KR100552947B1 - 병리적투과성변화를조절하는항분비인자펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항분비 인자(AF)로 불리우는 신규한 재조합 단백질 및 이의 상동물 및 펩티드 단편에 관한 것이다. 상기 단백질 및 이의 상동물 및 단편은 사람을 포함하는 동물에게 병리적 체액의 운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키는 데 유용하다. 또한, 본 발명은 AF에 대한 항체 또는 이들의 상동물 또는 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 코딩하는 핵산 뿐만 아니라 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주에 관한 것이다. rAF 및 이의 상동물 및 단편은 동물을 사육하기 위한 공급 첨가제로서, 설사억제제 및 부종, 탈수증 및/또는 염증을 포함하는 질병에 대한 약제로서 면역검출을 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 체액 운반 및/또는 염증 반응 조절 특성 뿐만 아니라 다핵 조절 특성(polynucleic regulating property)을 지니는 항분비 인자, 이를 코드화하는 폴리핵산, 및 이의 용도에 관한 것이다.
체내의 모든 세포 및 조직은 충분한 혈액 공급과 함께 일정하고 정상적인 체액 환경에 중요하게 의존한다. 이러한 유지 시스템 중의 하나 또는 둘 모두가 비정상이 되면 즉각적으로 치명적으로 될 수 있다. 체액 불균형과 관련하여 두가지의 원리면에서 상이한 시스템이 존재한다:
A. 세포간 조직 공간 또는 체강내의 비정상적인 체액의 축적을 특징으로 하는 부종, 또는
B. 엄격한 의미에서는 단지 수분의 손실을 의미하지만, 실제로 수분과 이온의 복합된 손실을 설명하기 위해 일반적으로 사용되는 탈수.
가장 일반적인 형태의 부종 또는 탈수는 설사, 염증성 장 질환, 뇌부종, 천식, 비염, 결막염, 관절염, 녹내장, 다양한 형태의 병리적 두개내압(증가 또는 감소), 메니에르 질환(Morbus M)과 같은 중이의 압력 변화, 피부염, 유방염과 같은 피부 및 피부 인접 분비샘의 화학적 또는 물리적인 이상, 및 요붕증, 콘 증후군(Conn's syndrome), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome) 및 애디슨 질환(Morbus Addison)과 같은 다양한 형태의 내분비 장애, 신우신염 및 사구체신염과 같은 신장질환, 점액부종 및 급성 간헐성 포르피린증과 같은 대사성 질환, 항당뇨병제, 삼환계 항우울제, 세포증식 억제제, 바르비투르염, 마약성 약물(narcotics) 및 마약 유사 약물과 같은 다양한 약물로 치료하는 동안의 부작용이다.
설사는 장에서의 전해질과 수분의 투과성이 변화되어 유발된다. 이러한 장애는 종종 대장균, 캄피로박터 제쥬니(Campylobacter jejuni), 비브리오 콜레라(Vibrio colerae), 시겔라 다이센테리아(Shigella dysenteriae) 및 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)에 의해 생성되는 엔테로톡신과 같은 박테리아성 엔테로톡신에 의해 유발된다. 이러한 장애는 또한 장내 염증에 의해 유발될 수 있다. 수분 흡수는 전해질 및 영양분의 흡수와 결부되기 때문에, 설사를 자주 앓는 동물은 영양실조에 걸리며, 이는 성장하는 동물에서 일일 체중 증가를 지연시킨다. 신체는 장점막내의 중간 뉴우론으로부터 소마토스타틴 및 아편류 펩티드의 방출과 같은 신경-호르몬 메카니즘에 의해 이러한 반응을 역전시킨다. 이러한 폴리펩티드는 체액 분비 및 설사를 역전시킬 수 있다.
최근에 기술된 항분비 인자(AF)는 돼지 뇌하수체로부터 부분적으로 정제되었고, 다양한 엔테로톡신에 의해 유도된 병리적 분비를 역전시키는 것으로 밝혀졌다. 돼지 밀크에 함유된 높은 수준의 AF는 젖먹이 새끼 돼지의 신생아 설사를 억제한다.
항균제는 사람 및 수의학 모두에서 설사를 치료하는 데 광범위하게 사용되고 있다. 또한 이러한 약물은 돼지, 송아지 및 병아리를 위한 사료 첨가제로 사용된다. 그러나, 장내 내성 박테리아가 신속하게 성장하기 때문에, 장염에 항생제를 사용하는 것은 의료 분야에서는 일반적으로 인정되지 않으며 수의학 분야에서도 감소 추세에 있다.
다른 항설사 약물은 장점막에서의 분비를 억제한다. 이러한 약물은 숙주 동물에 직접적이기 때문에, 약물에 대한 내성이 생기지 않을 것이다. 이러한 형태의 약물에는 페노티아진 및 티오크산텐과 같은 신경작용 약물이 있다. 이러한 형태의 약물은 몇가지 심각한 부작용으로 인해서 대부분의 국가에서 설사를 치료하는 데 허용되지 않고 있다. 그밖의 약물로는 코데인 및 로페라미드와 같은 아편제의 유도체가 있다. 이러한 약물은 주로 장의 운동을 억제하여 작용하기 때문에, 이러한 약물은 장으로부터 병원성 박테리아의 제거를 억제하며, 이질성 박테리아 또는 기생충에 대해서는 절대로 권장해서는 안된다. 소마토스타틴의 유도체는 최근에 소개되었지만, 약물 투여의 곤란성 및 성장의 내분비 조절과의 상호작용 가능성 때문에 현재까지 제한적으로 사용되고 있다.
항분비 인자(AF)는 항분비 인자 단백질의 순수한 제제를 얻는 것과 관련된 난점으로 인해 설사 또는 영양실조의 치료에 직접 사용되지 않고 있다. 그러나, 특정 사료를 투여한 가축에서 유사한 단백질을 얻는 것은 가능하였다(SE 특허 제9000028-2호). 돼지에게 이러한 사료를 공급하여 높은 수준의 AF 유사 단백질을 얻었으며 대조군에 비하여 일일 성장 속도가 현저하게 빨랐다. 클로스트리듐 디피실리로부터 얻은 독소 A로 시험감염시킨 랫트(rat)에서 AF는 장의 분비 뿐만 아니라 장에서의 염증 및 출혈을 억제한다.
본 발명의 주요 목적은 병리적 체액 운반을 정상화시키는데 사용되는 신규한 재조합 단백질 및 이의 상동물 및 단편(펩티드)을 제공하는 것이다. 이러한 단백질 및 펩티드는 포괄적으로 항분비 인자(AF)로 일컬어진다. AF의 사용은 다양한 병인의 염증 반응의 발생을 부분적으로 억제시키거나 완전히 제거시킨다. 정상으로의 원상회복(체액 운반 또는 염증)은 단백질 또는 펩티드의 사용에 의해 달성된다. 또한 AF 단백질 또는 펩티드는 효능의 소실 없이 다양한 점막을 통해 효과적으로 흡수된다(정맥내 투여와 비교했을 경우). 그 결과, 다수의 치료 요법이 있으며, 정확하게 투여된 단백질 또는 펩티드는 파괴된 체액(수분 및 이온) 균형, 염증 반응, 또는 이들 둘 모두를 신속하게 원상회복시킬 수 있다.
요약하면, 재조합 AF(rAF) 및 이의 상동물 및 단편은 면역검정에 사용될 수 있으며, 동물 사육용 사료 첨가제 및 부종, 탈수 및/또는 염증을 수반하는 질환을 치료하는 지사제 및 약물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 서열번호: 1에 기재된 재조합 단백질의 단편으로서, 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열중
a) 아미노산 번호 35-42
b) 아미노산 번호 35-46
c) 아미노산 번호 36-51
d) 아미노산 번호 36-80
e) 아미노산 번호 1-80을 포함하는 군으로부터 선택된 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열 번호: 1에 기재된 재조합 단백질의 아미노산 번호 35-42를 포함하는 단편에 상응하는 펩티드 X1VCX2X3KX4R(여기서, X는 I이거나 존재하지 않으며, X2는 H, R, 또는 K이고, X3은 S, L 또는 그밖의 중성 아미노산이며, X4는 T 또는 A이다)을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편에 대한 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편에 특이적인 항체에 결합하는 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편의 유효량을 활성 성분으로 포함하는, 병리적 체액 운반 및/또는 염증 반응을 정상화시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 사용하여 병리적 체액 운반 및/또는 염증 반응을 정상화시키기 위한 조성물을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편, 또는 상기 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 생성시킬 수 있는 유기체를 활성제로 포함하는, 척추동물에서 병리적 체액 운반 및/또는 염증 반응을 정상화시키기 위한 사료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편, 또는 상기 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 생성시킬 수 있는 유기체의 유효량을 척추동물에게 투여함을 포함하여 척추동물에서 병리적 체액 운반 및/또는 염증 반응을 정상화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편에 특이적인 항체를 사용하여 유기체에서 상기 단백질 또는 단편을 검출하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산을 사용하여 상응하는 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산으로부터 유도된 프로브(probe) 또는 프라이머(primer)를 사용하여 유기체에서 핵산의 존재를 검출하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산을 포함한 벡터를 포함하는, 사람을 제외한 숙주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 생성시킬 수 있는, 사람을 제외한 유기체의 주(strain)를 제공하는 것이다.
재조합 단백질을 생성시킬 수 있는 유기체로서, 다양한 형태의 유기체, 예를 들어 재조합 박테리아 및 효모와 같은 진핵 생물, 식물 및 사람을 제외한 척추동물이 사용될 수 있다.
통상의 생화학 기술로 AF를 정제하기 위한 수십년간의 연구에도 불구하고, AF를 균질한 형태로 얻는 것은 불가능하였다. 그러나, 면역용 반순수 AF를 제조하고 면역조직화학적 방법에 의해 항혈청을 선택하는 새로운 공정에 의해서, 적합한 항혈청을 선택하였다. 이러한 항혈청을 사용하여 대장균(E. coli)에서 AF를 발현하는 재조합 사람 cDNA를 클로닝하는 것이 이제 가능하게 되었다.
신규한 cDNA의 서열을 측정한 결과 독특한 것으로 밝혀졌다. 이러한 서열을 밝혀냄으로써, 사람 및 돼지 뇌하수체 RNA와 하이브리드화하는 올리고누클레오티드 프로브를 구성하였다. 이러한 RNA의 크기, 즉 약 1400개의 염기쌍은 1309개의 염기쌍과 폴리(A)테일(poly(A)tail)을 포함하는 서열화된 cDNA의 크기와 부합된다. 랫트의 뇌하수체로부터 얻은 부분적인 cDNA 서열은 사람 cDNA의 서열과 동일한 것으로 밝혀져 상이한 종의 AF 유전자에 보존되는 편재성 구조임을 나타내고 있다. 이러한 유사성 때문에 동일한 올리고누클레오티드 프로브를 상이한 종으로부터 얻은 AF코딩 RNA 및 DNA를 확인하는데 사용할 수 있다.
또한, rAF를 생물학적 활성 형태로 발현시키는 것이 가능해졌다. 글루타티온 S-트랜스퍼라아제와의 융합 단백질 형태의 AF 단백질을 대장균에서 다량으로 발현시켰고, 친화성 크로마토그래피에 의해 균질하게 정제시켰다. 융합 단백질을 트롬빈으로 분해시킨 후의 재조합 AF(rAF)는, 44ng(10-12 몰)이 랫트의 장에서 콜레라 독소로 유도시킨 체액 분비의 50% 최대 억제(half-maximal inhibition)를 제공하여 매우 효능있는 것으로 입증되었다.
유전자 기술에 의해, rAF의 더 작은 단편을 제조하였다. 활성은 7 내지 8개의 아미노산으로 이루어진 작은 서열에 존재하는 것으로 입증되었다. 이것은 화학적 고체상 합성에 의해 확인되었으며, 이 기술에 의해 옥타펩티드를 제조하였고 몰 기준으로 rAF와 거의 동일한 정도의 생물학적 효능이 있는 것으로 입증되었다. 지정 부위 합성(site-directed synthesis)에 의해, 활성 부위내의 다양한 서열을 구성하였고, 생물학적 활성의 소실 없이 특정 아미노산의 치환이 가능한 것으로 입증되었다.
체액 분비는 장 루프(intestinal loop) 모델에 의해 측정되었다: 소장의 절편(루프)은 2개의 새쳐(sature)에 의해 결합되며; 루프에, 특정량의 엔테로톡신이 주입된다. 항분비제를 시험하는 경우, 이들은 독소 시험감염 1시간 전 내지 2시간 후에 주입된다. 주입은 3가지 상이한 경로, 즉 정맥내, 장내 및 비내 경로에 의해 수행되었다. 체액은 독소 시험감염 5시간 후에 루프에 축적된다. 분비량은 장 1㎝당 축적된 체액의 중량으로부터 계산된다.
단백질의 서열은 아미노산 서열화에 의해 직접적으로 및 cDNA 서열로부터의 추론에 의해 간접적으로 둘 모두에 의해 결정되었다.
50% 최대 억제를 일으키는 양 보다 100배 더 많은 용량을 투여한 랫트에서 명백한 독성 반응이 나타나지 않았기 때문에 재조합 AF는 독성 또는 전신 효과를 거의 나타내지 않는 것으로 보인다. 소장에 주입된 경우 효과적이었기 때문에, 이것은 경구적으로 투여될 수 있다.
재조합 AF는 독소 시험감염 전에 주입되는 경우에만 효과적인 것으로 보이는 시험된 천연 AF의 제제와는 대조적으로, 독소 시험감염 후에 주입되는 경우에도 분비를 억제시킨다. 따라서, rAF는 예방 및 치료 둘 모두를 위해 사용될 수 있다.
또한, rAF 및 이것의 펩티드 단편은 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)로부터 얻은 독소 A에 의해 야기되는 소화관에서의 세포독성 반응 및 염증을 억제시키는 것으로 입증되었다. 염료 투과성 시험에 의해, rAF 및 이것의 단편은 장점막 뿐만 아니라 뇌에서의 체액 압력을 조절하는 맥락총(plexus choroideus)에서 콜레라 독소에 의해 유도되는 병리적 투과성 변동을 역전시키는 것으로 입증되었다.
rAF에 대한 항혈청을 토끼에서 생성시켰고, 효소 결합 면역 검정(ELISA)에 사용하였다. 이러한 검정은 체액 또는 사료중의 AF를 측정하는데 사용될 수 있다.
아가로오스 결합 rAF를 함유한 칼럼상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 AF(천연 또는 재조합)에 대한 항체를 정제하는 방법은 하기에 보고되어 있다.
또한, 항체는 면역조직화학 기술에 의한 조직 절편 중의 AF의 검출 및 웨스턴-블롯에서 AF의 검출에 효율적인 것으로 입증되었다.
본 발명은 첨부 도면과 함께 하기의 비제한적 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예 1. cDNA의 클로닝을 위해 제조된 AF에 대한 항체
항분비 인자를 돼지 혈액으로부터 아가로오스상 친화성 크로마토그래피 및 등전점 전기이동(isoelectic focusing)에 의해 제조하였다. 돼지 혈액(항응고 성분 함유) 1ℓ에, 티오황산 나트륨 1g 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 1㎎을 첨가하였다. 혈구를 원심분리에 의해 분리시키고, 맑은 혈장을 세파로오스 6B[파마시아 엘케이비 바이오테크놀로지 스톡홀름(Pharmacia LKB Biotechnology Stockholm)]를 갖는 칼럼을 통해 용리시켰으며, 겔 부피는 용액 부피의 약 10%에 상응하였다. 3배 충전 부피(bed volume)의 인산염 완충 식염액(PBS = 0.15M NaCl, 0.05M 인산 나트륨, pH 7.2)으로 세척한 후에, 칼럼을 PBS 중에 용해시킨 2배 충전 부피의 1M α-메틸-D-글루코오스로 용리시켰다. 용리물을 농축시키고, “오메가 10k 병류(Omega 10k flow through)” 한외여과막[필트론 테크놀로지 코포레이션(Filtron Technology Corp.)] 상에서 물에 대해 투석시켰다. 분획을 후속적으로 400㎖ 등전점 전기이동 칼럼(LKB, 스웨덴) 상에서 암폴린(파마시아) 그래디언트(pH 4-6)에서 등전점 전기이동에 의해 분별화시켰다. 등전점이 4.7 내지 4.9인 분획을 수집하여, PBS에 대해 투석하였다. 이와 같이, 부분 정제된 AF를 작은 분취량으로 분할하고, 상기 기술된 방법에 따라 토끼에서 항혈청을 제조하기 위해 사용하였다.
토끼를 면역시키고, 그 혈청을 사람 뇌하수체 절편에서 세포내 물질을 염색시키는 능력에 대해 시험하였다(실시예 6에 기술된 방법). 혈청 중 하나만이 세포외 매트릭스 단백질의 염색 없이 특이적이고 독특한 세포내 염색을 나타내었다. 상기 항혈청을 대장균에서 사람 뇌하수체 발현 단백질로부터 cDNA/람다 파지 GT11 라이브러리의 스크리닝을 위해 선택하였다.
실시예 2. 사람 뇌하수체 및 뇌로부터 cDNA 라이브러리의 스크리닝
9명의 백인의 푸울(pool)로부터 수득한 조직으로부터 얻은 정상적인 사람 뇌하수체의 5'-스트레치 cDNA 라이브러리를 클론테크 라보라토리즈(Clontech Laboratories)로부터 입수하였다. 라이브러리의 스크리닝을 위해, 파지를 대장균 Y1090에 대해 150㎜ 접시당 3 x 104 플라크 형성 단위로 플레이팅시켰다. 돼지 AF에 대한 상기 기술된 토끼 항혈청을 23℃에서 4시간 동안 0.5배 부피의 대장균 Y1090-용해물로 흡수시키고, 1:400의 비로 희석시키고, 영(Young) 및 데이비스(Davis)에 따라 스크리닝을 수행하였다 (1). 알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 항체를 제 2 항체[잭슨(Jackson)]로서 사용하였다. 양성 플라크를 선별하여, 파지 현탁 매질[20mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM MgSO4, 2% 젤라틴] 내로 용출시키고, 다시 플레이팅시키고, 시험된 모든 플라크가 양성으로 될 때까지 스크리닝시켰다.
cDNA-재클로닝 - AF 재조합체로부터 파지 DNA를 위자드 람다 프렙스(Wizard Lambda Preps)[프로메가(Promega)]로 분리시키고, EcoR1으로 소화시켰다. 삽입물을 세파글라스 밴드프레프 킷츠(Sephaglas BandPrep Kits)(파마시아)로 정제하고, 제조업자가 설명한 바와 같이 pGex-1λT 벡터(파마시아)로 재클로닝시키고, 에피쿠리안 콜리 XL1-블루(Epicurian Coli XL1-Blue), Top 1 세포 또는 BL21 세포(이들 3개 모두 스트라타겐(Stratagen)으로부터 입수)로 트랜스펙션시켰다. rAF 또는 r펩티드는 달리 언급하지 않는 한 BL21 세포에서 제조하였다 (2).
PCR에 의한 cDNA의 증폭 - cDNA의 결손 5'-말단을 얻기 위하여, PCR에 기초한 방법, 이른바 RACE(rapid ampilfication of cDNA ends)을 수행하였다. 사람 뇌 cDNA 분자의 3'-말단에 연결된 앵커 올리고누클레오티드를 갖는 5'-RACE-Ready cDNA를 생성시키는 변형된 RACE 방법을 클론테크 라보라토리즈로부터 입수하였다. 앵커에 상보적인 하나의 5' 프라이머 및 2개의 네스티드(nested) 유전자 특이적인 3' PCR 프라이머 A 및 B(A=염기 429-411, B=염기 376-359; 도 1a)를 사용하여 두 PCR 증폭 단계에서 5'-RACE-Ready cDNA의 일부로부터 5'-말단을 증폭시켰다. RACE 단편의 다양한 더 작은 부분을, 상응하는 펩티드를 발현시키고 이들의 생물학적 성질을 시험하기 위하여 추가로 증폭시켰다. 이들 올리고누클레오티드 단편 및 이들의 상응하는 펩티드의 출발점 및 말단에서 염기 및 아미노산의 위치를 표 1에 나타내었다. 돼지 및 소 cDNA(클론테크 라보라토리즈)를 표 1에서 N3에 상응하는 단편을 증폭시키기 위한 주형으로서 사용하였다. 또한, 서열의 변종을 지정 부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 인위적으로 삽입하였으며, 이 방법으로 위치 168-193에 상응하는 다양한 올리고누클레오티드를 아미노산 35-42(서열 번호: 1에 제시된 위치)를 하나씩 치환하도록 합성시켰다. 증폭된 DNA 단편을 앵커 및 유전자 특이적 프라이머 내로 조립된 EcoR1 부위를 사용하여 pGex-1λT 내로 클로닝시켰다. RACE 방법에 의해 얻어지는 서열을 확인하기 위해, 사람 뇌하수체 및 뇌로부터 이중 가닥 cDNA(클론테크)을 엑스트라 EcoR1 절단 부위를 함유하는 프라이머 쌍 C/D로 증폭시켰다 (도 1b). 프라이머를 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)이 증폭되도록 설계하였다. 예측된 크기의 뇌하수체 및 뇌 PCR 생성물을 EcoR1으로 소화시키고, 분리시키고, 플라스미드 pGex-1λT 벡터내로 클로닝시켰다.
DNA 서열화 및 올리고누클레오티드 - 플라스미드 pGex-1λT로부터 DNA를 시쿼나아제 버전 2.0 키트(Sequenase version 2.0 kit)(U.S. 바이오케미칼 코포레이션)을 사용하여 디데옥시 사슬 말단 방법(15)에 의한 삽입물의 서열화에 주형으로서 사용하였다. 삽입된 DNA의 바로 상류 및 하류에 있는 pGex-1λT의 영역을 복제하는 초기 전방 및 후방 프라이머를 파마시아로부터 입수하였다. 후속 프라이머를 얻어진 서열화 정보를 기초로 합성하였다[스칸디나비안 진 신서시스 아베(Scandinavian Gene Synthesis AB)]. 3가지 상이한 PCR 클론을 5'-RACE 방법에서 Taq 폴리머라아제에 의한 염기 치환을 피하도록 서열화시켰다.
누클레오티드 서열 및 추론된 단백질 서열 데이터를 수집하고, 맥벡터(MacVector) 4.1 [이스트만 케미칼 컴패니(Eastman Chemical Co.)]을 사용하여 분석하였다. cDNA 삽입물의 상응하는 아미노산 서열을 예측하기 위해, 상이한 리딩 프레임 코돈 사용을 비교하고, 하나의 큰 오픈 리딩 프레임을 수득하였다. DNA 및 단백질 서열 데이터의 인터로게이션(interrogation)을 엔트레츠(Entrez) CD-ROM 디스크[내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information), 베테스다, USA)]의 사용에 의해 수행하였다.
cDNA의 분자 클로닝 및 서열 분석 - 돼지로부터 얻은 AF 단백질에 대한 다가 항혈청을 사람 뇌하수체로부터 cDNA를 스크리닝하기 위해 사용하였다. 면역반응성 AF를 발현시키는 2개의 클론을 분리시키고, 파지 람다로부터 꺼내어, 파마시아로부터 제공된 키트에서 기술된 바와 같이 벡터 pGex-1λT의 EcoR1 부위 내로 재클로닝시켰다. 제한 분석은, 각각 1100 및 900 bp의 삽입물 크기를 나타냈다. 2개의 클론의 DNA 서열화로, 하나의 치환을 제외하고는 상동성은 완전한 것으로 확인되었다 (도 1, 위치 1011에서 T 대신 C로 치환). 클론 2의 5'-말단의 상류 서열을 RACE 방법에 의해 수득하였다. 단편은 총길이가 376 bp이었다(5'-말단에서 합성 누클레오티드 아암을 포함하지 않음). 재구성된 전체 cDNA는 1309개의 염기쌍을 함유하며, 그 뒤에 폴리-A-시그날이 선행된 폴리-A-테일이 이어져 있다(도 1, 위치 1289-1295). 1146 bp의 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)(위치 63-1208)이 확인되었다.
실시예 3. 재조합 플라스미드로부터 포유동물 AF 단백질의 발현
융합 단백질의 구성 및 정제 - 전체 cDNA의 면역 스크리닝 및 PCR 증폭에 의해 수득한 cDNA 클론을 pGex-1λT에 연결시켰다. 상기 벡터는 파마시아로부터 제공된 키트에 의해 비변성 조건하에 친화성 정제될 수 있는 쉬스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum) 26 kDa 글루타티온 S-트랜스퍼라아제의 C 말단에 대한 융합체로서 대장균에서 외래 단백질의 발현을 허용한다. 간략하게, 재조합 pGex-1λT 플라스미드로 형질전환시킨 대장균의 밤새 배양액을 새로운 배지 중에서 희석시키고, 37℃에서 추가로 3시간 동안 성장시켰다. 단백질 발현을 0.1mM IPTG(이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)에 의해 유도하고, 30℃에서 추가로 4시간 동안 성장시킨 후에, 세포를 펠릿화시키고, PBS 중에 재현탁시켰다. 세포를 음파처리에 의해 용해시키고, 1% 트리톤 X-100으로 처리하고, 10분 동안 12000X g으로 원심분리시켰으며; 발현된 융합 단백질을 함유하는 상청액을, 용해물을 글루타티온 아가로오스(파마시아)를 통해 통과시킴으로써 정제하였다. 융합 단백질을 유리 글루타티온과 경합(competition)에 의해 용리시키거나, 10 U 소 트롬빈으로 밤새 분해시켜서 GST 친화성 테일로부터 AF-단백질을 분리하였다. pGex 플라스미드를 사용하여 재조합 단백질 또는 펩티드를 정제시키는 총괄적인 방법은 파마시아(Pharmacia)사로부터 제공된 키트에 의해 수행되었다.
재조합 AF 단백질의 서열 및 크기 - 코딩 서열을 확인하기 위해, 전장 전사체를 뇌하수체 및 뇌 cDNA의 PCR 증폭에 의해 분리시켰다. 프라이머 쌍 C/D를 사용하여, 클론-4(도 1)의 서열과 동일한 1215 bp를 분리시켰다. 오픈 리딩 프레임은 계산된 분자 질량이 41.14 kDa이고 계산된 PI가 4.9인 382개의 아미노산을 코드화하였다.
ORF가 프레임중에 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST) 단백질을 갖도록 AF 클론-1, 2 및 3 및 올리고누클레오티드 N1-N5(도 1 및 표 1)을 pGex-1λT 플라스미드 벡터내로 연결시켰다. 구성물을 대장균에서 형질전환시키고, 융합 단백질의 발현을 IPTG로 유도시켰다. 정제된 융합 단백질, 및 트롬빈으로 분해된 AF 단백질 또는 펩티드를 돼지 항분비 인자에 대한 항혈청을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅시켰다(도 2). 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 결과, 더 작은 성분으로 분해를 나타낸 GST-AF-1 단백질을 제외하고 각각의 단백질에 대한 분리된 밴드가 나타났다.
고체상 펩티드 합성 - 작은 펩티드(표 1에서 P7 내지 P18)를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 펩티드 합성기를 사용하여 고체상에서 제조하였다(K.J. 로스-피터슨 AS). 각각의 펩티드의 순도는 물/아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로 아세트산의 선형 그래디언트를 사용하여 델타팩(Deltapak) C18, 300A상의 역상 HPLC에서 평가시 93 내지 100% 였다.
아미노산 서열화 - 단백질 서열 분석을 수행하여 확인된 ORF를 추가 확인하였다. 순수한 AF 단백질에 대해 10% 매크로-슬랩 겔(macro-slab gel) SDS-PAGE를 시행하고(14), 단백질을 전기블롯팅(electroblotting)(Bio-Rad)에 의해 프로블롯 막(Problot membrane)(어플라이드 시스템즈)으로 이동시켰다. 폰소 S(Ponceau S) 염색에 의해 가시화된 반점을 블롯으로부터 삭제하고 단백질의 첫 20개의 아미노산을 자동 서열기(어플라이드 시스템즈)에서 자동 에드만 분해에 의해 서열화시켰다.
클론-2 및 클론-3의 N 말단 서열이 결정되었고, 예상 서열(도 1)의 아미노산 63-75 및 130-140과 각각 완전하게 일치하는 것으로 나타났다.
겐뱅크(Genbank)로부터 시판되는 다른 단백질 서열과 비교한 결과, rAF의 서열(도 1)은 모든 부분에서 특이한 것으로 나타났고, 유사 서열이 전혀 없는 것으로 보고되었다.
단백질의 첫 10개의 잔기는 카이테돌리틀(KyteDoolittle)(22)에 따라 분석시 비교적 소수성인 것으로 나타났고, 이들은 단백질의 엑소사이토시스(exocytosis) 이전에 분해되는 시그날 펩티드를 구성할 수 있다. 이러한 해석은 재조합 단백질이 뇌하수체로부터의 단백질 추출물 보다 다소 높은 분자 질량을 갖는 것으로 나타난 웨스턴 블롯 분석(도 3)에 의해 지지된다. 그러나, 이러한 차이의 일부는 또한 융합 단백질의 트롬빈 분해 부위를 구성하는 재조합 단백질에서의 추가 5개의 아미노산에 의한 것일 수도 있다.
실시예 4. rAF에 대한 항혈청의 생성 및 시험
재조합 GST-AF 융합 단백질에 대한 항혈청 - ELISA, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학 시험에서 사용하기 위한 정제된 융합 단백질 GST-AF-1, GST-AF-2 및 트롬빈 으로 분해된 순수 AF-1 단백질(=rAF)에 대한 항체를 토끼에서 생성시켰다. 각 토끼에 동일 부피의 프로인트의 완전 애쥬번트(Freund's complete adjuvant)와 혼합된 1ml PBS중 항원 100㎍을 투여하였고, 각 면역화는 8 내지 10개 부분으로 나누어 등에 피내 주사하였다. 50㎍ 항원을 함유하는 2회의 추가접종(booster) 용량을 3 및 5주에 주사하였고, 5주째 추가접종은 프로인트 완전 애쥬번트 없이 주사하였다. 토끼를 최종 추가접종 후 6일간 방혈시키고 혈청을 제조하여 -20℃에서 저장하였다. 항혈청의 감도를 도트 블롯 검정으로 시험하였다. GST-AF-2를 1/5 희석하여 ECL 니트로셀룰로오스 막상에 도포하고, 항혈청을 1:1000으로 희석시켰다. 막은 16시간 동안 4℃에서 PBS중에 1% 소 혈청 알부민(BSA)로 블로킹시킨 후, 토끼 항-GST-AF 또는 돼지 AF 항혈청의 1:800 희석액과 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 블롯을 알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 면역글로불린에 이어서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 및 p-니트로 블루 테트라졸륨(뵈링커 만하임)으로 전개시켰다. 예측된 항원 검출 한계는 이 시험에서 약 1ng이었다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역블롯팅 - 사람 및 돼지 뇌하수체 추출물 및 순수 AF 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을, 기본적으로 라엠리(Laemmli)(4)에 의해 설명되는 바에 따라, 가교제인 비스-아크릴아미드를 상응하는 몰농도를 갖는 N,N'-디알릴타르타르디아미드로 대체하여 변형시켜 10% 아크릴아미드 미니슬랩 겔(minislab gel)에서 수행하였다. 피로닌 Y(Pyronin Y)(시그마)를 전기영동 프론트의 마커로서 사용하였다. 사전염색된 분자량 대조물질을 BDH로부터 구입하였다. 그 후 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색시키거나 전기영동에 의해 면역블롯팅용 0.45mm 공극 크기의 ECL 니트로 셀룰로오스(아머샴)로 이동시켰다. BSA, 컨쥬게이션된 항-IgG 및 알칼리성 포스파타아제 기질과의 후속 인큐베이션은 상기에 설명된 도트 블롯 검정에서와 동일하였다.
상기에 언급된 바와 같이 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 결과, GST-AF-1 단백질에 대해 분리된 밴드를 전혀 나타내지 않았으며, 이는 아마 작은 성분으로의 단백질 분해에 기인한 것이다. 그러나, 웨스턴 블롯 분석에서 전장 단백질은 분해 생성물보다 훨씬 강한 시그날을 제공하였다(도 2b). 돼지 AF에 대한 항혈청과의 강한 반응은 재조합 단백질이 실제로 AF와 같은 면역반응성을 갖는 것을 보여주었다. 전장 단백질의 분자량은 아미노산 조성으로부터 추정된 참값 분자량 41139Da 보다 높은 약 60kDa인 것으로 나타났다. 추가로, 단백질을 트롬빈으로 분해된 단백질(도 3)에 결합된, GST-AF-2에 대해 생성된 항혈청으로 면역블롯팅시키고 프로빙시켰다.
재조합 GST-AF-2에 대한 항혈청은 겉보기 몰질량이 60kDa인 천연 AF 단백질 및 보다 작은 성분, 아마 효소 분해 생성물과 반응하였다(도 3a).
AF-농도 측정을 위한 ELISA - ELISA 검정을 상기에 설명된 방법(5)에 따라 항-AF-1 및 항-AF-2를 사용하여 수행하였다. 도 3b에서 제시되는 바와 같이 미정제 항혈청을 사용한 시험의 감도는 1 내지 10㎍ 단백질인 반면, 친화성 정제된 항체를 사용한 시험은 5 내지 50ng 단백질의 감도를 가졌다.
실시예 5. 뇌하수체로부터 얻은 RNA의 노던 블롯 분석
노던 블롯 분석 - 사람 뇌하수체를 사알그렌스카(Sahlgrenska) 병원으로부터 부검하여 얻었다(스웨덴 보건복지부에 의해 허가; 2§transplantationslagen, 1975:190). RNA를 얻기 위해, 뇌하수체를 촘찐스키(Chomczynski) 및 사키(Sacchi) (6)에 따라 구아니디늄 티오시아네이트 RNA로 추출하였다. 폴리아데닐화 RNA를 올리고dT-셀룰로오스를 갖는 칼럼을 사용하여 상용 키트(파마시아)에 의해 선별하였다. 부가적으로, 클론테크로부터 구입한 107명의 사람 뇌하수체 mRNA의 푸울을 사용하였다. 각각의 폴리(A+)RNA 샘플 5㎍을 글리옥살 처리하고 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동시켰다(7). 하이본드(Hybond) N+ 나일론 막(아머샴)으로 0.05M NaOH에서 3시간 동안 모세관 알칼리 이동 후에, 예비하이브리드화 및 하이브리드화를 42℃에서 24시간 동안 수행하였다. 하이브리드화 용액은 50% 포름아미드, 5xSSPE를 함유하고, 변성된 저분자량 DNA 250㎍/ml 및 폴리아데닐산 50㎍/ml를 갖는 10X덴하르트 용액을 함유하였다. 블롯을 서열(도 1)의 위치 132-105(프라이머 E), 297-270(프라이머 F), 748-721(프라이머 G) 및 833-806 (프라이머 H)를 포함하는 4개의 상이한 안티센스 28 bp 올리고누클레오티드로 프로빙시키고, 프로브를 말단 트랜스퍼라아제(뵈링거 만하임)과 [α32p]ddATP(아머샴)으로 3'-말단 표지화시키고 닉 칼럼(Nick colummn)(파마시아)상에서 정제시켰다. 5XSSPE/0.1%SDS- 0.5XSSPE/0.1% SDS에서 각각 30분 동안 42℃에서 5회의 후세척을 수행하였고, 마지막 세척을 반복하였다. 필터를 7일 동안 하이퍼필름 MP(아머샴)에 노출시켰다.
뇌하수체에서의 발현 - 노던 블롯 분석을 클로닝된 cDNA를 따라 상이한 서열과 하이브리드화시킨 4개의 올리고누클레오티드 프로브의 혼합물을 사용하여 수행하였다(도 4). 상기 프로브를 뇌하수체로부터 분리된 mRNA의 약 1400 bp의 단일 밴드를 사용하여 하이브리드화시켰다. 가장 강한 시그날은 사람 재료에 있어서 수득되었지만, 돼지 재료도 교차반응하였다.
실시예 6. 뇌하수체의 절편 중의 AF의 분포
종 및 조직 - 사람 뇌하수체를 사알그렌스카 병원으로부터 부검하여 얻었다(스웨덴 보건복지부에 의해 허가; 2§transplantationslagen, 1975:190). 인산염완충 식염액(PBS=0.15 M NaCl, 0.05M 인산나트륨, pH 7.2)중에 용해시킨 4% 파라포름알데히드에서 24시간 고정시킨 후, PBS중의 7.5% 수크로오스로 이동시킨 조직검사용 뇌하수체를 제외하고는, 뇌하수체를 -70℃에서 냉동 저장시켰다. 도살장으로부터 얻은 5 내지 7개월 된 돼지의 뇌하수체를 수송 동안에 드라이 아이스상에 두고 사용할 때까지 -70℃에서 냉동 저장시켰다. 2 내지 3개월 된 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트를 스웨덴 솔렌투나에 소재한 B & K 유니버살 AB로부터 생물학적 검정을 위해 입수하였다. 면역 시험용 토끼(뉴질랜드 화이트)를 스웨덴의 리드쾨핑 카닌파름(LidkKaninfarm)으로부터 입수하였다.
면역조직화학 - 고정된 뇌하수체를 액체 질소중에 냉동시키고, 두께가 7㎛인 냉동 절편(cryo section)을 제조하였다. 각각의 샘플로부터 상이한 부위의 뇌하수체를 포함하는 5 내지 10개 절편을 현미경 슬라이드에 고정시켰다. 절편을 5% 무지방 분유중에 블로킹시키고 습한 챔버에서 밤새 4℃에서 1:4000 내지 1:8000으로 희석한 1차 토끼 항혈청(항-GST-AF-2 융합 단백질)과 인큐베이션시켰다. 완충액으로 헹군 후에, 표본을 1:50으로 희석된 알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이션된 돼지 항-토끼 면역글로불린(다코 A/S)과 23℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 면역 반응을 다른 곳(8)에서 설명된 바와 같이 포스파타아제 기질로 가시화시켰다. 대조 절편을 과량의 GST-AF-2 단백질로 흡수된 면역 혈청과 인큐베이션시키거나 1차 항체를 제외하고 모든 인큐베이션 단계를 사용하여 인큐베이션시켰다.
뇌하수체 절편중의 AF의 분포. 사람 뇌하수체 절편중 AF의 분포를 면역조직화학 기법을 사용하여 연구하였다(도 5). 조사된 모든 표본에서, 선하수체(adenohypophysis)의 세포는 적당수 염색되었고; 면역 염색된 재료는 세포질의 과립중에 위치하는 것으로 나타났으며; 과량의 GST-AF-2 단백질을 사용한 면역 혈청의 사전흡수로 시그날이 제거되었다. 후엽(신경뇌하수체)에서 염색은 전혀 나타나지 않았다.
뇌하수체에서 면역 반응 물질의 분포는 전엽(선하수체)의 분비 세포중에 AF의 세포내 분포만을 증명하였다. 전엽으로부터 방출되는 단백질은 성장 호르몬, 티로트로핀, 코르티코트로핀, 프로락틴 및 황체 형성 호르몬을 포함한다. 세포내 국재 위치로부터 혈관계까지 상기 호르몬의 통과는 시상하부중의 신경 내분비계 세포에 의해 생성된 방출 인자에 의해 자극된다.
실시예 7. rAF의 생물학적 활성
항분비 활성 - 항분비 활성을 이전에 설명된(9) 랫트 장 루프 모델에서 측정하였다. 공장 루프(jejunal loop)를 콜레라 독소 3㎍으로 시험감염시켰다. 상이한 용량의 정제된 AF-1-단백질 또는 PBS(대조군)를 콜레라 독소로 시험감염 전 또는 후에 주입하였다. 장 루프에 축적된 체액의 중량(㎎/㎝)을 5시간 후에 기록하였다. 각각의 AF 제제를 6마리 이상의 랫트에서 시험하였다. 데이터의 통계적인 분석을 위해 피셔(Fisher)의 PLSD를 이용하였다.
rAF 단백질의 생물학적 활성 - 대장균에서 생성된 클론-1의 순수 rAF 단백질의 생물학적 활성을 랫트 모델에서 시험하였다. 콜레라 독소를 사용한 장의 시험감염 20 내지 30초 전에 rAF 단백질을 정맥 주사한 경우 rAF의 체액 분비 억제능이 도 6에 도시되어 있다. 단지 완충액만 주입한 대조군 동물에서, 콜레라 독소는 현저한 분비, 즉 장 ㎝당 412±9㎎의 분비를 유발하였다. 순수 rAF는 완충액에 대한 반응과 현저하게 상이하게(p＜0.01, n=6) 콜레라 분비를 용량 의존적으로 억제시켰다. 클론-1 단백질 9ng이 반응을 34%까지 감소시키는 데 충분하며, 44ng(10-12 몰) 및 220ng는 반응을 각각 46% 및 78%까지 감소시켰다. 재조합 AF의 생물학적 활성은 공지된 다른 엔테로톡신의 생물학적 활성보다 크며, 수분 및 전해질 운반을 변화시키는 다른 장 호르몬 또는 뉴로펩티드의 생물학적 활성보다 크다. 또한, 랫트에서 사람 rAF의 활성 수준은 놀랍게도 높으며, 아마 이것은 상이한 종으로부터 얻은 rAF 분자에 보존되는 편재성 구조를 반영하는 것일 수 있다. 이러한 가설은 웨스턴 블롯 및 노던 블롯 분석에서 수득된 사람 및 돼지 재료간의 교차반응성에 의해 지지된다.
콜레라 독소 시험감염 20 내지 30초 전 및 90분 후에 rAF를 정맥주사한 경우, rAF 0.5㎍의 장 분비 억제능을 비교하였다(도 7). 둘 모두의 투여는 대조군 동물와 비교하여 현저한 억제(p＜0.01, n=6)를 나타내었다. 따라서, 천연 AF와는 다르게, 재조합 단백질은 독소 시험감염 후에 투여한 경우에도 효과적이었고, 이 때문에 rAF은 설사 치료에 유용하다.
rAF 3㎍을 콜레라 독소로 시험감염시킨 루프에 바로 인접하게 위치한 8 내지 10㎝ 길이의 루프에 주입하였다. rAF를 독소 시험감염 20 내지 30초 전 또는 90분 후에 유입시켰다. 도 8에, 두 시험군 모두 대조군과 비교하여 현저하게 체액 분비가 감소되었음(p＜0.01, n=6)이 도시되어 있고; 두 시험군간에 상이한 점이 관찰되지 않았다. 이러한 실험은 rAF가 경구 투여후 활성을 가지며, 심각한 부작용을 초래하지 않을 경우 동물 사료 첨가제로서 사용될 수 있음을 시사한다.
상기 설명된 실시예에서, rAF는 에피쿠리언 콜리(Epicurian Coli) XL-1 세포에서 생성되었다. 이러한 세포에서, 생성된 rAF의 상당량이 더 작은 펩티드로 분해되었다. rAF가 BL21 세포에서 생성된 경우 단지 rAF의 적은 부분만이 분해되는 반면, Top 1 세포에서는 분해가 관찰되지 않았다. 놀랍게도, 생물학적 활성은 분해의 정도에 비례하였다. 즉, 더 많은 분해가 더 높은 활성을 유도하였다. 따라서, 여러 개의 짧은 단편을 제조하여 가능한 생물학적 활성을 시험하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 이러한 단편을 상기 미분해 rAF에 대해 상기 설명된 것과 동일한 방법으로 콜레라 독소 시험감염 전에 정맥내 시험을 하였다. 0.1, 1 및 10㎍의 양으로 시험한 클론 2 및 3에 의해 발현된 펩티드는 독소 반응에 효과적이지 않았다. 이와는 달리, RACE 단편(클론 4)에 의해 발현된 펩티드 1㎍은 현저한 효과를 나타냈다. 많은 더 짧은 구성물을 RACE 단편으로부터 제조하였고, pGex-1-람다에서 발현시켰다. 표 1에 나타난 바와 같이, 활성 부위가 아미노산 잔기 35와 51 사이에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 활성 부위를 좀더 정확하게 결정하기 위해, 세 개의 작은 펩티드를 고체상 펩티드 합성에 의해 제조하였다. 이들 중 두 개인 펩티드 35 내지 46(P3) 및 펩티드 35 내지 42(P1)가 활성이 있었고; 후자 옥타펩티드 IVCHSKTR(P1)은 1ng 미만의 용량에서 활성이 있었고 이는 미분해 rAF와 몰 기준으로 거의 동등한 활성이었다. 이와 달리, 더 짧은 헥사펩티드 VCHSKT(P2)는 1ng 내지 10㎍의 용량으로 시험된 경우 효과를 나타내지 않았다.
또한, 사람 단편 P1에 상응하지만, 특정 변화 및/또는 결실을 가진 펩티드 X1VCX2X3KX4R을 지정 부위 돌연변이 유발에 의해 제조하여 이들의 생물학적 활성을 시험하였다. 소 및 돼지 cDNA의 서열을 또한 비교하였다. 이러한 연구 결과, 하기와 같은 변화 및/또는 결실이 제시되었다:
X1는 I이거나 존재하지 않으며,
X2는 H, R 또는 K이고,
X3는 S, L 또는 또 다른 중성의 아미노산이며;
X4는 T 또는 A이다.
[표 1]
| 코드 | 올리고누클레오티드* | 펩티드** | 콜레라 분비의 억제*** pmol ED50 | |
| N1 | 63-301 | 1-80 | + | 4 |
| N2 | 168-301 | 36-80 | + | 6 |
| N3 | 168-215 | 36-51 | + | 3 |
| N4 | 122-170 | 21-36 | - | |
| N5 | 186-269 | 42-69 | - | |
| P3 | S.P.S.**** | 35-46 | + | 7 |
| P1 | S.P.S. | 35-42 | + | 5 |
| P2 | S.P.S. | 36-41 | - | |
| * AF cDNA 및 pGex-1-람다로부터 제조된 구성물에서 발현된 서열 번호: 1에서 염기쌍의 위치. ** 합성 펩티드의 출발점과 말단에서 AF중의 아미노산 잔기(서열 번호: 1)의 위치. *** 연결된 랫트 장 루프에서 콜레라 독소로 유도된 체액 분비의 억제; 50% 최대 억제를 일으키는 양(ED 50)(pmol)은 활성 펩티드에 대해 기록된다. **** 이 펩티드는 고체상 합성에 의해 제조되었다. | ||||
장점막 염증에 대한 rAF의 효과를 또한 랫트 장 루프 모델에서 시험하였다. 따라서, 20마리의 랫트를 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)(10)로부터의 0.5㎍의 독소 A로 시험감염시키고, 2.5 및 5시간 후에 각각 염증 및 체액 분비를 측정하였다(10 + 10 랫트). 시험감염 30초 전에 각 군의 랫트 50%에 100ng의 rAF를 정맥내 투여하였고; 나머지 50%는 대조군으로서 PBS 완충액을 투여하였다. 랫트를 치사시킨 후, 루프를 절개하고, 루프의 중간 2 내지 3㎝ 부분을 드라이 아이스에서 냉동시켰다. 그 후, 냉동 표본을 라이카 저온유지 장치(Leica cryostat)를 사용해서 8㎛의 두께의 절편으로 절편화하였다. 절편을 효소 조직화학에 의해 알칼리성 포스파타아제를 입증하기 위해 염색시켰다. 알칼리성 포스파타아제는 장의 상피 세포에 의해 발현되며, 염색은 장의 상피 세포의 통합성을 평가하게 한다.
결과는 대조군 랫트가 장점막의 광범위한 손상을 일으킨 것으로 나타났다(도 9): 2.5시간 후에 기저막으로부터 상피 세포의 박리가 괴사 조직과 함께 관찰되었고, 5시간 후에 광범위한 출혈이 관찰되었다. 대조적으로, rAF로 처리한 동물은 박리, 괴사, 또는 출혈을 일으키지 않았다. 또한, 독소 A에 의해 유도된 체액 분비도 2.5시간 후 199±4 내지 137±5mg/cm로 억제되었고(p＜0.01), 6시간 후 421±3 내지 203±6mg/cm로 억제되었다(5마리 랫트/군, p＜0.01).
유사한 실험을 rAF 단백질 대신 0.5㎍의 펩티드 IVCHSKTR(=P1)를 사용하여 수행하였다. 옥타펩티드는 독소 A에 의해 유도된 장염증 및 체액 분비에 대해 도 9에 도시된 것과 동일한 효과를 달성하였다.
독성 - rAF의 독성을 시험하기 위해, 이를 고용량, 즉 랫트당 50㎍으로 주입하였다. 1주일의 관찰 기간 동안, 명백한 독성 반응은 기록되지 않았다.
실시예 8. 장 투과성에 대한 rAF의 생물학적 활성
혈중 용해 유기물의 투과성에 대한 rAF의 효과를 평가하기 위해, 에반스(Evans) 블루 염료 시험을 상기 설명된 방법(11)에 따라 수행하였다. 처음에는 실험을 상기 실시예 7 및 도 5에 설명된 것과 동일한 방법으로 콜레라 독소 시험감염 전에 rAF를 정맥 주사하여 수행하였다. 그러나, 체액 분비가 측정되지 않았고, 독소 시험감염 90분 후에 PBS중의 에반스 블루 염료 1.5% 용액 1ml를 정맥 주사하였다. 염료가 5분 동안 순환되도록 하였다. 그 후, 200㎖의 4℃ PBS/알세비얼(Alsevier)(1/1 비) 용액으로 좌심실-우심방을 경유하는 경심 관류(transcardial perfusion)(연동 펌프[콜 팔머 인스트루먼트(Cole Parmer Instruments), 시카고, 일리노이 U.S.A]를 이용)를 약 150초 동안 에테르 마취하에 수행하여 랫트를 처리하였다. 이러한 방법은 혈관계에 존재하는 EB를 모두 제거하고, 간질성 조직의 EB만을 남겨 이를 염료의 포름아미드 추출에 의해 검출하기 위하여 수행되었다.
표 2의 결과는 CT-시험감염이 장 조직으로부터 추출될 수 있는 EB의 양을 약 43%로 현저하게 증가(p＜0.001)시키는 반면, 콜레라 독소 시험감염 전에 1 BrT의 정맥 주사는 이러한 증가를 억제하였음을 입증한다. 즉, 1군(대조군)에서 조직으로부터 추출된 EB의 양은 3군(1 rAF + CT)에서의 EB 추출량과 상이하지 않았다.
[표 2]
| 군 | 시험감염 | ng | EB/g 장 조직 x 10-07 | EB-농도의 증가% |
| 1 | PBS + PBS | 6 | 29.3±1.0 | - |
| 2 | PBS + CT | 6 | 51.8±1.3 | 43(p＜0.001) |
| 3 | 1rAF + CT | 6 | 29.6±1.5 | 0 NS |
도 10 및 11에 도시된 결과는 랫트를 P1(IVCHSKTR)으로 전처리 및 전처리하지 않은 경우, 콜레라 독소 시험감염 후 소장 및 측뇌실 맥락총에서 아조 염료 에반스 블루의 혈관외유출을 입증한다.
실험을 하기와 같은 방법으로 수행하였다:
체중 350g의 수컷 스프라그-돌리 랫트를 실험 과정 전에 18시간 동안 절식시켰고, 단 물은 자유 섭취시켰다. 랫트를 6개의 군으로 사용하였다. 펩티드 P1, 콜레라 독소(CT) 및 PBS를 표 3에 따라 투여하였다.
[표 3]
| 군 | 정맥 주사 1 * | 경구 주입 * | 정맥 주사 2 * |
| A | P1 | CT | EB |
| B | PBS | CT | EB |
| C | PBS | PBS | EB |
| * P1 정맥(iv) 주사 1은 2㎖ PBS의 부피로 투여하였고, 경구(po) 주입은 5㎖의 부피로 제공하였으며, 정맥 주사 2는 PBS중에 용해된 3% 에반스 블루 1.5㎖이었다. 에테르를 모든 주입 수행 동안 마취에 사용하였다. | |||
100㎍ CT 또는 PBS에 의한 경구 시험감염 10 내지 15초 전에, P1(0.5㎍) 또는 PBS의 정맥 주사를 수행하였고; 경구 시험감염 60분 후에, 랫트를 에테르로 마취시키고, 에반스 블루를 정맥 주사하였다. 염료를 추가로 30분 동안 평형화시킨 후, 랫트를 다시 에테르로 마취시키고, 250㎖의 알세벌스(Alsevers) 용액/PBS = 50/50을 사용하여 좌심실을 경유하여 심장내로 관류시켜, 혈관계에 존재하는 염료를 모두 제거하였다. 2 내지 3분 동안 수행된 관류 처리 후에, 형광 기록은 혈관계 외부에만 존재하는 염료를 나타내어야 한다.
뇌 및 소장의 일부를 샘플링하여, 드라이 아이스상에서 냉동시키고, 8㎛ 두께의 저온유지 절편(cryostat section)을 제조하였다. 상기 절편을 공기 건조시키고, 크실렌 함유 봉입제(mounting medium)에 봉입시켰다. 상기 절편을 로다민 방출 형광법에 사용되는 것과 동일한 필터 조합을 사용하여 차이스(Zeiss) 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 10 및 도 11의 결과는 A군(P1 iv + CT po) 및 C군(PBS iv + PBS po)에서 소장(도 10) 및 맥락총(도 11) 모두에서 형광 강도(백색)가 유사한 크기임을 입증한다. B군(PBS iv + CT po)의 소장과 맥락총에서의 높은 형광 강도와 비교하면, 상기 결과는 독소 시험감염 전에 옥타펩티드의 주입이 CT로 유도된 에반스 블루의 혈관외 침투를 억제함을 분명히 입증한다. 이 결과는 이것이 소장의 혈관계에서 뿐만 아니라 뇌의 측뇌실의 맥락총에서도 사실임을 시사한다.
결론적으로, 옥타펩티드 IVCHSKTR 정맥내 투여의 효과는 소장에서 뿐만 아니라 중추신경계의 맥락총에서도 콜레라 독소로 유도된 에반스 블루의 혈관외 침투를 억제하는 것이다. 따라서, rAF 및 이들의 펩티드 유도체의 작용은 소장에만 제한되는 것이 아니며, 중추신경계 혈관의 투과성에도 영향을 미친다. 이러한 발견은 rAF 및 이들의 펩티드 유도체가 병리적인 두개내압, 중이의 압력 변화 및 다양한 형태의 혈관 투과성 변화를 역전시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
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도면 설명
도 1a 및 이어지는 도 1b는 신규한 사람 단백질의 핵산 서열 및 추론된 아미노산 서열이다. 확인된 아미노산 서열에는 밑줄이 그어져 있다. 도 1c 는 클로닝된 cDNA 및 올리고누클레오티드 프라이머를 도시하는 수평맵(horizontal map)이다.
도 2는 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된 SDS-폴리아크릴 아미드 미니겔(A) 및 돼지 AF에 대한 항혈청으로 프로빙된 면역블롯(B)을 도시한 것이다. 프라임(') 표시 없는 숫자를 갖는 레인은 글루타티온-아가로오스-정제된 GST-AF 융합 단백질인 AF-1, AF-2 및 AF-3를 함유하는 반면, 프라임 표시된 숫자를 갖는 레인은 트롬빈으로 분해된 융합 단백질을 함유한다. 분자량 대조물질(R)(BDH)은 좌측에 표시되어 있다. GST-AF-1 융합 단백질은 상당히 분해되지만, 면역블롯 분석은 전장 단백질 및 자연적인 트롬빈 분해 생성물의 검출만을 나타낸다. GST-AF-3 단백질에는 아미도 독립적으로 발현된 글루타티온 S-트랜스퍼라아제-테일인 26kDa 생성물이 존재한다.
도 3a는 재조합 단백질 AF-2에 대한 항혈청을 사용하는 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 좌측으로는 돼지(P) 및 세개의 사람(H1, H2, H3) 뇌하수체를, 우측으로는 세개의 재조합 단백질 AF-1, AF-2 및 AF-3(도 2 참조), 그리고 중앙에는 분자량 대조물질(R)을 적용하였다.
도 3b는 토끼에서 미정제 항혈청 및 친화성 정제된 항체를 사용하는 rAF의 효소 결합 면역 검정(ELISA)을 도시한 것이다.
도 4는 사람 및 돼지 뇌하수체(p = 푸울링 및 i = 개개의 재료)로부터 얻은 RNA의 노던 블롯의 오토라디오그램(autoradiogram)을 도시한 것이다. 5㎍의 정제된 mRNA를 각각의 수반에 가하고, 3'-말단 32P-표지된 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여, 7일 후 오토라디오그램을 전개하였다.
도 5는 재조합 단백질 GST-AF-2에 대한 항혈청으로 염색된 선하수체의 냉동 절편을 도시한 것이다. A. 다양한 양성 반응도를 가진 산재되어 있는 세포(속이 찬 화살표)를 나타내는, 면역 혈청과 인큐베이션된 절편. 많은 세포들이 전혀 염색되어 있지 않다(빈 화살표). B. 과량의 재조합 단백질 GST AF-2로 사전흡수된 면역 혈청과 인큐베이션된 A에 대한 연속적인 절편. 세포의 특이적 염색은 없다. C 및 D. 내분비 세포의 세포질 염색을 입증하는 면역양성 세포의 확대도, n = 핵, c = 세포질.
도 6은 콜레라 독소로 유도된 체액 분비의 억제를 시험하는 재조합 단백질 AF-1의 생물학적 활성을 도시한 것이다. 등급화된 용량의 단백질을 랫트에 정맥 주사하였다. 3㎍의 콜레라 독소를 장 루프내에 주사하였다. 5시간 후, 루프에 축적된 체액(㎎/장의 ㎝)을 측정하였다. 각각의 값은 6마리의 동물의 군의 평균 ± S.A.E를 나타낸다.
도 7은 정맥 주사한 rAF-1의 생물학적 활성을 나타낸 것이다. 0.5㎍의 rAF를 랫트의 장 루프에 3㎍의 콜레라 독소로 시험감염 20 내지 30초 전에 또는 90분 후에 투여하였다.
도 8은 관강내 주사된 rAF-1의 생물학적 활성을 나타낸 것이다. 랫트의 장 루프에 3㎍의 콜레라 독소로 시험감염 20 내지 30초 전에 또는 90분 후에 3㎍의 rAF를 주사하였으며, rAF는 상기 독소가 주사된 루프에 약 5㎝에 인접하여 주사하였다.
도 9의 A(x 2.5)는 장 루멘(intestinal lumen)(L)에서 세포 잔해물을 나타내지만, 잔류 점막의 염색을 나타내지 않은 대조군(PBS) 루프이며, 이는 상피 내층이 모두 파괴되었음을 시사한다. B(독소 시험감염전 0.5㎕의 P1)는 융모를 형성하는 상피 내층을 분명하게 나타내며, 이는 보존된 정상의 장점막을 나타낸다. L = 장 루멘. 바 = 500㎛. C(x10)는 PBS로 처리된 대조군에서 파괴된 점막을 나타내며, D는 시험(P1 처리)군에서 상응하는 점막을 나타낸다. 상피 내층에 검은 화살표 끝, LP = 고유층(lamina propria), mm = 근점막, 장샘 세포(crypt cell)에 빈 화살표 끝. 바 = 100㎛. E(x 25)는 대조군(PBS 처리)에서 파괴된 점막을 나타내며, F는 독소 시험감염전 P1 처리한 랫트로부터의 상응하는 확대도를 나타낸다. 바 = 50㎛.
도 10은 콜레라 독소(CT) 또는 대조 완충액(PBS)으로 처리하고, 항분비 펩티드 P1 또는 대조 완충액(PBS)으로 전처리한 3개 군의 랫트로부터 얻은 공장 표본에서의 에반스 블루 형광도이다. LP = 고유층. 검은 화살표는 상피 세포 내층을 나타내며, 빈 화살표촉은 장샘 세포를 나타낸다. 바 = 100㎛.
도 11은 도 10에 도시된 랫트로부터 얻은 맥락총 표본에서 에반스 블루 형광도. 바 = 50㎛.
서열목록
서열 번호: 1
서열의 형 : 상응하는 단백질을 함유하는 누클레오티드
서열의 길이 : 1309 염기쌍 + 폴리(A) 말단
쇄의 수 : 1 본쇄
형태 : 직쇄상
분자형 : cDNA
기원 유기체 : 사람
직접적인 실험 기원 : 뇌하수체
특성 : 63 내지 1208 bp 성숙 단백질
1289 -1295 bp 폴리(A) 시그날 서열
Claims (13)
- 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 가지는 재조합 폴리펩티드.
- 서열 번호: 1의 a) 아미노산 번호 35-42, b) 아미노산 번호 35-46, c) 아미노산 번호 36-51, d) 아미노산 번호 36-80, e) 아미노산 번호 1-80로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드.
- X1VCX2X3KX4R의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 (여기서, X1는 I이거나 존재하지 않고, X2는 H, R 또는 K이고, X3는 S, L 또는 또다른 중성 아미노산이고, X4는 T 또는 A이다).
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 특이적인 항체.
- 활성 성분으로서 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는, 사람을 포함하는 동물에서 병리적 체액 운반, 염증 반응, 또는 둘 모두를 정상화시키기 위한 조성물.
- 활성제로서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 이를 생성할 수 있는 유기체를 포함하는, 척추동물에서 병리적 체액 운반, 염증 반응, 또는 둘 모두를 정상화시키기 위한 사료.
- 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 이를 생성할 수 있는 유기체를 사람을 제외한 동물에게 투여함을 포함하는, 사람을 제외한 동물의 병리적 체액 운반, 염증 반응, 또는 둘 모두를 정상화시키는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 특이적인 항체를 포함하는, 유기체에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 검출하기 위한 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산으로부터 유도된 프로브 또는 프라이머를 포함하는, 유기체에서 핵산의 존재를 검출하기 위한 조성물.
- 제9항의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제11항의 벡터를 포함하는, 사람을 제외한 숙주.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 생성할 수 있는, 사람을 제외한 유기체.
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