EA001201B1 - Пептиды антисекреторного фактора, регулирующие патологические изменения проницаемости - Google Patents

Abstract

Описаны новый рекомбинантный белок, называемый антисекреторным фактором (rAF), его гомологи и пептидные фрагменты. Этот белок, а также его гомологи и фрагменты могут быть использованы для нормализации патологического транспорта жидкости и/или для подавления воспалительных реакций в организме животных и человека. Описаны антитела против AF или его гомологов или фрагментов. Кроме того, описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие указанный белок или его гомологи или фрагменты, а также векторы и хозяева, содержащие эти нуклеиновые кислоты. rAF, его гомологи и фрагменты могут быть использованы для иммунодетекции; для добавления в пищу животным молодняку в качестве пищевых добавок; а также в качестве противопоносных средств и лекарственных средств для лечения заболеваний, включая отеки, обезвоживание организма и/или воспаления.

Description

Настоящее изобретение относится к новым антисекреторным факторам, обладающим способностью регулировать транспорт жидкости и/или воспалительные реакции, а также свойствами полинуклеиновой регуляции; к полинуклеиновым кислотам, кодирующим указанные факторы; и к их использованию.

Все клетки и ткани организма в значительной степени зависят от постоянно присутствующей в организме нормальной жидкостной среды, а также от адекватного кровоснабжения. Расстройство одной или обеих этих поддерживающих систем может иметь роковые последствия. Что касается жидкостного дисбаланса, то существуют две принципиально различные системы:

A. Отек, который характеризуется аномальной аккумуляцией жидкости в межклеточном тканевом пространстве или в полостях организма; или

B. Обезвоживание, которое, строго говоря, означает потерю лишь воды, однако, фактически, этот термин используют для описания как потери воды, так и потери ионов.

Наиболее распространенными формами отеков или обезвоживания являются:

диарея; воспалительные заболевания кишечника; отек головного мозга; астма; ринит; конъюктивит; артрит; глаукома; различные формы аномального внутричерепного давления (повышенного или пониженного); изменение давления в среднем ухе, такое как болезнь Меньера; дерматит; химические или физические повреждения кожи и желез вместе с прилегающей к ним кожей, например мастит; различные формы эндокринных нарушений, таких как несахарный диабет, синдром Конна, синдром Кушинга и болезнь Аддисона; заболевания почек, такие как пиелонефрит и гломерулонефрит; болезни обмена веществ, такие как микседема, и острая интермиттирующая порфирия; побочные эффекты, возникающие в процессе лечения различными лекарственными средствами, такими как антидиабетические лекарственные средства, трициклические антидепрессанты, цитостатики, барбитураты, наркотические средства и аналоги наркотических средств.

Диарея возникает в результате изменения проницаемости кишечника для электролитов и воды. Эти расстройства часто вызываются бактериальными энтеротоксинами, такими как ЕксепсЫа сой, Сатру1оЬас!ег )ещпг У1Ьгю с1ю1егае, 8Ыде11а бухеШепае и С1о51пбшт бййсйе. Указанные расстройства могут быть также вызваны кишечным воспалением. Поскольку поглощение воды в организме животного сочетается с поглощением электролитов и питательных веществ, то животные с диареей часто страдают от недостаточности питания, что приводит к замедлению суточного прироста массы выкармливаемого животного. Организм противодействует этим реакциям посредством нейро гормональных механизмов, таких, как высвобождение соматостатина и опиоидных пептидов из интернейронов в слизистой оболочке кишечника. Эти полипептиды обладают способностью к восстановлению нормальной секреции жидкости и устранению диареи.

Описанный недавно антисекреторный фактор (АР) был частично очищен из гипофиза свиньи, и было показано, что этот фактор нормализует патологическую секрецию жидкости, индуцированную различными энтеротоксинами. Высокие уровни АР в молоке свиноматки способствуют защите вскармливаемых поросят от неонатальной диареи.

Для лечения диареи у человека и животных широко используются противомикробные лекарственные средства. Они также используются в качестве пищевых добавок в корм для свиней, телят и цыплят. Однако из-за быстрого развития в кишечнике резистентных бактерий, использование антибиотиков для лечения энтеритов обычно не практикуется в медицине, а их использование в ветеринарии также сведено до минимума.

Другие противопоносные лекарственные средства препятствуют секреции в слизистой оболочке кишечника. Поскольку эти лекарственные средства направлены против организмахозяина, то маловероятно, что в организме будет развиваться резистентность против таких лекарственных средств. Лекарственными средствами этого типа являются нейроактивные лекарственные средства, такие как фенотиазины и тиоксантены. Однако, в большинстве стран, лекарственные средства такого типа не применяются для лечения диареи из-за некоторых вызываемых ими серьезных побочных эффектов. Другими лекарственными средствами являются производные опиатов, такие, как кодеин и лоперамид. Поскольку эти лекарственные средства действуют посредством ингибирования кишечной перистальтики, то они также ингибируют вывод патогенных бактерий из кишечника, а поэтому такие лекарственные средства не рекомендуются для применения против дизентирийных бактерий или паразитов. Недавно стали использоваться производные соматостатина, но в настоящее время они имеют ограниченное применение из-за трудности их введения, а также из-за их возможного влияния на эндокринную регуляцию роста.

До настоящего времени, антисекреторный фактор (АР) не использовался непосредственно для лечения диареи или недостаточности питания из-за трудности получения чистого препарата этого белка. Однако, аналогичные белки можно было индуцировать у домашних животных, которым давали специальную пищу (патент 8Е № 9000028-2). Свиньи, получавшие такое питание, продуцировали высокие уровни АЕ-подобных белков и обнаруживали значительное увеличение суточного привеса по срав нению с соответствующим контролем. АР у крыс, подвергнутых контрольному заражению токсином А от С.6|ГПеПс. обеспечивал защиту животных не только от кишечной секреции, но также и от воспаления и кровотечения в кишечнике.

Основной задачей настоящего изобретения является получение нового рекомбинантного белка и его гомологов и фрагментов (пептидов) для использования в целях нормализации патологического транспорта жидкости. В целом, эти белки и пептиды называются антисекреторными факторами (АР). АР также частично ингибируют, или полностью предупреждают развитие воспалительных реакций различной этиологии. Такая нормализация транспорта жидкостей в организме или подавление воспалительных реакций достигается путем использования белков или пептидов. Кроме того, белки или пептиды АР с успехом абсорбируются через различные мембраны слизистых оболочек, не теряя, при этом, своей эффективности (по сравнению с внутривенным введением). Поэтому существует множество схем лечения, и правильное введение белка или пептида позволяет быстро восстановить нарушенный жидкостный баланс (воды и ионов) в организме, устранить воспалительные реакции, либо то и другое.

В целом, рекомбинантный белок АР (гАР). а также его гомологи и фрагменты могут быть использованы для иммунодетекции; а также в качестве пищевых добавок в корм для молодняка; и в качестве противопоносных средств и лекарственных средств для лечения заболеваний, включая отек, обезвоживание и/или воспаление.

Целями настоящего изобретения являются: Рекомбинантный белок, имеющий, в основном, аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологи или фрагменты.

Фрагмент рекомбинантного белка с 8ЕО ΙΌ Νο:1. где указанный фрагмент выбирают из группы, включающей:

a) аминокислоты № 35-42

b) аминокислоты № 35-46

c) аминокислоты № 36-51

6) аминокислоты № 36-80

е) аминокислоты № 1-80 аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ Νο:1.

Пептид Х1УСХ₂Х₃КХ₄К, соответствующий фрагменту, состоящему из аминокислот 35-42 рекомбинантного белка с 8ЕО ΙΌ Νο:1. где Х₁= 1 или отсутствует, Х₂ представляет Н, В или К; Х₃ представляет 8. Ь или другую нейтральную аминокислоту; а Х₄ представляет Т или А.

Поликлональные антитела против рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологов или фрагментов.

Композиция для нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций, содержащая в качестве главного активного ингредиента эффективное количество рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологов или фрагментов.

Использование рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологов или фрагментов для изготовления композиции в целях нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций.

Пищевой продукт для нормализации патологического транспорта жидкостей и/или подавления воспалительных реакций у позвоночных, содержащий в качестве активного агента рекомбинантный белок, имеющий, в основном, аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологи или фрагменты; или организм, способный продуцировать указанный белок или его гомологи или фрагменты.

Способ нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций в организме позвоночных, заключающийся во введении указанному позвоночному эффективного количества рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологов или фрагментов, или микроорганизма, продуцирующего указанный белок или его гомологи или фрагменты.

Использование специфических антител против рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологов или фрагментов для детекции указанного белка или его фрагментов в организме.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантный белок, имеющий, в основном, аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологи или фрагменты.

Использование нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантный белок, имеющий, в основном, аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологи или фрагменты, для продуцирования соответствующих белков или их гомологов или фрагментов и для получения зондов или праймеров для детекции присутствия нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный антисекреторный фактор в организме.

Вектор, содержащий нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантный белок, имеющий, в основном, аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1. или его гомологи или фрагменты.

Штамм организма, за исключением человека, способный продуцировать белок, имеющий, в основном, аминокислотную последова тельность 8ЕО ΙΌ Νο:1, или его гомологи или фрагменты.

В качестве организмов, способных продуцировать рекомбинантный белок, могут быть использованы организмы различных типов, таких, как рекомбинантные бактерии и эукариотические организмы, например, дрожжи, растения и позвоночные за исключением человека.

Несмотря на десятилетние усилия, направленные на очистку ΆΕ стандартными биохимическими методами, попытки получить гомогенную форму ΆΕ не увенчались успехом. Однако, был разработан новый способ получения полуочищенного ΛΕ для иммунизации и отбора сыворотки иммуногистохимическим методом с использованием подходящей антисыворотки. С помощью такой антисыворотки, в настоящее время стало возможным клонировать рекомбинантную кДНК человека, экспрессирующую ΆΕ в Е.сой.

Была определена последовательность новой кДНК, и было показано, что эта последовательность является уникальной. Благодаря определению этой последовательности были сконструированы олигонуклеотидные зонды, которые гибридизируются с РНК гипофиза человека и свиньи. Размер этой РНК, около 1400 пар оснований, соответствует размеру секвенированной кДНК, включающей 1309 пар оснований + ро1у(А)-хвост. Было показано, частичная кДНКпоследовательность от гипофиза крысы идентична соответствующей кДНК-последовательности человека, что свидетельствует о том, что структура генов АР является аналогичной у животных различных видов. Такая консервативность АР-генов позволяет использовать олигонуклеотидные зонды для идентификации АРкодирующей РНК и ДНК от различных видов животных.

Кроме того это позволяет экспрессировать рекомбинантный АР в биологически активной форме. Белок АР в форме слитого белка с глутатион-8-трансферазой был в больших количествах экспрессирован в Е.со11 и очищен до гомогенности с помощью аффинной хроматографии. Было показано, что после расщепления слитого белка тромбином, рекомбинантный АР (гАР) обладал исключительно сильным действием, дающим полумаксимальное ингибирование 44 нг (10^-12 моль) секреции жидкости, индуцированной холерным энтеротоксином в кишечнике крыс.

С использованием методов генной инженерии были продуцированы более мелкие фрагменты гАР. При этом, было показано, что небольшая последовательность, состоящая из 7-8 аминокислот, сохраняет свою активность. Это было подтверждено с помощью химического твердофазного синтеза, с помощью которого был продуцирован октапептид и было показано, что исходя из молярного соотношения, он имеет почти такое же биологическое действие, как и гАР. Посредством сайтнаправленного синтеза был сконструирован ряд последовательностей внутри активного центра, и было показано, что могут быть осуществлены замены нескольких аминокислот, которые не оказывают какоголибо неблагоприятного действия на биологическую активность.

Секрецию жидкости измеряли с помощью модели кишечной петли, а именно: участок (петлю) тонкой кишки перевязывали двумя нитями для хирургических швов; и в петлю инъецировали определенное количество энтеротоксина. Испытуемые антисекреторные лекарственные средства инъецировали за один час до и через два часа после стимуляции токсином. Эту инъекцию осуществляли тремя различными путями: внутривенно, интраинтестинально и интраназально. Жидкость аккумулировалась в петле через 5 ч после введения токсина. Секрецию жидкости измеряли исходя из массы аккумулированной жидкости на один сантиметр кишки.

Последовательность белка определяли прямым методом аминокислотного секвенирования и непрямым методом путем расшифровки кДНК-последовательности.

Было установлено, что рекомбинантный АР имеет очень низкую токсичность или низкую степень системного действия, поскольку у крыс, которым вводили дозы, 1 00-кратно превышающие дозы, вызывающие полумаксимальное ингибирование, не наблюдалось токсичных реакций. Поскольку эти дозы являются эффективными при инъекции в тонкий кишечник, то они могут быть введены перорально.

В отличие от испытанных препаратов натурального АР, которые являются эффективными только при их введении до заражения токсином, рекомбинантные АР-ингибиторы секреции обладают также эффективностью при их введении после заражения токсином. Поэтому гАР может быть использован как в профилактических, так и в терапевтических целях.

Кроме того было показано, что гАР и его пептидные фрагменты ингибируют цитотоксические реакции и воспалительные реакции в кишечнике, вызванные токсином А С1о8!пбшт НгГПсНе. С помощью теста на проникающую способность красителя было показано, что гАР и его фрагменты нормализуют патологические изменения проницаемости, индуцированные холерным энтеротоксином, не только в слизистой кишечника, но также и в сосудистом сплетении (р1ехи§ сйогоИеш), которое регулирует давление жидкости в головном мозге.

Антисыворотка против гАР была продуцирована в кроликах и использована в твердофазном иммуноферментном анализе (ЕБ18А). Этот анализ может быть использован для измерения АР в физиологических жидкостях или в пище.

Ниже описан способ очистки антител против АР (натурального или рекомбинантного) с помощью аффинной хроматографии на колонках с агарозой, связанной с гАЕ.

Было также показано, что эти антитела являются эффективными для обнаружения АЕ в срезах тканей, осуществляемого методами иммуногистохимического анализа, и для детекции АЕ в Вестерн-блот-анализе.

Более подробное описание настоящего изобретения приводится в нижеследующих неограничивающих примерах, которые сопровождаются прилагаемыми ниже рисунками.

Пример 1. Антитела против АЕ, продуцированные для клонирования кДНК.

Антисекреторный фактор получали из крови свиньи посредством аффинной хроматографии на агарозе и изоэлектрического фокусирования. К одному литру крови свиньи (содержащей противосвертывающие вещества) добавляли 1 г тиосульфата натрия и 1 мг фенилметилсульфонилфторида. Клетки крови отделяли путем центрифугирования, и прозрачную плазму элюировали на колонке с Сефарозой 6В (Рйагтааа ЬКВ Вю1ейпо1оду 81оекйо1т), причем, объем геля соответствовал примерно 10% объема раствора. После промывки тремя объемами фосфатно-буферного физиологического раствора (РВ8=0,15М ЫаС1, 0,05М фосфат натрия, рН =7,2), колонку элюировали двумя объемами 1М α-метил-Э-глюкозида, растворенного в РВ8. Элюат концентрировали и диализовали против воды на ультрафильтре Отеда 10к Доте ΙΙιΐΌΐίβΙι (Е1Игоп Тесйпо1оду Согр.). Затем, фракции разделяли путем изоэлектрического фокусирования в градиенте амфолина (Рйагтааа) при рН=4-6 на 400 мл-колонке для изоэлектрофокусирования (ЬКВ, 8теебеп). Фракцию, имеющую изоэлектрическую точку между 4,7 и 4,9, собирали, а затем диализовали против РВ8. Затем, частично очищенный АЕ делили на небольшие аликвоты и использовали для продуцирования антисыворотки у кроликов в соответствии с ранее описанным методом.

Кроликов иммунизировали и полученные сыворотки анализировали на их способность окрашивать внутриклеточный материал в срезах гипофиза человека (метод, описанный в примере 6). Лишь одна из полученных сывороток показала специфическое и отчетливое внутриклеточное окрашивание без окрашивания белков внеклеточного матрикса. Эту антисыворотку отбирали на скрининг библиотеки кДНК/лямбда-фага СТ11 от гипофиза человека, экспрессирующей белки в Е.сой.

Пример 2. Скрининг кДНК-библиотек от гипофиза и головного мозга человека.

5'-фрагмент кДНК-библиотеки от нормального гипофиза человека, происходящего от тканей, полученных из пула 9 пациентов белой расы [Саисаыап - жарг. (расистский термин) означает относящийся к кавказской расе, белый - (прим.пер.)] поставлялся С1оп1ес11 ЬаЬогаФпек. Для скрининга библиотеки, фаги засевали при плотности 3 х 10⁴ бляшкообразующих единиц на 150 мм-чашку с Υ1090 Е.со11. АЕ абсорбировали 0,5 объемами лизата Υ1090 Е.сой в течение 4 ч при температуре 23 °С, затем разводили в отношении 1:400, и осуществляли скрининг как описано Υоиηд & Эауй (1).

Конъюгированные со щелочной фосфатазой козьи антикроличьи антитела были использованы в качестве вторых антител (1аск§оп). Положительные бляшки собирали, элюировали в среду с фаговой суспензией [20 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 100 мМ ЫаС1, 10 мМ Мд80₄, 2% желатин], а затем снова засевали и скринировали до тех пор, пока не были протестированы все положительные бляшки.

Реклонирование кДНК - фаговую ДНК от АЕ-рекомбинантов выделяли с использованием Χνί/агб ЬатЬба Ргерк (Рготеда) и гидролизовали ферментом ЕсоК1. Вставки очищали с помощью 8ерйад1а5 ВапбРгер Кйь (Рйагтааа), снова клонировали в вектор рСех-1АТ (Рйагтас1а), как описано производителем, а затем трансфецировали в клетки ХЬ1-В1ие Еркшгап Сой, клетки Тор 1 или клетки ВЬ21 (все три от фирмы 8!га!адепе). гАЕ или рекомбинантные пептиды были получены в клетках ВЬ21, если это не оговорено особо (2).

Амплификация кДНК с помощью РСК. для получения отсутствующего 5'-конца кДНК использовали РСК-метод, называемый РАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК - гарИ атрйПсаОоп о£ сЭХА епбк). Набор для модифицированного КАСЕ-метода, который генерирует 5'-КАСЕ-Кеабу кДНК посредством якорного олигонуклеотида, лигированного с 3'-концом кДНК-молекул головного мозга человека, поставлялся фирмой С1оп1ес11 ЬаЬогаЮпех. 5'конец амплифицировали из части 5'-КАСЕКеабу-кДНК в две стадии РСК-амплификации с использованием 5'-праймера, комплементарного якорному праймеру и двум специфическим к внутригенному (гнездовому) гену 3'-РСКпраймерам А и В (А = основания 429-411, а В = основания 376-359; фиг. 1а). Кроме того различные более мелкие части КАСЕ-фрагмента амплифицировали для экспрессии соответствующих пептидов и анализировали на их биологические свойства. В таблице 1 показано положение основания и аминокислоты начала и конца этих олигонуклеотидных фрагментов и их соответствующих пептидов. Свиная и коровья кДНК (С1оп1есй ЬаЬога1ог1е5) были использованы в качестве матрицы для амплификации фрагментов, соответствующих N3 в таблице 1. Была также проведена модификация последовательности методом сайт-направленного мутагенеза, причем в этом методе различные олигонуклеотиды, соответствующие положениям 168193, синтезировали для последовательной замены аминокислот 35-42 (положения показаны в 8ЕО ΙΌ №:1). Амплифицированный ДНК-фраг мент клонировали в вектор рСех-ΙλΤ с использованием ЕсоВ1-сайта, встроенного в якорный и ген-специфический праймер. Для оценки последовательности, полученной ВАСЕ-методом, двухцепочечную кДНК от гипофиза и головного мозга человека (С1ои1есй) амплифицировали с использованием пары праймеров С/О, содержащих внешний рестрикционный ЕсоВ1-сайт (фиг. 1Ь). Праймеры были сконструированы так, чтобы амплифицировалась полная открытая рамка считывания (ОКЕ). РСВ-продукты нужного размера от гипофиза и головного мозга гидролизовали ферментом ЕсоК1, а затем выделяли и клонировали в плазмидный вектор рСех1λΤ.

Секвенирование ДНК и олигонуклеотидов - ДНК от плазмиды рСех-ΙλΤ использовали в качестве матрицы для секвенирования вставок методом терминации дидезокси-цепи (15) с использованием набора 8ес.|иепаке уеткюи 2,0 (И.8. Вюсйеш1са1 Согр.). Исходные прямые и обратные праймеры, копирующие области рСех-ΙλΤ непосредственно выше или ниже от вставленной ДНК, были получены от Рйаттааа. Последующие праймеры были синтезированы (8саибшау1ап Сепе 8уи1йек1к АВ) на основе полученных данных о последовательностях. Во избежание обмена оснований под действием полимеразы Της в 5'-ВАСЕ-методе были секвенированы три различных РСВ-клона.

Были собраны данные о нуклеотидной последовательности и выведенной белковой последовательности и проанализированы с использованием МасУес!от 4,1 (Еак!шаи Сйеш1са1 Со.). Для определения соответствующей аминокислотной последовательности кДНК-вставок, используемые кодоны различных рамок считывания сравнивали и получали одну большую открытую рамку считывания. Идентификацию данных ДНК-последовательностей и белковых последовательностей проводили с помощью Еп1гех СЭ-ВОМ-диска (Иа!юиа1 СеШет Гог Вю1ес1то1оду 1пГотта!юп, ВеШекба, И8А).

Молекулярное клонирование и анализ последовательности кДНК - поливалентные антисыворотки против белка АЕ от свиньи были использованы для скрининга кДНК от гипофиза человека. Два клона, экспрессирующих иммунореактивный АЕ, выделяли, а затем высвобождали из лямбда-фага, и снова клонировали в ЕсоК1-сайт вектора рСех-ΤλΤ, как описано в инструкции к набору, поставляемому фирмой Рйаттааа. Размеры вставок, полученные с помощью рестрикционного анализа, составляли 1100 и 900 п.о., соответственно. ДНКсеквенирование двух клонов выявило полную гомологию, за исключением одной замены (фиг.1, С заменено на Т в положении 1011). Последовательность, расположенная вверх по течению от 5'-конца клона 2, была получена ВАСЕ-методом. Этот фрагмент имеет полную длину 376 п.о. (не включая синтетического нуклеотидного плеча у 5'-конца). Полная реконструированная кДНК содержала 1309 пар оснований и следовала за ро1у А-хвостом, который предшествовал сигналу полиаденилирования (фиг.1, положения 1289-1295). Была также идентифицирована открытая рамка считывания (ОКЕ) размером в 1146 п.о. (положения 631208).

Пример 3. Экспрессия белка АЕ млекопитающего из рекомбинантных плазмид.

Конструирование и очистка слитых белков - кДНК-клоны, полученные путем иммунологического скрининга и РСВ-амплификации целой кДНК, лигировали в вектор рСех-ΤλΤ. Этот вектор позволяет экспрессировать Е.сой чужеродные белки в слитые с С-концом 26 кДаглутатион-3-трансферазы 8сЫк!окота )арошсит (СЗЦ, которые могут быть аффинно очищены в неденатурирующих условиях при помощи набора, предоставленного фирмой Рйаттааа. Для этого, ночные культуры Е.сой, трансформированные рекомбинантными плазмидами рСех1λΤ, разводили в свежеприготовленной среде, и выращивали в течение 3 ч при температуре 37°С. Экспрессию белка индуцировали 0,1мМ IРΤС (изопропил-бета-Э-тиогалактопиранозид), и после 4-часового выращивания при температуре 30°С клетки осаждали и ресуспендировали в РВ8. Клетки подвергали лизису путем обработки ультразвуком, а затем обрабатывали 1%ным Тритоном Х-100 и центрифугировали при 12000 х г в течение 10 мин; супернатант, содержащий экспрессированные слитые белки, очищали путем пропускания лизатов через глутатионагарозу (Рйатташа). Слитые белки либо элюировали посредством конкурентного связывания со свободным глутатионом, либо гидролизовали в течение ночи путем обработки 10 ед. коровьего тромбина для отщепления АБ-белка от С8Τ-аффинного хвоста. В целом, метод с использованием плазмиды рСех и очистку белков или пептидов проводили в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам от Рйаттааа.

Последовательность и размер рекомбинантных АБ-белков - для подтверждения кодирующей последовательности, полноразмерный транскрипт выделяли путем РСВ-амплификации кДНК гипофиза и головного мозга. С использованием пары праймеров С/ϋ была выделена последовательность в 1215 п.о., идентичная последовательности клона-4 (фиг.1). Открытая рамка считывания, кодирующая 382 аминокислоты, имеет вычисленную молекулярную массу 41,14 кДа и р1 = 4,9.

Клоны-1 , 2 и 3 АЕ, а также олигонуклеотиды Ν1-Ν5 (фиг.1 и таблица 1) лигировали в плазмидный вектор рСеx-1λΤ так, чтобы ОКЕ совпадала с рамкой белка глутатион-8-трансферазы (С8Ц. Затем, эти конструкции трансфор мировали в Е.сой, а экспрессию гибридных белков индуцировали посредством 1РТО. Очищенные слитые белки и расщепленный тромбином белок или пептид АР подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН и Вестерн-блоттингу с использованием антисыворотки против свиного антисекреторного фактора (фиг. 2).

Окрашивание белков кумасси бриллиантовым голубым выявило дискретные полосы для каждого белка за исключением белка ОЗТ-АР-1, что свидетельствовало о его разложении на более мелкие компоненты.

Твердофазный пептидный синтез - более мелкие пептиды (Р₇ -Р₁₈ в таблице 1) продуцировали (К.1. Во55-Рс1сг5сп АЗ) на твердой фазе в синтезаторе пептидов Аррйеб Вюкуйетк. Чистота каждого пептида составляла 93-100%, как показала обращеннофазовая ВЭЖХ на Оейарак С18, 300 А, проведенная в линейном градиенте 0,1% трифторуксусной кислоты в воде/ацетонитриле.

Аминокислотное секвенирование - для дополнительного подтверждения ОВР идентифицированной открытой рамки считывания проводили анализ последовательности белка. Чистые белки АР подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН (10% макропластины геля 14), и белки переносили на мембрану РгоЫо! (Аррйеб Вюкук1еш5) посредством электроблоттинга (Вю-Ваб). Пятна, визуально наблюдаемые после окрашивания Ропсеаи З, вырезали из блота, и первые 20 аминокислот белка секвенировали методом автоматического расщепления по Эдману на автематическом секвенаторе (Аррйеб Вю^уЧепъ).

Были определены Ν-концевые последовательности клона-2 и клона-3, что указывает на точное соответствие аминокислот 63-75 и 130140 предсказанной последовательности, соответственно (фиг. 1).

Сравнение с другими последовательностями белка, имеющимися в ОепВапк, выявило, что последовательность г АР (фиг. 1) является уникальной во всех своих частях и не похожа ни на одну известную последовательность.

В результате анализа, проведенного по методу Ку1е-Эоо1йй1е (22), было выявлено, что первые 10 остатков белка являются относительно гидрофобными и могут составлять сигнальный пептид, который отщепляется до экзоцитоза белка. Эта интерпретация подтверждается Вестерн-блот-анализом (фиг.3), в котором было обнаружено, что рекомбинантный белок имеет немного большую молекулярную массу, чем белковый экстракт, полученный из гипофиза. Однако, такое различие может быть обусловлено пятью дополнительными аминокислотами рекомбинантного белка, образующими сайт расщепления тромбином слитого белка.

Пример 4. Продуцирование и анализ антисыворотки/против гАР.

Антисыворотка против рекомбинантного слитого белка ОЗТ-АР -Антитела против очи щенных гибридных белков ОЗТ-АР-1, ОЗТ-АР2 и расщепленного тромбином чистого белка АР-1 (=гАР) для использования в ЕЬ1ЗА, в Вестерн-блот-анализе, и для иммуногистохимических исследований продуцировали в кроликах. Каждому кролику вводили 100 мкг антигена в 1 мл РВЗ, смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда; причем, каждую иммунизацию распределяли на 8-10 порций, которые вводили чрезкожно в спинку животного. Через 3 и 5 недель вводили две бустер-инъекции 50 мкг антигена, причем, последнюю бустер-дозу вводили без использования полного адъюванта Фрейнда. Через 6 дней после последней бустеринъекции, у кроликов брали кровь, получали сыворотку и полученные препараты хранили при -20°С. Чувствительность антисыворотки определяли методом дот-блотанализа. ОЗТ-АР2 наносили на нитроцеллюлозную мембрану ЕСЬ в 1/5- разведении, и антисыворотку разводили 1:1000. Мембраны блокировали 1% альбумином бычьей сыворотки (ВЗА) в РВЗ при 4°С в течение 16 ч, а затем инкубировали в течение полутора часов с 1:800-разведенной кроличьей антисывороткой против ОЗТ-АР или против свиного АР. Блоты проявляли с использованием конъюгированного со щелочной фосфатазой козьего антитела против кроличьих иммуноглобулинов, а затем 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и п-нитро-тетразолиевого синего (Воейгшдег Маппйе1ш). В этом тесте теоретический предел для детекции антигена составлял около 1 нг.

Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле и иммуноблоттинг - электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН (ПААГ-ДСН) экстрактов человеческого и свиного гипофиза и чистых АР-белков осуществляли в 10% акриламидном геле (минипластины геля), в основном, как описано Ьаеттй (4), за исключением того, что бис-акриламид, используемый в качестве перекрестносшивающего агента, заменяли Ν,Ν'диаллилтартардиамидом с соответствующей молярностью. В качестве маркера электрофоретического фронта использовали пиронин Υ (З1дта). Заранее окрашенный эталон молекулярных масс закупали у ВОН. Затем белки либо окрашивали кумасси бриллиантовым голубым, либо электрофоретически переносили на нитроцеллюлозу ЕСЬ (Атегайат) с размером пор 0,45 мм для иммуноблотинга. Последующее инкубирование с В ЗА, анти-1дС антителом, конъюгированным со щелочной фосфатазой, проводили точно так же, как и для дот-блот-анализа, описанного выше.

Как указывалось выше, окрашивание кумасси бриллиантовым голубым не выявило дискретной полосы для белка ОЗТ-АР-1, что вероятно, обусловлено его протеолитической деградацией на более мелкие компоненты. Однако в Вестерн-блот-анализе, полноразмерный белок дал значительно более сильный сигнал, чем его расщепленные продукты (фиг.2Ь). Сильная ре акция с антисывороткой против свиного АР свидетельствовала о том, что рекомбинантные белки действительно имеют такую же иммунореактивность, что и АР. Молекулярная масса полноразмерного белка составляет приблизительно 60 кДа, что превышает точное значение молекулярной массы, составляющее 41139 Да, и оцененное исходя из аминокислотного состава. Кроме того белки были также подвергнуты иммуноблотингу и зондированию с использованием антисыворотки против С8Т-АР-2, которая связывается с расщепленными тромбином белками (фиг.3).

Антисыворотка против рекомбинантного С8Т-АР-2 реагировала с нативным белком АР, имеющим кажущуюся молекулярную массу 60 кДа, и с некоторыми более мелкими компонентами, являющимися, по всей вероятности, продуктами ферментативного расщепления (фиг.3 а).

ЕБ18А для определения концентрации АР ЕЙ18А - Анализ осуществляли с использованием антител против АР-1 и АР-2 методом, описанным ранее (5). Как показано на фиг.ЗЬ, чувствительность теста с использованием неочищенной антисыворотки составляла в пределах 110 мкг белка, тогда, как чувствительность теста с использованием аффинноочищенного антитела составляла в пределах 5-50 нг белка.

Пример 5. Нозерн-блот-анализ РНК гипофиза.

Нозерн-блот-анализ - Гипофиз человека был получен посмертно из клиники 8ай1дтеп§ка (с разрешения Министерства здравоохранения Швеции (8\\еб1511 Неайй апб АеИате Воагб); §2 положения о трансплантации органов 1975:190). Гипофиз для получения РНК экстрагировали методом С11гоехуп5ку & 8аееЫ (6) с использованием тиоцианата гуанидиния-РНК. Полиаденилированную РНК отбирали с использованием готового набора (Рйатташа) и колонок с οΐίдобТ-целлюлозой. Кроме того, использовали пул мРНК из гипофиза человека, полученного от 107 индивидуумов и закупленного у С1оп1еей. 5 мкг каждого образца ро11(А+)РНК обрабатывали глиоксалем и подвергали электрофорезу в 1,2% агарозном геле (7). После капиллярного щелочного переноса в течение 3 ч в 0,05М №1ОН на нейлоновые мембраны НуЬоиб Ν+ (Атегайат), проводили предварительную гибридизацию и гибридизацию в течение 24 ч при 42°С каждую. Раствор для гибридизации содержал 50% формамида, 5 х 88РЕ, 10 х раствор Денхардта, 250 мкг/мл денатурированной низкомолекулярной ДНК и 50 мкг/мл полиадениловой кислоты. Блоты зондировали с использованием четырех различных антисмысловых 28 п.о.-олигонуклеотидов, содержащих нуклеотиды в положениях 132-105 (праймер Е), 297-270 (праймер Р), 748-721 (праймер 6) и 833-806 (праймер Н) последовательности, показанной на фиг. 1; зонды метили по 3'-концам терминальной трансферазой (Воейппдет Мапийет) + [а^32р]ббАТР (Атегайат), и очищали на никколонках (Рйагтааа). Затем проводили пять промывок в 5х88РЕ/0,1% ДСН -0,5х88РЕ/0,1 % ДСН при 42°С в течение 30 мин каждую, причем, последнюю промывку повторяли. Фильтры экспонировали с пленкой НуретШт МР (Атегкйат) в течение 7 дней.

Экспрессия в гипофизе - нозерн-блотанализ осуществляли с использованием смеси четырех олигонуклеотидных зондов, гибридизирующихся с различными последовательностями, находящимися в клонированной кДНК (фиг.4). Зонды гибридизировались лишь с одной полосой около 1400 п.о. в мРНК, выделенной из гипофиза. Наиболее сильный сигнал был получен с использованием человеческого материала, а материал, полученный от свиньи, давал также перекрестную реакцию.

Пример 6. Распределение АР в срезах гипофиза.

Виды и ткани - Гипофиз человека был получен после вскрытия из клиники 8ай1дтеп§ка (с разрешения Министерства здравоохранения Швеции (8\\ό6ι51ι Неайй апб Аейате Воагб); §2 положения о трансплантации органов 1975:190). Препараты гипофиза замораживали при -70°С, за исключением препаратов, используемых для гистологического анализа, которые фиксировали в течение 24 ч в 4% параформальдегиде, растворенном в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8=0,15М №С1, 0,05М фосфат натрия, рН 7,2), а затем переносили в 7,5% сахарозу в РВ8. Гипофизы от 5-7месячных свиней, полученные со скотобойни, выдерживали во время их транспортировки на сухом льду, и замораживали при -70°С вплоть до их использования. 2-3-месячных крыс 8ртадие-Эад1еу для биоанализа получали от В & К ишует8а1 АВ, 8о11еп1ипа, 8\\ебеп. Кролики (новозеландские белые) для иммунизации были получены от Ыбкортд КашпГагт. 8\\ебеп.

Иммуногистохимия - фиксированные гипофизы замораживали в жидком азоте, и получали криосрезы толщиной 7 мкм. 5-10 срезов от каждого образца, содержащих различные участки гипофиза, были фиксированы на предметных стеклах микроскопа. Срезы блокировали в 5%ном обезжиренном сухом молоке и инкубировали с первой кроличьей антисывороткой (против слитого белка С8Т-АР-2), разведенной в отношении 1:4000-1:8000, во влажной камере в течение ночи при 4°С. После промывания в буфере, образцы инкубировали в течение 1 ч при 23°С со свиной антисывороткой против кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированной со щелочной фосфатазой и разведенной в отношении 1:50 (Пако А/8). Иммунную реакцию визуализировали с использованием субстратов фосфатазы, как описано ранее (8). Контрольные срезы инкубировали с иммунной сывороткой, абсорбированной избытком 68Т-АР-2-белка, или проводили все стадии инкубирования, за исключением стадии в присутствии первого антитела.

Распределение АР в срезах гипофиза - Распределение АР в срезах человеческого гипофиза исследовали с помощью иммуногистохимического анализа (фиг.5). Во всех исследованных образцах, умеренное количество клеток в аденогипофизе было окрашено, что, очевидно, связано с тем, что иммуноокрашенный материал локализован в гранулах цитоплазмы; причем, предварительная абсорбция иммунной сыворотки с помощью избыточного количества С8ТΑΡ-2-белка приводила к отмене сигнала. В задней части гипофиза (нейрогипофиза) окрашивания не наблюдалось.

Распределение иммунореактивного материала в гипофизе продемонстрировало лишь внутриклеточное распределение АР в секретирующих клетках передней доли (аденогипофиз). Белками, секретирующимися из этой доли гипофиза, являются гормоны роста, тиротропин, кортикотропин, пролактин и лютенизирующий гормон. Перенос этого гормона из внутриклеточных участков в сосудистую систему стимулируется рилизинг-факторами, продуцируемыми нейроэндокринными клетками в гипоталамусе.

Пример 7. Биологическая активность рекомбинантного АР (гАР).

Антисекреторная активность - Антисекреторную активность измеряли с использованием описанной ранее (9) модели кишечной петли крысы. Петлю тонкой кишки подвергали контрольному заражению 3 микрограммами холерного энтеротоксина. Перед и после заражения холерным энтеротоксином инъецировали либо различные дозы очищенного белка АР-1, либо РВ8 (контроль). Через 5 ч измеряли массу жидкости, аккумулированной в кишечной петле (мг/см). Каждый ΑΡ-препарат испытывали, по крайней мере, на шести крысах. Для статистического анализа данных использовали критерий Фишера (РБ8Э).

Биологическая активность белка гАР Биологическую активность чистого белка гАР клона-1, продуцированного в Е.сой, тестировали на крысах. Способность гАР ингибировать секрецию кишечной жидкости при его внутривенном введении за 20-30 с до стимуляции тонкой кишки холерным энтеротоксином продемонстрирована на фиг. 6. У контрольных животных, которым был инъецирован лишь один буфер, инъекция холерного энтеротоксина вызывала заметную секрецию, 412±9 мг жидкости на см кишки. В отличие от контрольных животных, которым был введен лишь один буфер (р < 0,01, п=6), чистый гАР вызывал заметное дозозависимое ингибировние секреции жидкости, индуцированной холерным энтеротоксином. 9 нг белка клона-1 оказалось достаточным для снижения ответной реакции на 34%, а 44 нг (10^-12 моль) и 220 нг давало 46%- и 78%-ное снижение реакции, соответственно. Биологическая активность рекомбинантного АР превышала активность любого известного нам энтеротоксина или нейропептида, модифицирующего транспорт электролитов. Кроме того, уровень активности человеческого гАР в крысах оказался неожиданно высоким, что, вероятно, обусловлено консервативностью структуры молекулы гАР в различных видах животных. Эта гипотеза подтверждается перекрестной реактивностью между материалами, полученными от человека и свиньи в Вестерн-блот-анализе и Нозерн-блот-анализе.

Сравнивали способность 0,5 мкг гАР ингибировать кишечную секрецию при его внутривенной инъекции за 20-30 с до и через 90 мин. после заражения холерным энтеротоксином (фиг. 7). Оба режима введения давали значительное ингибирование по сравнению с контрольными животными (р < 0,01, п=6). Таким образом, в отличие от натурального АР, рекомбинантный белок является также эффективным при его введении после заражения токсином, что позволяет использовать гАР для терапевтического лечения диареи.

мкг гАР инъецировали в петлю длиной 810 см, расположенную непосредственно возле петли, зараженной холерным энтеротоксином. гАР вводили либо за 20-30 с до, либо через 90 мин после заражения токсином. Как показано на фиг. 8, обе испытуемые группы обнаруживали значительное снижение секреции жидкости по сравнению с контролем (р < 0,01, п=6); тогда как между этими двумя испытуемыми группами какого-либо отличия не наблюдалось. Эти эксперименты дают основание предположить, что гАР является активным после перорального введения и может быть использован в качестве добавки в корм животного, при условии, что он не вызывает серьезных побочных эффектов.

В вышеприведенных примерах, гАР продуцировали в клетках ХЬ-1 Еркштап Сой. В этих клетках большинство продуцированных гАР распадается на более мелкие пептиды. При продуцировании гАР в клетках ВЬ21, разлагается лишь небольшая часть гАР, тогда, как при продуцировании в клетках Тор 1, деградации вообще не наблюдается. Неожиданно было обнаружено, что биологическая активность пропорциональна степени разложения, то есть, чем больше разложение, тем выше активность. Поэтому были продуцированы различные более короткие фрагменты для оценки их возможной биологической активности.

Как показано в таблице 1, эти фрагменты были протестированы путем их внутривенного введения до заражения холерным энтеротоксином способом, описанным выше для интактного гАР. Пептиды, экспрессированные клоном 2 и 3, и протестированные в количествах 0,1, 1 и 10 мкг, не давали какого-либо эффекта в отно шении ответной реакции на заражения токсином. В противоположность этому, один микрограмм пептида, экспрессированного ВАСЕфрагментом (клон 4), давал заметный эффект. Из этого КАСЕ-фрагмента было получено большое количество более коротких конструкций, которые были экспрессированы в рСех-1лямбда. Как показано в таблице 1, было установлено, что активный центр расположен между остатками 35-51. Для более точного определения активного сайта были получены три небольших пептида методом твердофазного синтеза. Два из этих пептидов, пептид 35-46 (Р3) и пептид 35-42 (Р1), были активными; при этом, последний октапептид 1УСН8КТВ (Р1) был активным в дозе менее, чем 1 нг, то есть, он был почти таким же активным, как и интактный гАЕ, исходя из молярного соотношения. В противоположность этому, более короткий гексапептид УСН8КТ (Р2) не давал какого-либо эффекта при его тестировании в дозе, составляющей от 1 нг до 10 мкг.

Пептид Х₁УСХ₂Х₃КХ₄В, соответствующий фрагменту Р1 человека, но с некоторыми изменениями и/или делециями, был также продуцирован с помощью сайт-направленного мутагенеза и тестирован на биологическую активность. Было также проведено сравнение последовательностей кДНК, полученных от быка и свиньи. Эти исследования дают основания предположить о наличии следующих изменений и/или делеций:

Х₁ = 1 или отсутствует,

Х₂ представляет Н, В или К;

Х₃ представляет 8, Ь или другую нейтральную аминокислоту;

Х₄ представляет Т или А.

Таблица 1

Код	Олигонуклеотид*	Пептид**	Ингибирование секреции, вызванной холерным токсином***	ΕΏ50 пмоль
N1	63-301	1-80	+	4
N2	168-301	36-80	+	6
N3	168-215	36-51	+	3
N4	122-170	21-36	-
N5	186-269	42-69	-
Р3	8 р 8 ****	35-46	+	7
Р1	8.Р.8.	35-42	+	5
Р2	8.Р.8.	36-41	-

* Положение пар оснований в 8ЕО ΙΌ Νο:1, которые были экспрессированы в конструкции, полученной из кДНК АЕ и рСех-1-λ.

** Положения аминокислотных остатков (8ЕО ΙΌ Νο:1) в АЕ в начале и в конце синтезированного пептида.

*** Ингибирование секреции жидкости, индуцированной холерным энтеротоксином в перевязанной кишечной петле крысы; количество (пмоль), вызывающее полумаксимальное ингибирование (ЕИ₅₀), указано для активных пептидов.

**** Эти пептиды продуцировали методом твердофазного синтеза.

Действие гАЕ на воспаление слизистой оболочки кишечника было также протестировано на модели кишечной петли крысы. Для этого 20 крыс заражали 0,5 мкг токсина А от С1о51п61ит ЩГПсПе (10), и воспаление и секрецию жидкости измеряли через 2,5 и 5 ч, соответственно (10 + 10) крыс. Половине крыс в каждой группе внутривенно вводили 100 нг гАЕ за 30 с до заражения; а другой половине вводили буфер РВ8 в качестве контроля. После этого, крыс забивали, петли вырезали, и среднюю 2-3 см- часть вырезанных петель замораживали на сухом льду. Затем, замороженные образцы разделяли на толстые 8 мкм-срезы с использованием криостата Ьеюа. Срезы окрашивали для того, чтобы продемонстрировать действие щелочных фосфатаз посредством ферментной гистохимии. Щелочные фосфатазы экспрессировались кишечными эпителиальными клетками, и окрашивание позволяло провести количественную оценку и целостность кишечного эпителия.

Полученные результаты (фиг. 9) выявили обширное поражение кишечной слизистой оболочки у контрольных крыс: через 2,5 ч наблюдалось отделение эпителиальных клеток от базальной мембраны вместе с некротической тканью, тогда как интенсивное кровотечение наблюдалось через 5 ч. В противоположность этому, у животных, обработанных гАЕ, не наблюдалось отделения клеток, некроза или кровотечения. Секреция жидкости, индуцированная токсином А, была также ингибирована в пределах 199 ± 4 - 137 ± 5 мг/см через 2,5 ч (р < 0,01) и в пределах 421 ± 3 - 203 ± 6 мг/см через 6 ч (5 крыс на группу, р < 0,01).

Аналогичный эксперимент проводили с использованием 0,5 мкг пептида 1УСН8КТВ (= Р1) вместо белка гАЕ. Октапептид оказывал то же самое действие на кишечное воспаление и секрецию жидкости, индуцированные токсином А, как показано на фиг. 9.

Токсичность - Для теста на токсичность гАЕ, его вводили в большой дозе, 50 мкг на 1 крысу. Во время наблюдения в течение 1 недели, какой-либо заметной токсической реакции зарегистрировано не было.

Пример 8. Биологическая активность гАЕ по отношению к кишечной проницаемости.

Для оценки действия гАЕ на проницаемость для органического вещества, растворенного в крови, проводили тест с использованием голубого Эванс методом, описанным ранее (11). Эксперимент проводили, как описано выше в примере 7 и фиг.5 путем введения внутривенной инъекции гАЕ перед заражением холерным энтеротоксином. Секреция жидкости не была измерена, но тем не менее, через 90 мин после заражения токсином внутривенно вводили 1 мл 1,5 % раствора голубого Эванса в РВ8. Этот краситель попадал в кровоток в течение 5 мин. После этого, крысу подвергали транскардиальной перфузии через левый желудочек правое предсердие (с помощью перистальтического насоса [Со1е Рагтег 1п51гптсп15. СЫсадо, 111., И8А]) с использованием 200 мл раствора (4°С) Олсвера в РВ8 (отношение 1/1) в течение примерно 150 с при эфирной анестезии. Эта процедура была предпринята для удаления всего ЕВ (голубого Эванс), присутствующего в сосудистой системе, с сохранением лишь ЕВ в интерстициальной ткани для проведения детекции посредством формамидной экстракции красителя.

Результаты, представленные в таблице 2, указывают на то, что заражение холерным энтеротоксином значительно (р < 0,001) увеличивает количество ЕВ, которое может быть экстрагировано из кишечной ткани (примерно 43%), в то время как внутривенная инъекция 1 ВгТ перед заражением холерным энтеротоксином предупреждает это увеличение, то есть, количество ЕВ, экстрагированого из ткани в группе 1 (контрольная), не отличается от количества ЕВ в группе 3 (1 гАР + СТ).

Таблица 2

груп па	Заражение	НГ	ЕВ/г инт.ткань х10'7	% увеличения конц. ЕВ
1	РВ8 + РВ8	6	29,3 ± 1,0	-
2	РВ8 + СТ	6	51,8 ± 1,3	43 (р < 0,001)
3	1гАР + СТ	6	29,6 ± 1,5	0 N8

Результаты, представленные на фиг. 10 и 11, демонстрируют выход азокрасителя (голубого Эванс) в тонкую кишку и в соответствующее сосудистое сплетение из боковых желудочков головного мозга после кишечного заражения холерным энтеротоксином с предварительной обработкой и без обработки крыс пептидом Р1 (ГУСН8КТВ).

Эксперименты осуществляли следующим образом: самцов крыс 8ргадие-ОаМеу весом 350 грамм поддерживали в условиях голодания в течение 18 ч перед экспериментальной процедурой, но со свободным доступом к воде. В каждой группе было по шесть крыс. Пептид Р1, холерный энтеротоксин (СТ), и РВ8 вводили, как показано в таблице 3.

Таблица 3

Группа	ίν инъекция 1*	ро введение *	ίν инъекция 2*
А	Р1	СТ	ЕВ
В	РВ8	СТ	ЕВ
С	РВ8	РВ8	ЕВ

* Внутривенное введение 1 (Р1 ίν) проводили в объеме 2 мл РВ8, пероральное введение проводили в объеме 5 мл, а внутривенное введение 2 проводили с использованием 1,5 мл 3% голубого Эванса, растворенного в РВ8. Для анестезии во время осуществления всех инъекций был использован эфир.

Внутривенную инъекцию Р1 (0,5 мкг) или РВ8 проводили в течение за 10-15 с до перорального заражения 100 микрограммами СТ или РВ8; через 60 мин после перорального заражения; затем крыс анестезировали эфиром и внутривенно вводили голубой Эванс. Для уравновешивания краситель вводили еще через 30 мин, а затем, крыс снова анестезировали эфиром, и посредством интракардиальной перфузии через левый желудочек вводили 250 мл раствора Олсвера в РВ8 (50/50) для удаления всего красителя, присутствующего в сосудистой системе. После этой перфузионной обработки, осуществленной в течение примерно 2-3 мин, проводили флуоресцентный анализ, который указывал на то, что краситель присутствовал лишь вне сосудистой системы.

Головной мозг и часть тонкой кишки были отобраны и заморожены на сухом льду, а затем были получены криостатные срезы толщиной 8 мкм. Эти срезы сушили воздухом и помещали в заливочную среду, содержащую ксилол. Срезы анализировали под флуоресцентным микроскопом 2е155 с использованием комбинации фильтров, идентичной той, что была использована для флуоресценции, испускаемой родамином.

Результаты, представленные на фиг.10 и 11, показали, что интенсивность флуоресценции (белый цвет) имеет одинаковую величину как в тонкой кишке (фиг. 10), так и в сосудистом сплетении (фиг. 11) для группы А (Р1 ίν + СТ ро) и С (РВ8 ίν + РВ8 ро). По сравнению с высокой интенсивностью флуоресценции в тонком кишечнике, а также в сосудистом сплетении в группе В (РВ8 ίν + СТ ро), полученные результаты явно показали, что инъекция октапептида, введенная до заражения токсином, ингибирует СТ-индуцированную сосудистую проницаемость для голубого Эванс. Эти результаты дают основание предположить, что такой вывод справедлив не только в отношении сосудистой системы тонкого кишечника, но также и для сосудистого сплетения бокового желудочка головного мозга.

В заключение следует отметить, что внутривенное введение октапептида ГУСН8КТК. приводит к ингибированию индуцированного холерным эндотоксином экстраваскулярного проникновения голубого Эванс в тонкую кишку, а также в сосудистое сплетение центральной нервной системы. Таким образом, действие гАР и его пептидных производных не ограничивается лишь тонким кишечником, а также распространяется на кровеносные сосуды центральной нервной системы. Этот факт свидетельствует о том, что гАР и его пептидные производные могут быть использованы для нормализации аномального внутричерепного давления, изменения давления в среднем ухе и различных форм изменения проницаемости кровеносных сосудов.

ННРНННХСР8 [1] Уоипд, К..А. апй Вата, К..№. (1983) Ргос. №11. Асай. 8сР И8А. 80, 1194-1198.

[2] 8атЬгоок, 1., РгИксН, Е.Р., МашаЩ, Т. (1989) 5 Мо1еси1аг с1оп1пд: а 1аЬога1огу тапиа1, рр 1.74-1.84, Со1й 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1й 8ргтд НагЬог, Ν.Υ.

[3] Ргоктап. М.А.. ЭикН. М.К.. апб Магйп.

6.В. (1988) Ргос. Ναίΐ. Асаб. 8ск И8А 86. 89989002. 10.

[4] Ьаеттй. и.К. (1970) ХаИие 227.680685.

[5] ΖасЬπккοη. 6.. Ьадегдагб. Т. апб Ебппго111. Ι. (1986) Ас1а ра111. ткгоЬюк ίιηιηιιποί. ксапб. С. 94. 227-231.

[6] С1то1пс/упккг Р.. 8асск1. Ν. (1987) Апа1у1. Вюскет.162. 156-159.

[7] 83π±ιόο1<. 1.. Ргйкск. Е.Р.. Машабк. Т. (1989) Мο1еси1а^ с^пт^: а ΗώοηΙοίΎ тапиа1. рр 7.40-7.42. С.О16 8рпп§ Наг^г ^аЬο^аΐο^у Ргекк. С'о1б 8рпп§ На^г. Ν.Υ.

[8] .ВпшксНе. Е.. Ма1е)ка. 6.Ь. (1992) Ас1а РЬу8ю1. 8сапб. 146.79-86.

[9] Ьапде. 8. (1982) РЕМ8 МкгоЬюк Ьей. 15. 239-242.

[10] Τοπ-ек. 1.Р.. .ВпшксНе. Е.. Ьапде. 8. апб ЬбппгоШ. Ι. (1990) Си! 781-785.

[11] Ьапде. 8.. Эе1Ьго Ό8. ктшксНе Е. Ενапк В1ие регтеа!юп οΓ т!ек!ша1 титока т Не га!. 8сапб 1 Сак1гоеп1его1 1994. 29:38 - 46.

Описание рисунков

Фиг. 1а и его продолжение 1Ь. Нуклеиновокислотная последовательность и выведенная аминокислотная последовательность нового белка человека. Подтвержденная аминокислотная последовательность подчеркнута.

Фиг. 1с. Горизонтальная карта, иллюстрирующая клонированную кДНК и олигонуклеотидные праймеры.

Фиг. 2. ДНС-полиакриламидный минигель, окрашенный кумасси бриллиантовым голубым (A) . и иммуноблот, зондированный с использованием антисыворотки против свиного АР (В). Дорожки, обозначенные цифрами без дефисов, содержат глутатион-агароза-очищенные 68ТАР слитые белки АР-1. АР-2 и АР-3. а линии, обозначенные цифрами с дефисами, содержат слитые белки, расщепленные тромбином. Эталонные молекулярные массы (В). (ВЭН). указаны слева. Слитый белок С8Т-АР-1 подвержен высокой степени разложения, однако, иммуноблот-анализ выявил лишь полноразмерный белок и продукт спонтанного расщепления тромбином. В белке 68Т-АР-3 был обнаружен 26 кДапродукт, который, вероятно, является глутатином-3-трансферазным хвостом, который был экспрессирован независимо.

Фиг. 3а. Вестерн-блот-анализ с использованием антисыворотки против рекомбинантного белка АР-2. Слева - свиной (Р) и три человеческих (Н1. Н2. Н3) гипофиза; справа - три рекомбинантных белка АР-1. АР-2 и АР-3 (см. фиг. 2); а в центре - стандартная молекулярная масса (B) .

Фиг. 3Ь. Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕП8А) гАР с использованием неочищенной антисыворотки и аффинноочищенных антител, продуцированных в кроликах.

Фиг. 4. Авторадиограмма Нозерн-блотов РНК, выделенной из гипофиза человека и свиньи (р = пул, а ι = индивидуальный материал). В каждую лунку было введено 5 мкг очищенной мРНК; были использованы 3'-концевые ³²Рмеченные олигонуклеотидные зонды; авторадиограмму проявляли через 7 дней.

Фиг. 5. Криосрезы аденогипофиза, окрашенного антисывороткой против рекомбинантного белка 68Т-АР-2. А. Срезы, инкубированные с иммунной сывороткой; указаны отдельные клетки с различной степенью позитивной иммунореактивности (заштрихованные стрелки). Многие клетки были совершенно неокрашенными (незаштрихованные стрелки). В. Серийные срезы для А, инкубированных с иммунной сывороткой, предварительно абсорбированной избыточным количеством рекомбинантного белка С8Т-АР-2. Специфического окрашивания клеток не наблюдалось. С и Ό. Более увеличенное изображение иммунопозитивных клеток, демонстрирующее цитоплазматическое окрашивание эндокринных клеток; η = ядро, с = цитоплазма.

Фиг. 6. Тест на биологическую активность рекомбинантного белка АР-1. направленную на ингибирование индуцированной холерным энтеротоксином секреции жидкости. Возрастающие дозы белка инъецировали крысам внутривенно; 3 мкг холерного энтеротоксина инъецировали в кишечную петлю; через 5 ч измеряли количество жидкости, аккумулированной в петле (мг/см кишки). Каждое значение представляло собой среднюю величину + ср.кв.ош. для группы из шести животных.

Фиг. 7. Биологическая активность внутривенно инъецированного гАР; 0.5 мкг гАР вводили за 20-30 сек. или через 90 мин. после введения 3 мкг холерного энтеротоксина в кишечную петлю крысы.

Фиг. 8. Биологическая активность внутривенно инъецированного гАР; 3 мкг гАР вводили за 20-30 с или через 90 мин после введения 3 мкг холерного энтеротоксина в кишечную петлю крысы; гАР инъецировали в область, находящуюся примерно в 5 см от петли, в которую был инъецирован энтеротоксин.

Фиг. 9. А (х 2.5) контрольные (РВ8) петли, где в кишечной полости (Ь) виден клеточный дебрис, однако, остальная слизистая оболочка осталась неокрашенной, что позволяет предположить о полной деструкции эпителиальной выстилки. В (0.5 мкл Р1 до заражения токсином): явно видно четкое изображение эпителиальной выстилки, образующей ворсинки, что позволяет видеть трансформированную и нормальную слизистую оболочку кишки. Ь = кишечная полость. Линии = 500 мкм. С (х 10): показана поврежденная слизистая оболочка РВ8-обработанной контрольной группы; и Ό: показана соответствующая слизистая экспериментальной (Р1-обработанной) группы. Черная стрелка указывает на эпителиальную выстилку, ЬР = собственная пластинка слизистой оболочки, тт = мышечная слизистая оболочка; незаштриховання стрелка указывает на клетки крипта. Линии = 100 мкм. Е (х 25): показана поврежденная слизистая оболочка контрольной (РВ8обработанной) группы, и Р: показана соответствующая увеличенная слизистая крыс, подвергнутых Р1-обработке до заражения токсином. Линии = 50 мкм.

Фиг. 10. Флуоресценция голубого Эванс в образцах тощей кишки, взятых от трех групп крыс, обработанных холерным энтеротоксином (СТ) или контрольным буфером (РВ8); предварительную обработку проводили антисекреторным пептидом Р1 или контрольным буфером (РВ8). ЬР = собственная пластинка слизистой оболочки. Черная стрелка указывает на выстилку эпителиальных клеток; незаштрихованная стрелка указывает на клетки крипта. Линии = 100 мкм.

Фиг. 11. Флуоресценция голубого Эванс в образцах сосудистого сплетения, взятых от крыс, и показанных на фиг. 10. Линии = 50 мкм.

Список последовательностей

8ЕО ΙΌ Νο:1:

Тип последовательности: нуклеотидная с соответствующей аминокислотной последовательностью

Длина последовательности: 1309 пар оснований + ро1у(А)-хвост

Цепочечность: одноцепочечная Топология: линейная

Тип молекулы: кДНК Организм-источник: человек Промежуточный экспериментальный источник: гипофиз

Отличительные признаки: от 63 до 1208 п.о. зрелого белка от 1289 до 1295 п.о. ро1у(А)сигнальной последовательности.

Зедиепсе 1л51лпд

5Ες 10 N0: 1

БЕриЕИСЕ ΤΥΡΕ: Ыис1еоН<1е κίΐίι соггезропсНпд рго^ехп БЕриЕКСЕ ΙΕΝ(ΓΓΗ: 1309 Ьозе рахгз р!из ро!у(А) ίαίΐ

5ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ55: 51пд1е

ТОРОЮСУ: Ιλπϊογ

ΜΟΙ-ΕΟυίΕ ΤΥΡΕ: сОИА

0К1С1МА1 БОиКСЕ 0Κ0ΑΝΙ5Μ: Ьитап

ΙΜΜΕΟΙΑΤΕ ΕΧΡΕΚΙΜΕΝΤΑΙ 50иКСЕ: ΡίΐυίΐΟΓγ дЛапс!

ААПССАССАСПСТТСТТАСССССТСССССЛСЛСССССТССССАСССЛС

СААССТСССААС АТС СТС ПС САА ЛСС АСТ АТС СТС ТСТ СТС САС ААС АСТ 101

РЕАТиКЕЗ: ίτοιη 63 ίο 1208 Ьр тасиге ргоЬехп

Ггот 1289-1295 Ьр ро!у(А) $хдпо1 зериепсе

Мей Ус1 ίβυ С1и Зег ТЬг Ней Уо1 Суз Уо1 Азр Азл 5ег>

5

10

САС

ТАТ

АТС

ССС

ААТ

ССА

САС

ТТС

ПА

ССС

АСС

АСС

СТС

САС

ССС

САС

149

С1и

Туг

Мей

Агд

Азл

С1у

Азр

РЬс

1си

Рго

ТЬг

Агд

ίβυ

С1л

Αία

С1л>

15

20

25

САС

САТ

ССТ

СТС

ААС

АТА

СП

ТСТ

САТ

ТСА

ААС

ЛСС

ССС

АСС

ААС

ССТ

197

си

Азр

ли

Ус1

Азл

11с

Уо1

Суз

ΗΪ3

Зег

1уз

ТЬг

Агд

5сг

Азл

Рго>

30

35

40

45

САС

ААС

ААС

СТС

ССС

СП

АТС

АСА

СТС

ССТ

ААТ

САС

ТСТ

САА

СТС

СТС

245

С1и

Азл

Азл

Уо1С1у

ίου

Нс

ТЫ

1си

А1о

Лзл

Азр

Суз

С1и

ΥαΙ

ίβυ>

50

55

60

АСС

АСА

СТС

АСС

ССА

САС

АСТ

ССС

ССТ

АТС

СТС

ТСС

ААС

СТА

САТ

АСТ

293

ТЬг

ТЬг

ίβυ

ТЬг

Рго

Азр

ТЬг

С1 у Агд

Не

1си

Зег

1уз

1си

ΗΪ5

ТЬг>

65

70

75

СТС

САА

ССС

ААС

ССС

ААС

АТС

АСС

ТТС

тсс

АСС

ССС

АТС

ССС

СТС

ССС

341

Ус1

си

Рго

1уз

С1у

1уз

Ис

ТЬг

РЬс

ТЬг

С1у

Не

Агд

Уо1

А1о>

80

85

90

САТ

СТС

ССТ

СТС

ААС

САС

ССА

САА

ССС

ААС

ААТ

САС

ААС

АТС

ССС

АТС

389

ΚΪ5

Сеи

А1 а

1еи

Н1з

Агд

си

С1у

Суз -Авл

Ыз

Суз

Мей

Агд

Ио

95

100

105

АП

ССС

ПТ

СТС

ССА

АСС

ССА

СТС

САС

САС

АЛТ

САС

ААС

САТ

СТС

СТС

437

Не

А1с

РЬс

Уа1

С1у

Зег

Рго

Уа1

си

Азр Азл

си

1уз

Азр

ίου

Уо1>

129

125 не

115

485

13Θ

140

533

581

165

170

ААС АСС ТТС ААТ ССС ААА САТ ССЛ АСС ССТ ТСТ САТ СТС СТС АСА СТС

Азп ТЬг 1си Αίη С1у 1у$ Αιρ С1у ТЬг С1у Зег Ηίο 1си Уо1 ТЬг Ус1> 160 '

ССТ

ССТ

ССС

ССС

ЛСТ

ТТС

ССТ

САТ

ССТ

СТС

ЛТС

АСТ

ТСТ

ССС

АТТ

ТТС

629

Рго

Рго

С1у

Рго

Зег

1еи

А1о

Азр

ли

ίου

Ис

Зег

Зег

Рго

11с

1си>

175

180

185

ССТ

ССТ

САА

ССТ

ССТ

ССС

АТС

СТС

ССТ

СТТ

ССТ

ССС

АСТ

САС

ПТ

САА

677

А1о

С1у

си

С1у

С1у

А1а

Ней

1си

С1у

ίου

С1у

ли

5сг

Азр

РЬс

С1и>

190

195

200

205

ПТ

ССА

СТА

САТ

ССС

ЛСТ

ССТ

САТ

ССТ

САС

СТС

ССС

ПС

ССС

СП

ССТ

725

РЬс

СТу

Ус1

Азр

Рго

5сг

ли

Азр

Рго

С1и

ίευ

А1а

ίει/

ли

Сси

Агд>

210

215

220

СТА

ТСТ

АТС

САА

слс

САС

ССС

САС

ССЛ

ССА

ССА

ССЛ

ССС

ССС

ССС

ССЛ

773

Ус1

5ег

Мей

С1и

си

си

Лгд

ΗΪ3

ли

С1у

СТу

С1у

Αία

Агд

Лгд

ли>

225

230

235

ССТ

ССА

ССТ

ТСТ

ССТ

ССТ

САС

ССС

ССС

АТТ

ССТ

АСС

АСТ

ССС

АСТ

САА

821

ли

Агд

А1а

Зег

ли

ли

си

ли

С1у

Не

ли

ТЬг

ТЬг

С1у

ТЬг

61 и>

240

245

250

САС

ТСА

САС

САТ

ССС

СТС

СТС

ААС

ЛТС

АСС

АТС

ЛСС

САС

САА

САС

ПТ

869

Азр

Зег

Азр

Азр

Л1а

1еи

ίου

йуз

Мей

ТЬг

Нс

5ег

си

си

си

РЬо

255

260

265

ССС ССС АСТ ССС СП

С1у Агд ТЬг С1у Ьеи 270

ССТ САС СТА Рго Азр 1си 275

АСС АСТ АТС АСТ САС САА САС САС Зег Зег Мей ТЬг С1и С1и С1и С1л>

280 285

917

АП	ССТ	' ТАТ	ССС	АТС	САС	; атс	ТСС СТС СЛС ССА ССА САС ΊΤΪ ССС САС	965
Не	ли	Туг	ли	Мей	си	1 Мей	Зег 1еи С1п С1у ЛИ	1 си рье С1у С1п>
				290				295	. 300
ССС	САА	ТСА	ССА	САС	АП	САТ	ССС АСС	ТСА ССТ АТС	САС АСА ТСТ САС	1013
ли	си	Зег	ли	Азр	Не	Азр	А1а Зег	Зег А1а Ней	Азр ТЬг Зег С1и>
			305				310		315
ССА	ССС	ААС	САС	САС	САТ	САТ	ТАС САС	СТС ЛТС САС	СЛС ССС САС ТТС	1061
Рго	А1а	Суз	С1и	си	Азр	Азр	Туг Азр	Уо1 Мей С1п	Азр Рго С1и РЬо
		320					325		330
СП	САС	АСТ	СТС	СТА	САС	ААС	СТС ССА	ССТ СТС СЛТ	ССС ААС ЛАТ СЛА	1109
Ьси	си	5ег	Уо1	1си	си	Азп	1си Рго	С1у Ус1 Азр	Рго Азп Азп С1и>
335				• 340		345
ССС	АП	ССА	ААТ	ССТ	АТС	ССС	ТСС СТС	ССТ ССС АСС	ССА ССА АСС АСС	1157
А1о	Ис	Агд	Азл	ли	Мей	С1у	Зег 1еи	Рго Рго Лгд	Рго Рго Агд ТЬг>
350				355			360	365

1205

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантный антисекреторный фактор, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1, или его гомолог, обладающий, по существу, аналогичной биологической активностью.
2. 2. Фрагмент рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1, содержащий, по крайней мере, 7-8 аминокислот и обладающий, по существу, аналогичной биологической активностью.
3. 3. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 35-42 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1.
4. 4. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 35-46 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1.
5. 5. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 35-51 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1.
6. 6. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 35-80 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1.
7. 7. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 1-80 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1.
8. 8. Пептид, соответствующий фрагменту рекомбинантного антисекреторного фактора по п. 3 и имеющий аминокислотную последовательность:

   Х₁УСХ₂Х₃КХ₄К, где

   Х₁ отсутствует или представляет собой 11е,

   Х₂ представляет собой Ηίδ, Агд или Ьук,

   Х₃ представляет собой 8ег, Ьеи или другую нейтральную аминокислоту, а

   Х₄ представляет собой ТНг или А1а.
9. 9. Композиция для нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций у животного, в том числе человека, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество рекомбинантного антисекреторного фактора или его гомолога по п. 1 или его фрагмента по пп.2-7.
10. 10. Применение рекомбинантного антисекреторного фактора по п. 1 для приготовления композиции по п.9.
11. 11. Применение рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7 для приготовления композиции по п.9.
12. 12. Способ нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций в организме позвоночного, в том числе человека, заключающийся в том, что животному, в том числе человеку, вводят эффективное количество рекомбинантного анти секреторного фактора или его гомолога по п.1 или его фрагмента по любому из пп.2-7.
13. 13. Пищевой продукт для нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций в организме позвоночного, в том числе человека, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантный антисекреторный фактор или его гомолог по п. 1 или его фрагмент по любому из пп.2-7.
14. 14. Поликлональное антитело, специфичное к рекомбинантному антисекреторному фактору или его гомологу по п. 1 или его фрагменту по любому из пп. 2-7.
15. 15. Применение антитела по п.14 для обнаружения антисекреторного фактора или его гомолога по п. 1 или его фрагмента по любому из пп.2-7 в организме позвоночного, в том числе человека.
16. 16. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомбинантный антисекреторный фактор или его гомолог по п. 1.
17. 17. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фрагмент рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7.
18. 18. Применение последовательности нуклеиновой кислоты по п. 16 для получения рекомбинантного антисекреторного фактора или его гомолога по п. 1.
19. 19. Применение последовательности нуклеиновой кислоты по п.17 для получения фрагмента рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7.
20. 20. Применение последовательности нуклеиновой кислоты по п. 16 для получения зонда или праймера для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антисекреторный фактор или его гомолог по п. 1, в организме позвоночного, в том числе человека.
21. 21. Применение последовательности нуклеиновой кислоты по п. 17 для получения зонда или праймера для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антисекреторного фактора по любому из пп. 2-7.
22. 22. Вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п. 16 или п. 17.
23. 23. Штамм прокариотических клеток, трансформированных вектором по п.20.
24. 24. Штамм эукариотических клеток, за исключением клеток человека, трансформированных вектором по п.20.
25. 25. Штамм прокариотических клеток, способных продуцировать рекомбинантный антисекреторный фактор или его гомолог по п. 1 или фрагмент рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7.
26. 26. Штамм эукариотических клеток, за исключением клеток человека, способных продуцировать рекомбинантный антисекреторный фактор или его гомолог по п.1 или фрагмент рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7.