ES2118683T3

ES2118683T3 - Peptidos del factor antisecretor que regulan las modificaciones patologicas de permeabilidad.

Info

Publication number: ES2118683T3
Application number: ES96929619T
Authority: ES
Inventors: Ivar Lonnroth; Stefan Lange; Eva Johansson; Eva Jennische; Christina Lonnroth
Original assignee: Rural Patent Svenska AB
Current assignee: Rural Patent Svenska AB
Priority date: 1995-08-24
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2016-08-23
Also published as: HU224971B1; DE851876T1; AU6893296A; BR9610308A; RO120197B1; PL325114A1; JPH11511972A; NZ316647A; DE69632828T2; NO980743L; DK0851876T3; US20020099016A1; SE9502936D0; SK23698A3; NO320560B1; CN1171902C; KR100552947B1; CN1208420A; HUP9900137A2; NO980743D0

Abstract

SE DESCRIBE UNA NUEVA PROTEINA RECOMBINANTE DENOMINADA FACTOR ANTISECRETORIO (RAF) Y HOMOLOGOS Y FRAGMENTOS PEPTIDICOS DE ESTA. LA PROTEINA Y LOS HOMOLOGOS Y LOS FRAGMENTOS DE ESTA SON UTILES PARA NORMALIZAR EL TRANSPORTE PATOLOGICO DE FLUIDOS Y/O LAS REACCIONES INFLAMATORIAS EN ANIMALES INCLUYENDO EL HOMBRE. SE DESCRIBEN ANTICUERPOS FRENTE A AF U HOMOLOGOS O FRAGMENTOS DE LOS MISMOS. TAMBIEN SE DESCRIBEN ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LA PROTEINA O LOS HOMOLOGOS O LOS FRAGMENTOS DE LOS MISMOS, ASI COMO TAMBIEN VECTORES Y HUESPEDES QUE CONTIENEN LOS ACIDOS NUCLEICOS. LOS RAF Y LOS HOMOLOGOS Y LOS FRAGMENTOS DE LOS MISMOS PODRIAN USARSE PARA INMUNODETECCION, COMO ADITIVO EN LA ALIMENTACION DE ANIMALES EN CRECIMIENTO Y COMO ANTIDIARREICO Y EN FARMACOS CONTRA ENFERMEDADES QUE IMPLICAN LA EXISTENCIA DE EDEMA, DESHIDRATACION Y/O INFLAMACION.

Description

Pétidos del factor antisecretor que regulan las modificaciones patológicas de permeabilidad.

La presente invención se refiere a nuevos factores antisecretores que tienen propiedades reguladoras del transporte de fluidos y/o de las reacciones inflamatorias, así como propiedades reguladoras de polinucleicos y ácidos polinucleicos que los codifican y su uso.

Todas las células y tejidos del cuerpo son dependientes de forma decisiva de un entorno fluido constante y normal junto con un aporte de sangre adecuado. Perturbaciones de uno o de ambos de estos sistemas de apoyo se pueden volver rápidamente mortales. En relación con el equilibrio de fluidos, existen dos sistemas principalmente diferentes:

A. edema, que se caracteriza por la acumulación anormal de fluido en los espacios intercelulares del tejido o en las cavidades corporales, o

B. deshidratación, que en un sentido estricto significa sólo pérdida de agua pero que de hecho se emplea generalmente para describir la pérdida combinada de agua y iones.

Las formas más comunes de edema o deshidratación son:

Diarreas, enfermedades inflamatorias del intestino, edema cerebral, asma, rinitis, conjuntivitis, artritis, glaucoma, diversas formas de presión intracraneal patológica (incremento o disminución), alteración de la presión en el oído medio, tal como enfermedad de Ménière, dermatitis, perturbaciones químicas o físicas de la piel y de glándulas adyacentes a la piel, tales como mastitis, diversas formas de trastornos endocrinos, tales como diabetes insípida, síndrome de Conn, síndrome de Cushing y enfermedad de Addison, enfermedades renales tales como pielonefritis y glomerulonefritis, enfermedades metabólicas tales como mixedema y porfiria aguda intermitente, efectos secundarios durante el tratamiento con diversos fármacos, tales como antidiabéticos, antidepresivos tricíclicos, citostáticos, barbituratos, narcóticos y análogos de narcóticos.

La diarrea está causada por un cambio en la permeabilidad de electrolitos y agua en el intestino. Esta perturbación está causada frecuentemente por enterotoxinas bacterianas, tales como las producidas por Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae y Clostridium difficile. La perturbación también puede estar causada por inflamación intestinal. Puesto que la absorción de agua está acoplada con la absorción de electrolitos y nutrientes, los animales con diarrea frecuente sufren de malnutrición, dando como resultado un retardo en la ganancia de peso diaria en el animal en crecimiento. El cuerpo contrarresta estas reacciones mediante mecanismos neuro-hormonales, tales como la liberación de somatostatina y péptidos opiáceos desde las interneuronas en la mucosa intestinal. Estos polipéptidos son capaces de revertir la secreción de fluido y la diarrea.

El factor antisecretor (AF) descrito recientemente se ha purificado parcialmente a partir de la glándula pituitaria de cerdo y se ha observado que revierte la secreción patológica inducida por diversas enterotoxinas. Altos niveles de AF en la leche de las cerdas protegen a los cerditos amamantados contra la diarrea neonatal.

Se han empleado ampliamente fármacos antimicrobianos en el tratamiento de la diarrea, tanto en la medicina humana como en la veterinaria. También se emplean como aditivos para alimentación de cerdos, vacas y pollos. Sin embargo, debido al rápido desarrollo de resistencia bacteriana en el intestino, el uso de antibióticos contra la enteritis no se acepta generalmente en la medicina humana y su uso también está disminuyendo en la medicina veterinaria.

Otros fármacos antidiarreicos contrarrestan la secreción en la mucosa intestinal. Puesto que estos fármacos están dirigidos contra el animal hospedador, no es probable que se desarrolle resistencia contra los fármacos. Estos tipos de fármacos incluyen fármacos neuroactivos como fenotiazinas y tioxantenos. Debido a algunos graves efectos secundarios, estos tipos de fármacos no han sido aceptados para el tratamiento de la diarrea en la mayoría de los países. Otros fármacos son derivados de opiáceos, como la codeína y la loperamida. Puesto que estos fármacos actúan principalmente inhibiendo la movilidad intestinal, también inhiben el aclaramiento de bacterias patógenas del intestino y no se deben recomendar en absoluto contra las bacterias de la disentería o contra parásitos. Los derivados de la somatostatina han sido introducidos recientemente, pero tienen hasta ahora un uso limitado debido a dificultades en la administración de los fármacos y a posibles interacciones con la regulación endocrina del crecimiento.

El factor antisecretor (AF) no se ha utilizado hasta ahora directamente para el tratamiento de la diarrea o la malnutrición debido a dificultades implicadas en la obtención de una preparación pura de esta proteína. Sin embargo, ha sido posible inducir proteínas similares en animales domésticos a los que se ha dado una alimentación específica (documento de patente de Suecia nº 9000028-2). En los cerdos a los que se dio esta alimentación, se obtuvieron altos niveles de proteínas similares a AF y tenían un incremento significativo en la tasa de crecimiento diario, comparado con testigos compatibles. AF en ratas estimuladas con toxina A de C. difficile, protege no sólo contra la secreción intestinal, sino también contra la inflamación y las hemorragias en el intestino.

Un objeto principal de la presente invención es proporcionar una nueva proteína recombinante y sus homólogos y fragmentos (péptidos) para uso en la normalización del transporte de fluidos patológico. Estas proteínas y péptidos se denominan colectivamente factores antisecretores (AF). El uso de AF también inhibe parcialmente o elimina totalmente el desarrollo de reacciones inflamatorias de diversas etiologías. La reconstitución de vuelta a lo normal (transporte de fluidos o inflamación) se obtiene con el uso de proteínas o péptidos. Además, las proteínas o péptidos AF se absorben eficazmente a través de diversas membranas mucosas sin pérdida de potencia (cuando se compara con la administración intravenosa). Consecuentemente, existe una multitud de regímenes de tratamiento y una proteína o péptido administrado correctamente puede hacer posible una rápida reconstitución de un equilibrio de fluidos perturbado (agua e ión), de una reacción inflamatoria o de ambos.

Resumiendo, el AF recombinante (AFr) y sus homólogos y fragmentos se podrían utilizar para la inmunodetección, como aditivo alimentario para el crecimiento de animales y como antidiarreico y como fármacos contra enfermedades que implican edema, deshidratación y/o inflamación.

Los objetos de la presente invención son los siguientes:

Una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, u homólogos o fragmentos de la misma.

Un fragmento de la proteína recombinante mostrada en SEQ ID NO:1, cuyo fragmento se escoge entre el grupo que comprende

a) los aminoácidos nº 35-42

b) los aminoácidos nº 35-46

c) los aminoácidos nº 36-51

d) los aminoácidos nº 36-80

e) los aminoácidos nº 1-80

de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1.

Un péptido X_{1}VCX_{2}X_{3}KX_{4}R que se corresponde con el fragmento que comprende los aminoácidos nº 35-42 de la proteína recombinante mostrada en SEQ ID NO:1, en donde X_{1} es I o está ausente, X_{2} es H, R o K, X_{3} es S, L u otro aminoácido neutro y X_{4} es T o A.

Los anticuerpos contra una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o fragmentos.

Una proteína que se une a anticuerpos específicos de una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o fragmentos.

Una composición para normalizar el transporte de fluidos patológico y/o las reacciones inflamatorias que comprende como componente principal activo una cantidad eficaz de la proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1 o sus homólogos o fragmentos.

Uso de una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, o sus fragmentos o sus homólogos para preparar una composición para normalizar el transporte de fluidos patológico y/o las reacciones inflamatorias.

Alimento para normalizar el transporte de fluidos patológico y/o las reacciones inflamatorias en vertebrados, que comprende como agente activo una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1 o sus homólogos o sus fragmentos, o un organismo capaz de producir tal proteína o sus homólogos o sus fragmentos.

Un procedimiento para normalizar el transporte de fluidos patológico y/o las reacciones inflamatorias en vertebrados, que comprende administrar al vertebrado una cantidad eficaz de una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1 o sus homólogos o sus fragmentos, o un organismo que produce dicha proteína o los homólogos o fragmentos.

Uso de anticuerpos específicos contra una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o sus fragmentos, para detectar dicha proteína o dichos fragmentos en organismos.

Ácidos nucleicos que codifican una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o sus fragmentos.

Uso de ácidos nucleicos que codifican una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o sus fragmentos, para producir las proteínas, los homólogos o los fragmentos correspondientes.

Uso de sondas o de cebadores obtenidos a partir de ácidos nucleicos que codifican una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o sus fragmentos, para detectar la presencia de ácidos nucleicos en organismos.

Vector que comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o sus fragmentos.

Hospedador, excepto el ser humano, que comprende un vector que incluye ácidos nucleicos que codifican una proteína recombinante que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o sus fragmentos.

Una cepa de un organismo, excepto el ser humano, capaz de producir una proteína que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, o sus homólogos o sus fragmentos.

Como organismos capaces de producir la proteína recombinante se pueden emplear diferentes tipos de organismos, tales como bacterias recombinantes y organismos eucariontes, tales como levadura, vegetales y vertebrados, excepto el ser humano.

A pesar de los diez años de intentos de purificar AF mediante técnicas bioquímicas convencionales, no ha sido posible obtener AF de forma homogénea. Sin embargo, mediante un nuevo procedimiento para preparar un AF semipuro para inmunizar y seleccionando antisuero mediante un método inmunohistoquímico, se escogió un antisuero adecuado. Con este antisuero ha sido ahora posible clonar ADNc humano recombinante que expresa AF en E. coli.

La secuencia del nuevo ADNc se determinó y se observó que era única. Al tener conocimiento de esta secuencia, se construyeron sondas de oligonucleótidos que se hibridaban con ARN de la glándula pituitaria humana y porcina. El tamaño de este ARN, aproximadamente 1400 pares de bases, se corresponde con el tamaño del ADNc secuenciado que comprende 1309 pares de bases más una cola de poli(A). Una secuencia parcial de ADNc procedente de la glándula pituitaria de rata, se ha observado que es idéntica a la del ADNc humano, lo que refleja una estructura ubicua conservada en los genes de AF de especies diferentes. Esta semejanza hace posible el uso de las mismas sondas de oligonucleótidos para identificar el ARN y el ADN que codifican AF de diferentes especies.

También ha sido posible expresar el AFr en una forma biológicamente activa. La proteína AF en forma de una proteína de fusión con S-transferasa de glutatión, se expresaba en grandes cantidades en E. coli y se purificaba hasta homogeneidad por cromatografía de afinidad. Después de cortar la proteína de fusión con trombina, se observó que el AF recombinante (AFr) era extremadamente potente, 44 ng (10^{-12} mol), proporcionando una inhibición semi-máxima de la secreción de fluido inducida con toxina del cólera en el intestino de ratas.

Se produjeron fragmentos más pequeños de AFr mediante tecnología genética. Se observó que la actividad residía en una pequeña secuencia que constaba de 7 a 8 aminoácidos. Esto se confirmó con ayuda de la síntesis química en fase sólida, según la cual se producía un octapéptido y se observó que era casi tan potente biológicamente como AFr en base molar. Con ayuda de la síntesis dirigida al sitio, se construyó una variedad de secuencias con el sitio activo y se observó que se podían sustituir ciertos aminoácidos sin suprimir la actividad biológica.

La secreción de fluido se midió según el modelo de asa intestinal: una sección (asa) del intestino delgado se liga mediante dos suturas; en el asa se inyecta una cierta cantidad de enterotoxina. Si se someten a ensayo los fármacos antisecretores, se inyectan entre una hora antes y dos horas después de la estimulación con la toxina. La inyección se realizó mediante tres rutas diferentes; de forma intravenosa, intraintestinal e intranasal. El fluido se acumula en el asa, 5 h después de la estimulación con la toxina. La secreción se calcula a partir del peso del fluido acumulado por cm de intestino.

La secuencia de la proteína se determinó directamente por secuenciación de aminoácidos, e indirectamente por deducción a partir de la secuencia de ADNc.

El AF recombinante parece que ejerce muy poca toxicidad o efectos sistémicos, puesto que no se observaron reacciones tóxicas obvias en ratas a las que se habían proporcionado dosis 100 veces superiores a las que causan una inhibición semi-máxima. Ya que es eficaz cuando se inyecta en el intestino delgado, se podía administrar peroralmente.

El AF recombinante inhibe la secreción también cuando se inyecta después de la estimulación con la toxina, en oposición con las preparaciones de AF natural sometido a ensayo, que parece ser eficaz sólo cuando se inyecta antes de la toxina. Por tanto, el AFr se podía utilizar tanto de forma profiláctica como terapéutica.

Además, se observó que AFr y sus fragmentos peptídicos inhibían las reacciones citotóxicas y la inflamación en el intestino, causadas por la toxina A de Clostridium difficile. Con ayuda de un ensayo de tinción de la permeabilidad, se observó que AFr y sus fragmentos revertían los cambios patológicos de la permeabilidad, inducidos por la toxina del cólera, no sólo en la mucosa intestinal sino también en el plexo coroideo que regula la presión del fluido en el cerebro.

Los antisueros contra AFr se produjeron en conejos y se emplearon enzimoinmunoensayos (ELISA). Este ensayo se puede utilizar para medir AF en fluidos corporales o en alimentos.

Un método para purificar anticuerpos contra AF (naturales o recombinantes) mediante la cromatografía de afinidad sobre columnas con agarosa acoplada a AFr, se describe a continuación.

Los anticuerpos también mostraron ser eficaces para detectar AF en secciones de tejido mediante técnicas inmunohistoquímicas y para detectar AF en transferencia tipo Western.

La invención se describe a continuación adicionalmente, mediante los siguientes Ejemplos no limitantes, junto con los dibujos acompañantes.

Ejemplo 1 Anticuerpos contra AF producidos para clonar el ADNc

El factor antisecretor se preparó a partir de sangre de cerdo mediante cromatografía de afinidad sobre agarosa y enfoque isoeléctrico. A un litro de sangre de cerdo (que contenía sustancias anticoagulantes) se añadió 1 g de tiosulfato sódico y 1 mg de fluoruro de fenilmetilsulfonilo. Las células sanguíneas fueron separadas por centrifugación y el plasma aclarado se eluyó a través de una columna con Sepharose 6B (Pharmacia LKB Biotechnology Stockholm), el volumen del gel se correspondía a aproximadamente 10% del volumen de la solución. Después de lavar con tres volúmenes de lecho de solución salina tamponada con fosfato (PBS = NaCl 0,15 M, fosfato sódico 0,05 M, pH 7,2), la columna se eluyó con dos volúmenes de lecho de \alpha-metil-D-glucósido 1 M disuelto en PBS. El material eluido se concentró y se dializó frente a agua en un ultrafiltro de "flujo a través de Omega 10k" (Filtron Technology Corp.). La fracción se fraccionó posteriormente mediante enfoque isoeléctrico en un gradiente de Ampholine (Pharmacia) pH 4-6, sobre una columna de enfoque isoeléctrico de 400 ml (LKB, Suecia). Una fracción que tenía un punto isoeléctrico entre 4,7 y 4,9 se recogió y se dializó frente a PBS. Por tanto, el AF parcialmente purificado se dividió en partes alícuotas pequeñas y se empleó para producir antisuero en conejos de acuerdo con un método descrito previamente.

Los conejos se inmunizaron y los sueros se sometieron a ensayo para estudiar su capacidad para teñir material intracelular en secciones de glándula pituitaria humana (método descrito en el Ejemplo 6). Sólo uno de los sueros mostraba una tinción intracelular específica y distinta sin teñir las proteínas de la matriz extracelular. Este antisuero se seleccionó para el escrutinio de una genoteca de ADNc/fago lambda GT11, procedente de proteínas con expresión de la glándula pituitaria humana en E. coli.

Ejemplo 2 Escrutinio de genotecas de ADNc procedentes de glándula pituitaria y cerebro humano

Una genoteca del segmento 5' de ADNc de la glándula pituitaria humana normal, obtenida a partir de tejidos procedentes de un conjunto de nueve individuos caucasianos, se adquirió de Clontech Laboratories. Para escrutar la genoteca, se extendieron en placas fagos, con 3 x 10^{4} unidades formadoras de placas, por placa de 150 mm en E. coli Y1090. El antisuero de conejo descrito previamente contra AF de porcino, fue absorbido con 0,5 volúmenes de E. coli Y1090-material lisado, durante 4 horas a 23ºC y se diluyó hasta una proporción de 1:400 y se realizó el escrutinio según Young y Davis (1).

Los anticuerpos anti-conejo de cabra, conjugados con fosfatasa alcalina se emplearon como segundos anticuerpos (Jackson). Las placas positivas se repicaron, se eluyeron en medio de suspensión de fagos [Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, MgSO_{4}10 mM, 2% de gelatina], se extendieron de nuevo en placas, y se escrutaron hasta que todas las placas sometidas a ensayo eran positivas.

Reclonación del ADNc - El ADN fágico procedente de recombinantes de AF fue aislado con Wizard Lambda Preps (Promega) y se digirió con EcoRI. Los insertos se purificaron con equipos de reactivos de Sephaglas BandPrep (Pharmacia), se clonaron de nuevo en el vector pGex-1\lambdaT (Pharmacia) tal y como describe el fabricante, y se transfectaron en células Epicurian Coli XL1-Blue, en células Top 1 o en células BL21 (las tres de Stratagen). El AFr o los péptidos recombinantes se prepararon en células BL21, si no se indica de otro modo (2).

Amplificación del ADNc mediante PCR - Para obtener el extremo 5' perdido del ADNc, se realizó un método basado en la PCR denominado RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc). Un método RACE modificado que genera ADNc 5'-RACE-Ready con un oligonucleótido de anclaje ligado a los extremos 3' de moléculas de ADNc de cerebro humano, se adquirió de Clontech Laboratories. El extremo 5' se amplificó desde una parte del ADNc 5'-RACE-Ready en dos etapas de amplificación de PCR, empleando un cebador 5' complementario al ancla y dos cebadores anidados A y B de PCR (A= bases 429-411 y B= bases 376-359; Fig. 1a), 3' específicos de gen. Diversas partes más pequeñas del fragmento RACE se amplificaron posteriormente para expresar los péptidos correspondientes y se sometieron a ensayo sus propiedades biológicas. La posición de la base y del aminoácido al comienzo y al final de estos fragmentos de oligonucleótidos y de sus péptidos correspondientes, se muestran en la Tabla 1. ADNc porcino y bovino (Clontech Laboratories) se empleó como molde para amplificar fragmentos correspondientes a N3 en la Tabla 1. Una variación de la secuencia también se insertó artificialmente mediante mutagénesis dirigida al sitio, con dicho método se sintetizaron diversos oligonucleótidos correspondientes a las posiciones 168-193, para reemplazar uno a uno los aminoácidos 35-42 (las posiciones se muestran en SEQ ID NO:1). El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pGex-1\lambdaT empleando el sitio EcoRI construido en el ancla y el cebador específico del gen. Para verificar la secuencia obtenida por el método RACE, se amplificó el ADNc bicatenario procedente de la glándula pituitaria y del cerebro humanos (Clontech) con la pareja de cebadores C/D que contenía un sitio de corte extra para EcoRI (Fig. 1b). Los cebadores fueron diseñados para permitir que el marco de lectura abierto completo (ORF) fuera amplificado. Los productos de la PCR de la glándula pituitaria y del cerebro de tamaño esperado fueron digeridos con EcoRI, se aislaron y se clonaron en el vector del plásmido pGex-1\lambdaT.

Secuenciación del ADN y de los oligonucleótidos - El ADN del plásmido pGex-1\lambdaT se empleó como molde para secuenciar los insertos según el método de terminación didesoxi de la cadena (15) empleando el equipo de reactivos de la versión 2.0 de Sequenase (U.S. Biochemical Corp.). Los cebadores iniciales hacia delante y hacia atrás que copiaban las regiones de pGex-1\lambdaT inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del ADN insertado, se obtuvieron de Pharmacia. Los cebadores siguientes se sintetizaron (Scandinavian Gene Synthesis AB) basándose en la información de la secuencia obtenida. Se secuenciaron tres clones diferentes de la PCR para evitar un intercambio de bases por la polimerasa Taq en el método 5'-RACE.

Los datos de la secuencia de nucleótidos y de la secuencia de proteínas deducida se recogieron y se analizaron empleando MacVector 4.1 (Eastman Chemicals Co.). Para pronosticar la secuencia de aminoácidos correspondiente de los insertos de ADNc, se comparó el uso de diferentes marcos de lectura y se proporcionó un marco de lectura abierto largo. La cuestión de los datos de la secuencia de ADN y proteica se realizó empleando un disco CD-ROM Entrez (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA).

Clonación molecular y análisis de la secuencia de ADNc - Los antisueros polivalentes contra la proteína de AF procedentes de cerdo se emplearon para escrutar el ADNc de glándulas pituitarias humanas. Se aislaron dos clones que expresaban AF inmunorreactivo, rescatados del fago lambda y vueltos a clonar en el sitio EcoRI del vector pGex-1\lambdaT, tal y como se describe en el equipo de reactivos proporcionado por Pharmacia. Los análisis de restricción proporcionaron tamaños de insertos de 1100 y 900 pb, respectivamente. La secuenciación del ADN de los dos clones revelaba que la homología era completa, excepto para una sustitución (Fig. 1, C sustituye a T en la posición 1011). Una secuencia aguas arriba del extremo 5' del clon 2, se obtuvo mediante el método RACE. El fragmento tenía una longitud total de 376 pb (sin incluir el brazo de nucleótidos sintéticos en el extremo 5'). El ADNc reconstruido totalmente contenía 1309 pares de bases seguido de una cola poli-A que estaba precedida por una señal poli-A (Fig. 1, posiciones 1289-1295). Un marco de lectura abierto (ORF) de 1146 pb (posiciones 63-1208) fue identificado.

Ejemplo 3 Expresión de la proteína AF de mamíferos de plásmidos recombinantes

Construcción y purificación de proteínas de fusión - Los clones de ADNc obtenidos por escrutinio inmunológico y por amplificación con PCR del ADNc completo, se ligaron a pGex-1\lambdaT. Este vector permite la expresión de proteínas extrañas en E. coli como fusiones para los extremos C de la S-transferasa de glutatión de 26 kDa de Schistosoma japonicum (GST) que se puede purificar por afinidad bajo condiciones no desnaturalizantes con ayuda del equipo de reactivos proporcionado por Pharmacia. Resumiendo, cultivos durante una noche de E. coli transformada con plásmidos pGex-1\lambdaT recombinantes, se diluyeron en medio de nuevo aporte y se dejaron crecer durante 3 h adicionales a 37ºC. La expresión proteica fue inducida con IPTG 0,1 mM (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido) y después de otras 4 h de crecimiento a 30ºC, las células se sedimentaron y se resuspendieron en PBS. Las células se lisaron con ultrasonidos, se trataron con 1% de Triton X-100 y se centrifugaron a 12000 x g durante 10 min; el material sobrenadante que contenía las proteínas de fusión expresadas se purificaron haciendo pasar el material lisado a través de agarosa con glutatión (Pharmacia). Las proteínas de fusión se eluyeron por competición con glutatión libre o se cortaron durante una noche con 10 U de trombina de bovino para eliminar la proteína AF de la cola de afinidad por GST. El método completo para usar el plásmido pGex y purificar las proteínas recombinantes o los péptidos, se realizó mediante los equipos de reactivos proporcionados por Pharmacia.

Secuencia y tamaño de proteínas AF recombinantes - Para confirmar la secuencia codificante, el transcrito de longitud completa se aisló empleando amplificación con PCR de ADNc de la glándula pituitaria y del cerebro. Empleando la pareja de cebadores C/D, se aislaron 1215 pb idénticos a la secuencia del clon-4 (Fig. 1). El marco de lectura abierto codificaba 382 aminoácidos con una masa molecular calculada de 41,14 kDa y un pI calculado de 4,9.

Los clones 1, 2 y 3 de AF, así como los oligonucleótidos N1-N5 (Fig. 1 y Tabla 1) se ligaron en el vector del plásmido pGex-1\lambdaT, de modo que el ORF estaba en marco con la proteína de la S-transferasa de glutatión (GST). Las estructuras artificiales se transformaron en E. coli y la expresión de las proteínas de fusión fue inducida con IPTG. Las proteínas de fusión purificadas y la proteína AF o el péptido cortado con trombina, fueron sometidos a SDS-PAGE y transferencia tipo Western empleando antisuero contra el factor antisecretor porcino (Fig. 2). La tinción con azul de Coomassie brillante de las proteínas, revelaba bandas discretas para cada proteína, excepto para la proteína GST-AF-1 que manifestaba degradación en pequeños componentes.

Síntesis peptídica en fase sólida - Se produjeron pequeños péptidos (P_{7} a P_{18} en la Tabla 1) (K.J. Ross-Petersen AS) sobre fase sólida en un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems. La pureza de cada péptido era de 93-100%, tal y como se evaluó con HPLC de fase inversa en Deltapak C18, 300 A, empleando un gradiente lineal de 0,1% de ácido trifluoroacético en agua/acetonitrilo.

Secuenciación de aminoácidos - El análisis de la secuencia proteica se realizó para validar adicionalmente el ORF identificado. Las proteínas AF puras se hicieron correr en SDS-PAGE con 10% de gel de macro-lámina (del inglés, "slab") (14) y las proteínas se transfirieron a una membrana Problot (Applied Biosystems) mediante electrotransferencia (Bio-Rad). Las manchas, visualizadas mediante tinción de Ponceau S, se escindieron de la transferencia y se secuenciaron los primeros 20 aminoácidos de las proteínas mediante degradación de Edman automatizada sobre un secuenciador automático (Applied Biosystems).

Las secuencias N-terminales del clon-2 y del clon-3 se determinaron y se observó que son perfectamente compatibles con los aminoácidos 63-75 y 130-140, respectivamente, de la secuencia pronosticada (Fig. 1).

La comparación con otras secuencias de proteínas disponibles a partir de GenBank, reveló que la secuencia de AFr (Fig. 1) es única en todas sus partes y no se ha descrito una secuencia similar.

Los primeros diez residuos de la proteína parece que son relativamente hidrófobos cuando se analizan de acuerdo con Kyte-Doolittle (22) y pueden constituir un péptido señal, que se separa por corte antes de la exocitosis de la proteína. Esta interpretación se apoya en los análisis por transferencia tipo Western (Fig. 3) en donde la proteína recombinante parece tener una masa molecular ligeramente mayor a la del extracto de proteína procedente de la glándula pituitaria. Algo de esta diferencia, sin embargo, puede ser debida a los cinco aminoácidos adicionales en la proteína recombinante que constituyen el sitio de corte de la trombina de la proteína de fusión.

Ejemplo 4 Producción y ensayo de antisueros contra AFr

Antisueros contra la proteína de fusión recombinante GST-AF - Los anticuerpos contra las proteínas de fusión purificadas GST-AF-1, GST-AF-2 y la proteína AF-1 pura cortada con trombina (=AFr) se produjeron en conejos para uso en ELISA, transferencia tipo Western y estudios inmunohistoquímicos. A cada conejo se proporcionaron 100 \mug de antígeno en 1 ml de PBS mezclado con un volumen igual de coadyuvante de Freund completo; cada inmunización se distribuyó en 8-10 porciones inyectadas por vía intravenosa en el lomo. Dos dosis de refuerzo con 50 \mug de antígeno fueron inyectadas en 3 a 5 semanas, y la última sin coadyuvante completo de Freund. Se extrajo sangre de los conejos 6 días después del último refuerzo y se prepararon los sueros y se almacenaron a -20ºC. Se sometió a ensayo la sensibilidad de los antisueros con un ensayo de transferencia de mancha. GST-AF-2 fue aplicado sobre una membrana de nitrocelulosa ECL en diluciones de 1/5 y el antisuero se diluyó 1:1000. La membrana se bloqueó con seroalbúmina bovina al 1% (BSA) en PBS a 4ºC durante 16 h, y a continuación se incubó durante 1^{1/2} h con una dilución 1:800 de antisuero anti-GST-AF de conejo o antisuero de AF porcino. La transferencia se reveló con inmunoglobulina anti-conejo de cabra, conjugada con fosfatasa alcalina, seguida de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo y p-nitro azul tetrazolio (Boehringer Mannheim). El límite estimado para la detección del antígeno fue aproximadamente 1 ng en este ensayo.

Electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida e inmunotransferencia - La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) de los extractos de la glándula pituitaria humana y porcina y las proteínas AF puras, se realizó en geles de minilámina con 10% de acrilamida, esencialmente tal y como ha descrito Laemmli (4) con la modificación de que se reemplazó la bis-acrilamida como reticulador por N,N'-dialiltartardiamida con la molaridad correspondiente. Pyronin Y (Sigma) se empleó como un marcador del frente electroforético. La referencia teñida previamente para el peso molecular, se obtuvo de BDH. Las proteínas se tiñeron a continuación con azul brillante de Coomassie o se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa ECL con 0,45 mm de tamaño de poro (Amersham) para la inmunotransferencia. Las incubaciones posteriores con BSA, anti-IgG conjugada y sustrato de fosfatasa alcalina, fueron las mismas que para el ensayo de transferencia de mancha descrito anteriormente.

Tal y como se ha descrito anteriormente, la tinción con azul brillante de Coomassie no revelaba una banda discreta para la proteína GST-AF-1, lo que podía ser debido probablemente a una degradación proteolítica en componentes menores. Sin embargo, en los análisis de transferencia de tipo Western, la proteína de longitud completa proporcionaba una señal mucho más fuerte que los productos degradados (Fig. 2b). La fuerte reacción con el antisuero contra AF porcino indicaba que las proteínas recombinantes todavía tenían la misma inmunorreactividad que AF. El peso molecular de la proteína de longitud completa parecía que era aproximadamente 60 kDa, que es superior al peso molecular verdadero de 41139 Da, estimado a partir de la composición de aminoácidos. Además, las proteínas fueron sometidas también a inmunotransferencia y se sondaron con antisuero dirigido contra GST-AF-2 que se une a las proteínas cortadas con trombina (Fig. 3).

El antisuero contra GST-AF-2 recombinante reaccionaba con la proteína AF presente en la naturaleza, de una masa molar aparente de 60 kDa, y con algunos componentes menores, probablemente productos de la degradación enzimática (Fig. 3a).

ELISA para determinar concentraciones de AF - Los ensayos de ELISA se realizaron empleando anti-AF-1 y anti-AF-2 según un método descrito previamente (5). Tal y como se muestra en la Fig. 3b, la sensibilidad del ensayo con el antisuero bruto, era entre 1-10 \mug de proteína, mientras que el ensayo con el anticuerpo purificado por afinidad tenía una sensibilidad entre 5 y 50 ng de proteína.

Ejemplo 5 Análisis de transferencia tipo Northern del ARN de la glándula pituitaria

Análisis por transferencia de tipo Northern - Las glándulas pituitarias humanas se obtuvieron post mortem en el Hospital Sahlgrenska (permiso otorgado por el Consejo de Salud y Bienestar Social Sueco; 2\NAK de la ley de transplantaciones, 1975:190). Para obtener ARN, se extrajeron glándulas pituitarias con tiocianato de guanidinio, según Chomczynski y Sacchi (6). El ARN poliadenilado se seleccionó mediante un equipo de reactivos comercial (Pharmacia) empleando columnas con celulosa oligodT. Además, se empleó un grupo de ARNm de pituitaria humana procedente de 107 individuos obtenido a partir de Clontech. Se trataron con glioxal cinco \mug de cada muestra de ARN poli(A+) y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,2% (7). Después de la transferencia capilar alcalina durante 3 h en NaOH 0,05 M, hasta las membranas de nailon Hybond N+ (Amersham), se realizó la prehibridación y la hibridación durante 24 h cada una a 42ºC. La solución de hibridación contenía 50% de formamida, 5 x SSPE, 10 x solución de Denhard con 250 \mug/ml de ADN de bajo PM desnaturalizado y 50 \mug/ml de ácido poliadenílico. Las hibridaciones se trataron con sondas de cuatro oligonucleótidos de 28 pb antiparalelas diferentes, que comprendían las posiciones 132-105 (cebador E), 297-270 (cebador F), 748-721 (cebador G) y 833-806 (cebador H) de la secuencia (Fig. 1); las sondas se marcaron en el extremo 3' con transferasa terminal (Boehringer Mannheim) más [\alpha^{32}P]ddATP (Amersham) y se purificaron sobre columnas Nick (Pharmacia). Se realizaron cinco lavados posteriores en 5 x SSPE/0,1% de SDS - 0,5 x SSPE/0,1% de SDS a 42ºC, durante 30 min cada uno, repitiendo el último lavado. Los filtros fueron expuestos a un Hyperfilm MP (Amersham) durante 7 días.

Expresión en la glándula pituitaria - Los análisis por transferencia tipo Northern se realizaron con un mezcla de cuatro sondas de oligonucleótidos que se hibridaban con secuencias diferentes a lo largo del ADNc clonado (Fig. 4). Las sondas se hibridaban con una única banda de aproximadamente 1400 pb en el ARNm separado de la glándula pituitaria. Las señales más fuertes se obtuvieron con el material humano, pero el material porcino tenía también reacción cruzada.

Ejemplo 6 Distribución de AF en secciones de glándula pituitaria

Especies y tejidos - Las glándulas pituitarias humanas se obtuvieron post mortem en el Hospital Sahlgrenska (permiso otorgado por el Consejo de Salud y Bienestar Social Sueco; 2\NAK de la ley de transplantaciones, 1975:190). Las glándulas se mantuvieron congeladas a -70ºC, excepto las empleadas para el examen histológico que se fijaron durante 24 h en paraformaldehído al 4% disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS = NaCl 0,15 M, fosfato sódico 0,05 M, pH 7,2) y a continuación se transfirieron a sacarosa al 7,5% en PBS. Las glándulas pituituarias de cerdos de 5-7 meses de edad, obtenidas de un matadero, se colocaron sobre hielo seco durante el transporte y se mantuvieron congeladas a -70ºC hasta su uso. Las ratas Sprague-Dawley, de 2-3 meses de edad, se obtuvieron para bioensayo de B & K Universal AB, Sollentuna, Suecia. Los conejos (New Zealand White) para las inmunizaciones se obtuvieron de la granja de conejos Lidköping, Suecia.

Inmunohistoquímica - Las glándulas pituitarias fijadas en nitrógeno líquido y las criosecciones de 7 \mum de espesor, se prepararon. De cada muestra, se fijaron 5-10 secciones que comprendían partes diferentes de la glándula para portaobjetos de microscopio. Las secciones se introdujeron en bloques en leche en polvo al 5% desnatada y se incubaron con antisuero primario de conejo (proteína de fusión anti-GST-AF-2) diluido 1:4000-1:8000 en una cámara húmeda, durante una noche a 4ºC. Después de lavar en tampón, se incubaron los especímenes durante 1 h a 23ºC con inmunogobulinas de cerdo anti-conejo, conjugadas con fosfatasa alcalina, diluidas 1:50 (Dako A/S). La inmunorreacción se visualizó con sustratos de fosfatasa tal y como ha descrito cualquiera (8). Las secciones testigo se incubaron con inmunosuero absorbido con un exceso de proteína GST-AF-2 o con todas las etapas de incubación excepto el anticuerpo primario.

Distribución de AF en secciones de glándula pituitaria - La distribución de AF en secciones de glándulas pituitarias humanas se estudió con técnicas inmunohistoquímicas (Fig. 5). En todos los especímenes investigados, se tiñó una cantidad moderada de células en la adenohipófisis; el material inmunoteñido parecía estar localizado en gránulos en el citoplasma; la preabsorción del inmunosuero con un exceso de proteína GST-AF-2 suprimía la señal. No se observó tinción en la parte posterior (neurohipófisis).

La distribución del material inmunoreactivo en la glándula pituitaria mostraba sólo una distribución intracelular de AF en células secretoras del lóbulo anterior (adenohipófisis). Las proteínas que provenían de este lóbulo incluyen la hormona del crecimiento, la tirotropina, la corticotropina, la prolactina y la hormona luteinizante. El paso de estas hormonas desde una posición intracelular al sistema vascular está disparado por factores de liberación producidos por células neuroendocrinas en el hipotálamo.

Ejemplo 7 Actividad biológica de AFr

Actividad antisecretora - La actividad antisecretora se midió en un modelo de asa intestinal de rata, descrito previamente (9). Un asa del yeyuno se estimuló con 3 \mug de toxina del cólera. Diferentes dosis de proteínas AF-1 purificadas o de PBS (testigo) fueron inyectadas antes o después de la estimulación con la toxina del cólera. El peso del fluido acumulado en el asa intestinal (mg/cm) se registró después de cinco horas. Cada preparación de AF fue sometida a ensayo al menos en seis ratas. Para el análisis estadístico de los datos se empleó PLSD de Fisher.

Actividad biológica de la proteína AFr - La actividad biológica de la proteína AFr pura del clon-1 producida en E. coli, se sometió a ensayo en un modelo de rata. La capacidad de AFr para inhibir la secreción del fluido intestinal cuando se inyectaba por vía intravenosa 20-30 s antes de la estimulación intestinal con toxina del cólera, se muestra en la Fig. 6. En animales testigos inyectados sólo con tampón, la toxina del cólera causaba una secreción pronunciada, 412\pm9 mg de fluido por cm de intestino. El AFr puro causaba una inhibición dependiente de la dosis, de la secreción con cólera, lo que era significativamente diferente de la respuesta al tampón (p<0,01, n=6). Nueve ng de proteína del clon-1 son suficientes para reducir la respuesta en 34%, mientras que 44 ng (10^{-12} mol) y 220 ng la reducían en 46% y 78%, respectivamente. La actividad biológica de AF recombinante es mayor que la de cualquier enterotoxina conocida por nosotros y mayor que cualquier hormona intestinal o neuropéptido que modifique el transporte de agua y electrolitos. Además, el nivel de actividad de AFr humano en ratas es sorprendentemente alto, lo que refleja probablemente una estructura ubicua conservada en las moléculas de AFr de especies diferentes. Esta hipótesis se apoya en la reactividad cruzada entre el material humano y el porcino obtenido en los análisis con transferencia de tipo Western y de tipo Northern.

Se comparó la capacidad de 0,5 \mug de AFr para inhibir la secreción intestinal cuando se inyectaban por vía intravenosa 20-30 segundos antes de la estimulación con la toxina del cólera y 90 minutos después (Fig. 7). Ambas administraciones proporcionaban una inhibición significativa comparada con animales testigos (p<0,01, n=6). Por tanto, en comparación con el AF natural, la proteína recombinante también era eficaz cuando se proporcionaba después de la estimulación con toxina, lo que hace a AFr útil para el tratamiento terapéutico de la diarrea.

Se inyectaron 3 \mug de AFr en un asa de 8-10 cm de longitud, situado en posición inmediatamente proximal al asa que se había estimulado con toxina del cólera. El AFr se indujo 20-30 segundos antes o 90 minutos después de la estimulación con la toxina. En la Fig. 8 se observa que en ambos grupos del ensayo se obtenía una disminución significativa de la secreción de fluido, comparada con los testigos (p<0,01, n=6); no se observaba una diferencia entre los dos grupos del ensayo. Este experimento sugiere que AFr es activo después de la administración oral y que puede usarse como aditivo en alimento animal, con la condición de que no se produzca un efecto secundario grave.

En los Ejemplos descritos anteriormente, el AFr se produjo en células Epicurian Coli XL-1. En estas células, la mayoría del AFr producido se degradaba en péptidos más pequeños. Cuando se producía AFr en células BL21, sólo una pequeña parte de AFr era degradado, mientras que en las células Top 1 no se observaba degradación. Sorprendentemente, la actividad biológica era proporcional al grado de degradación, es decir, una mayor degradación daba como resultado una mayor actividad. Por tanto, se produjeron diversos fragmentos más pequeños para someter a ensayo su posible actividad biológica.

Tal y como se muestra en la Tabla 1, estos fragmentos se sometieron a ensayo intravenosamente antes de la estimulación con toxina del cólera, del mismo modo que se ha descrito anteriormente para el AFr intacto. Los péptidos expresados por los clones 2 y 3 sometidos a ensayo en cantidades de 0,1, 1 y 10 \mug, no tenían efecto sobre la respuesta de la toxina. Por el contrario, un microgramo del péptido expresado por el fragmento RACE (clon 4) tenía un efecto pronunciado. Un lote de estructuras artificiales más cortas se preparó a partir del fragmento RACE y se expresó en pGex-1-lambda. Tal y como se muestra en la Tabla 1, el sitio activo se encontró que estaba situado entre el residuo de aminoácido 35 a 51. Para determinar más exactamente el sitio activo, se prepararon tres péptidos cortos mediante síntesis peptídica en fase sólida. Dos de ellos eran activos, el péptido 35-46 (P3) y el péptido 35-42 (P1); el último octapéptido IVCHSKTR (P1) era activo en una dosis menor de 1 ng, siendo casi siempre tan activo en una base molar como el AFr intacto. Por el contrario, un hexapéptido más corto VCHSKT (P2) no tenía ningún efecto cuando se sometía a ensayo en dosis de entre 1 ng y 10 \mug.

Un péptido X_{1}VCX_{2}X_{3}KX_{4}R que se corresponde con el fragmento P1 humano pero con ciertos cambios y/o deleciones, también ha sido producido por mutagénesis dirigida al sitio y se ha sometido a ensayo su actividad biológica. Se compararon las secuencias de ADNc de bovino y porcino. Estos estudios sugerían los siguientes cambios y/o deleciones:

X_{1} es I o está ausente

X_{2} es H, R o K

X_{3} es S, L u otro aminoácido neutro

X_{4} es T o A.

TABLA 1

Código	Oligonucleótido*	Péptido**	Inhibición de la secreción	ED50
			por cólera***	pmol
N1	63-301	1-80	+	4
N2	168-301	36-80	+	6
N3	168-215	36-51	+	3
N4	122-170	21-36	-
N5	186-269	42-69	-
P3	S.P.S.****	35-46	+	7
P1	S.P.S.	35-42	+	5
P2	S.P.S.	36-41	-
* Posición del par de bases en SEQ ID NO:1 que se ha expresado en la estructura artificial preparada a partir
del ADNc de AF y pGex-1-lambda
** Posiciones de los residuos de aminoácidos (SEQ ID NO:1) en AF al principio y al final del péptido
sintetizado.
*** La inhibición de la toxina del cólera inducía secreción de fluido en un asa intestinal ligada de rata; la
cantidad (pmol) que causaba una inhibición semimáxima (ED50) se observó para péptidos activos.
**** Estos péptidos se producían por síntesis en fase sólida.

El efecto de AFr sobre la inflamación en la mucosa intestinal también se sometió a ensayo en el modelo de asa intestinal de rata. Por tanto, se estimularon 20 ratas con 0,5 \mug de toxina A procedente de Clostridium difficile (10) y se midió la inflamación y la secreción de fluido después de 2,5 y 5 horas, respectivamente (10 + 10 ratas). La mitad de las ratas en cada grupo recibía 100 ng de AFr por vía intravenosa, 30 segundos antes de la estimulación; la otra mitad recibía el tampón PBS como testigo. Después de sacrificar a la rata, se separaron por disección las asas y la parte media de 2-3 cm de las asas se congeló sobre hielo seco. Los especímenes congelados se seccionaron a continuación en secciones de 8 \mum de espesor, empleando un criostato de Leica. Las secciones se tiñeron para mostrar las fosfatasas alcalinas mediante histoquímica enzimática. Las fosfatasas alcalinas eran expresadas por las células epiteliales intestinales y la tinción permitía determinar la integridad del epitelio intestinal.

Los resultados revelaban (Fig. 9) que en las ratas testigos se desarrollaba una lesión extensiva de la mucosa intestinal: después de 2,5 h se observó un desprendimiento de las células epiteliales de la membrana basal, junto con tejido necrótico, mientras que se observaba una hemorragia extensiva después de 5 h. Por el contrario, el animal tratado con AFr no desarrollaba desprendimiento, necrosis ni hemorragia. La secreción de fluido inducida por la toxina A también era inhibida desde 199\pm4 hasta 137\pm5 mg/cm después de 2,5 h (p<0,01) y desde 421\pm3 hasta 203\pm6 mg/cm después de 6 h (5 ratas/grupo, p<0,01).

Se realizó un experimento similar con 0,5 \mug del péptido IVCHSKTR (=P1), reemplazando la proteína AFr. Con el octapéptido se conseguía el mismo efecto sobre la inflación intestinal y la secreción de fluido inducidas por la toxina A, tal y como se muestra en la Fig. 9.

Toxicidad - Para someter a ensayo la toxicidad de AFr se inyectó una dosis alta, 50 \mug por rata. No se registró ninguna reacción tóxica obvia durante un periodo de observación de una semana.

Ejemplo 8 Actividad biológica de AFr sobre la permeabilidad intestinal

Para evaluar el efecto de AFr sobre la permeabilidad de una sustancia orgánica disuelta en la sangre, se realizó un ensayo con el colorante Evans blue, según un método descrito previamente (11). El experimento se realizó inicialmente tal y como se ha descrito arriba en el Ejemplo 7 y en la Fig. 5 con inyección intravenosa de AFr antes de la estimulación con la toxina del cólera. Sin embargo, no se midió una secreción de fluido, sino que 90 min después de la estimulación con la toxina, se inyectó por vía intravenosa 1 ml de una solución de colorante Evans blue al 1,5% en PBS. El colorante se dejó circular durante un periodo de 5 min. Después la rata se sometió a perfusión transcardiaca a través del ventrículo izquierdo - atrio derecho (empleando una bomba peristáltica [Cole Parmer Instruments, Chicago, Ill., EE.UU.]) con 200 ml de solución PBS/Alsevier a 4ºC (proporción 1:1), durante un periodo unos 150 segundos, realizada bajo anestesia con éter. Este procedimiento se realizó para eliminar todo el EB presente en el sistema vascular, dejando sólo el EB en el tejido intersticial para ser detectado por la extracción con formamida del colorante.

Los resultados en la Tabla 2 muestran que la estimulación con CT incrementa significativamente (p<0,001) la cantidad de EB que se puede extraer del tejido intestinal con un 43%, mientras que una inyección intravenosa de 1 BrT antes de la estimulación con toxina del cólera evita ese incremento, es decir, la cantidad de EB extraído del tejido en el grupo 1 (testigo) no difería de la del grupo 3 (1 AFr + CT).

TABLA 2

Grupo	Estimulación	ng	EB/g tejido int. X 10^{-7}	% de incremento de conc. de EB
1	PBS+PBS	6	29,3\pm1,0	-
2	PBS+CT	6	51,8\pm1,3	43 (p<0,001)
3	1AFr+CT	6	29,6\pm1,5	0 NS

Los resultados mostrados en las Figs. 10 y 11 muestran la extravasación del colorante Evans blue en el intestino delgado y en el plexo coroideo correspondiente desde los ventrículos laterales del cerebro, después de la estimulación intestinal con toxina del cólera, con y sin tratamiento previo de las ratas con P1 (IVCHSKTR).

Los experimentos se realizaron del modo siguiente: ratas macho Sprague-Dawley, que pesaban 350 g, fueron privadas de alimento durante 18 h antes del procedimiento experimental, pero teniendo acceso libre a agua. Las ratas se emplearon en grupos de seis. El péptido P1, la toxina del cólera (CT) y PBS se administraron de acuerdo con la Tabla 3.

TABLA 3

Grupo	Iny. 1* iv.	Iny.* po.	Iny.2* iv.
A	P1	CT	EB
B	PBS	CT	EB
C	PBS	PBS	EB
* Inyección 1 de P1 (iv.) proporcionada en un volumen de 2 ml de PBS, la inyección peroral (po) se proporcionó
en un volumen de 5 ml, la inyección 2 intravenosa consistía en 1,5 ml de Evans blue al 3% disuelto en PBS. El
éter se empleó para la anestesia durante la realización de todas las inyecciones.

La inyección iv de P1 (0,5 \mug) o de PBS se realizó 10-15 segundos antes de la estimulación peroral con 100 \mug de CT o con PBS; 60 minutos después de la estimulación peroral, se anestesiaron las ratas con éter y se inyectó por vía iv. Evans blue. Se dejó que el colorante se equilibrara durante otros 30 minutos, y a continuación las ratas se anestesiaron de nuevo con éter y se realizó la perfusión intracardiaca a través del ventrículo izquierdo con 250 ml de solución de Alsever/PBS = 50/50, para eliminar todo el colorante presente en el sistema vascular. Después de este tratamiento de perfusión, realizado durante unos 2-3 minutos, la fluorescencia registrada debía representar el colorante presente sólo en el exterior del sistema vascular.

Se prepararon muestras del cerebro y de una parte del intestino delgado y se congelaron sobre hielo seco y se prepararon secciones con criostato de 8 \mum de espesor. Las secciones se secaron al aire y se montaron en un medio de montaje que contenía xileno. Las secciones se visualizaron en un microscopio de fluorescencia de Zeiss, empleando una combinación de filtros idéntica a la empleada para la fluorescencia emitida con rodamina.

Los resultados en las Figs. 10 y 11 mostraban que la intensidad de la fluorescencia (color blanco) es de una magnitud similar en el intestino delgado (Fig. 10) y en el plexo coroideo (Fig. 11), en el grupo A (P1 iv + CT po) y C (PBS iv + PBS po). Comparando con la alta intensidad fluorescente en el intestino delgado, así como en el plexo coroideo en el grupo B (PBS iv + CT po), los resultados muestran claramente que la inyección del octapéptido antes de la estimulación con toxina inhibe la penetración extravascular inducida con CT de Evans blue. Los resultados sugieren que esto es cierto no sólo en el sistema vascular del intestino delgado, sino también en el plexo coroideo de los ventrículos laterales del cerebro.

En conclusión: el efecto de la administración intravenosa del octapéptido IVCHSKTR inhibe la penetración extravascular inducida por la toxina del cólera, de Evans blue en el intestino delgado así como en el plexo coroideo en el sistema nervioso central. Por tanto, la acción de AFr y sus derivados peptídicos no está confinada sólo al intestino delgado, sino que influye también en la permeabilidad de los vasos sanguíneos en el sistema nervioso central. Estos descubrimientos indican que AFr y sus derivados peptídicos se pueden utilizar para revertir la presión intracraneana patológica, la alteración de la presión en el oído medio y diversas formas de cambios en la permeabilidad de los vasos sanguíneos.

Referencias

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[11] Lange, S., Delbro DS, Jannische E. Evans Blue permeation of intestinal mucosa in the rat. Scand J Gatroenterol 1994, 29:38-46.

Leyendas de las figuras

Fig. 1a y continuación en Fig. 1b. Secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos deducidos de la nueva proteína humana. La secuencia de aminoácidos confirmada está subrayada.

Fig. 1c. El mapa horizontal muestra el ADNc clonado y los cebadores de oligonucleótidos.

Fig. 2. Minigel de SDS-poliacrilamida teñido con azul brillante de Coomassie (A) e inmunotransferencia sondada con antisuero contra AF de porcino (B). Las pistas con números no primos contienen proteínas de fusión GST-AF purificadas sobre glutatión-agarosa, AF-1, AF-2 y AF-3, mientras que las pistas con números primos contienen las proteínas de fusión cortadas con trombina. Las referencias del peso molecular (R), (BDH), se indican a la izquierda. La proteína de fusión GST-AF-1 está muy degradada pero el análisis por inmunotransferencia muestra sólo la detección de una proteína de longitud completa y el producto del corte con trombina espontáneo. Existe un producto de 26 kDa en la proteína GST-AF-3, probablemente la cola de la S-transferasa de glutatión, que se ha expresado independientemente.

Fig. 3a. Transferencia de tipo Western empleando antisuero contra la proteína recombinante AF-2. A la izquierda, se emplearon glándulas pituitarias de porcino (P) y tres humanas (H1, H2, H3); y a la derecha, las tres proteínas recombinantes AF-1, AF-2 y AF-3 (véase Fig. 2); en el centro el peso molecular patrón (R).

Fig. 3b. Enzimoinmunoensayo (ELISA) de AFr empleando antisuero bruto y anticuerpos purificados por afinidad obtenidos de conejo.

Fig. 4. Autorradiograma de transferencias tipo Northern de ARN procedente de glándula pituitaria humana y porcina (p = material reunido e i = material individual). Se aplicaron cinco \mug de ARNm purificado en cada cuenco; se emplearon sondas de oligonucleótidos marcadas con ^{32}P en el extremo 3' y la autorradiografía se reveló al cabo de 7 días.

Fig. 5. Criosecciones de adenohipófisis teñida con antisuero contra la proteína GST-AF-2 recombinante. A.
Secciones incubadas con inmunosuero que muestra células dispersas con diversos grados de inmunorreactividad positiva (flechas negras). Muchas células carecían completamente de tinción (flechas blancas). B. Secciones en serie de A incubada con inmunosuero preabsorbido con un exceso de proteína recombinante GST-AF-2. No hay una tinción específica de las células. C y D. Grandes ampliaciones de células inmunopositivas que muestran una tinción citoplasmática de las células endocrinas, n = núcleo, c = citoplasma.

Fig. 6. Actividad biológica de la proteína AF-1 recombinante, sometiendo a ensayo la inhibición de la secreción de fluido inducida por la toxina del cólera. Se inyectaron por vía intravenosa dosis graduadas de la proteína en ratas; tres \mug de toxina del cólera fueron inyectados en un asa intestinal; después de cinco horas se midió el líquido acumulado (mg/cm de intestino) en el asa. Cada valor representa la media \pm S.A.E. de un grupo de seis animales.

Fig. 7. Actividad biológica de AFr-1 inyectado por vía intravenosa; 0,5 \mug de AFr fueron administrados 20-30 segundos antes o 90 minutos después de la estimulación con 3 \mug de toxina del cólera en un asa intestinal de rata.

Fig. 8. Actividad biológica de AFr-1 inyectado por vía intraluminal; 3 \mug de AFr fueron inyectados 20-30 segundos antes o 90 minutos después de la estimulación con 3 \mug de toxina del cólera en un asa intestinal de rata; el AFr fue inyectado proximal aproximadamente a 5 cm del asa en la que se había inyectado la toxina.

Fig. 9. A (x 2,5) son asas testigos (PBS) mostrando desechos celulares en el lumen intestinal (L) pero sin tinción de la mucosa restante, lo que sugiere una destrucción total de la envuelta epitelial. B (0,5 \mul de P1 antes de la estimulación con la toxina) muestra una envuelta epitelial claramente delineada que forma vello, sugiriendo una mucosa intestinal conservada y normal. L = lumen intestinal. Barras = 500 \mum. C (x 10) muestra la mucosa destruida en el grupo testigo tratado con PBS y D muestra la mucosa correspondiente en el grupo experimental (tratado con P1). La punta de flecha negra en la envoltura epitelial, LP = lámina propia, mm = mucosa muscular, la punta de flecha blanca en las criptocélulas. Barras = 100 \mum. E (x 25) muestra la mucosa destruida en el grupo testigo (tratado con PBS), y F muestra una ampliación correspondiente de una rata sometida a tratamiento con P1 antes de la estimulación con la toxina. Barras = 50 \mum.

Fig. 10. Fluorescencia de Evans blue en especímenes de yeyuno de tres grupos de ratas tratadas con toxina del cólera (CT) o con tampón testigo (PBS); pretratamiento con péptido antisecretor P1 o tampón testigo (PBS). LP = lámina propia. La flecha negra indica la envoltura de células epiteliales; la punta de flecha blanca indica las criptocélulas. Barras = 100 \mum.

Fig. 11. Fluorescencia de Evans blue en especímenes de plexo coroideo de las ratas mostradas en la Fig. 10. Barras = 50 \mum.

SEQ ID NO:1

TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con la proteína correspondiente

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1309 pares de bases más la cola poli(A)

\vskip1.000000\baselineskip

TIPO DE CADENA: sencilla

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

ORGANISMO DE LA FUENTE ORIGINAL: ser humano

FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: glándula pituitaria

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CARACTERÍSTICAS: desde 63 a 1208 pb de proteína madura

\hskip3,3cm

desde 1289-1295 pb de secuencia de la señal poli(A)

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1

2

Claims

1. Una proteína recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1 o sus homólogos que tienen actividad antisecretora.

2. Un fragmento de la proteína recombinante mostrada en SEQ ID NO:1, según la reivindicación 1, cuyo fragmento se escoge entre el grupo que comprende:

a) los aminoácidos nº 35-42

b) los aminoácidos nº 35-46

c) los aminoácidos nº 36-51

d) los aminoácidos nº 36-80

e) los aminoácidos nº 1-80

de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1.

3. Un péptido X_{1}VCX_{2}X_{3}KX_{4}R que se corresponde con el fragmento que comprende los aminoácidos nº 35-42 de la proteína recombinante mostrada en SEQ ID NO:1, en donde X_{1} es I o está ausente, X_{2} es H, R o K, X_{3} es S, L u otro aminoácido neutro y X_{4} es T o A.

4. Anticuerpos específicos de la proteína recombinante o de homólogos de la misma según la reivindicación 1, o los fragmentos según la reivindicación 2, o los péptidos según la reivindicación 3.

5. Una composición para normalizar el transporte de fluidos patológico y/o las reacciones inflamatorias en animales que incluyen al ser humano, que comprende como componente activo principal una cantidad eficaz de un fragmento según la reivindicación 2 o un péptido según la reivindicación 3.

6. Uso de un fragmento según la reivindicación 2 o un péptido según la reivindicación 3, para preparar una composición para normalizar el transporte de fluidos patológico y/o las reacciones inflamatorias en animales que incluyen al ser humano.

7. Un alimento para normalizar el transporte de fluidos patológico y/o las reacciones inflamatorias en vertebrados, que comprende como agente activo un fragmento según la reivindicación 2 o un péptido según la reivindicación 3 o un organismo no humano capaz de producir dicho fragmento o péptido.

8. Uso de anticuerpos específicos según la reivindicación 4, para detectar in vitro la proteína recombinante o sus homólogos según la reivindicación 1, o los fragmentos según la reivindicación 2, o los péptidos según la reivindicación 3 en organismos.

9. Ácidos nucleicos que codifican la proteína recombinante según la reivindicación 1, o el fragmento según la reivindicación 2, o los péptidos según la reivindicación 3.

10. Uso de ácidos nucleicos de la reivindicación 9, para producir las proteínas correspondientes o dichos homólogos o fragmentos.

11. Uso de sondas o cebadores obtenidos a partir de ácidos nucleicos que codifican la proteína recombinante o sus homólogos según la reivindicación 1, o los fragmentos según la reivindicación 2 o los péptidos según la reivindicación 3, para detectar in vitro la presencia de ácidos nucleicos en organismos.

12. Un vector que comprende ácidos nucleicos según la reivindicación 9.

13. Un hospedador exceptuando el ser humano, que comprende un vector de la reivindicación 9.