EP0342219A1 - Proteine homologue de l'angiogenine humaine - Google Patents
Proteine homologue de l'angiogenine humaineInfo
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- EP0342219A1 EP0342219A1 EP88910059A EP88910059A EP0342219A1 EP 0342219 A1 EP0342219 A1 EP 0342219A1 EP 88910059 A EP88910059 A EP 88910059A EP 88910059 A EP88910059 A EP 88910059A EP 0342219 A1 EP0342219 A1 EP 0342219A1
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Definitions
- the present invention relates to a new protein of about 17 KD, with angiogenic action, to its method of isolation from milk of mammals, to therapeutic compositions containing it, to a method of detection and / or of assay, as well as immunological reagents for detecting and / or assaying angiogenins in mammals, their homologs and their fragments.
- TAF Tumor angiogenesis factor
- Angiogenin isolated from human tumor cells comprises a single protein chain comprising 123 amino acids and the sequence of which is as follows:
- the C-terminal amino acid is proline; three disulfide bridges link cysteines 26-81, 39-92 and 57-107.
- human angiogenin is 35% homologous to that of human pancreatic ribonuclease, in particularly with regard to the amino acids essential for ribonucleolytic activity (cf. BIOCHEMISTRY, (1985), 24, 5494-5499. KURACHI et al.).
- the activity of human angiogenin is important, since 50 ng, or 3.5 picomoles, are capable of causing vascularization of the rabbit cornea and 35 fentomoles are capable of inducing vascularization of the chicken embryo.
- the present invention has therefore set itself the aim of providing a new protein having properties similar to those of human angiogenin, obtained by inexpensive means which are easy to implement, allowing high quantitative yields. It is also an object of the invention to provide a new process for obtaining said protein, which does not have the drawbacks of the processes of the prior art; in fact, this new process makes it possible to obtain large quantities of the protein in question at a very low cost, which, in the context of the industrial manufacture of pharmaceutical compositions containing this protein, has significant advantages. It is another object of the invention to provide pharmaceutical compositions containing said protein.
- the present invention relates to a protein, characterized in that it has a sequence which comprises 125 amino acids, and corresponds to formula I below: (I) Ala 1 -Gln-Asp-Asp-Tyr 5 -Arg -Tyr-Ile-His-Phe 10- Leu-Thr-Gln-His-Tyr 15 -Asp-Ala-Lys-Pro-Lys 20 - Gly-Arg-Asn-Asp-Glu 25 -Tyr-Cys-Phe-Asn -Met 30 - Met-Lys-Asn-Arg-Arg 35 -Leu-Thr-Arg-Pro-Cys 40
- the molecular mass was evaluated by comparing the speed of electrophoretic migration of said bovine protein with that of the following controls: myoglobin (MW: 17,200), myoglobin 1 + 2 (MW: 14,600), myoglobin A (MW: 8,240), myoglobin 2 (MW: 6,380), myoglobin 3 (MW: 2,560) (Pharmacia).
- said protein 17 KD, determined after total acid hydrolysis, the following amino acids are present in the following proportions: Phe: 6, Leu: 4, Ile: 9, Met: 2, Val: 4, Pro : 7, Ser s 6, Thr: 6, Ala: 4, Tyr: 6, His: 6, Glu (Gin): 10, Asp (Asn): 16, Lys: 9, Arg: 15, Gly: 9, Cys : 6.
- said protein is obtained by extraction of milk from mammals, in particular from cows or by cloning or by synthesis.
- the present invention also relates to peptides which constitute fragments of the 17KD protein according to the invention, it covers in particular:
- a peptide which has the following amino acid sequence: Phe-Asp-Glu-Ser-Phe 1 20 -Ile-Thr-Pro-Arg-His 1 25 and which corresponds to the C terminal fragment of the 17 KD protein
- Glu-Asn 110 -Gly-Leu-Pro-Val-His 115 -Phe which aligns with the sequence 108-115 of human angiogenin, in which sequence 7 of 8 residues are identical;
- peptide having the following amino acid sequence: Arg-Tyr-Ile-His-Phe 10 -Leu-Thr-Gln-His-Tyr 15 -Asp-Ala-Lys of which 11 of 13 residues align with the sequence 5-17 human angiogenin;
- peptide which has the following amino acid sequence: Leu 70 -Arg-Ile-Ser-Lys-Ser 75 -Glu-Phe-Gln of which 8 out of 10 residues align with the sequence 69-77 of angiogenin human.
- a peptide which has the following amino acid sequence: Arg 67 -Gly-Asp, said peptide being recognized by a receptor for endothelial cells.
- the present invention also relates to a process for obtaining said protein according to the invention, characterized in that said protein is extracted from mammalian milk, in particular from cow's milk.
- the extraction of said protein is carried out by cation exchange chromatography, followed by elution with an appropriate eluent.
- the eluent is an alkaline salt of a weak organic acid, in particular sodium acetate.
- the eluted fraction is subjected to a second cation exchange chromatography.
- the protein thus isolated is purified by chromatography on a gel-filtration column.
- the protein thus purified is obtained with a yield of the order of 0.5 mg / liter of milk.
- the milk of bovine origin is subjected to delipidation.
- defatting is carried out by centrifugation.
- the centrifugation is carried out at 4000 g for 30 min and at a temperature of 4oC.
- the present invention also relates to a therapeutic composition which comprises, as active compound, the 17 KD protein and / or fragments or homologues thereof, in particular for the treatment of disorders requiring inhibition or increased growth blood vessels.
- the therapeutic compositions in accordance with the invention can be used in all pathologies in which there is a problem of vascularization, and in particular wounds, bedsores, ulcers, grafts, circulatory insufficiencies. They can also be used in cosmetology (skin, scalp). They can also be used in the veterinary field, in particular in the diagnosis of mastitis and the selection of lactating cows.
- the present invention also relates to an immunological reagent for detecting or assaying mammalian angiogenins, characterized in that it is chosen from the group which comprises anti-protein 17 KD antibodies, anti-peptide antibodies, in particular antibodies against one of the peptides defined above, which antibodies being used alone or as a mixture.
- the present invention also relates to a method for detecting and assaying mammalian angiogenins in biological fluids, characterized in that an anti-angiogenin antibody, in particular an anti-protein antibody, is reacted under appropriate conditions 17 KD or an anti-peptide antibody, in accordance with the invention with a biological fluid supposed to contain said angiogenin, the reading of the reaction being carried out by an appropriate means, such as in particular RIA, ELISA, Immunofluorescence.
- the present invention further relates to a kit for detecting and / or assaying, in biological fluids, angiogenin in mammals and in particular human angiogenin, characterized in that it comprises:
- anti-angiogenin antibody in particular of anti-protein 17 KD antibody or of anti-peptide antibody, in particular of antibodies against one of the peptides defined above ;
- buffers optionally an appropriate quantity of buffers, diluents, reagents, necessary for the implementation of said detection and / or assay.
- the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to an example of preparation of the protein according to the invention, as well as to a report of '' experiments carried out:
- the attached Figure 1 represents the elution diagram of the 17 KD protein from the Phenyl Superose column, with the time in minutes on the abscissa, and the optical densities on the ordinate. Peak 2 contains the pure 17 KD protein.
- the yield is 25 mg of protein, ie 0.5 mg / l of defatted milk.
- the protein 17 KD of bovine origin has an additional alanine in the N-terminal position.
- bovine RNAse 17 KD of bovine origin shares a similar homology with bovine RNAse (39% of the remains being identical), to that of human angiogenin for human RNAse (34% of the remains being identical).
- pancreatic ribonuclease A the three-dimensional structure of angiogenin human has been evaluated when the sites, on which the mutations have focused, are reported on this structure; in this case, it can be observed that, with the exception of the Arg / Ile mutation at position 43, all the substitutions which occur in the spatial structure of the protein, involved in its ribonucleolytic activity, are conservative substitutions.
- the fertilized eggs are placed in an incubator at 38oC in an atmosphere at 70% humidity.
- a window is opened in the shell and is closed by a gas permeable membrane.
- the protein 17 KD of bovine origin in accordance with the invention can be used in a pharmaceutically acceptable form for the treatment of disorders requiring inhibition or increased growth of blood vessels in humans.
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Abstract
La présente invention est relative à une nouvelle protéine d'environ 17 KD, à action angiogénique, à son procédé d'isolement à partir de lait de mammifères, à des compositions thérapeutiques la contenant, à un procédé de détection et/ou de dosage des angiogénines de mammifères, de leurs homologues et de leurs fragments. Ladite protéine, d'origine bovine présentant une séquence de 125 amino-acides, dont 81 sont communs avec l'angiogénine humaine et ayant un poids moléculaire d'environ 17 KD, est extraite de lait de mammifère. Application à la détection des angiogénines de mammifères.
Description
PROTEINE HOMOLOGUE DE L'ANGIOGENINE HUMAINE
La présente invention est relative a une nouvelle protéine d'environ 17 KD, à action angiogenique, à son procédé d'isolement à partir de lait de mammifères, à des compositions thérapeutiques la contenant, à un procédé de détection et/ou de dosage, ainsi qu'à des réactifs immunologiques de détection et/ou de dosage des angiogenines de mammifères, de leurs homologues et de leurs fragments.
A la suite du travail de pionnier de J. FOLKMAN (of. J. Exp. Med., 133, 275 (1971)), qui a démontré que la croissance d'une tumeur requiert une alimentation sanguine importante, celle-ci étant réalisée par la croissance continue de nouveaux vaisseaux sanguins ; il a suggéré que cette croissance résulte de la présence d'une substance diffusible qu'il a dénommée "Tumor angiogenesis factor" (TAF), plusieurs protéines qui stimulent l'angiogénèse ont été isolées (FOLKMAN et al., Science, (1987), 235, 442). Parmi ces substances, l'angiogenine, protéine d'origine humaine, a été purifiée par l'Equipe de VALLEE, de même que le clonage de son
gène. En 1985, FETT J.W. et al., (Biochem, (1985), 24, 5480-5486) ont isolé l'angiogenine humaine à partir de cellules intestinales humaines cancéreuses en culture. Les cellules intestinales HT 29 sécrètent l'angiogenine humaine dans le milieu de culture. A partir de ces milieux de culture ne renfermant pas de sérum, 0,5 ug/litre d' angiogenine humaine a été isolée. L'équipe de VALLEE a déterminé la concentration en angiogenine tout d'abord par la méthode de Bradford (Anal. Biochem., 1975, 72, 248-254 méthode par fixation de colorant, en utilisant la SAB comme standard), puis par la méthode décrite dans Biochem, 1986, 25, 3527, 3732, par SHAPIRO et Al.. La séquence en amino-acides a été également précisée par STRYDOM et Al. (BIOCHEMISTRY (1985), 24, p. 5486-5494). L'angiogenine humaine est une protéine dont la masse moléculaire est de 14 400 D.
L'angiogenine isolée de cellules tumorales humaines comprend une seule chaîne protéinique comprenant 123 amino-acides et dont la séquence est la suivante :
Gln-Asp-Asn-Ser-Arg-Tyr-Thr-His-Phe-Leu-Thr-Gln- His-Thr-Asp15-Ala-Lys-Pro-Gln-Gly-Arg-Asp-Asp-Arg- Tyr-Cys-Glu-Ser-Ile-Met30-Arg-Arg-Arg-Gly-Leu-Thr- Ser-Pro-Cys-Lys-Arg-Ile-Asn-Thr-Phe45-Ile-His-Gly- Asn-Lys-Arg-Ser-Ile-Lys-Ala-Ile-Cys-Glu-Asn-Lys60-
Asn-Gly-Asn-Pro-His-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Ile-Ser-Lys Ser-Ser75-Phe-Gln-Val-Thr-Thr-Cys-Lys-Leu-His-Gly- Gly-Ser-Pro-Trp-Pro90-Pro-Cys-Gln-Tyr-Arg-Ala-Thr- Ala-Gly-Phe-Arg-Asn-Val-Val-Val105-Ala-Cys-Glu-Asn- Gly-Leu-Pro-Val-His-Leu-Asp-Gln-Ser-Ile-Phe120-Arg-
Arg-Pro123-OH
L'amino-acide C-terminal est la proline ; trois ponts disulfure lient les cystéines 26-81, 39-92 et 57-107.
La séquence de l 'angiogenine humaine est homologue à 35% de celle de la ribonuclease humaine pancréatique, en
particulier en ce qui concerne les amino-acides essentiels à l'activité ribonucléolytique (cf. BIOCHEMISTRY, (1985), 24, 5494-5499. KURACHI et Al.). L'activité de l'angiogenine humaine est importante, puisque 50 ng, soit 3,5 picomoles, sont capables d'entraîner une vascularisation de la cornée de lapin et 35 fentomoles sont capables d'induire la vascularisation de l'embryon de poulet.
Il est connu de préparer l' angiogenine humaine parclonage. Le clonage du gène codant pour l' angiogenine humaine permet de préparer des quantités satisfaisantes par l'intermédiaire de systèmes d'expression adéquats. Néanmoins, de telles méthodes sont coûteuses.
Il s'est avéré nécessaire de rechercher un composé qui présenterait des propriétés similaires à celles de l'angiogénine humaine et dont le procédé d'obtention serait plus simple et moins coûteux.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une nouvelle protéine présentant des propriétés similaires à celles de l'angiogénine humaine, obtenue par des moyens peu coûteux et faciles à mettre en oeuvre, permettant des rendements quantitatifs élevés. C'est aussi un but de l'invention de pourvoir à un nouveau procédé d'obtention de ladite protéine, ne présentant pas les inconvénients des procédés de l'Art antérieur ; en effet, ce nouveau procédé permet d'obtenir d'importantes quantités de la protéine en question à un coût très bas, ce qui, dans le cadre de la fabrication industrielle de compositions pharmaceutiques contenant cette protéine, présente des avantages importants. C'est encore un but de l'invention de pourvoir à des compositions pharmaceutiques contenant ladite protéine.
C'est également un but de l'invention de pourvoir à un agent de détection et de dosage des angiogenines de mammifères, de leurs homologues, de leurs fragments, dans des fluides biologiques.
C'est en outre un but de l'invention de pourvoir à un kit de détection et de dosage des protéines susdites dans lesdits fluides.
La présente invention a pour objet une protéine, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence qui comporte125 amino-acides, et répond à la formule I ci-après : (I) Ala1-Gln-Asp-Asp-Tyr5-Arg-Tyr-Ile-His-Phe10- Leu-Thr-Gln-His-Tyr15-Asp-Ala-Lys-Pro-Lys20- Gly-Arg-Asn-Asp-Glu25-Tyr-Cys-Phe-Asn-Met30- Met-Lys-Asn-Arg-Arg35-Leu-Thr-Arg-Pro-Cys40
Lys-Arg-Arg-Asn-Thr45-Phe-Ile-His-Gly-Asn50 Lys-Asn-Arg-Ile-Lys55-Ala-Ile-Cys-Glu-Asρ60- Arg-Asn-Gly-Gln-Pro65-Tyr-Arg-Gly-Asp-Leu70- Arg-Ile-Ser-Lys-Ser75-Glu-Phe-Gln-Ile-Thr80- Xle-Cys-Lys-His-Lys85-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg90-
Pro-Pro-Cys-Arg-Tyr95-Gly-Ala-Thr-Glu-Asρ100- Ser-Arg-Val-Ile-Val105-Val-Gly-Cys-Glu-Asn110 Gly-Leu-Pro—Val-His115-Phe-Asρ-Glu-Ser-Phe1201 Ile-Thr-Pro-Arg-His 125_OH,
en ce que 81 amino-acides de sa séquence sont communs avec l'angiogénine humaine, et en ce que son poids moléculaire est d'environ 17 KD.
La masse moléculaire a été évaluée en comparant la vitesse de migration electrophoretique de ladite protéine bovine à celle des témoins suivants : la myoglobine (P.M. : 17 200), la myoglobine 1 + 2 (P.M. : 14 600), la myoglobine A (P.M. : 8 240), la myoglobine 2 (P. M. : 6 380), la myoglobine 3 (P.M. : 2 560) (Pharmacia). Dans la composition de ladite protéine 17 KD, déterminée après hydrolyse acide totale, les amino-acides suivants sont présents dans les proportions ci-après : Phé : 6, Leu : 4, Ile : 9, Met : 2, Val : 4, Pro : 7, Ser s 6, Thr : 6, Ala : 4, Tyr : 6, His : 6, Glu(Gin) : 10, Asp(Asn) : 16, Lys : 9, Arg : 15, Gly : 9, Cys : 6.
Conformément à l'invention, ladite protéine est obtenue par extraction de lait de mammifères, notamment de vache ou par clonage ou par voie de synthèse.
La présente invention a également pour objet des peptides qui constituent des fragments de la protéine 17KD conforme à l'invention, elle couvre en particulier :
- un peptide qui présente la séquence suivante en amino-acides :
Glu-Asp60-Arg-Asn-Gly-Gln-Pro65-Tyr-Arg-Gly-Asp- Leu70-Arg-Ile-Ser dont 9 restes sur 15 s'alignent sur la séquence 58-72 de l'angiogénine humaine.
- un peptide qui présente la séquence suivante en amino-acides : Phe-Asp-Glu-Ser-Phe 1 20-Ile-Thr-Pro-Arg-His 1 25 et qui correspond au fragment C terminal de la protéine 17 KD
- un peptide présentant la séquence suivante en amino-acides :
Glu-Asn110-Gly-Leu-Pro-Val-His115-Phe qui s'aligne sur la séquence 108-115 de l'angiogénine humaine, dans laquelle séquence 7 restes sur 8 sont identiques ;
- un peptide présentant la séquence en aminoacides suivante : Ile-Val105-Val-Gly-Cys-Glu dont 4 restes sur 6 s'alignent sur la séquence 103-108 de l'angiogénine humaine ;
- un peptide présentant la séquence suivante en amino-acides: Arg-Tyr-Ile-His-Phe10-Leu-Thr-Gln-His-Tyr15-Asp-Ala-Lys dont 11 restes sur 13 s'alignent sur la séquence 5-17 de l'angiogénine humaine ;
- un peptide présentant la séquence suivante en amino-acides : Asn-Thr45-Phe-Ile-His-Gly-Asn50-Lys,
qui se distingue par une homologie totale avec la séquence 43-50 de l'angiogénine humaine. un peptide qui présente la séquence en amino-acides suivante : Ile-Lys55-Ala-Ile-Cys-Glu, qui se distingue également par une homologie totale avec la séquence 53-58 de l'angiogénine humaine.
- un peptide qui présente la séquence suivante en amino-acides : Leu70-Arg-Ile-Ser-Lys-Ser75-Glu-Phe-Gln dont 8 restes sur 10 s'alignent sur la séquence 69-77 de l'angiogénine humaine.
- un peptide qui présente la séquence suivante en amino-acides : Arg67-Gly-Asp, ledit peptide étant reconnu par un récepteur des cellules endothéliales.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de ladite protéine conforme à l'invention, caractérisé en ce que ladite protéine est extraite de lait de mammifère, notamment de vache.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, l'extraction de ladite protéine est réalisée par chromatographie par échange de cations, suivie d'une élution par un éluant approprié.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l' éluant est un sel alcalin d'un acide organique faible, notamment de l'acétate de sodium.
Selon une autre disposition avantageuse, la fraction éluée est soumise à une deuxième chromatographie par échange de cations.
La protéine ainsi isolée est purifiée par chromatographie sur une colonne de gel-filtration.
La protéine ainsi purifiée est obtenue avec un rendément de l'ordre de 0,5 mg/litre de lait.
En variante à ce mode de mise en oeuvre, préalablement à l'extraction, le lait d'origine bovine est soumis à une délipidation.
Selon une disposition avantageuse, la délipidation est réalisée par centrifugation.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, la centrifugation est réalisée à 4000 g pendant 30 mn et à une température de 4ºC.
La présente invention a encore pour objet une composition thérapeutique qui comprend comme composé actif, la protéine 17 KD et/ou des fragments ou des homologues de celle-ci, notamment pour le traitement de troubles requérant l'inhibition ou l'augmentation de la croissance des vaisseaux sanguins. Les compositions thérapeutiques conformes à l'invention peuvent être utilisées dans toutes les pathologies dans lesquelles existe un problème de vascularisation, et notamment plaies, escarres, ulcères, greffes, insuffisances circulatoires. Elles peuvent être également utilisées en cosmétologie (peau, cuir chevelu). Elles peuvent aussi être utilisées dans le domaine vétérinaire, notamment dans le diagnostic de mammites et la sélection de vaches lactantes.
La présente invention a également pour objet un réactif immunologique de détection ou de dosage des angiogénines de mammifères, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe qui comprend des anticorps anti-protéine 17 KD, des anticorps anti-peptide, notamment des anticorps contre l'un des peptides définis ci-dessus, lesquels anticorps étant utilisés seuls ou en mélange. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et de dosage des angiogenines de mammifères dans des fluides biologiques, caractérisé en ce que l'on fait réagir, dans des conditions appropriées, un anticorps anti-angiogénine, notamment un anticorps anti-protéine 17 KD ou un anticorps anti-peptide, conformes à l'invention
avec un fluide biologique supposé contenir ladite angiogenine, la lecture de la réaction étant effectuée par un moyen approprié, tel que notamment RIA, ELISA, Immunofluorescence. La présente invention a en outre pour objet un kit de détection et/ou de dosage , dans des fluides biologiques, d'angiogenine de mammifères et notamment de l'angiogénine humaine, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une quantité appropriée, éventuellement subdivisée en doses unitaires, d'anticorps anti-angiogénine, en particulier d'anticorps anti-protéine 17 KD ou d'anticorps anti-peptide, notamment d'anticorps contre l'un des peptides définis ci-dessus ;
- éventuellement une quantité appropriée de tampons, diluants, réactifs, nécessaires à la mise en oeuvre de ladite détection et/ou dosage.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation de la protéine selon l'invention, ainsi qu'à un compte-rendu d'expérimentations effectuées :
- pour démontrer l'homologie angiogenine humaine/ protéine 17 KD d'origine bovine, selon l'invention ; - pour démontrer l'homologie avec la ribonuclease ;
- pour démontrer l'activité sur l'angiogénèse de ladite protéine 17 KD d'origine bovine.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et ce compte-rendu d'expérimentations sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE A : EXTRACTION DE LA PROTEINE 17 KD DU LAIT DE VACHE
50 litres de lait de vache sont délipidés par centrifugation (4 000 xg - 30 mn - 4ºC ) et chromatog raphiés sur une colonne de SP-Sephadex C50 (10 ×100 cm) (Pharmacia).
La colonne est lavée par 10 1 d'une solution d'acétate de sodium 0,35 M pH 7, puis est éluée par 5 1 d'acétate de sodium 1,5 M pH 8. La solution obtenue est diluée de manière à obtenir une concentration en acétate de sodium 0,2 M. Cette solution est chromatographiée sur une colonne de S-Sepharose Fast Flow (10 × 100 cm) (Pharmacia) préalablement équilibrée avec de l'acétate de sodium 0,22 M pH 6,5. Après lavage de la colonne par la même solution d'acétate, l'élution de la protéine est réalisée par un litre d'une solution d'acétate de sodium 0,4 M.
Cette solution est dessalée par chromatographie de gel-filtration sur une colonne de Bio-gel P-30 (4 × 100 cm). Après élution de la colonne à l'eau, la fraction renfermant la protéine est chromatographiée sur une colonne de Phényl Superose HR5/5 (Pharmacia) par F.P.L.C. (Fast Protein Liquid Chromatography). L'élution est réalisée à l'aide d'un gradient obtenu en mélangeant le tampon A : Phosphate de sodium 50 mM, sulfate d'ammonium 1,7 M pH 7, avec le tampon B : phosphate de sodium 50 mM pH 7 (temps 0 minute : 100 % TpA ; temps 15 minutes : 100 % TpA ; temps 40 minutes : 0 % TpA).
La Figure 1 annexée représente le diagramme d'élution de la protéine 17 KD de la colonne de Phényl Superose, avec en abscisse le temps en minutes, et en ordonnée les densités optiques. Le pic 2 renferme la protéine 17 KD pure. Le rendement est de 25 mg de protéine, soit 0,5 mg/l de lait délipidé.
TESTS EXEMPLE 1 : HOMOLOGIE ANGIOGENINE HUMAINE/PROTEINE 17 KD
Les données dont nous disposons sur la protéine 17 KD font apparaître sa parenté avec l'angiogénine humaine ; en effet, 81 amino-acides sont communs aux deux protéines :
L'analyse en amino-acides, évaluée pour l'angiogénine humaine et déterminée après hydrolyse acide totale pour la protéine 17 KD d'origine bovine (Tableau I ci-après) montre que les deux protéines possèdent des compositions très proches.
La comparaison des séquences de l'angiogénine humaine et de la protéine 17 KD d'origine bovin qui figure au Tableau II ci-après, montre une homologie supérieure à 60 %. La plupart des différences sont le résultat de remplacements conservatifs. Les 6 restes cystéines sont en même position, ce
qui indique une structure tertiaire similaire à celle de l'angiogénine humaine, un seul espacement est nécessaire dans la région C-terminale pour l'alignement ; seulement les zones N et C terminales sont responsables de la différence de taille entre les deux protéines (la protéine 17 KD a deux aminoacides de plus que l'angiogénine humaine).
Cependant, à la différence de l'angiogénine humaine, qui a, en position N-terminale, un acide pyroglutamique, la protéine 17 KD d'origine bovine a une alanine supplémentaire en position N-terminale.
Cette différence s'explique par la présence d'un peptide signal de 24 (ou 22) amino-acides (FETT J. et al. Biochem., (1985), 24, 5480), révélé par le séquençage des cDNA codant pour l'angiogénine humaine ; la suppression de ce peptide se produit lors du traitement par la peptidase signal, qui clive entre l'alanine et la glutamine dans :
Pro-Pro-Thr-Leu-Ala-1-Glu+1-Asp-Asn..., dans l'angiogénine humaine, alors que la présence de l'alanine N-terminale, en ce qui concerne la protéine 17 KD d'origine bovine, est due au déplacement de la liaison clivée par la peptidase signal, laissant ainsi une alanine supplémentaire en position N-terminale, évitant la modification en acide pyroglutamique observée dans l'angiogénine humaine.
La séquence de la protéine 17KD telle qu'elle figure au Tableau II, ci-après, a été déterminée par les techniques classiques de séquençage des protéines.
EXEMPLE 2 - HOMOLOGIE AVEC LA RNAse :
R. SHAPIRO et al. (Biochem, (1986), 25, 3527-3532) ont montré que, en pratique, tous les restes de la séquence du site actif de la RNAse bovine sont conservés dans l'angiogénine humaine.
De plus, l'observation qu'un inhibiteur de la ribonuclease humaine supprime à la fois l'activité angiogenique et ribonucleolytique de l'angiogénine humaine, confirme que l'homologie angiogénine/RNAse est fonctionnellement significative.
Les résultats suivants confirment ces observations (Tableau III, ci-après) :
- la protéine 17 KD d'origine bovine partage une homologie similaire avec la RNAse bovine (39 % des restes étant identiques), à celle de l'angiogénine humaine pour la RNAse humaine (34 % des restes étant identiques).
- mise à part la mutation Arg/Ile en position 43 et deux substitutions conservatives (Asp-69 pour Asn-68 et Phe 116 pour Leu-115), tous les restes qui sont connus pour être impliqués dans l'activité ribonucleolytique sont préservés, tant dans l'angiogénine humaine que dans la protéine 17 KD d'origine bovine, indiquant une forte pression sélective pour le maintien de cette homologie fonctionnelle significative (Tableau III). La substitution de la Leu-115 de l'angiogénine humaine par la Phe-116 de la protéine 17 KD d'origine bovine est d'un intérêt particulier : il a été montré, par exemple, que dans la RNAse, le remplacement de Phe par Leu faisait chuter l'activité d'un facteur 10. Ainsi, la présence de Phe-116 dans la protéine 17 KD, sous réserve que l'activité RNAse soit directement impliquée dans son activité biologique, pourrait être une indication d'une activité supérieure à celle de l'angiogénine humaine.
- basée sur son homologie avec la ribonuclease A pancréatique : la structure tridimensionnelle de l'angiogénine
humaine a été évaluée lorsque les sites, sur lesquels les mutations ont porté, sont rapportés sur cette structure ; en ce cas, on peut observer que, à l'exception de la mutation Arg/Ile en position 43, toutes les substitutions qui surviennent dans la structure spatiale de la protéine, impliquées dans son activité ribonucleolytique, sont des substitutions conservatives.
EXEMPLE 3 - PROPRIETES BIOLOGIQUES DE LA PROTEINE 17 KD D'ORIGINE BOVINE. - Test de la membrane chorio-allantoïque de l'oeuf de la poule : Ce test d'activité biologique a été décrit par
FETT et al. (Biochem, (1985), 24, 5480-5486). Ce test consiste à apprécier le développement de vaisseaux sanguins au niveau de la membrane chorio-allantoïque de l'embryon de Poulet après application de quantités croissantes de protéine 17 KD d'origine bovine de l'ordre de 10 ng à 1 μg. Sur 80 oeufs fécondés qui ont été expérimentés en présence de la protéine 17 KD, il a été observé un développement de nouveaux vaisseaux sanguins dans 62 oeufs pour une quantité d 'angiogenine de 50 ng. Ces résultats démontrent que la protéine 17 KD selon l'invention possède un effet sur l'organogenèse et la croissance des vaisseaux sanguins.
Les oeufs fécondés sont placés dans une couveuse à 38ºC en atmosphère à 70 % d'humidité.
Après 3 jours, une fenêtre est ouverte dans la coquille et est fermée par une membrane perméable aux gaz.
Au 5ème jour, un disque d'une membrane imbibée de la solution de protéine 17 KD est implanté sur la membrane chorio-allantoïque.
Le développement des vaisseaux sanguins qui convergent vers le disque imbibé d' angiogenine est suivi à la loupe binoculaire au 8ème, 9ème et 10ème jours.
La protéine 17 KD d'origine bovine conforme à l'invention peut être utilisée sous une forme pharmaceutiquement acceptable pour le traitement des troubles requérant l'inhibition ou l'augmentation de la croissance des vaisseaux sanguins chez l'Homme.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les
variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
Claims
REVENDICATIONS 1º) Protéine, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence qui comporte 125 amino-acides, et répond à la formule I ci-après : Ala1-Gln-Asp-Asp-Tyr5-Arg-Tyr-Ile-His-Phe10-
Leu-Thr-Gln-His-Tyr15-Asp-Ala-Lys-Pro-Lys20- Gly-Arg-Asn-Asp-Glu25-Tyr-Cys-Phe-Asn-Met30-
Met-Lys-Asn-Arg-Arg35-Leu-τhr-Arg-Pro-Cys40 (I) Lys-Arg-Arg-Asn-Asn-Thr45-Phe-Ile-His-Gly-Asn50 Lys-Asn-Arg-Ile-Lys55-Ala-Ile-Cys-Glu-Asp60-
Arg-Asn-Gly-Glu-Pro65-Tyr-Arg-Gly-Asp-Leu70- Arg-Xle-Ser-Lys-Ser75-Glu-Phe-Gln-Ile-Thr80- Ile-Cys-Lys-His-Lys85-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg90- Pro-Pro-Cys-Arg-Tyr95-Gly-Ala-Thr-Glu-Asp100- Ser-Arg-Val-Ile-Val105-Val-Gly-Cys-Glu-Asn110
Gly-Leu-Pro-Val-His115-Phe-Asp-Glu-Ser-Phe120- Ile-Thr-Pro-Arg-His125-OH, en ce que 81 amino-acides de sa séquence sont communs avec l'angiogénine humaine et en ce que son poids moléculaire est d'environ 17 KD.
2º) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par extraction de lait de mammifères, notamment de vache.
3º) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par clonage.
4º) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par voie de synthèse.
5º) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides s
Glu-Asp60-Arg-Asn-Gly-Gln-Pro-Tyr-Arg-Gly-Asp- Leu70-Arg-Ile-Ser dont 9 restes sur 15 s'alignent sur la séquence 58-72 de l'angiogénine humaine.
6º) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue le fragment C-terminal de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence en amino-acides suivante : Phe-Asp-Glu-Ser-Phe120-Ile-Thr-Pro-Arg-His125
7º) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides : Glu-Asn110-Gly-Leu-Pro-Val-His115-Phe dont 7 restes sur 8 s'alignent sur la séquence 108-115 de l'angiogénine humaine.
8º) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un fragment de la protéine selon lune quelconque des revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence en aminoacides suivante s
Ile-Val105-Val-Gly-Cys-Glu dont 4 restes sur 6 s'alignent sur la séquence 103-108 de l'angiogénine humaine. 9º) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides:
Arg-Tyr-Ile-His-Phe10-Leu-Thr-Gln-His-Tyr15-Asp-Ala-Lys dont 11 restes sur 13 s'alignent sur la séquence 5-17 de l'angiogénine humaine.
10º) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides :
Asn-Thr45-Phe-Ile-His-Gly-Asn50-Lys, qui se distingue par une homologie totale avec la séquence 43-50 de l'angiogénine humaine.
11°) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendi
cations 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides :
Ile-Lys55-Ala-Ile-Cys-Glu, qui se distingue également par une homologie totale avec la séquence 53-58 de l'angiogénine humaine.
12e) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides : Leu70-Arg-Ile-Ser-Lys-Ser75-Glu-Phe-Gln dont 8 restes sur 10 s'alignent sur la séquence 69-77 de l'angiogénine humaine.
13º) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides s
Arg67-Gly-Asp, ledit peptide étant reconnu par un récepteur des cellules endothéliales. 14º) Procédé d'obtention de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ladite protéine est extraite de lait de mammifère, notamment de vache.
15º) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'extraction est réalisée par chromatographie par échange de cations, suivie d'une élution par un éluant approprié.
16º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, caractérisé en ce que l'éluant est un sel alcâlin d'un acide organique faible, notamment de l'acétate de sodium.
17º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que la fraction éluée est soumise à une deuxième chromatographie par échange de cations, suivie d'une deuxième élution par un éluant approprié.
18°) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'éluant est un sel alcalin d'un acide organique faible, notamment de l'acétate de sodium.
19º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que le produit obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel-filtration.
20º) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le lait est préalablement délipidé par centrifugation.
21º) Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend comme composé actif, la protéine 17 KD selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou des fragments selon l'une quelconque des revendications 5 à 13 ou des homologues de celle-ci.
22º) Réactif immunologique de détection ou de dosage des angiogenines de mammifères, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe qui comprend des anticorps contre la protéine 17 KD selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, des anticorps anti-peptide, notamment des anticorps contre l'un des peptides selon l'une quelconque des revendications 5 à 13, lesquels anticorps sont utilisés seuls ou en mélange. 23º) Procédé de détection et de dosage des angiogenines de mammifères dans des fluides biologiques, caractérisé en ce que l'on fait réagir, dans des conditions appropriées, un anticorps anti-angiogénine, notamment un anticorps antiprotéine 17 KD ou un anticorps anti-peptide, selon la revendication 22, avec un fluide biologique supposé contenir ladite angiogenine, la lecture de la réaction étant effectuée par un moyen approprié, tel que notamment test RIA, ELISA, d'immunofluorescence.
24°) Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la détection et/ou le dosage, dans des fluides biologiques, d' angiogenines de mammifère et notamment de l'angiogénine humaine, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une quantité appropriée, éventuellement subdivisée en doses unitaires, d'anticorps anti-angiogénine, notamment d'anti corps anti-protéine 17 KD ou d'anticorps anti-peptides selon la revendication 22. - éventuellement une quantité appropriée de tampons, di luants, réactifs, nécessaires à la mise en oeuvre de ladite détection et/ou dosage.
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