CN1171902C

CN1171902C - 调节病理通透性改变的抑制分泌因子肽

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Publication number: CN1171902C
Application number: CNB961973005A
Authority: CN
Inventors: I; I·伦罗思; S·兰格; ��ɭ; E·约翰森; E·詹尼斯; C·伦罗思
Original assignee: SWEDEN AGRICULTURE PATENT AB
Current assignee: SWEDEN AGRICULTURE PATENT AB
Priority date: 1995-08-24
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 2004-10-20
Anticipated expiration: 2016-08-23
Also published as: NZ316647A; EA199800221A1; DK0851876T3; AU6893296A; NO980743D0; NZ337380A; HU224971B1; TR199800304T1; DE69632828D1; BG102280A; CZ52098A3; WO1997008202A1; DE851876T1; SE9502936L; SE9502936D0; EA001201B1; SK23698A3; AU702589B2; ES2118683T3; ATE270305T1

Abstract

本说明书描述了一种新的称为抑制分泌因子的重组蛋白(rAF)和其同源物及肽段。该蛋白和其同源物及肽段对于使包括人类的动物病理性流体运输和/或炎症反应的正常化是有用的。还描述了抗AF或其同源物或其片段的抗体。也描述了编码该蛋白或其同源物或其片段的核酸以及包括该核酸的载体和宿主。rAF和其源物及片段可用于免疫检测。作为饲养动物的饲料添加剂和止泻剂(antidiarrheal)以及抗包括水肿、脱水和/或炎症疾病的药物。

Description

调节病理通透性改变的抑制分泌因子肽

本发明涉及新的具有流体运输和/或炎症反应调节特性以及多核(polynucleic)调节特性的抑制分泌因子和编码该因子的多聚核酸及其使用。

身体的所有细胞和组织关键依赖于一个稳定而正常的流体环境加上充足的血液供应。这些支持系统中一个或两个紊乱可迅速致命。关于流体失衡，主要存在两种不同的系统：

A.水肿，其特征在于在细胞间组织或体腔中不正常的流体积累，或

B.脱水，在严格的意义上，其意思为仅仅水的丢失，但实际上通常用于描述水和离子的共同丢失。

水肿或脱水的最常见形式有：

腹泻、炎症型内脏病(inflammatory bowel diseases)、脑水肿、哮喘、鼻炎、结膜炎、关节炎、青光眼、不同形式的病理性颅内压(增加或减低)、中耳内压力改变如Morbus Meniere、皮炎、皮肤或皮肤相邻腺体的化学或物理紊乱如乳腺炎、多种形式的内分泌紊乱如尿崩症、原发性醛甾酮过多症、Cushing’s综合症和Morbus Addison、肾病如肾盂肾炎和肾小球性肾炎、代谢疾病如粘液性水肿和急性间歇性卟啉症、以各种药物如抗糖尿病药、三环抗抑郁药(tricyclic antidepressants)、细胞生长抑制剂(cytostatics)、巴比妥酸盐、麻醉剂及其类似物处理过程中的副作用。

腹泻由肠道中电解质和水的通透性改变所致。该紊乱常由细菌肠毒素如大肠杆菌，空肠弯曲杆菌，霍乱弧菌，痢疾杆菌和艰难梭菌产生的毒素所致。该紊乱也可由肠感染所致。由于水的摄入与电解质和营养的摄入相偶联，帮频繁腹泻的动物患有营养不良，导致正在生长动物每日体重获得的延缓。身体通过神经激素机制抵消这些反应如肠粘膜(intestinal mucosa)中的中间神经元释放抑生长素(somatostatin)和麻醉肽(opiate peptides)。这些多肽能够逆转流体分泌和腹泻。

最近描述的抑制分泌因子(AF)部分地从猪垂体腺中得到纯化并显示逆转由多种肠毒素诱导的病理性分泌。母猪奶中高水平的AF保护哺乳小猪免受新生腹泻。

抗菌药已广泛地在人和兽医药中用于腹泻治疗。它们也用作猪、小牛及小鸡的饲料添加剂。然而，由于抗性细菌在消化道中迅速形成，抗肠炎抗生素的使用一般不被接受进人类药物中且它们的使用在兽医药中也减少。

其它的止泻剂抵消肠系膜的分泌。由于这些药物是针对宿主动物的，故抗药性形成不可能。这类药包括神经活性药如苯硫胺素(phenothiamines)和硫呫吨(thioxanthenes)。由于一些严重的副作用在大多数国家不接受这类药用于治疗腹泻。其它药物有鸦片制剂的衍生物如可待因和loperamide。由于这些药物主要通过抑制肠的活动性(mobility)而起作用，故它们也抑制消化道中病原菌的清除且肯定不应推荐为抗痢疾杆菌或寄生虫。最近已引入抑生长素衍生物，但由于药物施用的困难和与生长内分泌调节可能的相互作用，到目前为止仅具有有限的使用。

由于获得纯化抑制分泌因子蛋白的困难，该因子到目前为止还没有直接用于治疗腹泻和营养不良。然而，在施以特定食物(SE Patent No.9000028-2)的家养动物中诱导类似的蛋白是可能的。施以这种饲料的猪获得高水平的AK样蛋白且与匹配的对照相比及生长速率有显著的提高。用艰难梭菌毒素A攻击的大鼠中的AF不仅保护其抑制肠的分泌而且免受消化道发炎和出血。

本发明的主要目的是提供一种新的重组蛋白和其同源物及其片段(肽)用于使病理性流体的运输正常化。这些蛋白和肽统称为抑制分泌因子(AF)。AF的使用也部分抑制、或完全排除各种病因炎症反应的形成。恢复到正常(流体运输或炎症)通过使用蛋白或肽加以获得。此外AF蛋白或肽通过各种粘膜有效地吸收而不丢失活性(当与静脉内用药相比较时)。因此，存在多种处方，并且正确地施用蛋白或肽使迅速重建紊乱流体(水和离子)的平衡、炎症反应或者同时重建二者成为可能。

总之，重组AF(rAF)和其同源物及片段可用于免疫检测、作为饲养动物的饲料添加剂和止泻剂以及抗包括水肿、脱水和/或炎症疾病的药物。

本发明的目的如下：

基本上具有由SEQ ID No.1中显示氨基酸序列的重组蛋白或其同源物或片段。

显示于SEQ ID NO.1中重组蛋白的片段，该片段选自包括SEQ IDNO.1中显示氨基酸序列中下面的氨基酸序列：

a)氨基酸nos.35-42

b)氨基酸nos.35-46

c)氨基酸nos.36-51

d)氨基酸nos.36-80

e)氨基酸nos.1-80

肽X₁VCX₂X₃KX₄R相应于包括显示于SEQ ID NO.1重组蛋白中no.35-42氨基酸的片段，其中X为I或空缺，X₂为H、R或K，X₃为S、L或别的中性氨基酸且X₄为T或A。

抗体，抗基本上具有SEQ ID NO.1中显示氨基酸序列的重组蛋白或其同源物或其片段。

结合抗体的蛋白，该抗体对基本上具有SEQ ID No.1中显示氨基酸序列的重组蛋白或其同源物或其片段是特异性的。

用于使病理性流体运输和/或炎症反应正常化的组合物，包括有效量的基本上具有SEQ ID NO.1中显示氨基酸序列的重组蛋白或同源物或其片段作为活性成分。

基本上具有SEQ ID NO.1中显示氨基酸序列的重组蛋白、同源物或其片段用于制备使病理性流体运输和/或炎症反应正常化的组合物。

用于使脊椎动物动物病理性流体运输和/或炎症反应正常化的饲料，其中包括基本上具有SEQ ID NO.1中显示氨基酸序列的重组蛋白或同源物或其片段，或者能够产生这种蛋白或同源物或其片段的生物作为活性剂。

使脊椎动物病理性流体运输和/或炎症反应正常化的方法，包括向脊椎动物施用有效量的基本上具有显示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白或同源物或其片段，或者产生所述蛋白或同源物或片段的生物。

抗基本上具有显示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白或同源物或其片段的特异性抗体用于检测生物体中所述蛋白或片段。

编码基本上具有显示于SEQ ID NO.1中的序列的重组蛋白或同源物或其片段的核酸。

编码基本上具有显示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白或同源物或其片段的核酸用于制备相应蛋白或同源物或其片段。

源自编码基本上具有显示于SEQ ID NO.1中序列的重组蛋白或同源物或其片段的核酸的探针或引物用于检测生物体中核酸的存在。

包括编码基本上具有显示于SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白或同源物或其片段的核酸的载体。

除了人类以外的宿主，其包含有编码基本上具有显示于SEQ IDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白或同源物或其片段的核酸的载体。

除了人类以外的生物品种、它能够产生基本上具有显示于SEQ IDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白或同源物或其片段。

作为能够产生重组蛋白使用的生物体可由不同类型的生物体所组成，如重组细菌和真核生物，如酵母、植物和除人类以外的脊椎动物。

尽管尝试了10年通过常现的生化技术纯化AF，但还不可能获得均一形式的AF。然而，通过一种新的制备半纯AF的方法通过免疫组化方法用于免疫和筛选抗血清筛选到一种合适的抗血清。用这种抗血清在大肠杆菌中克隆表达AF的重组人类cDNA是可能的。

该新cDNA序列被测定并显示出为独特的。通过该序列信息，构建与人类和猪垂体RNA杂交的寡核苷酸探针。约1400个碱基对的该RNA的大小符合包括1309个碱基对测序cDNA的大小加上多聚(A)尾部。已显示大鼠垂体腺的部分cDNA序列与人类的cDNA一致反映不同种AF基因为保守的普通结构。该相似使应用相同的寡苷酸探针从不同种中鉴定编码AF的RNA和DNA成为可能。

此外表达生物活性形式的rAF是可能的。与谷胱甘肽S-转移酶呈融合蛋白形式的AF蛋白在大肠杆菌中大量表达并通过亲和层析纯化到均质。经凝血酶裂解融合蛋白后，重组AF(rAF)显示出极大的活性，44ng(10-12摩尔)导致大鼠肠中霍乱毒素诱导的流体分泌的半最大化(half-maximal)抑制。

通过基因技术制备更小的rAF片段。显示其活性在于由7到8个氨基酸所组成的小序列。这借助于化学固相合成加以证实，通过该技术制备出八肽并且显示出基于相同的摩尔数其与rAF几乎具有相同的生物活性。在定点合成的帮助下构建多种活性位点内的序列并显示替代某些氨基酸，而没有消除生物活性是可能的。

通过肠袢环模型(intestinal loop model)测量流体分泌：小肠节段(袢环)通过两条缝合线(satures)连接；在袢环中注射一定量的肠毒素。如果测试抑制分泌药物将它们在毒素攻击的一小时前和二小时后之间注射。注射通过三条不同的途径完成；静脉内，肠内和鼻内。毒素攻击后5小时流体在袢环中积累。根据每厘米肠积累流体的重量计算分泌。

既直接通过氨基酸测序又间接通过从cDNA序列的推导测定蛋白的序列。

重组AF似乎产生很少的毒性或系统效应，因为在施予高于导致半最大化抑制100倍的剂量的大鼠中没有注意到明显的毒性反应。由于注射于小肠中时其是有效的故可以口服施用。

与被测试的似乎是仅当在毒素接触注射时有效的天然AF制剂相反，重组AF在毒素攻击后注射时也抑制分泌。因此，rAF既可用于预防上又可用于治疗上。

此外，已显示rAF和其肽段抑制由艰难梭菌毒素A导致肠道中的细胞毒反应和炎症。借助于着色通透性测试显示rAF和其片段不仅在肠粘膜而且在调节脑流体压的plexus choroideus中逆转由霍乱毒素诱导的病理性通透性改变。

在兔子中制备抗rAF的抗血清并用于酶联免疫分析(ELISA)。此分析可用于测量身体流体或饲料中的AF。

通过琼脂糖偶联rAF柱的亲和层析纯化抗AF(天然或重组)抗体的方法报告如下。

该抗体对于通过免疫组化技术对组织中AF的检测和在Western-杂交中对AF的检测显示是有效的。

通过下面非限制性实施例加上伴随的附图现将更进一步描述本发明。

实施例1.制备用于cDNA克隆的抗AF抗体

通过琼脂糖上的亲和层析和等电聚焦方法从猪血中制备抑制分泌因子。向1升猪血(含有抗凝物质)中加入1g硫代硫酸钠和1mg苯甲磺酰氟。离心分离血细胞并将清彻的血浆经具有琼脂糖凝胶6B(发玛西亚LKB生物技术Stockholm)的柱洗脱，凝胶柱相应于约10％的溶液体积。以3倍柱床体积的磷酸缓冲盐(PBS＝0.15M Nacl，0.05M磷酸钠，pH7.2)冲洗后，将柱以2倍柱床体积溶解于水PBS中的1Mα-甲基-D-葡糖苷洗脱。将洗脱液浓缩并用“Ω10K flow through”滤膜(Filtron技术公司)在水中透析。随后将馏伤在400ml等电聚焦柱(LKB，瑞典)中pH4-6的两性电解质(发玛西亚)梯度中通过等电聚焦分离。收集具有4.7～4.9等电点的馏份并于PBS中透析。因此，将部分纯化的AF分成小的等份试样并用于按前述方法在兔中制备抗血清。

将兔免疫并测试其血清染色人类垂体腺切片中细胞内物质的能力(实施例6中描述的方法)。仅一种血清显示特异的且明显的细胞内染色而不染色细胞外基质蛋白。选择该抗血清用于筛选在大肠杆菌中表达蛋白的人垂体腺cDNA/λ噬菌体GT11文库。

实施例2.筛选人垂体腺和脑的cDNA文库

正常人垂体腺(源自从9个白种人库中获得的组织)的5′-段cDNA文库购自Clontech Laboratories。为了筛选该文库，将噬菌体以在大肠杆菌Y1090中每150mm盘中3×10⁴个噬菌斑形成单位涂板。将前述的抗猪AF的兔抗血清以0.5体积的大肠杆菌Y1090裂解液于23℃吸附4小时并稀释至1∶400的比例且根据Young和Davis(1)完成筛选。碱性磷酸酶交联的羊抗兔抗体用作2级抗体(Jackson)。挑取阳性噬菌斑洗脱入噬菌体悬液介质[20mm TrisHcl(pH 7.5)，100mM Nacl，10mM MgSO₄，2％明胶]，重新涂板并筛选，直到所有测试的噬菌斑均为阳性为止。

cDNA再次克隆-以Wizard Lambda Preps(Promega)分离AF重组子噬菌体DNA并以EcoRI消化。以Sephagles Band Prep试剂盒(发玛西亚)纯化插入子、再次按制造商所述克隆入pGex-1λT载体(发玛西亚)并转染到Epicurian Coli XL-Blue、Top 1细胞或BL 21细胞(三种均来自Stratagen)。没有特别说明时在BL21细胞中制备rAF或重组肽(rpeptides)(2)。

通过PCR的cDNA扩增-为了获得丢失的cDNA5′-末端进行一种称为RACE(cDNA末端的快速扩增)的基于PCR的方法。产生具有连接到人类脑cDNA分子3′-末端的锚定寡核苷酸的5′-RACE-即用cDNA的修饰RACE方法购自Clontech Laboratories。用互补于锚定物的5′引物和2条嵌套式(nested)基因特异性3′PCR引物A和B(A＝碱基429-411且B＝碱基376-359)；图(a)从5′-RACE-即用cDNA中用两步PCR扩增步骤来扩增5′-末端。为了表达相应的肽并测试它们的生物学特性进一步扩增各种更小部分的RACE片段。在这些寡核苷酸片段和它们相应肽的头部和尾部碱基和氨基酸的位置显示于表1。猪和牛cDNA(Clontech Laboratories)用作扩增相应于表1中N3片段的模板。序列变异也通过定点诱变人工插入，其中合成了相应于位置168-193的各种寡苷酸以逐一替代氨基酸35-42(如SEQ ID No.1中显示的位置)。通过用植入锚定物中的EcoRI位点和基因特异性引物将扩增的DNA片段克隆入pGex-1aT载体。为了验证通过RACE方法而获得的序列，用含有额外EcoRI-切割位点的引物对C/D(图1b)扩增人类垂体腺和脑的双链cDNA(Clontech)。设计引物以允许整个开放阅读框(ORF)被扩增。以EcoRI消化预其大小的垂体和脑PCR产物，分离并克隆入质粒pGex-1λT载体。

DNA测序和寡核苷酸-质粒pGex-1λT的DNA用作模板用于通过双脱氧链终止方法用测序酶2.0做试剂盒(美国生化公司)对插入子进行测序。拷贝紧接于插入DNA上游和下游pGex-1λT区域的起始正向和反向引物获自发码西亚。随后的引物根据获得的序列信息合成(Scandinavian基因合成AB)。为了避免在5′-RACE方法中Taq聚合酶的碱基改变将三种不同的PCR克隆测序。

通过用MacVector 4.1(Eastman化学公司)编辑和分析核苷酸序列及推导的蛋白序列数据。为了预测cDNA插入子相应的氨基酸序列，比较不同阅读框密码子的使用并得出一个大的并放阅读框。通过用Entrez CD-ROM盘(美国生物技术信息中心，Bethesda，美国)完成DNA和蛋白序列的查询。

分子克隆和cDNA序列的分析-猪的多价抗AF蛋白抗血清用于筛选人类垂体腺cDNA。分离两个表达免疫反应AF的克隆，从噬菌体λ中营救出来并按发码西亚提供的试剂盒中的描述将其重新克隆λ载体pGex-1λT的EcoRI位点。限制性分析分别得到1100和900bp大小的插入子。两个克隆的DNA-测序显示除了一个替代外同源性是完全的(图1，在位置1011C替代T)。克隆2-5′端上游序列通过RACE方法获得。该片段具有376bp的总长度(不包括5′-末端的合成核苷酸臂)。全长重建cDNA含有1309个碱基对接着一个多聚A尾部，其接着一个多聚A信号(图1，位置1289-1295)。鉴定出1146 bp(位置63-1208)的开放阅读框(ORF)。

实施例3.哺乳动物AF蛋白在重组质粒中的表达

融合蛋白的纯化和构建-通过免疫学筛选和全长cDNA的PCR扩增而获得的cDNA-克隆连接到pGex-1λT。该载体允许外源蛋白融合到Schistosoma japonicum 26KDa谷胱甘肽S-转移酶(GST)的C-末端而在大肠杆菌中表达，谷胱甘肽可在非变性条件借助于发码西亚提供的试剂盒加以亲和纯化。简言之，以重组pGex-1λT质粒转化的大肠杆菌过夜培养物稀释于新鲜培养基中并于37℃进一步培养3小时。通过0.1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导蛋白表达，并经30℃进一步培养4小时后，沉淀细胞并重悬于PBS。将细胞通过超声裂解，以1％Triton x-100处理并以12000×g离心10分钟；含有表达融合蛋白的上清通过将裂的液经谷胱甘肽琼脂糖(发码西亚)加以纯化。融合蛋白或者通过以无谷胱甘肽的竞争洗脱或者以10U的牛凝血酶切割过夜以从GST亲和尾部去除AF-蛋白。用pGex质粒和纯化重组蛋白或肽的整个方法通过发码西亚提供的试剂盒方法加以完成。

重组AF蛋白的序列和大小—为了证实编码序列，通过用PCR扩增垂体和脑的cDNA而分离全长转录子。用引物对C/D，分离1215bp的与克隆4序列一致的序列(图-1)。该开放阅读框编码具有41.14KDa计算分子量和4.9计算PI的氨基酸。

将AF克隆1、2和3以及寡核苷酸N1-N5(图-1和表1)连接到pGex-1λT质粒载体从而使ORF在谷胱甘肽S-转移酶(GST)蛋白的阅读框内。该构建体转化λ大肠杆菌，并以IPTG诱导融合蛋白的表达。用抗猪抑制分泌因子的抗血清将纯化的融合蛋白和凝血酶切割的AF蛋白或肽进行SDS-PAGE并进行Western印迹(图2)。蛋白的考马斯亮蓝染色显示出每种蛋白的分离带，除了GST-AF-1蛋白被证明降解成更小的成分。

固相肽合成一个应用系统肽合成仪中的固相上制备(K.J.Ross-Petersen AS)更大的肽(表1中的P₇到P₈)。根据用于水/乙腈中0.1％三氟乙酸的线性梯度于Deltapak C18，300A中的反相HPLC估计每种肽的纯度为93-100％。

氨基酸测序-为了进一步证实鉴定的ORF进行蛋白序列分析。将纯的AF蛋白在10％大板(macro-slab)凝胶SDS-PAGE(14)中走胶并通过电印迹(伯乐)将蛋白转移至Problot膜(应用生物系统)上。通过Ponceau S染色观察到的点从印迹中切下并通过自动Edman降解于自动测序仪(应用系统)上测序蛋白的前20个氨基酸。

测定克隆-2和克隆-3的N-末端序列并显示分别与预期序列的63-75和130-140氨基酸完全匹配。

与从GenBank中得到的其它蛋白序列相比较显示rAF序列(图1)在其所有部分中都是独一无二的且没有报导类似的序列。

当根据Kyte-Doolittle分析时该蛋白的起初10个残基似乎是相对疏水的且可能构成信号肽，其在蛋白的细胞外分泌之前被切除。这种解释由Western印迹分析所支持(图3)，其中重组蛋白似乎较从垂体腺中提取的蛋白具有略高的分子量。然而，这些差异中的有些也可能是由于在重组蛋白中构成融合蛋白的凝血酶切割位点的额外5个氨基酸所致。

实施例4.制备和测度抗rAF抗血清

抗重组GST-AF融合蛋白的抗血清-在兔子中制备用于ELISA、Western印迹和免疫组化研究的抗纯化融合蛋白GST-AF-1、GST-AF-2和凝血酶切割的纯AF-1蛋白(＝rAF)抗体。每只兔子施以1mlPBS中100μg抗原混合以等体积的Frend氏完全佐剂；每次免疫分8-10部分注射于背部皮内。在第3和第5周注两次具有50μg抗原的增强剂量，最后一次没有Frend氏完全佐剂。最后一次增强免疫6天后将兔放血并制备血清贮存于-20℃。以点印迹分析测试血清的敏感性。将GST-AF-2应用于1/5稀释液中的ECL硝酸纤维素膜，并将抗血清稀释1∶1000。将该膜以PBS中1％的牛血清蛋白(BSA)于4℃封闭16小时，并且然后与兔抗-GST-AF的1∶800稀释液或猪AF抗血清孵育1.5小时。用碱性磷酸酶交联的羊抗-兔免疫球蛋白接着以5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐和P-硝基蓝四唑鎓(宝灵曼)形成印迹。在该测试中估计抗原检测的极限为约1ng。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹-人类和猪垂体腺提取物和纯AF-蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在10％的丙烯酰胺微板胶中完成，基本上按Laemmli(4)的描述，具有以下的修改，即以相应的摩尔数以N，N′-二烯丙基酒石二酰胺(diallyltartardiamide)替代作为交联物的双丙烯酰胺(bis-acrylamide)。派若宁(Pyronin Y)(Sigma)用作电泳前沿标记。预染的分子量参照购自BDH。然后将蛋白或者以考马斯亮蓝染色或电泳转移至0.45mm孔径的ECL硝酸纤维素(Amersham)用于免疫印迹。随后与BSA的孵育、交联抗-IgG和磷酸酶底物与前述用于点印迹的方法相同。

按上述考马斯亮蓝染色显示出没有GST-AF-1蛋白的分离带，这也许是由于蛋白水解降解成更小的成分。然而，在Western印迹分析中全长蛋白较降解产物得到强得多的信号(图2b)。与抗猪AF抗血清的强烈反应显示该重组蛋白的确与AF具有相同的免疫反应性。全长蛋白的分子量似乎约60KDa，其高于根据氨基酸组成估计的41139Da的真实摩尔重量(true mol.wt)。此外，该蛋白也以产生的抗GST-AF-2并结合到凝血酶切割蛋白上的抗血清进行免疫印迹和检测(图3)。

抗重组GST-AF-2抗血清与表观分子量为60KDa的自然产生AF蛋白和一些更小的成分(可能为酶促降解产物)起反应(图3a)。

AF-浓度的ELISA测定-根据前述方法(5)用抗-AF-1和抗-AF-2进行ELISA分析。如图3b所示，以粗抗血清测试的灵敏度在1-10μg之间而以亲和纯化抗体测试具有5-50μg蛋白的灵敏度。

实施例5.垂体腺RNA的Northern印迹分析

Northern印迹分析，人类垂体腺获自sahlgrenska医院死后的病人(postmortem)(得到瑞典健康委员会允许；2§transplantationslagen，1975：190)。为了获得RNA，以硫氰酸胍RNA根据Chomcynski和Sacchi(6)提取垂体腺。多聚腺苷酸化RNA通过商业上可得到的试剂盒(发玛西亚)用Ohigo dT-纤维素柱加以筛选。此外，使用了购自Clontech 107个个体的人类垂体mRNA库。5μg的每种poly(A+)RNA样品以乙二醛处理并在1.2％的琼脂糖凝胶中电泳(7)。在0.05M NaOH中毛细碱性转移3小时至HybondN⁺尼龙膜(Amersham)后，预杂交和杂交每个于42℃进行24小时。杂交液中含50％的甲醛，5×SSPE，10×Denhard’s溶液并具有250μg/ml变性低分子量DNA和50μg/ml多聚腺苷酸。印迹以四种不同的反义28bp寡核苷酸检测，包括序列(图1)中的位置132-105(引物E)，297-270(引物F)，748-721(引物G)和833-806(引物H)；探针以末端转移酶(宝灵曼)加上[α³²P]ddATP(Amersham)进行3′末端标记并于Nick柱(发玛西亚)上纯化。以5×SSPE/0.1％SDS-0.5×SSPE/0.1％SDS于42℃洗5次，每次30分钟。最后重复洗一次。将滤膜与Hyperfilm MP(Amersham)曝光7天。

在垂体腺中的表达-以与克隆的cDNA不同序列杂交的四种寡核苷酸探针的混合物进行Northern印迹分析(图4)。在垂体腺分离的mRNA中探针与约1400bp的单个带杂交。以人为材料获得了最强的信号，但猪材料也交叉反应。

实施例6.垂体腺切片中AF的分布

物种及组织-人类垂体腺获自Sahlgrenska医院的死后病人(得到瑞典健康委员会允许；§2 transplantationslagen，1975：190)。腺体除了用于组织学检查的外冷冻于-70℃，组织学检查的于溶于磷酸缓冲盐中(PBS＝0.15M Nacl，0.05M磷酸钠，pH7.2)4％的多聚甲醛中固定24小时并之后转移至7.5％PBS中的蔗糖中。获自屠宰场5-7月龄的猪垂体腺在运输过程中置于干冰上且直到使用前保持冰冻于-70℃。2-3月龄的Sprague-Dawley大鼠获自瑞典Bsck大学AB，Sollentuna。用于免疫的兔子(New Zealand White(获自瑞典的LidkopingKaninform)。

免疫组化-将固定过的垂体腺冰冻于液氮中并制备7μm厚的冰冻切片。每个样本中包括腺体不同部分的5-10张切片固定于显微镜载玻片上。将切片用5％脱脂奶粉封闭并与1∶4000-1∶8000稀释的第一兔抗血清(抗-GST-AF-2融合蛋白)于湿室中于4℃孵育过夜。以缓冲液冲洗后，将标本与碱性磷酸酶-交联的1∶50稀释的猪抗兔免疫球蛋白(Dako A/S)于23℃孵育1小时。按别处所述(8)以磷酸酶底物观察免疫反应。对照切片与以过多GST-AF-2蛋白或以除第一抗体以外的所有孵育步骤吸附的免疫血清一起孵育。

垂体腺切片中AF的分布人类垂体腺切片中AF的分布以免疫组化技术加以研究(图5)。在所有研究的标本中，腺垂体中适当数目的细胞被染色；免疫染色的物质似乎位于细胞质中的颗粒中；以过多GST-AF-2蛋白免疫血清的预吸附(Preabsorption)抹去了信号。在后部分(神经垂体)中没有观察到染色。

在垂体腺中免疫反应物质的分布证明仅在前叶(腺垂体)的分泌细胞中有AF的细胞内分布。从该叶中释放的蛋白包括生长激素、促甲状腺素、催乳素和黄体生成素。这些激素从细胞内位置到血管系统的通路由下丘脑中神经内分泌细胞产生的释放因子所激发。

实施例7.rAF的生物学活性

抑制分泌活性、在前述的大鼠肠袢环模型中测量抑制分泌活性(9)。将空肠袢环用3μg霍乱毒素攻击。用霍乱毒素攻击之前或之后注射不同剂量的纯化AF-1-蛋白或PBS(对照)。5小时后记录肠袢环中积液的重量(mg/cm)。每种AF制品在至少六只大鼠中测试。Fisher’sPLSD用于数据的统计分析。

rAF蛋白的生物学活性-在大鼠模型中测试大肠杆菌中产生的克隆-1纯rAF蛋白的生物学活性。在肠用霍乱毒素攻击之前20-30秒静脉内注射时rAF抑制肠流体分泌的能力显示于图6。在仅以缓冲液注射的对照动物中，霍乱毒素导致明显的分泌，每cm肠412±9mg流体。纯rAF导致与对缓冲液反应明显不同的霍乱分泌剂量依赖性抑制(P＜0.01，n＝6)。9ng克隆-1蛋白足以减少反应34％，而44ng(10^-12mol)和220ng分别减少反应46％和78％。重组AF的生物学活性大于任何我们已知的肠毒素的生物学活性且大于任何改变水和电解质运输肠激素或神经肽的生物学活性。此外，人类rAF在大鼠中的活性水平惊人地高，这也许反映在不同物种rAF分子中保守的普遍结构。此假说由在Western印迹和Northern印迹分析获得的人类与猪材料的交叉反应性所支持。

在霍乱毒素攻击前20-30秒和攻击后90分钟静脉内注射时0.5μg rAF抑制肠分泌的能力进行了比较(图7)。与对照动物相比两次施用得到了显著的抑制(P＜0.01，n＝6)。因此，与天然AF相比，当毒素攻击后施用时重组蛋白也有效，这使得rAF对腹泻的治疗是有用的。

将3μg的rAF注射入8-10cm长的袢环中，该环位置紧邻用霍乱毒素攻击的环。rAF在毒素攻击前20-30秒或之后90分钟被诱导。在图8中显示与对照组相比两个测试组获得了流体分泌的显著减少(P＜0.01，n＝6)；两个测试组之间没有观察到差异。该实验表明rAF在口服后是有活性的并且如果没有获得严重的副作用可用作动物饲料添加剂。

在上述实施例中，rAF在Epicurian Coli XL-1细胞中制备。在这些细胞中许多制备的rAF被降解成更小的肽。当rAF在BL21细胞中制备时仅小部分rAF被降解而在Topl细胞中没有观察到降解。令人惊奇的是生物学活性与降解程度成比例，即，更多的降解导致更高的活性。因此制备各种较短的片段以测试它们可能的生物学活性。

如表1中所示。在霍乱毒素攻击之前按前述用于完整rAF相同的方法静脉内测试这些片段。测试克隆2和3表达的0.1，1和10μg量的肽对毒素反应没有影响。相反由RACE片段(克隆4)表达的1微克肽具有显著的效应。从RACE片段中制备许多较短的构建体并在pGex-1-λ中表达。如表1中所示，发现活性位点位于氨基酸残基35到51之间。为了更准确地测定活性位点通过固相肽合成制备三段小肽。它们中的两个是有活性的，肽35-46(P3)和肽35-42(P1)；后者的八肽IVCHSKTR(P1)在不到1ng的剂量与相同摩尔数(in a molar basis)的完整rAF几乎具有相同的活性。相反较短的六肽VCHSKT(P2)当于1ng和10μg之间的剂量测试时没有效应。

相应于人类片段P1但具有某些改变和/或缺失的肽X₁VCX₂X₃KX₄R也通过定点诱变加以制备并测试其生物学活性。牛和猪cDNA序列也进行了比较。这些研究显示出下面的改变和/或缺失：

X₁为I或缺如

X₂为H，R或K

X₃为S，L或别的中性氨基酸

X₄为T或A。

表1

编号	寡核苷酸^*	肽^**	霍乱分泌抑制^***	pmol ED50
编号	寡核苷酸^*	肽^**	霍乱分泌抑制^***	pmol ED50	N1	63-301	1-80	+	4
N2	168-301	36-80	+	6	N1	63-301	1-80	+	4
N2	168-301	36-80	+	6	N3	168-215	36-51	+	3
N4	122-170	21-36	-		N3	168-215	36-51	+	3
N4	122-170	21-36	-		N5	186-269	42-69	-
P3	S.P.S.^****	35-46	+	7	N5	186-269	42-69	-
P3	S.P.S.^****	35-46	+	7	P1	S.P.S.	35-42	+	5
P2	S.P.S.	36-41	-		P1	S.P.S.	35-42	+	5

^*在从AF cDNA和pGeX-1-λ中制备的构建体中表达的SEQID NO.1中的碱基对位置

^**合成肽的起点与末端在AF中氨基酸残基的位置(SEQ IDNO.1)，

^***在连接的大鼠肠袢环中霍乱毒素诱导的流体分泌的抑制；导致半最大化抑制(ED50)的量(pmol)指活性肽。

^****这些肽通过固相合成制备。

在肠粘膜中rAF对炎症的效应也在大鼠肠袢环模型中加以测试。因此，将20只大鼠用0.5μg艰难梭菌的毒素A(10)攻击并分别于2.5和5小时后(10+10只大鼠)测量炎症和流体分泌。每组大鼠中一半在攻击前30秒静脉内接受100ng rAF；另一半接受PBS缓冲液作为对照，杀死大鼠后，解剖出袢环，并将袢环中部的2-3cm部分冷冻于干冰上。然后通过用Leica cryostat将冷冻标本切成8μm厚的切片。染色切片以通过酶组织化学显示碱性磷酸酶。碱性磷酸酶通过肠上皮细胞表达且染色允许对肠上皮组织整合的估计。

结果显示(图9)对照大鼠显示出肠粘膜广泛的损伤：2.5小时后观察到上皮细胞从基底膜脱落以及坏死的组织，而5小时后观察到广泛的出血。相反，以rAF处理的动物没有形成脱落坏死或出血。毒素A诱导的流体分泌也在2.5小时后从199±4抑制到137±5mg/cm(P＜0.01)且6小时后从421±3抑制到203±6mg/cm(5只大鼠/组，P＜0.01)。

以0.5μg肽IVCHSKT(＝P1)替代rAF蛋白进行了类似的实验。该八肽得到了对毒素A-诱导的肠炎和流体分泌相同的效应如图9所示。

毒性，为了测试rAF的毒性，以50μg每只大鼠的高剂量注射。在一周的观察期间没有记录到明显的毒性反应。

实施例8 rAF对肠通透性的生物学活性

为了评估rAF对溶于血液中有机物质通透性的效应，根据前述方法(11)进行以Evans蓝染色的测试。实验起始按上面实施例7和图5所述完成，在霍乱毒素攻击前静脉注射rAF。然而，没有测量到流体分泌但毒素攻击后90分钟将PBS中1ml 1.5％的Evans蓝染色液静脉内注射。允许染料循环5分钟的时间。之后将大鼠在醚麻醉状态下以200ml 4℃的PBS/Alsevier’s(1/1比例)溶液在约150秒期间经左心室-右心房进行跨心脏灌注(transcardial perfusion)(用蠕动泵[Cole ParmerInstruments，Chiacago，Ill.，美国])。施行该方法是为了去除所有存在于血管系统中的EB，仅留下EB在肠组织中以通过染料的甲醛提取加以检测。

在表2中的结果显示CT-攻击显著(P＜0.01)增加可从肠组织中提取EB的量，约43％，而在霍乱毒素攻击之前静脉注射1BrT阻止这种增加，即，组1中(对照)从组织提取EB的量与组3(1rAF+CT)没有差异。

表2

组攻击 ng EB/g肠组织×10^-07 ％ EB-konc的增加

1 PBS+PBS 6 29.3±1.0 -

2 PBS+CT 6 51.8±1.3 43(P＜0.001)

3 1rAF+CT 6 29.6±1.5 0NS

显示在图10和11中的结果显示在肠用霍乱毒素攻击后，在具有或不具有以PI(IVCHSKTR)对大鼠的预处理的情况下在小肠或大脑侧室相应的脉络丛中偶氮染料Evans蓝的外渗(extravasation)。

实验以下面的方式完成：重350g的雄性Sprague-Davley大鼠在实验前饥饿18小时，但自由进水。大鼠用于六只的组。根据表3施用肽P1、霍乱毒素(CT)和PBS。

表3

组 iv ing 1^* po.inj^* iv.inj.2^*

A P1 CT EB

B PBS CT EB

C PBS PBS EB

^*P1(iv.)注射1施以2mlPBS体积，经口腔(po.)注射施以5ml体积，静脉内注射2由溶于PBS的1.5ml 3％Evans蓝所组成。在所有注射过程中醚用于麻醉。

P1(0.5μg)或PBS的i.v注射在以100μgCT或以PBS的口腔攻击前10-15秒进行；口腔攻击60分钟后，将大鼠以醚麻醉并以Evans蓝注射。允许染料再平衡30分钟，之后将大鼠再次以醚麻醉并以250ml Alsevers溶液/PBS＝50/50经左心室心内灌注以去除存在于血管系统中所有的染料。此约2-3分钟中完成的灌注处理以后，记录到的荧光应该代表仅存在于外周血管系统的染料。

取样大脑和部分小肠并于干冰上冷冻且制备8μm厚的冰冻切片(cryostat sections)。将切片空气干燥并固定于含二甲苯的固定介质中。用与用于若丹明(rhodamin)发射荧光相同的滤片(filter)组合用Zeiss荧光显微镜观察切片。

图10和11中的结果显示荧光密度(白色)在组A(P1 iv+CTpo)和C(PBS iv+PBS po)中在小肠(图10)和脉络丛(图11)中具有相似的大小。与组B(PBS iv+CT po)中的小肠及脉络丛中的高荧光强度相比，该结果清楚地显示在毒素攻击前注射八肽抑制CT-诱导的Evans蓝的血管外穿透。该结果表明该结果不仅在小肠的血管系统中如此，而且在大脑侧室的脉络丛中也是如此。

结论：静脉内八肽IVCHSKTR的施用效应抑制小肠及中枢神经系统脉络丛中霍乱毒素诱导的Evans蓝血管外穿透。因此，rAF和其肽衍生物的作用不仅仅局限于小肠，而且影响中枢神经系统血管的通透性。这些发现表明rAF和其肽衍生物可用于逆转病理性质内压、中耳内的压力改变和血管中各种形式的通透性变化。

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附图说明

图1a和相继的图1b，新的人类蛋白的核酸序列和推导的氨基酸序列。证实的氨基酸序列下被划线。

图1c显示克隆cDNA和寡核苷酸引物的水平图谱。

图2考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶(A)和以抗猪AF抗血清检测的免疫印迹(B)。不带有单引号(unprimed)数字的泳道含有谷胱甘肽-琼脂糖-纯化的GST-AF融合蛋白AF-1，AF-2和AF-3，而带有单引号(primed)数字的泳道含有以凝血酶切割的融合蛋白。分子量参照(R)，(BDH)显示于左侧。GST-AF-1融合蛋白被高度降解但免疫印迹分析仅显示全长蛋白和自发性凝血酶切割产物的检测。在GST-AT-3蛋白中有26KDa的产物，可能是已独立表达的谷胱甘肽S-转移酶尾部。

图3a用抗重组蛋白AF-2抗血清的Western印迹。在左侧，使用的为猪(P)和三个人类(H1，H2，H3)垂体腺；且在右侧，使用的为三个重组蛋白AF-1，AF-2和AF-3(见图2)；中部为分子量标准(R)。

图3b用在兔子中产生的粗抗血清和亲和纯化的抗体对rAF的酶联免疫分析(ELISA)。

图4人类和猪垂体腺RNA Northern印迹的放射自显影CP：混合的(Pooled)且i＝个体材料)。每道(basin)中使用了5μg纯化mRNA；使用3’-末端标记的寡核苷酸探针且7天后放射自显影显色。

图5以抗重组蛋白GST-AF-2抗血清染色的腺垂体的冻冻切片。A.与免疫血清孵育的切片显示具有不同程度阳性免疫反应性的分散细胞(实心箭头)。许多细胞完全缺乏染色(空心箭头)。B.与从过量重组蛋白GST-AF-2预吸附的免疫抗血清孵育的A系列切片(Serial sections to A)，没有细胞的特异性染色。C和D。显示内分泌细胞细胞质染色的免疫阳性细胞的较大的放大。n：核，c＝细胞质。

图6测试霍乱毒素诱导的流体分泌抑制的重组蛋白AF-1的生物学活性。不同级别剂量的蛋白于大鼠静脉内注射；将3μg霍乱毒素注射到肠袢环中；5小时后测量袢环中的积液(mg/cm肠)。每个值代表6只动物一组的平均值±S.A.E。

图7静脉内注射rAF-1的生物学活性；在用3μg霍乱毒素攻击前20-30秒或90分钟后施用0.5μg rAF于大鼠肠袢环中。

图8管腔内(intraluminarly)注射rAF-1的生物学活性；在用3μg霍乱毒素前20-30秒或90分钟后将3μgrAF注射λ大鼠肠袢环中；在相邻于被注射毒素的袢环约5cm处注射rAE。

图9A(×2.5)为对照(PBS)环，显示肠腔(L)内的细胞碎片，但剩余的粘膜没有染色，这表明上皮内衬(Lining)的完全破坏。B(毒素攻击前0.5μl P1)显示形成绒毛的清晰排列的上皮内衬，表明受保护的且正常的肠粘膜。L＝肠腔。横线＝500μm。C(×10)显示在PBS处理的对照组中破坏的粘膜，和D显示在实验(P1-处理)组中相应的粘膜。黑箭头指向上皮衬里，LP＝固有层，mm＝肌肉粘膜，空心箭头指向隐窝(Crypt)细胞。横线＝100μm。E(×2.5)显示对照组(PBS-处理)中破坏的粘膜，且F显示在毒素攻击前经P1处理大鼠的相应放大。横线＝50μm。

图10以霍乱毒素(CT)或对照缓冲液(PBS)处理三组大鼠空肠标本的Evans蓝荧光；以抑制分泌肽P1或对照缓冲液(PBS)进行预处理。LP＝固有层。黑箭头表示上皮细胞衬里；空心箭头表示隐窝细胞。横线＝100μm。

图11显示于图10中大鼠脉络丛标本的Evans蓝荧光，横线＝50μm。

序列表

SEQ ID NO：1

序列类型：具有相应蛋白的核苷酸

序列长度：1309个碱基对加上多聚(A)尾部

链型：单链

拓扑学：线性

分子类型：cDNA

最初来源生物：人类

立即表达来源：垂体腺

特征：从63到1208为成熟蛋白

从1289-1295为多聚(A)信号序列

AATTGGAGGAGTTGTTGTTAGGCCGTCCCGGAGACCCGGTCGGGAGGGAG

GAAGGTGGCAAG ATG GTG TTG GAA AGC ACT ATG GTG TGT GTG GAC AAC AGT 101

Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser＞

5 10

GAG TAT ATG CGG AAT GGA GAC TTC TTA CCC ACC AGG CTG CAG GCC CAG 149

Glu Tyr Met Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln＞

15 20 25

CAC GAT GCT GTC AAC ATA GTT TGT CAT TCA AAG ACC CGC AGC AAC CCT 197

Gln Asp Ala Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro＞

30 35 40 45

GAG AAC AAC GTG GGC CTT ATC ACA CTG GCT AAT GAC TGT GAA GTG CTG 245

Glu Asn Asn Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu＞

50 55 60

ACC ACA CTC ACC CCA GAC ACT GGC CGT ATC CTG TCC AAG CTA CAT ACT 293

Thr Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr＞

65 70 75

GTC CAA CCC AAG GGC AAG ATC ACC TTC TGC ACG GGC ATC CGC GTG GCC 341

Val Gln Pro Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala＞

80 85 90

CAT CTG GCT CTG AAG CAC CGA CAA GGC AAG AAT CAC AAG ATG CGC ATC 389

His Leu Ala Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Het Arg Ile＞

95 100 105

ATT GCC TTT GTG GGA AGC CCA GTG GAG GAC AAT GAG AAG GAT CTG GTG 437

Ile Ala Phe Val Gly Ser Pro Val Clu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val＞

110 115 120 125

AAA CTG GCT AAA CGC CTC AAG AAG GAG AAA GTA AAT GTT GAC ATT ATC 485

Lys Leu Ala Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile＞

130 135 140

AAT TTT GGG GAA GAG GAG GTG AAC ACA GAA AAG CTG ACA GCC TTT GTA 533

Asn Phe Gly Glu Glu Clu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val＞

145 150 155

AAC ACG TTG AAT GGC AAA GAT GGA ACC GGT TCT CAT CTG GTG ACA GTG 581

Asn Thr Leu Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val＞

160 165 170

CCT CCT GGG CCC AGT TTG GCT GAT GCT CTC ATC AGT TCT CCG ATT TTG 629

Pro Pro Gly Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu＞

175 180 185

GCT GGT GAA GGT GGT GCC ATG CTG GGT CTT GGT GCC AGT GAC TTT GAA 677

Ala Gly Glu Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu＞

190 195 200 205

TTT GGA GTA GAT CCC AGT GCT GAT CCT GAG CTG GCC TTG GCC CTT CGT 725

Phe Gly Val Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg＞

210 215 220

GTA TCT ATG GAA GAG CAG CGG CAC GCA GGA GCA GGA GCG CGG CGG GCA 773

Val Ser Met Glu Glu Gln Arg His Ala Gly Gly Gly Ala Arg Arg Ala＞

225 230 235

GCT CGA GCT TCT GCT GCT GAG GCC GGG ATT GCT ACG ACT GGG ACT GAA 821

Ala Arg Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu＞

240 245 250

GAC TCA GAC GAT GCC CTG CTG AAG ATG ACC ATC AGC CAG CAA GAG TTT 869

Asp Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Glu Glu Phe＞

255 260 265

GGC CGC ACT GGG CTT CCT GAC CTA AGC AGT ATG ACT GAG GAA GAG CAG 917

Gly Arg Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln＞

270 275 280 285

ATT GCT TAT GCC ATG CAG ATG TCC CTG CAG GGA GCA GAG TTT GGC CAG 965

Ile Ala Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln＞

290 295 300

GCG GAA TCA GCA GAC ATT GAT GCC AGC TCA GCT ATG GAC ACA TCT GAG 1013

Ala Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu＞

305 310 315

CCA GCC AAG GAG GAG GAT GAT TAC GAC GTG ATG CAG GAC CCC GAG TTC 1061

Pro Ala Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Met Gln Asp Pro Glu Phc＞

320 325 330

CTT CAG AGT GTC CTA GAG AAC CTC CCA GGT GTG GAT CCC AAC AAT GAA 1109

Leu Gln Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu＞

335 340 345

GCC ATT CGA AAT GCT ATG GGC TCC CTG CCT CCC AGG CCA CCA AGG ACG 1157

Ala Ile Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Pro Pro Arg Pro Pro Arg Thr＞

350 355 360 365

GCA AGA AGG ACA AGA AGG AGG AAG ACA AGA AGT GAG ACT GGA GGG AAA 1205

Ala Arg Arg Thr Arg Arg Arg Lys Thr Arg Ser Glu Thr Gly Gly Lys＞

370 375 380

GGG TAGCTGAGTCTGCTTAGGGACTGCATGGGAAGCACGGAATATAGGGTTAGATGTGTGT

Gly＞

TATCTGTAACCATTACAGCCTAAATAAAGCTTGGCAACTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Claims

1.一种蛋白，具有显示于SEQ ID NO.1中的氨基酸序列。

2.显示于SEQ ID NO.1中的蛋白的片段，该片段选自包括下面显示于SEQ ID NO.1中的氨基酸序列的组：

a)氨基酸nos.35-42

b)氨基酸nos.35-46

c)氨基酸nos.36-51

d)氨基酸nos.36-80

e)氨基酸nos.1-80。

3.相应于包括显示于SEQ ID NO.1中的蛋白氨基酸no.35-42片段的肽X₁VCX₂X₃KX₄R，其中的X₁为I或不存在，X₂为H、R或K，X₃为S、L或别的中性氨基酸且X₄为T或A。

4.如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽，其是通过重组方法获得的。

5.如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽，其是通过合成方法获得的。

6.对如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽特异性的抗体。

7.一种用于使动物包括人类的病理性流体运输和/或炎症反应正常化的组合物，包括有效量的如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽作为活性成分。

8.如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽用于制备使动物包括人类的病理性流体运输和/或炎症反应正常化的组合物的用途。

9.一种用于使脊椎动物中的病理性流体运输和/或炎症反应正常化的饲料，包括如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽作为活性剂。

10.针对如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽的特异性抗体用于检测生物体中所述的蛋白、片段或肽的用途。

11.编码如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽的核酸。

12.编码如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽的核酸用于制备相应的蛋白、片段或肽的用途。

13.源自编码如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽的核酸的探针或引物用于检测生物体中该核酸的存在的用途。

14.载体，包括编码如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2所述的片段或如权利要求3所述的肽的核酸。

15.宿主细胞，包含如权利要求14所述的载体。

16.权利要求15的宿主细胞，其为细菌。