KR19990044110A - 병리적 투과성 변화를 조절하는 항분비 인자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항분비 인자(AF)로 불리우는 신규한 재조합 단백질 및 이의 상동물 및 펩티드 단편에 관한 것이다. 상기 단백질 및 이의 상동물 및 단편은 사람을 포함하는 동물에게 병리적 체액의 운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키는 데 유용하다. 또한, 본 발명은 AF에 대한 항체 또는 이들의 상동물 또는 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 코딩하는 핵산 뿐만 아니라 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주에 관한 것이다. rAF 및 이의 상동물 및 단편은 동물을 사육하기 위한 공급 첨가제로서, 설사억제제 및 부종, 탈수증 및/또는 염증을 포함하는 질병에 대한 약제로서 면역검출을 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 체액 운반 및/또는 염증성 반응 조절 특성 뿐만 아니라 다핵 조절 특성을 지니는 항분비 인자, 이를 코딩하는 폴리핵산, 및 이의 용도에 관한 것이다.
체내의 모든 세포 및 조직은 충분한 혈액 공급과 함께 일정하고 정상적인 체액 환경에 중요하게 의존한다. 이러한 지지 시스템중의 하나 또는 둘 모두가 비정상이 되면 즉각적으로 치명적일 수 있다. 체액 불균형과 관련하여 두가지의 원리면에서 상이한 시스템이 존재한다:
A. 세포간 조직 공간 또는 체강내의 비정상적인 체액의 축적으로 특정화되는 부종, 또는
B. 엄밀한 의미로 단지 물의 손실을 의미하며, 물과 이온의 복합된 손실을 설명하는 데는 일반적으로 이용되지는 않는 탈수.
가장 일반적인 형태의 부종 또는 탈수는 설사, 염증성 장 질환, 뇌부종, 천식, 비염, 결막염, 관절염, 녹내장, 다양한 형태의 병리적 두개내 혈압(고혈압 또는 저혈압), 모르부스 메니어(Morbus Meniere)와 같은 중이에서의 혈압변화, 피부염, 유방염과 같은 피부 및 피부 인접 분비샘의 화학적 또는 물리적인 이상, 및 요붕증, 콘 증후군(Conn's syndrome), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome) 및 모르부스 에디슨(Morbus Addison)과 같은 다양한 형태의 내분비 장애, 신우신염 및 사구체신염과 같은 신장질환, 점액부종 및 급성의 간헐성 포르피린증과 같은 대사성 질환, 항당뇨병제와 같은 다양한 약물 치료동안의 부작용, 삼환계항우울제, 세포증식 억제증, 바르비투르염, 수면(narcotics) 및 수면 유사증이다.
설사는 장에서의 전해질과 물의 투과성이 변화되어 유발된다. 이러한 장애는 종종 대장균, 캄필로박터 제쥬니(Campylobacter jejuni), 비브리오콜레라, 쉬겔라 다이센테리아(Shigella dysenteriae) 및 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile)에 의해 생성되는 장독소와 같은 박테리아성 장독소에 의해 유발된다. 이러한 장애는 또한 장내 염증에 의해 유발될 수 있다. 물의 흡수는 전해질 및 영양분의 흡수와 결부되기 때문에, 설사를 자주 앓고 있는 동물은 영양실조에 걸리게 되어, 성장하고 있는 동물에게 있어서 일일 체중 증가에 방해를 받게된다. 신체는 장내 점막내의 중간 뉴우론으로부터 아편 펩티드 및 소마토스타틴을 분비하는 바와 같은 신경-호르몬 메카니즘에 의해 이러한 반응을 억제한다. 이러한 폴리펩티드는 체액분비 및 설사를 억제할 수 있다.
최근에 기술된 항분비 인자(AF)는 돼지 내하수체로부터 부분적으로 정제되었고 다양한 장독소에 의해 유도된 병원성 분비를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 돼지 밀크중에 있는 높은 수준의 AF는 젖먹이 새끼 돼지의 설사를 억제한다.
항바이러스 약물이 사람 및 수의술에서 설사를 치료하는 데 광범위하게 사용되고 있다. 또한 이러한 항바이러스 약물은 돼지, 송아지 및 병아리를 위한 사료 첨가제로 사용된다. 그러나, 장에서 내성 박테리아가 신속하게 성장하기 때문에, 장염에 항생제를 사용하는 것은 수의학 분야에서 감소 추세에 있다.
다른 항설사 약물은 장의 점막에서의 분비를 억제한다. 이러한 약물은 숙주동물에 직접적이기 때문에, 약물에 대한 내성이 생길 것 같지 않다. 이러한 형태의 약물에는 신경작용 약물 유사 페노티아진 및 티오크산텐이 있다. 이러한 형태의 약물은 몇가지 심각한 부작용으로 인해서 대부분의 국가에서 설사를 치료하는 데 허용되지 않고 있다. 그밖의 약물로는 아편 유사 코데인 및 로페라미드의 유도체가 있다. 이러한 약물은 주로 장의 운동을 억제하여 작용하기 때문에, 이러한 약물은 장으로부터의 병원성 박테리아의 제거를 억제하고 있으며, 이질성 박테리아 또는 기생충에 대해서는 한정적으로 권장되지 않고 있다. 소마토스타틴의 유도체는 최근에 소개되었지만, 약물 투여의 곤란성 및 성장에 대한 내분비 조절과 상호작용하는 가능성으로 인해 현재까지 제한적으로 사용되고 있다.
항분비 인자(AF)는 항분비 인자 단백질의 순수한 제제를 얻는것과 관련된 곤란성으로 인해 설사 또는 영양실조의 치료에 직접 사용되지 않고 있다. 그러나, 특정의 사료가 공급된 가축에서 유사한 단백질을 얻을 수 있다(SE 특허 제9000028-2호). 돼지에게 이러한 사료를 공급하여 높은 수준의 AF 유사 단백질을 얻었으며 대조군에 비하여 일일 성장 속도가 현저하게 빨랐다. 클로스트리디움 디피실리로부터의 독소 A로 도전된 래트(rat)에서의 AF는 장의 분비 뿐만 아니라 장에서의 염증 및 출혈을 억제한다.
본 발명의 주요 목적은 병리적 체액 운반을 정상화시키는데 사용되는 신규한 재조합 단백질 및 이의 상동물 및 단편(펩티드)을 제공하는 데 있다. 이러한 단백질 및 펩티드는 포괄적으로 항분비 인자(AF)로 일컬어진다. AF를 사용하면 다양한 병인의 염증성 반응의 전개가 부분적으로 억제시키거나 완전히 억제된다. 정상으로의 재구성(체액운반 또는 염증화)은 단백질 또는 펩티드의 사용에 의해 달성된다. 또한 AF 단백질 또는 펩티드는 효능이 손실되지 않으면서 다양한 점막을 통해 효과적으로 흡수된다(정맥내 투여와 비교했을 경우). 그 결과, 다수의 치료 섭생법이 있으며, 정확하게 투여된 단백질 또는 펩티드는 파괴된 체액(물 및 이온)균형, 염증성 반응, 또는 이들 둘 모두을 신속하게 재구성시킬 수 있다.
요약하면, 재조합 AF(rAF) 및 이의 상동물 및 단편은 면역검정에 사용될 수 있으며, 동물을 성장시키기 위한 음식물 첨가제 및 질환 관련된 부종, 탈수 및/또는 염증을 치료하는 약물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 목적은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열중의
a) 아미노산 번호 35-42
b) 아미노산 번호 35-46
c) 아미노산 번호 36-51
d) 아미노산 번호 36-80
e) 아미노산 번호 1-80을 포함하는 그룹으로부터 선택된 단편으로서 서열번호 1에 기재된 재조합 단백질의 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열 번호 1에 기재된 재조합 단백질의 아미노산 번호 35-42를 포함하는 단편에 상응하는 펩티드 X1VCX2X3KX4R(여기서, X는 I 이거나아무것도 아니며, X2는 H이고, R, K 또는 X3은 S, L 또는 그밖의 중성 아미노산이며, X4는 T 또는 A이다)을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편에 대한 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편에 특이적인 항체에 결합하는 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 유효량의 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 활성원으로 포함하는 병리적 체액 운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 사용하여 병리적 체액운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키기 위한 조성물을 제조하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편, 또는 상기 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 생성시킬 수 있는 유기물을 활성제로 포함하는 병리적 체액 운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키기 위한 음식물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 유효량의 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편, 또는 상기 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 생성시킬 수 있는 유기물을 척추동물에게 투여함을 포함하여 병리적 체액운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편에 특이적인 항체를 사용하여 유기물내의 상기 단백질 또는 단편을 검출하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코딩하는 핵산을 사용하여 상응하는 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 생성시키는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코딩하는 핵산으로부터 유도된 프로브(probe) 또는 프라이머(primer)를 사용하여 유기물내 핵산의 존재를 검출하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함한 벡터를 포함하는 사람 이외의 숙주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기본으로 하는 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편을 생성시킬 수 있는 사람 이외의 유기물 균주를 제공하는 데 있다.
재조합 단백질을 생성시킬 수 있는 유기물로서, 재조합 박테리아 및 진핵 유기물과 같거나, 효모, 식물, 및 사람 이외의 척추동물과 같은 다양한 형태의 유기물이 사용될 수 있다.
통상의 생화학기술로 AF를 정제하기 위한 수십연간의 연구에도 불구하고, AF를 균일한 형태로 얻는 것은 불가능하였다. 그러나, 면역조직화학 방법으로 면역화 및 항혈청을 위한 순수한 AF를 제조하는 새로운 공정에 의해서, 적합한 항혈청을 선택하였다. 본 발명에서는 이러한 항혈청으로 대장균(E. coli)에서 AF를 발현하는 재조합 사람 cDNA를 클로닝하는 것을 가능하게 하였다.
신규한 cDNA의 서열을 측정한 결과 독특한 것으로 밝혀졌다. 이러한 서열을 밝혀냄으로써, 사람 및 돼지 뇌하수체 RNA와 혼성화되는 올리고누클레오티드 프로브를 구성시켰다. 이러한 RNA의 크기, 즉 1400 염기쌍은 1309 염기쌍과 폴리(A)테일(poly(A)tail)을 포함하는 서열화된 cDNA의 크기와 부합된다. 쥐의 뇌하수체로부터의 부분적인 cDNA 서열은 사람 cDNA의 서열과 동일한 것으로 밝혀져 상이한 종의 AF 유전자에서 보존되는 편재성 구조임을 나타내고 있다. 이러한 유사성은 상기 올리고누클레오티드를 상이한 종으로부터의 AF 코딩 RNA 및 DNA를 동정하는 데 사용될 수 있게 한다.
또한, rAF를 생물학적 활성 형태로 발현시키는 것이 가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라아제와의 융합 단백질의 형태의 AF 단백질은 대장균에서 다량으로 발현되고, 친화성 크로마토그래피에 의해 동질성이 될 때까지 정제된다. 트롬빈에 의한 융합 단백질의 분해 후에, 재조합 AF(rAF)가 매우 유력한 것으로 입증되었으며, 44 ng(10-12몰)이 쥐의 장에서 담즙 독소 유도 체액 분비의 반최대 억제를 제공한다.
유전자 기술에 의해, rAF의 더 작은 단편이 생성된다. 활성은 7 내지 8개의 아미노산으로 이루어진 작은 서열 중에 잔류하는 것으로 입증되었다. 이것은 화학적 고체상 합성에 의해 확인되었으며, 이 기술에 의해 옥타펩티드가 생성되고 몰 기준으로 rAF 거의 동일한 정도로 생물학적으로 유력한 것으로 입증되었다. 자리 유도 합성에 의해, 활성 자리 내의 다양한 서열이 구성되며, 특정 아미노산의 교체가 생물학적 활성의 손실 없이 가능한 것으로 입증되었다.
체액 분비는 장의 루프 모델에 의해 측정되며, 소장의 단면(루프)은 2개의 새쳐(sature)에 의해 결합되고; 루프에서, 특정량의 엔터로톡신이 주입된다. 항분비제를 시험하는 경우, 이들은 독소 유발 1시간 전 내지 2시간 후에 주입된다. 주입은 3가지 상이한 경로, 즉 정맥내, 장내 및 비내 경로에 의해 이루어진다. 체액은 독소 유발 5시간 후에 루프에 축적된다. 분비량은 장 1㎝당 축적된 체액의 중량으로부터 계산된다.
단백질의 서열은 아미노산 서열화에 의해 직접 및 cDNA 서열로부터의 추론에 의해 간접 둘 모두에 의해 결정된다.
재조합 AF는 독성 또는 전신 효과를 거의 나타내지 않는 것으로 보이며, 그 이유는 반최대 억제를 야기시키는 것 보다 100배 더 많은 용량이 제공된 쥐에서 명백한 독성 반응이 나타나지 않기 때문이다. 소장에 주입되는 경우가 효과적이기 때문에, 이것은 경구적으로 투여될 수 있다.
재조합 AF는 독소 유발 전에 주입되는 경우에만 효과적인 것으로 보이는 시험된 천연 AF의 제조물과는 대조적으로, 독소 유발 후에 주입되는 경우에 또한 분비를 억제시킨다. 이와 같이, rAF는 예방 및 치료 둘 모두를 위해 사용될 수 있다.
또한, rAF 및 이것의 펩티드 단편은 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)로부터의 독소 A에 의해 야기되는 소화관에서의 세포독 반응 및 염증을 억제시키는 것으로 입증되었다. 염료 투과성 시험에 의해, rAF 및 이것의 단편은 장의 점액, 뿐만 아니라 뇌에서 체액 압력을 조절하는 망상 코로이듀스(choroideus)에서 콜레라 독소에 의해 유도되는 병리적 투과성 변동을 역전시키는 것으로 입증되었다.
rAF에 대한 항혈청은 토끼에서 생성되고, 효소 결합 면역 검정(ELISA)에 사용된다. 이러한 검정은 체액 또는 공급물 중의 AF를 측정하는 데에 사용된다.
아가로오스 결합 rAF를 함유한 칼럼상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 AF(천연 또는 재조합)에 대한 항체를 정제하는 기술은 하기에 보고되어 있다.
항체는 또한, 면역조직화학 기술에 의해 조직 분비에서 AF의 검출을 위해 그리고 웨스턴-블롯에서 AF의 검출을 위해 효율적인 것으로 입증되었다.
본 발명은 첨부 도면과 함께 하기의 비제한적 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 키는 는 되어 본 발명은 청구항 1의 전제부에 따른 사출성형기에 관한 것이다.
실시예 1. cDNA의 클로닝을 위해 생성되는 AF에 대한 항체
항분비 인자를 돼지 혈액으로부터 아가로오스 상에서의 크로마토그래피 및 등전 포커싱에 의해 제조하였다. 혈액(항응고 성분 함유) 1ℓ에, 티오황산 나트륨 1g 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 1㎎을 첨가하였다. 혈액 세포를 원심분리에 의해 분리시키고, 맑은 혈장을 세파로오스 6B[파마시아 엘케이비 바이오테크놀로지 스톡홀름(Pharmacia LKB Biotechnology Stockholm)]을 갖는 칼럼을 통해 용리시켰으며, 겔 부피는 용액 부피의 약 10%에 상응한다. 3배 부피의 인산염 완충 식염(PBS = 0.15M NaCl, 0.05M 인산 나트륨, pH 7.2)로 세척한 후에, 칼럼을 PBS 중에 용해시킨 2배 부피의 1M α-메틸-D-글루코오스로 용리시켰다. 용리물을 농축시키고, "오메가 10K 병류" 한외여과막[필트론 테크놀로지 코포레이션(Filtron Technology Corp.)] 상에서 물에 대해 투석시켰다. 분획을 후속적으로 400㎖ 등전 포커싱 칼럼(LKB, 스웨덴) 상에서 암폴린(파마시아) 그래디언트(pH 4-6)에서 등전 포커싱에 의해 분별화시켰다. 등전점이 4.7 내지 4.9인 분획을 모으고, PBS에 대해 투석하였다. 이와 같이, 부분 정제된 AF를 작은 분취량으로 분할하고, 상기 기술된 방법에 따라 토끼에서 항혈청을 제조하기 위해 사용하였다.
토끼를 면역시키고, 사람 뇌하수체의 박편에서 세포내 물질을 오염시키는 능력에 대해 혈청을 시험하였다 (실시예 6에 기술된 방법). 혈청 중 하나만이 세포외 매트릭스 단백질의 오염 없이 특이적이고 독특한 세포내 오염을 나타내었다. 상기 항혈청을 대장균에서 사람 뇌하수체 발현 단백질로부터 cDNA/람다 파지 GT11 라이브러리의 스크리닝을 위해 선택하였다.
실시예 2. 사람 뇌하수체 및 뇌로부터의 cDNA 라이브러리의 스크리닝
9명의 백인의 푸울로부터 수득한 조직으로부터 유도된 정상 사람 뇌하수체로부터의 5'-스트레치 cDNA 라이브러리를 클론테크 라보라토리즈(Clontech Laboratories)로부터 입수하였다. 라이브러리의 스크리닝을 위해, 파지를 대장균 Y1090에 대해 150㎜ 접시에 대해 3 x 104플라크에 플레이팅시켰다. 포르신 AF에 대한 상기 기술된 토끼 항혈청을 23℃에서 4시간 동안 0.5배 부피의 대장균 Y1090-융해물로 흡수시키고, 1:400의 비로 희석시키고, 영(Young) 및 데이비스(Davis)에 따라 스크리닝을 수행하였다 (1). 알칼리-포스파타아제-컨쥬게이트 염소 항-토끼 항체를 제 2 항체[잭슨(Jackson)]으로서 사용하였다. 포지티브 플라크를 고정시키고, 파지 현탁 매질[20mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM MgSO4, 2% 젤라틴] 내로 용출시키고, 다시 플레이팅시키고, 시험한 모든 플라크가 포지티브가 될 때까지 스크리닝시켰다.
cDNA-재클로닝- AF 재조합체로부터의 파지 DNA를 위자드 람다 프렙스(Wizard Lambda Preps)[프로메가(Promega)]로 단리시키고, EcoR1으로 절단시켰다. 삽입물을 세파글라스 밴드프레프 킷츠(Sephaglas BandPrep Kits)(파마시아)로 정제하고, 제조업자가 설명한 바와 같이 pGex-1λT 벡터(파마시아)로 다시 클로닝시키고, 에피쿠리안 콜리 XL-블루(Epicurian Coli XL-Blue), 톱(Top) 1 세포 또는 BL21 세포(이들 3개는 모두 스트라타겐(Stratagen)으로부터 입수함)로 형질감염시킨다. rAF 또는 r펩티드를 다르게 규정하지 않는 한은 BL21 세포에서 제조하였다.
PCR에 의한 cDNA의 증폭 - cDNA의 결손 5'-말단을 얻기 위하여, PCR 기본 방법, 이른바 RACE(cDNA 말단의 신속한 증폭)을 수행하였다. 사람 뇌 cDNA 분자의 3'-말단에 결찰된 앵커 올리고누클레오티드를 갖는 5'-RACE-레아디(Ready) cDNA를 생성시키는 변형된 RACE 방법을 클론테크 라보라토리즈로부터 입수하였다. 5'-말단을 앵커에 상보적인 하나의 5'프라이머 및 2개의 네스티드 유전자 특이적 3' 프라이머 A 및 B(A=염기 429-411, B=염기 376-359; 도 1a)를 사용하여 2가지 PCR 증폭 단계의 일부로부터 증폭시켰다. RACE 단편의 다양한 더 작은 부분을 상응하는 펩티드를 발현시키고 이들의 생물학적 성질을 시험하기 위해 추가로 증폭시켰다. 이들 올리고누클레오티드 단편 및 이들의 상응하는 펩티드의 출발 및 말단에서 여기 및 아미노산의 위치를 표 1에 나타내었다. 포르신 및 소 cDNA(클론테크 라보라토리즈)를 표 1에서 N3에 상응하는 단편을 증폭시키기 위한 템플레이트로서 사용하였다. 서열의 변동 부분을 또한, 자리 유도 돌연변이에 의해 인위적으로 삽입하였으며, 이 방법으로 위치 168-193에 상응하는 다양한 올리고누클레오티드를 아미노산 35-42(SEQ ID No. 1로 나타낸 위치)를 하나씩 교체하도록 합성시켰다. 증폭된 DNA 단편을 앵커 및 유전자 특이적 프라이머 내로 축적된 EcoR1 자리를 사용하여 pGEX-1λT 내로 클로닝시켰다. RACE 방법에 의해 얻어지는 서열을 확인하기 위해, 사람 뇌하수체 및 뇌로부터의 이중 가닥 cDNA(클론테크)을 엑스트라 EcoR1 절단 자리를 함유하는 프라이머 쌍 C/D로 증폭시켰다 (도 1b). 프라이머를 전체 개방 판독 프레임(ORF)이 증폭되도록 설계하였다. 예측된 크기의 뇌하수체 및 뇌 PCR 생성물을 EcoR1으로 절단시키고, 단리시키고, 플라스미드 pGex-1λT 벡터내로 클로닝시켰다.
DNA 서열화 및 올리고누클레오티드 - 플라스미드 pGex-1λT로부터의 DNA를 시쿼나아제 버전 2.0 킷(U.S. 바이오케미칼 코포레이션)을 사용하여 디데옥시 사슬 말단 방법(15)에 의한 삽입물의 서열화를 위한 템플레이트로서 사용하였다. 삽입된 DNA의 바로 상류 및 하류에 있는 pGex-1λT의 영역을 복제하는 초기 전방 및 후방 프라이머를 파마시아로부터 입수하였다. 후속 프라이머를 얻어진 서열화 정보를 기준으로 합성하였다[스칸디나비안 진 신서시스 아베(Scandinavian Gene Synthesis AB)]. 3가지 상이한 PCR 클론을 5'-RACE 방법에서 Taq 폴리머라아제에 의한 염기 교환을 피하도록 서열화시켰다.
누클레오티드 서열 및 추론된 단백질 서열 데이터를 따르고, 맥벡터(MacVector) 4.1 [이스트만 케미칼 컴패니(Eastman Chemical Co.)]을 사용하여 분삭하였다. cDNA 삽입물의 상응하는 아미노산 서열을 예측하기 위해, 상이한 판독 프레임 코돈 사용을 비교하고, 하나의 큰 개방 판독 프레임을 수득하였다. 단백질 및 단백질 서열 데이터의 인터로게이션(interrogation)을 엔트레츠(Entrez) CD-ROM 디스크[내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information), 베테스다, USA)의 사용에 의해 수행하였다.
cDNA의 분자 클로닝 및 서열 분석 - 돼지로부터의 AF 단백질에 대한 다가 항혈청을 사람 뇌하수체로부터의 cDNA를 스크리닝하기 위해 사용하였다. 면역반응성 AF를 발현시키는 2개의 클론을 단리시키고, 파지 람다로부터 분리하고, 파마시아로부터 제공된 킷에서 기술된 바와 같이 벡터 pGex-1λTdml EcoR1 자리 내로 다시 클로닝시켰다. 제한 분석으로, 각각 1100 및 900 bp의 삽입 자리를 수득하였다. 2개의 클론의 DNA 서열화로, 하나의 치환을 제외하고는 동질성이 완결된 것이 확인되었다 (도 1, 위치 1011에서 C가 T 대신 교체됨). 클론 2의 5'-말단의 상류의 서열을 RACE 방법에 의해 수득하였다. 단편은 총길이가 376 bp이다 (5'-말단에서 합성 누클레오티드 아암을 포함하지 않음). 전체 제한된 cDNA는 폴리-A-테일 뒤에 1309개의 염기쌍을 함유하며, 이는 폴리-A 신호에 의해 진행된다 (도 1, 위치 1289-1295). 1146 bp의 하나의 개방 판독 프레임(ORF)(위치 63-1208)이 확인되었다.
실시예 3. 재조합 플라스미드로부터의 포유동물 AF 단백질의 발현
융합 단백질의 구성 및 정제 - 전체 cDNA의 면역 스크리닝 및 PCR 증폭에 의해 수득한 cDNA 클론을 pGex-1λTDP 결찰시켰다. 상기 벡터는 파마시아로부터 제공된 킷의에 의해 비변성 조건하에 친화성 정제될 수 있는 쉬스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum) 26 kDa 글루타티온 S-트랜스퍼라아제의 C 말단에 대한 융합체로서 대장균에서의 외래 단백질의 발현을 허용한다. 간략하게, 재조합 pGex-1λT 플라스미드로 형질전환시킨 대장균의 밤샌 배양액을 새로운 배지 중에서 희석시키고, 37℃에서 추가로 3시간 동안 성장시켰다. 단백질 발현을 0.1mM IPTG(이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)에 의해 유도하고, 30℃에서 추가로 4시간 동안 성장시킨 후에, 세포를 펠릿화시키고, PBS 중에 재현탁시켰다. 세포를 초음파에 의해 융해시키고, 1% 트리톤 X-100으로 처리하고, 10분 동안 12000X g으로 원심분리시켰으며; 발현된 융합 단백질을 함유하는 상등액을 융해물을 글루타티온 아가로오스(파마시아)를 통해 통과시킴으로써 정제하였다. 융합 단백질을 유리 글루타티온으로 완결될 때까지 용리시키거나, 10 U TH 트롬빈으로 밤새 분해시켜서 GST 친화성 테일로부터 AF-단백질을 분리해내었다. pGex 플라스미드를 사용하여 재조합 단백질 또는 펩티드를 정제시키는 총괄적인 방법은 파마시아(Pharmacia)사로부터 제공된 키트에 의해 수행하였다.
재조합 AF 단백질의 서열 및 크기 - 코딩 서열을 확인하기 위해, 전체 길이 전사체를 뇌하수체 및 뇌 cDNA의 PCR 증폭에 의해 단리시켰다. 프라이머 쌍 C/D를 사용하여, 클론-4(도 1)의 서열과 동일한 1215bp를 단리시켰다. 오픈 리딩 프레임은 계산된 분자 질량이 41.14 kDa 이고 계산된 PI가 4.9인 382개의 아미노산을 코드화시켰다.
AF 클론-1, 2 및 3 이외에도 올리고누클레오티드 N1-N5(도 1 및 표 1)을 pGEX-1λT 플라스미드 벡터로 결합시켜서 ORF는 프레임중에 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST) 단백질을 갖는다. 구성물은 대장균으로 형질전환되고, 융합 단백질의 발현은 IPTG를 사용하여 유도시켰다. 정제된 융합 단백질 및 트롬빈 분할 AF 단백질 또는 펩티드는 돼지 항분비 요소(도 2)에 대한 항혈청을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅시켰다. 단백질의 쿠마지 밝은 청색 착색으로 작은 성분으로 퇴화가 나타나는 GST-AF-1 단백질을 제외하고 각각의 단백질에 대한 분리된 밴드가 나타났다.
고체상 펩티드 합성 - 작은 펩티드(표 1에서 P7내지 P18)를 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) 펩티드 합성기를 사용하여 고체상에서 생성하였다(K.J. 로스-피터슨 AS). 각각의 펩티드의 순도는 물/아세토니트릴중에서 0.1% 트리플루오로 아세트산의 선형 성분을 사용하여 델타팩 C18, 300A상의 가역상 HPLC에서 평가되는 바와 같이 93 내지 100% 였다.
아미노산 서열화 - 단백질 서열 분석을 수행하여 동일한 ORF를 추가 확인하였다. 순수한 AF 단백질을 10% 매크로 slab 겔 SDS-PAGE(14)에서 조작하고 단백질을 전기 블롯팅(Bio-Rad)에 의해 프로블롯 막(어플라이드 시스템)으로 이동시켰다. 선홍색 S 착색에 의해 가시화된 얼룩을 블롯으로부터 삭제하고 단백질의 첫번째 20개의 아미노산을 자동 서열기(어플라이드 시스템스)에서 에드만 퇴화에 의해 서열화시켰다.
클론 2 및 클론 3의 N 말단 서열을 결정하고, 예상된 서열(도 1)의 아미노산 63-75 및 130-140이 각각 완전하게 부합되는 것으로 나타났다.
겐뱅크로부터 시판되는 다른 단백질 서열과의 비교는 rAF(도 1)의 서열이 이것의 모든 부분에서 특이하고 유사한 서열이 전혀 없는 것으로 보고된 것을 나타내고 있다.
단백질의 첫번째 10개의 잔기는 카이테돌리틀(KyteDoolittle)(22)에 따라 분석되고 단일 펩티드를 구성하는 경우, 비교적 소수성인 것으로 나타났고, 이들은 단백질의 엑소사이토시스 이전에 분할된다. 이러한 해석은 재조합 단백질이 뇌하수체 분비선으로부터 추출된 단백질보다 다소 높은 분자 질량을 갖는 것으로 밝혀진 웨스턴 블롯 분석(도 3)에 의해 지지된다. 그러나, 이러한 차이의 일부는 또한 융합 단백질의 트롬빈 분할 부위를 구성하는 재조합 단백질에서의 추가 5개의 아미노산에 의한 것이다.
실시예 4. rAF에 대한 항혈정의 생성 및 시험
재조합 GST-AF 융합 단백질에 대한 항혈청 - ELISA, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학에서 사용하기 위한 정제된 융합 단백질 GST-AF-1, GST-AF-2 및 트롬빈 분할 순수 AF-1 단백질(=rAF)에 대한 항체를 집토끼에서 생성하였다. 각각의 집토끼에 프로인트의 완전 보조제 1ml와 혼합된 1ml PBS에서 항원 100㎍을 투여하였고, 각각의 면역 조치를 등에서 피부내 주사된 8-10 부분으로 배당하였다. 50㎍ 항원을 갖는 2번의 효능 촉진제 투여량을 3 및 5 주에 주사하였고, 마지막에는 프로인트 완전 보조제 없이 주사하였다. 집토끼를 마지막 효능 촉진제 투여후 6일간 방혈시키고 혈청을 준비하여 -20℃에서 저장하였다. 항혈청의 감도를 도트 블롯 검정으로 시험하였다. GST-AF-2를 1/5 희석으로 ECL 니트로셀룰로오스 막상에 도포하고, 항혈청을 1:1000 으로 희석시켰다. 막은 16시간 동안 4℃에서 PBS중에 1% 소 혈청 알부민(BSA)로 블로킹시킨 후, 집토끼 항-GST-AF 또는 돼지 AF 항혈청의 1:800 희석으로 1.5 시간 동안 인큐베이팅시켰다. 블롯을 알칼리 포스파타제 컨쥬게이트 염소 항 집토끼 면역글로불린에 이어서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 및 p-니트로 블루 테트라졸륨(뵈링커 만하임)으로 전개시켰다. 항원 검출에 대한 평가된 한계는 이 시험에서 약 1ng 이었다.
사람 및 돼지 뇌하수체 분비선 추출물 및 순수 AF 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역 블롯팅-SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 가교제로서 비스-아크릴아미드가 상응하는 분자성을 갖는 N,N'-디알릴타르타르디아미드에 의해 대체되는 변형을 갖는 것이 라엠리(Laemmli)(4)에 의해 설명되는 바와 같이, 10% 아크릴아미드 미니슬랩 겔중에서 수행하였다. 피로닌 Y(시그마)를 전기 영동 프론트의 마커로서 사용하였다. 사전 착색된 분자량 참고 문헌을 BDH로부터 구입하였다. 그 후 단백질을 쿠마지 밝은 청색으로 착색시키거나 전기영동에 의해 면역블롯팅용 0.45mm 구멍 크기 ECL 니트로 셀룰로오스(아머샴)으로 이동시켰다. BSA를 갖고, 항 IgG 및 알칼리 포스파타아제 기질과 컨쥬게이트된 생성된 배양물은 상기에 설명된 도트 블롯 검정에 있어서 동일하였다.
상기에 언급된 바와 같이 쿠마지 밝은 청색 착색은 아마도 작은 성분으로의 단백질 가수 분해성 퇴화에 의해, GST-AF-1 단백질에 대한 분리 밴드를 전혀 나타내지 않았다. 그러나, 웨스턴 블롯 분석에서 전체 길이의 단백질은 퇴화된 생성물(도 2b)보다 훨씬 강한 시그날을 제공하였다. 돼지 AF에 대한 항혈청과의 강한 반응은 재조합 단백질이 실제로 AF와 같은 면역반응성을 갖는 것으로 나타났다. 전체 길이 단백질의 분자량은 아미노산 조성물로부터 추정된 참값 분자량 41139Da 보다 높은 약 60kDa인 것으로 나타났다. 추가로, 단백질은 또한 트롬빈 분할 단백질(도 3)에 결합된 GST-AF-2에 대해 증가된 항혈청으로 면역블롯팅시키고 탐침시켰다.
재조합 GST-AF-2에 대한 항혈청은 분자 질량이 60kDa이고, 일부 작은 성분, 가능하게는 효소적 퇴화 생성물(도 3a)를 갖는 천연 발생 AF 단백질과 반응하였다.
AF-농도-ELISA 검정의 결정에 위한 ELISA를 상기에 설명된 방법(5)에 따라 항-AF-1 및 항-AF-2를 사용하여 수행하였다. 도 3b에서 제시되는 바와 같이 미정제 항혈청을 사용한 시험의 감도는 1 내지 10㎍인 반면 친화성 정제된 항체를 사용한 시험은 5 내지 50ng 단백질 사이의 감도를 갖는다.
실시예 5. 뇌하수체 분비선으로부터의 RNA의 노던 블롯 분석
노던 블롯 분석 - 사람 뇌하수체 분비선을 사알그렌스카(Sahlgrenska) 병원으로부터 부검을 얻었다(스웨덴 건강 복지 위원회에 의해 허가됨; 2§ transplantationslagen, 1975:190). RNA를 얻기 위해, 뇌하수체 분비선을 촘찐스키(Chomczynski) 및 사키(Sacchi)(6)에 따라 구아니디늄 티오시아네이트 RNA로 추출하였다. 폴리아데닐화된 RNA를 올리고dt-셀룰로오스를 갖는 칼럼을 사용하여 통상적인 킷(파마시아)에 의해 선택하였다. 부가적으로, 클론테크로부터 구입한 107명의 부검으로부터의 사람 뇌하수체 mRNA의 뇌하수체를 사용하였다. 각각의 샘플의 폴리(A+)RNA 5㎍을 글리옥살 처리하고 1.2% 아카로오스 겔(7)에서 전기영동시켰다. 하이본드(Hybond) N+ 나일론 막(아머샴)으로 0.05M NaOH에서 3시간 동안 모세관 알칼리 이동 후에, 사전 혼성화 및 혼성화를 42℃에서 24시간 동안 수행하였다. 혼성화 용액은 50% 포름아미드, 5xSSPE를 함유하고, 10X덴하르트 용액은 변성된 저분자량 DNA 250㎍ml 및 폴리아데닐산 50㎍/ml를 갖는다. 블롯을 서열(도 1)의 위치 132-105(프라이머 E), 297-270(프라이머 F), 748-721(프라이머 G) 및 833-806 (프라이머 H)를 포함하는 4개의 상이한 안티센스 28bp 올리고누클레오티드로 탐침시키고, 프로브를 말단 트랜스퍼라제(뵈링거 만하임)과 [α32p]ddATP(아머샴)으로 3'-말단 표지화시키고 닉 칼럼(파마시아)상에서 정제시켰다. 5XSSPE/0.1% SDS-0.5XSSPE/0.1% SDS중의 5개의 후세척물을 각각 30분 동안 42℃에서 제조하였고, 마지막 세척을 반복하였다. 필터를 7일 동안 하이퍼필름 MP(아머샴)에 노출시켰다.
뇌하수체 분비선에서의 발현 - 노던 블롯 분석을 클로닝된 cDNA(eh 4)를 따라 상이한 서열로 혼성화된 4개의 올리고누클레오티드 프로브의 혼합물을 사용하여 수행하였다. 상기 프로브를 뇌하수체 분비선으로부터 분리된 mRNA에서 약 1400bp의 단일 밴드를 사용하여 혼성화시켰다. 가장 강한 시그날을 사람 물질을 사용하여 수득하였지만, 돼지 물질도 또한 교차결합하였다.
실시예 6. 뇌하수체 분비선의 섹션에서의 AF의 분포
종 및 조직 - 사람 뇌하수체 분비선을 사알그렌스카 병원으로부터 부검을 얻었다(스웨덴 건강 복지 위원회에 의해 허가됨; 2§ transplantationslagen, 1975:190). 포스페이트 완충 염수(PBS=0.15 M NaCl, 0.05M 인산나트륨, pH 7.2)중에 용해시킨 후, PBS 중에서 7.5% 수크로오스로 전달된 4% 파라포름알데히드중에서 24시간 동안 고정된 조직학 검사를 위해 사용되는 것을 제외하고, 분비선을 -70℃에서 냉동 저장시켰다. 도살장으로부터 얻은 5 내지 7개월 된 돼지로부터의 뇌하수체 분비선을 이송 동안에 드라이 아이스상에 두고 사용할 때까지 -70℃에서 냉동 저장시켰다. 2 내지 3개월 된 스프라그-다울리 쥐를 스웨덴 솔렌투나에 소재한 B & K 유니버살 AB로부터 바이오 검정을 위해 얻었다. 면역 시험용 집토끼(뉴질랜드 화이트)를 스웨덴의 리드쾨핑 카닌파름으로부터 얻었다.
면역조직화학 - 고정된 뇌하수체 분비선을 액체 질소중에 냉동시키고, 두께가 7㎛인 크리오 섹션을 제조하였다. 각각의 샘플로부터 분비선의 상이한 부분을 포함하는 5-10 섹션을 현미경 슬라이드에 고정시켰다. 섹션을 5% 지방이 제거된 건조 우유중에 블로킹시키고 습기찬 챔버에서 밤새 4℃에서 1:4000 내지 1:8000 희석된 주요 집토끼 항혈청(항-GST-AF-2 융합 단백질)로 인큐베이팅시켰다. 완충액중에서 헹군 후에, 견본을 1:50 (다코 A/S) 희석된 알칼리 포스파타제 컨쥬게이트 스윈 항 집토끼 면역글로불린으로 23℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 면역 반응을 다른 곳(8)에서 설명된 바와 같이 포스파타제 기질로 가시화시켰다. 조절 섹션을 과량의 GST-AF-2 단백질로 흡수된 면역 혈청으로 인큐베이팅시키거나 주요 항체를 제외하고 모든 인큐베이션 단계를 사용하여 인큐베이팅시켰다.
뇌하수체 분비선의 섹션에서 AF의 분포. 사람 뇌하수체 분비선의 섹션에서 AF의 분포를 면역조직화학 기법(도 5)을 사용하여 연구하였다. 조사된 모든 견본에서, 아데노 하수체에서 세포를 적당수 착색시키고, 면역 착색된 물질은 사이토플라즘중의 입자중에 위치하는 것으로 나타나며; 과량의 GST-AF-2 단백질을 사용한 면역 혈청의 사전 흡수를 시그날을 제거하였다. 후두 부분(신경 하수체)에서 착색은 전혀 발견되지 않았다.
뇌하수체 분비선에서 면역 반응 물질의 분포는 단지 전방 로브(lobe)(아네노 하수체)의 분비 세포중에 AF의 세포내 분포를 증명하고 있다. 이러한 로브로부터 방출된 단백질은 성장 호르몬, 티로트로핀, 코르티코트로핀, 프로락틴 및 황체 형성 호르몬을 포함한다. 세포내 위치로부터 혈관계까지의 상기 호르몬의 통과는 시상 하부중의 신경 내분비계 세포에 의해 생성된 방출 인자에 의해 유인된다.
실시예 7. rAF의 생물학적 활성
항분비 활성 - 항분비 활성을 이전에 설명된(9) 쥐 장 루프 모델에서 측정하였다. 공장 루프를 콜레라 독소 3㎍으로 시험하였다.
상이한 투여량을 갖는 정제된 AF-1-단백질 또는 PBS(대조군)를 콜레라 독소로 자극하기 전 또는 후에 주입하였다. 장환에서 축적된 장액의 중량(㎎/㎝)을 5시간 후에 기록하였다. 각각의 AF 조제물을 6마리 이상의 쥐에서 시험하였다. 데이터의 통계적인 분석을 위해 포어성 동물의 PLSD를 이용하였다.
rAF 단백질의 생물학적 활성 - 대장균에서 생성된 클론-1의 순수 rAF 단백질의 생물학적 활성을 쥐 모델에서 시험하였다. 콜레라 독소로 장을 자극하기 전에 rAF 단백질을 20 내지 30 초동안 정맥내로 주입할 경우, 장액 분비를 억제하기 위한 rAF의 능력이 도 6에 도시되어 있다. 단지 완충제만 주입한 대조군 동물에서, 콜레라 독소는 두드러진 분비액, 즉 장길이 ㎝당 412±9㎎의 분비액을 유발한다. 순수 rAF는 완충제(p＜0.01, n=6)에 대한 반응과 현저하게 상이한 콜레라 분비액의 투여량 의존적 억제를 유발한다. 클론-1의 9ng이 34%까지 반응을 감소시키는 데 충분하며, 44ng(10-12몰) 및 220ng는 반응을 각각 46% 및 78%까지 감소시킨다. 재조합 AF의 생물학적 활성은 공지된 다른 장독소의 생물학적 활성보다 크며, 다른 장 호르몬 또는 뉴로펩티드 변형 물 및 전해질 이송의 생물학적 활성보다 크다. 또한, 쥐에서 인간 rAF의 활성 수준은 놀랄만큼 높으며, 아마 이것은 상이한 종에 대한 rAF 분자에 보존되는 편재 구조를 반영함을 나타낼지도 모른다. 이러한 가설은 인간과 웨스턴 블롯 및 노던 블롯 분석에서 수득한 돼지 물질 사이의 상호 반응성에 의해 지지된다.
콜레라 독소 자극 전과 콜레라 독소 자극 후 90 분후에 20 내지 30 초동안 정맥내로 rAF를 주입할 경우, 장액 분비를 억제시키는 rAF 0.5㎍의 능력을 비교하였다(도 7). 둘 모두의 투여는 대조군 동물(p＜0.01, n=6)와 비교하여 현저한 억제를 나타내었다. 따라서, 자연적 AF와는 다르게, 재조합 단백질은 독소 자극 후에 제공되는 것이 또한 효과적이고, 이것은 설사 치료에 유용한 rAF를 만든다.
rAF 3㎍을 콜레라 독소로 자극된 관에 인접하게 위치한 8 내지 10㎝의 관에 주입하였다. rAF가 독소 자극전 또는 독소 자극후 90분 후에 20 내지 30 분동안 유도되었다. 대조군(p＜0.01, n=6)과 비교하여 분비액의 현저한 감소가 달성된 둘 모두의 시험군이 도 8에 도시되어 있다; 두 시험군 사이에는 상이한 점이 관찰되지 않았다. 이러한 실험은 rAF가 경구 투여에 활성적이며, 심각한 부작용을 초래하지 않을 정도로 제공되는 동물 먹이에 첨가함으로써 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
상기 설명된 실시예에서, rAF는 에피쿠리언 콜리(Epicurian Coli) XL-1 세포에서 생성된다. 이러한 세포에서, 상당한 생성된 rAF는 더 작은 펩티드로 분해된다. rAF가 BL21 세포에서 생성될 경우, 단지 rAF의 적은 부분만이 분해되며, 반면 Top 1 세포에서는 분해가 관찰되지 않는다. 놀랍게도, 생물학적 활성은 분해의 정도에 비례한다. 즉 더 많은 분해가 더 높은 활성을 유도한다. 따라서, 다양한 짧은 단편을 이들의 가능한 생물학적 활성을 시험하기 위해 제조하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 이러한 단편을 상기의 손상되지 않은 rAF에 대한 상기 설명된 바와 같은 동일한 방법으로 콜레라 독소 자극 전에 정맥내 시험을 하였다. 0.1, 1 및 10㎍의 양으로 시험한 클론 2 및 3의 발현된 펩티드는 독소 반응에 효과적이지 않았다. 이와는 달리, RACE 단편(클론 4)의 발현된 펩티드 1㎍은 두드러진 효과를 나타냈다. 많은 더 짧은 구조를 RACE 단편으로부터 유도하였고, pGex-1-lambda에서 발현시켰다. 표 1에 나타난 바와 같이, 활성 부위가 아미노산 잔기 35와 51사이에 위치함이 발견되었다. 활성 부위를 좀더 정확하게 측정하기 위해, 세 개의 작은 펩티드를 고체상 펩티드 합성으로 만들었다. 이들중 두 개는 활성적이고; 펩티드 35 내지 46(P3) 및 펩티드 35 내지 42(P1); 후자 옥타펩티드 IVCHSKTR(P1)은 손상되지 않은 rAF로서의 1몰에서 거의 활성적인 투여량 1ng 미만에서 활성을 갖는다. 이와 달리, 더 짧은 헥사펩티드 VCHSKT(P2)는 1ng 내지 10㎍의 투여량으로 시험됐을 때는 아무런 영향을 끼치지 못했다.
인간 단편 P1 상응하는(단 특정 변화 및/또는 삭제를 가짐) 펩티드 X1VCX2X3KX4R을 부위 유도 돌연변위원에 의해 또한 제조하였고, 이들의 생물학적 활성을 시험하였다. 소 및 돼지 cDNA의 서열을 또한 비교하였다. 이러한 연구는 하기와 같은 변화 및/또는 삭제를 나타낸다:
X1는 I 이거나 아무것도 아니며,
X2는 H, R 또는 K이며,
X3는 S, L 또는 또 다른 중성의 아미노산이며;
X4는 T 또는 A이다.
| 코드 | 올리고누클레오티드* | 펩티드 | 콜레라 분비 억제*** | pmol ED50 |
| N1 | 63-301 | 1-8 | + | 4 |
| N2 | 168-301 | 36-80 | + | 6 |
| N3 | 168-215 | 36-51 | + | 3 |
| N4 | 122-170 | 21-36 | - | |
| N5 | 186-269 | 42-69 | - | |
| P3 | S.P.S.**** | 35-46 | + | 7 |
| P1 | S.P.S. | 35-42 | + | 5 |
| P2 | S.P.S. | 36-41 | - | |
| * AF cDNA 및 pGex-1-lambda로부터 생성된 구조에서 발현되는 서열 번호. 1의 염 기쌍의 위치.* 합성된 펩티드의 앞과 말단에서 AF중의 아미노산 잔기(서열 번호. 1)의 위치.*** 결합된 쥐 장환에서 장액 분비를 유도하는 콜레라 독소의 억제; 활성 펩티드 에 대한 반감기 억제(ED 50)를 유도하는 양(pmol)을 나타내었다.**** 이 펩티드는 고체상 합성에 의해 생성되었다. |
장막 염증에 대한 rAF의 효과를 또한 모델 쥐의 장환에서 시험하였다. 따라서, 20 마리의 쥐를 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile)(10)으로부터의 0.5㎍의 독소 A로 자극하고, 2.5 및 5시간 후에 각각 염증성 및 장액의 분비를 측정하였다(10 + 10 쥐). 자극 전에 각각의 군의 쥐중 반마리에 100ng의 rAF를 30초 동안 정맥내 투여하였다; 나머지 반은 대조군으로서 PBS 완충제를 투여하였다. 쥐를 죽인 후, 관을 절개하고, 관의 중간 2 내지 3㎝ 부분을 드라이 아이스에서 냉동시켰다. 그 후, 냉동 견본을 라이카 저온유지 장치를 사용해서 8㎛의 두께의 분획으로 만들었다. 분획을 효소 조직화학에 의해 알칼린 포스파타아제를 입증하기 위해 염료시켰다. 알칼린 포스파타아제가 장 상피세포에서 발현되고, 이러한 염색은 장 상피세포의 완전도를 평가하게 한다.
결과는 대조군 쥐가 장막의 광범위한 손상을 일으킴을 나타낸다; 기저막으로부터의 상피세포의 탈피가 회저성 조직과 함께 2.5시간 후 관찰된 반면, 광범위한 방혈은 5시간 후에 관찰되었다. 독소 A에 의해 유도된 장액 분비가 또한 2.5시간 후 199±4 내지 137±5mg/cm로 억제되고(p＜0.01), 6 시간후 421±3 내지 203±6mg/cm로 억제되었다(5 마리 쥐/군, p＜0.01).
유사한 실험을 rAF 단백질 대신 0.5㎍의 펩티드 IVCHSKTR(=P1)로 수행하였다. 옥토펩티드는 독소 A에 의해 유도된 장염증 및 장액 분비에 대한 동일한 효과를 도 9에 도시된 바와 같이 수득하였다.
독성 - rAF의 독성을 시험하기 위해, 이를 고투여량, 즉 한 마리 쥐당 50㎍으로 주입하였다. 명백한 독성 반응이 일주일 동안 관찰되지 않았다.
실시예 8. 장 투과성에 대한 rAF의 생물학적 활성
혈액에 용해되 있는 유기체의 투과성에 대한 rAF의 효과를 평가하기 위해, 에반스(Evans) 블루 염료 시험을 상기 설명된 방법(11)에 따라 수행하였다. 실험을 초기에 상기 실시예 7 및 콜레라 촉소 자극 전에 rAF의 정맥 주입을 나타낸 도 5에 설명된 바와 같은 방법으로 수행하였다. 그러나, 장액 분비가 측정되지 않았지만, 독소 자극후 90분 후에 PBS중의 1.5% 용액을 정맥내로 주입하였다. 염료가 5분 동안 퍼지도록 하였다. 그 후, 200㎖의 4℃ PBS/알세비얼(Alsevier)(1/1 비) 용액의 쥐 좌심실 우심방(연동 펌프[콜 팔머 인스트루먼트, 시카고, 아이 11. U.S.A]을 이용)을 경유한 교차살포를 약 150초 동안 에테르 마취하에 수행되도록 처리하였다. 이러한 방법은 혈관 시스템에 존재하는 EB를 모두 제거하고, 염료의 포름아미드에 의해 검출되는 간질성 조직에만 EB가 존재하도록 하기 위해 착수하였다.
표 2의 결과는 CT-자극이 장 조직으로부터 추출될 수 있는 EB의 양을 약 43% 현저하게(p＜0.001) 증가시키고, 반면 콜레라 독소 자극 전에 1 BrT의 정맥내 주입은 이러한 증가를 억제함을 입증하였다. 즉, 군 1(대조군)의 조직으로부터 추출된 EB의 양은 군 3(1 rAF + CT)로부터 추출된 EB양과 다르지 않다.
| 군 | 자극원 | ng | EB/g 장 조직 x 10-07 | EB-농도의 증가% |
| 1 | PBS + PBS | 6 | 29.3±1.0 | - |
| 2 | PBS + CT | 6 | 51.8±1.3 | 43(p＜0.001) |
| 3 | 1rAF + CT | 6 | 29.6±1.5 | 0 NS |
도 10 및 11에 도시된 결과는 미리 P1(IVCHSKTR)으로 처리한 쥐 및 처리하지 않은 쥐의 콜레라 독소 자극 후, 작은 창자 및 측뇌실 맥락총에서 아조 염료 에반스 블루의 넘쳐 흐름을 입증하였다.
실험을 하기와 같은 방법으로 수행하였다:
무게가 350g인 숫쥐 스프라구-댈리(Sprague-Dawley)를 실험 과정 전에 18시간 동안 굶겼다(단, 물은 공급함). 쥐를 6개의 군으로 이용하였다. 펩티드 P1, 콜레라 독소(CT) 및 PBS를 표 3에 따라 투여하였다.
| 그룹 | 정맥 주입.1* | 경구 주입* | 정맥 주입.2* |
| A | P1 | CT | EB |
| B | PBS | CT | EB |
| C | PBS | PBS | EB |
| * P1(ⅳ) 주입 1이 2㎖ PBS의 부피로 제공되었으며, 경구(po.) 주입이 5㎖의 부피로 제공되었고, 정맥내 주입 2는 PBS중에 용해된 3% 에반스 블루 1.5㎖로 구성된다. 에테르가 모든 주입의 수행동안 마취제로 이용되었다. |
100㎍ CT 또는 PBS로 경구 자극하기 전에, P1(0.5㎍) 및 PBS의 정맥내 주입을 10 내지 15초 동안 수행하였다; 자극 후 60분 후에, 쥐를 에테르로 마취시키고, 에반스 블루를 정맥내로 주입하였다. 염료가 균질화되도록 추가로 30분 동안 방치하고, 이후 쥐를 다시 에테르로 마취시키고, 250㎖의 알세벌스(Alsevers) 용액/PBS = 50/50을 좌심실을 경유하여 심장내로 살포시켜서, 혈관에 존재하는 염료를 모두 제거하였다. 이러한 2 내지 3분 동안 수행된 살포 처리후, 형광 표시가 외부 혈관 시스템에만 존재하는 염료를 나타낸다. 뇌 및 소장의 일부를 샘플링하고, 드라이아이스상에서 냉동시키고, 8㎛ 두께의 저온 유지 섹션을 준비하였다. 상기 섹션을 공기 건조시키고, 크실렌 함유 설치용 매질에 설치하였다. 상기 섹션을 로다민 방출 형광법에 사용되는 것과 동일한 필터 조합을 사용하여 차이스 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 10 및 도 11에서의 결과는 형광도(백색)가 소장(도 10)과 그룹 A(P1 iv + CT po) 및 C(PBS iv + PBS po)의 맥락총에서 크기가 유사함을 입증한다. 소장과 그룹 B(PBS iv + CT po)의 맥락총에서의 높은 형광도와 비교하면, 상기 결과는 독소 자극전에 옥타펩티드의 주입이 에반스 블루의 CT-유도된 혈관외 침투를 억제함을 분명히 입증한다. 이 결과는 이것이 소장의 혈관계에서 뿐만 아니라 뇌의 측뇌실의 맥관총에서도 사실임을 시사한다.
결론적으로, 정맥내 옥타펩티드 IVCHSKTE 투여의 효과는 소장에서 뿐만 아니라 중추신경계의 맥관총에서도 에반스 블루의 콜레라 독소 유도된 혈관외 침투를 억제하는 것이다. 따라서, rAF 및 이들의 펩티드 유도체의 작용은 소장에만 제한되는 것이 아니며, 중추신경계 혈관의 투과성에도 영향을 미친다. 이러한 발견은 rAF 및 이들의 펩티드 유도체가 병리적인 두개내 압력, 중이에서의 압력 변경 및 혈관에서 다양한 형태의 투과성 변화를 역전시키는 데 사용될 수 있다.
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도면 설명
도 1a 및 이어지는 도 1b는 신규한 사람 단백질의 핵산 서열 및 유도된 아미노산 서열이다. 확인된 아미노산 서열에는 밑줄이 그어져 있다. 도 1c 는 클로닝된 cDNA 및 올리고누클레오티드르 도시한 수평도이다.
도 2는 쿠마시(Coomassie)의 밝은 청색 염색된 SDS-폴리아크릴 아미드 미니겔(A) 및 돼지 AF(B)에 대해 항혈청으로 프로빙된 면역블롯을 도시한 것이다. 프라임되지 않은 숫자를 갖는 레인은 글루타티온-아가로오스-정제된 GST-AF 유합 단백질인 AF-1, AF-2 및 AF-3를 함유하는 반면, 프라임된 숫자를 갖는 레인은 트롬빈으로 분해된 융합 단백질을 함유한다.
도 3a는 재조합 단백질 AF-2에 대한 항혈청을 사용하는 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 좌측으로는 돼지(P) 및 세개의 사람(H1, H2, H3) 뇌하수체를, 그리고 우측으로는 세개의 재조합 단백질 AF-1, AF-2 및 AF-3(도 2 참조)를 적용하였다(분자량 기준을 중심으로(R)).
도 3b는 토끼에서의 미정제 항혈청 및 친화성 정제된 항체를 사용하는 rAF의 효소 결합된 면역 검정(ELISA)을 도시한 것이다.
도 4는 사람 및 돼지 뇌하수체(p = 푸울링됨 및 i = 개개의 재료)로부터의 RNA의 노던 블롯의 오토라디오그램을 도시한 것이다. 5㎍의 정제된 mRNA를 각각의 수반에 가하고, 3'-말단32P-표지화된 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여, 7일 후 오토라디오그램을 전개하였다.
도 5는 재조합 단백질 GST-AF-2에 대한 항혈청으로 염색된 샘뇌하수체의 저온 섹션을 도시한 것이다. A. 다양한 등급의 포지티브 면역반응성을 갖는 분산된 세포를 나타내는 면역 혈청으로 인큐베이팅된 섹션(진한 화살표). 많은 세포가 착색이 완전히 결여되어 있다(빈 화살표). B. 과량의 재조합 단백질 GST AF-2로 예비 흡수된 면역 혈청으로 인큐베이팅된 A에 대한 연속적인 섹션. 세포의 특이적 염색은 없다. C 및 D. 면역포지티브 세포를 보다 크게 확대하면 내분비 세포, n = 핵, c = 세포질의 세포질 염색을 입증한다.
도 6은 콜레라 독소 유도된 액 분비의 억제를 시험하는 재조합 단백질 AF-1의 생물학적 활성을 도시한 것이다. 등급화된 단백질의 투여량을 쥐에 정맥 주사하였다. 3㎍의 콜레라 독소를 장루프내에 주사하였다. 5시간 후, 루프에 축적된 액(㎎/장의 ㎝)을 측정하였다. 각각의 값은 6마리의 동물의 군의 평균 ± S.A.E를 나타낸다.
도 7은 정맥 주사된 rAF-1의 생물학적 활성을 나타낸 것이다. 0.5㎍의 rAF를 쥐의 장루프에 3㎍의 콜레라 독소로 자극하기 전 20 내지 30초에 또는 90 분 후에 투여하였다.
도 8은 요추내 주사된 rAF-1의 생물학적 활성을 나타낸 것이다. 3㎍의 rAF를 쥐의 장루프에 3㎍의 콜레라 독소로 자극하기 전 20 내지 30초에 또는 90 분 후에 주사하였으며, 이 rAF를 상기 독소가 주사된 루프에 약 5㎝에 인접하여 주사하였다.
도 9에서 A(x 2.5)는 장루멘(L)에서 세포 잔해물을 나타내는 대조군(PBS) 루프이나, 잔류하는 점막의 염색은 나타나지 않는 데, 이는 상피 내층이 모두 파괴되었음을 시사한다. B(독소 자극전 0.5㎕의 P1)는 융모를 형성하는 상피 라이닝을 분명하게 나타내며, 이는 보존된 정상의 장점막을 나타낸다. L=장루멘. 바 = 500㎛. C(x10)은 PBS 처리된 대조군에서 파괴된 점막을 나타내며, D는 시험(P1-처리된)군에서 상응하는 점막을 나타낸다. 상피 라이닝에서이 검은 화살표 지점, LP = 단편 프로프리아, mm = 근점막, 크립트(crypt) 세포에서의 빈 화살표 지점, 바 = 100㎛. E(x 25)는 대조군(PBS-처리된)에서의 파괴된 점막을 나타내며, F는 독소 자극전 P1 처리된 쥐로부터의 상응하는 확대도를 나타낸다.
도 10은 콜레라 독소(CT) 또는 대조군 완충액(PBS)로 처리된 세 그룹의 쥐로부터의 공장 표본에서의 에반스 블루 형광도; 항분비 펩티드 P1 또는 대조군 완충액(PBS)로 전처리. LPM = 단편 프로프리아. 검은 화살표는 상피 세포 라이닝을 나타내며, 빈 화살표의 머리부는 크립트 세포를 나타낸다. 바 = 100㎛.
도 11은 도 10에서 도시된 쥐로부터의 맥관총 표본에서의 에반스 블루 형광도. 바 = 50㎛.
서열목록
서열 번호: 1
서열의 형 : 상응하는 단백질을 함유하는 누클레오티드
서열의 길이 : 1309 염기쌍 + 폴리(A) 말단
쇄의 수 : 1 본쇄
형태 : 직쇄상
분자형 : cDNA
기원 유기체: 사람
직접적인 실험 기원: 뇌하수체
특성: 63 내지 1208 bp 성숙 단백질
1289 -1295 bp 폴리(A) 시그날 서열
Claims (19)
- 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이의 상동물 또는 단편.
- 단편이 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의a) 아미노산 번호 35-42b) 아미노산 번호 35-46c) 아미노산 번호 36-51d) 아미노산 번호 36-80e) 아미노산 번호 1-80을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열 번호 1에 기재된 재조합 단백질의 단편.
- 서열 번호 1에 기재된 재조합 단백질의 아미노산 번호 35-42를 포함하는 단편에 상응하는 펩티드 X1VCX2X3KX4R(여기서, X1는 I이거나 아무것도 아니며, X2는 H, R 또는 K이고, X3는 S, L 또는 또 다른 중성 아미노산이고, X4는 T 또는 A이다).
- 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편에 특이적인 항체.
- 서열 번호 1에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편에 특이적인 항체에 결합하는 단백질.
- 활성 기재로서 서열 번호 1에서의 유효량의 재조합 단백질, 또는 동일한 활성을 갖는 이들의 상동물 또는 단편을 포함하는, 사람을 포함하는 동물에서의 병리적 체액의 운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키기 위한 조성물.
- 단편이 서열 번호 1에서의 아미노산 서열의a) 아미노산 번호 35-42b) 아미노산 번호 35-46c) 아미노산 번호 36-51d) 아미노산 번호 36-80e) 아미노산 번호 1-80을 포함하는 군으로부터 선택되는 제 6항에 따른 약제.
- 서열 번호에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질, 또는 동일한 활성을 갖는 이들의 상동물 또는 단편을, 사람을 포함하는 동물에서의 병리적 체액의 운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키기 위한 조성물을 제조하기 위해 사용하는 방법.
- 활성제로서 서열 번호 1에서의 아미노산을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 동일한 활성을 갖는 이들의 상동물 또는 단편, 또는 상기 재조합 단백질, 상동물 또는 단편을 생성할 수 있는 유기체를 포함하는, 척추동물에서 병리적 체액의 운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키기 위한 공급물.
- 서열 번호 1에서의 아미노산을 필수적으로 가지는 단백질 또는 동일한 활성을 갖는 이들의 상동물 또는 단편, 또는 상기 재조합 단백질, 상동물 또는 단편을 생성할 수 있는 유기체의 유효량을 상기 동물에 투여함을 포함하여, 사람을 포함하는 동물의 병리적 체액의 운반 및/또는 염증성 반응을 정상화시키는 방법.
- 제 12항에 있어서, 단편이 서열 번호 1에서의 아미노산 서열의a) 아미노산 번호 35-42b) 아미노산 번호 35-46c) 아미노산 번호 36-51d) 아미노산 번호 36-80e) 아미노산 번호 1-80을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
- 서열 번호 1에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편에 대해 특이적인 항체를 이러한 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 검출하기 위해 사용하는 방법.
- 서열 번호 1에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산.
- 제 13 항에 있어서, 코드화된 단편이 서열 번호 1에서의 아미노산 서열의a) 아미노산 번호 35-42b) 아미노산 번호 35-46c) 아미노산 번호 36-51d) 아미노산 번호 36-80e) 아미노산 번호 1-80을 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산.
- 서열 번호 1에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산을 상응하는 단백질 또는 상동물 또는 단편을 생성하기 위해 사용하는 방법.
- 서열 번호 1에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산으로부터 유도된 프로브 또는 프라이머를 유기체의 핵산의 존재를 검출하기 위해 사용하는 방법.
- 서열 번호 1에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산을 포함하는 벡터.
- 서열 번호 1에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 코드화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 사람을 제외한 숙주.
- 서열 번호 1에서의 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 재조합 단백질 또는 이들의 상동물 또는 단편을 생성할 수 있는 사람을 제외한 유기체의 균주.
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