NO320560B1

NO320560B1 - Antisekretoriske faktorpeptider som regulerer patologiske permeabilitetsforandringer, samt formateriale som omfatter disse.

Info

Publication number: NO320560B1
Application number: NO19980743A
Authority: NO
Inventors: Ivar Lonnroth; Stefan Lange; Eva Johansson; Eva Jennische; Christina Lonnroth
Original assignee: Rural Patent Svenska Ab
Priority date: 1995-08-24
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2005-12-19
Also published as: BG63209B1; CZ295444B6; SE9502936D0; SK23698A3; AU6893296A; ATE270305T1; CN1208420A; CZ52098A3; DK0851876T3; EP0851876B1; JP4040679B2; HUP9900137A3; WO1997008202A1; DE851876T1; KR100552947B1; JPH11511972A; AU702589B2; PL188530B1; NZ337380A; SI0851876T1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et rekombinant protein og fragmenter derav; samt peptider, antistoffer, nukleinsyrer og vektorer derav; anvendelser derav; en vert eller stamme av en organisme dertil med unntak av menneske; samt en sammensetning for å normalisere patologisk fluidtransport og/eller inflammatorisk reaksjon i dyr inkludert menneske.

Således omfatter oppfinnelsen nye antisekretoriske faktorer som har regulatoriske egenskaper for fluid-transport og/eller inflammatoriske reaksjoner, og likeledes polynukleisk-regulerende egenskaper, samt polynukleinsyrer som koder for disse, og anvendelse derav.

Alle celler og vev i kroppen er kritisk avhengig av et konstant og normalt fluidmiljø, i kombinasjon med en adekvat tilførsel av blod. Forstyrrelse av ett, eller begge disse støttesystemer kan hurtig bli skjebnesvanger. Ved-rørende fluid-ubalanse, eksisterer to prinsipielt forskjellige systemer: A. ødem, som er karakterisert ved anormal akkumulering av fluid i det intracellulære vevsrom eller kroppshulrom, eller

B. dehydrering, som, strengt tatt, betyr tap av kun vann, men som faktisk ofte anvendes for å beskrive kombi-nert tap av vann og ioner.

De mest vanlige former for enten ødem eller dehydrering er: diaré, inflammatorisk tarmlidelse, hjerneødem, astma, rhinitis, konjunktivitt, leddgikt, glaukom, forskjellige former for patologiske intrakraniske trykk (øket eller ned-satt), trykkforandringer i mellomøret såsom Morbus Méniére, dermatitt, kjemiske eller fysiske forandringer av huden og kjertler som tilgrenser til huden såsom mastitis, forskjellige former for endokrine lidelser, såsom diabetes insipidus. Conn's syndrom, Cushing's syndrom og Morbus Addison, nyrelidelser såsom pyelonephritis og glomerulo-nephritis, metabolske lidelser såsom myxedema og akutt tilbakevirkende porfyri, bieffekter under behandling med forskjellige medikamenter såsom antidiabetiske midler, trisykliske antidepressiva, cytostatika, barbiturater, narkotika og narkotiske analoger.

Diaré er forårsaket av en forandring i permeabiliteten i tarmen for elektrolytter og vann. Denne forandring forårsakes ofte av bakterielle enterotoksiner såsom de som produseres av Escerichia coli, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae og Clostridium difficile. Forandringen kan også forårsakes av intestinal betennelse. Idet opptaket av vann er koblet til opptaket av elektrolytter og næringsstoff, vil dyr som lider av hyppig forekommende diaré lide av feilernæring, noe som resulterer i en retardasjon av den daglige vektøkning for det voksende dyr. Kroppen motvirker disse reaksjoner ved neuro-hormonale mekanismer såsom frigjøring av somatostatin og opiate peptider fra interneuroner i intestinal mukosa. Disse poly-peptider er i stand til å reversere fluid-sekresjon og diaré.

Den nylig beskrevne antisekretoriske faktor (AF) har blitt delvis renset fra hypofysekjertler fra gris, og det er blitt vist at den reverserer patologisk sekresjon som er indusert av forskjellige enterotoksiner. Høye nivåer av AF i purkemelk beskytter de diende grisene mot neonatal diaré.

Antimikrobiale medikamenter har blitt anvendt i stor grad i behandlingen av diaré for mennesker, samt innen veterinærmedisin. De anvendes også som et fortilsetnings-stoff for griser, kalver og kyllinger. Imidlertid, på grunn av den hurtige utvikling av resistente bakterier i tarmen, er anvendelse av antibiotika mot enteritis generelt ikke akseptert innen human medisin, og deres anvendelse blir også redusert innen veterinærmedisin.

Andre antidiaré-medikamenter motvirker sekresjonen i intestinal mukosa. Idet disse medikamenter er rettet mot vertsdyret, er det usannsynlig at resistens mot medika-mentet vil utvikles. Disse medikamenter inkluderer nerve-aktive medikamenter såsom fenotiaziner og tioksantener. På grunn av noen alvorlige bieffekter har disse typer medikamenter ikke i de fleste land ikke blitt akseptert for behandling av diaré. Andre medikamenter er derivater av opiater såsom kodein og loperamid. Idet disse medikamenter i hovedsak virker ved å inhibere intestinal mobilitet, vil de også inhibere fjerning av patogene bakterier fra tarmen, og må derfor definitivt ikke anbefales mot dysenteriske bakterier eller parasitter. Nylig har derivater av somatostatin blitt introdusert, men disse har så langt vist seg å ha begrenset anvendelse på grunn av problemer ved admini-streringen av medikamentene, og mulige interaksjoner med den endokrine vekstregulering.

Den antisekretoriske faktor (AF) har så langt ikke blitt anvendt direkte for behandling av diaré eller feilernæring på grunn av problemer som er forbundet med å oppnå en ren fremstilling av dette protein. Imidlertid har det blitt mulig å indusere lignende proteiner i husdyr som har fått et spesifikt for (se patent nr. 9000028-2). Griser som ble gitt dette for oppnådde høye nivåer av AF-lignende proteiner og hadde en signifikant økning i den daglige vekstrate sammenlignet med tilhørende kontroller. AF i rotter som var utsatt for toksin A fra C. difficile beskytter ikke bare mot intestinal sekresjon, men også mot betennelse og blødning i tarmen.

Et hovedformål ifølge foreliggende oppfinnelse er å frembringe et nytt rekombinant protein, og homologer og fragmenter (peptider) derav for anvendelse til normalisering av patologisk fluid-transport. Disse proteiner og peptider benevnes samlet som antisekretoriske faktorer (AF). Anvendelse av AF inhiberer også delvis, eller elimi-nerer totalt utviklingen av inflammatoriske reaksjoner for forskjellige etiologier. Rekonstituering tilbake til normalen (fluid-transport eller inflammasjon) oppnås ved anvendelse av proteiner eller peptider. Ytterligere, AF-proteinene eller -peptidene blir effektivt absorbert via forskjellige mukøse membraner uten tap av potensiale (sammenlignet med intravenøs administrering). Som en konse-kvens eksisterer det derfor et mangfold av behandlings-regimer, og et korrekt administrert protein eller peptid gjør det mulig hurtig å rekonstituere en forstyrret væske-balanse (vann og ioner), en inflammatorisk reaksjon, eller begge deler.

Det rekombinante AF (rAF) og homologer og fragmenter derav kan dermed anvendes for immunodeteksjon, som et for-tilsetningsstoff for voksende dyr og som et middel mot diaré, og mot lidelser som involverer ødem, dehydrering og/eller betennelse.

Den foreliggende oppfinnelse er således kjennetegnet ved: Et rekombinant protein som har en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter derav.

Et fragment av det rekombinante protein som angitt i SEQ ID No. 1, hvori fragmentet er valgt fra gruppen omfattende

a) aminosyrer nr. 35-42,

b) aminosyrer nr. 35-46,

c) aminosyrer nr. 36-51,

d) aminosyrer nr. 36-80,

e) aminosyrer nr. 1-80,

av aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1.

Et peptid X1VCX2X3KX4R som korresponderer til fragmentet som omfatter aminosyrer nr. 35-42 av det rekombinante protein som vist i SEQ ID No. 1, hvori X er I eller ingen, X2 er H, R eller K, X3 er S, L eller en annen nøytral aminosyre og X4 er T eller A.

Antistoff som er rettet mot et rekombinant protein som har aminosyresekvensen vist i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som vist ovenfor i a-e.

Et protein som binder til antistoff som er spesifikke til et rekombinant protein som har aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor.

Et materiale for normalisering av patologisk fluid-transport og/eller inflammatoriske reaksjoner omfattende som en aktiv hovedkomponent en effektiv mengde av det rekombinante protein som har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor.

Anvendelse av et rekombinant protein, som har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor, for fremstilling av et materiale for normalisering av patologisk fluid-transport og/eller inflammatoriske reaksjoner.

For for normalisering av patologisk fluid-transport og/eller inflammatoriske reaksjoner i vertebrater, omfattende som et aktivt middel et rekombinant protein som har aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor, eller en organisme som er i stand til å produsere et slikt protein eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor.

Fremgangsmåte for å normalisere patologisk fluid-transport og/eller inflammatoriske reaksjoner i vertebrater, omfattende administrering til vertebratet en effektiv mengde av et rekombinant protein som har aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor, eller i en organisme som produserer nevnte protein eller homologer eller fragmenter.

Anvendelse av spesifikke antistoff mot et rekombinant protein som har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor, for å detektere nevnte protein eller fragmenter i organismer.

Nukleinsyrer som koder for et rekombinant protein som har sekvensen som vist i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor.

Anvendelse av nukleinsyrer som koder for et rekombinant protein som har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor, for å produsere korresponderende proteiner eller homologer eller fragmenter.

Anvendelse av prober eller primere som er avledet fra nukleinsyrer som koder for et rekombinant protein som har sekvensen som vist i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor, for å detektere nærvær av nukleinsyrer i organismer.

Vektorer som omfatter nukleinsyrer som koder for et rekombinant protein som har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor.

Vert, med unntak av menneske, omfattende en vektor som omfatter nukleinsyrer som koder for et rekombinant protein som har aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor.

En stamme av en organisme, med unntak av menneske, som er i stand til å produsere et protein som har aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter som angitt ovenfor.

Som organismer som er i stand til å produsere det rekombinante protein kan det anvendes forskjellige typer organismer, såsom rekombinante bakterier og eukaryote organismer, såsom gjær, planter og vertebrater, med unntak av mennesker.

På tross av 10 års forsøk på å rense AF ved konven-sjonelle biokjemiske teknikker, har det nå blitt mulig å oppnå AF i en homogen form. Imidlertid ble dette oppnådd ved en ny fremgangsmåte for fremstilling av halvrent AF. For immunisering og utvelgelse av antiserum ved immunohistokjemiske metoder ble et egnet antiserum valgt. Med dette antiserum har det nå blitt mulig å klone rekombinant humant cDNA som uttrykker AF i E. coli.

Sekvensen av den nye cDNA ble bestemt, og viste seg å være unik. Med kjennskap til denne sekvens ble det produsert oligonukleotid-prober som hybridiserer med RNA fra hypofyse fra menneske og gris. Størrelsen på dette RNA, ca. 1.400 basepar, stemmer med størrelsen på det sekvenserte cDNA omfattende 1.309 basepar pluss en poly-(A)-hale. En partiell cDNA-sekvens fra hypofysekjertler fra rotte har blitt vist å være identisk med den humane cDNA, noe som viser en allestedsnærværende struktur som er konservert i AF-gener fra forskjellige spesis. Denne likhet gjør det mulig å anvende de samme oligonukleotid-prober for å identifisere AF-kodende RNA og DNA fra forskjellige spesis.

Det er videre blitt mulig å uttrykke rAF i en biologisk aktiv form. AF-proteinet i form av et fusjonsprotein med glutation S-transferase ble uttrykt i store mengder i E. coli, og renset til homogenisitet ved affinitetskromatografi. Etter spalting av fusjonsproteinet med trombin, ble det rekombinante AF (rAF) vist å være ekstremt potent, 44 ng (10~<12> mol) gir en halv-maksimal inhibering av kolera-toksinindusert fluidsekresjon i rottetarm.

Med genteknikker ble mindre fragmenter av rAF produsert. Aktiviteten ble vist å ligge i en mindre sekvens som består av 7-8 aminosyrer. Dette ble bekreftet ved hjelp av kjemisk fast-fase-synteser, ved hvilken teknikk et oktapeptid ble produsert, og der det viste seg at dette var omtrent like biologisk potent på molar basis som rAF. Ved seterettet-syntese ble en rekke forskjellige sekvenser innen det aktive sete konstruert, og utbytting av visse aminosyrer var mulig uten at den biologiske aktivitet ble opphevet.

Fluid-sekresjonen ble målt ved en intestinal sløyfe-modell; en seksjon (sløyfe) av en tynntarm ligeres ved hjelp av to satures, og det injiseres i sløyfen en bestemt mengde av et enterotoksin. Ved testing av antisekretoriske medikamenter injiseres disse mellom en time foran og to timer etter toksin-utfordringen. Injiseringen ble utført ved tre forskjellige ruter; intravenøst, intraintestinalt og intraanasalt. Fluidet akkumulerer i sløyfen 5 timer etter toksin-utfordringen. Sekresjonen kalkuleres fra vekten av det akkumulerte fluid per cm tarm.

Sekvensen av proteinet ble bestemt både direkte ved aminosyresekvensering og indirekte ved deduksjon fra cDNA-sekvensen.

Rekombinant AF synes å utøve svært lite toksiske eller systemiske effekter idet ingen tydelig toksisk reaksjon ble påvist i rotter som var gitt 100 gangers høyere doser enn det som forårsaket halv-maksimal inhibering. Idet det er effektivt ved injisering i tynntarmen kan det administreres peroralt.

Det rekombinante AF inhiberer også sekresjon ved injisering etter toksin-utfordring i motsetning til preparater av naturlig AF testet som så ut til å være effektiv kun ved injisering før toksinet. rAF kan dermed anvendes både profylaktisk og terapeutisk.

Det ble videre vist at rAF og dets peptidfragmenter inhiberte cytotoksiske reaksjoner og betennelse i tarmen forårsaket av toksin A fra Clostridium difficile. Ved en farge-permeabilitetstest ble rAF og dets fragmenter vist å reversere patologiske permeabilitetsforandringer som var indusert av koleratoksin ikke bare i intestinal mukusa men også i plexus choroidea som regulerer fluid-trykket i hjernen.

Antisera mot rAF ble produsert i kaniner, og anvendt i et enzymkoblet immunoassay (ELISA). Dette forsøket kan anvendes for å måle AF i kroppsfluider eller for.

En fremgangsmåte for å rense antistoff mot AF (natur-lige eller rekombinante) ved affinitetskromatografi på kolonner med agarose som er koblet til rAF beskrives neden-for.

Antistoffene ble også vist å være effektive for deteksjon av AF i vevssekresjoner ved immunohistokjemiske teknikker, og for deteksjon av AF i Western-blot.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ytterligere ved en rekke ikke-begrensende eksempler, samt av de medfølgende figurer.

Eksempel 1. Fremstilling av antistoff mot AF for kloning av cDNA

Antisekretorisk faktor ble fremstilt fra blod fra gris ved affinitetskromatografi på agarose, og isoelektrisk fokusering. Til 1 liter griseblod (inneholdende antikoagu-lasjonsmidler) ble 1 g natriumtiosulfat og 1 mg fenylmetyl-sulfonylfluorid tilsatt. Blodcellene ble separert ved sentrifugering, og det klare plasma ble eluert gjennom en kolonne med Sepharose 6B (Pharmacia LKB Biotechnology Stockholm), idet gelvolumet korresponderer til ca. 10% av volumet av løsningen. Etter vasking med tre "bed"-volumer fosfatbufret saltløsning (PBS = 0,15 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat, pH 7,2), ble kolonnen eluert med to "bed"-volumer av 1 M a-metyl-D-glukosid oppløst i PBS. Eluatet ble konsentrert og dialysert mot vann på en ultrafilter av typen "Omega 10k flow through" (Filtron Technology Corp.). Fraksjonen ble deretter fraksjonert ved isoelektrisk fokusering i en ampholine-gradient (Pharmacia) pH 4-6 på en 400 ml isoelektrofokuserende kolonne (LKB, Sverige). En fraksjon som har et isoelektrisk punkt mellom 4,7 og 4,9 ble oppsamlet og dialysert mot PBS. Delvis renset AF ble delt i mindre alikvoter, og anvendt for produksjon av antiserum i kanin i samsvar med tidligere beskrevet fremgangsmåte.

Kaninene ble immunisert og sera ble testet for deres kapasitet til å farge intracellulært materiale i seksjoner av hypofysekjertler fra menneske (fremgangsmåte beskrevet i eksempel 6). Kun ett av seraene viste spesifikk og distinkt intracellulær farging uten farging av ekstracellulære matriksproteiner. Dette antiserum ble valgt for screening av et cDNA/lambda-fag GTll bibliotek fra hypofysekjertler fra menneske som uttrykker proteiner i E. coli.

Eksempel 2. Screening av cDNA bibliotek fra humane hypofysekjertler og hjerne

Et 5'-område cDNA bibliotek fra normale humane hypofysekjertler, avledet fra vev oppnådd fra en gruppe av ni kaukasianere, ble innkjøpt fra Clontech Laboratories. For screening av biblioteket, ble fag utsådd, med 3 x 10^ plakk-formende enheter per 150 mm skål, på E. coli Y1090. Kanin-antiserum som er beskrevet ovenfor mot porcint AF ble absorbert med 0,5 volumer av E. coli Y1090-lysat i 4 timer ved 23°C og fortynnet til et forhold på 1:400, og screening ble utført i samsvar med metoden til Young and Davis (1).

Alkalisk-fosfatase-konjugert anti-kanin antistoff fra geit ble anvendt som et andre antistoff (Jackson). Positive plakk ble utvalgt, eluert inn i et fag-suspensjonsmedium (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgS04, 2% gelatin) og utsådd på nytt, og screenet inntil alle plakk som ble testet var positive.

cDNA-rekloning - Fag-DNA fra AF-rekombinanter ble isolert ved Wizard Lambda Preps (Promega), og oppkuttet med EcoRl. Innskuddene ble renset med Sephaglas BandPrep Kits (Pharmacia), reklonet inn i pGex-lÅ,T-vektor (Pharmacia) som beskrevet av produsent, og transfektert inn i Epicurian Coli CLl-Blue, topp 1-celler eller BL21-celler (alle fra Stratagen). rAF eller r-peptider ble fremstilt i BL21-celler dersom ikke annet er angitt (2).

Mangfoldiggjøring av cDNA ved PCR - For å oppnå den manglende 5'-ende av cDNAen ble en PCR-basert fremgangsmåte, benevnt RACE (rapid amplification of cDNA ends) ut-ført. En modifisert RACE-metode som danner 5'-RACE-Ready cDNA med et forankringsoligonukleotid ligert til 3'-enden av de humane cDNA-molekyler fra hjerne ble innkjøpt fra Clontech Laboratories. 5'-enden ble mangfoldiggjort fra et parti av 5'-RACE-Ready cDNA i to PCR-mangfoldiggjørings-trinn ved å anvende en 5'-primer som er komplimentær til forankringen og to "nested" genspesifikke 3'-PCR-primere A og B (A=base 429-411, og B=base 376-359, fig. la). Forskjellige mindre partier av RACE-fragmentet ble videre mangfoldiggjort for å uttrykke de korresponderende peptider, og for å teste deres biologiske egenskaper. Posisjonen av basen, og aminosyren ved start og stopp av disse oligonukleotidfragmenter, samt deres korresponderende peptider er vist i tabell 1. Porcint og bovint cDNA (Clontech Laboratories) ble anvendt som templat for mang-foldiggj øringsf ragmenter korresponderende til N3 i tabell 1. Variasjon i sekvensen ble også innsatt kunstig ved sete-dirigert mutagenese ved hvilken metode forskjellige oligonukleotider som korresponderer til posisjoner 168-193 ble syntesert for å erstatte én for én av aminosyrene 35-42 (posisjoner som vist i SEQ ID No. 1). Det mangfoldiggjorte DNA-fragment ble klonet inn i pGex-lA,T-vektor ved å anvende EcoRl-setet bygget inn i ankeret og den gen-spesifikke primer. For å verifisere sekvensen som ble oppnådd ved RACE-metoden, ble dobbelttrådet cDNA fra human hypofysekjertel og hjerne (Clontech) mangfoldiggjort med primerpar C/D inneholdende et ekstra EcoRl-oppkuttingspunkt (fig. lb). Primerne ble konstruert for å muliggjøre mangfoldig-gjøring av den fullstendige åpne leseramme (ORF). PCR-produktene fra hypofyse og hjerne av forventet størrelse ble oppkuttet med EcoRl, isolert og klonet inn i plasmid pGex-lA,T-vektor.

DNA-sekvensering og oligonukleotider - DNA fra plasmid pGex-lÅ/r ble anvendt som et templat for sekvensering av

innskuddene ved dideoksy-kjedetermineringsmetode (15) ved å anvende Sequenase versjon 2.0 kit (U.S. Biochemical Corp.). Initiale fremover- og tilbake-primere som kopierte regioner av pGex-lÅ.T umiddelbart oppstrøms og nedstrøms for det inn-satte DNA var tilgjengelig fra Pharmacia. Påfølgende

primere ble syntesert (Scandinavian Gene Synthesis AB) på basis av den sekvensinformasjon som ble oppnådd. Tre forskjellige PCR-kloner ble sekvensert for å unngå base-utbytting ved Taq-polymerase i 5'-RACE-metoden.

Nukleotidsekvensen og de deduserte proteinsekvensdata ble sammenlignet og analysert ved å anvende MacVector 4.1 (Eastman Chemical Co.). For å predikere den korresponderende aminosyresekvens av cDNA-innskuddet, ble kodon-behandling av forskjellige leserammer sammenlignet, og dette ga én stor åpen leseramme. Undersøkelse av DNA- og proteinsekvensdata ble utført ved anvendelse av en Entrez CD-ROM-plate (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA).

Molekylær kloning og sekvensanalyse av cDNA - Poly-valent antisera mot AF-protein fra gris ble anvendt for screening av cDNA fra humane hypofysekjertler. To kloner som uttrykker immunoreaktivt AF ble isolert, opptatt fra fag-lambda og reklonet inn i EcoRl-setet av vektor pGex-lA,T-, som beskrevet i kittet fra Pharmacia. Restrik-sjonsanalyser ga innskuddsstørrelser på 1.100 og 900 bp, respektivt. DNA-sekvensering av de to kloner ga en fullstendig homologi med unntak av en substitusjon (fig. 1, C erstatter T ved posisjon 1011). En sekvens oppstrøms for 5'-enden av klon 2 ble oppnådd ved RACE-metoden. Fragmentet hadde en total lengde på 376 bp (ikke inkludert den syn-tetiske nukleotid-arm ved 5'-enden). Det totale rekonstru-erte cDNA inneholdt 1.309 basebar etterfulgt av en poly-A-hale, og foran dette et poly-A-signal (fig. 1, posisjoner 1289-1295). En åpen leseramme (ORF) på 1.146 bp (posisjoner 63-1208) ble identifisert.

Eksempel 3. Uttrykking av mammalsk AF- protein fra rekombinante plasmider

Konstruksjon og rensing av fusjonsproteiner - cDNA-klonene som ble oppnådd ved immunologisk screening, og ved PCR-mangfoldiggjøring av den fullstendige cDNA, ble ligert til pGex-lÅ,T. Denne vektor muliggjør uttrykking av fremmede proteiner i E. coli som fusjoner til C-terrainus av Schistosoma japonicum 26 kDa glutation S-transferase (GST), som kan renses ved affinitetsteknikk under ikke-denatu-rerende betingelser ved et kit tilgjengelig fra Pharmacia. Kort fortalt, kulturer av E. coli, som har stått over natten^ transformert med rekombinant pGex-lXT-plasmider, ble fortynnet i ferskt medium og fikk vokse i en periode på 3 timer ved 37°C. Proteinuttrykking ble indusert ved 0,1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid), og etter en ytterligere periode på 4 timer med vekst ved 30°C ble cellene pelletert og resuspendert i PBS. Cellene ble lysert ved sonikering, behandlet med 1% Triton X-100 og sentri-fugert ved 12.000 x g i 10 minutter. Supernatanten inneholdende de uttrykte fusjonsproteiner ble renset ved å føre lysatene gjennom glutationagarose (Pharmacia). Fusjonsproteinene ble enten eluert ved konkurranse med fritt glutation, eller de ble spaltet over natten med 10 U bovint trombin for å fjerne AF-protein fra GST-affinitetshalen. Hele metoden, ved anvendelse pGex-plasmid og rensing av de rekombinante proteiner eller peptider, ble utført med kitt som er tilgjengelig fra Pharmacia.

Sekvens og størrelse av rekombinante AF-proteiner - For å bekrefte kodesekvensen ble transkripter av full lengde isolert ved å anvende PCR-mangfoldiggjøring av cDNA fra hypofyse og hjerne. Ved å anvende primer-paret C/D ble 1.215 bp som er identisk til sekvensen i klon 4 (fig. 1) isolert. Den åpne leseramme kodet for 382 aminosyrer med en kalkulert molekylmasse på 41,14 kDa, og en kalkulert pl på 4,9.

AF-klonene 1, 2 og 3, og likeledes oligonukleotidene N1-N5 (fig. 1 og tabell 1) ble ligert inn i pGex-lXT-plasmidvektor slik at ORFen var i ramme med glutation S-transferaseproteinet (GST). Konstruktene ble transformert inn i E. coli, og uttrykking av fusjonsproteiner ble indusert med IPTG. De rensede fusjonsproteiner, og det trombin-spaltede AF-protein eller peptid, ble underlagt SDS-PAGE og Western-blotting ved å anvende antiserum mot porcin antisekretorisk faktor (fig. 2). Farging av proteinene med Coomassie brilliant blue ga bestemte bånd for hvert protein, med unntak av GST-AF-l-proteinet som manifisterte degradering til mindre komponenter.

Fastfase-peptidsyntese - Mindre peptider (P7-P18 i tabell 1) ble dannet (K.J. Ross-Petersen AS) på fastfase i en "Applied Biosystems peptide synthesiser". Renheten for hvert peptid var 93-100%, bestemt ved revers fase HPLC på Deltapak C18, 300 A, ved å anvende en lineær gradient av 0,1% trifluor-eddiksyre i vann/acetonitril.

Aminosyresekvensering - Proteinsekvensanalyser ble ut-ført for ytterligere å undersøke den identifiserte ORF. De rene AF-proteiner ble kjørt i en 10% makro-slab-gel SDS-PAGE (14), og proteinene ble overført til en Problot-membran (Applied Biosystems) ved elektroblotting (Bio-Rad). Flekker, visualisert ved Ponceau S-farging, ble skjært ut fra blottet, og de første 20 aminosyrer av proteinene ble sekvensert ved automatisert Edman-degradering på en auto-matisk sekvenser (Applied Biosystems).

De N-terminale sekvensene til klon 2 og klon 3 ble bestemt, og vist å passe perfekt til aminosyrer 63-75 og 130-140, respektivt, av den predikerte sekvens (fig. 1).

Sammenligning med andre proteinsekvenser som er til-gjengelige fra GenBank viste at sekvensen av rAF (fig. 1) er unik i alle dets partier, og ingen tilsvarende sekvens har tidligere blitt rapportert.

De første ti enheter av proteinet synes å være rela-tivt hydrofobe ved analysering ifølge Kyte-Doolittle (22), og kan utgjøre et signalpeptid som spaltes av før exocytose av proteinet. Denne fortolkning støttes av Western-blot analyser (fig. 3) hvor det rekombinante protein synes å ha en noe høyere molekylmasse enn prpteinekstraktet fra hypofysekjertel. Noe av denne forskjell kan imidlertid også skyldes de ytterligere fem aminosyrer i det rekombinante protein som utgjør trombinspaltingssetet i fusjonsproteinet .

Eksempel 4. Produksjon og testing av antisera mot rAF

Antisera mot rekombinant GST-AF-fusjonsprotein - Antistoff mot de rensede fusjonsproteiner GST-AF-1, GST-AF-2 og trombinspaltet rent AF-l-protein (=rAF) for anvendelse i ELISA, Western-blot og immunohistokjemiske undersøkelser ble fremstilt i kaniner. Hver kanin ble gitt 100 ug antigen i 1 ml PBS blandet med et tilsvarende volum av "Freund's komplette adjuvans". Hver immunisering ble fordelt i 8-10 porsjoner, og ble injisert i ryggen intrakutanøst. To store doser med 50 ug antigen ble injisert ved 3 og 5 uker, den siste uten Freund's komplette adjuvans. Kaninene ble åre-latet 6 dager etter den siste injisering, og sera ble fremstilt og lagret ved -20°C. Sensitiviteten til antiserumet ble testet ved en analyse av typen "dot-blot". GST-AF-2 ble applisert på en ECL-nitrocellulosemembran i 1/5-fortynninger, og antiserumet ble fortynnet til 1:1.000. Membranene ble blokkert med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS ved 4°C i 16 timer, og deretter inkubert i 1,5 time med 1:800-fortynning av anti-GST-AF fra kanin eller AF-antiserum fra gris. Avtrykket ble utviklet med alkalisk fosfatase-konjugert anti-kanin immunoglobulin fra geit etterfulgt av 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat og p-nitro blå tetrazolium (Boehringer Mannheim). De estimerte grensene for antigendeteksjon var i denne analyse ca. 1 ng.

SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og immunoblotting - SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) av humane og porcine hypofysekjertelekstrakter og rene AF-proteiner ble utført i 10% akrylamid "minislab" geler, i hovedsak som beskrevet av Laemmli (4) men modifisert slik at bis-akrylamid som kryssbinder ble erstattet av N,N'-diallyltartar-diamid med den korresponderende molaritet. Pyronin Y (Sigma) ble anvendt* som en markør for den elektroforetiske front. Molekylvektreferanser som på forhånd er farget, ble innkjøpt fra BDH. Proteinene ble deretter enten farget med Coomassie brilliant blue, eller overført elektroforetisk til ECL nitrocellulose med 0,45 mm porestørrelse (Amersham) for immunoblotting. Den påfølgende inkubasjon med BSA, konjugert anti-IgG og alkalisk fosfatasesubstrat var den samme som for "dot-blot"-analysen beskrevet ovenfor.

Som forklart ovenfor viste farging med Coomassie brilliant blue ingen diskrete bånd for GST-AF-l-proteinet, noe som sannsynligvis skyldes proteolytisk degradering til mindre komponenter. Imidlertid ga Western-blot-analysene av proteinet i full lengde et mye sterkere signal enn for de degraderte produkter (fig. 2b). Den sterke reaksjon med antiserum mot porcint AF indikerer at de rekombinante proteiner faktisk har den samme immunoreaktivitet som AF. Den molekylære vekt av proteinet i full lengde synes å være ca. 60 kDa, som er noe høyere enn den sanne molekylvekt på 41139 Da som er estimert fra aminosyresammensetningen. Videre ble proteinene også immunoblottet og probet med antiserum mot GST-AF-2, som bandt til de trombin-spaltede proteiner (fig. 3).

Antiserum mot rekombinant GST-AF-2 reagerte med det naturlig forekommende AF-protein med en tilsynelatende molekylmasse på 60 kDa, og med noen mindre komponenter, sannsynligvis enzymatiske degraderingsprodukter (fig. 3a).

ELISA for bestemmelse av AF-konsentrasjoner - ELISA-analyser ble utført ved å anvende anti-AF-1 og anti-AF-2 i samsvar med en tidligere beskrevet fremgangsmåte (5). Som vist i fig. 3b var sensitiviteten av testen med rå-antiserum mellom 1-10 ug protein, mens testen med affinitets-renset antistoff hadde en sensitivitet på mellom 5 og 50 ng protein.

Eksempel 5. Northern blot analyser av RNA fra hypofysekjertel

Northern blot analyser - Humane hypofysekjertler ble oppnådd postmortem fra Sahlgrenska Hospital (tillatelse gitt av Svenske helsemyndigheter; 2§ transplantationslagen, 1975:190). For å oppnå RNA ble hypofysekjertler ekstrahert med guanidiniumtiocyanat RNA i samsvar med metoden til Chomczynski og Sacchi (6). Polyadenylert RNA ble utvalgt ved et kommersielt kit (Pharmacia) ved å anvende kolonner med oligodT-cellulose. I tillegg ble en fraksjon av humant hypofyse mRNA fra 107 individer fra Clontech anvendt. 5 ug av hver prøve poly(A+)RNA ble glyoksal-behandlet og elektroforerert i en 1,2% agarosegel (7). Etter kappilær-alkalisk overføring i 3 timer i 0,05 M NaOH til Hybond N+ nylonmembraner (Amersham), ble prehybridisering og hybridi-sering utført i 24 timer, hver ved 42°C. Hybridiserings-løsningen inneholdt 50% formamid, 5xSSPE, 10XDenhard's løsning med 250 ug/ml denaturert DNA av lav molekylvekt og 50 ug/ml polyadenylenisk syre. Blottene ble probet med fire forskjellige antisense 28 bp oligonukleotider omfattende posisjonene 132-105 (primer E), 297-270 (primer F), 748-721 (primer G) og 833-806 (primer H) av sekvensen (fig. 1). Probene var merket i 3'-ende med terminal transferase (Boehringer Mannheim) pluss [a^P]ddATP (Amersham) og renset på kolonner av typen Nick (Pharmacia). Fem ettervask i 5XSSPE/0,1% SDS - 0,5XSSPE/0,1% SDS ble utført ved 42°C, hver i 30 minutter, med en repetisjon for det siste vaske-trinn. Filtrene ble eksponert til Hyperfilm MP (Amersham) i 7 dager.

Uttrykking i hypofysekjertler - Northern blot analyser ble utført med en blanding av fire oligonukleotidprober som hybridiserer med forskjellige sekvenser langs den klonede cDNA (fig. 4). Probene hybridiserte med ett enkelt bånd på ca. 1.400 bp i den separerte mRNA fra hypofysekjertel. Det sterkeste signal ble oppnådd med det humane materiale, men også det porsine materiale kryssreagerte.

Eksempel 6. Fordeling av AF i seksjoner i hypofysekjertel

Spesis og vev - Humane hypofysekjertler ble oppnådd postmortem fra Sahlgrenska Hospital (tillatelse gitt av Svenske helsemyndigheter, §2 transplantationslagen, 1975:190). Kjertlene ble holdt frossen ved -70°C, med unntak av de som ble anvendt for histologisk undersøkelse som ble fiksert i 24 timer i 4% paraformaldehyd oppløst i fosfatbufret saltløsning (PBS=0,15 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat, pH 7,2) og deretter overført til 7,5% sukrose i PBS. Hypofysekjertler fra gris, 5-7 måneder gamle, fra et slakteri, ble plassert på tørr-is under transport og holdt frossen ved -70°C inntil anvendelse. Sprague-Dawley-rotter, 2-3 måneder gamle, for bioanalyse fra B & K Universal AB, Sollentuna, Sverige. Kaniner (New Zealand White) for immunisering var fra Lidkoping Kaninfarm, Sverige.

Immunohistokjemi - De fikserte hypofysekjertler ble frosset i flytende nitrogen, og kryo-seksjoner med en tykkelse på 7 um ble tillaget. For hver prøve ble 5-10 seksjoner omfattende forskjellige deler av kjertelen fast-gjort til mikroskoppreparatglassene. Seksjonene ble blokkert i 5% fettfri tørket melk og inkubert med primært kanin-antiserum (anti-GST-AF-2 fusjonsprotein) fortynnet 1:4.000-1:8.000 i et fuktig kammer over natten ved 4°C. Etter skylling i buffer, ble prøvene inkubert i 1 time ved 23°C med alkalisk fosfatasekonjugert anti-kaninimmuno-globuliner fra svin fortynnet 1:50 (Dako A/S). Immuno-reaksjonen ble visualisert med fosfatasesubstrater som beskrevet (8). Kontrollseksjoner ble inkubert med immunserum absorbert med et overskudd av GST-AF-2-protein, eller med alle inkubasjonstrinn med unntak av primær-antistoff.

Fordeling av AF i seksjoner av humane hypofysekjertler ble undersøkt med immunohistokjemiske teknikker (fig. 5). I alle spesiemene som ble undersøkt, ble et moderat antall celler i adenohypofyse farget. Det immunofargede materiale synes å være lokalisert i granuler i cytoplasma. Preabsorp-sjon av immunserumet med et overskudd av GST-AF-2-protein opphevet signalet. Ingen farging ble observert i det bakre parti (neurohypofyse).

Fordelingen av immunoreaktivt materiale i hypofysekjertel demonstrerte klart den intracellulære fordeling av AF i sekrerende celler i den fremre lapp (adenophypofyse). Proteinene som kommer fra denne lapp inkluderer vekst-hormon, tyrotropin, kortikotropin, prolaktin og luteini-serende hormon. Passasjen for disse hormoner fra intracellulær lokalisasjon til det vaskulære system utløses av frigjøringsfaktorer som dannes av neuroendokrine celler i hypotalamus.

Eksempel 7. Biologisk aktivitet for rAF

Antisekretorisk aktivitet - Den antisekretoriske aktivitet ble målt i en intestinal sløyfemodell fra rotte, som beskrevet tidligere (9). En sløyfe fra tomtarmen ble utfordret med 3 ug koleratoksin. Forskjellige doser av rensede AF-l-proteiner eller PBS (kontroll) ble injisert før eller etter påføringen av koleratoksin. Vekten av akkumulert fluid i den intestinale sløyfe (mg/cm) ble målt etter 5 timer. Hvert AF-preparat ble testet på minst 6 rotter. Fisher's PLSD ble anvendt for statistisk analyse av dataene.

Biologisk aktivitet for rAF protein - Den biologiske aktivitet for det rene rAF protein som ble fremstilt ved klon 1 i E. coli ble testet i en rottemodell. Kapasiteten til rAF for å inhibere intestinal fluid-sekresjon ved injisering intravenøst 20-30 sekunder før intestinal påføring av koleratoksin er vist i fig. 6. I kontrolldyrene, som kun er injisert med buffer, forårsaket koleratoksin en uttalt sekresjon, 412+9 mg fluid per cm tarm. Den rene rAF forårsaket dose-avhengig inhibering av kolerasekresjonen som var signifikant forskjellig fra responsen til bufferen (p<0,01, n=6). 9 ng klon 1-protein er tilstrekkelig til å redusere responsen med 34%, mens 44 ng (lO--^ mol) og 220 ng redu-serte responsen med 46 og 78% respektivt. Den biologiske aktivitet av rekombinant AF er større enn den av ethvert kjent enterotoksin, og større enn for ethvert intestinalt hormon eller neuropeptid som modifiserer vann- og elektro-lyttransport. Videre er aktivitetsnivået for humant rAF i rotte overraskende høyt, noe som sannsynligvis reflekterer en allesteds nærværende struktur som er konservert i rAF-molekyler fra forskjellige spesis. Denne hypotese støttes av kryssreaktiviteten mellom humant og porcint materiale oppnådd i Western blot- og Northern blot-analyser.

Kapasiteten av 0,5 ug rAF til å inhibere intestinal sekresjon ved injisering intravenøst 20-30 sekunder før og 90 minutter etter koleratoksinpåføringen ble sammenlignet (fig. 7). Begge administreringer ga signifikant inhibering sammenlignet med kontrolldyr (p<0,01, n=6). I motsetning til naturlig AF var det rekombinante protein også effektivt når det ble gitt etter toksinutfordringen, noe som gjør rAF anvendelig for terapeutisk behandling av diaré. 3 ug rAF ble injisert i en 8-10 cm lang sløyfe plassert umiddelbart proksimalt i forhold til sløyfen som ble utfordret med koleratoksin. rAF ble enten indusert 20-30 sekunder før, eller 90 minutter etter toksinutfordringen. Det vises i fig. 8 at begge testgruppene oppnådde en signifikant reduksjon av fluid-sekresjonen sammenlignet med kontroller (p<0,01, n=6). Ingen forskjell ble observert mellom de to testgrupper. Dette forsøk antyder at rAF er aktiv etter oral administrering, og kan anvendes som et tilsetningsstoff i et dyrefor såfremt ingen alvorlige bieffekter oppstår.

I eksemplene beskrevet ovenfor ble rAF produsert i Epicurian Coli XL-l-celler. I disse celler ble en stor del av det dannede rAF degradert til mindre peptider. Ved produksjon av rAF i BL21-celler ble kun en mindre andel av rAF degradert, mens i topp 1-celler ble ingen degradering observert. Overraskende var den biologiske aktivitet proporsjonal til graden av degradering, dvs. høyere grad av degradering resulterte i en høyere aktivitet. Derfor ble forskjellige korte fragmenter produsert for å teste for deres mulige biologiske aktivitet.

Som vist i tabell 1, ble disse fragmenter testet intravenøst før koleratoksinutfordringen på samme måte som beskrevet ovenfor for det intakte rAF. Peptidene som ble uttrykt av klon 2 og 3 ble testet i mengder på 0,1, 1 og 10 ug, og hadde ingen effekt på toksinresponsen. I motsetning hadde 1 mg av peptidet uttrykt av RACE-fragmentet (klon 4) en betydelig effekt. En mengde kortere konstrukter ble tillaget fra RACE-fragmentet og uttrykt i pGex-1-lambda. Som vist i tabell 1, ble det aktive sete funnet å være posi-sjonert mellom aminosyreenheter 35-51. For å bestemme mer eksakt posisjonen til det aktive sete ble tre mindre peptider tillaget ved fastfase-peptidsyntese. To av dem var aktive, peptidet 35-46 (P3) og peptid 35-42 (Pl). Det siste oktapeptid IVCHSKTR (Pl) var aktivt i en dose på mindre enn 1 ng, og er omtrent like aktivt på molar basis som det intakte rAF. I motsetning oppviste et kortere heksapeptid VCHSKT (P2) ingen effekt ved testing i doser på mellom 1 ng og 10 ug.

Et peptid X1VCX2X3KX4R korresponderende til det humane fragment Pl, men med visse forandringer og/eller deleteringer, har også blitt fremstilt ved sete-dirigert mutagenese, og ble testet for biologisk aktivitet. Det ble også utført en sammenligning av sekvenser fra bovint og porcint cDNA. Disse forsøk antyder følgende forandringer og/eller deleteringer:

X-L er I eller ingen

X2 er H, R eller K

X3 er S, L eller en annen nøytral aminosyre

X4 er T eller A.

Effekten av rAF på betennelse i den intestinale mukosa ble også testet i den intestinale sløyfemodell fra rotte.

20 rotter ble utfordret med 0,5 ug toksin A fra Clostridium difficile (10) og den inflammatoriske respons og fluidsekresjon ble målt etter 2,5 og 5 timer, respektivt (10 + 10 rotter). Halvparten av rottene i hver gruppe fikk 100 ng rAF intravenøst 30 sekunder før utfordringen. Den andre halvdelen fikk PBS-buffer som kontroll. Etter at rottene var drept, ble sløyfene dissekert ut, og midt-partiet, 2-3 cm, av sløyfene ble frosset på tørr-is. Det frosne spésiemens ble deretter seksjonert i 8 um tykke seksjoner ved anvendelse av Leica kryostat. Seksjonene ble farget for å vise alkalisk fosfatase ved enzym-histokjemi. Alkaliske fosfataser uttrykkes av de intestinale epitelialceller, og fargingen muliggjør undersøkelse av integriteten til det intestinale epitelium.

Resultatene viste (fig. 9) at kontrollrottene utviklet en betydelig skade av den intestinale mukosa: etter 2,5 timer ble det observert en avstøpning av epitelialceller fra den basale membran sammen med nekrotisk vev, mens en utstrakt blødning ble observert etter 5 timer. I motsetning utviklet dyr behandlet med rAF ingen avstøpning, nekrose eller blødning. Den toksin A induserte fluidsekresjon ble også inhibert fra 199 + 4 til 137 + 5 mg/cm etter 2,5 timer (p<0,01) og fra 421 + 3 til 203 + 6 mg/cm etter 6 timer (5 rotter/gruppe, p<0,01).

Et tilsvarende forsøk ble utført med 0,5 ug av peptidet IVCHSKTR (=P1) som erstatning for rAF-proteinet. Oktapeptidet oppnådde den samme effekt på toksin A indusert intestinal betennelse og fluidsekresjon som vist i fig. 9.

Toksisitet - For å teste toksisiteten av rAF ble den injisert i en høy dose, 50 ug per rotte. Ingen tydelig toksisk reaksjon ble registrert under observasjonsperioden på 1 uke.

Eksempel 8. Biologisk aktivitet av rAF på intestinal permeabilitet

For å evaluere effekten av rAF på permeabiliteten av en organisk substans oppløst i blod ble en analyse med Evans blue fargestoff utført i samsvar med en tidligere beskrevet metode (11). Eksperimentet ble innledningsvis utført som beskrevet ovenfor i eksempel 7 og fig. 5 med intravenøs injisering av rAF før koleratoksinutfordringen. Imidlertid ble ingen fluid-sekresjon målt, men 90 minutter etter toksinutfordring ble Evans blue fargestoff, 1 ml av en 1,5% løsning i PBS, injisert intravenøst. Fargestoffet fikk sirkulere i en periode på 5 minutter. Deretter ble rotten underlagt transkardinal perfusjon via den venstre ventrikkel - høyre atrium (ved å anvende en peristaltisk pumpe [Cole Parmer Instruments, Chicago, 111., USA]) med 200 ml 4°C PBS/Alsevier's (1/1-forhold) løsning under en periode på ca. 150 sekunder, utført under eter-anestesi. Denne prosedyre ble utført for å fjerne alle EB som foreligger i det vaskulære system, noe som gjør at kun det EB som finnes i det interstitiale vev detekteres ved formamid-ekstraksjonen av fargestoffet.

Resultatene i tabell 2 viser at sete-utfordring signifikant (p<0,001) øker mengden av EB som kan ekstraheres fra det intestinale vev med rundt 43°C, mens en intravenøs injisering av 1 BrT før koleratoksinutfordringen hindrer denne økning, dvs. mengden av EB ekstrahert fra vevet i gruppe 1 (kontroll) var ikke forskjellig fra den i gruppe 3 (1 rAF + CT).

Resultatene angitt i fig. 10 og 11 viser ekstravasasjonen av azo-fargestoffet Evans blue i tynntarmen og i den korresponderende plexus choroideus fra de laterale ventrikler av hjernen etter utfordring av tarmen med koleratoksin, med og uten en forbehandling av rottene med Pl (IVCHSKTR).

Eksperimentene ble utført på følgende måte: Sprague-Dawley-rotter av hankjønn, vekt 350 g, ble sultet i en periode på 18 timer før den eksperimentelle prosedyre, men hadde fri tilgang til vann. Rottene ble anvendt i grupper på 6. Peptidet Pl, koleratoksin (CT) og PBS ble administrert i samsvar til tabell 3.

i.v.-injiseringen av Pl (0,5 ug) eller av PBS ble ut-ført 10-15 sekunder før den perorale utfordring med 100 ug CT eller med PBS. 60 minutter etter den perorale utfordring ble rottene anestetisert med eter og injisert iv. med Evans blue. Fargestoffet fikk ekvilibrere for ytterligere 30 minutter, hvoretter rottene igjen ble anestetisert med eter og perfusert intrakardialt via den venstre ventrikkel med 250 ml Alsevers løsning/PBS = 50/50, for å fjerne alt fargestoff som foreligger i det vaskulære system. Etter denne perfusjonsbehandling, utført i løpet av en 2-3 minutters periode, skal det fluorescens som registreres kun representere fargestoff som foreligger på utsiden av det vaskulære system.

Hjernen og en del av tynntarmen ble innsamlet og frosset på tørr-is, og kryostatseksjoner, 8 um tykke, ble fremstilt. Seksjonene ble tørket i luft og montert i et xylen-inneholdende monteringsmedium. Seksjonene ble analysert i et Zeiss-fluorescensmikroskop, ved å anvende en filterkombinasjon som er identisk til den som ble anvendt for rhodamin-emittert fluorescens.

Resultatene i fig. 10 og 11 viser at fluorescens-intensiteten (hvit farge) er av tilsvarende størrelse både i tynntarmen (fig. 10) og i plexus choroideus (fig. 11) i gruppe A (Pl iv + CT po) og C (PBS iv + PBS po). Sammenlignet med den høye fluorescensintensitet i tynntarmen og likeledes i plexus choroideus i gruppe B (PBS iv + CT po), viser resultatene klart at injisering av oktapeptidet før toksinutfordringen inhiberer den CT-induserte ekstravaskulære penetrering av Evans blue. Resultatene antyder at dette også er riktig ikke bare i det vaskulære system i tynntarmen, men også i plexus choroideus i den laterale ventrikkel i hjernen.

Konklusjon: Effekten av intravenøs oktapeptid IVCHSKTR administrering inhiberer koleratoksin-indusert ekstra-vaskulær penetrering av Evans blue i tynntarmen og likeledes i plexus choroideus i det sentrale nervesystem. Virk-ningen av rAF og dets peptidderivater er dermed ikke begrenset til tynntarmen, men influerer også pemeabiliteten av blodårer i det sentrale nervesystem. Disse funn indikerer at rAF og dets peptidderivater kan anvendes for å reversere patologisk intrakranielt trykk, trykkforandringer i mellomøret og forskjellige former for permeabilitetsforandringer i blodkar.

REFERANSER

[I] R.A. Young og R.W. Davis, Proe. Nati. Acad. Sei., USA,

Vol 80, 1983, p 1194-1198.

[2] J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, p 1.74-1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,

N. Y.

[3] M.A. Frohman, M.K. Dush og G.R. Martin, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, Vol 86, 1988, p 8998-9002.

[4] U.K. Laemmli, Nature, Vol 227, 1970, p 680-685.

[5] G. Zachrisson, T. Lagergård og I. Lonnroth, Acta path. microbiol. immunol. scand. C, Vol 94, 1986,

p 227-231.

[6] P. Chomczynski, N. Sacchi, Analyt. Biochem., Vol 162, 1987, p 156-159.

[7] J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, p 7.40-7.42, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,

N. Y.

[8] E. Jennische, G.L. Matejka, Acta Physiol. Scand, Vol 46, 1992, p 79-86.

[9] S. Lange, FEMS Microbiol. Lett., Vol 15, 1982,

p 239-242.

[10] J.F. Torres, E. Jennische, S. Lange og I. Lonnroth, Gut, 1990, p 781-785.

[II] S. Lange, Delbro DS, E. Jannische, Evans Blue permeation of intestinal mucosa in the rat. Scand J. Gastroenterol, Vol 29, 1994, p 38-46.

FIGURTEKSTER

Fig. la og fortsatt på fig. lb viser nukleinsyre-sekvens og dedusert aminosyresekvens for det nye humane protein. Den bekreftede aminosyresekvens er understreket. Fig. lc viser et horisontalt kart som viser klonet cDNA og oligonukleotidprimere. Fig. 2 viser en Coomassie brilliant blue-farget SDS-polyakrylamid minigel (A) og immunoblot probet med antisera mot porcint AF (B). Spor med tallhenvisning uten anførsels-tegn inneholder glutation-agarose-renset GST-AF fusjonsproteiner AF-1, AF-2 og AF-3, mens spor med henvisningstall med anførselstegn inneholder fusjonsproteinene som er spaltet med trombin. Molekylære vektreferanser (R), (BDH), er angitt til venstre. GST-AT-1 fusjonsproteinet er sterkt degradert, men immunoblotanalysene viser kun detektering av et protein i full størrelse og spontant trombinspaltings-produkt. Der er et 26 kDa produkt i GST-AF-3 proteinet, sannsynligvis glutation S-transferasehalen som uavhengig er blitt uttrykt. Fig. 3a er et Western-blot der det anvendes antiserum mot rekombinant protein AF-2. Til venstre er det applisert porcint (P) og tre humane (Hl, H2, H3) hypofysekjertler, og til høyre er de tre rekombinante proteiner AF-1, AF-2 og AF-3 (se fig. 2) påført, og i midten molekylvektstandarden

(R) .

Fig. 3b viser en enzymkoblet immunoassay (ELISA) av rAF-anvendende rå-antiserum og affinitetsrensede antistoff dannet i kanin. Fig. 4 viser et autoradiogram av Northern blot av RNA fra en human og porsin hypofysekjertel (p = sammensatt, og i = individuelt materiale). 5 ug renset mRNA ble applisert i hver brønn, og 3'-ender-^^P-merkede oligonukleotidprober ble anvendt, og autoradiogrammer ble utviklet i 7 dager. Fig. 5 viser kryoseksjoner av adenohypofyse farget med antiserum mot rekombinant protein GST-AF-2. A. Seksjoner inkubert med immunserum som viser avtrykk av celler med forskjellig grad av positiv immunoreaktivitet (hele piler). Mange celler mangler fullstendig farging (åpne piler). B.

Seriale seksjoner til A inkubert med immunserum preabsor-bert med overskudd av rekombinant protein GST-AF-2. Der er ingen spesifikk farging av cellene. Større forstørrelser av immunopositive celler som viser cytoplasmisk farging av de endokrine celler, n = kjerne, c = cytoplasma. Fig. 6 viser biologisk aktivitet av rekombinant protein AF-1 ved testing av inhibering av koleratoksin-indusert fluidsekresjon. Graderte doser av proteinet ble injisert intravenøst i rotte. 3 ug koleratoksin ble injisert i en intestinal sløyfe. Etter 5 timer ble det akkumulerte fluid (mg/cm tarm) i sløyfen målt. Hver verdi repre-senterer gjennomsnittet + S.A.E. av en gruppe på 6 dyr. Fig. 7 viser biologisk aktivitet av intravenøst injisert rAF-1. 0,5 ug rAF ble administrert 20-30 sekunder før, eller 90 minutter etter utfordring med 3 ug koleratoksin i en intestinalsløyfe fra rotte. Fig. 8 viser biologisk aktivitet av intraluminært injisert rAF-1. 3 ug rAF ble injisert 20-30 sekunder før, eller 90 minutter etter utfordring med 3 ug koleratoksin i en intestinalsløyfe fra rotte. rAF ble injisert ca. 5 cm fra sløyfen hvori toksinet ble injisert. Fig. 9 A (x 2,5) er kontrollsløyfer (PBS) som viser cellulære rester i den intestinale lumen (L), men ingen farging av den gjenværende mukosa, noe som tyder på en total ødeleggelse av den epiteliale linje. B. (0,5 ul Pl før toksinutfordring) viser en klar delineert epitelial-linje som danner villi, noe som antyder en konservert og normal intestinal mukosa. L = intestinal lumen. Stolper = 500 um. C (x 10) viser den ødelagte mukosa i den PBS-be-handlede kontrollgruppe, og D viser den korresponderende mukosa i den eksperimentelle (Pl-behandlet) gruppe. Den svarte pil peker ved den epiteliale føring, LP = lamina propria, mm = muscularis mucosa, åpen pil peker ved krypt-cellene. Stolper = 100 um. E (x 25) viser den ødelagte mukosa i kontrollen (PBS-behandlet) gruppe, og F viser en korresponderende forstørrelse fra en rotte underlagt Pl-behandling før toksinutfordring. Stolper = 50 um. Fig. 10 viser blå fluorescens i jejunal spesiemens fra tre grupper av rotter behandlet med koleratoksin (CT) eller kontrollbuffer (PBS). Prebehandling med antisekretorisk peptid Pl eller kontrollbuffer (PBS). LP = lamina propria. Svart pil indikerer epitelial celleføring. Åpen pil indikerer kryptceller. Stolper = 100 um. Fig. 11 viser Evans blue fluorescens i plexus choroideus spesiemens fra rotter vist i fig. 10. Stolper = 50 <y>m.

Claims

1. Rekombinant protein, karakterisert ved at det har aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO.

1. eller homologer derav som har den samme aktivitet.

2. Fragment av det rekombinante protein som angitt i SEQ ID No. 1, karakterisert ved at fragmentet er valgt fra gruppen som består av a) aminosyrer nr. 35-42, b) aminosyrer nr. 35-46, c) aminosyrer nr. 36-51, d) aminosyrer nr. 36-80, e) aminosyrer nr. 1-80, av aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1.

3. Peptid, karakterisert ved formelen X-LVCX2X3KX4R korresponderende til fragmentet omfattende aminosyrer nr. 35-42 av det rekombinante protein som angitt i SEQ ID No. 1, hvori X^ er I eller ingen, X2 er H, R eller K, X3 er S, L eller en annen nøytral aminosyre og X4 er T eller A.

4. Antistoff, karakterisert ved at de er spesifikke til proteinet som har aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 med den samme aktivitet.

5. Sammensetning for å normalisere patologisk fluidtransport og/eller inflammatorisk reaksjon i dyr inkludert menneske, karakterisert ved at det omfatter som en aktiv hovedkomponent en effektiv mengde av det rekombinante protein som har aminosyresekvens angitt i SEQ ID NO. 1, eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 som har den samme aktivitet.

6. Sammensetning i samsvar med krav 5, karakterisert ved at fragmentet er valgt fra gruppen som består av a) aminosyrer nr. 35-42, b) aminosyrer nr. 35-46, c) aminosyrer nr. 36-51, d) aminosyrer nr. 36-80, e) aminosyrer nr. 1-80, av aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1.

7. Anvendelse av et rekombinant protein som har den samme aminosyresekvens som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 som har den samme aktivitet, for fremstilling av et materiale for å normalisere patologisk fluidtransport og/eller inflammatoriske reaksjoner i dyr inkludert menneske.

8. Formateriale for normalisering av patologisk fluid-transport og/eller inflammatoriske reaksjoner i vertebrater, karakterisert ved at det som aktivt middel omfatter et rekombinant protein som har den samme aminosyresekvens som angitt i SEQ ID No. 1 eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 som har den samme aktivitet, eller en organisme som er i stand til å produsere nevnte rekombinante protein, homologer eller fragmenter.

9. Anvendelse av et protein som har den samme aminosyresekvens som angitt i SEQ ID No. 1 eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 som har den samme aktivitet, eller en organisme som er i stand til å produsere nevnte rekombinante protein, homologer eller fragmenter, for fremstilling av et medikament for terapautisk profylaktisk behandling for å normalisere patologisk fluid-transport og/eller inflammatoriske reaksjoner i dyr inkludert menneske.

10. Anvendelse i samsvar med krav 9, hvori fragmentet er valgt fra gruppen omfattende a) aminosyrer nr. 35-42, b) aminosyrer nr. 35-46, c) aminosyrer nr. 36-51, d) aminosyrer nr. 36-80, e) aminosyrer nr. 1-80, av aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1.

11. Nukleinsyrer, karakterisert ved at de koder for et rekombinant protein som har den samme sekvens som angitt i SEQ ID NO. 1, eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 som har den samme aktivitet.

12. Nukleinsyrer i samsvar med krav 11, karakterisert ved at fragmentene som kodes for er valgt fra gruppen omfattende a) aminosyrer nr. 35-42, b) aminosyrer nr. 35-46, c) aminosyrer nr. 36-51, d) aminosyrer nr. 36-80, e) aminosyrer nr. 1-80, av aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID No. 1.

13. Anvendelse av nukleinsyrer som koder for det rekombinante protein som har den samme aminosyresekvens som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 som har den samme aktivitet, for å produsere korresponderende proteiner eller homologer eller fragmenter.

14. Vektor, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyrer som koder for proteiner som har den samme aminosyresekvens som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 som har den samme aktivitet.

15. En vert, med unntak av menneske, karakterisert ved at den omfatter en vektor som inkluderer en nukleinsyre som koder for et rekombinant protein som har den samme aminosyresekvens som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 som har den samme aktivitet.

16. Stamme av en organisme, med unntak av menneske, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen omfattende rekombinante bakterier og eukaryotiske organismer, som er i stand til å produsere et rekombinant protein som har den samme aminosyresekvens som angitt i SEQ ID No. 1, eller homologer eller fragmenter i følge krav 2 .