RO120197B1 - Factori antisecreţionali, pentru reglarea schimbării permeabilităţii patologice - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o proteină recombinantă, cu activitate antisecretorie, omologi şi peptide ale acesteia, utile pentru normalizarea transportului fluidelor patologice şi/sau normalizarea reacţiilor inflamatorii, la animale, inclusiv la oameni, la anticorpi, împotriva factorului antisecretor, şi la utilizarea proteinei recombinante, a omologilor sau a peptidelor, sub formă de compoziţie sau aliment, pentru normalizarea transportului fluidelor patologice şi/sau normalizarea reacţiilor inflamatorii, la animale, inclusiv la oameni.

Description

Prezenta invenție se referă la noi factori antisecreționali de natură proteică, având proprietăți de reglare a transportului de fluid și/sau a reacțiilor inflamatorii, precum și proprietăți de reglare polinucleotidică, prin codificarea acizilor polinucleici, și la utilizarea acestora.

Este cunoscut faptul că toate celulele și țesuturile corpului sunt dependente, în mod critic, de mediul fluid constant și normal, în combinație cu o alimentare adecvată cu sânge. Dereglarea unuia sau a ambelor sisteme de suport poate deveni, în mod rapid, fatală. în legătură cu dezechilibrul fluidului, există două sisteme principiale diferite:

A. Edemul, care este caracterizat printr-o acumulare anormală a fluidului în spațiile țesutului intercelular sau a cavității corpului, sau

B. Deshidratarea, care în sensul strict al cuvântului, înseamnă doar pierderea apei, dar în realitate este, în general, utilizat pentru a descrie pierderea combinată de apă și de ioni.

Formele cele mai obișnuite de edem sau de deshidratare sunt, după cum urmează: diareea, bolile inflamatorii ale intestinelor, edemul cerebral, astmul, rinita, conjunctivitele, artrita, glaucomul, diferite forme ale presiunii intracraniene patologice (creșteri sau descreșteri), modificarea presiunii în urechea mijlocie, cum este boala Meniere, dermatitele, dezechilibrele chimice sau fizice ale pielii și ale glandelor adiacente pielii, cum este mastita, diferitele forme de tulburări endocrine, cum este diabetul insipid, sindromul Conn, sindromul Cushing și boala Addison, boli ale rinichilor, cum este pielonefrita și glomerulonefrita, tulburări metabolice, cum este miredemul și porfiria intermitentă acută, efectele secundare ale tratamentului cu diferite medicamente, cum arfi cu antidiabetice, antidepresive triciclice, citostatice, barbiturice, narcotice și analogi ai narcoticelor.

Diareea este cauzată de schimbări în permeabilitatea intestinelor în ceea ce privește electroliții și apa. Această tulburare este, în mod obișnuit, cauzată de enterotoxine bacteriene, cum sunt cele produse de Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae și Clostridium difficile. Această tulburare poate fi, de asemenea, cauzată de inflamații intestinale. întrucât absorbția apei este cuplată cu absorbția electroliților și nutrienților, animalele cu diaree frecventă suferă de malnutriție, conducând la întârzieri în câștigarea zilnică în greutate, la animalele în creștere. Corpul contracarează aceste reacții prin mecanisme neuro-hormonale, cum este eliberarea de somatostatină și peptide narcotice din interneuronii din mucoasa intestinală. Aceste polipeptide sunt capabile să inverseze secreția de fluid și diaree.

Factorul Antisecrețional (AF), descris recent, a fost parțial purificat de glanda pituitară la porc și pare să inverseze secreția patologică indusă de diferite enterotoxine. Nivelurile ridicate de Factor Antisecrețional în laptele de scroafă protejează purcelușii care sug, împotriva diareii neonatale.

Pe scară largă, au fost utilizate medicamente antimicrobiene în tratamentul diareii atât la oameni, cât și în medicina veterinară. Ele sunt utilizate, de asemenea, ca aditivi de hrană pentru porci, viței și pui. Cu toate acestea, datorită dezvoltării rapide a unor bacterii rezistente în intestine, utilizarea antibioticelor împotriva enteritei nu este, în general, acceptată în medicina umană și utilizarea lor în medicina veterinară este, de asemenea, în scădere.

Alte medicamente antidiareice contracarează secreția din mucoasa intestinală, întrucât aceste medicamente sunt orientate împotriva animalului gazdă, nu este de crezut că rezistența împotriva medicamentelor se va dezvolta. Aceste tipuri de medicamente includ medicamente nervo-active, cum sunt fenotiazinele și tioxantenele. Datorită unor efecte secundare serioase, aceste tipuri de medicamente nu au fost acceptate în tratamentul

RO 120197 Β1 diareii în cele mai multe țări. Alte medicamente sunt derivați ai narcoticelor, cum este co- 1 deina și loperamida. întrucât aceste medicamente acționează în principal prin inhibarea mobilității intestinale, ele inhibă totodată curățarea bacteriilor patogenice din intestine și nu ar 3 trebui să fie deloc recomandate împotriva bacteriilor dezinterice sau paraziților. Derivați ai somatostatinei au fost recent folosiți, dar ei au până în prezent o utilizare limitată, datorită 5 dificultățilorîn administrarea medicamentelor și posibilelor interacțiuni cu reglarea endocrină a creșterii. 7

Factorul Antisecrețional (AF) nu a fost până în prezent utilizat în mod direct, pentru tratamentul diareii sau al malnutriției, datorită dificultăților legate de obținerea unui preparat 9 pur al acestei proteine. Cu toate acestea, a fost posibil să se administreze proteine similare la animale domestice cărora li s-a administrat o hrană specifică (SE 9000028-2). Porcii, 11 cărora li s-a administrat această hrană, au obținut niveluri ridicate de AF - proteine și au prezentat o creștere semnificativă - a vitezei zilnice de creștere a greutății, în comparație cu 13 partidele de control. Factorul Antisecrețional la șobolani provocat cu toxina A din Clostridium difficile protejează nu numai împotriva secreției intestinale, ci totodată, împotriva inflamațiilor 15 și sângerării din intestine.

Problema, pe care o rezolvă invenția, este de a prezenta o proteină recombinantă, 17 un fragment al acesteia și o peptidă ca Factor Antisecrețional, un anticorp specific pentru proteina recombinantă, o compoziție pentru normalizarea transportului fluidelor și/sau 19 normalizarea reacțiilor inflamatorii, un aliment pentru normalizarea transportului fluidelor și/sau normalizarea reacțiilor inflamatorii, precum și la acizii nucleici care codifică proteina 21 recombinantă și fragmentele acesteia, și vectorul care conține acești acizi nucleici.

Proteina recombinantă, conformă invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin 23 aceea că are secvența de aminoacizi prezentată în SECV. ID. NR.1, sau omologi sau fragmente ale acesteia, având activitate antisecretorie. 25

Fragmentul proteinei recombinante, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că este ales dintr-un grup constând din: 27

a) aminoacizii cu nr. 35-42;

b) aminoacizii cu nr. 35-46; 29

c) aminoacizii cu nr. 36-51;

d) aminoacizii cu nr. 36-80; 31

e) aminoacizii cu nr. 1-80;

ai secvenței de aminoacizi arătată în SECV. ID. NR.1. 33

Peptida conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că are succesiunea de aminoacizi corespunzătoare formulei corespunzătoare fragmentului ce cuprinde 35 aminoacizii 35-42 ai peptidei recombinante prezentate în SECV. ID. NR.1, în care X, este I sau nimic, X₂ este H, R este K, X₃ este S, L sau alt aminoacid neutru și X₄ este T sau A. 37

Anticorpul conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că este specific pentru proteina recombinantă sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendi- 39 carea 1, sau fragmentele acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2.

Compoziția pentru normalizarea transportului fluidelor patologice și/sau normalizarea 41 reacțiilor inflamatorii, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că aceasta cuprinde ca ingredient activ principal o cantitate eficientă dintr-o proteină recom- 43 binantă sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendicarea 1, sau fragmente ale acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2. 45

Utilizarea proteinei recombinate definită în revendicarea 1 sau a fragmentelor acesteia, definite în revendicarea 2, pentru fabricarea unei compoziții pentru normalizarea trans- 47 portului fluidelor patologice și/sau normalizarea reacțiilor inflamatorii la animale, inclusiv, la oameni. 49

RO 120197 Β1

Alimentul pentru normalizarea transportului fluidelor patologice și/sau normalizarea reacțiilor inflamatorii, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că acesta cuprinde, ca agent activ, o proteină recombinantă sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendicarea 1, sau fragmentele acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2, sau un organism non-uman capabil pentru producerea respectivei proteine recombinante, omologi sau fragmente ale acesteia.

Acizii nucleici, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că ei codifică proteina recombinantă definită în revendicarea 1 sau fragmentele acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2.

Vectorul conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că acesta cuprinde acizii nucleici definiți în revendicarea 9.

Utilizarea acizilor nucleici și a probelor sau primerilor derivați din acizii nucleici, care codifică proteina recombinantă sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendicarea 1, sau fragmentele acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2, pentru a detecta in vitro prezența acizilor nucleici în organism.

Un obiectiv major al prezentei invenții este de a asigura o nouă proteină recombinantă, omologi și fragmente (peptide) ale acestora, în vederea utilizării în normalizarea transportului de fluid patologic. Aceste proteine și peptide sunt denumite, în general, Factori Antisecreționali (AF). AF, de asemenea, inhibă parțial sau elimină în totalitate evoluția reacțiilor inflamatorii ale diferitelor etiologii. Revenirea la normal (a transportului de fluid sau a inflamației) se obține prin utilizarea proteinelor sau peptidelor, în mod suplimentar, proteinele AF sau peptidele sunt absorbite, în mod suplimentar, proteinele AF sau peptidele sunt absorbite în mod efectiv prin diferite membrane mucoase fără pierderea potenței (atunci când se compară cu administrarea intravenoasă). în mod corespunzător, există o multitudine de regimuri de tratament, iar o administrare corectă a proteinei sau peptidei face posibilă o reconstituire rapidă a fluidului degradat (apă și ion) în ceea ce privește echilibrul acestuia, o reacție inflamatorie sau ambele.

în concluzie, AF recombinant (rAF), omologii și fragmentele acestuia pot fi utilizate pentru imunodetectare, ca aditiv de hrană pentru animale de creștere și ca antidiareic și medicament împotriva bolilor care implică edemul, deshidratarea și/sau inflamațiile.

Ca organisme capabile să producă proteina recombinantă, există diferite tipuri de organisme, cum ar fi bacteria recombinantă sau organismele eucariote, cum ar fi fermenții, plantele și vertebratele, cu excepția oamenilor.

în ciuda a 10 ani de încercări privind purificarea Factorului Antisecrețional (AF) cu ajutorul tehnicilor biochimice convenționale, nu a fost posibil a se obține Factorul Antisecrețional într-o formă omogenă. Cu toate acestea, cu ajutorul unei noi proceduri de preparare a Factorului Antisecrețional în stare semipură, pentru imunizări, și selectarea antiserului prin mijloacele unei metode imunohistochimice, a fost ales un antiser adecvat. Cu acest antiser, a fost acum posibil să se doneze ADNc uman recombinant, ce exprimă Factorul Antisecrețional în Escherichia coli.

Secvența unui nou ADNc a fost determinată și arătată a fi unică. Prin cunoașterea acestei secvențe, au fost construite probele de oligonucleotide care hibridizează cu ARN-ul pituitaruman și de porcine. Dimensiunea acestor ARN-uri, aproximativ 1400 perechi de bază, este aceeași cu dimensiunea secvenței ADNc, cuprinzând 1309 perechi de bază plus o poli (A) coadă. O secvență ADNc parțială cu glanda pituitară a șobolanului s-a arătat a fi identică cu cea a ADN-ului uman, codificând o structură omniprezentă conservată în genele AF din diferite specii. Această asemănare face posibilă utilizarea aceleași probe oligonucleotidice, pentru a identifica ARN-ul și ADN-ul, din diferite specii care codifică Factorul Antisecrețional (AF).

RO 120197 Β1

Mai mult decât atât, este posibil să se exprime rAF într-o formă activă din punct de 1 vedere biologic. Proteina AF, în forma unei proteine de fuziune cu glutation S-transferază, a fost exprimată în cantități mari, în Escherichia coli și purificată prin afinitate cromatografică, 3 pentru a obține omogenate. După scindarea proteinei de fuziune cu trombină, Factorul Antisecrețional recombinant (rAF) s-a arătat a fi extrem de potent, 44 ng (10'¹² mol), asigurând 5 o inhibare de jumătate din cantitatea maximă din secreția de fluid indusă de toxina holerei în intestinul șobolanilor. 7

Prin tehnici genetice, au fost produse segmente mai mici de rAF. S-a arătat că activitatea este rapidă într-o secvență mică, constând din 7 până la 8 aminoacizi. Aceasta a fost 9 confirmată cu ajutorul sintezei chimice în fază solidă, tehnică prin care a fost produsă o octapeptidă, care este la fel de potentă din punct de vedere biologic ca și rAF pe bază molară. 11 Cu ajutorul sintezei orientate la situs, s-a arătat că este posibilă construirea unei secvențe prin înlocuirea anumitoraminoacizi în interiorul părții active, fără dispariția activității biologice. 13

Secreția de fluid a fost măsurată prin intermediul unui model intestinal în buclă: o secțiune (buclă) a intestinului mic este ligată cu ajutorul a două seturi; în buclă este injectată 15 o anumită cantitate de enterotoxină. în cazul în care sunt testate medicamente antisecreționale, ele sunt injectate cu o oră înainte sau două ore după provocarea cu toxină, respectiv 17 în interiorul acestui interval de timp. Injecția a fost efectuată pe trei căi diferite; pe cale intravenoasă, intraintestinală și intranazală. Fluidul este acumulat în bucla de 5 h, după 19 provocarea cu toxină. Secreția este calculată din greutatea fluidului acumulat per lungime de intestin. 21

Secreția periodică a fost determinată atât direct prin secvențarea aminoacidului, cât și indirect, prin deducerea ei din secvența ADNc. 23

Factorul Antisecrețional (AF) pare a exercita efecte toxice sau sistemice foarte mici, întrucât nu s-au observat reacții toxice evidente la șobolanii cărora li s-a administrat o doză 25 de 100 ori mai mare decât cea care a provocat o inhibare a jumătate din cantitatea maximă, întrucât AF este eficient atunci când este injectat în intestinul mic, acesta poate fi administrat 27 pe cale orală.

Factorul Antisecrețional recombinant inhibă secreția și atunci când este injectat după 29 toxină, în contrast cu preparatele de AF natural testate, care s-ar părea că sunt eficiente numai dacă au fost injectate înainte de toxină. Astfel, rAF poate fi utilizat atât în scop 31 profilactic, cât și în scop terapeutic.

în mod suplimentar, s-a arătat că rAF și fragmentele peptidice ale peptidei inhibă 33 reacțiile citotoxice și inflamațiile din intestin provocate de toxina A din Clostridium difficile. Cu ajutorul unui test de permeabilitate a unui colorant, s-a dovedit că rAF și fragmentele 35 acestuia inversează modificările permeabilității patologice induse de toxina holerei, nu numai în mucoasa intestinală, ci și în plexus coroideus care reglează presiunea fluidului în creier. 37

Antiserul împotriva rAF a fost produs la iepuri și utilizat în teste imunologice legate chimic de enzime (ELISA -Enzyme - linked Immuno Assay). Acest test ar putea fi utilizat 39 pentru a măsura AF în fluidul corpului sau în alimente.

în continuare, este prezentată o metodă de purificare a anticorpilor față de AF 41 (natural sau recombinant), pe baza afinității cromatografice, pe coloana cu agar cuplată la rAF. 43

S-a arătat, de asemenea, că anticorpii sunt eficienți pentru detectarea Factorului Antisecrețional (AF), în secțiuni de țesut, prin intermediul tehnicilor imuno-histochimice și 45 pentru detectarea Factorului Antisecrețional prin Vestern-blot.

Exemplele care urmează, ajută la înțelegerea invenției și nu limitează sfera acesteia. 47

RO 120197 Β1 în continuare, se prezintă 8 exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1 ...11 care reprezintă:

- fig. 1a și continuată cu fig. 1b, secvența acidului nucleic și secvența de aminioacizi corespunzătoare noii proteine umane. Este subliniată secvența confirmată a aminoacidului;

- fig. 1c, harta orizontală ilustrând ADNc clonă și amorsele polinucleotidice;

- fig. 2, minigel și poliacrilamidă-SDS colorat în albastru strălucitor Coomasie (A) și imunoblot examinate cu antiseruri împotriva porcinelor AF (B). Benzile cu numere neprime conțin glutation-agaroză purificată GST-AF, proteine de fuziune AF-1, AF-2 și AF-3, în timp ce benzile cu numere prime conțin proteine de fuziune scindate cu trombină. Referirile privind greutatea moleculară (R), (BDH), sunt indicate pe partea stângă. Proteina de fuziune GST-AF-1 este puternic degradată, dar analiza imuno-blot arată doar detectarea proteinei având întreaga lungime și a produsului scindat spontan cu trombină. Există un produs cu greutatea moleculară 26 kDa în GST-AF-3, probabil cozi ale glutation S-transferază, care au fost exprimate în mod independent;

- fig. 3, testul Western blot folosind antiser împotriva proteinei AF-2. Spre stânga, glande pituitare porcine (P) și trei umane (E1, E2, E3); iar spre dreapta, au fost prezentate trei proteine recombinante AF-1, AF-2 și AF-3 (vezi fig. 2); în centru, greutatea moleculară standard (R);

-fig. 3b, test imunologic privind amina legată (ELISA-Enzyme linked immuno - assay) a Factorului Antisecrețional recombinant (rAF), folosind antiser brut și anticorpi purificați, ca urmare a afinității, dezvoltați în iepure;

- fig. 4, autoradiograma-Northern blot a acizilor ribonucleici (ARN) de la o glandă pituitară de la om și de la porcine (p = în comun, iar i = material individual). Au fost folosite cinci micrograme de ARNm în fiecare bazin; au fost utilizate probe de oligonucleotide de la capătul 3' marcate ³²P, iar autoradiogramele au fost developate după 7 zile;

-fig. 5, criosecțiuni ale adenohipofizei colorate cu antiser împotriva proteinei recombinante GST-AF-2, A. Secțiunile incubate cu aer imunologic arătând celule împrăștiate cu diferite grade de imuno-reactivitate pozitivă (marcate prin săgeți pline). Multora dintre celule le lipsește complet colorarea (marcate prin săgeți goale), B. Secțiuni de serie pentru A incubate cu aer imunologic preabsorbit cu exces de proteină recombinantă GST- AF-2. Nu există o colorare specifică a celulelor C și D. Mărirea la o scară mai mare a celulelor imunopozitive, demonstrând colorarea citoplasmatică a celulelor endocrine, n=nucleu, c= citoplasmă;

- fig. 6, activitatea biologică a proteinei recombinante AF-1, testând inhibarea secreției de fluid indusă de toxina holerei. Au fost injectate doze gradate de proteină la șobolan pe cale intravenoasă; au fost injectate în bucla intestinală trei micrograme de toxină a holerei; după cinci ore, a fost măsurat fluidul acumulat (mg/cm de intestin) în buclă. Fiecare valoare reprezintă o medie plus sau minus S.A.E. a grupei de șase animale;

- fig. 7, activitatea biologică a Factorului Antisecrețional recombinant (rAF) injectat intraluminar; au fost administrate 0,5 pg de Factor Antisecrețional recombinant (rAF) 20...30 s înainte sau 90 min, după provocarea cu 3 pg din toxina holerei, în bucla intestinală a șobolanului;

- fig. 8, activitatea biologică a Factorului Antisecrețional recombinant (rAF-1) injectat intraluminar; 3 pg de Factor Antisecrețional recombinant au fost injectate 20...30 s înainte sau 90 min, după provocarea cu 3 pg din toxina holerei, în bucla intestinală a șobolanului; Factorul Antisecrețional recombinant rAF a fost injectat la aproximativ 5 cm în vecinătatea buclei în care a fost injectată toxina;

RO 120197 Β1

- fig. 9, A . (x 2,5) este o buclă de control (PBS), ilustrând sfărâmarea celulară în 1 lumenul intestinal (L), dar nici o colorare a mucoasei rămase, ceea ce sugerează o distrugere totală a căptușelii epiteliale. B. (0,5 pl de P1 înainte de provocarea toxinei) arată 3 o căptușeală epitalială clar conturată, formând domenii, sugerând o mucoasă intestinală normală și conservată. L=lumen intestinal. Benzi=500 pg, C. (X10) ilustrează mucoasa distrusă 5 în grupul de control tratat cu saramură tamponată cu fosfat (PBS), iar D ilustrează mucoasa corespunzătoare în grupa experimentală (tratată cu peptida P1). Săgeata înnegrită mar- 7 chează căptușeala epitelială, LP = lamina proprie, mm = muscularis mucosa, săgeată goală în interior marchează cripto - celulele. Benzile = 100 pm, E (X 25) ilustrează mucoasa dis- 9 trusă în grupul de control (tratată cu soluție tamponată cu fosfat (FBS)), iar F ilustrează o mărire la scară corespunzătoare la un șobolan supus tratamentului cu P1 înainte de provo- 11 carea toxinei. Benzile = 50 pm;

- fig. 10, fluorescenta albastru Iu i Evans în specimene puerile din trei grupe de șobo- 13 lani tratați cu toxina holerei (CF) sau cu soluția de control (FBS - soluție de sare tamponată cu fosfat); pretratare cu peptida antisecrețională P1 sau cu soluția de control (PBS). LP = 15 lamina proprie. Săgeata neclară indicând căptușeala celulei epiteliale; săgeata goală în interior indicând cripto - celulele; 17

- fig. 11, fluorescența albastrului Evans în specimenele de plexus oboroideus la șobolanii arătați în fig. 10. Benzile = 50 pm. 19

Exemplul 1. Anticorpi împotriva AF produși pentru donarea ADNc.

Factorul Antisecrețional a fost preparat din sânge de porc, prin intermediul afinității 21 cromatografice pe agar și focalizare izoelectrică. La un litru de sânge de porc (conținând substanțe anticoagulante), s-au adăugat 1 g de tiosulfat de sodiu și 1 mg de fenilmetil- 23 sulfonilfluorură. Celulele sângelui au fost separate prin centrifugare și plasma limpede a fost eluată printr-o coloană cu Sepharose 6B (Pharmacia LKB Biotechnology Stockholm), 25 volumul gelului corespunzând la aproximativ 10% din volumul soluției. După spălare cu de trei ori volumul stratului cu soluție de sare tamponată cu fosfat (PBS = 0,15 M clorură de 27 sodiu, 0,05 M fosfat de sodiu, pH = 7,2), eluția coloanei s-a efectuat cu o cantitate egală cu de două ori volumul stratului de 1M a/fa-metil-D-glucozidă dizolvată în PBS. Eluatul a fost 29 concentrat și dializat față de apă, pe un ultrafiltru Omega 10K flow through” (Filtron Technology Corp). Fracția a fost ulterior fracționată prin focalizare izoelectrică în amfolit 31 (Pharmacia) gradient, pH=4...6, pe o coloană cu izoelectro-focalizare de 400 ml (LKB, Suedia). O fracțiune având punctul izoelectric cuprins între 4,7 și 4,9, a fost colectată și 33 dializată împotriva PBS. Astfel, AF parțial purificat a fost împărțit în alicote mici și utilizat pentru producerea de antiser în iepuri, în conformitate cu metoda descrisă anterior. 35

Iepurii au fost imunizați și serurile au fost testate privind capacitatea lor de a colora materialul intracelular în secțiunile glandei pituitare umane (metodă descrisă în exemplul 6). 37

Numai unul dintre seruri a arătat o colorare intracelulară specifică și distinctă, fără a colora matricea extracelulară a proteinelor. Acest antiser a fost selectat pentru examinarea unei 39 biblioteci de ADNc/fagi lambda (phages) GT 11 din glanda pituitară umană, exprimând proteinele din Escherichia coli. 41

Exemplul 2. Examinarea bibliotecilor de ADNc din glanda pituitară umană și creier.

O bibliotecă de ADNc cu prelungire la capătul 5' dintr-o glandă pituitară umană, 43 derivată din țesuturile obținute dintr-un rezervor cu nouă caucaziane, a fost comandată de la Clontech Laboratories. Pentru examinarea bibliotecii, fagii au fost întinși la 3 x 10⁴, pe o 45 placă formând unități per 150 mm placă pe Escherichia coli Y1090. Antiserul de iepure descris anterior împotriva Factorului Antisecrețional la porcine a fost absorbit cu 0,5 volume 47

RO 120197 Β1 de Escherichia co//Y1090, lizat timp de 4 h, la temperatura de 23°C și diluat la un raport de 1:400, și supus examinării în conformitate cu Young, R. A. și Davis, R. W. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 80,1194-1198. Anticorpi de capră anti-iepure conjugați cu fosfatază alcalină au fost utilizați ca anticorpi de gradul doi (Jackson). Plăcile pozitive au fost curățate, eluate într-un mediu de suspensie pentru fagi/20 mM Tris - BC1 (pH=7,5,100 mM clorură de sodiu, 10 mM sulfat de magneziu, 2% gelatină, replacate și triate, până când toate plăcile testate au fost pozitive.

Reclonarea ADNc Fagi ADN din AF recombinați au fost izolați cu Wizard Lambda Preps (Promega) și supuși digestiei cu EcoRI. Inserțiile au fost purificate cu Sephaglas BandPrep Kits (Pharmacia), reclonați în vector pGex-1 lambda T (Pharmacia), așa cum este descris de către fabricant și transfectate în Epicurian Coli XL1 - Elue, celule Top 1 sau celule BL 21 (toate trei de la Stratagan). rAF sau peptidele au fost preparate în celule BL 21, dacă nu este menționat altfel (Sambrook J., Fritsh E.F., Maneatis, T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonarea moleculară; Manual de laborator) pp 1.74-1.84), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harber, N.Y.)

Amplificarea PCR a ADNc. Pentru a obține capătul lipsă 5' al ADNc, a fost utilizată o metodă bazată pe PCR, denumită RACE - Rapid Amplification of ADNc Ends (Amplificarea rapidă a capetelor ADNc). O metodă RACE modificată, care generează 5'-RACE-Ready ADNc cu o ancoră oligonucleotidică legată la capetele 3' ale moleculelor de ADNc din creier uman, a fost obținută de la Clontech Laboratories. Capătul 5' a fost amplificat într-o porțiune a 5' - RACE Ready ADNc în două trepte de amplificare PCR, folosind o amorsă 5' complementară față de ancoră și două amorse PCR 3' cu genă specifică A și B (A = bază 429 - 411 și B = bază 376 - 359; fig. 1a). Diferite fragmente mai mici ale fragmentului RACE au fost apoi amplificate, în scopul de a exprima peptidele corespunzătoare, și testate privind proprietățile lor biologice. Poziția bazei și aminoacidul de start de la capătul acestor fragmente oligonucleotidice și peptidele lor corespunzătoare sunt prezentate în tabelul 1. ADNc porcin și bovin (Clontech Laboratories) au fost utilizate ca mostră pentru amplificarea fragmentelor corespunzătoare lui N3 în tabelul 1. Variația secvenței a fost, de asemenea, inserată în mod artificial prin mutageneză orientată in situ, metodă în care diferitele oligonucleotide corespunzătoare poziției 168-193 au fost sintetizate, în scopul de a înlocui unul câte unul aminoacizii 35-42 (pozițiile așa cum sunt indicate în SECV ID NR.1). Fragmentul ADN amplificat a fost donat în vectorul pGex-1 lambda T, prin utilizarea poziției EcoRI construită în ancoră și amorsa de genă specifică. Pentru a verifica secvența obținută prin metoda RACE, ADNc dublu răsucit din glanda pituitară umană și din creier (Clontech) a fost amplificată cu perechea de amors C/D conținând o parte extra de scindare EcoRI (fig. 1b). Amorsele au fost concepute să permită ca întreag domeniul deschis de citire (ORF-Open Reading Frame) să fie amplificat. Produsele PCR din creier și pituitare de dimensiuni scontate au fost digerate cu EcoRI, izolate și donate într-un vector plasmid pGex-1 lambda T.

Secvențierea ADN și a oligonucleotidelor. ADN-ul din plasmida pGex-1 lambda T a fost utilizată ca șablon pentru secvențierea inserților prin metoda terminației lanțului dideoxi (folosind versiunea Sequenase 2,0 kit (U.S. Biochemical Corp.). Regiunile de copiere ale amorselor inițiale din față și inverse ale pGex-1 lambda T, imediat în amonte și în aval, al ADN-urilor inserate, au fost obținute de la Pharmacia. Amorsele ulterioare au fost sintetizate (Scandinavian Gene Sythesie AB) pe baza informației secvențiale obținute. Au fost secvențiate trei clone diferite PCR, în scopul de a evita schimbul de bază prin polimeraza Taq din metoda 5’-RACE.

RO 120197 Β1

Datele privind secvența nucleotidică și secvența dedusă a proteinei au fost compilate 1 și analizate, utilizând MacVector4.1 (Eastman Chemical Co.). Pentru a prevesti secvența de aminoacizi corespunzătoare inserțiilor de ADNc, codul de folosire a diferitelor cadre de 3 citire a fost comparat și s-a dat un cadru deschis de citire larg. Verificarea datelor privind secvența proteinei și cADN-ului a fost efectuată prin utilizarea unui disc Entrez CD-ROM 5 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, US).

Clonarea moleculară și analiza secvențială a ADNc. Antiserurile polivalente împotriva 7 proteinei AF de la porc au fost utilizate pentru colectarea ADNc din glandele pituitare umane.

Au fost izolate două clone exprimând AF imunoreactiv, eliberate de fagii lambda și reclonate 9 în poziția EcoR1 a vectorului pGer-1 lamba T, așa cum este descris în setul (kit) provenit de la Pharmacia. Analiza restrictivă a dat dimensiunile de inserție de 1100 și 900 bp. Secven- 11 țierea ADN a celor două clone a demonstrat faptul că omologia este completă, cu excepția unei substituții (fig. 1, C înlocuiește pe T la poziția 1011). O secvență în amonte de capătul 13 5' al clonei 2 a fost obținută prin intermediul metodei RACE. Fragmentul a avut o lungime totală de 376 bp (neincluzând ramura nucleotidei sintetice de la capătul 5'). ADNc total 15 reconstruit a conținut 1309 perechi de bază, urmate de o coadă poli-A, care a fost precedată de un semnal poli-A (fig. 1, pozițiile 1289 -1295). A fost identificat un cadru deschis de citire 17 de 1146 bp (pozițiile 63 - 1208).

Exemplul 3. Expresia proteinei Factorului Antisecrețional mamar din plasmide 19 recombinante.

Construcția și purificarea proteinelor fuzibile. Clonele ADNc obținute prin colecție 21 imunologică și prin amplificarea PCR a întregului ADNc fost ligate la pGex -1 lambda T.

Acest vector admite expresia proteinelor străine în Escherichia coli ca fuziuni la capătul C 23 terminal Schistosoma jasponicum 26 kDa glutation S-transferazei (GST-Glutathion STransferase), care poate fi purificată prin afinitate în condiții nedenaturate cu ajutorul seriei 25 prevăzute de Pharmacia. Pe scurt, culturile de peste noapte ale Escherichia coli, transformate cu plasmide pGex-1 lambda T recombinante au fost diluate într-un mediu proaspăt 27 și crescute o perioadă de timp suplimentară de 3 h, la temperatura de 37°C. Expresia proteinei a fost indusă de 0,1 mM IPTG (izopropil-P-D-tiogalacto piranozidă), și după încă 29 alte 4 h de creștere la temperatura de 30’C, celulele au fost peletate și resuspendate în PBS. Celulele au fost lizate prin sonicare, tratate cu 1% Triton X-100 și centrifugate la 12000 xg, 31 timp de 10 min; supenatantul conținând proteinele de fuziune exprimate, a fost purificat prin trecerea Uzatelor prin glutation agaroză (Pharmacia). Proteinele de fuziune au fost fie elutate 33 prin competiție cu glutation liber, fie au fost scindate cu trombină bovină 10 U peste noapte, pentru a îndepărta proteina AF de coada de afinitate GST. întreaga metodă de utilizare a 35 plasmidei pGex și purificarea proteinelor recombinante sau peptidelor a fost aplicată prin intermediul truselor prevăzute de Pharmacia. 37

Secvența și dimensiunile proteinelor-AF recombinante. Pentru a confirma secvența codificată, întreaga lungime de transcript a fost izolată prin utilizarea amplificării PCR a ADNc 39 pituitar și ADNc din creier. Utilizând perechea de amorse C/D, au fost izolate 1215 bp identice cu secvența clonării-4 (fig. 1). Cadrul deschis de citire codificând aminoacizii 382 cu o 41 masă moleculară calculată de 41,14 kDa și o valoare pl calculată de 4,9.

Clonele 1,2 și 3 ale AF, precum și oligonucleotidele N1-N5 (fig. 1 și tabelul 1) au fost 43 ligate în vectorul plasmid pGex-1 lambda T, astfel încât ORF era în cadru cu proteina glutation S-transferază (GST). Constructele au fost transformate în Escherichia coli și 45 expresia proteinelor de fuziune a fost indusă cu IPTG. Proteinele de fuziune purificate și proteina AF scindate cu trombină sau peptida au fost supuse SDS-PAGE și colorării 47

Western, folosind antiserul împotriva Factorului Antisecrețional la porcine (fig. 2). Colorarea în albastru strălucitor Coomassie a proteinelor a scos în evidență benzi distinctive pentru 49 fiecare proteină, cu excepția proteinei GST-AF-1, care a manifestat degradarea în componente mai mici. 51

RO 120197 Β1

Sinteza peptidei în fază solidă. Au fost produse peptide mai mici (P₇ până la P₁₈ în tabelul 1) (K.J. Ross-Petersen A5) în fază solidă, într-un aparat de sintetizare a peptidei Applied Biosysten. Puritatea fiecărei peptide a fost de 93...100% așa cum a fost ea evaluată cu ajutorul cromatografiei lichide de înaltă performanță (EPLC) cu fază inversă pe Deltapak C 18, 300 A, folosind un gradient liniar de acid trifluoro acetic 0,1% în apă/acetonitril.

Secvențierea aminoacidului. Analiza secvenței proteinei a fost efectuată pentru a valida, în continuare, ORF identificat. Proteinele AF pure au fost operate în SDS-PAGE cu macrogel slab 10%, iar proteinele transferate la o membrană Problot (Applied Biosystems) prin electrobloting (Bio-Rad). Petele (spoturile) vizualizate prin colorarea Ponceau S au fost extrase din blot și primii 20 aminoacizi ai proteinelor au fost secvențiați prin degradare Edman automată, pe un aparat de secvențiere automat (Applied Biosystems).

Au fost determinate secvențele N-terminale ale donărilor 2 și 3, și s-a arătat că se adaptează perfect la aminoacizii 63-75 și 130-140 din secvența prevăzută (fig. 1).

Prin comparare cu alte secvențe de proteine obtenabile de la GenBank, s-a scos în evidență faptul că secvența Factorului Antisecrețional recombinant (rAF) (fig. 1) este unică în toate părțile acesteia și nu a fost raportată nici o secvență similară.

Primele zece reziduuri ale proteinei par a fi relativ hidrofobe, atunci când sunt analizate în conformitate cu Kyte - Doolitle (22) și ar putea constitui o peptidă semnal, care este scindată anterior exocitozei proteinei. Această interpretare este susținută de analizele Western blot (fig. 3), în care proteina recombinantă pare a avea o masă moleculară ușor mai ridicată decât extractul de proteină din glanda pituitară. Unele dintre aceste diferențe, totuși, s-ar putea datora, de asemenea, primilor cinci aminoacizi adiționali în proteina recombinantă, constituind locul de scindare cu trombină a proteinei de fuziune.

Exemplul 4. Producerea și testarea antiserului împotriva rAF.

Antiseruri împotriva proteinei de fuziune GST-AF recombinante. Anticorpii împotriva proteinelor de fuziune purificate GST-AF-1, GST-AF-2 și proteina scindată cu trombină pură AF-1 (=rAF) pentru utilizare în ELISA, Western blot și studiile imunohistochimice au fost produși în iepuri. Fiecărui iepure i s-au administrat 100 pg de antigen în 1 ml PBS amestecul cu un volum egal de adjuvant complet Freund; fiecare imunizare a fost distribuită în 8...10 porțiuni injectate pe cale intracutanală în spate. Două doze suplimentare cu 50 pg de antigen au fost injectate la 3 și 5 săptămâni, ultima fiind fără adjuvant complet Freund. Iepurii au murit la 6 zile după ultima doză suplimentară și au fost preparate serurile, care au fost stocate la temperatura de -20’C. Sensibilitatea antiserului a fost testată cu ajutorul unui test cu pată punctată. GST-AF-2 a fost aplicată pe o membrană de nitroceluloză ECL în diluție de 1/5, iarantiserul a fost diluat la 1:1000. Membrana a fost blocată cu albumină serică bovină 1% (BSA) în PBS la temperatura de 4°C, timp de 16 h, și apoi incubată timp de o oră și jumătate cu o diluție de 1:800 a antiserului AF porcin sau anti-GST-AF la iepuri. Pata (blot) a fost analizată cu imunoglobulină anti-iepure de capră conjugată cu alcalin fosfatază, urmată de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat și p-nitro tetrazol albastru (Boehringer Mannhein). Limita estimată pentru detectarea antigenului a fost de aproximativ 1 ng în acest test.

Electroforeza cu gel poliacrilamidic-SDS și imunobloting. Electroforeza cu gel poliacrilamidic - SDS (SDS-PAGE) a extractelor de glandă pituitară la porcine și oameni, și a proteinelor-AF pure a fost efectuată în geluri minislabe de acrilamidă 10%, practic așa cum este descris de Laemli, U. K. (1970), Nature, 227, 680-685, cu modificarea că b/'s-acrilamida ca agent reticular a fost înlocuită cu N, N’-dialiltartardiamidă cu molaritate corespunzătoare. Ca semn al frontului electroforetic a fost utilizat Pyronin Y (Sigma). Referința de greutate moleculară, precolorată, a fost comandată de la BDH. Proteinele au fost apoi fie colorate cu albastru strălucitor Coomassie, fie transferate pe cale electroforetică la ECL nitroceluloză cu 0,45 mm dimensiunea porilor (Amersham) pentru imunocolorare. Incubările ulterioare cu B1 BSA, anti-LgG conjugat și substrat de alcalin fosfatază au fost aceleași ca și pentru testul cu pată punctată (dot blot), descris mai înainte.

RO 120197 Β1

Așa cum s-a arătat mai înainte, colorarea cu albastru strălucitor Coomassie 1 (Coomassie Briliant Blue) nu a scos în evidență vreo bandă distinctivă pentru proteina GSTAF-1, care s-a datorat probabil degradării proteolitice în componente mai mici. Cu toate 3 acestea, în analizele Western blot, întreaga lungime a proteinei a dat un semnal mai puternic decât produsele degradate (fig. 2b). Reacția puternică cu antiserul AF, împotriva porcinelor, 5 a indicat că proteinele recombinante au într-adevăr aceeași imunoreactivitate ca și AF. Greutatea moleculară a întregii lungimi de proteină pare a fi de aproximativ 60 kDa, care este mai 7 mare decât greutatea moleculară reală de 41,139 kDa, estimată pentru compoziția de aminoacizi. Mai mult decât atât, proteinele au fost, de asemenea, imuno-colorate și examinate cu 9 antiser crescut împotriva GST-AF-2, care sunt atașate de proteinele scindate cu trombină (fig. 3). 11

Antiserul împotriva GST-AF-2 recombinant reacționează cu proteina AF, ce apare pe cale naturală cu o greutate moleculară aparentă de 60 kDa, și cu ceva componente mai mici, 13 probabil produse de degradare enzimatică (fig. 3a).

ELISA pentru determinarea concentrațiilor AF. Testele ELISA au fost efectuate 15 folosind anti-AF-1 și anti-AF-2 în conformitate cu metoda descrisă anterior în Zachrisson, G. Lagergard, T. și Lonnroth, I. (1986), Acta Path, Microbiol, Immunol Scand, C, 94, 227 - 231. 17

Așa cum este arătat în fig. 3b, sensibilitatea testului cu antiser brut a fost între 1 și 10 pg proteine, în timp ce testul cu anticorpi purificați ca afinitate a prezentat o sensibilitate 19 cuprinsă între 5 și 50 ng proteine.

Exemplul 5. Analiza Northern blot a ARN-ului din glanda pituitară. 21

Analiza Northern blot. Glandele pituitoare umane au fost obținute post mortem de la Spitalul Sahlgrenska (cu permisiunea dată de Departamentul Sănătății și Asistenței sociale 23 din Suedia; 2 transplantationslagen, 1975:190). Pentru a obține acizii ribonucleici (ARN), glandele pituitare au fost extrase cu ARN guanidin tiocianat în conformitate cu Chomozinski 25 și Sacchi (1987), Analyt. Biochem, 162,156 -159. Au fost selectați ARN poliadenilați cu ajutorul unei truse comerciale (Pharmacia), folosind coloane cu oligodT - celuloză. Suplimentar, 27 a fost utilizat un rezervor de ARNm pituitar uman de la 107 indivizi, achiziționat de la Clontech. Cinci pg din fiecare probă de poli (A+) ARN au fost tratate cu glioxal și supuse electro- 29 forezei într-un gel de 1,2% agarozi Sambrook, J., Fritch, E.F., Maniatis, T, (1989), Molecular Cloning:A laboratory manual(Clonare moleculară: Manual de laborator), pp 7,40-7,42, Cold 31 Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. După transferul alcalin capilar, timp de 3 h, în soluție de hidroxid de sodiu 0,05 M, pe membrane de nylon Hybond N + 33 (Amersham), a fost efectuată prehibridizarea și hibridizarea timp de 24 h, fiecare din ele la temperatura de 42°C. Soluția de hibridizare a conținut 50% formamidă, 5 x SSPE, 10 x 35 soluție Denhard cu 250 pg/ml ADN denaturat cu greutate moleculară scăzută și 50 pg de acid poliadenilic. Blot-urile au fost examinate cu patru oligonucleotide antisens diferite 28 bp, 37 cuprinzând pozițiile 132-105 (amorsa E), 297 - 270 (amorsa F), 748 - 721 (amorsa G) și 833 - 806 (amorsa H) a secvenței (fig. 1); probele au fost marcate la capătul 3' cu transferază 39 terminală (Boehringer Mannheim) plus/a^32p/dd ATP (Amersham) și purificate pe coloane Nick (Pharmacia). Cinci post-spălări în 5 x SSPE/0,1 % SDS au fost efectuate la temperatura de 41 42’C, de fiecare dată, timp de 30 min, cu repetarea ultimei spălări. Filtrele au fost expuse la Hyperfilm MP (Amersham), timp de 7 zile. 43

Expresia din glanda pituitară. Analizele Northern blot au fost efectuate cu un amestec de patru probe oligonucleotidice, hibridizând cu diferite secvențe de-a lungul ADNc donat 45 (fig. 4). Probele au hibridizat cu o singură bandă de aproximativ 1400 bp în ARNm separați din glanda pituitară. Semnalele cele mai puternice au fost obținute cu material uman, dar 47 materialul de la porcine a reacționat, de asemenea, reticulat.

RO 120197 Β1

Exemplul 6. Distribuția Factorului Antisecrețional (AF) în secțiuni de glandă pituitară.

Specii și țesuturi. Glandele pituitare umane au fost obținute post mortem de la Spitalul Sahlgrenska (permisiunea a fost dată de Administrația Suedeză de Sănătate și Asistență Socială; 2 transplantationslagen, 1975:190). Glandele au fost păstrate congelate la temperatura de -70°C, cu excepția celor utilizate pentru examinarea histologică, care au fost fixate timp de 24 h în 4% paraformaldehidă dizolvată în soluție salină - tamponată cu fosfat (PBS = 1,15 M clorură de sodiu, 0,05 M fosfat de sodiu, pH=7,2) și apoi transferate în 7,5 zaharoză în PBS. Glandele pituitare de la porci, cu vârste cuprinse între 5 și 7 luni, obținute de la un abator, au fost plasate pe gheață uscată în timpul transportului și ținute congelate la temperatura de -70°C până în momentul utilizării. Șobolani din specia Sprague - Dawley, cu vârste cuprinse între 2 și 3 luni, au fost obținuți pentru teste biologice de la B și K Universal AB, Sollentuna, Suedia. Iepurii pentru imunizare (specia NewZealandWhite) au fost obținuți de la Lidkoping Kaninfarm, Suedia.

Imunohistochimia. Glandele pituitare fixate au fost congelate în azot lichid și au fost preparate secțiuni criogenice, având grosimi de 7 pg. Pentru fiecare probă, au fost fixate

5...10 secțiuni, cuprinzând diferite părți ale glandei pe lamele microscopului. Secțiunile au fost blocate în 5% lapte uscat lipsit de grăsime și incubate cu antiser primar de iepure (proteină de fuziune anti-GST-AF-2) diluat la 1:4000...1:8000, într-o cameră umedă, peste noapte la temperatura de 4°C. După spălare cu soluție tampon, specimenele au fost incubate timp de o oră la temperatura de 23°C cu imunoglobuline anti-iepure de la porc conjugate cu fosfatază alcalină diluată 1:50 (Dako A/S). Imunoreacția a fost vizualizată cu substraturi de fasfatază, așa cum a fost descris de Jemische, E., Matejka, G, J (1992), Acta Physiol. Scand., 146, 79-86. Secțiunile de control au fost incubate cu ser imunoabsorbit cu un exces de proteină GST-AF-2 sau cu toate fazele de incubare cu excepția anticorpului primar.

Distribuția Factorului Antisecrețional (AF) în secțiunile glandei pituitare. Distribuția Factorului Antisecrețional în secțiunile glandelor pituitare umane a fost analizată cu tehnici imunohistochimice (fig. 5). în toate probele investigate, au fost colorate un număr moderat de celule în adenohipofiză; materialul imunologic colorat apare a fi localizat în granule în citoplasmă; preabsorbția serului imunologic cu un exces de proteină GST-AF-2 a desființat semnalul. Nu s-a observat nici o colorare în partea posterioară (neurohipofiza).

Distribuția materialului imunoreactivîn glanda pituitară a demonstrat distribuția intracelulară exclusivă a Factorului Antisecrețional (AF)în celulele de secreție ale lobului anterior (adenohipofiză). Proteinele emanate de către acest lob includ hormoni de creștere, tirotropină, corticotropină, prolactină și hormonul de luteinizare. Trecerea acestor hormoni din localizarea în sistemul vascular este impulsionată de către factori de eliberare produși de celulele neuroendocrine în hipotalamus.

Exemplul 7. Activitatea biologică a Factorului Antisecrețional recombinant (rAF).

Activitatea antisecrețională. Activitatea antisecrețională a fost măsurată într-un model de buclă intestinală la șobolan, descrisă anterior Lange, S. (1982), FENS Microbiol., Lett. 15, 239 - 242. A fost provocată o buclă mică cu 3 micrograme de toxină a holerei. Au fost injectate fie doze diferite de proteină purificată AF-1, fie soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (de control) înainte sau după provocarea cu toxina holerei. Greutatea fluidului acumulat în bucla intestinală (mg/cm) a fost înregistrată după cinci ore. Fiecare preparat al Factorului Antisecrețional (AF) a fost testat la cel puțin șase șobolani. PLSD Fischer a fost utilizat pentru analiza statistică a datelor.

RO 120197 Β1

Activitatea biologică a proteinei Factor Antisecrețional recombinant (rAF). Activitatea 1 biologică a proteinei - Factor Antisecrețional recombinant (rAF) - pură a clonei -1, produsă în Escherichia coli, a fost testată într-un model de șobolan. Capacitatea Factorului 3 Antisecrețional recombinant (rAF) de a inhiba secreția fluidului intestinal, atunci când este injectat pe cale intravenoasă cu 20...30 s, înainte de provocarea intestinală cu toxina holerei, 5 este arătată în fig. 6. La animalele de control injectate numai cu soluție tampon, toxina holerei a cauzat o secreție pronunțată, 412 ± 9 mg fluid per centimetru de intestin. Factorul 7 Antisecrețional recombinant (rAF) a provocat o inhibare dependentă de doză a secreției holerei, care a fost în mod semnificativ diferită de răspunsul față de soluția tampon (p mai 9 mic decât 0,01, n = 6). 9 ng (nanograme) de proteină clonă-1 sunt suficiente pentru a reduce răspunsul cu 34%, în timp ce 44 ng (10'¹² moli) și 220 ng l-au redus cu 46% și respectiv 78%. 11

Activitatea biologică a Factorului Antisecrețional recombinant (rAF) este mai mare decât cea a oricărei enterotoxine cunoscute de noi și mai mare decât cea a oricărui hormon intestinal 13 sau a neuropeptidei, care modifică transportul apei și al electrolitului. Mai mult decât atât, nivelul activității Factorului Antisecrețional recombinant (rAF) uman la șobolan este surprin- 15 zător de ridicat, ceea ce reflectă probabil o structură omniprezentă conservată în moleculele rAF din diferitele specii. Această izoteză este susținută de către activitatea încrucișată dintre 17 materialul uman și materialul de porcine obținut în analize Western blot și analize Northern blot. 19

A fost comparată capacitatea de a inhiba secreția intestinală a 0,5 pg de Factor Antisecrețional recombinant (rAF), atunci când este injectat intravenos 20...30 s înainte, în 21 cazul în care este administrat 90 min, după provocarea cu toxina holerei (fig. 7). Ambele administrări au condus la inhibări semnificative în comparație cu animalele de control (p mai 23 mic decât 0,01, n = 6). Astfel, în contrast cu Factorul Antisecrețional natural, proteina recombinantă a fost, de asemenea, eficientă, când a fost administrată după provocarea cu 25 toxină, ceea ce face ca Factorul Antisecrețional recombinant (rAF) să fie util în tratamentul terapeutic al diareii. 27 pg de Factor Antisecrețional recombinant (rAF) au fost injectate într-o buclă având lungimea de 8...10 cm, plasată în imediata apropiere a buclei care a fost provocată cu toxina 29 holerei. Factorul Antisecrețional recombinant (rAF) a fost indus cu 20...30 s înainte sau 90 min, după provocarea cu toxină. în fig. 8 este arătat faptul că ambele grupe de testare au 31 obținut o reducere semnificativă a secreției de fluid în comparație cu grupările de control (p mai mic decât 0,01. N = 6); nu s-a observat nici o diferență între cele două grupe de testare. 33 Acest experiment sugerează faptul că Factorul Antisecrețional recombinant (rAF) este activ după administrarea orală și ar putea fi utilizat ca aditiv în hrana animalelor, deoarece că nu 35 se obțin efecte secundare serioase.

în exemplele descrise mai înainte, Factorul Antisecrețional recombinant (rAF) a fost 37 produs în celulele Epicurian ColiXL-1. în aceste celule, o mare parte din Factorul Antisecrețional recombinant (rAF) a fost degradat în peptide mai mici. Atunci când Factorul Antisecre- 39 țional recombinant a fost produs în celulele BL 21, doar o mică porțiune din Factorul Antisecrețional recombinant (rAF) a fost degradat, în timp ce în celulele Top 1 nus-auobser- 41 vat degradări. în mod surprinzător, activitatea biologică a fost proporțională cu extinderea degradării, respectiv o degradare mai mare a condus la o activitate mai ridicată. Ca urmare, 43 diferite fragmente mai scurte au fost produse, în scopul de a fi testate în ceea ce privește activitatea lor biologică posibilă. 45

RO 120197 Β1

Așa cum se arată în tabelul 1, aceste fragmente au fost testate intravenos înainte de provocare cu toxina holerei, în același mod ca cel descris mai înainte, pentru Factorul Antisecrețional recombinant intact. Peptidele exprimate prin clona-2 și clona-3, testate în cantități de 0,1,1 și 10 pg nu au avut nici un efect asupra răspunsului toxinei. Din contră, 1 pg din peptida exprimată prin fragmentul RACE (clona-4) a prezentat un efect pronunțat. O serie de constructi mai scurte au fost produse din fragmentul RACE și exprimate în pGex-1 lambda. Așa cum este arătat în tabelul 1, partea activă s-a găsit a fi situată între reziduul aminoacid 35 până la 51. Pentru a determina mai exact partea activă, au fost produse trei peptide mici prin sinteza peptidelorîn fază solidă. Două dintre ele au fost active, peptidele 35 - 46 (P3) și peptidele 35 - 42 (P1); octapeptida recentă IVCHSKTR (P1) a fost activă într-o doză mai mică decât 1 ng (nanogram), fiind aproape la fel de activă pe bază molară ca și Factorul Antisecrețional recombinant intact. Din contră, o hexapeptidă mai scurtă VCHSKT (P2) nu a exercitat vreun efect, atunci când a fost testată în doze cuprinse între 1 ng și 10 pg.

O peptidă X! VCY₂X₃KX₄R corespunzând fragmentului P1 uman, dar cu anumite modificări și/sau eliminări, a fost, de asemenea, produsă prin mutageneză orientată local și testată în ceea ce privește activitatea biologică. A fost făcută, de asemenea, comparația secvențelor ADNc. Aceste studii au sugerat următoarele modificări sau eliminări:

X, este I sau nimic,

X₂ este E, R sau K,

X₃ este S, L sau alt aminoacid neutru,

X₄ este T sau A.

Tabelul 1

Codul	Oligonucleotida*	Peptida”	Inhibarea secreției de toxină de
holeră*”	Pmol ED50
N1	63 - 301	1 -80	+	4
N2	168-301	36-80	+	6
N3	168-215	36-51	+	3
N4	122-170	21-36	-
N5	186-269	42-69	-
P3	S.P.S.XXXX	35-46	+	7
P1	S.P.S.	35-42	+	5
P2	S.P.S.	36-41	-

x Poziția perechii de baze în SECV. ID NR.1 care a fost exprimată în constructul făcut din Factorul Antisecrețional ADNc și pGex-1 -lambda·, xx Pozițiile reziduurilor de aminoacid (SECV. ID NR.1) în Factorul Antisecrețional AF la începutul și sfârșitul peptidei sintetizate.

xxx Inhibarea secreției de fluid indusă de către toxina holerei într-o buclă intestinală de șobolan ligată; cantitatea (pmol) care provoacă inhibarea la valoarea jumătate din cea maximă (ED 50) este menționată pentru peptidele active.

xxxx Aceste peptide au fost produse prin sinteză în fază solidă.

RO 120197 Β1

Efectul Factorului Antisecrețional recombinant (rAF) asupra influenței mucoasei 1 intestinale a fost, de asemenea, testat în modelul de buclă intestinală la șobolan. Astfel, 20 de șobolani au fost provocați cu 0,5 pg din toxina A din Clorstridium difficile (10) și secreția 3 inflamatorie și de fluid a fost măsurată după 2,5 și respectiv 5 h (10 plus 10 șobolani). Jumătate din șobolanii din fiecare grup au primit 100 ng de Factor Antisecrețional 5 recombinant (rAF) pe cale intravenoasă 30 s înainte de provocare; cealaltă jumătate a primit soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), drept soluție de control. După uciderea 7 șobolanului, buclele au fost supuse disecției și partea de mijloc cu lungimea de 2...3 cm din buclă a fost congelată pe gheață uscată. Probele congelate au fost apoi secționate în 9 secțiuni cu grosimea de 8 pm, prin utilizarea unui criostat de tipul Leica. Secțiunile au fost colorate pentru a demonstra fosfatazele alcaline prin histochimia enzimală. Fosfatazele 11 alcaline sunt exprimate prin celulele epiteliale intestinale și colorarea a permis o estimare a integrității epiteliului intestinal. 13

Rezultatele au scos în evidență (fig. 9) faptul că șobolanii de control au prezentat o vătămare extensivă a mucoasei intestinale: după 2,5 h, pierderea celulelor epiteliale din 15 membrana de bază a fost observată împreună cu țesutul necrotic, în timp ce sângerarea extensivă a fost observată după 5 h. Din contră, animalele tratate cu Factorul Antisecrețional 17 recombinant (rAF) nu au prezentat pierderi ale celulelor epiteliale, necroze sau sângerări. Secreția de fluid indusă de către toxina A a fost, de asemenea, inhibată de la 199+4 până 19 la 137±5 mg/cm după 2,5 h (p mai mic decât 0,01) și de la 421 ±3 până la 203±6 mg/cm, după 6 h (5 șobolani/grupă, p mai mic decât 0,01). 21

Un experiment similar a fost efectuat cu 0,5 pg de peptidă IVCHSKTR (P1), care a înlocuit proteina Factorului Antisecrețional recombinant (rAF). Octapeptida a realizat același 23 efect asupra inflamației intestinale și secreției de fluid indusă de toxina A, așa cum este arătat în fig. 9. 25

Toxicitate. în scopul de a testa toxicitatea Factorului Antisecrețional recombinant (rAF), a fost injectată o doză mare, de 50 de pg/șobolan. Nu au fost înregistrate nici un fel 27 de reacții toxice pe durata unei perioade de observație de o săptămână.

Exemplul 8. Activitatea biologică a Factorului Antisecrețional recombinant (rAF) 29 asupra permeabilității intestinale.

Cu scopul de a evalua efectul Factorului Antisecrețional recombinant (rAF) asupra 31 permeabilității unei substanțe organice dizolvată în sânge, a fost efectuat un test cu colorant albastru Evans, în conformitate cu metoda descrisă mai înainte. Experimentul a fost efectuat 33 inițial așa cum este descris mai înainte în exemplul 7 și fig. 5 cu injectarea pe cale intravenoasă a Factorului Antisecrețional recombinant (rAF), înainte de provocarea toxinei 35 de holeră. Cu toate că nu a fost măsurată nici o secreție de fluid, dar la 90 min după provocarea toxinei, un mililitru de soluție de colorant albastru Evans 1,5% în soluție salină 37 tamponată cu fosfat (PBS) a fost injectat pe cale intravenoasă. Colorantului i s-a permis să circule o perioadă de timp de cinci minute. După aceasta, șobolanul a fost supus unei 39 perfuzii transcardiace prin ventriculul stâng-atrium-ul drept (folosind o pompă peristaltică [Cole Palmer Instruments, Chicago Illinois, Statele Unite]) cu 200 ml de PBS, la temperatura 41 de 4°C/soluție Alsevier (în raport de 1/1), o perioadă de timp de aproximativ 150 s, operație efectuată sub anestezie cu eter. Această procedură a fost întreprinsă cu scopul de a 43 îndepărta toată cantitatea de EB prezentă în sistemul vascular, lăsând doar cantitatea de EB din țesutul interstițial să fie detectată prin extracția cu formamidă a colorantului. 45

RO 120197 Β1

Rezultatele din tabelul 2 au demonstrat că provocarea CT conduce la creșterea semnificativă (p mai mic decât 0,001) a cantității de EB, care a fost extrasă din țesutul intestinal cu aproximativ 43%, în timp ce injectarea pe cale intravenoasă a 1 BrT înainte de provocarea toxinei de holeră a prevenit această creștere, respectiv, cantitatea de EB extrasă din țesut în grupul 1 (de control) nu a diferit de cea din grupul 3 (1 rAF + CT).

Tabelul 2

Grupa	Provocare	ng	EB/g țesut interstițial x 1O'°7	% creștere a concentrației de EB
1	PBS + PBS	6	29,3 ±1,0	-
2	OPBS + CT	6	51,8 ± 1,3	43 (p mai mic de 0,001)
3	1raF+CT	6	29,6 ±1,5	ONS

Rezultatele arătate în fig. 10 și 11 au demonstrat extravazarea colorantului azo albastru Evans în intestinul mic și în plexus chorodeus corespunzător din ventricolul lateral al creierului după provocarea intestinală cu toxina holerei, cu și fără tratamentul anterior al șobolanilor cu P1 (IVCHSKTR).

Experimentele au fost efectuate în următorul mod: șobolani de sex masculin din specia Sprague - Dawley, cântărind 350 g, au fost înfometați timp de 18 h, înainte de procedura experimentală, dar au avut acces liber la apă. Șobolanii au fost folosiți în grupe de câte șase. Peptida P1, toxina holerei (CT) și soluția salină tamponată cu fosfat (PBS) au fost administrate în conformitate cu tabelul 3.

Tabelul 3

Grupa	Injecția 1* intravenoasă	Injecția* perorală	Injecția -2X intravenoasă
A	P1	CT	EB
B	PBS	CT	EB
C	PBS	PBS	EB

x Injecția cu P1 intravenos a fost administrată într-un volum de 2 ml saramură tamponată cu fosfat (PBS), injecția perorală a fost administrată într-un volum de 5 ml; injecția 2 intravenoasă a fost constituită din 1,5 ml de colorant albastru Evans dizolvat în PBS. A fost utilizat eter pentru anestezie în timpul efectuării tuturor injecțiilor.

Injecția intravenoasă de P1 (0,5 pg) sau a PBS au fost efectuate 10...15 s, înainte de provocarea perorală cu 100 pg de CT sau cu PBS; 60 min după provocarea perorală, șobolanii au fost anesteziați cu eter și injectați intravenos cu albastru Evans. Colorantului i s-a admis să mențină echilibrul timp de încă 30 min, după care șobolanii au fost din nou anesteziați cu eter și li s-au făcut perfuzii intracardiace prin ventriculul stâng cu 250 ml de soluție Alsevers/saramură tamponată cu fosfat (PBS) în raport de 50/50, cu scopul de a îndepărta tot colorantul prezent în sistemul vascular. După acest tratament perfuzal, efectuat o perioadă de timp de aproximativ 2...3 min, fluorescența înregistrată trebuia să reprezinte doar colorantul din afara sistemului vascular.

RO 120197 Β1

S-au luat probe din creier și o parte din intestinul mic, probe care au fost congelate 1 cu gheață uscată și s-au preparat secțiuni criostatice cu grosimea de 8 pm. Secțiunile au fost uscate cu aer și fixate într-un mediu de fixare conținând xilen. Secțiunile au fost examinate 3 într-un microscop Zeiss cu fluorescentă, folosind o combinație de filtru identică cu cea utilizată pentru fluorescența emisă de rodamin. 5

Rezultatele din fig. 10 și 11 au demonstratfaptul că intensitatea fluorescentă (culoare albă) este de o magnitudine similară atât în intestinul mic (fig. 10), cât și în plexus choroideus 7 (fig. 11) în grupa A (P1 intravenos + CT perorai) și grupa C (PBS intravenos + PBS perorai). Comparate cu intensitatea fluorescentă ridicată din intestinul mic, precum și din plexus 9 c/7oro/cteusdingrupaB(PSBintravenos + CT perorai), rezultatele au demonstrat în mod clar că injectarea de octapeptide, înainte de provocarea cu toxină, inhibă penetrația vasculară 11 a colorantului albastru Evans indusă de toxina holerei (CT). Rezultatele obținute sugerează faptul că aceasta este adevărat nu numai în sistemul vascular al intestinului mic, ci și în 13 plexus choroideus al ventriculului lateral al creierului.

în concluzie: efectul administrării pe cale intravenoasă a octapeptidei IVCHSKTR 15 inhibă penetrația extravasculară a colorantului albastru Evans indusă de toxina holerei (CT) în intestinul mic, precum și în plexus choroideus din sistemul nervos central. Astfel, acțiunea 17 Factorului Antisecrețional recombinant (rAF) și a derivaților peptidici ai acestuia nu este limitată numai la intestinul mic, ci influențează, de asemenea, permeabilitatea vaselor san- 19 guine din sistemul nervos central. Aceste descoperiri indică faptul că Factorul Antisecrețional recombinant (rAF) și derivații săi peptidici pot fi utilizați pentru a inversa presiunea intra- 21 craniană patologică, alterarea presiunii din urechea mijlocie și diferite forme ale modificărilor de permeabilitate în vasele sanguine. 23

LISTA DE SECVENȚE 25

SECV. ID. NR. 1 27

TIPUL SECVENȚEI: Nucleotidă cu proteina corespunzătoare

LUNGIMEA SECVENȚEI: 1309 perechi de baze plus coada poli(A) 29

ÎMPLETITĂ: singulară

TOPOLOGIE: liniară 31

TIPUL MOLECULEI: ADNc

ORGANISMUL SURSEI ORIGINALE: uman 33

SURSA EXPERIMENTALĂ IMEDIATĂ: glanda pituitară

CARACTERISTICI: de la 63 până la 1208 bp proteină matură 35 de la 1289 până la 1295 bp secvență semnal poli(A)

RO 120197 Β1

MTTCUCaCTTCTTCTTACCCCCTCCCCCAUCCCCCTCCCUCCUC

CMCCTCCCMC ATC CTC TTG CM ACC ACT ATC CTC TCT CTC GAC AAC ACT 101 Met Vel Leu Clu Ser Thr Met Vel Cyi Voi top A»n Ser»

1»

CAC

TAT

ATC

CCC

MT

CCA

CAC

TTC

TTA

CCC ACC

ACC

CTC

UC CCC

UC

149

Glu

Tyr

Mit

Ar®

ton

CLy

Mp

Phc

Leu

Pro Thr

Arg

leu

Cin Ala

Cin»

13

10

25

CAC

CAT

CCT

CTC

MC

ATA

CTT

TCT

CAT

TU MC

ACC

cec

ACC MC

CCT

197

Cin

A»P

Alo

Voi

Ajn

lle

Vel

Cy»

KtA

Ser lyi

Thr

Ar?

Ser ton

Pro»

3«

35

*9

45

CAC

AAC

AAC

CTC

CCC

CTT

ATC

AU

CTC

CCT AAT

UC

TCT

CAA CTC

CTC

245

Clu

Α»λ

Ajn

Voi

CI,

Leu

IU

Thr

Leu

Alo Aw,

top

Cy*

Clu Val

Leu»

se

55

60

ACC

ACA

CTC

ACC

CU

CAC

ACT

CCC

CCT

ATC CTC

TCC

MC

CTA UT

ACT

293

Thr

Thr

Leu

Thr

Pro

Mp

Thr

Cly

Arg

lle Leu

Ser

LyJ

Leu Hi»

Thr»

65

79

75

CTC

CM

CCC

MC

CCC

MC

ATC

ACC

TTC

TCC ACC

CGC

ATC

CCC CTC

CCC

341

Vot

Cin

Pro

Lyi

Cly

Lys

lle

Thr

Phe

Cy» Thr

Cly

lle

Arg Voi

Ale»

8»

85

99

CAT

CTC

CCT

CTC

MC

CAC

CCA

CM

CCC

MC MT

UC

MC

ATC CCC

ATC

389

His

Leu

Alo

Leu

ly*

Hi»

Arg

Gin

Cly

Ly» -A »n

Hi»

ly»

Het Arg

lle»

95

IM

195

ATT

CCC

ΤΠ

CTC

CCA

ACC

ca

CTC

CAC

UC MT

UC

MC

UT CTC

CTG

437

lle

Ale

Phe

Voi

CI,

Ser

Pro

Val

Clu

Ajp Ai»

Clu

Ly»

top Leu

Val»

11·

115

12»

125

AAA

CTC

CCT

AM

CCC

CTC

MC

MC

CAC

AM CTA

MT

CTT

UC ATT

ATC

485

L/i

Leu

Ale

Ly*

Arg

Leu

Ly*

Ly»

Clu

ly* Voi

ton

Voi

top 11 <

lle»

130

135

149

MT

TTT

CCC

CM

CAC

CAC

CTC

MC

ACA

CAA MC

CTC ,

AU

CCC TTT

CTA

533

Ajn

Pht

ily

Clu

Clu

Clu

Vel

A»n

Thr

Clu Lyi

Leu

Thr ,

Ala Phc

Val»

1A5

15«

15S

AAC

ACC

TTC

MT

CCC

MA

Cat

CCA

ACC

CCT TCT

CAT

CTC

CTC AU

CTC

581

ton

Thr

Leu

Am

ci/

Lyi

AlP

Cly

Thr

Cly Ser

H.l

Leu

Vel Thr

Val»

169

165

170

RO 120197 Β1

«T «T CCC Pro Pro Cly 175

CCC ACT TTC CCT CAT CCT CTC ATC ACT TCT CCC ATT TTC

629

1 3

Pro Ser

Leu

Ale ÎS»

A*p Alo Leu

llc Ser 185

Ser Pro llc Leu»

CCT

CCT

CAA

CCT

CCT

CCC

ATC

CTC

CCT cn

CCT CCC

ACT

ac

TTT

CAA

677

Alo

Cly

Clu

Cly

Cly

Ala

Mît

Leu

Cly Leu

Cly Ala

Ser

Asp

Phe

Clu»

5

19»

195

2»»

205

TTT

CCA

CTA

CAT

CCC

ACT

CCT

CAT

CCT ac

CTC CCC

TTC

CCC

CTT

CC7

725

7

Phe

Cly Voi

Aap

Pro

Ser

Ala

A*p

Pro Clu

Leu Alo

Leu

Ala

Leu

Arg»

21»

215

22»

9

CTA

TCT

ATC

CAA

CAC

ac

CCC

ac

ca cca

ca cca

CCC

CCC

CCC

ca

773

Vel

Ser

Met

Clu

Clu

Cin

Arg

Mii

Ala Cly Cly Cly

Ala

Arg Arg

Alo»

11

225

23»

235

CCT

CCA

CCT

TCT

CCT

CCT

CAC

CCC

CCC ATT

CCT ACC

ACT

CCC

ACT

CAA

»21

13

Ale

Arg

Alo

Ser

Ala

Ala

Clu

Ala

Cly lle

Ala Thr

Thr

Cly

Thr

Clu»

240

2«

25»

15

UC

TCA

UC

CAT

CCC

CTC

CTC

AAC

ATC ACC

ATC ACC

ac

CAA

UC

TTT

»69

AJP

Ser Asp Ai? Ala

Leu

Leu

Lyj

Met Thr

Ile Ser

cin

Cin

Clu

Pho

17

255

26»

255

ccc

CCC

ACT

CCC

CTT

CCT-

CAC

CTA

ACC ACT

ATC ACT

ac

CAA

UC UC

917

19

Cly Arg

Thr

Cly

Leu

Pro

A»p

Leu

Ser Str

Met Thr

Clu

Clu

Clv Cin»

27»

275

21»

285

21

ΑΠ

CCT

TAT

CCC

ATC ac

ATC

TCC

ctc ac

ca ca

. ac τπ

CCC

: uc

965

Ilr

Alo

Tyr

Ala

Met

Cin

Mec

Ser

Leu Cin Cly Ala Clu Phe

Cly Cin»

23

29»

295

3»»

CCC

CAA

τα

CCA

CAC

ATT

CAT

ccc acc τα

cct atc ac

AU

TCT

ac

1»13

25

Alo

Clu

Ser

Ala

A»p

Ile

Aip

Alo

Ser Ser

Alo Ket Asp

Thr

Ser

Clu»

39S

31»

315

27

CCA

CCC

AAC

CAC

CAC

CAT

CAT

TAC

ac crc

atc ac

ac

CCC

UC TTC

1061

Pro

Ale

ly»

Clu

Clu

Ai?

Alp

Tyr Aip Vel

Met Cin As? Pro Clu Phe»

29

32»

325

33»

στ

ac

ACT

CTC

CTA

CAC

AAC

CTC

ca cct

ctc ατ

CCC

AAC AAT

CAA

1199

31

Leu

Cin

5er

voi

leu

Clu

Aon

Leu

Pro Cly Val Asp

Pro Aon

Asn

Clu»

33S

340

345

33

CCC

ATT

CCA

AAT

CCT

ATC

CCC

TCC

CTC CCT

ccc acc

ca

ca

ACG

ACC

1157

Ale

Xlc

Arg

Atn

Aia

Met

Cly

Ser

Leu Pro Pro Arg

Pro

Pro Arg Thr»

35

35»

355

36»

365

CCA

ACA

ACC

ACA

AU

ACC

ACC

AAC

ACA ACA

act ac

ACT

CU

CCC

AAA

12«S

37

Ale

Arj

Arp

Thr

Arg

Arp

Arg

Lyi

Thr Arg

Ser Llu

Thr Cly Cly

Lyt»

37» 375 Μ»

CCC TACCTCACTCTCCTTACCCCACTCCATCCCAAÎCACCCĂArATACSCTTACArCTCTCr 3θ

Cly»

Claims (12)

1. Revendicări

   1. Proteină recombinantă, caracterizată prin aceea că are secvența de aminoacizi prezentată în SECV. ID. NR.1 sau omologi sau fragmente ale acesteia, având activitate antisecretorie.
2. 2. Fragment al proteinei recombinante prezentată în SECV. ID. NR.1, caracterizată prin aceea că este ales dintr-un grup, constând din:

   a) aminoacizii cu nr. 35-42;

   b) aminoacizii cu nr. 35-46;

   c) aminoacizii cu nr. 36-51;

   d) aminoacizii cu nr. 36-80;

   e) aminoacizii cu nr. 1-80;

   ai secvenței de aminoacizi arătată în SECV. ID. NR.1.
3. 3. Peptidă X₁VCX₂X₃KX₄R, caracterizată prin aceea că aceasta corespunde fragmentului ce cuprinde aminoacizii 35-42 ai peptidei recombinante prezentate în SECV. ID. NR.1, în care X_q este I sau nimic, X₂ este H, R este K, X₃ este S, L sau alt aminoacid neutru și X₄ este T sau A.
4. 4. Anticorpi caracterizați prin acea că sunt specifici pentru proteina recombinantă sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendicarea 1, sau fragmente ale acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2.
5. 5. Compoziție pentru normalizarea transportului fluidelor patologice și/sau normalizarea reacțiilor inflamatorii la animale, inclusiv, la oameni, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde, ca ingredient activ principal, o cantitate eficientă dintr-o proteină recombinantă sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendicarea 1, sau fragmente ale acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2.
6. 6. Utilizare a unei proteine recombinante sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendicarea 1, sau fragmentele acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2, pentru fabricarea unei compoziții pentru normalizarea transportului fluidelor patologice și/sau normalizarea reacțiilor inflamatorii la animale, inclusiv, la oameni.
7. 7. Aliment pentru normalizarea transportului fluidelor patologice și/sau normalizarea reacțiilor inflamatorii la vertebrate, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde, ca agent activ, o proteină recombinantă sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendicarea

   1, sau fragmentele acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2, sau un organism nonuman capabil pentru producerea respectivei proteine recombinante, omologi sau fragmente ale acesteia.
8. 8. Utilizare a anticorpilor definiți în revendicarea 4, pentru detectarea in vitro a proteinei recombinante, a omologilor sau a fragmentelor acesteia.
9. 9. Acizi nucleici, caracterizați prin aceea că aceștia codifică proteina recombinantă definită în revendicarea 1, sau fragmentele acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea

   2.
10. 10. Utilizare a acizilor nucleici definiți în revendicarea 9, pentru producerea proteinelor, a omologilor sau a fragmentelor corespunzătoare.
11. 11. Utilizare a probelor sau primerilor derivați din acizi nucleici care codifică proteina recombinantă sau omologii acesteia, așa cum sunt definiți în revendicarea 1, sau fragmentele acesteia, așa cum sunt definite în revendicarea 2, pentru a detecta in vitro prezența acizilor nucleici în organism.
12. 12. Vector, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde acizii nucleici definiți în revendicarea 9.