PL188530B1 - Rekombinowane białko, peptyd, przeciwciała specyficzne wobec białka, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie rekombinowanego białka, preparat paszowo-weterynaryjny, zastosowanie specyficznych przeciwciał, kwasy nukleinowe, zastosowanie sond lub primerów, wektor i komórka gospodarza - Google Patents

Abstract

1. R ekom binowane bialko posiadajace sekwencje am inokw asow a pokazana w SEQ ID nr 1 lub je g o fragmenty, posiadajace aktywnosc przeciw w ydzielnicza 3. Peptyd X 1V C X 2 X 3 K X 4 R odpowiadajacy fragmentowi, zawierajacemu am inokwasy nr 35-42 rekombinowanego bialka uka- zanego w SEQ ID nr 1, znam ienny tym, ze X 1 oznacza I lub go brak, X 2 jest H R lub K, X 3 jest S, L lub innym aminokwasem obojetnym i X 4 jest T lub A. 4. Przeciw ciala specyficzne w obec bialka posiadajacego sekwencje am inokw asow a ukazana w SEQ ID nr 1 lub je g o frag- m entów posiadajacych aktywnosc przeciwwydzielnicza. 5. K om pozycja farmaceutyczna do normalizacji patologicznego transportu plynów i/lub reakcji zapalnych u zwierzat, w la- czajac ludzi, zawierajaca czynnik aktywny i akceptowalne w farmacji i/lub weterynarii nosniki oraz substancje dodatkowe, zn a m ien - na tym , ze jako czynnik aktywny zawiera skuteczna ilosc rekom binowanego bialka ukazanego w SEQ ID nr 1 lub jeg o fragm entów posiadajacych aktywnosc przeciwwydzielnicza. 7. Zastosow anie rekom binowanego bialka, posiadajacego sekwencje ukazana w SEQ ID nr 1 lub je g o fragm entów posiada- jacych aktywnosc przeciw w ydzielnicza, do produkcji kom pozycji do normalizacji patologicznego transportu plynów i/lub reakcji zapalnych u zwierzat, wlaczajac czlowieka. 9 Preparat paszowo-weterynaryjny dla zwierzat do norm alizacji patologicznego transportu plynów i/lub reakcji zapalnych u kregowców, zawierajacy znane substancje odzyw cze oraz czynnik aktywny, zn am ien n y tym , ze jako czynnik aktywny zawiera rekombinowane bialko, posiadajace sekwencje ukazana w SEQ ID nr 1, lub je g o fragmenty, posiadajace aktyw nosc przeciw w ydziel- nicza, albo organizm zdolny do wytwarzania wym ienionego rekom binowanego bialka lub je g o fragmentów. 10. Zastosow anie specyficznych przeciwcial przeciw rekom binowanem u bialku posiadajacem u sekw encje am inokw asow a ukazana w SEQ ID nr 1 lub je g o fragmentom posiadajacym aktywnosc przeciw w ydzielnicza, do wykrywania in vitro w ym ienionego bialka lub je g o fragmentów w organizmach. 11. Kwasy nukleinowe, kodujace rekombinowane bialko posiadajace sekw encje ukazana w SEQ ID nr 1 lub je g o fragmenty posiadajace aktywnosc przeciw w ydzielnicza 13. Zastosow anie sond lub primerów pochodzacych z kw asów nukleinow ych kodujacych rekom binowane bialko posiadajace sekwencje ukazana w SEQ ID nr 1 lub je g o fragmenty posiadajace aktywnosc przeciw w ydzielnicza, do wykrywania in vitro obecnosci kw asów nukleinowych w organizmach 14. Wektor zawierajacy kwasy nukleinowe kodujace bialko posiadajace sekwencje ukazana w SEQ ID nr 1 lub je g o fragmen- ty posiadajace aktywnosc przeciw w ydzielnicza 15. Komórka gospodarza z wyjatkiem czlowieka obejmujaca wektor zawierajacy kwasy nukleinowe kodujace rekombinowane bialko posiadajace sekwencje aminokwasowa ukazana w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadajace aktywnosc przeciwwydzielnicza. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest także peptyd XfVCX2X3KX4R odpowiadający fragmentowi, zawierającemu aminokwasy nr 35-42 rekombinowanego białka ukazanego w SEQ ID nr 1, w którym Xi oznacza I lub go brak, X2 jest H, R lub K, X3 jest S, L lub innym aminokwasem obojętnym i jest T lub A.

Następnym przedmiotem wynalazku są przeciwciała specyficzne wobec białka posiadającego sekwencję aminokwasową ukazaną w SEQ ID nr 1 lub wobec jego fragmentów posiadających aktywność przeciwwydzielniczą.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna do normalizacji patologicznego transportu płynów i/lub reakcji zapalnych u zwierząt, włączając ludzi, zawierająca czynnik aktywny i akceptowalne w farmacji i/lub weterynarii nośniki oraz substancje dodatkowe, charakteryzująca się tym, że jako czynnik aktywny zawiera skuteczną ilość rekombinowanego białka ukazanego w SEQ ID nr 1 lub jego fragmentów posiadających aktywność przeciwwydzielniczą.

Korzystnie kompozycja może zawierać fragment rekombinowanego białka wybrany z grupy, obejmującej:

a) aminokwasy nr 35-42

b) aminokwasy nr 35-46

c) aminokwasy nr 36-51

d) aminokwasy nr 36-80

e) aminokwasy nr 1-80 sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEQ ID nr 1.

Następnie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rekombinowanego białka, posiadającego sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmentów posiadających aktywność przeciwwydzielniczą, do produkcji kompozycji do normalizacji patologicznego transportu płynów i/lub reakcji zapalnych u zwierząt, włączając człowieka.

Korzystnie stosuje się fragment rekombinowanego białka, który wybiera się z grupy, obejmującej:

a) aminokwasy nr 35-42

b) aminokwasy nr 35-46

c) aminokwasy nr 36-51

d) aminokwasy nr 36-80

e) aminokwasy nr 1-80 sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEQ ID nr 1.

Przedmiotem wynalazku jest także preparat paszowo-weterynaryjny dla zwierząt do normalizacji patologicznego transportu płynów i/lub reakcji zapalnych u kręgowców, zawierający znane substancje odżywcze oraz czynnik aktywny, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera rekombinowane białko, posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1, lub jego fragmenty, posiadające aktywność przeciwwydzielniczą, albo organizm zdolny do wytwarzania wymienionego rekombinowanego białka lub jego fragmentów.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie specyficznych przeciwciał przeciw rekombinowanemu białku posiadającemu sekwencję aminokwasową ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmentom posiadającym aktywność przeciwwydzielniczą, do wykrywania in vitro wymienionego białka lub jego fragmentów w organizmach.

Przedmiotem wynalazku są także kwasy nukleinowe, kodujące rekombinowane białko posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadające aktywność przeciwwydzielniczą.

188 530

Korzystnie kwasy nukleinowe według wynalazku kodują fragmenty rekombinowanego białka wybrane się z grupy obejmującej:

a) aminokwasy nr 35-42

b) aminokwasy nr 35-46

c) aminokwasy nr 36-51

d) aminokwasy nr 36-80

e) aminokwasy nr 1-80 sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEQ ID nr 1.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie sond lub primerów pochodzących z kwasów nukleinowych kodujących rekombinowane białko posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadające aktywność przeciwwydzielniczą, do wykrywania in vitro obecności kwasów nukleinowych w organizmach.

Następnie, przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający kwasy nukleinowe kodujące białko posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadające aktywność przeciwwydzielniczą.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza z wyjątkiem człowieka obejmująca wektor zawierający kwasy nukleinowe kodujące rekombinowane białko posiadające sekwencję aminokwasową. ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadające aktywność przeciwwydzielniczą.

Jako organizmów zdolnych do wytwarzania rekombinowanego białka, można użyć różnych typów organizmów, takich jak rekombinowane bakterie i organizmy eukariotyczne, takie jak drożdże, rośliny i kręgowce, z wyjątkiem ludzi.

Mimo dziesięciu lat prób oczyszczenia AF konwencjonalnymi technikami biochemicznymi, nie było możliwe otrzymanie AF w postaci jednorodnej. Jednakże za pomocą nowej procedury preparacji półczystego AF do immunizacji i selekcji antyserum za pomocą metody immunohistochemicznej rekombinowane białko, posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1, lub jego homologi lub fragmenty, wybrano odpowiednie antyserum. Z użyciem tego antyserum jest teraz możliwe klonowanie rekombinowanego ludzkiego cDNA, wykazującego ekspresję AF u E.coli.

Określono sekwencję nowego cDNA i okazała się ona jedyna w swoim rodzaju. Znajomość tej sekwencji pozwoliła skonstruować sondy oligonukleotydowe, które hybrydyzują z RNA przysadki człowieka i świni. Wielkość tego RNA, około 1400 par zasad, stosuje się do wielkości sekwencjonowanego cDNA, zawierającego 1309 par zasad plus ogonek poli(A). Okazało się, że częściowa sekwencja cDNA z gruczołu przysadkowego szczura, jest identyczna z cDNA człowieka, odzwierciedlając wszechobecną strukturę zachowaną w genach AF różnych gatunków. To podobieństwo umożliwia użycie tych samych sond oligonukleotydowych do identyfikacji RNA i DNA, kodującego AF od różnych gatunków.

Możliwa była ponadto ekspresja rAF w postaci aktywnej biologicznie. Białko AF w postaci białka połączonego glutationo-S-transferazą, podlegało ekspresji w wielkich ilościach u E.coli i oczyszczono je do jednorodności przez chromatografię powinowactwa. Po rozszczepieniu trombiną białka połączonego, okazało się, że rekombinowany AF (rAF) jest niezwykle silny, 44 ng (10'¹² mola) daje połowę maksymalnej inhibicji wydzielania płynu indukowanego przez toksynę cholery w jelicie szczura.

Dzięki technikom genowym wytworzono mniejsze fragmenty rAF. Okazało się, że aktywność umiejscowiona jest w małej sekwencji, składającej się z 7 do 8 aminokwasów. Potwierdzono to za pomocą chemicznej syntezy w fazie stałej, dzięki której wytworzono oktapeptyd i pokazano, że jest on prawie tak samo biologicznie silny jak rAF w oparciu o molamość. Za pomocą syntezy skierowanej miejscowo, skonstruowano różnorodne sekwencje wewnątrz miejsca aktywnego i okazało się, że wymiany pewnych aminokwasów są możliwe bez zakłócania aktywności biologicznej.

Sekrecję płynów mierzono w modelu pętli jelitowej: część (pętlę) jelita cienkiego podwiązuje się za pomocą dwóch podwiązek (satures); do pętli wstrzykuje się pewną ilość enterotoksyny. Jeśli testuje się leki przeciwwydzielnicze, wstrzykuje się je między jedną godziną przed i dwie godziny po prowokacji toksyną. Injekcję wykonano trzema różnymi drogami;

188 530 dożylnie, dojelitowo i donosowo. Płyn gromadzi się w pętli 5 godzin po prowokacji toksyną. Sekrecję oblicza się z ciężaru zgromadzonego płynu na cm jelita.

Sekwencję białka określono zarówno bezpośrednio przez sekwencjonowanie aminokwasów jak i pośrednio przez wnioskowanie z sekwencji cDNA.

Rekombinowany AF wydaje się wywierać bardzo mały wpływ toksyczny lub układowy, ponieważ nie zauważono wyraźnych reakcji toksycznych u szczurów, którym podano 100krotnie większe dawki niż takie, które powodują połowę maksymalnej inhibicji. Ponieważ jest skuteczny wstrzyknięty do jelita cienkiego, możnaby go podawać doustnie.

Rekombinowany AF hamuje także sekrecję wstrzyknięty po prowokacji toksyną, w przeciwieństwie do testowanych preparatów naturalnego AF, które wydają się być skuteczne tylko wstrzyknięte przed toksyną. W ten sposób, rAF mógłby być stosowany zarówno profilaktycznie jak i terapeutycznie.

Dalej, okazało się, że rAF i jego fragmenty peptydowe hamują reakcje cytotoksyczne i zapalne w jelicie spowodowane przez toksynę A z Clostridium difficile. Za pomocą testu przenikalności barwnika rAF i jego fragmenty okazały się odwracać patologiczne zmiany przenikalności indukowane przez toksynę cholery nie tylko w błonie śluzowej jelita lecz także w splocie naczyniówkowym, który reguluje ciśnienie płynu w mózgu.

Antysera przeciw rAF wytworzono u szczurów i użyto w oznaczeniach immunologicznych wiązania enzymu (ELISA). Tego oznaczenia można użyć do pomiaru AF w płynach ciała lub paszy.

Metodę oczyszczania przeciwciał przeciw AF (naturalnemu lub rekombinowanemu) za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnie z rAF sprzężonym z agarozą, opisuje się poniżej.

Okazało się także, że przeciwciała są skuteczne przy wykrywaniu AF w fragmentach tkanki, za pomocą technik immunohistochemicznych oraz przy wykrywaniu AF w Western biot.

Wynalazek będzie teraz opisany dodatkowo za pomocą następujących nie ograniczających przykładów, razem z 5 towarzyszącymi rysunkami.

Przykład 1. Przeciwciała przeciw AF wytworzone do kloningu cDNA

Czynnik przeciwwydzielniczy wytworzono z krwi świni za pomocą chromatografii powinowactwa na agarozie oraz ogniskowania izoelektrycznego. Do jednego litra krwi świni (zawierającej substancje przeciwskrzepowe) dodano 1 g tiosiarczanu sodu i 1 mg fenylometylosulfonylofluorku. Komórki krwi oddzielono przez wirowanie i czyste osocze poddano elucji przez kolumnę z Sepharose 6B (Pharmacia lKb Biotechnology Sztokholm), przy czym objętość żelu odpowiada około 10% objętości roztworu. Po przemyciu trzema objętościami łoża, roztworu soli buforowanej fosforanem (PBS = 0,15 M NaCl, 0,05 M fosforan sodu, pH 7,2), kolumnę poddano elucji dwoma objętościami łoża 1 M a-metylo-D-glukozydu rozpuszczonego w PBS. Produkt elucji zatężono i dializowano przeciw wodzie na ultrafiltrze „Omega 10K flow through” (Filtron Technology Corp.). Następnie frakcję frakcjonowano przez ogniskowanie izoelektryczne w gradiencie amfoliny (Pharmacia) pH 4-6 na 400 ml kolumnie ogniskowania izoelektrycznego (LKB, Szwecja). Frakcję, posiadającą punkt izoelektryczny między 4,7 i 4,9 zebrano i dializowano przeciw PBS. W ten sposób częściowo oczyszczony AF podzielono na małe równe części i użyto do wytworzenia antyserum u królika zgodnie z metodą opisaną wcześniej.

Immunizowano króliki i sera testowano pod względem ich zdolności do barwienia materiału wewnątrzkomórkowego w przekrojach ludzkiego gruczołu przysadkowego (metoda opisana w przykładzie 6). Tylko jedno z serów wykazało specyficzne i wyraźne zabarwienie wewnątrzkomórkowe bez zabarwienia zewnątrzkomórkowych białek matriks. To antyserum wybrano do skriningu biblioteki cDNA/faga lambda GT11 z ludzkiego gruczołu przysadkowego, wykazującego ekspresję białek w E.coli.

Przykład 2. Skrining bibliotek cDNA z gruczołu przysadkowego i mózgu człowieka.

Bibliotekę cDNA przedłużenia 5' z normalnego gruczołu przysadkowego człowieka, pochodzącego z tkanek otrzymanych z puli dziewięciu Kaukazów (caucasians), nabyto od Clontech Laboratories. Do skriningu biblioteki, powleczono w ilości 3 x 10⁴ jednostek, tworzących

188 530 blaszki na 150 mm płytkę z E. coli Y1090. Wcześniej opisane królicze antyserum przeciw świńskiemu AF absorbowano za pomocą 0,5 objętości lizatu E. coli Y1090 przez 4 godziny w temperaturze 23 °C i rozcieńczono do stosunku 1:400 i przeprowadzono skrining zgodnie z Youngiem i Davisem (1). Kozich przeciwciał antykróliczych sprzężonych z fosfatazą alkaliczną użyto jako przeciwciał wtórnych (Jackson). Płytki pozytywne zebrano, wymyto do pożywki z zawiesiną faga [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 2% żelatyna], ponownie powleczono i przesiewano aż wszystkie testowane płytki były pozytywne.

Rekloning cDNA - DNA faga z rekombinantów AF izolowano przy użyciu Wizard Lambda Preps (Promega) i trawiono EcoRI. Inserty oczyszczono za pomocą Sephaglas BandPrep Kits (Pharmacia), reklonowano do wektora pGex-lA,T (Pharmacia) jak opisano przez producenta, i transfekowano do komórek Epicurian Coli Xll-Blue, Top 1 lub komórek BL21 (wszystkie trzy od Stratagen). rAF lub r-peptydy wytworzono w komórkach BL21, jeśli nie ustalono inaczej (2).

Powielenie cDNA przez PCR - Aby otrzymać brakujący koniec 5' cDNA przeprowadzono metodę opartą na PCR nazwaną RACE (szybkie powielenie końców cDNA). Modyfikowaną metodę RACE, która tworzy cDNA 5'-RACE-Ready z zakotwiczonym oligonukleotydem przyłączonym do końców 3' cząsteczek cDNA mózgu człowieka, nabyto od Clontech Laboratories. Koniec 5' powielono z części cDNA 5'-RACE-Ready w dwóch etapach powielania PCR, przy użyciu primera 5' komplemetarnego do zakotwiczenia oraz dwóch zgrupowanych primerów 3' PCR A i B specyficznych dla genu (A = zasada 429-411 i B = zasada 376359; fig 1a). Różne niniejsze części fragmentu RACE powielono dalej w celu ekspresji odpowiadających peptydów i testowania pod względem ich właściwości biologicznych. Pozycję zasady i aminokwasu na początku i na końcu tych fragmentów oligonukleotydowych ukazuje się w tabeli 1. cDNA świni i bydła (Clontech Laboratories) użyto jako matrycę do powielenia fragmentów, odpowiadających N3 w tabeli 1. Odmianę sekwencji także wtrącono sztucznie przez miejscowo skierowaną mutagenezę, w której to metodzie różne oligonukleotydy, odpowiadające pozycji 168-193 syntetyzowano w celu zamiany jednego aminokwasu 35-42 na drugi (pozycje jakie ukazano w SEQ ID nr 1). Powielony fragment DNA klonowano do wektora pGex-1X-T przy użyciu miejsca EcoRI wbudowanego do zakotwiczenia, oraz primera specyficznego dla genu. Aby zweryfikować sekwencję uzyskaną metodą RACE, cDNA o podwójnym łańcuchu z gruczołu przysadkowego i mózgu człowieka (Clontech) powielono za pomocą pary primerów C/D, zawierającej dodatkowe miejsce rozszczepienia EcoRI (fig. 1b). Primery zaplanowano, aby pozwolić na powielenie całej otwartej ramki odczytu (ORF). Produkty PCR przysadki i mózgu oczekiwanej wielkości trawiono EcoRI, izolowano i klonowano do plazmidu wektora pGex-1X,T.

Sekwencjonowanie DNA i oligonukleotydy - DNA z plazmidu pGex-1XT użyto jako matrycę do sekwencjonowania insertów metodą terminacji dideoksy łańcucha (15) przy użyciu zestawu Sequenase wersja 2,0 (U.S. Biochemical Corp.). Regiony kopiujące początkowych primerów o orientacji w jedną stronę i przeciwnie pGex-1XT tuż w górę i w dół od wtrąconego DNA, otrzymano od Pharmacia. Kolejne primery zsyntetyzowano (Scandinavian Gene Synthesis AB) na podstawie otrzymanej informacji o sekwencji. Trzy różne klony PCR sekwencjonowano w celu uniknięcia wymiany zasad przez polimerazę Taq w metodzie 5'-RACE.

Dane o sekwencji nukleotydowej i wyprowadzonej sekwencji białka opracowano i analizowano przy użyciu MacVector 4.1 (Eastman Chemical Co.). Aby przewidzieć odpowiadającą sekwencję aminokwasową insertów cDNA, porównano użycie kodonu różnych ramek odczytu i podano jedną wielką otwartą ramkę odczytu. Dane przebadania sekwencji DNA i białka przeprowadzono przy użyciu dysku CD-ROM Entrez (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA).

Kloning cząsteczkowy i analiza sekwencji cDNA - Poliwalentnych antyser przeciw białku AF ze świni użyto do skriningu cDNA z gruczołów przysadkowych człowieka. Dwa klony, wykazujące ekspresję immunoreaktywnego AF izolowano, odebrano od faga lambda i reklonowano do miejsca EcoRI wektora pGex-1XT jak opisano w zestawie dostarczonym od Pharmacia. Analiza restrykcyjna dała wielkości insertów, wynoszące odpowiednio 1100 i 900 bp. Sekwencjonowanie DNA dwóch klonów, wykazało pełną homologię z wyjątkiem jednej substytucji (fig. 1, C zastępujące T w pozycji 1011). Sekwencję w górę od końca 5' klonu 2

188 530 otrzymano za pomocą metody RACE. Fragment miał całkowitą długość 376 bp (nie włączając syntetycznego ramienia nukleotydowego przy końcu 5'). Całkowity przebudowany cDNA zawierał 1309 par zasad, potem ogonek poli-A, który poprzedzał sygnał poli-A (fig. 1, pozycje 1289-1295). Określono otwartą ramkę odczytu (ORF) o 1146 bp (pozycje 63-1208).

Przykład 3. Ekspresja białka AF ssaka z rekombinowanych plazmidów.

Budowanie i oczyszczanie białka połączonego - Klony cDNA otrzymane przez skrining immunologiczny i przez powielenie PCR całego cDNA, poddano ligacji do pGex-1XT. Wektor ten pozwala na ekspresję obcych białek w E. coli jak połączona z końcem C glutationo-Stransferaza (GST) Schistosoma japonicum o 26 kDa, którą można oczyszczać przez powinowactwo, w warunkach nie denaturujących, za pomocą zestawu dostarczonego od Pharmacia. W skrócie, nocne hodowle E. coli transformowane rekombinowanymi plazmidami pGex-1XT rozcieńczono w świeżej pożywce i hodowano przez dalsze 3 godziny w temperaturze 37°C. Ekspresję białka indukowano 0,1 mM IPTG (izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd) i po dalszych 4 godzinach hodowli w temperaturze 30°C komórki granulowano i ponownie zawieszono w PBS. Komórki poddano lizie za pomocą dźwięku, traktowano 1% Triton Χ-100 i wirowano przy 12000Χ g przez 10 minut; supernatant, zawierający uzyskane w wyniku ekspresji białka połączone oczyszczono przez przejście lizatów przez agarozę z glutationem (Pharmacia). Białka połączone albo poddano elucji przez konkurencję z wolnym glutationem albo rozszczepiano przez noc przy użyciu 10 jednostek trombiny bydlęcej, w celu usunięcia białka AF z ogonka powinowactwa GST. Całość metody użycia plazmidu pGex i oczyszczenie rekombinowanych białek lub peptydów wykonano za pomocą zestawów dostarczonych przez Pharmacia.

Sekwencja i wielkość rekombinowanych białek AF - Aby potwierdzić sekwencję kodującą, izolowano transkrypt o pełnej długości stosując powielenie PCR cDNA przysadki i mózgu. Przy użyciu pary primerów C/D, izolowano 1215 bp identycznych z sekwencją klonu-4 (fig. 1). Otwarta aamka ddczytu kddowala 882 armookwasy o bbliczonej masie zzs^^tcczkwe^ej 41,14 kDA i obliczonym pI 4,9.

Klony AF 1, 2 i 3, a także oligonu0łeotydy N1-N5 (fig. 1 i tabela 1) poddano ligacji do wektora plazmidu pGex-1XT tak, że ORF była w ramce z białkiem glutktiono-S-taaosferazy (GST). Konstrukcje transformowano do E. coli i indukowano ekspresję białek połączonych za pomocą IPTG Oczyszczone białka połączone i rozszczepione trombiną białko lub peptyd AF poddano SDS-PAGE i Western blotting przy użyciu antyserum przeciw czynnikowi antywydzielniczemu świni (fig. 2). Barwienie białek czystym błękitem Coomkasle ujawniło delikatne wstęgi dla każdego białka z wyjątkiem białka GST-AF-1, co było przejawem degradacji do mniejszych składników

Synteza peptydu w fazie stałej - Wytworzono mniejsze peptydy (P7 do Pi₈ w tabeli 1) (K. J.Ross-Petersto AS) na fazie stałej w syntetyzerze peptydów Applied Biosystems. Czystość każdego peptydu wynosiła 93-100% jak oceniono przez HPLC z odwrotną fazą na Deltapak C18, 300 A, przy użyciu gradientu liniowego 0,1% kwasu trifluorooctowego w wodzit/kcttooitaylu.

Stkweodjonowkoie aminokwasów - Analizę sekwencji kmiooOwkaowej przeprowadzono do dalszej oceny zidentyfikowanej ORF. Czyste białka AF przepuszczono w 10% żelu SDS-PAGE o dużych płatkach (14) i przeniesiono białka na błonę Problot (Applied Biosystems) przez tlektroblotting (Bio-Rad). Plamki uwidocznione przez barwienie Ponceau S usunięto z odcisku i pierwsze 20 aminokwasów białka sekwtocjonowkoo przez automatyczną degradację Edman na sekweocerzt automatycznym (Applied Biosystems).

Określono sekwencje N-terminalne klonu 2 i klonu 3 i okazało się, że są one doskonale dopasowane do kmiookwkaów odpowiednio 63-75 i 130-140, sekwencji przewidywanej (fig. 1).

Porównanie z innymi se0wtocjami białkowymi dostępnymi z GtoBao0, ujawniło, że sekwencja rAF (fig. 1) jest jedyna w swoim rodzaju we wszystkich swoich częściach i nie doniesiono o żadnej podobnej sekwencji.

Pierwsze dziesięć reszt białka okazało się stosunkowo hydrofobowych przy analizie według Kytt-Dzolittle'a (22) i mogła stanowić peptyd sygnałowy, który odszczepiono przed egzocytozą białka. Ta interpretacja opiera się na analizach Western blotting (fig. 3), w których okazało się, że ^kombinowane białko ma nieznacznie wyższy ciężar cząsteczkowy niż ekstrat

188 530 białkowy z gruczołu przysadkowego. Niektóre z tych różnic jednakże, mogły być także spowodowane dodatkowymi pięcioma aminokwasami w rekombinowanym białku, stanowiącymi miejsce rozszczepienia trombiną białka połączonego.

Przykład 4. Wytwarzanie i testowanie antyserów przeciw rAF

Antysera przeciw rekombinowanemu białku połączonemu GST-AF - Przeciwciała przeciw oczyszczonym białkom połączonym GST-AF-1 i GST-AF-2 oraz czystemu białku AF-1 rozszczepionemu trombiną (=rAF), do użytku w ELISA, Western blot i badaniach immunohistochemicznych, wytworzono u królików Każdemu królikowi podano 100 pg antygenu w 1 ml PBS zmieszanym z równą objętością kompletnego adjuwanta Freunda; każdą immunizację rozłożono na 8-10 części wstrzykiwanych dożylnie w grzbiet. Dwie dawki przypominające z 50 pg antygenu wstrzyknięto w 3 i 5 tygodniu, ostatnią bez kompletnego adjuwanta Freunda. Króliki skrwawiono 6 dni po ostatniej dawce przypominającej a sera sporządzono i przechowywano w temperaturze -20°C. Czułość antyserum testowano za pomocą oznaczenia dot blot. GST-AF-2 nałożono na błonę nitrocelulozową ECL w rozcieńczeniach 1/5, a antyserum rozcieńczono 1:1000. Błonę zablokowano 1% albuminą osocza bydlęcego (BSA) w PBS w temperaturze 4°C przez 16 godzin, a potem inkubowano przez 1 1/2 godziny z rozcieńczonym 1:800 króliczym antyserum anty-GST-AF lub świńskim AF. Odcisk wywołano za pomocą koziej antykróliczej immunoglobuliny sprzężonej z fosfatazą alkaliczną po czym 5-bromo4-chloro-3-indolilofosforanem i tetrazolium p-nitro błękitu (Boehringer Monachium). Oszacowana granica dla detekcji antygenu wynosiła w teście około 1.

SDS-elektroforeza w żelu poliakrylamidowym i immunolblotting - Wykonano SDSelektroforezę w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) ekstraktów i czystych białek AF ludzkiego i świńskiego gruczołu przysadkowego, w 10% żelach akrylamidowych małopłatkowych, zasadniczo jak opisano u Laemmli'ego (4) z taką modyfikacją, że bis-akrylamid jako czynnik sieciujący zastąpiono N,N'-diallilowinianodiamidem o odpowiadającej molarności. Pironinę Y (Sigma) użyto jako markera czoła elektroforetycznego. Wstępnie barwiony odnośnik ciężaru cząsteczkowego nabyto od BDH. Następnie albo barwiono białka czystym błękitem Coomassie albo przeniesiono elektroforetycznie na nitrocelulozę ECL o wielkości porów 0,45 mm (Amersham) do immunoblottingu. Następne inkubacje z BSA, substrat IgG sprzężony z fosfatazą alkaliczną, były takie same jak do oznaczenia dot blot opisanego powyżej.

Jak ustalono powyżej, barwienie Coomassie Brilliant Blue nie ujawniło delikatnej wstęgi dla białka GST-AF-1, co prawdopodobnie spowodowane było proteolityczną degradacją do mniejszych składników. Jednakże w analizach Western blot białko o pełnej długości dawało znacznie silniejszy sygnał niż rozłożone produkty (fig. 2b). Silna rekacja z antyserum przeciw świńskiemu AF wskazywała, że rekombinowane białka rzeczywiście mają taką samą immunoreaktywność jak AF. Okazało się, że ciężar cząsteczkowy białka o pełnej długości wynosi około 60 kDA, jest więc wyższy niż prawdziwy ciężar cząsteczkowy, wynoszący 41139 Da oszacowany ze składu aminokwasowego. Ponadto, białka poddano także immunoblottingowi i sondowano z antyserum aktywowanym przeciw GST-AF-2, które wiąże się z białkami rozszczepionymi trombiną (fig. 3).

Antyserum przeciw rekombinowanemu GST-AF-2 reagowało z naturalnie występującym białkiem AF o widocznej masie molowej 60 kDa i z niektórymi mniejszymi składnikami, prawdopodobnie produktami rozkładu enzymatycznego (fig. 3a).

ELISA, określająca stężenie AF - Przeprowadzono test ELISA przy użyciu anty AF-1 i anty -AF-2 według metody opisanej wcześniej (5). Jak pokazano w fig. 3b czułość testu z surowym antyserum wynosiła między 1-10 pg białka, podczas gdy test z przeciwciałem oczyszczonym przez powinowactwo miał czułość między 5 i 50 ng białka.

P r z yk ł a d 5. Analiza Nothern biot RNA z gruczołu przysadkowego

Analiza Nothern biot - Ludzkie gruczoły przysadkowe otrzymano pośmiertnie ze szpitala Sahlgrenska (zezwolenie wydane przez Szwedzkie Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej; 2§ transplantationslagen, 1975:190). Aby otrzymać RNA, gruczoły przysadkowe poddano ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny RNA zgodnie z Chomczynskim i Sacchi (6). Poliadenylowany RNA poddano selekcji za pomocą handlowego zestawu (Pharmacia) przy użyciu kolumn z oligodT-celulozą. Dodatkowo, użyto pulę ludzkiego mRNA przysadkowego

188 530 od 107 osób, nabyltą od Clontech. Pięć pg każdej próbki pali(A+)RNA traktowano glioksalem i poddawano elektroforezie w 1,2% żelu agarozowym (7). Po przeniesieniu za pomocą kapilary alkalicznej przez 3 godziny w 0,05 M NaOH na błony Hybond N+ (Amersham), przeprowadzono hybrydyzację wstępną i hybrydyzację właściwą przez 24 godziny każdą, w temperaturze 42°C. Roztwór do hybrydyzacji zawierał 50% formamidu, 5 x SSPE, 10 x roztwór Dennharda z 250 pg/ml denaturowanego DNA o niskim ciężarze cząsteczkowym i 50 pg/ml kwasu poliadenylowego. Odciski sondowano czterema różnymi oligonukleotydami antysensownymi o 28 bp, zawierającymi pozycje 132-105 (primer E), 297-270 (primer F), 748-721 (primer G) i 833-806 (primer H) sekwencji (fig. 1); sondy znakowano na końcu 3' transferazą terminalną (Boehringer Monachium) plus [a^PjddATP (Amersham) oraz oczyszczono na kolumnach Nick (Pharmacia). Wykonano potem pięć przemyć w 5 x SSPE/0,1% SDS - 0,5 x SSPE/0,1% SDS, w temperaturze 42°C przez 30 minut za każdym razem, z powtórzeniem ostatniego przemycia. Sączki poddano ekspozycji na Hyperfilm MP (Amersham) przez 7 dni.

Ekspresja w gruczołach przysadkowych - Przeprowadzono analizę Nothem blot z mieszaniną czterech sond oligonukleotydowych, hybrydyżujących z różnymi sekwencjami wzdłuż klonowanego cDNA (fig. 4). Sondy hybrydyzowafy z pojedynczą wstęgą o około 1400 bp w oddzielonym mRNA z gruczołu przysadkowego. Najsilniejsze sygnały otrzymano z materiałem ludzkim, lecz materiał świński także reagował krzyżowo.

Przykład 6. Rozkład AF w przekrojach gruczołu przysadkowego

Gatunki i tkanki - Ludzkie gruczoły przysadkowe otrzymano pośmiertnie ze szpitala Sahlgrenska (zezwolenie wydane przez Szwedzkie Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej; 2§ transplantationslagen, 1975:190). Gruczoły utrzymywano zamrożone w temperaturze -70°C z wyjątkiem tych użytych do badania histologicznego, które utrwalono przez 24 godziny w 4% p-formaldehydzie rozpuszczonym w roztworze soli buforowanej fosforanem (PBS=0,15 M NaCl, 0,05 M fosforanu sodu, pH 7,2) i potem przeniesiono do 7,5% sacharozy w PBS. Gruczoły przysadkowe świń w wieku 5-7 miesięcy, otrzymano z rzeźni, gdzie umieszczono je na suchym lodzie podczas transportu i utrzymywano zamrożone w temperaturze -70°C do chwili użycia. Szczury Sprague-Dawley w wieku 2-3 miesięcy, otrzymano do biotestu z B&K Universal AB, Sollentuna, Szwecja.

Immunohistochemia - Utrwalone gruczoły przysadkowe zamrożono w ciekłym azocie i sporządzono przekroje na zimno, grubości 7 pm. Z każdej próbki, 5-10 przekrojów, zawierających różne części gruczołu umocowano na szkiełkach mikroskopowych. Przekroje zablokowano w 5% odtłuszczonym wysuszonym mleku i inkubowano z pierwotnym antyserum królika (białko połączone anty-GST-AF-2) rozcieńczone 1:4000-1:8000, w wilgotnej komorze przez noc, w temperaturze 4°C. Po przepłukaniu w buforze, próbki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 23 °C z świńskimi immunoglobulinami antykróliczymi sprzężonymi z fosfatazą alkaliczną, rozcieńczonymi 1:50 (Dako A/S). Reakcję immunologiczną uwidoczniono za pomocą substratów fosfatazy jak opisano w innym miejscu (8). Przekroje kontrolne inkubowano z ciałami odpornościowymi absorbowanymi za pomocą nadmiaru białka GSTAF-2, lub wszystkich etapów inkubacji z wyjątkiem przeciwciała pierwotnego.

Rozmieszczenie AF w przekrojach gruczołu przysadkowego. Rozmieszczenie AF w przekrojach ludzkiego gruczołu przysadkowego badano technikami immunohistochemicznymi (fig. 5). We wszystkich badanych próbkach, barwiono niewielką liczbę komórek w części gruczołowej przysadki; immunologicznie barwiony materiał okazał się umiejscowiony w ziarnach w cytoplazmie; wstępna absorpcja ciała odpornościowego z nadmiarem białka GST-AF-2 zakłóciła sygnał. Nie obserwowano barwienia w części tylnej (przedni płat przysadki).

Rozmieszczenie materiału immunoreaktywnego w gruczole przysadkowym przedstawiło jedynie wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie AF w komórkach wydzielających przedniego płata (część gruczołowa przysadki). Białka, wydzielające się z tego płata obejmują hormon wzrostu, tyreotropinę, kortykotropinę, prolaktynę i hormon luteinizujący. Przejście tych hormonów z położenia wewnątrzkomórkowego do układu naczyniowego dokonuje się przez uwolnienie czynników wytwarzanych przez komórki neuroendokrynowe w podwzgórzu.

188 530

Przykład 7. Aktywność biologiczna rAF

Aktywność przeciwwydzielniczą - Aktywność przeciwwydzielniczą mierzono u szczurów na modelu pętli jelitowej opisanej poprzednio (9). Pętlę jelita czczego sprowokowano 3 pg toksyny cholery. Wstrzyknięto albo różne dawki oczyszczonych białek Af-1 albo PSS (kontrola), przed lub po prowokacji toksyną cholery. Ciężar zgromadzonego płynu w pętli jelitowej (mg/cm) zapisano po pięciu godzinach. Każdy preparat AF testowano u co najmniej sześciu szczurów.. Do analiza statystycznej danych użyto PLSD Fishera.

Aktywność biologiczna białka rAF - Aktywność biologiczną czystego białka rAF klonu 1 wytworzonego w E. coli testowano na modelu szczurzym. Zdolność rAF do hamowania wydzielania płynów po wstrzyknięciu dożylnym 20-30 sekund przed prowokacją jelita toksyną cholery, ukazano w fig. 6. U zwierząt kontrolnych, którym wstrzyknięto tylko bufor, toksyna cholery spowodowała wyraźną sekrecję, 412±9 mg płynu na cm jelita. Czysty rAF powodował zależną od dawki inhibicję cholerycznego wydzielania, które było istotnie różne od odpowiedzi na bufor (p<0,01, n=6). Dziewięć ng białka klonu 1 wystarcza do zmniejszenia odpowiedzi o 34%, podczas gdy 44 ng (10-² mola) i 220 ng zmniejszało ją o odpowiednio 46% i 78%. Aktywność biologiczna rekombinowanego AF jest większa od każdej znanej nam enterotoksyny i większa od każdego hormonu jelitowego lub neuropeptydu, modyfikującego transport wody i elektrolitu. Ponadto, poziom aktywności ludzkiego rAF u szczura jest zaskakująco wysoki, co prawdopodobnie odzwierciedla wszechobecną strukturę zachowaną w cząsteczkach rAF od różnych gatunków. Ta hipoteza opiera się na reaktywności krzyżowej między materiałem ludzkim i świńskim otrzymanym w analizach Western blot i Nothern blot.

Zdolność 0,5 pg rAF do inhibicji sekrecji jelitowej porównano po wstrzyknięciu dożylnym 20-30 sekund przed, i 90 minut po prowokacji toksyną cholery, (fig. 7). Oba przypadki podania dały istotną inhibicję w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi (p<0,01, n=6). W ten sposób, w przeciwieństwie do AF naturalnego, rekombinowane białko było także skuteczne przy podaniu po prowokacji toksyną, co czyni rAF użytecznym do traktowania terapeutycznego biegunki.

pg rAF wstrzyknięto do pętli o długości 8-10 cm umieszczonej tuż przed pętlą sprowokowaną toksyną cholery. rAF indukowano albo 20-30 sekund przed, albo 90 minut po prowokacji toksyną. W fig. 8 ukazano, że obie grupy testowe uzyskały istotne zmniejszenie wydzielania płynów w porównaniu z kontrolami (p<0,01, n=6); nie obserwowano różnic między dwiema grupami testowymi. To doświadczenie sugeruje, że rAF jest aktywne po podaniu doustnym i może być stosowane jako dodatek do paszy zwierzęcej, zapewniając, że nie spowoduje to żadnych poważnych skutków ubocznych.

W przykładach opisanych powyżej, rAF wytwarzano w komórkach Epicurian Coli XL-1. W tych komórkach duża ilość wytworzonego rAF była rozkładana na mniejsze peptydy. Przy wytwarzaniu rAF w komórkach BL21, tylko mała część rAF była rozkładana, podczas gdy w komórkach Top 1 nie obserwowano rozkładu. Niespodziewanie, aktywność biologiczna była proporcjonalna do stopnia rozkładu, to jest wyższa aktywność dawała w wyniku większy rozkład. Dlatego wytwarzano różne krótsze fragmenty, w celu testowania ich możliwej aktywności biologicznej.

Jak ukazano w tabeli 1, fragmenty te testowano dożylnie przed prowokacją toksyną cholery, w ten sam sposób jak opisany powyżej dla nienaruszonego rAF. Peptydy, które podlegały ekspresji dla klonu 2 i 3, testowanych w ilościach, wynoszących 0,1, 1 i 10 pg, nie miały wpływu na odpowiedź na toksynę. Przeciwnie, jeden mikrogram peptydu, którego ekspresja zachodziła we fragmencie RACE (klon 4) miał wpływ wyraźny. Wiele krótszych konstrukcji zrobiono z fragmentu RACE i spowodowano jego ekspresje w pGex-1-lambda. Jak ukazano w tabeli 1, okazało się, że miejsce aktywne jest położone między resztą ćaminokwasową 35 do 51. W celu określenia dokładniej miejsca aktywnego, sporządzono trzy rr.ałe peptydy, drogą syntezy w fazie stałej. Dwa z nich były aktywne, peptyd 35-46 (P3) i peptyd 35-42 (P1); ostatni oktapeptyd IVCHSKTR (P1) był aktywny w dawce mniejszej od 1 ng, będąc prawie tak aktywnym w oparciu o molarność jak nieuszkodzony rAF. Przeciwnie, krótszy heksapeptyd VCHSKT (P2) nie wywierał wpływu przy testowaniu w dawkach między 1 ng i 10 pg.

Peptyd Xi VCX2X3KX4.R, odpowiadający ludzkiemu fragmentowi P1 lecz z pewnymi zmianami i/lub delecjami, także został wytworzony przez miejscowo skierowaną mutagenezę

188 530 i testowany pod względem aktywności biologicznej. Porównano także sekwencje z cDNA bydlęcego i świńskiego. Badania te sugerowały następujące zmiany i/lub delecje:

X1 jest I lub go brak Χ2 jest H, R lub K

Χ3 jest S L lub innym obojętnym aminokwasem jest T lub A.

Tabela 1

Kod	Oligonukleotyd*	Peptyd**	Inhibicja sekrecji przy cholerze*** pmol ED50
N1	63-301	1-80	+ 4
N2	168-301	36-80	+ 6
N3	168-215	36-51	+ 3
N4	122-170	21-36	-
N5	186-269	42-69	-
P3	S.P.S. ****	35-46	+ 7
P1	S.P.S.	35-42	+ 5
P2	S.P.S.	36-41	-

* Pozycja pary zasad w SEQ ID nr 1 której ekspresja zachodziła w konstrukcji wytworzonej z cDNA AF i pGex-1-lamMa.

** Pozycje reszt aminokwasów (SEQ ID nr 1) w AF na początku i na końcu syntetyzowanego peptydu.

*** Inhibicja sekrecji płynu indukowana przez toksynę cholery w podwiązanej pętli jelita szczura; ilość (pmol), powodującą połowę maksymalnej inhibicji (ED50) notuje się dla peptydów aktywnych.

**** Te peptydy wytworzono przez syntezę w fazie stałej.

Wpływ rAF na zapalenie błony śluzowej jelita, testowano także na modelu pętli jelitowej u szczura. W ten sposób 20 szczurów sprowokowano 0,5 pg toksyny A z Clostridium difficile (10) i mierzono sekrecję zapalną i płynową odpowiednio po 2,5 i 5 godzinach (10 + 10 szczurów). Połowa szczurów w każdej grupie otrzymała 100 ng rAF dożylnie, 30 sekund przed prowokacją; druga połowa otrzymała bufor FBS jako kontrolę. Po zabiciu szczurów, pętle zamrożono na suchym lodzie. Zamrożone próbki pokrojono potem na przekroje o 8 pg grubości przy użycia kriostatu Leica. Przekroje zabarwiono, aby przedstawić fosfatazy alkaliczne za pomocą histochemii. Fosfatazy alkaliczne podlegają ekspresji w komórkach nabłonka jelita barwienie pozwala na ocenę całości nabłonka jelita.

Wyniki ujawniły (fig. 9), że u szczurów kontrolnych rozwinęło się rozległe zniszczenie błony śluzowej jelita: po 2,5 godziny obserwowano utratę komórek nabłonka z błony podstawowej, razem z tkanką nekrotyczną, podczas gdy rozległe krwawienie obserwowano po 5 godzinach. Przeciwnie, u zwierząt traktowanych rAF nie rozwinęła się utrata, nekroza ani krwawienie. Sekrecję płynu indukowaną toksyną A hamowano także od 199±4 do 137±5 mg/cm po 2,5 godziny (p<0,01) i od 421±3 do 203±6 mg/cm po 6 godzinach (5 szczurów/grupę, p<0,01).

Podobne doświadczenie przeprowadzono z 0,5 pg peptydu IVCHSKTR (=P1), zamieniając białka rAF. Oktapeptyd uzyskał ten sam wpływ na zapalenie jelita i sekrecję płynu wywołane przez toksynę A, jak ukazano w fig. 9.

Toksyczność - W celu przetestowania toksyczności rAF, wstrzyknięto go w wysokiej dawce, 50 g na szczura. Nie zanotowano wyraźnej reakcji toksycznej podczas okresu obserwacji, wynoszącego jeden tydzień.

Przykład 8. Aktywność biologiczna rAF na przenikalność jelita

W celu oszacowania wpływu rAF na przenikalność substancji organicznej rozpuszczonej we krwi, przeprowadzono test za pomocą barwnika błękitu Evansa zgodnie z metodą opisaną wcześniej (11). Doświadczenie początkowo przeprowadzono jak opisano powyżej w przykładzie 7 i fig. 5 z dożylną injekcją rAF przed prowokacją toksyną cholery. Jednak nie zmierzono żadnego wydzielania płynu lecz 90 minut po prowokacji toksyną, wstrzyknięto

188 530 dożylnie barwnik błękit Evansa, 1 ml 1,5% roztworu w PBS. Pozwolono na krążenie barwnika przez okres czasu długości 5 minut. Potem szczura poddano perfuzji przezsercowej przez lewą komorę - prawy przedsionek (przy użyciu pompy perystaltycznej [Cole Parmer Instruments, Chicago IH, USA]) za pomocą 200 ml roztworu PBS/Alserviera (stosunek 1/1) o temperaturze 4°C, przez okres około 150 sekund, przeprowadzonej w uśpieniu eterem. Procedurę tę podjęto w celu usunięcia całego EB obecnego w układzie krążenia, pozostawiając tylko EB w tkance śródmiąższowej, dającej się wykryć przez ekstrakcję barwnika formamidem.

Wyniki w tabeli 2 pokazują że prowokacja CT istotnie (p<0,001) zwiększa ilość EB, którą można ekstrahować z tkanki jelita o około 43%, podczas gdy injekcja dożylna 1 BrT przed prowokacją toksyną cholery zapobiega zwiększeniu, to jest ilość EB ekstrahowanego z tkanki w grupie 1 (kontrolnej) nie różniła się od tej z grupy 3 (1rAF + CT)

Tabela 2

Grupa	Prowokacja	ng	EB/g tkanki jelita x W”	% wzrostu EB-konc
1	PBS+PBS	6	29,3 ±31,0	-
2	PBS+CT	6	51,8 ± 1,3	43 (p<0,001)
3	IrAF+CT	6	29,6 ± 1,5	0NS

Wyniki ukazane w fig. 10 i 11 przedstawiają wynaczynienie barwnika azowego błękitu Evansa w jelicie cienkim i w odpowiadającym splocie naczyniówkowym bocznych komórek mózgu po prowokacji jelita toksyną cholery, z i bez poprzedzającego traktowania szczurów P1 (P/CHSKTR).

Doświadczenia przeprowadzono w następujący sposób: Samce szczura SpragueDawley, ważące 350 g, głodzono przez 18 godzin przed procedurą doświadczalną, lecz miały one wolny dostęp do wody. Szczurów użyto 20 następnie w grupach po sześć. Podano peptyd P1, toksynę cholery (CT) i PBS zgodnie z tabełą3

Tabela 3

Grupa	Injekcja dożylna 1*	Injekcja doustna*	Injekcja dożylna 2*
A	P1	CT	EB
B	PBS	CT	EB
C	PBS	PBS	EB

* P1 (iv.) iniekcję 1 podano w objętości 2 ml PBS, injekcję doustną (po.) podano w objętości 5 ml, injekcja dożylna 2 składała się z 1,5 ml 3% błękitu Evansa rozpuszczonego w PBS. Eteru użyto do uśpienia podczas wykonywania wszystkich injekcji.

Injekcję i.v. P1 (0,5 pg) lub PBS wykonano 10-15 sekund przed doustną prowokacją 100 pg CT lub PBS; 60 minut po doustnej prowokacji szczury uśpiono eterem i poddano injekcji iv. błękitem Evansa. Pozwolono barwnikowi na wyrównanie przez następne 30 minut, po czym szczury znów uśpiono eterem i poddano perfuzji przezsercowo poprzez lewą komorę 250 ml roztworu Alseversa/PBS = 50/50, w celu usunięcia całego barwnika obecnego w układzie naczyniowym. Po tej perfuzji, wykonanej w ciągu 2-3 minut, rejestrowana fluorescencja powiną przedstawić barwnik obecny tylko poza układem naczyniowym.

Mózg i część jelita cienkiego podzielono na próbki i zamrożono na suchym lodzie oraz sporządzono przekroje przy użyciu kriostatu, o grubości 8 pm. Przekroje wysuszono powietrzem i osadzono w środowiskach do osadzania, zawierających ksylen. Przekroje przeglądano w mikroskopie fluorescencyjnym Zeiss, przy użyciu kombinacji filtrów identycznej z używaną dla fluorescencji emitowanej przez rodaminę.

Wyniki w fig. 10 i 11 pokazują, że intensywność fluorescencji (kolor biały) jest podobnej wielkości zarówno w jelicie cienkim (fig. 10) jak i w splocie naczyniówkowym (fig. 11) w grupie A (P1 iv +CT po) i C (PBS iv + PBS po). W porównaniu z wysoką intensywnością

188 530 fluorescencji w jelicie cienkim jak również w splocie naczyniówkowym w grupie B (PBS iv + CT po), wyniki jasno pokazują, że injekcja oktapeptydu przed prowokacją toksyną hamuje penetrację naczyń przez błękit Evansa indukowaną przez Ct. Wyniki sugerują, że prawdziwe jest to nie tylko w układzie naczyń jelita cienkiego, lecz także w splocie naczyniówkowym bocznych komór mózgu.

Wniosek: Wpływ dożylnego podania oktapeptydu IVCHSKTR hamuje penetrację przez błękit Evansa indukowaną przez prowokację toksyną cholery w jelicie cienkim jak również w splocie naczyniówkowym w centralnym układzie nerwowym. W ten sposób działanie rAF i jego pochodnych peptydowych nie ogranicza się tylko do jelita cienkiego lecz wpływa także na przenikalność naczyń krwionośnych w centralnym układzie nerwowym. Odkrycia te wskazują, że rAF i jego pochodne peptydowe można stosować do odwracania patologicznego ciśnienia wewnątrzczaszkowego, zmiany ciśnienia w uchu środkowym i różnych postaci zmian przenikalności naczyń krwionośnych.

Odnośniki [1] R.A.Young i R.W. Davis (1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 80, 1194-1198 [2] J.Sambrook, E.F.Fritsch, TManiatis (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, strony 1.74-1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring- Harbor, N. Y.

[3] M.A.Frohman, M.K.Dush i GR.Martin (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 8998-9002.

[4] U.K.Laemmli (1970) Nature 227, 680-685.

[5] GZachrisson, T.Lagergard i I.Lonnroth (1986) Acta path.microbiol immunol.scand.C, 94 227-231.

[6] P.Chomczynski, N.Sacchi (1987) Analyt.Biochem. 162,156-159.

[7] J.Sambrook. E. F.Fritsch, T.Maniatis (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, strony 7.40-7.42, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

[8] E.Jennische, GL.Matejka (1992) Acta Physiol.Scand. 146 79-86.

[9] S.Lange (1982) FEMS Microbiol.Lett.15, 239-242.

[10] J.F.Torres, E.Jennische, S.Lange i I.Lonnroth, (1990) Gut 781-785.

[11] S.Lange, DS.Delbro, E.Jennische, Evans blue permeation of intestinal mucosa in the rat. Scand J.Gastroenterol 1994, 29:38-46.

Opis rysunków

Fig. la i ciąg dalszy w fig. 1b. Sekwencja kwasu jądrowego i wnioskowana sekwencja aminokwasowa nowego białka ludzkiego. Potwierdzoną sekwencję aminokwasową podkreślono.

Fig. 1c. Pozioma mapa, ukazująca klonowany cDNA i primery Ollgonukleotydowe.

Fig. 2. Miniżel poliakryloamidowy SDS (A) barwiony czystym błękitem Coomassie oraz odcisk immunologiczny sondowany antyserami przeciw AF świni (B). Przebiegi z cyframi bez primów zawierają białka połączone GST-AF AF-1, AF-2 i AF-3 oczyszczone na agarozie z glutationem, podczas gdy przebiegi z cyframi z primami zawierają białka połączone rozszczepione trombiną. Odniesienia ciężaru cząsteczkowego (R), (BDH), wskazano po lewej. Białko połączone gST-AF jest rozłożone w wysokim stopniu, lecz analiza immunoblot pokazuje tylko wykrycie białka o pełnej długości i produkt spontanicznego rozszczepienia trombiną. W białku GST-AF-3 jest produkt o 26 kDa, prawdopodobnie ogonek glutationo-Stransferazy, który niezależnie podlegał ekspresji.

Fig. 3a. Western blot przy użyciu antyserum przeciw rekombinowanemu białku AF-2. Nałożono po lewej, świński (P) i trzy ludzkie (H1, H2, H3) gruczoły przysadkowe; i po prawej trzy rekombinowane białka AF-1, AF-2 i AF-3 (patrz fig. 2); pośrodku standard ciężaru cząsteczkowego (R).

Fig. 3b. Test immunologiczny wiązania enzymu (ELISA) rAF, przy użyciu surowego antyserum i przeciwciała oczyszczone przez powinowactwo, uaktywnione u królika. ...

Fig. 4. Autoradiogram Nothem blot RNA z gruczołu przysadkowego człowieka i świni (p = z puli oraz i = materiał indywidualny). Pięć ug mRNA nałożono do każdego zagłębienia; użyto sond oligonukleotydowych znakow<anych 3 ²P na końcu 3' i autoradiogram wywołano po 7 dniach.

188 530

Fig. 5. Krioprzekroje gruczołowej części przysadki barwione antyserum przeciw rekombinowanemu białku GST-AF-2. A. Przekroje inkubowano z ciałem odpornościowym, ukazując rozproszone komórki ze zmieniającym się stopniem pozytywnej immunoreaktywnosci (strzałki wypełnione). W wielu komórkach całkowicie brak zabarwienia (puste strzałki). B. Szeregowe przekroje do A inkubowano z ciałem odpornościowym wstępnie absorbowanym za pomocą nadmiaru rekombinowanego białka GST-AF-2. Brak specyficznego barwienia komórek. C i D. Większe powiększenie komórek immunopozytywnych pokazuje barwienie cytoplazmatyczne w komórkach endokrynowych, n = jądro, c - cytoplazma.

Fig.6. Biologiczna aktywność rekombinowanego białka AF-1, testująca inhibicja wydzielania płynu indukowanego przez toksynę cholery. Stopniowane dawki białka wstrzykiwano dożylnie szczurom; trzy pg toksyny cholery wstrzyknięto do pętli jelitowej; po pięciu godzinach mierzono płyn zgromadzony w jelicie (mg/cm jelita). Każda wartość przedstawia średnią ± S.A.E. grupy sześciu zwierząt.

Fig. 7. Biologiczna aktywność dożylnie wstrzykniętego rAF-1; 0,5 pg rAF podano 20-30 sekund przed lub 90 minut po prowokacji 3 pg toksyny cholery w pętli jelitowej szczura.

Fig. 8. Biologiczna aktywność wstrzykniętego do światła rAF-1; 0,5 pg podano 20-30 sekund przed lub 90 minut po prowokacji 3 pg toksyny cholery w pętli jelita szczura; rAF wstrzyknięto około 5 cm proksymalnie do pętli, w której wstrzyknięto toksynę.

Fig. 9. A (x 2,5) są pętlami kontrolnymi (PBS), ukazującymi resztki komórek w świetle jelita (L), lecz brak zabarwienia pozostałej śluzówki, co sugeruje całkowite zniszczenie powłoki nabłonkowej. B. (0,5 pl P1 przed prowokacją toksyną) pokazuje wyraźnie zarysowaną powłokę nabłonkową, tworzącą kosmki, sugerując zachowaną i normalną śluzówkę jelita. L = światło jelita. Słupki = 500 pm. C (xl0) ukazują zniszczoną śluzówkę w grupie kontrolnej traktowanej PBS, oraz D ukazuje odpowiadającą śluzówkę w grupie doświadczalnej (traktowanej P1). Czarna strzałka wskazuje powłokę nabłonkową, LP = blaszka właściwa, mm = śluzówka mięśniowa, otwarta strzałka wskazuje komórki kryptowe. Słupki =100 pm. E (x 25) ukazują zniszczoną śluzówkę w grupie kontrolnej (traktowanej PBS), i F ukazuje odpowiadające powiększenie od szczura poddanego traktowaniu P1 przed prowokacją toksyną. Słupki = 50 pm.

Fig. 10. Fluorescencja błękitu Evansa w próbkach jelita czczego od trzech grup szczurów traktowanych toksyną cholery (CT) lub buforem kontrolnym (PBS); wstępne traktowanie peptydem przeciwwydzielniczym P1 lub buforem kontrolnym (PBS). LP = blaszką właściwa. Czarna strzałka wskazująca powłokę z komórek nabłonkowych; pusta strzałka wskazująca komórki kryptowe. Słupki =100 pm.

Fig. 11. Fluorescencja błękitu Evansa w próbkach splotu naczyniówkowego od szczurów pokazanych w fig. 10. Słupki = 50 pm.

188 530

Wykaz sekwencji

SEQ ID nr 1

TYP SEKWENCJI: Nukleotydowa z odpowiadającym białkiem DŁUGOŚĆ _r SEKWENCJI: 1309 par zasad plus ogonek poli(A)

ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

TOPOLOGIA: liniowa TYP CZĄSTECZKI: cDNA ORGANIZM POCHODZENIA: człowiek

BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO DOŚWIADCZALNE: gruczoł przysadkowy CECHY; dojrzałe białko od 63 do 1208 bp sekwencja sygnałowa poli(A) od 1289-1295 bp

MnCCACCACTTCTTCTTACCCCCTCCCCCACACCCCCTCCCCACCCAC

CMMTCCCMC ATC CTC TTC CM ACC ACT ATC CTC TCT CTC CAC MC ACT 181 Kot Yel leu Clu Ser Thr Kot Yel Cy* Yel Mp A*n Ser»

s

18

CAC

TAT

ATC

CCC

MT

CCA

GAC

TTC

ΠΑ

CCC

ACC

ACC

CTC

CAC

CCC

OC

149

Clu

Tyr

Hit

Arę

A»n

Cly

A»p

Phe

LeU

Pre

Thr

Arg

Leu

Cln

Ale

Cln»

15

28

25

CAS

CAT

cct

CTC

MC

ATA

CTT

TCT

OT

TO

MC

ACC

CCC

Ace

AAC

CCT

197

Cln

Asp

Ale

Yel

Am

Ile

Yel

Cyi

Hi»

Ser

Lył

Thr

Arg

Ser

A»n

Pro»

1»

35

48

45

CAC

MC

MC

CTC

CCC

CTT

ATC

ACA

CTC

CCT

MT

oe

TCT

CM

CTC

CTC

245

Clu

ton

Am

Yel·

Cly

Leu

Tle

Thr

Leu

Ale

Am

Asp

cy»

Clu

Yel

Leu>

55 69

ACC AO CTC ACC CCA CAC ACT CCC CCT ATC CTC ICC MC CTA OT ACT 293

Thr Thr Leu Thr Pro A»p Thr CTjr Arg Jle Leu Ser ly» Leu Ki» Thr» « 75 75

CTC CM CCC MC CCC AAC ATC ACC TTC TCC A<C CCC ATC CCC CTC CCC 341

Ysl Cła Prc Lys Cly lys Σΰ Thr Rw Cy» Thr Sly :’t Arg Ysl Al«

85 98

CAT CT5 CCT CTC MC CAC CCA CM CCC MC AAT CAC MC ATC CCC ATC 389

Hlł Leu Ale Leu Ly» Hi» Aro Cln Cly Ly» ·Α»η Ili» Lyi Mat Arj Ile»

183 195

ATT CCC TTT SSA ACC CC* 5TS CAC CAC M7 CAC AAC CAT CTC CTC «3?

Ile Ale Phe Yal Cly Ser Pro Yel Clu Aap A»n Clu Lył Aip Leu Vel>

na uj iz· 125

AAA CTC CCT AAA CCC CTC MJ ΑΛ CAC AM CTA MT CTT CAC ATT ATC 483 tył Leu Ale Lys Arj Leu '.y» ly» Clu ty* 9·! Ma Yel A»g 21e ller·

133 135 148

AAT TTT CCC CM CAC CAC ς.ύ MC ACA CM MC CTC aCA CCC ΤΓΓ CTA 533 *»n Ph< Cly Clu Clu Clu Vel Ααλ Tnr Clu Ly» Leu Thr Ais Phe Vel>

145 15« 1SS

MC ACC TTC MT CCC aaa CAT CCA ACC ξ{Τ ΤζΤ CAT CTC CTC ACA CTC 531

A».n Thr Leu A»n Cly ly» A»p Cly Thr Cly Ser KU Leu Yel Thr Yel»

188 185 17»

188 530

CCT	CCT	CCC	CCC	ACT	TTC	CCT	CAT	CCT CTC ATC ACT TCT CCC ATT	TTC	629
Pro	Pro	Cly	Pro	Ser	Leu	Ala	Alp	Ala Leu Ile Ser Ser Pro He	Leu»
	175					189		185
CCT	CCT	CAA	CCT	CCT	CCC	ATC	CTC	CCT CTT CCT KC ACT CAC ΤΠ	UA	877
Ala	ety	Clu	Cly	Cly	Ala	Het	leu	Cly Leu Cly Alo Ser Aap Phe	Clu»
199					195			299	285
πτ	CCA	CTA	CAT	CCC	ACT	CCT	CAT	CCT CAC CTC CCC TTC CCC CTT	CCT	723
Phe	Cly	Yal	A»p	Pro	Ser	Ala	A»P	Pro Clu Leu Ala Lei/ Ala Lau	Arg»
				219				215 229
CTa	TCT	ATC	CAA	CAC	CAC	CCC	CAC	CCA CCA CCA CCA KC ccc ccc	CCA	773
Val	Ser	Met	Clu	Clu	Cln	Arg	HU	Ale Cly Cly Cly Ala Arg Arg	Ala»
			225					238 235
CCT	CCA	CCT	TCT	CCT	CCT	CAC	ccc	CCC ATT CCT ACC ACT CCC ACT	CAA	821
Ala	Arfl	Ala	Ser	Ala	Alo	Clu	Ala	Cly Ile Ala Thr Thr Cly Thr	Glu>
		249					245	238
GAC	TCA	CAC	CAT	CCC	CTC	CTC	AAC	ATC ACC ATC ACC CAC CAA CAC	TTT	869
Alp	Ser	Asp	Alp	Ala	Leu	Leu	Ly«	Met Thr Ile Ser Gin Cln Clu	Phe»
	253					268		265
CCC	CCC	ACT	CCC	CTT	CCT	CAC	CTA	ACC ACT ATC ACT CAC CAA GAC	ac	917
ciy	Arg	Thr	Cly	Leu	Pro	Aip	Leu	Ser Ser Ket Thr Clu Clu Clu	Cln>
2?«					27S			288	285
ATT	CCT	TAT	CCC	ATC	CAC	ATC	TCC	CTC CAC CCA CCA CAG TTT CCC	ac	995
n*	Ais	Tyr	Ala	Het	Cln	Met	$er	Leu Cln Cly Ale Clu Phe Cly	Gin»
			299				295 398
CCC	CAA	TCA	CCA	CAC	ATT	CAT	CCC	agc τα cct atc ας Aa tct	ac	1813
Alo	Clu	Ser	Ala	Asp	Ile	Alp	Ala	Ser Sar Ale Met Ajp Thr Ser	Clu»
		385					328 3lS
CCA	CCC	AAC	CAC	CAC	CAT	GAT	TAC	CAC CTC ATG CAG CAC CCC CAC	TTC	1061
Pro	Alo	lyj	Clu	Clu	Aep	Alp	Tyr	Alp Vol Het Cln Ajp Pro Clu	Phe»
		328					325	339
CTT	CAC	ACT	CTC	CTA	CAC	AAC	CTC	ca CCT CTG CAT CCC AAC AAT	CAA	1199
Lcu	Cln	Ser	Vol	Leu	Clu	Ain	Leu	Pro Cly Yel Aip Pro A»n A*n	Clu»
335				3*9		34$
ccc	ΑΠ	CCA	AAT	CCT	ATC	CCC	TCC	ctc cct ccc acc ca ca agc	ACC	1157
Ala	He	Arg	Ain	Ala	Het	Cly	Ser	Leu Pro Pro Arg Pro Pra Arg '	Thr»
358			335			369	363
CCA	ACA	ACC	ACA	ACA	ACC	ACC	AAC	*a *a act ac act ca ccc	AAA	1295
Ala	Arg	Arg	Thr	Arp	Arg	Arg	Lya	Thr Arg Ser Clu Thr Cly Cly	Ly»
			379			375 388

CSC TACCTaCTCTCCTTAiCGCACTGCATCiCAACaCCCW.TATACCCTTACATCTCTCT Cly>

TATCTCTAACaTTACACCCTAAATAAACCTTCCCAACTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

188 530

FIG.ia

AATTCGACaGTTGTTGTTAGGCCGTCCCGGACACCCGGTCCGCAGGGAG

CAACCTCGCAAC ATC CTG KG CAA AGC ACT ATG CTG TCT GTC GAC AAC ACT 101 Met Yol Leu Glu Ser Thr Het Yol Cys Yal Asp Asn Ser>

5

10

GAG

TAT ATG

CCC

AAT CCA

CAC

TTC TTA

CCC ACC AGG

ac

CAG

ccc

CAG

14S

Clu

Tyr

Met

Arg

Asn

Gly

Asp

Phe

Leu

Pro Thr

Arg

Leu

Gin

Ala

Cln»

15

20

2S

CAG

CAT

CCT

CTC

AAC

ATA

CTT

TGT

CAT

TCA AAC

ACC

CGC

ACC

AAC

CCT

197

Cln

Asp

Ala

Yol

Asn

Ile

Yol

Cys

His

Ser Lys

Thr

Arg

Ser

Asn

Pro

30

35

40

45

GAC

AAC

AAC

CTC

ccc

err ATC

Aa

CTC

CCT AAT

CAC

TGT

GAA

CTG

CTG

245

Clu

Asn

Asn

Yal

Cly

Leu

Ile

Thr

Lev

Ala Asn

Asp

Cys

Glu

Yol

Lcu>

50

55

60

ACC

ACA

crc

ACC

CCA

GAC

ACT

GGC

CGT

ATC CTG

TCC

AAG

CTA

CAT

ACT

293

Thr

Thr

Ltu

Thr

Pro

Asp

Thr

Gly Arg

Ile Leu

Ser

Lys

Leu

His

Thr»

65

70

75

CTC

CAA

CCC

AAC

CCC

AAG

ATC

ACC

TTC

TGC ACC

CGC

ATC

CGC

GTC

CCC

341

Yal

Cln

Pro

lyj

Gly lys

le

Thr

Phe

Cys Thr

Gly

Ile

Arg

Yal

Alo

80

85

S0

CAT

CTG

CCT

CTC

AAC

CAC

CCA

CAA

CGC

AAC AAT

CAC

AAG

ATC

CGC

ATC

389

His

Leu

Ala

Leu

Lys

HIS

Arg

Gin

Gly Lys -Asn

His

Lys

Het

Arg

Ho

95

100

105

ATT

CCC

TTT

GTC

GCA

ACC

CCA

CTG

Gag

GAC ΑΛΤ

CAC

AAG

CAT

nc

CTG

437

Ile

Ala

Phe

Yel

Cly

Ser

Pro

Yol

Clu

Asp Asn

Clu

Lys As?

Leu

Yol»

110

115

120

125

AAA

CTC

CCT

AAA

CCC CTC

AAG ΑΛ

GAC AAA CTA

AAT

CTT CAC ATT ATC

485

Lyi

Leu

Ala

lys

Arj

Leu

Lys Lys

G|u

Lys Yal

Asn

Yel

Asp He

Ile»

130

135

140

AAT

ΤΓΓ

CCC

GAA

CAG

CAG

CTC ,

AAC ACA

GAA AAG

CTC ACA

CCC 77T

CTA

533

Asn

Phe

Cly

Clu

Clu

Clu

Yol ,

Asn

Thr

Clu Lys

Leu '

Thr .

Ale !

Phe Vo!>

145

4

15«

155

AAC

ACC

TG

AAT

CGC

AAA

CAT CCA

ACC

CCT 7CT

CAT

CTC

CTC

ACA

M 4 u

F 4 · ;o-

Ałn

Thr

Leu

Asn

Gly Lys Asp Cly

Thr Cly Ser

His

leu Yal

Thr

Ya i >

160

165

170

188 530

FIG.Ib

CCT

CCT

CCC

CCC

ACT

TTC

CCT

CAT

CCT

CTC

ATC

ACT

TCT

CCC

ATT

TTC

629

Pro

Pro

Cly

Pro

Ser

Leu

Ala

Asp

Ma

Leu

Ile

Ser

Ser

Pro

Ile

Leu»·

175

188

185

CCT

CCT

CAA

CCT

CCT

CCC

ATC

CTC

CCT

CTT

CCT

CCC

ACT

CAC

TTT

CAA

G77

Ala

Cly

Clu

Cly

Cly

Ala

Met

leu

«1/

leu

Cly

Ala

Ser

AS?

Phe

Clu>

198

195

288

285

TTT

CCA

CTA

CAT

CCC

ACT

CCT

CAT

cer

CAC

CTC

CCC

TTC

CCC

CTT

CCT

725

Phc

Gly

Yol

As?

Pro

Ser

Ala

Asp

Pro

Clu

leu

Alo

LeJ

Ala

Leu

Arg»

218

215

228

CTA

TCT

ATC

CAA

'CAC

CAC

CCC

CAC

CCA

CCA

CCA

CCA

CCC

CCC

CCC

CCA

773

Yal

Ser

Met

Clu

Clu

Cln

Arg

His

Ala

Cly

Cly

Cly

Alo

Arg

Arg

Alo>

225

238

235

CCT CCA CCT TCT CCT CCT CAC CCC CCC ATT CCT ACG ACT CCC ACT CAA 821

Alo Arg Ale Sc.* Ala Ala Clu Ala Cly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Clu>

248 245 258

GAC CA	CAC	CAT	CCC CTC	CTC	AAC ATC ACC ATC ACC	CAC CAA CAC	TTT	069
Alp Ser	Asp	Asp	Alo Leu	Leu	Lys Ket Thr Ile Ser	Cln Cln Clu	Phe>
255				268	265
CCC ccc	ACT	GCG	CTT CCT	CAC	CTA ACC ACT ATC ACT	CAC CAA CAC	CAC	917
Cly Arg	Thr	Cly	Leu Pro	Aip	Leu Ser Ser Met Thr	Clu Clu Clu	Cln»
273			275		280		28S
ATT CCT	TAT	CCC	ATC CAC	ATC	TCC CTC CAC CCA CCA	CAC TTT CCC	CAC	965
Ile Ale	T/r	Ale	Met Cln	M»C	Ser Leu Cln Cly Alo	Clu Phe Cly	1 Cln>
		298		295	300
GCC CAA	TCA	CCA	CAC ATT	CAT	CCC ACC TCA CCT ATC.	CAC ACA TCT	CAC	1013
Ala Clu	Ser	Alo	Alp Ile	As?	Alo Ser Ser Alo Met	Asp Thr Ser	Clu»
	385			310	315
CCA CCC	AAC	GAC	CAC CAT	CAT	TAC CAC CTC ATC CAC	CAC CCC CAC	TTC	1061
Pro Ale	Lys	Clu	Clu Asp	As?	Tyr Asp Yot Met Cln	Asp Pro Clu	Phe»
	320				32S	338
;π cac	ACT	CTC	CTA CAC	AAC	ctc ca cer ctc cat	CCC AAC AAT	CAA	1199
Leu Cln	5er	Yel	Leu Clu	Asn	Leu Pro Cly Yol Asp	Pro Asn Asn	Clu»
335			340	345
CCC ATT	CCA	AAT	CCT ATC	CCC	TCC CTC CCT CCC ACC	ca CCA ACC	ACC	1157
Ale Cle	Arg	Asn	Ale Met	C-7	Jer Leu Pro Pro Arg ,	Pre Pro Arg	Thr,
358		3S5		360		365
CCA ACA	ACC	ACA	ACA ACC	ACC	AAC ACA ACA ACT CAC	ACT CCA CCC	AAA	1205
Ais Arg	Arg	Thr	Arg Arg	Arg	Lys Thr Arg Ser Clu	Thr Cly Cly	lys>
		378		375	380

CCC TAiCTCACTCTCCTTACCCCACTCCATCCCAACCACCCAATATACCCTTACATGTCTCT Cly»

TATCTCTAACCATTACACCCTAAATAAACCTTCCCAACnTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

188 530

ixoiaiQ<mu

CM CO

188 530

FIG.2

Β.

R 1 1' 2 2' 3 3'

FIG.4

Człowiek Człowiek Świnia (pula) (pula) bp

-9490

-7450

188 530

FIG.3a
kD p 105 s	HI H2 H3	R 1 2 3
98 -		. fśK*.· W IW · .
53- 7^- 33- 25-	-2’ **

abs,405nm

FIG.3b

Logarytmiczny nanogram białka (przeciwciało)

188 530

FIG.5

188 530

FIG.6 * * *

220

188 530

Ε

JS .aj

Ν •σ £

FIG.7

FIG.8

500'

Kontrola

Przed

Pć

188 530

FIG.9

188 530

FIG.IO

PBS+CT

P1+CT

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Rekombinowane białko posiadające sekwencję aminokwasową pokazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty, posiadające aktywność przeciwwydzielniczą.
2. 2. Rekombinowane białko, według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi go fragment rekombinowanego białka pokazanego w SEQ ID nr 1, wybrany z grupy obejmującej:

   a) aminokwasy nr 35-42

   b) aminokwasy nr 35-46

   c) aminokwasy nr 36-51

   d) aminokwasy nr 36-80

   e) aminokwasy nr 1-80 sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEQ ID nr 1.
3. 3. Peptyd XfVCX2X3KX4R odpowiadający fragmentowi, zawierającemu aminokwasy nr 35-42 rekombinowanego białka ukazanego w SEq ID nr 1, znamienny tym, że Xj oznacza I lub go brak, X2 jest H, R lub K, X3 jest S, L lub innym aminokwasem obojętnym i X4 jest T lub A.
4. 4. Przeciwciała specyficzne wobec białka posiadającego sekwencję aminokwasową ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmentów posiadających aktywność przeciwwydzielniczą.
5. 5. Kompozycja farmaceutyczna do normalizacji patologicznego transportu płynów i/lub reakcji zapalnych u zwierząt, włączając ludzi, zawierająca czynnik aktywny i akceptowalne w farmacji i/lub weterynarii nośniki oraz substancje dodatkowe, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera skuteczną ilość rekombinowanego białka ukazanego w SEQ ID nr 1 lub jego fragmentów posiadających aktywność przeciwwydzielniczą.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że fragment rekombinowanego białka wybiera się z grupy, obejmującej:

   a) aminokwasy nr 35-42

   b) aminokwasy nr 35-46

   c) aminokwasy nr 36-51

   d) aminokwasy nr 36-80

   e) aminokwasy nr 1 -80 sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEQ ID nr 1.
7. 7. Zastosowanie rekombinowanego białka, posiadającego sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmentów posiadających aktywność przeciwwydzielniczą, do produkcji kompozycji do normalizacji patologicznego transportu płynów i/lub reakcji zapalnych u zwierząt, włączając człowieka.
8. 8. Zastosowanie zastrz. 7, znamienne tym, że fragment reekombinowanego białka wybiera się z grupy, obejmującej:

   a) aminokwasy nr 35-42

   b) aminokwasy nr 35-46

   c) aminokwasy nr 36-51

   d) aminokwasy nr 36-80

   e) aminokwasy nr 1-80 sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEQ ID nr 1.
9. 9. Preparat paszowo-weterynaryjny dla zwierząt do normalizacji patologicznego transportu płynów i/lub reakcji zapalnych u kręgowców, zawierający znane substancje odżywcze oraz czynnik aktywny, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera rekombinowane białko, posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1, lub jego fragmenty, posiadające ak188 530 tywność przeciwwydzielniczą, albo organizm zdolny do wytwarzania wymienionego rekombinowanego białka lub jego fragmentów.
10. 10. Zastosowanie specyficznych przeciwciał przeciw rekombinowanemu białku posiadającemu sekwencję aminokwasową ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmentom posiadającym aktywność przeciwwydzielniczą, do wykrywania in vitro wymienionego białka lub jego fragmentów w organizmach.
11. 11. Kwasy nukleinowe, kodujące rekombinowane białko posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadające aktywność przeciwwydzielniczą
12. 12. Kwasy nukleinowe według zastrz. 11, znamienne tym, że kodowane fragmenty rekombinowanego białka wybiera się z grupy obejmującej:

    a) aminokwasy nr 35-42

    b) aminokwasy nr 35-46

    c) aminokwasy nr 36-51

    d) aminokwasy nr 36-80

    e) aminokwasy nr 1-80 sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEQ ID nr 1.
13. 13. Zastosowanie sond lub primerów pochodzących z kwasów nukleinowych kodujących rekombinowane białko posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadające aktywność przeciwwydzielniczą, do wykrywania in vitro obecności kwasów nukleinowych w organizmach.
14. 14. Wektor zawierający kwasy nukleinowe kodujące białko posiadające sekwencję ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadające aktywność przeciwwydzielniczą.
15. 15. Komórka gospodarza z wyjątkiem człowieka obejmująca wektor zawierający kwasy nukleinowe kodujące rekombinowane białko posiadające sekwencję aminokwasową ukazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty posiadające aktywność przeciwwydzielniccą .

    Niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanego białka, peptydu, przeciwciała specyficznego wobec białka, kompozycji farmaceutycznej, zastosowania rekombinowanego białka, preparatu paszowo-weterynaryjnego, zastosowania specyficznych przciwciał, kwasów nukleinowych, zastosowania sond lub primerów, wektora i komórki gospodarza. Rekombinowane białko według wynalazku lub jego fragmenty stanowią nowy czynnik przeciwwydzielniczy, który posiada właściwości regulujące transport płynów i/lub reakcje zapalne.

    Wszystkie komórki i tkanki organizmu zależą od stałego i normalnego środowiska płynów w połączeniu z odpowiednim dostarczaniem krwi. Rozstrojenie jednego lub obu tych układów podtrzymujących może szybko doprowadzić do śmierci. Jeśli chodzi o zaburzenie równowagi, istnieją dwa zasadniczo różne układy:

    A. obrzęk, który charakteryzuje się nieprawidłowym gromadzeniem się płynu w przestrzeniach międzykomórkowych tkanki lub jamach ciała, albo

    B. odwodnienie, które w sensie bezpośrednim, oznacza tylko utratę wody, lecz w rzeczywistości zwykle używa się tego określenia do opisania utraty wody łącznie z jonami.

    Najpowszechniejszymi postaciami obrzęku albo odwodnienia są:

    biegunki, choroby zapalne jelita, obrzęk mózgu, astma, nieżyt nosa, zapalenie spojówek, zapalenie stawów, jaskra, różne postacie patologicznego ciśnienia wewnątrzczaszkowego (zwiększenia lub zmniejszenia), zmiana ciśnienia w uchu środkowym, tak jak w chorobie Meniera, zapalenie skóry, chemiczne lub fizyczne zaburzenie równowagi skóry i przyległych gruczołów dokrewnych, tak jak zapalenia gruczołu sutkowego, różne postacie schorzeń endokrynologicznych, takie jak moczówka prosta, zespół Conna, zespół Cushinga, choroba Addisona, choroby nerek, takie jak odmiedniczkowe zapalenie nerek, zapalenie kłębuszkowe nerek, choroby metaboliczne, takie jak obrzęk śluzowaty i ostra przerywana porfiria, skutki uboczne podczas leczenia różnymi lekami, takimi jak przeciwcukrzycowe, trój cykliczne antydepresyjne, cytostatyki, barbiturany, narkotyki i analogi narkotyków.

    188 530

    Biegunkę powoduje zmiana przenikalności jelita dla elektrolitów i wody. To zakłócenie często powodują enterotoksyny bakteryjne, takie jak wytwarzane przez Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Vbrio cholerae, Shigella dysenteriae i Clostridium difficile. Zakłócenie może być także spowodowane przez zapalenie jelit. Ponieważ pobieranie wody związane jest z pobieraniem elektrolitów i składników odżywczych, zwierzęta z biegunką cierpią na niedożywienie, dające w efekcie zwolnienie przyrostów dziennych u hodowanych zwierząt. Organizm przeciwdziała tym reakcjom dzięki mechanizmom neurohormonalnym, takim jak uwalnianie somatostatyny i peptydów opiatowych z neuronów wstawkowych błony śluzowej jelita. Te polipeptydy umożliwiają odwrócenie wydzielania płynów i biegunki.

    Niedawno opisany czynnik przeciwwydzielniczy (AF) został częściowo oczyszczony z gruczołu przysadkowego świni i ukazany jako odwracający patologiczne wydzielanie indukowane przez różne enterotoksyny. Wysoki poziom AF w mleku maciory zabezpiecza ssące prosięta przed biegunką noworodkową.

    Leki przeciwbakteryjne są szeroko stosowane w leczeniu biegunki zarówno w medycynie ludzkiej jak i weterynaryjnej. Stosuje się je także jako dodatki paszowe dla świń, cieląt i kurcząt. Jednakże z powodu szybkiego rozwoju odpornych bakterii w jelicie, w medycynie ludzkiej generalnie nie dopuszcza się użycia antybiotyków przeciw zapaleniu jelita, a także zmniejsza się ich użycie w medycynie weterynaryjnej.

    Inne leki przeciwbiegunkowe przeciwdziałają wydzielaniu w śluzówce jelita. Ponieważ leki te są kierowane przeciw gospodarzowi, jest mało prawdopodobne, że będzie się rozwijała odporność na leki. Te typy leków obejmują leki aktywne wobec nerwów, jak fenotiazyny i tioksanteny. Z powodu niektórych poważnych skutków ubocznych, tych rodzajów leków nie dopuszcza się do leczenia biegunki w większości krajów. Innymi lekami są pochodne opiatów, jak kodeina i loperamid. Ponieważ leki te działają głównie przez hamowanie ruchów jelit, hamują one także klirens bakterii patogennych z jelita i stanowczo nie powinny być polecane przeciw bakteriom dezynterycznym i pasożytom. Pochodne somatostatyny wprowadzono ostatnio, lecz mają one jak dotąd ograniczone zastosowanie spowodowane trudnościami w podawaniu leków i ewentualnymi interakcjami z regulacją dokrewną wzrostu.

    Czynnika przeciwwydzielniczego (AF) nie użyto jak dotąd bezpośrednio do leczenia biegunki lub niedożywienia, z powodu trudności związanych z uzyskaniem czystego preparatu tego białka. Jednakże możliwe było indukowanie podobnych białek u zwierząt domowych, którym podawano konkretną paszę (patrz zgłoszenie patentowe SE nr 9000028-2). Świnie, którym podawano tę paszę otrzymywały wysoki poziom białek podobnych do AF i wykazaływały znaczny wzrost tempa przyrostu dziennego w porównaniu z próbami kontrolnymi. Af u szczurów sprowokowany toksyną A z C. difficile zabezpiecza nie tylko przed wydzielaniem jelitowym lecz także przed zapaleniem i krwawieniem w jelicie.

    Głównym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowego rekombinowanego białka i jego homologów oraz fragmentów (peptydów) do użytku w normalizacji patologicznego transportu płynów. Białka te i peptydy są zbiorowo nazywane czynnikami przeciwwydzielnicznymi (AF). Stosowanie AF także hamuje częściowo lub eliminuje całkowicie rozwój reakcji zapalnych o różnych etiologiach. Powrót do stanu normalnego (transport płynów lub zapalenie) uzyskuje się przez użycie białek lub peptydów. Dalej białka lub peptydy AF są efektywnie absorbowane przez błony śluzowe bez utraty mocy (w porównaniu z podawaniem dożylnym). W konsekwencji, istnieje wiele trybów postępowania leczniczego, a prawidłowo podane białko lub peptyd umożliwia szybki powrót zaburzonej równowagi płynów (wodnej i jonowej) reakcji zapalnej, lub obu.

    W skrócie, rekombinowany AF (rAF) i jego homologi oraz fragmenty można użyć do immunodetekcji, jako dodatek paszowy w hodowli zwierząt i jako lek przeciwbiegunkowy przeciw chorobom, obejmującym obrzęk, odwodnienie i/lub zapalenie.

    Przedmiotem niniejszego wynalazku jest rekombinowane białko posiadające sekwencję aminokwasową pokazaną w SEQ ID nr 1 lub jego fragmenty, posiadające aktywność przeciwwydzielniczą.

    188 530

    Korzystnie rekombinowanym białkiem według wynalazku jest fragment rekombinowanego białka pokazanego w SEQ ID nr 1, wybrany się z grupy obejmującej:

    a) aminokwasy nr 35-42

    b) aminokwasy nr 35-46

    c) aminokwasy nr 36-51

    d) aminokwasy nr 36-80

    e) aminokwasy nr 1-80 sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEQ ID nr 1.