SK23698A3

SK23698A3 - Antisecretory factor peptides regulating pathological permeability changes

Info

Publication number: SK23698A3
Application number: SK236-98A
Authority: SK
Inventors: Ivar Lonnroth; Stefan Lange; Eva Johansson; Eva Jennische; Christina Lonnroth
Original assignee: Rural Patent Svenska Ab
Priority date: 1995-08-24
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 1998-12-02
Also published as: BG63209B1; CZ295444B6; SE9502936D0; AU6893296A; ATE270305T1; CN1208420A; CZ52098A3; DK0851876T3; EP0851876B1; JP4040679B2; HUP9900137A3; WO1997008202A1; DE851876T1; KR100552947B1; JPH11511972A; AU702589B2; PL188530B1; NZ337380A; SI0851876T1; EE9800055A

Description

Ob1as ť te chnik v

Prihláška popisuje nový antisekrečný faktor, ktorý ovplyvňuje transport tekutiny, a/alebo zápalové reakcie, ktorý má ďalej mnohé regulačné schopnosti. Patent sa ďalej zaoberá nukleovými kyselinami kódujúcimi tento faktor a Jeho použitím.

D o t e r a i ší stav tec hni k y

Všetky bunky a tkanivá sú kriticky závislé od konštantného a rovnovážneho prostredia spoločne s adekvátnym krvným zásobením. Porucha jednej alebo obidvoch zložiek sa môže stať pre organizmus kritickou. Existujú dva rôzne typy vodnej nerovnováhy:

A. edém, ktorý Je charakterizovaný abnormálnou akumuláciou tekutiny v intracelulárnom priestore alebo v telových dutinách.

13. dehydratácia, ktorá vody, v pôvodnom zmysle slova znamená stratu ale je často používaná na popis straty vody a iónov.

Najbežnejšími príčinami edému a dehydratácie sú: hnačka, choroby spojené so zápalom, mozgový edém, astma, rinitída, konjunktivitída, artritída, glaukóm, rôzne formy patologickej zmeny tlaku v intrakraniálnom priestore, Chypo- aj hypertenzia), zmeny tlaku v strednom uchu, ako napríklad morus Nenlere, dermatitída, chemické alebo fyzikálne poruchy kože a kožných žliazok, ako napríklad mastitída, rôzne formy endokrinných p o r ú c h, a k o n a p r í k 1 a d d i a b e t e s i. n s i p i d u s . C o n n o v s y n d r óm, Cusbingov syndróm a morbos Adison, poruchy obličiek, ako n a p r í l< 1 a d p y e 1 o n e f r i t í d a a g 1 o m e r u 1 o n e f r i t í d a, m e t a b o 1. i c k é poruchy, ako napríklad myxedém a akútna intermitentná porfýria. Ďalej sú to vedľajšie účinky spôsobené liekmi, ako napríklad narkotík.

Hnačka Je čreve

Táto e n t e r o t o x í nm í

Campylobacter cytostatiká.

barbituráty, n ark otlká a ana1ógy spôsobená zmenou permeability pre vodu a ióny v porucha ktoré

Jejúni,

Clostridium difficile.

Je často spôsobená bakteriálnymi produkuje napríklad Escherichla Coli,

V ibr i o choler ae

Porucha môže byt

Shlqella dysertteria a tiež spôsobená črevným zápalom. Pretože transport vody Je spätý so vstrebávaním elektrolytov a živín, trpia zvieratá pravidelne hnačkami a malnutríciou, ktorá sa prejaví váhovým úbytkom a retardáciou rastu. Organizmus môže: o vplyvní t túto nerev no váh u n e u r o h o r m o n á 1 n y m i m e c: h a n i zm a m i, n a p r í k ľJ. a d u v o T n e n í m s om a t o s t a t í n u a peptidov opiátového typu z interneurónev v črevnej sliznici.

Tieto polypeptidy sú zodpovedné za spomalenie sekrécie tekutiny a zmiernenie hnačky.

Posledný čas bol popísaný antisekrečný faktor C AF), ktorý bol izolovaný z bravčovej hypofýzy a ukázalo sa, že zastavuje patologickú sekréciu indukovanú rôznymi enterotoxínmi. Vysoké hladiny AF v bravčovom mlieku chránia kojené mláďatá proti neonatálnym hnačkám.

Predtým boli pri liečení hnačiek u 'ľudí a j zvierat bežne používané rôzne antimikrobiálne látky. Sú tiež často užívané ako potravinové aditíva pre ošípané, hovädzí dobytok a hydinu. Kvôli rýchlemu nárastu rezistencií baktérií, čreva na tieto látky Je teraz používanie antibiotík pri terapii enteritídy obmedzované ako u ludí, tak aj vo veterinárnom ošetrovaní.

Iné antidiaretlká ovplyvňujú sekréciu tekutiny v črevnej sliznici. AJ keď tieto látky ovplyvňujú priamo organizmus hostiteľa, Je známe, že sa aj v tomto.prípade postupom času rozvinie rezistencia. Medzi tieto látky patria neureaktívne lieky, ako napríklad fenotiazíny a tioxantény. Vďaka značným nežiadúcim účinkom týchto látok neboli v mnohých krajinách zahrnuté medzi lieky na antidiáretickú terapiu. Ďalšie látky sú deriváty opiátov, ako napríklad kodeín a loperaniid. Pretože mnohé z týchto látok majú tiež inhibičný vplyv na črevnú mot11itu, zamedzujú tak rýchlemu klíren© patogénnych baktérií v črevnom prostredí a nemôžu byt preto použité na terapiu enteritídy dyzenterického alebo parazitárneho pôvodu. Deriváty samotostatínu boli používané už predtým, ale ich použitie Je limitované obtiažnym dávkovaním týchto látok a možnými interakciami s endokrinnou reguláciou rastu.

Antisekrečný faktor A F⁷ nebol doteraz použitý na liečenie m a I. n u t r í c i e a h n a č i e k k v ô 1 i. J e h o o t) t i a ž n e J p r í p r a v e. Avšak b o 1 o možné indukovať Jednoduché proteíny v hostiteľskom organizme, ktorý bol týmto proteínom pravidelne kŕmený CSE patent č. 9000028-2). Ošípané, ktorým bola podávaná potrava obsahujúca vysoké hladiny AF podobného proteínu mali značne vyšší váhový nárast oproti vyššie uskutočneným kontrolám. AF proteín u potkanov infikovaných toxínom A z C. difficile mal nielen vplyv na zastavenie intestinálnej sekrécie, ale potlačil aj zápalové r e a l< c i u a krv á c a n i e v č rev e.

P o d s tata v y n á1ezu

Hlavným objektom vynálezu Je nový rekombinantný proteín a Jeho homológy a peptidy, pre použitie na normalizovanie patologických transportov tekutiny. Tieto pr o t eíny sú nazývané antisekrečné proteíny CAF). Pri použití AF dochádza tiež k čiastočnej inhibícii alebo totálnej eliminácii vývoja zápalových reakcií s rôznou etiológiou. Návrat k normálnemu stavu C normálny t r a n s p o r t t; e k u t í n a neprítomnosť zápalu) Je dosiahnutý použitím t ý c h t o p r o t e í n o v.

Tieto AF proteíny či peptidy sú efektívni t r a n s p o r t o v a n é c e z sliznicu čreva bez straty svojho účinku (v porovnaní s intravenóznym podaním).

režimy liečenia podávania p r o t e í n u. T o m ô že r ý c h 1 o zastaviť úbytok tekutiny v organizme a vývoj zápalu alebo obidva.

Na záver, rekombinantný proteín AF CrAF) a Jeho homológy a fragmenty môžu byť použité na imunodetekciu, ako potravinové aditíva na urýchlenie rastu zvierat a ako protihnačkové liečivé.

proti chorobám spojeným s edémom, dehydratáciou a/alebo zápalom.

Predmetom vynálezu sú:

Rekombinantný proteín, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEQ 10 č. 1, alebo Jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť.

Fragment rekombinantného proteínu, v zobrazení v SEQ 1D č . 1, j e vybraný zo sk upiny obsahuJ úceJ t

a)	aminokyseliny	č.	35	až	42
b)	a m i n o k y s e 1 i n y	č.	35	až	46
c)	a m i n o k y s e 1 i n y	č.	36	až	51
d)	a m i n o k y s e 1 i n y	č.	36	až	80
e)	a m i n o k y s e 1 i n y	č.	1	až	80

a m i. n o k y s e 1 i n ovej sekvencie, v zobrazení v SEQ l’D č. 1.

P e p t i d X x ý C X X KX R z o d p o v e d a. j ú c i f r a gm e n t u, k t o r ý o b s a h u j e aminokyseliny č. 35 až 42 rekombinantného proteínu, v zobrazení v v SEQ 10 č.l, kde X.,. Je I alebo nie Je zastúpené, X_Ä Je atóm vodíka, R alebo K, X_:3 Je S, L alebo ďalšia neutrálna aminokyselina a X,₊ Je T alebo A.

Protilátky charakteristické pre proteíny, ktoré obsahujú v podstate aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEQ ID č.l, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú aktivitu.

Proteíny naviazané na p r o t i 1 á t k y c h a r a k t e r i s t i c k é p r e

P r o t e í n y, k t o r é o b s a h u J ú v zobrazení v SEQ ID č.1, v podstate aminokyselinovú sekvenciu, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré m a. j ú rovnakú

Kompozícia na úpravu t r a n s p o r t u p a t o 1. o g i c ký c h t e k u t í n a/alebo zápalových reakcií u zvierat, do toho zahrnujúc aj človeka, ktorá obsahuje účinné množstvo rekombinantného proteínu, ktorý v podstate: obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SECJ T.D č.l, alebo Jeho homológu, alebo fragmentu, ktoré majú rovnakú aktivitu.

F³ o u ž i t i e r e k om b i n a n t n é h o p r o t e í n u, k t o r ý v p o d s t a t e o b s a h u J e aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SECJ ID č.l, alebo Jeho homológov, alebo fragmentov, ktoré majú rovnakú účinnosť, pre prípravu kompozície na úpravu transportu patologických tekutín a/alebo zápalových reakcií u zvierat, do toho zahrnujúc aj človeka.

Krmivo na úpravu patologického transportu tekutín a/alebo zápalových reakcií u stavovcov, obsahujúce ako účinnú látku rekombinantný proteín, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení, v SED ID.č.l, alebo ..jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť, alebo organizmus, ktorý Je schopný produkovať uvedený rekombinantný proteín, homológy alebo fragmenty.

Proces úpravy patologického transportu tekutín a/alebo zápalový c Fi r e a k c i í u c i c a v c o v, z a h r n u ...j ú c í p o d a n í e c í č a v c o v í účinného množstva rekombinantného proteínu, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobražení v SEO ID č. 1, alebo ..jeho homológov, alebo fragmentov, ktoré majú rovnakú účinnosť, alebo organizmus produkujúci tento proteín alebo homológy alebo fragmenty.

P o u ž i t í e p r o t i. 1 á t o k c h a r a k t e r i. s t í c k ý c: h p r e r e k om b i n a n t n ý proteín, ktorý v .podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEÍ'J ID č.l, alebo Jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť, na detekciu uvedeného proteínu, alebo Jeho homológov, alebo fragmentov, v organizme.

Nukleové kyseliny kódujúce rekombinantné proteíny obsahujúce sekvencie, v zobrazení v SEQ ID č. 1, alebo ich homológy a fragmenty.

Použitie nukleových kyselín, kódujúcich rekombinantný proteín, ktorý v podstate obsahuje amiriokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEQ ID č. 1, alebo Jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť, pre: prípravu príslušných proteínov alebo homológov alebo fragmentov.

Použitie sond, alebo iniciátorov odvodených od nukleových kyselín kódujúcich rekombinantný proteín, ktorý v podstate obsahuje arninokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEQ ID č.l, alebo Jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť, na detekciu prítomnosti nukleových kyselín v organizme.

Vektor obsahujúci nukleové kyseliny kódujúce: proteíny, ktoré v podstate obsahujú aminokysellnové sekvencle, v zobrazení v SE~Q ID č.l, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť.

Hostiteľ., okrem ľudského, ktorý obsahuje vektor zahrnujúci nukleové kyseliny kódujúce: rekombinantné proteíny, ktoré v podstate obsahujú aminokysellnové sekvencle, v zobrazení v SEQ ID č.l, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť.

Bakteriálny kmeň organizmu, okrem ľudského, schopný produkovať rekombinantné proteíny, ktoré v podstate obsahuje: aminokysellnové sekvencle, v zobrazení v SEQ ID č.l, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť.

Ako organizmy, ktoré by produkovali rekombinantný proteín;

je možné použiť rôzne typy rekombinantných baktérií a e: k u k a r y o t i c k ý c h o r g a n i zm o v, ako napríklad kvasinky, rastliny, stavovce, okrem človeka.

V posledných desiatich rokoch prebehlo mnoho pokusov o izoláciu čistého proteínu AF pomocou všeobecných biochemických metód, ale týmto spôsobom sa proteín nepodarilo získať. Avšak vhodné antisérum bolo vybrané novým postupom na prípravu semičistého AF pre imunizáciu a selekciu antiséra pomocou imunohistochemickej metódy. Pomocou tohoto antiséra bolo možné vyklonovať ľudskú cDNA, ktorá bola exprimovaná v E. coli

Bola stanovená sekvenčia novej cDNA. So znalosťou tejto sekvencie boli skonštruované ollgonkleotidové próby, ktoré h y b r i d i z o v a 1. i s 1 u d s k o u In y p o f y z á r n o u R N A. V e 11< o s ť t e. J t o R N A» ktorá Je okolo 1400 párov, zodpovedá veľkosti sekveneovaneJ cDNA, ktorá obsahu je 1309 párov báz plus polyC A)zakončenie. Čiastková cDNA sekvenčia z potkanej hypofýzy sa ukázala byť identická s ľudskou cDNA, kde odráža ubikvitérnu štruktúru obsiahnutú v AF génoch z rôznych species. To znamená, že Je možné použiť rovnaké oligonukleotidové próby pre identifikáciu RNA kódujúcu AF a DNA z rôznych species.

Neskôr bolo možné exprimovať rAF v biologicky aktívnej forme. AI- proteín ako fúzny proteín s glutatión S-transferázou bol exprimovaný vo veľkom množstve v E. coli a čistený do homogénneho stavu pomocou afinlnitriej chromatografie. Po dobehnutí fúzie proteínu s trombínom sa ukázalo, že rekombiriantný AF CrAF) Je veľmi nádejný, 44 ng CUT’~) dávalo polovičnú maximálnu inhibíciu cholera toxínom indukovanej sekrécie tekutín v čreve potkana.

Pomocou génovej technológie boli produkované menšie fragmenty rAF. Ukázalo sa, že tieto malé fragmenty obsahujúce: 7-8 aminokyselín majú dostatočnú aktivitu. To bolo dokázané pomocou syntézy chemicky pevnej fázy, pri ktorej bol produkovaný technický oktapeptid a ukázalo sa, že Je skoro tak biologicky aktívny ako rAF na molárnej báze. Pomocou miestne regulovanej syntézy bolo vytvorených mnoho sekvencií vnútri aktívneho miesta a premiestenie určitých aminokyselín bolo možné bez straty b i o 1 o g i c k e. j ak t i v i t y .

Množstvo sekretovanej tekutiny bolo merané pomocou modelu č r e v n e J s 1 u č k y ·. č a s ť C s 1 u č k a j t e n k é h o č r e v a b o 1 a 1 i g a t o v a n á d v om a sutúrami; do slučky bolo injikované určité množstvo enterotoxínu. F’r i testovaní a n t isek rétorických látok sú tieto látky podané medzi Jednou hodinou pred a dvoma hodinami po toxínovej reakcii. Injekcia bola aplikovaná troma rôznymi spôsobmi; intravenózne, intraintestinálne a intranazálne. Tekutina sa akumulovala v črevnej slučke päť hodín po podaní toxínu. Sekrécia bola počítaná podlá hmotnosti akumulovanej tekutiny na cm čreva.

Sekvencie protelnu boli určené priamo podľa aminokyselinových sekvencií aj nepriamo podľa sekvencií cDNA.

Rekombinantný AF má veľmi malé toxické alebo systémové účinky, keďže: neboli, zaznamenané žiadne obvyklé toxické reakcie u potkanov, ktorým bola podávaná lOOx vyššia dávka ako tá, ktorá spôsobuje polovičnú maximálnu inhibíciu. Keďže: Je: látka účinná keď Je injikovaná do tenkého čreva, môže byť podávaná perorálne. Rekombinantný AF^ľ inhibuje sekréciu tiež pri injikovanl po uvoľnení, toxínu na rozdiel od prirodzeného AF, ktorý Je účinný len ak Je injikovaný pred uvoľnením toxínu. Preto rAF by mohol byť použitý ako profylaktický tak aj terapeuticky.

Ba čo viac, ukázalo sa, že: rAF a Jeho peptidové fragmenty inhibujú cytotoxické reakcie: a zápal. čreva spôsobený toxínom A z ClosIrídium difficile. Pomocou testu na priepustnosť farbiva sa zistilo, že: rAF a Jeho fragmenty môžu zvrátiť patologické zmeny priepustnosti indukované cholera toxínom nielen v črevnej sliznici, ale: tiež v plexus choroideus, ktorý reguluje tlak 1 i k v o r u v m o z g u.

Bolo vyrobené antisérum proti. rAF v králikoch a použité o metóde: ELISA C enzýme-linked immuno assays) . Táto metóda môže: byť použitá na meranie AF v telových tekutinách alebo Jedle.

Π e; t ó d a p u r i f i k á c: i e p r o t i 1 á t o k p r o t i A F C p r i r o d z e n ém u a 1 e: b o rekombinantnému), ktorá sa uskutočňuje afinitnou chromatografiou na stĺpcoch s agarózou, ktorá viaže rAF, Je popísaná nižšie.

Ukázalo sa, že protilátky sú tiež vhodné na detekciu AF- v tkanivových rezoch metódou iinunohistochemických techník a na d e t e k c i u A F v o W e s t e r n b 1 o t e.

Vynález bude teraz popísaný ďalej pomocou nasledujúcich n e o bm e d z u j ú c i c h p r í k 1 a d o c h a s p r i e v o d n ý c h o b r á z k o v .

Príklady realizácie vynálezu

Príklad é. 1

Protilátky proti A F produkované pre klonovanie c D IM A

Antisekrečný faktor boli pripravený z krvi ošípané, j pomocou afinitnej chromatografie na agaróze a izoelektrickou fokusáciou.. Do Jedného litra krvi ošípané J C obsahujúcej antikoagúlačné látky) bol pridaný 1 g tiosulfátu sodného a 1 mg fenylmetylsulfonylfluoridu. Krvné bunky boli separované pomocou centrifugácie a čistá plazma bola eluovaná . cez stĺpec so Sepharose 6B CPharmacia LKB Biotechnology Stockholm). Objem gélu zodpovedal asi 10% objemu roztoku. Po premytí pomocou trojnásobku objemu fosfátovým pufrom (. PBS ~ 0,15 mol NaCl, 0, 05 mol fosfátu sodného, pl-l 7, 2) stĺpec bol eluovaný pomocou dvojnásobku objemu 1 mol ct-metyl-D-glukozidu rozpusteného v PBS. Eluát bol koncentrovaný a dialyzovaný proti vode na Omega 10k flotu through ultrafiltri C F i11ron T echno1ogy Corp.). F rak cia bo1a ná s1edne frak cionizovaná pomocou izoelektrlckeJ fokusácie v ampholine CPharmacia) gradiente pH 4-6 na 400 ml izoelektrofokusačnom stĺpci CLKB, Sweden). Frakcia majúca izoelektrický bol medzi 4, 7 a 4, 9 bola zozbieraná a dialyzovaná. proti PBS. Týmto spôsobom čiastočne purifíkovaný A F bol. rozdelený na malé časti a použitý pre produkciu antiséra v králikoch podlá vyššie popísanej metódy.

Králiky boli imunizované a sérum testované na svoju kapacitu označil intracelulárny materiál v rezoch ľudskej hypofýzy Cmetóda popísaná v príklade 6). Len Jedno zo sér bolo špecifické a rozlíšilo intracelulárne zložky bez označenia extracelulárnych matricových proteínov. Toto antisérum bolo vybrané pre: zobrazenie cDNA/lambda fágovej GT.1.1 knižnice: z ľudskej hypofýzy, ktorá e x p r im u J e p r o t e: í n u v E . c o 11 Príklad č, 2

Zobrazenie c DM A knižnice: z ľudskej hypofýzy a mozgu

5'-predĺžená cDNA knižnica z normálnej ľudskej hypofýzy, získaná z tkaniva deviatich kaukazanov, bola zakúpená od Clontech Laboratories. S cieľom zobrazenia knižnice, boli naočkované fágy 3x10* PFU na 150 mm misku do E. coli Y1090. Vyššie popísané králičie antisérum proti bravčovému AF bolo absorbované polovicou objemu E. coli Y1090 lyzátu počas 4 hodín pri 23 °C a rozriedené v pomere 1:400 a zobrazenie prebiehalo podľa Younga a Davisa (1). Ako druhé protilátky boli použité alkalickou fosfatázou konjugované anti-králičie protilátky. Boli vybrané pozitívne plaky, boli eluované do fágového suspenzného média (20 mmol Trls HC1 (pH 7,5), 100 mmol NaCl, 10 mmol MgSCU, 2% želatíny), preočkované a sledované dokiaľ všetky testované plaky neboli pozitívne.

Reklonovanie cDNA - Fágová DNA z AF rekombinantov bola izolovaná pomocou Wizard Lambda Presp (Promega) a zažitá pomocou EcoRl. Inzerty boli čistené pomocou Sephaglas BandPrep Kits (Pharmacia), reklonované do pGex-llambdaT vektora (Pharmacia) ako je to popísané výrobcom a transfekované do Epicurian Coli

XLl-Blue, Top 1 buniek alebo	BL21	buniek (všetky	tri od
Stratagene). r AF alebo r peptidy	boli	pripravené v BL21	bunkách,
P o k i a ľ n e b o 1 o u v e d e n é n i e č o i n é .
Amplif ikácia cDNA pomocou	PCR	S cieľom	získania

chýbajúceho 5' -konca cDNA bola použitá metóda na báze: PCR nazvaná RAČE (rapic amplification of cDNA ends). Modifikovaná metóda RAČE, ktorá generuje 5'-RAČE pripravenú cDNA ukotveným oligonukleotidom s naviazaním na. 3' -konce ľudských mozgových cDNA m o 1 e k ú 1 bo 1 a zakúpená o d C1 o n t e c h L. a b o r a t o rieš. 5' - k o n i e c b o 1 amplifikovaný z časti 5'-RACE-pripraveneJ cDNA v dvoch PCR amplifikačných kr okoch používajúc 5' -primér komplementárny ku kotve a dva hniezdené génovo Špecifické 3' priméry A a B C A = báza 429-411 a B é báza 376-359; Obr. la). Rôzne menšie časti RAČE fragmentu boli ďalej amplifikované s cieľom expresie zodpovedajúcich peptidov a testované ich biologické vlastnosti. Pozícia bázy a aminokyseliny na začiatku a na konci týchto oligonukleotidových fragmentov a ich zodpovedajúce; peptidy sú zobrazené v tabuľke 1. Bravčová a hovädzia cDNA (Clontech Laboratories) boli použité ako matrica pre; amplif ikáciu fragmentov korešpondujúc: s N3 v Tabuľke; 1. Variácia sekvencie bola tiež inzertovaná umelo pomocou určenej mutagenézy. V tejto metóde; boli syntetizované rôzne; oligonukleotidy korešpondujúce; s pozíciou 166-193 s cieľom nahradenia Jednu po druhej aminokyselín 35-42 <pozície; ako sú zobrazené v SEO ID č. 1). Amplifikovaný DNA fragment bol klonovaný do pGEX-llambdaT vektora pri použití EcoRl miesta so vsadením do kotvy a génovo špecifického priméru. S cieľom overenia sekvencie získanej RAČE metódou boli amplifikované dvojreťazcové cDNA z ľudskej hypofýzy a mozgu C Clontech) pomocou primérového páru C/D s obsahom extra EcoRl Stepné miesto CObr. lb). Priméry boli vytvorené s cieľom umožnenia amplifikácie celého otvoreného čítacieho rámca C ORF- operí reading f ráme) . Hypofyzárne a mozgové PCR produkty s očakávanou veľkosťou boli digerované s EcoRl, izolované a k losované do plazmidového p G e; x—llambdaT vektora.

/7/7/1 sekvencwanie a oligoriukleotidy - DNA z plazmidu pGex-llambdaT bola použitá ako matrica pre sekvencovanie; inzertov pomocou ’'dideoxy-chain-termination metódy C15) pri použití kitu Sequenase verzia 2.0 (U.S. Biochemical Corp.). Začiatočné dopredné a reverzné priméry kopírujúce; oblasti pGEX-llambdaT bezprostredne; smerom hore; aj dole vloženej DNA boli získané od P h a r m a c i a. N á s 1 e d n é p r im é r y b o 1. i s y n t e: t i z o v a n é C S c a n d i n a v i a n G e; n e; Synthesis AB) na základe získanej sekvenčnej informácie. Tri rôzne; PCR kleny boli sekvencované s cieľom vyhnutia sa výmene; báz Taq polymerázou v 5’-RAČE metóde.

Nukleotidové sekvencie; a dedukované proteínové sekvenčné dáta boli zostavené a analyzované pomocou NacVector 4.1 C Eastman Chemical Co.). Aby sa určila korešpondujúca aminokyselinová sekvencía c D IM A inzertov bolo porovnané kodónové použitie rôznych čítacích rámcov a vytvorilo Jeden veľký otvorený čítací rámec. Skúmané dáta DNA a proteínovej sekvencie boli získané pomocou En t rez C D-R 01*1 disc C Na t ióna 1 Center f or Biotechnology Information, Bethesda, USA) .

Molekúl árne.

klonovanie a sekvenčná analýza cDMA

Polyvalentné antiséra proti AF proteínu z ošípanej boli použité na zobrazenie cDMA z ľudskej hypofýzy. Boli izolované dva klony exprimujúce im u n o r e a k t í v n y A F' zobrané z fágu lambda a r eklonované do EcoRl pozície vektora pGEX-llambdaR, ako Je to popísané v kite poskytnutom od Pharmacia. Pomocou reštrikčnej analýzy boli zistené inzertné veľkosti

1100 a 900 bp DNA ekvencovanie dvoch klonov umožnilo utvoriť homolégiu výnimkou jednej substitúcie (Obr. 1, C namiesto

S e k v e n c i a sm e r om In o r e

RAČE metódy.

F- ragment

5'—konca klonu 2 ni a 1 c e 1 k o v ú d í ž k u získaná pomocou

376 ;; y n t e t i c k é n u k 1 e o t i d o v é vetvu na 5'-konci).

Úplne cDNA obsahovala 1.309 párov báz nasledovaných poly-A koncom, ktorý bol. precedenčný poly-A signálom (Obr. 1, pozícia 1289-1295).

Bol identifikovaný otvorený čítací rámec CORF) 1146 bp C pozícii

63-1206).

Príklad 3

Expresia cicavčieho AF- proteínu z rekombinantných plazmidov

Konštrukcia a čistenie ŕúznych pr otelnov - cDNA k lony získané pomocou imunologického zobrazenia a PCR amplifikácie celej cDNA boli ligované k pGEX-llambdaT. Tento vektor umožňuje exprešiu cudzích proteínov v E. coli ako fúzie k C koncu Schistosoma .japonicum 26 kDa glutatión S-transferázy, ktorá môže byť afinitne purifikovaná pri nedenaturačných podmienkach pomocou kitu poskytnutého od Pharmacia. Stručne, počas noci získané kultúry E. coli transformované rekombinantným pGex-llambdal plazmidmi boli rozpustené v čerstvom média ponechané rásť počas hodín pri 37 °C. Proteínoví! expresia bola indukovaná pomocou 0,1 mmol IPTG Cizopropyl-beta-D-tiogalaktopyranozid) a po ďalších hodinách rastu pri 30 °C boli bunky na očko varíš a resuspendované v PBS. Bunky boli lýzované soriif ikáclou, ošetrené 1% Tritonom X--100 a centrifugované pri. 12000 ot/niin. Supernatant obsahujúci exprimovarié fúzne proteíny bol čistený pasážou lyzátov cez glutatiónovú agarózu CPharmacia). Fúzne proteíny boli buď eluované pomocou kompetície s voľnými glutatlónmi alebo boli rozštiepené cez noc pomocou 10 U hovädzieho trombínu s cieľom odstránenia AF proteínu z GST afinitného konca. Celá metóda použitia pGEX plazmidu a čistenia rekombinantných proteínov alebo peptidov bola použitá ako kit dodaný od Pharmacia.

Sekvencíe a i/e2'kosť rekombinantných AF proteínov - S cieľom získanie kódujúcej sek venci e bol izolovaný transkri.pt s plnou dĺžkou pomocou PCR amplifikácie hypofyzárnej a mozgovej cDMA. Pomocou primárovho páru C/D sa získalo 1215 bp Identických so sekvenciou klonu-4 CObr. 1). ORF kódoval 382 aminokyselín s vypočítanou relatívnou molekulovou hmotnosťou 41.14 kDa a v y p o č í t a n im p I 4.9 .

AF kloriy-l, 2 a 3 takisto ako oligonukleotidy Ν1-Μ5 C CJbr. 1 a tabuľka 1) boli naviazané do pGex-llambdal plazmidového vektora, takže ORF bol v rámci s proteínom glutatión S-transf eráza. Konštrukty boli transformované do E. coli ti expresia fúzriych proteínov bolai indukovaná pomocou IPTG. Čistené fúzne proteíny a trombínom rozštiepený AF proteín alebo peptid boli spracované SDS-PAGE s Western blotom s využitím antiséra proti bravčovému antisekrečnému faktoru CObr. 2). Značenie pomocou Coomassie brilliant modrej proteínov poskytlo diskrétne pásy pre každý proteín okrem GST-AF-1 proteínu, čo manifestuje degradáciu na menšie časti.

Syntéza peptidu pevnou fázou - Menšie peptidy (P-r až Ρ_1Θ v tabuľke 1) boli vytvorené (K. J. Ross—Peter sen AS) na pevnej fáze: v Applied Bíosystems peptidovom syntetizéri. Čistota každého peptidu bola 93-1.00%, ako to bolo vyhodnotené podľa reverznej fázy HPLC na Deltapak C18. 300 A s použitím lineárneho gradientu

0,1% kyseliny trifluóroctovej vo vode/acetonitrile.

Sekvencoi/artie aminokyselín - Analýza proteínových sekvencií bola uskutočnená s cieľom zistenia validity identifikovanej Í JRF, Čisté A F proteíny boli ponechané aby bežali v 10 % niacro-slab SDS-PAGE C14) a transferované proteíny v Problot membráne CApplied Biosystem) pomocou elektroblotingu CBiop-Rad). Vzorky boli zviditeľnené pomocou Ponceau S značenia, ďalej boli excídované z blotu ei prvých 20 aminokyselín proteínu bolo sekvencovaných pomocou autolmunitnej EdmanoveJ degradácie na automatickom sekvenovači CApplied Biosystems).

N—terminálne sekvencie: klonu—2 a 3 boli determinované a ukázalo sa, že aminokyseliny sa dobre: hodia k aminokyselinám 63-75 a 130-140 resp. k ich korešpondujúcim nukleotidovým sekvenciám (Obr. 1).

Porovnanie s inými proteínovými sekvenciami dostupnými v GenBank ukázalo, že sekvencia rAF Je unikátna (Obr. 1) vo všetkých Jeho častiach a žiadne podobné sekvencie neboli zistené.

Prvých desať zvyškov proteínu sa ukázalo ako relatívne: hydrofóbnych, boli analyzované pomocou Kztes-Doolittle C 22) a môžu tvoriť signálny peptid, ktorý Je rozštiepený ešte pred svojou exocytézou z proteínu. Táto interpretácia Je: podporená analýzou Nesiem blot CObr . 3), pri ktorej sa zdá, že tento proteín má vyššiu molekulovú hmotnosť ako proteín extrahovaný z hypofýzy.

Niektorý z. týchto môže tiež byť spôsobený pridaním 5 aminokyselín do rek ombinantného proteín, ktorý Je zložený z t r om b í n om r o z š t i e p i t e 1 n é h o m i e: s t a f ú z n e h o p r o t e: í n u.

Príklad 4

Produkcia a testovanie antiséra proti rAF

Antiséra proti rekombinantnému GST-AF -fúznemu proteínú - V organizme králika boli vytvorené protilátky proti čisteným fúznym proteínom GST-AF-l, GST-AF-2 a trombínom rozštiepitelnému čistému AF1 proteínú C=rAF) pre použitie v ELISA, Western blote a imunohistochemických štúdiách. Každému králikovi bolo podaných 100 ug antigénu v 1 ml PBS mixovaného s rovnakým objemom Freundovho kompletného adJuvans. Každá imunizácia bola rozdelená do 8-10 dávok injikovaných do chrbáta intrakutánne. Dva udržiavacie dávky s 50 j_tg antigénu boli injikované v treťom a piatom týždni a posledná bola bez Freundovho adJuvans.

Králikom bola odobraná krv 6. deň po poslednej udržiavacej dávke a séra boli skladované pri -20 °C. Citlivosť antiséra bola testovaná pomocou dot-blot skúšky. GST-AF-2 bola amplifikovaná na ECL nitrocelulózovej membráne v 1/5 dilúcii a antisérum bolo zriedené v pomere 1 s 1000. Membrána bola blokovaná pomocou 1% hovädzieho sérového albumínu (BSA) v PBS pri 4 °C počas 16 hodín a potom inkubovaná počas 1,5 hodiny pomocou 1:800 riedeného králičieho anti GST AF alebo bravčového antiséra. BIot bol vyvinutý pomocou konjugátu alkalickej fosfatázy kozy a antikráličieho imunoglobulínu a potom pomocou bróm-4-chlór-3-indolylfosfátu a p-nitro modré tetrazolium CBoeringer ľlannhelm) . V prípade tohoto testu bol odhadovaný limit pre detekciu antigénu okolo 1 ng.

El&ktroforéza ria SDS-polyakrylamidcn/om géle: a imunoblotting - Elektroforéza na SDS-polyakrylamidovom géle (SDS-PAGE) extraktov z ľudskej a bravčovej hypofýzy a čisté AF proteíny boli pridané do 10% akrylamidového gélu, presne ako to popísal Laemmli (4) s modifikáciou, žé bis-akrylamid ako sieťovadlo bol t r a n s fer ovaný N,N’-dia1y11ar t ardiamidom pod1a pr íslušneJ molarity. Pyronín Y (Sigma) bol použitý ako marker elektroforézy. Dopredu označené molekulové hmotnosti boli nakúpené od BPH. Každý proteín bol potom označený pomocou Coomassie briliantovej modrej alebo boli transferované na ECL. nitrocelulóze s 0, 45 mm veľkými pórmi CAmersham) pre imunoblotting. Subsekventné inkubácie pomocou BSA konjugovanej s protilátkami anti-IgG boli rovnaké ako pre dot-blot skúšku popísanú vyššie.

Ako bolo uvedené vyššie značenie pomocou Coomassie Brilliant modrej nevytvorilo žiadny špecifický prúžok pre GST-AF-1 proteín, ktorý bol pravdepodobne proteolytlcky degradovaný na menšie fragmenty. Rovnako ako vo Western bJot analýze vytvorili proteíny s úplnou dĺžkou oveľa silnejší signál ako degradované produkty CObr. 2b). Silná reakcia medzi antisérom proti bravčovému AF naznačovala, že rekombinantné proteíny mali skutočne rovnakú imunoreaktivitu ako AF. Molekulová hmotnosť proteínov s celou dĺžkou sa zdala byť okolo 60 kDa, čo Je vyššie, ako Je molekulová hmotnosť 41139 Da zistených u aminokyselinových kompozícií.

Proteíny boli ďalej imunoblotované a testované s antisérom vyvinutým proti GST-AF-2, ktoré viaže trombínom rozštiepené proteíny CObr. 3).

Antlsérum proti rekombinantnému GST-AF-2 reagovalo s prirodzeným spôsobom získaným AF proteínom s molekulovou hmotnosťou 60 kDa a s niektorými malými časticami pravdepodobne produktmi enzymatickej degradácie CObr. 3a).

ELISA na určenie koncentrácie AF — ú ELISA skúške boli použité anti-AF-1 a anti-AF-2 podľa vyššie popísanej metódy C5). Ako Je ukázané na obr. 3b, citlivosť tohoto testu so surovým antisérom bola medzi 1-10 mg proteínu, zatiaľ čo test s afinitne čistenými protilátkami mal citlivosť medzi 5-50 ng proteínu.

Príklad 5 hlorthern blot analýza RNA z hypofýzy

Northern blot analýza - Ľudská hypofýza získaná postmortálne z Sahlgrenska Hospital C so súhlasom Suedish Flealth and Wealfare Board, paragraf 2 transplantationslagen, 1975:190). RNA bola z hypofýzy extrahovaná pomocou guanidín tiokaynátu podľa Chomczynski a Sacchi C 6). Polyadenylovaná RNA bola vybraná pomocou komerčného kitu CPharmacia) používajúceho kolóny s oligodT-celulózy. Ďalej boli, použité vzorky ľudskej hypofyzárnej mRMA od 107 darcov odkúpené od Clontech. Každá vzorka s 5 jjg polyC A-+-) RNA bola ošetrená glyoxalom a podrobená elektroforéze na 1,2 % agarózovom géle (7). Po prebehnutí trojhodinového kapilárneho alkalického prenosu v 0, 05 mol NaOH do Hybortd N->nylónovej membrány CAmersham) prebehla prehybridizácia a hybridizácia počas 24h pri. 42 °C. Hybridizačný roztok obsahoval 50 % formamidu, 5xSSPE, lOxDenhardovho roztoku s 250 ug/ml denaturovanej nízkomolekulárnej DMA a 50 ug/ml polyadenylovej kyseliny. Bloty boli testované pomocou štyroch rôznych antisenciálnych 28 bp oligonukleotidov obsahujúcich pozície 132-105 Cprimér E), 297-270 Cprimér F), 748-721 Cprimér G) a 833-806 Cprimér H) sekvencie (obr. 1) . Tieto próby boli 3'-koncom spojené s terminálnou transferázou (Boeringer Mannheim) plus C alfa^’p) ddATP CAmersham) a čistené na Mlok kolónach (Pharmacia) . Päť premytých vzoriek v 5XSSPE/0, 1% SDS - 0,5XSSPE/0, 1% SDS bolo pripravovaných pri 41 ^<:>0 počas 30 minút s opakovaním posledného premývania. Filtre boli, exponované na hyperfilm MP (Amersham) počas siedmich dní.

Expresla i/ hypofýze - Norther n blot analýza bola použitá pre zmes štyroch oligonukleotidových prób, ktoré hybridizovali s rôznymi, sekvenciamí pozdĺž klonovanej cDMA. Pr óby hybridizovali s jednotlivými pásmi., ktoré mali okolo 1400 bp. na mRNA, ktorá bola separovaná z hypofýzy.

Silnejšie signály boli, získané z humánneho materiálu, ale bravčový materiál tiež sieťoval.

Príklad 6

Distribúcia AF v rezoch hypofýzy

Molekulárny druh a tkanivá - Ľudská hypofýza bola získaná v Sahlgrenska Hospital C so súhlasom Swedish Health and Wealfare Board, paragraf 2 transplantationslagen, 1975.-190). Žľazy boli, zmrazené na -70 °C a tak uchovávané, okrem tých, ktoré boli p o uži t é p r e h i s t o 1 o g i c l< é s l< ú š l< y .

Tieto žľazy boli fixované počas 24 hodín u 4 % paraformaldehyde rozpustenom vo fosfátom-pufrovanom roztoku CPBS=O, 15 mol NaCl, 0,05 mol fosfátu sodného, pH =7,2) a potom boli premiestené do 7,5 % sacharózy v PE3S. Hypofýza z ošípaných bola počas transportu skladovaná na suchom lade pri -70 *0 až do doby použitia. Sprague-Dawley potkany, 2-3 mesiace staré, boli získané pre bioslcúšky od B & K IJniversal AB, Sollentuna, Sweden. Králiky CNew Zéland White) pre imunizáciu boli získané od Lidkoping Kaninfarm, Sweden.

Imunohistochémia - Fixovaná hypofýza bola zmrazená v tekutom dusíku a boli pripravené 7um tenké rezy. 7. každej vzorky bolo pripravených 5-10 rezov, ktoré obsahovali rôzne časti žlazy. Boli pripevnené na mikroskopické sklíčka. Vzorky boli, uložené do 5 % odtučneného sušeného mlieka a inkubované s primárnym králičím a n t i s é r om C a n t i - G S T - A F - 2 f ú z n y p r o t e í n ) . z r i e d e n é 1:4000-1=8000 vo vlhkej komôrke cez noc pri 4 °C. Po premytí v pufri boli vzorky inkubované počas jednej hodiny pri 23 °C s alkalickou fosfatázou konjugovaným bravčovým antikráličím imunoglobulínom a boli zriedené v pomere 1:50 (Dáko A/S), Imunoreakcie boli vizualizované pomocou fosfatázových substrátov, ako to bolo popísané inde C8). Kontrolné vzorky boli inkubované s imúnnym sérom absorbovaným s prebytkom GST-AF-proteínu alebo so všetkými inkubačnými krokmi, okrem Inkubácie s primárnymi protilátkami.

Distribúcia i\F v rezoch hypofýzy - Distribúcia AF v rezoch ľudskej hypofýzy bola študovaná pomocou imunohistochemických techník CObr. 5). Vo všetkých vyšetrovaných vzorkách sa zobrazili rôzne množstvá buniek v adenohypofýze. Imunohistochemický materiál bol lokalizovaný v cytoplazme. Signál, bol zrušený preabsorpciou imúnneho séra s prebytkom GST-AF-2 proteínu. Neboli zistené žiadne značené: miesta v zadných častiach žľazy Cneurohypofýze).

Distribúcia imunoreaktívneho materiálu v hypofýze ukázala výrazné rozloženie AF výrazné intracelulárne rozloženie AF v sekrečných bunkách predného laloka hypofýzy Cadenohypofýzy).

Medzi proteíny uvoľňované z tohoto laloka patrí rastový hormón, tyreotropín, kortikotropín, prolaktín a luteinlzačný hormón. Pasáž týchto hormónov z intracelulárnej lokalizácie do vaskulárneho systému „je riadená realizačnými faktormi, ktoré sú uvoľňované neuroendokrinnýini bunkami v hypotalame.

Príklad 7

Biologická aktivita rAF

Antisekrečná aktivita - Antisekrečná aktivita bola meraná na modeli potkanej intestiriálnej slučky, popísanom už predtým (9). Jejunálna slučka bola intoxikovaná troma ug cholera toxínu. Každá rôzna dávka čisteného AF proteínu alebo PBS (kontrola) bola injikovariá pred alebo po intoxikácii cholera toxínom. Hmotnosť akumulovanej tekutiny v intestiriálnej slučke (jjg/cm) bola meraná po piatich hodinách. Každá vzorka AF bola testovaná najmenej na šiestich potkanoch. Fisherov PLSD bol použitý pre štatistickú analýzu získaných dát.

Biologická aktivita rAF proteínu Biologická aktivita čistého rAF- proteínu k lonu-1 produkovaného v E. coli bola testovaná na potkanioin modeli. Kapacita rAF⁷ inhibovať sekréciu intestinálnej tekutiny po i.v. injekcii podanej 20-30 sek. pred intoxikáciou choler a toxínom Je zobr azená na C'Jbr. 6. U kontrolných zvierat, ktorým bol podaný len pufer, spôsobil cholera toxín sekréciu 412+/-9 mg na cm čreva. Čistý rAF- spôsobil od dávky závislú inhibíciu sekrécie, ktorá bola značne rôzna od výsledkov získaných po podaní len pufra (p<0,01, n=6).

Deväť ng proteínu klonu-1 stačí na redukciu odpovede na 34 X, kde 44 n g (10~¹² mol) a 220 n g redukuje odpoveď na 4Ei % a X. Biologická aktivita rekombinantného AF Je väčšia ako nám doteraz známeho enterotoxínu, neurohormónu alebo intestinálneho hormónu regulujúceho vodný a elektrolytický transport. Hodnota aktivity ľudského rAF u potkana Je prekvapivo vysoká, čo pravdepodobne odráža všadeprítomnosť Struk túry reprezentovanej v rAF molekule z rôznych vzorcov. Táto hypotéza Je podporená skríženou reaktivitou medzi ľudskou a bravčovou vzorkou vyčetrovanými vo Western blote a Morthern blote.

Bola porovnaná kapacita 0, 5 j.tg rAF inhibovať intestinálnu sekréciu po i.v. injekcii podanej 20-30 sek. pred a 90 min. po intoxikácii cholera toxínom CObr. 7). Obidva spôsoby podania mali značný inhibičný účinok oproti kontrolám Cp<0, 01, n-6) .

Takže, na rozdiel od prirodzeného AF, rekomblnantný proteín bol tiež účinný, keď bol podaný po toxikácii, čo umožňuje rAF použitie v terapeutickom liečení hnačky.

u g rAF boli injikované do 8-10 cm dlhej črevnej slučky umiestenej prevažne proximálne. Črevná slučka bola intoxikovaná toxínom cholery.

rAF bol podaný 20-30 sek. pred alebo 90 min. po intoxikácii cholera toxínom. Na obr. 8 Je ukázané, že v obidvoch skupinách testov došlo k značnej redukcii sekrécie tekutiny <p<0,01, n=6). Tento experiment predpokladá, že rAF Je aktívny po orálnom podaní a môže byť použitý v potrave ako adltívum a nemá žiadne silnejšie v e d ľ. a J S i e ú č i n k y .

V príkladoch po písaný c h vyššie bol rAF produkovaný v Epicurian coli XL-1 bunkách. V týchto bunkách bolo mnoho produktov degradovaných na menšie peptidy. Ak bol rAF produkovaný len v BL21 bunkách, len Jeho malá časť bola degradovaná, v Top 1 bunkách nedošlo vôbec k žiadnej degradácii.

Prekvapivo bola biologická aktivita úmerná výške degradácie. Tzn. vyššia degradácia bola spojená s vyššou aktivitou. Z týchto dôvodov boli aj menšie fragmenty testované na svoju biologickú aktivitu.

Ako je ukázané v tabuľke 1, boli tieto fragmenty testované po i.v. podaní pred intoxikáciou cholera toxínom rovnakým spôsobom, ako Je popísané vyššie pre intaktný rAF. Peptidy exprimované klonom 2 a 3 boli testované v množstve 0, 1, 1 a 10 yg. Nemali žiadny efekt na účinok toxínu. Na rozdiel to toho, 1 u g peptidu exprimovaného pomocou R A C. E fragmentu (kloň 4) mal značný efekt. Mnoho kratších častí bolo vytvorených RAČE fragmentom a exprimovaných v pGex-llambda. Aktívne miesto bolo zistené v polohe medzi aminokyselinovými zvyškami 35-51, ako Je ukázané v tabuľke 1. V snahe určiť presnejšie aktívne miesto boli vytvorené tri malé peptidy pomocou metódy syntézy pevnej fázy. Dva z nich boli aktívny peptid 35--46 CP3) a peptid 35-42 C PI). Posledný uvedený oktapeptid IVCHSKTR bol aktívny v dávke menšej ako 1 ug a bol rovnako účinný ako Intaktný rAF. Oproti tomu kratší hexapeptid VCHSKT CP2) nemal žiadny účinok, ak bol podaný v dávke medzi 1 ng a 10 ug.

Peptid X1VCX2X3KX4R zodpovedá s určitými zmenami a/alebo deléciami ľudskému fragmentu PI. Bol vytvorený pomocou priamej mu t a genéz y a bolia testovaná Jeho biologická aktivita. Boli porovnané tiež sekvencle z hovädzej a bravčovej cDNA. Tieto štúdie ukázali nasledujúce zmeny alebo delécie:

XI Je 1 alebo nie Je zastúpený
X2	Je H, R alebo K
X 3	Je S, Ľ. alebo iná	ne u t r á1na aminok yse1in a
X 4	Je T alebo A

Tabulka 1

Kód *Oligonukleotid ^MMPeptid ***^M'Inhibícia choler. sekrécie pniol ED50

N1	63-301	1-80	-h	4
N2	168-301	36-80		6
N3	168-215	36-51.	-4-	3
N 4	122-170	21-36
N5	186-269	42-69	-
P 3	S P s ^xxxx	35-46	J-	7
PI	S . P . s.	35-42	-4-	’o
P2	S.P.s.	36-41

^x Pozícia párov báz v SEO ID č. 1, ktorá bola exprimovaná vo vzorke: vytvorenej s AF cDNA a pGex-1--lambda ^K><' Pozícia aminokyselinových zvyškov C SEQ ID č. 1) v AF na začiatku a na konci syntetizovaného peptidu ^xxx U aktívnych peptidov bola zaznamenávaná inhibícia cholera toxínu, ktorý indukoval sekréciu tekutiny v ligatovanej potkanej črevnej slučke a množstvo Cpmol) inhibujúce polovicu maximálnej sekrécie (ED50) x x χ. x yj _eto peptidy boli produkované syntézou tuhej fázy

Vplyv rAF na zápal v črevnej sliznici bol tiež testovaný na modeli črevnej slučky potkana. 20-tim potkanom bolo podané 0,5 ug toxínu A z Clostridium difficile a sekrétované tekutiny a zápal boli merané po 2,‘5 a 5 hodinách C10 -*-10 potkanov). Polovica týchto potkanov v každej skupine dostala 100 ng i.v. pred podaním cholera toxínu a druhá polovica dostala PBS pufer ako placebo. Po zabití potkanov boli črevné slučky disekované a stredná časť 2-3 cm slučky bola zmrazená na suchom lade. Zmrazené vzorky boli krájané v Leyca kryostate na 8j..im rezy. Rezy boli značkované tak, aby sa zobrazila alkalická fosfatáza pomocou histochemických metód. Alkalické fosfatázy sú exprimované v intestinálnych epiteliálnych bunkách.

Toto značenie zobrazilo integritu črevnej sliznice. Z výsledkov Je zrejmé Cobr. 9), že u kontrolných potkanov došlo k veľmi rozsiahlemu poškodeniu intestinálnej sliznice: po 2,5 hodinách boli intestinálne epitelie oddelené od bazálnej membrány a boli zistené aj oblasti nekrotického tkaniva, ďalej bolo po 5 h o d i n ách zistené rozsiah1e krvácanie.

Oproti tomu u zvierat, ktorým bol podaný rAF nedošlo k žiadnemu oddeleniu epitélie od bazálnej membrány, nekróze alebo krvácaniu. Sekrécia tekutiny indukovaná toxínom A bola inhibovaná z 199±4 na 13715 mg/cm po 2,5 h Cp<0, 01) a z 42113 na 20316 mg/cm po 6 h C 5 potkanov na skupinu, p<0,01).

Rovnaký experiment bol. uskutočnený s 0, 5 ja g peptidu IVCHSTR C--P1) premies Ľ u J ú c rAF proteín. Oktapeptid mal rovnaký vplyv na toxínom A Indukovaný intestinálny zápal a sekréciu tekutiny, ako bolo ukázané na obr. 9.

Toxicita — V zhode s testom toxicity rAF boli i n J i l< o varných 50 j..tg na potkana a neboli zistené žiadne toxické reakcie počas o b d o b 1 a .J e d n é h o t ý ž d ň a .

Príklad 8

Biologická aktivita rAF na intestinálnu permeabilitu

S cieľom zhodnotil:' vplyv rAF na permeabilitu organických látok rozpustených v krvi bol uskutočnený pokus s Blue Evans farbivom, podľa vyššie popísanej inetódy (11). Experiment bol zo začiatku uskutočnený tak, ako Je popísané v príklade 7 a Obr. 5 a to i.v. podaním rAF pred intoxikáciou cholera toxínom. Nebola meraná sekrécia tekutiny a po 90 min. po podaní toxínu bolo i.v. podané farbivo Blue Evans a to 1 ml 1,5% roztoku v PBS. Farbivo cirkulovalo počas 5 min. v organizme. Po tejto dobe boli potkany perfundované via ľavá komora-pravá predsieň (bola použitá períšbaltická pumpa-Cole Parmer Instruments, Chicago, 111., USA) P oni o c o u r o z t o l< u 200 m 1 4 C F’ B S / A1 s e u i e r o v In o r o z t o k u C1 /1 p oni e r ) počas 150 sek. Všetko prebiehalo v éterovej anestézii.

Táto procedúra vymyla všetky EB prítomné vo vaskulárnom systéme a zobrazila len EB viazané v extravaskulárnom priestore, napríklad v intestiná!nej sliznici. To sa dá potom delegovať formamidovou extrakciou. Výsledky v tabuľke 2 ukazujú, že CT intoxikácia signifikantne zvyšuje (p<0, 001.) množstvo EB, ktoré môže byť extrahované z intestinálneho tkaniva v celkovom množstve okolo 43 %, zatiaľ čo i.v. 1 BrT pred CT intoxikáciou zabraňuje tomuto nárastu a množstvo EB extrahované z tkaniva v skupine 1 (kontrola) sa nelíšilo od skupiny 3 ClrAF +· CT) .

Tabuľka 2

Skupina Opakov, imunizácie ng EB/g % zvýšenia EB-konc int. tkanivo x 10~^x

1 PBS+PBS	6	29, 311, 0
2 PBS+CT	6	51, 8*1, 3	43 (p<0, 001)
3 IrAF+CT	6	29, 6*1, 5	0 N S

Výsledky z obr. 10 a 11 ukazujú extravazáciu farbiva Blue Evans v tenkom čreve a ďalej v plexus choroideus z laterálnej komory mozgu po CT intoxikácii čreva s alebo bez predchádzajúcej terapie potkanov pomocou PI C1VCHSKTR).

Experimenty boli uskutočňované týmto spôsobom s Samci potkana Sprague-Dauiley, vážiace 350 g, boli ponechané hladovať 18 hodín pred začiatkom experimentu, ale mali voľne prístupný zdroj vody. Potkany boli rozdelené do skupín po šiestich. Peptid PI, cholera toxín (CT) a PBS boli podávané podľa tabuľky 3.

Tabuľka 3

S; k upína

i.v. inej. ľ¹

A	PI	CT	E B
B	PBS	C T	EB
C	PBS	PBS	E B

PI (i.v.) injekcie 1 boli podané v množstve 2 ml. P tl S, p. o. v objeme Ei ml, i.v. injekcie 2 bola zložená z 1,5 ml 3% Evans blue r oztoku v PBS. Éter bol použitý ako anestetikum počas P o k u s u p r- e vše t k y i n J e k c i e .

i.v. injekcie PI CO, E> ug) alebo PBS boli podané 10-15 sek.

pred p. o. podaním 100 jjg CT alebo PBS. 60 min. pred podaním boli potkany uvedené do anestézie pomocou éteru a i.v. im bolo podané farbivo Evans Blue. Farbivo cirkulovalo ďalších 30 min. Po tejto dobe bolo potkanom podané opäť anestetikum s éterom a boli perfundované intrakardiálne cez l'avú komorou pomocou 250 ml roztoku Alsever-/PBS^SO/SO tak, aby bolo odstránené všetko farbivo prítomné vo vaskulárnom systéme. Po tejto per fúzii, ktorá prebehla počas 2-3 min., bolo možné pomocou fluorescenčnej registrácie delegovať farbivo naviazané mimo vaskulárny systém.

Z mozgu a časti tenkého čreva boli odobrané vzorky a zmrazené na suchom lade, v kryostate nakrájané na Bum tenké rezy a tieto rezy boli vysušené vzduchom, ošetrené v médiu s xylénom a pozorované v Zeisovom fluorescenčnom mikroskope. Pomocou kombinácie filtrov, ktorá Je používaná pre rodamín emitujúcu fluorescenciu.

Výsledky na obr. 10 a 11 demonštrujú, že intenzita fluorescencie C biela farba) Je rovnaká v obidvoch vzorkách tenkom čreve CObr. 11) aj plexus choroideus CObr. 11) v skupine A C PI i.v. + CT p. o.) a C C PBS) i.v. +· PBS p. o.). V porovnaní s vysokou fluorescenčnou Intenzitou v tenkom čreve a v plexus choroideus v skupine B (PBS i.v. +· Ctp.o.), výsledky Jasne demonštrujú, že injekcia oktapeptidu pred podaním CT inhibuje CT indukovanú extravaskulárnu penetráciu Evans Blue. Výsledky ukazujú, že to platí nie len pre vaskulárny systém tenkého čreva, ale aj v plexus choroideus v laterálnej komore: mozgu.

Ma záver: Efekt i.v. podania oktapeptidu TVCTISKTR inhibuje CT indukovanú extravaskulárnu penetráciu farbiva Evans Blue? v tenkom čreve; aj v plexus choroideus v centrálnom nervovom systéme. Tento účinok rAF a Jeho peptidových derivátov nenachádzame len v tenkom čreve, ale ovplyvňuje aj’ permeabilitu ciev v centrálnom nervovom systéme. Tieto nálezy ukazujú, že rAF a Jeho deriváty môžu byť použité aj na terapiu intrakraniálnej hypertenzie, zmeny tlaku v strednom uchu a rôznych foriem zmeny permeability v krvných cievach.

F’ o u ž i t á 1. i. t e r a t ú r a

Young, R.A. a Davis, R.W. (1983) Proc. Mati. Acad. Sci., USA

80, 1194-1198.

2.

S am b r o o k, J ., F r i t s c h, E. F .

ľlaniatls, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual

H a r b o r L a b o r a t o r y P r· e s s, C o 1 d S p r i. n g H a r b o r, N. Y .

Frohman, M.A., Dush

M. K. a Martin, G. R. (1988) Proc.

8998-9002.

4.

Laemli, U.K. C1970)

Náture 227, 680-685.

5.

Largergard

T.

a Lonnroth, T. (1986) iinmunol. scand. (

Chomczynski

P.

Sachi, M.

C 1987)

A n a 1 y t. B i o c h em. 16 2

156-159.

7.

Sambrokk,

J.

Frtísch,

ΓΙ a n i a t i s, T. (1989 ) ľl o 1 e c u 1 a r cloning: a laboratory m a n u a 1, s t r. 7.40-7.42, C o 1 d S p r i n g

Harbor Laboratory Press

C o 1 d Sp r i n g Ha r bor, N. Y .

8.

Jennische ľl a t e .J k a, G. L . C1992 ) A c ta P h y s i o 1.. S c a n d.

9.

Lange, S. (1982) FEMS ľlicrobiol. Lett. 15, 239-242.

10. Torres, J.F., Jannische, E., Lange, S. a Lonnroth, I. (1990) Gut 781-785.

11. Lange, S., Delbro DS, Jannische, E. Evans Blue permeation of intestínal mucosa in the rat. Scand J. Gastroenterol 1994, 29;38-46.

Legenda k obrázkom

Obr. la a ďalej Obr. 1b

Sekvencie nukleových kyselín a zodpovedajúce aminok y seli.no v é s e k v e n c i e n o v é h o ľ. u d s k é h o p r o t e í n u .

Obr. 1c

Horizontálna mapa ukazujúca klónovanú cDNA a oligonukleotidové priméry.

Obr. 2

Coomassie modro zafarbený SDS-polyakrylamid minigél (A) a imunoblotová próba s antisérami oproti časti AF (B). Línia s n e p r im é r o v ým i. č í s 1 am i o b s a h u J e g 1 u t a t i ó n a g _a r ó z a - č i s t e n ú G T S - A F fúziu proteínov AF-1, AF-2 a AF-3, ďalej líniu s primárovými číslami obsahujúca fúziu proteínov r o z č t i e p e n ú t r om b í n oni. V T a v o ú u v e d e n é m o 1 e k u 1 o v é hm o t n o s t i (R) (BDH). GST-AF-l fúzia proteínu Je vysoko degradovaná, dĺžky proteír imunoblot ul< azu J e len detekciu spontánnych produktov je

S-1ransferá zy, ktorý J e nezávisle exprimovaný.

Obr. 3a

Western blot používajúci antisérum oproti rekoinbinantnému P r o t e í n u AF-2. B o 1.1 p o u ž i t é t i e t o zložky: v 1' a v o p o r c í n C P ) a t r i ľudské hypofýzy (Hl, H2, H3) a vpravo tri rekombinantné proteíny

AF-1, AF-2 a AF-3 (Obr. 2). V centrálnej časti štandard molekulárnej hmotnosti (R).

Obr. 3b

ELISA rAF používajúca antisérum a afinitne čistenej protilátky vyrobenej v tele králika.

Obr. 4

Autorádiogram Northern blotu RNA z ľudskej a bravčovej hypofýzy (p=pooled, i=individual materiál). Bolo použitých 5 j.ig čistej mRNA v každej báze, 3’-end -’^P-viazaného oligonukleotidovej próby a tie potom boli autorádiograficky vyvíjané počas 7 dní.

Obr. 5

Kr o y s e k c i a a d e n o h y p o f ý z y z n a č e n e J o p r o t i r e k o m b i n a n t n ém u p r o t e í n u GST-AF-2. A. Rezy inkubované s imúnnym sérom ukazujúce bunky s rôznym stupňom imunoreaktivity C hrubé šípky). Mnohým bunkám chýba značenie (svetlé šípky). B. Rôzne rezy k A inkubované s imúnnym sérom preabsorbovaným prebytkom rekombinantného GST-AF-2. Tu nie Je žiadne špecifické značenie buniek. C a D. Značná imunosenzitivita buniek Je znázornená znázornením cytoplazmy endokrinných buniek, kde n=nucleus a c=cytoplazma.

Obr. 6

Biologická aktivita r AF-1 testujúca inhibiciu CT indukovanej sekrécie tekutiny. Rastúce dávky proteínu boli potkanom podané i. v. 3 j..ig C T boli podané do črevnej slučky, po 5 h bola meraná akumulácia tekutiny Cmg/cm čreva). Každá hladina reprezentuje P r i eme r ± S.A.E. sk upiny šiestich zvierat.

Obr. 7

Biologická aktivita intraluminárne injikovaného rAF-Ι; 0, b j.ig rAF boli podané 20-30 sek. pred alebo 90 min. po intoxikácii 3 ug CT do črevnej slučky potkana.

Obr. EJ

Biologická aktivita intraluininárne injikovaného rAF-1; 3 jjg rAF boli podané 20-30 sek. pred alebo 90 min. po intoxikácii 3 jjg C T do črevnej slučky potkana? rAF bol injikovaný 5 cm proximálne do miesta, kam bol aplikovaný CT.

Obr . EJ

A (x2, 5) Je k on t rol n tí slučka C P EJ S) ukazujúca celulárne zvyšky vnútri lumen (L), značenie na zvyšnej sliznici nie Je zrejmé, čo svedčí o úplnej deštrukcii epitelu. B (0,5 ul PI pred CT podaním) ukazuje Jasne epitélie tvoriace villi, čo svedčí o normálnej neporušenej sliznici. L-lumen čreva. Čiarky 500 um. C (x.1.0) ukazuje deštrukciu epitelu v PBS-o šetrenej kontrolnej skupine: a D znázorňuje sliznicu čreva v skúmanej skupine (podanie PI). Čierna bodka označená šípkou v epiteli, LP=lamina propria, mm=niuscularis mucosae, svetlá šípka na bunkách krýpt. Čiarky = 100 um. E Cx25) znázorňujú deštrukciu mukózy v kontrolnej skupine (ošetrenej PBS) a F ukazuje zodpovedajúce; výsledky zo skupiny potkanov ošetrených PI. pred CT podaním. Čiarky = 100 um.

Obr-. 10

Fluorescencia Evans Blue vo vzorke JeJunálneJ slučky z troch skupín potkanov ošetrených CT alebo kontrolným pufrom (PBS)? prešetrených antisekretorickým peptidom PI alebo kontrolným pufrom (PBS). LP=lamina propria. Čierna šípka znázorňuje: epitelle; svetlá šípka ukazuje bunky krýpt. Čiarky = 100 um.

Obr. 11

Fluorescencia Evans Blue; vo vzorke plexus choroideus od potkanov znázornených na obr. 10. Čiarky = 50 um.

Sek venčia ID. č.: 1.

1yp sekvencie: Nukleotid s príslušným proteínom

Dĺžka sek ve nci e: 1309 párov báz p> 1us poly C A) k oniec Vlákno: Jednoduché

Um i e s t e n i e: 1 i n e á r n e

Typ molekuly: cDNA

Organizmus darcu vzorky: človek

Zdroj experimentálneho tkaniva: hypofýza

Výsledky: od 63 do 1208 bp vlastný proteín od 1289-1295 bp polyC A) signálna sekvenčia

AATTCGACCAGTTCTTGTTaGGCCGTCCCCGACaCCCGGTCCGGAGGGAG

GAACCTGGCAAG ATG CTG TK CAA AGC ACT ATG GTG TGT CTG GAC AAC AGT 101 Met Yol Leu Clu Scr Thr Met Vol Cys Val Asp Asn Ser>

5

10

GAC

TAT

ATG

CGG

AAT

GGA

GAC

TTC

TTA

CCC

ACC

AGG

CTG

CAG

GCC

CAG

149

Glu

Tyr

Het

Arg

Asn

ciy

Asp

Phc

Leu

Pro

Thr

Arg

Leu

Gin

Ala

Cla*

15

20

•

25

CAC

GAT

GCT

CTC

AAC

ATA

GTT

TGT

CAT

TCA

AAG

ACC

CGC

AGC

AAC

CCT

197

Gin

Asp

Alo

Val

Asn

íle

.Yol

Cys

His

Scr

Lys

Thr

Arg

Scr

Asn

Pro

30

35

40

45

GAC

AAC

GTG

CGC

CTľ

ATC

ACA

CTG

GCT

AAT

GAC

TCT

GAA

GTG

CTG

245

Glu

Asn

Val-

Gly

Leu

íle

Thr

Leu

Ala

Asn

Asp

Cys

Glu

Yal

Lcu>

50

55

60

•

ACC

ACA

CTC

ACC

CCA

GAC

ACT

CCC

CCT

ATC

CTG

TCC

AAG

CTA

CAT

ACT

293

Thr

Leu

Thr

Pro

Asp

Thr

Gly

Arg

íle

Leu

5cr

Lys

Leu

His

Thr>

65

70

75

CTC

CAA

CCC

AAG

CCC

AAG

ATC

ACC

TTC

TGC

ACG

CGC

ATC

CGC

GTG

CCC

341

Yal

Gin

Pro

Lys

Cly

lys

íle

Thr

Phc

Cys

Thr

Gly

íle

Arg

Yal

Alo>

80

85

90

CAT

CTC

CCT

CTG

AAG

CAC

CGA

CAA

GGC

AAG

AAT

CAC

AAG

ATG

CGC

ATC

3B9

His

Leu

Ala

Leu

Lys

His

Arg

Gin

Gly

lys

•Asn

His

Lys

Het

Arg

Ilo

95

100

105

ATT

GCC

TTT

CTG

CGA

AGC

CCA

CTG

GAG

CAC

ΑΛΤ

CAC

AAG

GAT

CTG

CTC

437

íle

Ale

Phc

Vcl

Cly

Scr

Pro

Yal

Clu

Asp

Asn

Clv

Lys

Asp

Leu

Val>

11®

115

120

125

AAA CTG CC AAA CGC CTC AAG AW GAG AAA CTA AAT GTT GAC ATT ATC 485 Lys Cca Ale Lys Arg Leu Lys Lys Clu Lys Yol Asn Val Asp íle íle*

130 13S14®

AAT TTT CGG GAA GAG GAG CTG AAC ACA CAA AAC CTC ACA GCC TTT GTA533

Asn Phc Gly Clu Clu Clu Yol Asn Thr Clu Lys Leu Thr Ale Phc Val>

145 150155

AAC ACG TTG AAT CGC AAA CAT GGA ACC GGT TCT CAT CTC CTC ACA CTG581

Asn Thr Leu Asn Gly Lys Asp Gly Thr Cly Scr His Leu Yol Thr Val>

160 165170

CCT

CGG

CCC

ACT

TTC

CCT

GAT

CCT

CTC ATC

ACT

TCT

CCG

ATT

TTG

629

Pro

cly

Pro

Scr

Lev

Alo

Asp

Alo

Leu íle

Scr

Pro

íle

Leus

17S

180

185

CCT

CAA

CGT

CCT

GCC

ATC

CTG

CGT

CH CCT

CCC

ACT

GAC

TTT

CAA

67?

Ale

Cly

Clu

Cly

Alo

Het

Leu

ciy

Leu Cly

Alo

Scr

Asp

Phe

Clu>

199

195

200

205

TTT

CCA

GTA

GAT

CCC

ACT

CCT

CAT

CCT

GAC CTC

CCC

ne

CCC

en

CGT

725

Phe

Cly

Val

Asp

Pro

Ser

Ale

Asp

Pre

Glu Leu

Ala

leif

Alq

Leu

Arg>

210

215

220

CTA

TCT

ATC

GAA

‘CAG

CAG

CGG

•i CAC

GCA

CCA GGA

GCA

CCG

CCA

773

Yal

Scr

Het

Glu

Gin

Arg

His

Alo

Gly Cly

Cly

Ala

Arg

Alo

225

230

235

CCT

CCA

en

TCT

CCT

cct

GAG

GCC

CCC

ATT CCT

ACG

ACT

GGC

ACT

CAA

821

Ala

Arg

Ala

5cr

Ala

Glu

Ala

Gly

íle Alo

Thr

Gly

Thr

Glo

240

245

250

GAC

TCA

CAC

GAT

GCC

CTG

AAG

ATC

ACC ATC

AGC

CAG

CAA

CAG

TTT

869

Asp

Scr

Asp

-Ala

Leu

Lys

Het

Thr íle

Ser

Gin

Glu

Phe>

255

260

26S

CCC

ACT

GGC

CTT

CCT

GAC

CTA

AGC

ACT ATC

ACT

GAG

CAA

CAG

CAC

917

Cly

Arg

Thr

Cly

Leu

Pro

Asp

Leu

Scr

Scr Het

Thr

Glu

Clu

Glu

Cln>

270

275

280

285

ATT GCT ΤΑΤ GCC ATG CAG ATC TCC CTC CAG GCA CCA GAC TTT GGC GAG955 íle Ala Tyr Ala Het Gin Het Ser Leu Gin Cly Ala Clu Phe ClyGln>

299 295 :3W

CCG	GAA	TCA	GCA	CAC	ATT GAT	GCC AGC TCA GCT ATG	GAC ACA TCT GAG	1913
Alo	Clu	Scr	Ala	Asp	íle Asp	Ala Ser Scr Ala Het	Asp Thr Scr Glu>
		305			3ie	315
CCA	CCC	AAG	GAC	GAG	CAT CAT	TAC CAC CTC ATC CAC	GAC CCC CAG CTC	1061
Pro	Ala	Lys	Glu	Glu	Asp Asp	Tyr Asp Yal Het Cln	Asp Pro Glu Pho
		320				325	339
CTT	CAG	AGT	GTC	CTA	CAG AAC	CTC CCA GGT GTC CAT	CCC AAC AAT GAA	1109
Leu	Gin	Ser	Yal	Leu	Glu Asn	Leu Pro Cly Yal Asp	Pro Asn Asn Glu>
	335				340	345
CCC	ATT	CGA	AAT	CCT	ATG GGC	TCC CTC CCT CCC ACG	CCA CCA ACC ACC	1157
Ale	íle	Arg	Asn	Ala	Het Gly	Scr Leu Pro Pro Arg	Pro Pro Arg Thr>
350				355	360	365

CCA ACA ACG ACA AGA ACC ACC AAC AGA ACA ACT CAG ACT GGA GGG ΛΑΑ 1ΖΘ5 Ale Arg Arg Thr Arg Arg Arg Lys Thr Arg Scr Clu Thr Cly Cly Lys>

Claims

PATENT (ľ) V É NÁROKY

1. Rekombinantný proteín, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEQ ID č. 1, alebo Jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť.
2. Fragment rekombinantného proteínu, v zobrazení v SEQ ID č.1 ktorý Je vybraný zo skupiny obsahujúcej:

a) aminokys elíny č. 35 až 42 b) aminokys e11ny č. 35 až 46 c) aminokys elíny č. 36 až 51 d) aminokys elíny č. 36 až 80 e) aminokys elíny č. 1 až 80

aminokyselinovej sekvencie, v zobrazení v SEQ TľJ č
3. Peptid X i VCX-.X.^KX^.R zodpovedajúci fragmentu, ktorý obsahuje aminokyseliny č. 35 až 42 rekombinantného proteínu, v zobrazení v v.SEQ T.D č. 1, kde X_:1 Je I alebo nie Je zastúpené, X_a Je atóm vodíka, R alebo K, X-, Je S, L alebo ďalšia neutrálna aminokyselina a X^. Je T alebo A.
4. Protilátky charakteristické pre proteíny, ktoré obsahujú v podstate aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEQ TD č.1, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú aktivitu.
5. Proteíny naviazané na protilátky charakteristické pre proteíny, ktoré obsahujú v podstate aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEQ TD č.l, alebo ich homológy, alebo fragmenty, k t o r é m a J ú r o v n a k ú a k t i v i t u.
6.

Kompožicia na úpravu t r a n s p o r t u p a t o 1 o g 1 c k ý c h t e k u t í n a/alebo zápalových reakcií u zvierat, do toho zahrnujúc aj človeka, ktorá obsahuje účinné množstvo rekombinantného proteínu, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, u zobrazení v SEO ID č.l, alebo Jeho homológu, alebo fragmentu, ktoré majú rovnakú aktivitu.
7. Kômp o z í c i a p o d 1 a n á r o l< u 6, kde fragment Je vybraný zo skupiny obsahujúcej

a) aminokyseliny č. 35 až 42 b) a m i n o kyseliny č. 35 až 46 C) a m i n o k y s e 1 i n y č. 36 až 51 d) aminokyseliny č. 36 až 80 e) am i n o k y s e 1 i n y č. 1 až 80

sekvencie, v zobrazení v SEO 1D č.l.
8. Použitie rekombinantného proteínu, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEO ID č.l, alebo Jeho homológov, alebo fragmentov, ktoré majú rovnakú účinnosť, pre prípravu kompozície na úpravu transportu patologických tekutín a/alebo zápalových reakcií u zvierat, do toho zahrnujúc aj človeka.
9. Krmivo na úpravu patologického transportu tekutín a/alebo zápalových reakcií u stavovcov, obsahujúce ako účinnú látku rekombinantný proteín, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEO ID č.l, alebo Jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť, alebo organizmus, ktorý Je schopný produkovať uvedený rekombinantný proteín, homológy alebo fragmenty.
10. Proces úpravy patologického transportu tekutín a/alebo zápalových reakcií u cicavcov, zahrnujúci podanie cicavcovi účinného množstva rekombinantného proteínu, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEO ID č. 1, alebo Jeho homológov, alebo fragmentov, ktoré majú rovnakú účinnosť, alebo organizmus produkujúci tento proteín alebo h oni o 1 ó g y a 1 e b o f r a gni e n b y .
11. Spôsob podľa nároku 10, kde fragment je vybraný zo skupiny zahrnujúcej:

a) aminokyseliny Č:. 3 b až 42 b) aminokyseliny Č . 35 až 4 fc c) aminok yseliny č. 36 až 5.1. d) am 1 n o k y s e 1 i n y č . 36 až 80 e) am i n o l< y s e 1 i n y č. 1 až 80

a m i n o k y s e1inoveJ sekvencie.

v zobrazení v SEO ID č.1
12. Použitie protilátok charakterlstických pre rekombinantný proteín, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení, v SEO 10 č.l, alebo Jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť, na detekciu uvedeného proteínu, alebo Jeho homológov, alebo fragmentov, v organizme.
13. Nukleové kyseliny kódujúce rekombinarrtné proteíny obsahujúce sekvencie, v zobrazení v SEO TD č. 1, alebo ich homológy a fragmenty.
14. Nukleové kyseliny podľa nároku 13, kde kódované fragmenty sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej:

a) aminokyseliny č. 35 až 42 b) aminokyseliny č. 35 až 46 c) a m i n o k y s e 1 i n y č. 36 až 51 d) a m i n o k y s e 11. n y č. 36 až 80 e) a m 1 n o k y s e 1 i n y č . 1. až 80

sekvencie, v zobrazení v SEO ID č.l.
15. Použitie n u k 1 e o v ý c h k y s e 1 í n, k ó d u J ú c i c h r e l< om b 1 n a n t n ý proteín, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení v SEQ ID č.l, alebo ...jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť, pre prípravu príslušných protei.nov alebo homológov alebo fragmentov.
16. Použitie sond, alebo iniciátorov odvodených od nukleových kyselín kódujúcich rekombinantný proteín, ktorý v podstate obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, v zobrazení. v SEQ ID č.l, alebo .jeho homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť, na detekciu prítomnosti nukleových kyselín v organizme.
17. Vektor obsahujúci nukleové kyseliny kódujúce proteíny, ktoré v podstate obsahujú aminokyselínové sekvencle, v zobrazení v SEQ ID č.l, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť.
18. Hostiteľ, okrem ľudského, ktorý obsahuje vektor zahrnujúci nukleové kyseliny kódujúce rekombinantné proteíny, ktoré v podstate obsahujú aminokysellnové sekvencle, v zobrazení v SEQ ID č.l, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť.
19. Bakteriálny kmeň organizmu.

okrem ľ u d s k é h o, s c h o p n ý

P r o d u k o v a ť r e k om b i n a n t n é proteíny.

ktoré v podstate obsahuje ŕ· a m i r i o k y s e· 1 i n o v é s e k v e n c i e, v zobrazení v SEQ ID č.l, alebo ich homológy, alebo fragmenty, ktoré majú rovnakú účinnosť.