= rAF) zur Verwendung in ELISA, Western Blot und immunhistochemischen Studien wurden in Kaninchen produziert. Jedem Kaninchen wurde 100 μg an Antigen in 1 ml PBS gemischt mit einem gleichen Volumen von Freunds kompletten Adjuvans verabreicht; jede Immunisierung wurde auf 8 bis 10 Portionen verteilt, die intrakutan in den Rücken injiziert wurden; Zwei Booster-Dosen mit 50 μg Antigen wurden über 3 und 5 Wochen injiziert, die letzte ohne Freunds komplettem Adjuvans. Den Kaninchen wurde 6 Tage nach dem letzten Booster Blut entnommen und es wurde Serum hergestellt und bei –20°C gelagert. Die Empfindlichkeit des Antiserums wurde mit einem Dot-Blot-Assay getestet. GST-AF-2 wurde auf eine ECL-Nitrocellulosemembran in 1/5-Verdünnungen aufgetragen und das Antiserum 1 : 1000 verdünnt. Die Membran wurde 16 Stunden lang bei 4°C mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockiert und dann 1½ Stunden mit einer Verdünnung 1 : 800 von Kaninchen-Anti-GST-AF- oder Schweine-AF-Antiserum inkubiert. Der Blot wurde mit alkalisch-phosphatasekonjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Immunglobulin gefolgt von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und p-Nitrotetrazoliumblau (Boehringer Mannheim) entwickelt. Die geschätzte Grenze für Antigenerfassung betrug bei diesem Test etwa 1 ng.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblotting – SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von Human- und Schweine-Hinrnanhangdrüse-Extrakten und reinen AF-Proteinen wurde in 10% Acrylamid-Minislabgelen durchgeführt, im Wesentlichen wie es von Laemmli (4) beschrieben wurde, mit der Modifikation, dass Bisacrylamid als ein Netzwerkbildner durch N,N'-Diallyltartardiamid mit der entsprechenden Molarität ersetzt wurde. Pyronin Y (Sigma) wurde als ein Marker der elektrophoretischen Front verwendet. Vorangefärbte Molekulargewichtreferenz wurde von BDH erworben. Proteine wurden dann entweder mit Coomassie Brillantblau angefärbt oder elektrophoretisch auf 0.45 mm Porengröße ECL Nitrocellulose (Amersham) zum Immunoblotting transferiert. Die anschließenden Inkubationen mit BSA, konjugiertem Anti-IgG und alkalischem Phosphatasesubstrat waren die gleichen wie für den oben beschriebenen Dot-Blot-Assay.
Wie es oben angegeben wurde, machte das Anfärben mit Coomassie Brillantblau keine diskreten Banden für das GST-AF-1-Protein deutlich, was wahrscheinlich eine Folge des proteolytischen Abbaus in kleinere Komponenten ist. Bei der Westernblot-Analyse ergab das Protein voller Länge ein wesentlich stärkeres Signal als die abgebauten Produkte (2). Die starke Reaktion mit dem Antiserum gegen Schweine-AF deutet darauf hin, dass die rekombinanten Proteine in der Tat die gleiche Immunreaktivität wie AF aufweisen. Das Molekulargewicht des Proteins voller Länge erscheint 60 kDa zu sein, was größer ist als das wahre Molekulargewicht von 41139 Da, das aus der Aminosäurezusammensetzung berechnet wurde. Darüber hinaus wurden die Proteine ebenfalls Immunoblotting unterzogen und mit Antiserum untersucht, das gegen GST-AF-2 erzeugt wurde, welches an die thrombingespaltenen Proteine gebunden ist (3).
Antiserum gegen rekombinantes GST-AF-2 reagierte mit dem natürlich auftretenden AF-Protein einer scheinbaren Molmasse von 60 kDa und mit einigen kleineren Komponenten, wahrscheinlich enzymatische Abbauprodukte (3a).
ELISA für das Erfassen von AF-Konzentrationen – ELISA-Assays wurden unter verwendung von Anti-AF-1 und Anti-AF-2 nach einem früher beschriebenen Verfahren (5) durchgeführt. Wie es in 3b gezeigt ist, betrug die Empfindlichkeit des Tests mit dem rohen Antiserum zwischen 1 bis 10 μg Protein, während der Test mit dem affinitätsgereinigten Antikörper eine Empfindlichkeit zwischen 5 und 50 ng Protein aufwies.
Beispiel 5. Northern-Blot-Analyse von RNA aus Hirnanhangdrüse
Northern-Blot-Analyse – menschliche Hirnanhangdrüsen wurden postmortal aus dem Sahlgrenska-Krankenhaus erhalten (die Erlaubnis wurde von der Schwedischen Gesundheits- und Wohlfahrtsbehörde erteilt; 2§ transplantationslagen, 1975: 190). Um RNA zu erhalten, wurden Hirnanhangdrüsen mit Guanidiniumthiocyanat-RNA nach Chomczynski und Sacchi (6) extrahiert. Polyadenylierte RNA wurde mittels eines kommerziellen Kits (Pharmacia) unter Verwendung von Säulen mit OligodT-Cellulose selektiert. Zusätzlich wurde ein Pool von menschlicher Hypophysen-mRNA von 107 Personen verwendet, der von Clontech erworben wurde. Fünf μg einer jeden Probe von Poly(A+)RNA wurden mit Glyoxal behandelt und in einem 1.2% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen (7). Nach 3 Stunden langem kapillar-alkalischem Transfer auf Hybond N+ Nylon-Membranen (Amersham) in 0.05 M NaOH, wurden 24 Stunden lang jeweils bei 42°C Vorhybridisierung und Hybridisierung ausgeführt. Die Hybridisierungslösung enthielt 50% Formamid, 5 × SSPE, 10 × Denharts-Lösung mit 250 μg/ml denaturierter DNA mit niedrigem Molekulargewicht und 50 μg/ml Polyadenylsäure. Die Blots wurden mit vier verschiedenen Antisens-Oligonukleotiden mit 28 bp untersucht, die die Positionen 132 bis 105 (Primer E), 297 bis 270 (Primer F), 748 bis 721 (Primer G) und 833 bis 806 (Primer H) der Sequenz (1) umfassen; die Sonden wurden am 3'-Ende mit Terminaler Transferase (Boehringer Mannheim) plus [α³²P]ddATP (Amersham) markiert und an Nick-Säulen (Pharmacia) gereinigt. Fünf Nachwaschungen in 5 × SSPE/0.1% SDS bis 0.5 × SSPE/0.1% SDS wurden bei 42°C jeweils 30 min lang ausgeführt, mit einer Wiederholung der letzten Waschung. Die Filter wurden 7 Tage lang Hyperfilm MP (Amersham) ausgesetzt.
Expression in Hirnanhangdrüse – Northern-Blot-Analyse wurde mit einer Mischung aus vier Oligonukleotidsonden durchgeführt, die mit verschiedenen Sequenzen entlang der klonierten cDNA (4) hybridisieren. Die Sonden hybridisierten mit einer einzelnen Bande von etwa 1400 pb in der separierten mRNA aus Hirnanhangdrüse. Die stärksten Signale wurden mit dem menschlichen Material erhalten, aber das Schweinematerial kreuzreagierte ebenfalls.
Beispiel 6. Verteilung von AF in Schnitten von Hirnanhangdrüse
Arten und Gewebe – Menschliche Hirnanhangdrüsen wurden postmortal aus dem Sahlgrenska-Krankenhaus erhalten (die Erlaubnis wurde von der Schwedischen Gesundheits- und Wohlfahrtsbehörde erteilt; 2§ transplantationslagen, 1975: 190). Drüsen wurden bei –70°C gefroren gehalten, mit Ausnahme jener, die für histologische Untersuchung verwendet wurden, welche 24 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd, gelöst in phoshatgepufferter Kochsalzlösung (PBS = 0.15 M NaCl, 0.05 M Natriumphosphat, pH 7.2), fixiert wurden und danach in 7.5% Sucrose in PBS übertragen wurden. Hirnanhangdrüsen von Schweinen, 5 bis 7 Monate alt, erhalten aus einem Schlachthaus, wurden während des Transports auf Trockeneis gelagert und bei –70°C gefroren gehalten, bis sie verwendet wurden. Sprague-Dawley-Ratten, 2 bis 3 Monate alt, wurden für den Bioassay von B & K Universal AB, Sollentuna, Schweden erhalten. Kaninchen (Neuseeland Weiß) für Immunisierungen wurden von Lidköping Kaninfarm, Schweden erhalten.
Immunhistochemie – Die fixierten Hirnanhangdrüsen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und Kryoschnitte, 7 μm dick, wurden angefertigt. Von jeder Probe wurden 5 bis 10 Schnitte, umfassend verschiedene Teile der Hirnanhangdrüse, auf Objektträgern befestigt. Die Schnitte wurden in 5% fettfreier, getrockneter Milch blockiert und mit primärem Kaninchen-Antiserum (Anti-GST-AF-2-Fusionsprotein), verdünnt 1 : 4000 bis 1 : 8000 in einer Feuchtkammer übernacht bei 4°C inkubiert. Nach Spülen in Puffer wurden die Proben 1 Stunde lang bei 23°C mit alkalischphosphatasekonjugiertem Schweine-Antikaninchen-Immunglobulinen, verdünnt 1 : 50 (Dako A/S), inkubiert. Die Immunreaktion wurde mit Phosphatasesubstraten sichtbar gemacht, wie es an anderer Stelle beschrieben ist (8). Kontrollschnitte wurden mit Immunserum inkubiert, absorbiert mit einem Überschuss an GST-AF-2-Protein oder mit allen Inkubationsschritten mit Ausnahme der primären Antikörper.
Verteilung von AF in Schnitten von Hirnanhangdrüse – Die Verteilung von AF in Schnitten von menschlichen Hirnanhangdrüsen wurde mit immunhistochemischen Techniken studiert (5). Bei allen untersuchten Arten wurde eine moderate Zahl von Zellen in der Adenohypophyse angefärbt; das immungefärbte Material schien in den Zellkörnchen im Cytoplasma lokalisiert zu sein; Präabsorption des Immunserums mit einem Überschuss von GST-AF-2-Protein beseitigte das Signal. Es wurde keine Färbung im hinteren Teil (Neurohypophyse) beobachtet.
Die Verteilung von immunreaktivem Material in der Hirnanhangdrüse demonstrierte ausschließlich intrazelluläre Verteilung von AF in sekretierenden Zellen des Vorderlappens (Adenohypophyse). Die Proteine, die von diesem Lappen ausströmen, schließen Wachtumshormone, Thyrotropin, Corticotropin, Prolactin und luteinisierendes Hormon ein. Die Passage dieser Hormone von der intrazellularen Lokalisation zum Gefäßsystem wird durch Releasefaktoren ausgelöst, die von neuroendokrinen Zellen im Hypothalamus erzeugt werden.
Beispiel 7. Biologische Aktivität von rAF
Antisekretorische Aktivität – Die antisekretorische Aktivität wurde in einem Ratten-Darmschleifenmodell gemessen, wie es kürzlich beschrieben wurde (9). Eine Jejunalschlinge wurde mit 3 μg von Choleratoxin gereizt. Entweder verschiedene Dosen von gereinigten AF-1-Proteinen oder PBS (Kontrolle) wurden vor oder nach der Reizsetzung mit Choleratoxin injiziert. Das Gewicht der angesammelten Flüssigkeit in der Darmschlinge (mg/cm) wurde nach fünf Stunden aufgezeichnet. Jede AF-Präparation wurde in wenigstens sechs Ratten getestet. Fisher's PLSD wurde für statistische Analyse der Daten verwendet.
Biologische Aktivität von rAF-Protein – Die biologische Aktivität von reinem rAF-Protein von Klon-1, erzeugt in E. coli, wurde in einem Rattenmodell getestet. Die Kapazität des rAF, die intestinale Flüssigkeitssekretion zu inhibieren, wenn es 20 bis 30 Sekunden vor der Darmreizsetzung mit Choleratoxin intravenös injiziert wurde, ist in 6 gezeigt. In Kontrolltieren, denen nur Puffer injiziert wurde, verursachte das Choleratoxin eine ausgeprägte Sekretion, 4129 mg Flüssigkeit pro cm darm. Das reine rAF verursachte dosisabhängige Inhibierung der Cholera-Sekretion, die deutlich unterschiedlich zu der Antwort auf den Puffer war (p < 0.01, n = 6). Neun ng von Klon-1-Protein ist ausreichend, um die Antwort um 34% zu reduzieren, wohingegen sie 44 ng (10^–12 mol) und 220 ng um 46% bzw. 78% reduzierte. Die biologische Aktivität von rekombinantem AF ist größer als die irgendeines uns bekannten Enterotoxins und größer als die irgendeines intestinalen Hormons oder Neuropeptids, das den Wasser- und Elektrolyttransport ändert. Darüber hinaus ist der Aktivitätspegel von Human-rAF in Ratten überraschend hoch, was möglicherweise eine ubiquitäre Struktur widerspiegelt, die in rAF-Molekülen von verschiedenen Arten konserviert wurde. Diese Hypothese wird durch die Kreuzreaktivität zwischen Human- und Schweinematerial unterstützt, die bei der Western-Blot- und Northern-Blot-Analyse erhalten wurde.
Die Kapazität von 0.5 μg von rAF, um Darmsekretion zu inhibieren, wenn es 20 bis 30 Sekunden vor und 90 Minuten nach Choleratoxin-Reizsetzung intravenös injiziert wird, wurde verglichen (7). Beide Verabreichungen ergaben signifikante Inhibierung im Vergleich zu Kontrolltieren (p < 0.01, n = 6). Demgemäß war das rekombinante Protein, im Gegensatz zu natürlichem AF, auch wirksam, wenn es nach der Toxin-Reizsetzung verabreicht wurde, was rAF sinnvoll für therapeutische Behandlung von Diarrhö macht.
3 μg rAF wurde in eine 8 bis 10 cm lange Schlinge injiziert, die unmittelbar proximal zu der Schlinge platziert war, die mit Choleratoxin gereizt wurde. Das rAF wurde entweder 20 bis 30 Sekunden vor oder 90 Minuten nach der Toxin-Reizsetzung induziert. In 8 ist gezeigt, dass beide Testgruppen eine signifikante Reduzierung der Flüssigkeitssekretion im Vergleich zu Kontrollen erreichten (p < 0.01; n = 6); zwischen den zwei Testgruppen wurden keine Unterschiede beobachtet. Dieses Experiment legt nahe, dass rAF nach oraler Verabreichung aktiv ist und als ein Additiv in Tierfutter verwendet werden könnte, vorausgesetzt dass keine ernsthaften Nebenwirkungen erhalten werden.
Bei den oben beschriebenen Beispielen wurde das rAF in Epicurian Coli XL-1-Zellen produziert. In diesen Zellen wurde viel des produzierten rAF in kleinere Peptide abgebaut. Wenn rAF in BL21-Zellen produziert wurden, wurde nur ein kleiner Teil des rAF abgebaut, während in Top-1-Zellen kein Abbau beobachtet wurde. Überaschenderweise war die biologische Aktivität proportional zu dem Ausmaß des Abbaus, d. h. stärkerer Abbau führte zu größerer Aktivität. Deshalb wurden verschiedene kürzere Fragmente produziert, um sie auf ihre mögliche biologische Aktivität zu testen.
Wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, wurden diese Fragmente intravenös vor der Choleratoxin-Reizsetzung auf die gleiche Weise getestet wie es oben für das intakte rAF beschrieben wurde. Die von Klon 2 und 3 exprimierten Peptide, die in Mengen von 0.1, 1 und 10 μg getestet wurden, hatten keinen Effekt auf die Toxinatwort. Im Gegensatz dazu hatte ein Mikrogramm des Peptids, das von dem RACE-Fragment (Klon 4) exprimiert wurde, einen ausgeprägten Effekt. Von dem RACE-Fragment wurden viele kürzere Konstrukte gefertigt und in pGex-1-Lamda exprimiert. Wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, wurde gefunden, dass die aktive Stelle zwischen Aminosäurerest 35 bis 51 situiert ist. Um die aktive Stelle genauer zu bestimmen, wurden drei kleine Peptide durch Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Zwei von diesen waren aktiv, Peptid 35 bis 46 (P3) und Peptid 35 bis 42 (P1); das letzte Octapeptid IVCHSKTR (P1) war in Dosen von weniger als 1 ng aktiv, wobei es auf einer molaren Basis fast so aktiv ist wie das intakte rAF. Im Gegensatz dazu zeigte ein kürzeres Hexapeptid VCHSKT (P2) keinen Effekt, wenn es in Dosen zwischen 1 ng und 10 μg getestet wurde.
Ein Peptid X₁VCX₂X₃KX₄R entsprechend dem Humanfragment P1 aber mit bestimmten Veränderungen und/oder Streichungen ist ebenfalls durch zielgerichtete Mutagenese produziert und auf biologische Aktivität getestet worden. Es wurde auch ein Vergleich von Sequenzen von Rinder- und Schweine-cDNA gemacht. Diese Studien legen die folgenden Veränderungen und/oder Streichungen nahe:
X₁ ist I oder fehlt
X₂ ist H, R oder K
X₃ ist S, L oder eine andere neutrale Aminosäure
X₄ ist T oder A
Tabelle 1
Der Effekt von rAF auf Entzündung in der Darmschleimhaut wurde auch im Ratten-Darmschleifenmodell getestet. Demgemäß wurden 20 Ratten mit 0.5 μg von Toxin A aus Clostridium difficile (10) konfrontiert und die entzündliche und Flüssigkeitssekretion nach 2.5 bzw. 5 Stunden gemessen (10 + 10 Ratten). Die Hälfte dieser Ratten in jeder Gruppe erhielt 30 Sekunden vor der Reizung 100 ng von rAF; die andere Hälfte erhielt PBS-Puffer als Kontrolle. Nach Tötung der Ratten wurden die Schlingen herausgeschnitten und der mittlere 2 bis 3 cm Teil der Schlingen wurde auf Trockeneis eingefroren. Die gefrorenen Proben wurden dann unter Verwendung eines Leica-Kryostaten in 8 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden angefärbt, um durch Enzymhistochemie alkalische Phosphatasen zu demonstrieren. Alkalische Phosphatasen werden durch die Darm-Epithelzellen exprimiert und das anfärben erlaubt eine Beurteilung der Unversehrtheit des Darm-Epithels.
Die Ergebnisse (9) offenbarten, dass die Kontrollratten ausgeprägte Schädigung der Darmschleimhaut entwickelten: nach 2.5 Stunden wurde das Abstoßen von Epithelzellen von der Basalmembran zusammen mit nekrotischem Gewebe beobachtet, wohingegen nach fünf Stunden ausgeprägte Blutung beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu entwickelten Tiere, die mit rAF behandelt wurden, keine Abstoßung, Nekrose oder Blutung. Die durch Toxin A induzierte Flüssigkeitssekretion wurde auch von 1994 bis 1375 mg/cm nach 2.5 Stunden (p < 0.01) und von 421 ± 3 bis 203 ± 6 mg/cm nach 6 Stunden (5 Ratten/Gruppe, p < 0.01) inhibiert.
Ein ähnliches Experiment wurde mit 0.5 μg des Peptids IVCHSKTR (= P1) im Ersatz des rAF-Proteins durchgeführt. Das Oktapeptid erzielte den gleichen Effekt auf durch Toxin A induzierte Darmentzündung und Flüssigkeitssekretion, wie es in 9 gezeigt ist.
Toxizität – Um die Toxizität von rAF zu testen, wurde es in einer hohen Dosis, 50 μg pro Ratte, injiziert. Es wurden keine offensichtlichen Reaktionen während eines Beobachtungszeitraums von einer Woche registriert.
Beispiel 8. Biologische Aktivität von rAF auf Darmdurchlässigkeit
Um den Effekt von rAF auf die Durchlässigkeit einer organischen Substanz zu evaluieren, die im Blut gelöst ist, wurde ein Test mit dem Farbstoff Evans-Blau nach dem kürzlich beschriebenen Verfahren (11) durchgeführt. Das Experiment wurde anfänglich durchgeführt, wie es oben bei Beispiel 7 und Fig. Beschrieben wurde, mit intravenöser Injektion von rAF vor der Choleratoxin-Reizsetzung. Es wurde jedoch keine Flüssigkeitssekretion gemessen sondern 90 Minuten nach der Toxin-Reizsetzung wurde Evans-Blau-Farbstoff, 1 ml einer 1.5% Lösung in PBS, intravenös injiziert. Dem Farbstoff wurde erlaubt, einen Zeitraum von 5 Minuten lang zu zirkulieren. Danach wurde die Ratte transkardialer Perfusion über die linke Herzkammer – rechter Vorhof unterzogen (unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe [Cole Parmer Instruments, Chicago, Ill., USA]), mit 200 ml von 4°C PBS/Alseviers Lösung (Verhältnis 1/1) während einer Zeitdauer von etwa 150 Sekunden, durchgeführt unter Ether-Betäubung. Diese Prozedur wurde unternommen, um alles im Gefäßsystem vorhandene EB zu entfernen, nur das EB im Darmgewebe zurückzulassend, das durch die Formamidextraktion des Farbstoffs erfasst wird.
Die Ergebnisse in Tabelle 2 demonstrieren, dass CT-Reizsetzung die Menge von EB, die aus dem Darmgewebe extrahiert werden kann, signifikant (p < 0.001) um etwa 43% erhöht, während eine intravenöse Injektion von 1 BrT vor der Choleratoxin-Reizsetzung diese Erhöhung verhindert, d. h. die Menge EB, die aus dem Gewebe in Gruppe 1 (Kontrolle) extrahiert wurde, wich nicht von der in Gruppe 3 (1 rAF + CT) ab.
Tabelle 2
Die in den 10 und 11 gezeigten Ergebnisse demonstrieren die Extravasation des Azofarbstoffs Evansblau im Dünndarm und im entsprechenden Plexus choroideus aus dem Seitenvertikel des Gehirns nach Darmreizsetzung mit Choleratoxin, mit und ohne vorherige Behandlung der Ratten mit P1 (IVCHSKTR).
Die Experimente wurden auf die folgende Weise durchgeführt: Männliche Sprague-Dawley-Ratten, 350 g schwer, wurden 18 Stunden vor der experimentellen Prozedur hungern gelassen, hatten aber freies Übermaß an Wasser. Die Ratten wurden in Gruppen von sechs verwendet. Das Peptid P1, Choleratoxin (CT) und PBS wurden gemäß Tabelle 3 verabreicht.
Tabelle 3
Die i. v. Injektion von P1 (0.5 g) oder PBS wurde 10 bis 15 Sekunden vor der peroralen Reizsetzung mit 100 μg CT oder mit PBS durchgeführt; 60 Minuten nach der peroralen Reizsetzung wurden die Ratten mit Ether betäubt und iv. mit Evans-Blau injiziert. Dem Farbstoff wurde erlaubt, sich weitere 30 Minuten zu äquilibrieren, worauf die Ratten wiederum mit Ether betäubt wurden und interkardial über die linke Herzkammer mit 250 ml von Alsevers-Lösung/PBS = 50/50 perfundiert, um allen im Gefäßsystem vorhandenen Farbstoff zu entfernen. Nach dieser Perfusionsbehardlung, die während etwa 2 bis 3 Minuten durchgeführt wurde, sollte die registrierte Fluoreszenz lediglich den außerhalb des Gefäßsystems vorhandenen Farbstoff repräsentieren.
Vom Gehirn und einem Teil des Dünndarms wurden Proben entnommen und auf Trockeneis eingefroren und es wurden 8 μm dicke Kryoschnitte angefertigt. Die Schnitte wurden luftgetrocknet und in einem xylolhaltigen Aufbewahrungsmedium gelagert. Die Schnitte wurden in einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung einer Filterkombination betrachtet, die mit der identisch ist, die für mit Rhodamin emittierte Fluoreszenz verwendet wird.
Die Ergebnisse in den 10 und 11 demonstrieren, dass die Fluoreszenzintensität (weiße Farbe) sowohl beim Dünndarm (10) als auch beim Plexus choreideus (11) in Gruppe A (P1 iv + CT po) und C (PBS iv + PBS po) von gleicher Größenordnung ist. Im Vergleich mit der hohen Fluoreszenzintensität beim Dünndarm sowie beim Plexus choreideus in Gruppe B (PBS iv + CT po) demonstrieren die Ergebnisse klar, dass Injektion des Oktapeptids vor der Toxin-Reizsetzung die CT-induzierte extravaskuläre Penetration von Evans-Blau inhibiert. Die Ergebnisse legen nahe, dass dies nicht nur beim Gefäßsystem des Dünndarms richtig ist, sondern auch im Plexus choreideus des Seitenventrikels des Gehirns.
Zusammenfassend: der Effekt von intravenöser Verabreichung des Oktapeptids IVCHSKTR inhibiert durch Choleratoxin induzierte extravaskuläre Penetration von Evans-Blau im Dünndarm sowie im Plexus choreideus im Zentralen Nervensystem.
Demgemäß ist die Wirkung von rAF und seiner Peptid-Derivate nicht nur auf den Dünndarm beschränkt, sondern beeinflusst auch die Durchlässigkeit von Blutgefäßen im Zentralen Nervensystem. Diese Befunde indizieren, dass rAF und seine Peptid-Derivate verwendet werden können, um pathologischen intrakraniellen Druck, Druckänderung im Mittelohr und verschiedene Formen von Durchlässigkeitsänderungen bei Blutgefäßen umzukehren.
LITERATURNACHWEISE

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FIGURENLEGENDEN
1a und fortgesetzt in 1b. Nukleinsäuresequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des neuen Humanproteins. Die bestätigte Aminosäuresequenz ist unterstrichen.
1c. Horizontale Karte, die geklonte cDNA und Oligonukleotid-Primer zeigt.
2. Mit Coomassie Brillantblau angefärbtes SDS-Polyacrylamid-Minigel (A) und Immunoblot, sondiert mit Antiserum gegen Schweine-AF (B). Bahnen mit ungestrichenen Zahlen beinhalten glutathion-agarose-gereinigte GST-AF-Fusionsproteine AF-1, AF-2 und AF-3, wohingegen Bahnen mit gestichenen Zahlen die Fusionsproteine enthält, die mit Thrombin gespalten wurden. Molekulargewichtsreferenzen (R), (BDH), sind links angegeben. Das GST-AF-Fusionsprotein ist hoch abgebaut, aber die Immunoblotanalyse zeigt nur die Erfassung eines Proteins voller Länge und spontane Thrombinspaltprodukte. Es existiert ein 26 kDa Produkt im GST-AF-3-Protein, wahrscheinlich der Glutathion-S-Transferaseschwanz, der unabhängig exprimiert worden ist.
3a. Westernblot unter Verwendung von Antiserum gegen rekombinantes Protein AF-2. Zur linken Schweine (P) und drei Humanhirnanhangdrüsen (H1, H2, H3); und zur Rechten die drei rekombinanten Proteine AF-1, AF-2 und AF-3 (siehe 2) wurden appliziert; in der Mitte der Molekulargewichtsstandard (R).
3b. Enzymverlinkter Immunoassay (ELISA) von rAF unter Verwendung von rohem Antiserum und affinitätsgereinigten Antikörpern, die in Kaninchen erzeugt wurden.
4. Autoradiogramm des Northern-Blots von RNA aus einer Human- und Schweine-Hirnanhangdrüse (p = zusammengefasstes und i = individuelles Material). In jedem Becken wurden fünf mg von gereinigter mRNA appliziert; es wurden am 3'-Ende mit ³²P markierte Oligonukleotidsonden verwendet und das Autoradiogramm nach 7 Tagen entwickelt.
5 Kryoschnitte von Adenohypophyse, die mit Antiserum gegen rekombinantes Protein GST-AF-2 angefärbt wurden. A. Schnitte, die mit Immunserum inkubiert wurden, die abgelöste Zellen mit unterschiedlichen Graden an positiver Immunreaktivität zeigen (ausgefüllte Pfeile). Bei vielen Zellen fehlt die Anfärbung vollständig (offene Pfeile). B. fortlaufende Schnitte zu A, inkubiert mit Immunserum, vorangefärbt mit Überschuss an rekombinantem Protein GST-AF-2. Es gibt keine besondere Färbung der Zellen. C und D. Größere Vergrößerungen von immunpositiven Zellen, die cytoplasmatisches Anfärben von endokrinen Zellen demonstrieren, n = Kern, c = Zytoplasma.
6. Biologische Aktivität von rekombinantem Protein AF-1, Testen der Inhibierung von durch Choleratoxin iduzierter Flüssigkeitssekretion. Abgestufte Dosen des Proteins wurden intravenös in Ratten injiziert; drei μg von Choleratoxin wurde in eine Darmschlinge injiziert; nach fünf Stunden wurde die angesammelte Flüssigkeit (mg/cm Darm) in der Schlinge gemessen. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert ± Stichproben- und Analysefehler einer Gruppe von sechs Tieren.
7. Biologische Aktivität von intravenös injiziertem rAF-1; 0.5 μg von rAF wurde 20 bis 30 Sekunden vor oder 90 Minuten nach der Reizsetzung mit 3 μg von Choleratoxin in eine Ratten-Darmschlinge injiziert.
8. Biologische Aktivität von intraluminar injiziertem rAF-1; 3 μg von rAF wurde 20 bis 30 Sekunden vor oder 90 Minuten nach der Reizsetzung mit 3 μg von Choleratoxin in eine Ratten-Darmschlinge injiziert; das rAF wurde etwa 5 cm proximal zur Schlinge injiziert, in der das Toxin injiziert wurde.
9. A (×2.5) sind Kontrollschlingen (PBS), die zelluläre Trümmer im Darm-Lumen (L) zeigen, aber keine Färbung der verbliebenen Schleimhaut, was eine vollständige Zerstörung des Epithelbelags nahe legt. B (0.5 μl von P1 vor der Toxin-Reizsetzung) zeigt einen klar abgegrenzten Epithelbelag, der Zotten bildet, was eine konservierte und normale Darmschleimhaut nahe legt. L = Darm-Lumen. Balken = 500 μm. C (×10) zeigt die zerstörte Schleimhaut in der mit PBS behandelten Kontrollgruppe und D zeigt die entsprechende Schleimhaut in der experimentellen (mit P1 behandelten) Gruppe. Der schwarze Pfeil zeigt auf den Epithelbelag, LP = Lamina propria, mm = Mukosa muscularis, offener Pfeil zeigt auf die Kryptenzellen. Balken = 100 μm. E (×25) zeigt die zerstörte Schleimhaut in der Kontrollgruppe (mit PBS behandelt), und F zeigt eine entsprechende Vergrößerung aus einer Ratte, die vor der Toxin-Reizsetzung P1-Behandlung unterzogen wurde. Balken = 50 μm.
10. Evans-Blau-Fluoreszenz in jejunalen Proben aus drei Gruppen von Ratten, die mit Choleratoxin (CT) oder Kontrollpuffer (PBS) behandelt wurden; Vorbehandlung mit antisekretorischem Peptid P1 oder Kontrollpuffer (PBS). LP = Lamina propria. Schwarzer Pfeil zeigt den Epithelzellbelag an; offener Pfeilkopf zeigt Kryptenzellen an. Balken = 100 μm.
11. Evans-Blau-Fluoreszenz in Proben von Plexus choreideus aus den Ratten, die in 10 gezeigt sind. Balken = 50 μm.
Sequenzauflistung

Claims

Ein rekombinantes Protein, das die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder Homologe oder Fragmente davon, mit antisekretorischer Aktivität.
Ein Fragment des in SEQ ID Nr. 1 gezeigten rekombinanten Proteins nach Anspruch 1, wobei das Fragment aus der Gruppe ausgewählt ist, die a) die Aminosäuren Nr. 35–42 b) die Aminosäuren Nr. 35–46 c) die Aminosäuren Nr. 36–51 d) die Aminosäuren Nr. 36–80 e) die Aminosäuren Nr. 1–80 aus der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst.
Ein dem Fragment, das die Aminosäuren Nr. 35–42 des in SEQ ID Nr. 1 gezeigten rekombinanten Proteins umfasst, entsprechendes Peptid X₁VCX₂X₃KX₄R, wobei X₁ für I steht oder fehlt, X₂ für H, R oder K steht, X₃ für S, L oder eine andere neutrale Aminosäure steht und X₄ für T oder A steht.
Antikörper, die für das rekombinante Protein oder für Homologe davon nach Anspruch 1 oder für die Fragmente nach Anspruch 2 oder die Peptide nach Anspruch 3 spezifisch sind.
Eine Zubereitung zur Normalisierung von pathologischem Flüssigkeitstransport und/oder entzündlichen Reaktionen in Tieren einschließlich Menschen, die als Wirkprinzip eine wirksame Menge eines Fragments nach Anspruch 2 oder ein Peptid nach Anspruch 3 umfasst.
Verwendung eines Fragments nach Anspruch 2 oder eines Peptids nach Anspruch 3 zur Herstellung einer Zubereitung zur Normalisierung von pathologischem Flüssigkeitstransport und/oder entzündlichen Reaktionen in Tieren einschließlich Menschen.
Ein Futtermittel zur Normalisierung von pathologischem Flüssigkeitstransport und/oder entzündlichen Reaktionen in Wirbeltieren, das als Wirkstoff ein Fragment nach Anspruch 2 oder ein Peptid nach Anspruch 3 oder einen nichtmenschlichen Organismus umfasst, der in der Lage ist, das Fragment oder Peptid herzustellen.
Verwendung von spezifischen Antikörpern nach Anspruch 4, um das rekombinante Protein oder Homologe davon nach Anspruch 1 oder die Fragmente nach Anspruch 2 oder die Peptide nach Anspruch 3 in Organismen in vitro nachzuweisen.
Nukleinsäuren, die für das rekombinante Protein nach Anspruch 1 oder das Fragment nach Anspruch 2 oder die Peptide nach Anspruch 3 kodieren.
Verwendung von Nukleinsäuren nach Anspruch 9 zur Herstellung von entsprechenden Proteinen oder den Homologen oder Fragmenten.
Verwendung von Sonden oder Primern, die aus Nukleinsäuren erhalten wurden, welche für das rekombinante Protein oder Homologe davon nach Anspruch 1 oder die Fragmente nach Anspruch 2 oder die Peptide nach Anspruch 3 kodieren, um die Anwesenheit von Nukleinsäuren in Organismen in vitro nachzuweisen.
Ein Vektor, der Nukleinsäuren nach Anspruch 9 umfasst.
Ein Wirt ausschließlich Menschen, der einen Vektor nach Anspruch 9 umfasst.