CN107949392B - 用于生产含高含量af-16的蛋黄的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于生产含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、特别是含极高含量的基本上由如在SEQ.ID.NO.1(AF‑16)和/或SEQ.ID.NO.2(AF‑8)中所示的氨基酸序列组成的AF蛋白质片段的蛋黄的方法，所述方法包括饲喂家禽、诸如母鸡用于家禽的每公斤饲料包含至少0.14％游离色氨酸、诸如1‑2g色氨酸的诱导AF‑16的颗粒饲料至少4周，和此后从所述家禽收集蛋，分离蛋黄与蛋白，和可替选地喷雾干燥、流化床干燥、研磨、沥滤、提取、蒸发、膜过滤和/或冷冻干燥所述蛋黄。本发明还涉及根据本文所述的方法生产的含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质的所述蛋黄及其用于制备治疗和预防如由异常高水平的体液排出导致的异常生理状况的功能性食品和药品的用途。本发明还涉及如此制备的食品和药品。

Description

用于生产含高含量AF-16的蛋黄的方法

技术领域

本发明涉及用于生产含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、特别是含极高含量的基本上由如在SEQ.ID.NO.1(AF-16)和/或SEQ.ID.NO.2(AF-8)中所示的氨基酸序列组成的AF蛋白质片段的蛋黄的方法，所述方法包括饲喂家禽(诸如母鸡)用于家禽的每公斤饲料包含至少0.14％游离色氨酸或至少1g至2g色氨酸的诱导AF-16的颗粒饲料至少12周，和此后从所述家禽收集蛋，分离蛋黄与蛋白，和可替选地喷雾干燥、流化床干燥、研磨、沥滤、提取、蒸发、膜过滤和/或冷冻干燥所述蛋黄。

本发明还涉及根据本文所述的方法生产的含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质及其片段的所述蛋黄，及其用于制备治疗和预防如由异常高水平的体液排出导致的异常生理状况的功能性食品和药品的用途。本发明还涉及如此制备的食品和药品。

定义

蛋白质是由通过肽键连接在一起的氨基酸残基构成的生物大分子。蛋白质，作为氨基酸的线性聚合物，也被称为多肽。通常。蛋白质具有50个至800个氨基酸残基，因此具有在约6,000道尔顿至约数十万道尔顿或更大的范围内的分子量。小蛋白质被称为肽、多肽或寡肽。术语“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”在上下文中可互换使用。肽可具有非常少的氨基酸残基，诸如2个至50个氨基酸残基(aa)之间。

在本申请的上下文中，“药物组合物”是指包含任选地与药物活性赋形剂(诸如载体或媒介物)组合的治疗有效量的抗分泌因子(AF)蛋白质的组合物。所述药物组合物被配制用于适当的施用途径，这取决于患者的情况以及其他因素，诸如年龄或首选的选择。包含抗分泌因子(AF)蛋白质的药物组合物可用作药物递送系统。药物组合物在施用时将活性物质呈现给人或动物的身体。所述药物组合物可以呈例如片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、大便丸剂(stool pills)、凝胶剂、溶液等的形式，但不限于此。

术语“药物活性盐”是指抗分泌因子(AF)蛋白质、肽或多肽、或其同系物和/或片段的盐，该盐可以是基于所谓的霍夫梅斯特序列(Hofmeiser’s series)的衍生自抗分泌因子(AF)蛋白质、肽或多肽、或其同系物和/或片段的任何盐。药物活性盐的其它实例包括三氟乙酸盐、乙酸盐、硫酸盐和氯化物，本发明不限于此。

术语“抗分泌”在上下文中是指抑制或减少分泌和/或流体转移。因此，术语“抗分泌因子(AF)蛋白质”是指能够抑制或减少或者调节体内流体转移以及分泌的一类蛋白质。

在上下文中，“等效活性”涉及抗分泌因子(AF)蛋白质、肽或多肽、或其同系物、衍生物和/或片段的生物效应，即其用于改善疗法和/或治疗胶质母细胞瘤的能力。用于测试和/或测量这种能力的标准化实例在本领域是公知的。

在上下文中，术语“抗分泌因子蛋白质”、“抗分泌因子(AF)蛋白质”、“AF-蛋白质”、AF或其同系物、衍生物或片段可与如在WO 97/08202中所定义的“抗分泌因子”或“抗分泌因子蛋白质”互换使用，且是指具有抗分泌的和/或等效功能的和/或类似的活性的抗分泌因子(AF)蛋白质、或肽、或其同系物、衍生物和/或片段，或是指不改变多肽功能的其修饰。因此，应理解在上下文中“抗分泌因子”、“抗分泌因子蛋白质”、“抗分泌肽”、“抗分泌片段”或“抗分泌因子(AF)蛋白质”也可指代其衍生物、同系物或片段。这些术语在本发明的上下文中可以全部互换使用。此外，在上下文中，术语“抗分泌因子”可被缩写为“AF”。在上下文中抗分泌因子(AF)蛋白质还是指如之前在WO97/08202和WO 00/38535中所定义的具有抗分泌性能的蛋白质。抗分泌因子也公开于例如WO 05/030246中。术语抗分泌因子还意指如SE900028-2和WO 00/38535所公开的富含抗分泌因子的蛋黄中的天生和/或天然的抗分泌因子，如在下文中进一步描述。

在下文，术语“NASP”将用于“天然抗分泌蛋白质”。

术语“ASP”将用于天然抗分泌蛋白质中包括的“抗分泌蛋白质”。

“功能性食品”在上下文中意指具有健康功能、即对人或动物的健康具有有益作用的食品。

PBS：磷酸盐缓冲盐水；

AF：抗分泌因子；

全长AF蛋白质(如在SEQ ID NO:1中所示)；

AF-6：六肽CHSKTR(如在SEQ ID NO:2中所示)；

AF-16：由氨基酸VCHSKTRSNPENNVGL组成的肽(如在SEQ ID NO:3中所示)；

AF-8：七肽VCHSKTR(如在SEQ ID NO:4中所示)；

八肽IVCHSKTR(如在SEQ ID NO:5中所示)；

五肽HSKTR(如在SEQ ID NO:6中所示)；

SPC：经特别处理的谷物；

RTT：用于测量大鼠小肠中的标准化分泌响应的方法，如在SE 9000028-2(公布号466331)中所公开的用于测量AF(ASP)的含量。

背景技术

WO 98/21978公开了具有酶活性的产物用于生产诱导抗分泌因子(AF)蛋白质形成的食物的用途。WO 00/038535进一步公开了像这样的富含天生抗分泌因子(AF)蛋白质的食品。

从瑞典专利SE 9000028-2(公布No.466,331)可知，可通过向动物饲料中添加某些糖、氨基酸和酰胺来刺激抗分泌因子或抗分泌蛋白质(ASP：也被称为FIL)形成。待用于形成感兴趣量的ASP的这些物质的种类和量通过该专利中公开的方法确定。简言之，这种方法涉及测量大鼠小肠中标准化的分泌响应。根据该专利显而易见的是，所形成的经诱导的ASP引导体液分泌到肠中。在所述的专利中，天然抗分泌蛋白质的含量或量是由其对体液分泌到已被霍乱毒素攻击的实验室大鼠的小肠中的影响来定义的。与没有ASP的对照相比，一个ASP单位(FIL单位)对应于肠内体液流量减少50％。抗分泌蛋白质在极少量时仍具有活性，因此，通过它们的作用比通过它们的质量更容易确定它们。

从PCT申请PCT/SE96/01049已知某些抗分泌蛋白质的结构，并且描述它们的活性部分。已经显示通过重组基因工程或固相技术制备并具有确定结构的合成ASP对活体细胞膜上的体液流动具有总体控制影响。

从PCT申请PCT/SE97/01918(WO 98/21978)已知，可以通过食用具有酶活性的某种食物在体内诱导ASP的形成。诱导的效果和由此引起的ASP的形成根据个体和其状况而变化，并且以迄今为止不可预测的强度和诱导期发生。然而，之后可对它们进行测量，并且可以在所述测量的指导下进行必要的校正。

在本发明人根据瑞典专利SE 9000028-2配制饲料以刺激抗分泌蛋白质形成的持续工作中，已知形成的天然抗分泌蛋白质的合成能力和浓度在体内最不均匀分布。极高水平的NASP存在于某些器官、身体部位或体液中，并且特别是存在于禽蛋的蛋黄中。WO008535公开了这个事实，并因此使用了富集NASP的蛋黄。WO008535总体公开了用于治疗和预防由极端体液排出引起的异常生理状况的富含NASP的食品和药品的制备。

发明内容

与之前例如在WO008535中描述的蛋黄相比，本发明首次描述了含更高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质的蛋黄、且特别是含恒定且高含量的具有如在SEQ.ID.NO.1(AF-16)和/或SEQ.ID.NO.2(AF-8)中公开的氨基酸序列的因子(AF)蛋白质片段的蛋黄。本文公开的蛋黄包含至少0.05ng/ml的具有如SEQ.ID.NO.1和/或SEQ.ID.NO.2(AF-8)中公开的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白质片段。蛋黄可呈流体形式或可替选地被喷雾干燥或流化床干燥，并且特征还在于在摄入至少4克所述冷冻干燥的蛋黄之后的60分钟至120分钟之间在有需要的患者中诱导至少0.5个AF单位，其速度至少是通过WO008535中描述的蛋黄诱导的速度的两倍。

根据本发明的蛋黄通常可源自家禽、诸如鸡形目禽(gallinaceous bird)、诸如母鸡的蛋。

根据本发明的蛋黄通过用于生产含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、特别是含极高含量的如在SEQ.ID.NO.1(AF-16)中所示的AF蛋白质片段的蛋黄的方法生产，所述方法包括饲喂家禽(诸如母鸡)用于家禽的包含至少0.4％游离色氨酸的诱导AF-16的颗粒饲料至少12周，和此后从所述家禽收集蛋，分离蛋黄与蛋白，和可替选地喷雾干燥、流化床干燥、研磨、沥滤、提取、蒸发、膜过滤和/或冷冻干燥所述蛋黄。

在一个实施方案中，根据本发明的蛋黄通过用于生产含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、特别是含极高含量的如在SEQ.ID.NO.2(AF-8)中所示的AF蛋白质片段的蛋黄的方法生产，所述方法包括饲喂家禽(诸如母鸡)用于家禽的包含至少0.4％游离色氨酸的诱导AF-8的颗粒饲料至少12周，和此后从所述家禽收集蛋，分离蛋黄与蛋白，和可替选地喷雾干燥、流化床干燥、研磨、沥滤、提取、蒸发、膜过滤和/或冷冻干燥所述蛋黄。

根据本发明的蛋黄通过用于生产含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、特别是含极高含量的如在SEQ.ID.NO.1(AF-16)和/或SEQ.ID.NO.2(AF-8)中所示的AF蛋白质片段的蛋黄的方法生产，所述方法包括饲喂家禽(诸如母鸡)用于家禽的包含至少0.4％游离色氨酸的诱导AF-16和/或AF-8的颗粒饲料至少12周，和此后从所述家禽收集蛋，分离蛋黄与蛋白，和可替选地喷雾干燥、流化床干燥、研磨、沥滤、提取、蒸发、膜过滤和/或冷冻干燥所述蛋黄。

在本发明的一个实施方案中，由根据本发明的方法生产的蛋黄用于医药中。在本发明一个优选的实施方案中，所述蛋黄用于治疗和预防由极端体液排出引起的疾病样状况，其选自疾病组但不限于由以下组成的组：腹泻、炎性疾病、水肿、自身免疫性疾病、癌症、肿瘤、白血病、糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus)、胶质母细胞瘤、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)、帕金森氏病(Parkinsons’Disease)、脑炎和美尼尔氏病(Meniere’s Disease)。

在一个本发明同样优选的实施方案中，所述蛋黄用于优化区室和/或细胞药物摄取以进行神经保护的用途。

本发明还涉及由根据本发明的方法生产的蛋黄用于制备治疗和/或预防由极端体液排出、腹泻、炎性疾病、癌症、胶质母细胞瘤、AD和/或PD引起的疾病样状况的药剂的用途。本发明还涉及由根据本发明的方法生产的蛋黄用于制备优化区室和/或细胞药物摄取和/或神经保护的药剂的用途。

本发明还涉及用于治疗和/或预防由极端体液排出、腹泻、炎性疾病、癌症、胶质母细胞瘤、AD和/或PD引起的疾病样状况的方法，所述方法包括向有需要的对象施用药物有效量的根据本发明的方法生产的蛋黄。本发明还涉及用于优化区室和/或细胞药物摄取和/或用于神经保护的方法，所述方法包括向有需要的对象施用药物有效量的根据本发明的方法生产的蛋黄。

根据本发明的蛋黄可用于制备富含抗分泌因子(AF)蛋白质的功能性食品，诸如饲料、食物和/或食物补充剂。因此，同样公开了包含根据本发明的蛋黄的所述食物、饲料和/或食物补充剂。此类包含根据本发明的蛋黄的食物可选自由以下组成的组：煎饼、煎蛋卷、冰激凌、全熟煮蛋或半熟煮蛋和软饮料、酸奶、食物棒等。

本发明的另一个实施方案涉及包含根据本发明的蛋黄和适合的药物载体的药物组合物。通常，适合的药物载体选自由水、PBS等组成的组。

一个特定的实施方案涉及包含根据本发明的蛋黄的药物组合物，所述药物组合物包含0.00005ng/ml的具有如在SEQ.ID.NO.1中所公开的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白质片段，其特征还在于在有需要的患者中诱导至少0.5个AF-单位。

本发明涉及用于生产含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、特别是含极高含量的基本上由如在SEQ.ID.NO.1(AF-16)和/或SEQ.ID.NO.2(AF-8)中所示的氨基酸序列组成的AF蛋白质片段的蛋黄的方法，所述方法包括饲喂家禽(诸如母鸡)用于家禽的包含至少0.4％的游离色氨酸的诱导AF-16和/或AF-8的颗粒饲料至少12周，和此后从所述家禽收集蛋，分离蛋黄与蛋白，和可替选地喷雾干燥、研磨、沥滤、提取、蒸发、膜过滤、流化床干燥和/或冷冻干燥所述蛋黄。所述家禽通常是鸡形目禽，诸如母鸡。

用于生产根据本发明的蛋黄的方法可以可替选地包括饲喂家禽诱导AF-16和/或AF-8的饲料至少13周或14周，诸如至少15周、16周、17周或18周。

因此，本发明还涉及可用于本文所述的方法中的用于家禽的诱导AF-16和/或AF-8的饲料，其中所述饲料还可包含一定量和比例的氨基酸、糖和酰胺和/或发芽的谷物，使得在食用所述饲料之后在家禽中刺激AF-16和/或AF-8的形成。

在本发明的一个实施方案中，所述用于家禽的诱导AF-16和/或AF-8的饲料包含至少0.14％至1％的游离色氨酸，诸如至少0.7％或至少0.1％的游离色氨酸，并且呈颗粒形式。根据本文所述的方法生产的蛋黄在本发明一个优选的实施方案中的特征还在于其包含至少0.05ng/ml的具有如在SEQ.ID.NO.1中所公开的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白质片段。在另一个实施方案中，根据本文所述的方法生产的蛋黄的特征还在于其包含至少0.05ng/ml的具有如在SEQ.ID.NO.2中所公开的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白质片段。

具体实施方式

蛋黄

根据本文所述的方法生产的蛋黄在本发明一个优选的实施方案中的特征还在于其包含至少0.05ng/ml的具有如在SEQ.ID.NO.1和/或SEQ.ID.NO.2中所公开的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白质片段。

食物和食物补充剂

本发明总体涉及蛋黄用于制备治疗和预防由极端体液排出引起的异常生理状况的富含抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是富含AF-16的功能性食品和药品的用途。

根据另一方面，本发明涉及此类用于制备含抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8的药品和用于特定营养目的的口粮的用途。

在上下文中，表述“食品”意在包括人类使用的食物以及动物使用的饲料。食物可以是产品形式的物品，其制剂包括蛋黄，诸如煎饼、煎蛋卷、冰激凌和各种类型的面包。蛋黄还可以以蛋酒或者全熟煮蛋或半熟煮蛋的形式食用。食物还可以呈面包、饼干、意大利面、谷物和薄片、粥或稀糊的形式，或者可以混合到具有或不具有电解质的各种饮料组合物中，或者含有富含抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8的肉和肉制品、脂肪和脂肪制品或奶和奶制品的食物制剂。可将抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8以几乎纯化的形式混合到食品中。为了符合就适口性和膳食变化而言的要求，可使用技术人员已知的知识以极大的自由度来制备食物制剂。

蛋黄通常起源于可用于人类和动物食用的禽蛋，其包含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8。蛋优选由产蛋母鸡生产，但也可以从例如鸭子、火鸡、鹌鹑和鸵鸟获得。

含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8的食物或饲料包含一定浓度的所述蛋白质或蛋白质片段，使得当食用该食品时其提供所需的对健康有价值的作用。

在一个实施方案中，食用至少4g的根据本发明公开的方法生产的蛋黄在有需要的患者中诱导所述患者血液中至少0.5个AF-单位，即每毫升血液的FIL单位的水平超过0.5个FIL单位/ml血液。健康人通常在血液中具有在0至0.5个FIL单位/ml血液之间的AF-单位水平。

当刺激抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8产生时，已令人惊讶和出乎意料地显示极高水平的抗分泌因子(AF)蛋白质(包括其片段)、诸如特别是AF-16和/或AF-8可在禽蛋中诱导。

药物组合物

在蛋黄中产生的抗分泌因子(AF)蛋白质及其片段、诸如特别是AF-16和/或AF-8可以被浓缩，例如在特定的吸附柱上洗脱、回收和/或浓缩，然后可以施用于动物或人类，分别与饲料或食物混合，或作为几乎分离的产物制备和配制为药品或其它健康服务产品。此类药品以技术人员已知的方式使用可接受的赋形剂(包括载体和稀释剂)制备，并根据预期施用途径配制成固体或液体形式。

本文设想的药物组合物优选配制成口服并经口施用。

根据本发明用于制备富含抗分泌因子(AF)蛋白质和/或其片段、诸如特别是富含AF-16-和/或富含AF-8的食品的用途的另一实施方案，使用由蛋黄本身或完整蛋(可能以加工的形式)与食物或饲料混合。任何加工都可包括研磨、沥滤、提取、蒸发、超滤、干燥和其它标准操作，以获得适用于实际目的的富含抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是富含AF-16和/或富含AF-8的蛋黄产品，以与食物或饲料混合。

通常，抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8以4g至8g喷雾干燥的蛋黄粉的剂量每天施用一次或两次。

对某些状况，可能需要甚至更高剂量的抗分泌因子(AF)蛋白质，诸如特别是AF-16和/或AF-8。在此类情况下，可将从蛋黄分离的抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8添加至任何食品，或者可制备经分离的抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8用于以片剂或混悬剂的形式摄入。

一个特别优选的实施方案包括通过喷雾干燥制备蛋黄粉。此类产品特别适用于各种食品的工业加工中，其中在摄入所讨论的食品之后期望实现抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8的有益效果。蛋黄粉使其本身很好地混合到诸如香肠和冰激凌的极大不同的产品中，从而可能实现膳食品质的深远变化。

在需要通过沥滤或提取制备富集的或浓缩的抗分泌因子(AF)蛋白质、诸如特别是AF-16和/或AF-8产品以用于随后制备例如药物的情况下，蛋黄粉也最适合用作中间体。

由于其分子量相对较低，抗分泌因子(AF)蛋白质且特别是其片段，诸如AF-16和/或AF-8具有相当的热稳定性，因此可以在制备用于食用的抗分泌因子(AF)蛋白质之前已经包含在食物中。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。技术人员通过实验可以容易地确定根据本发明使用的药学上可接受的赋形剂及其最佳浓度的选择。根据本发明使用的药学上可接受的赋形剂包括溶剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、抗氧化剂和稳定剂、乳化剂、助悬剂和/或稀释剂。本发明的药物组合物可根据常规的药物实践配制，例如根据“Remington:The science and practice of pharmacy”，第21版，ISBN 0-7817-4673-6或“Encyclopedia of pharmaceutical technology”，第2版，Swarbrick J.编辑，ISBN：0-8247-2152-7。药学上可接受的赋形剂是对施用组合物的个体基本无害的物质。此类赋形剂通常满足国家卫生部门的要求。官方药典，诸如英国药典(British Pharmacopoeia)、美国药典(United States of America Pharmacopoeia)和欧洲药典(The European Pharmacopoeia)制定了药学上可接受的赋形剂的标准。

以下是根据本发明在药物组合物中任选使用的相关组合物的综述。综述基于特定的施用途径。然而，可以理解的是，在药学上可接受的赋形剂可用于不同的剂型或组合物中的那些情况下，特定药学上可接受的赋形剂的施加不限于特定的剂型或具有赋形剂的特定功能。应该强调的是，本发明不限于使用下面提及的组合物。

胃肠外组合物：

对于全身施加，根据本发明的组合物可含有常规无毒的药学上可接受的载体和赋形剂，包括微球和脂质体。

根据本发明使用的组合物可包括所有种类的固体、半固体和流体组合物。

药学上可接受的赋形剂可包括溶剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、抗氧化剂和稳定剂、乳化剂、助悬剂和/或稀释剂。

根据本发明的药物组合物在一种情况下可以局部施用，或经由静脉内外周输注施用，或经由肌内或皮下注射给予患者施用，或经由颊、肺、鼻、皮肤或经口途径施用。此外，也可能通过手术插入的分流器将药物组合物施用到患者的脑室中。

在一个实施方案中，根据本发明使用的药物组合物经配制用于眼内、局部、鼻内、经口、皮下和/或全身施用。所选择的施用途径将根据待治疗患者的状况和患者的年龄和性别等而变化。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物通过作为用于吸入的混悬剂或甚至更优选粉末剂通过喷雾器、气喷器、吸入器或雾化器经鼻和/或施加至呼吸道来施用。

包含抗分泌因子的粉末剂的施用在稳定性和剂量方面具有额外的优势。根据本发明的药物组合物也可经眼、经鼻、经口、皮下局部施加和/或经由血管全身施用。在一个优选的实施方案中，药物组合物经配制用于静脉内、肌内、局部、经口或经鼻施用。通常，当用于局部施加至眼睛时，本发明组合物的施加浓度为每次施加1μg至1mg，优选50μg-500μg作为每天单次剂量或每天重复数次(多剂量)，但不限于此。

全身施用至血液，剂量在每次施加和每kg体重0.1μg至10mg的范围内、诸如每次施加和每kg体重0.1μg至1mg的范围内、优选1-500μg/kg体重、诸如1-1000μg/kg体重。当根据本发明使用富含抗分泌因子的蛋黄时，该制剂优选经口施用。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是选择为适用于特定目的的任何优选的赋形剂。

抗分泌因子(AF)

抗分泌因子是一类在体内天然存在的蛋白质。抗分泌因子(AF)是一种41kDa的蛋白质，最初被描述为提供针对腹泻疾病和肠道炎症的保护(对于综述，参见Lange和

2001)。抗分泌因子(AF)蛋白质已被测序且其cDNA被克隆。人抗分泌因子AF蛋白质是当从垂体分离时包含382-288氨基酸的41kDa的蛋白质。根据本发明，对于胶质母细胞瘤治疗有益作用而言的活性位点可定位于蛋白质的邻近蛋白质N端的区域内，特别是定位于SEQ ID NO 4的氨基酸1-163处，更具体地是抗分泌因子(AF)蛋白质序列上的氨基酸位置35-50处。AF的生物学作用通过任何包含所述共有序列的至少6个氨基酸的肽或多肽(SEQID NO:3(AF-6))、或其不改变多肽和/或肽的功能的修饰物来产生。

免疫化学和免疫组织化学研究揭示了抗分泌因子(AF)蛋白质存在并且也可以由机体中的大多数组织和器官合成。先前已经描述了包含抗腹泻序列的合成肽(WO 97/08202；WO 05/030246)。

本发明人已经表明，抗分泌因子在某种程度上与蛋白质S5a和Rpn10同源，Rpn10构成了在所有细胞中普遍存在的成分26S蛋白酶体的亚基，更具体地在19S/PA 700帽中。在本发明中，抗分泌因子(AF)蛋白质被定义为具有相同功能性质的一类同源蛋白质。抗分泌因子也与angiocidin高度相似，angiocidin是已知结合血小板反应蛋白-1并与癌症发展相关的另一种蛋白质同种型。

根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白质和/或肽的同系物、衍生物和片段全部具有类似的生物活性。在上下文中，同系物、衍生物和片段包含与天然存在的抗分泌因子(AF)蛋白质的氨基酸对应的至少6个氨基酸(如在SEQ ID NO:2中所示)，其可通过改变一个或多个氨基酸来进一步修饰以优化抗分泌因子的生物活性而不改变多肽和/或肽的基本功能。

衍生物在上下文中意指具有与本文所定义的抗分泌因子等效活性和/或功能等效活性的、直接或通过修饰或部分取代从另一种物质衍生的蛋白质，其中一种或多种氨基酸已被另一种氨基酸取代，该另一种氨基酸可以是修饰的或非天然的氨基酸。例如，根据本发明的抗分泌因子衍生物可以包含N端和/或C端保护基。N端保护基的一个实例包括乙酰基。C端保护基的一个实例包括酰胺。

此外，与根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白质、肽、同系物、衍生物和/或片段的氨基酸序列具有至少70％同一性、诸如至少72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列被认为在本发明的范围内。

确定身份和相似性的方法被编入可公开获得的程序中。确定两条序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J等(1994))BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等(1990))。BLASTX程序可从NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.F.等，Altschul，S.F.等(1990))公开获得。每条序列分析程序都有默认的评分矩阵和默认的空位罚分。一般来说，分子生物学家将被期望使用由所使用的软件程序建立的默认设置。

如本文所定义的抗分泌因子(AF)蛋白质或其具有等效活性的肽或同系物、衍生物和/或片段可包含6个氨基酸或更多个氨基酸，诸如6-16个氨基酸，诸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸或更多个氨基酸。在其它优选的实施方案中，抗分泌因子由42、43、45、46、51、80、128、129或163个氨基酸组成。在优选的实施方案中，根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白质、其同系物、衍生物、肽和/或片段由6、7、8或16个氨基酸组成。

特别地，抗分泌因子(AF)蛋白质是具有如在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的蛋白质，或其包含SEQ ID NO:2的氨基酸37-42的同系物、衍生物和/或片段。

AF-16是具有如在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白质的片段，因此包含SEQ ID NO:2的氨基酸37-42。

医学指征

抗分泌因子(AF)蛋白质，诸如特别是AF-16，已显示对活细胞膜上的体液流动具有普遍的控制作用，因此不仅腹泻状况可被缓解、治愈或预防，而且由生理失衡引起的不适或由极端体液排出引起的疾病样状况，诸如炎症、水肿、关节炎、青光眼和其它体内变化，诸如偏头痛、灼伤和体内和体表的创伤性损伤也可被缓解、治愈或预防。

根据本发明的食品和药品可以用于此类目的。

根据本发明的食品和药品可以用作胶质母细胞瘤治疗的佐剂和/或用于优化药学物质和/或制剂(诸如抗癌药物)的递送和细胞摄取、免疫疗法、放射疗法或至胶质母细胞瘤肿瘤细胞的基因递送。

抗分泌因子(AF)蛋白质和肽之前已经被公开用于使例如在用霍乱毒素攻击后肠和中枢神经系统的脉络丛中的病理性流体转运和/或炎性反应正常化(WO 97/08202)。根据本发明的食品和药品可以用于此类目的。

具有诱导AF的内源性合成或者添加AF的摄取的能力的食物和饲料在WO97/08202中已被建议用于治疗水肿、腹泻、脱水和炎症。根据本发明的食品和药品可以用于此类目的。

抗分泌因子(AF)蛋白质及其片段在治疗与细胞损失和/或增加相关的状况中也已经显示出能够改善神经组织的修复以及干细胞和祖细胞及其衍生细胞的增殖、凋亡、分化和/或迁移(WO 05/030246)，并且在治疗和/或预防眼内高压方面(WO 07/126364)与治疗和/或预防间隔室综合征(WO 07/126363)方面同样有效。根据本发明的食品和药品可以用于此类目的。

而且，本发明人最近指出，AF能够监测和/或有利地影响膜中脂筏、受体和/或小窝的结构、分布和多种功能，因此可用于治疗和/或预防细胞膜中的脂筏和/或小窝的结构性解体和功能障碍(WO 07/126365)。根据本发明的食品和药品可以用于此类目的。

本发明人进一步能够证明相同的抗分泌因子(AF)蛋白质、其肽及片段可以干预跨膜蛋白质的生物活化，例如穿过FAK和CAP的NKCC1，因此它们可以直接调节病理细胞和/或受干扰细胞中的离子通道的病理活性，有效地使所述细胞内的细胞内压和跨膜蛋白功能正常化，从而改善了用于例如癌症疗法中的药物的摄取(WO 2010/093324)。根据本发明的食品和药品可以用于此类目的。

WO 2014/096384公开了抗分泌因子(AF)蛋白质、其肽、同系物和/或片段可以进一步用于胶质母细胞瘤的症状性疗法、治愈性疗法和姑息性疗法。特别地，在胶质母细胞瘤的治疗中，它们可用作佐剂和/或用于优化药物和基因递送，以及化疗、免疫疗法和放射疗法。根据本发明的食品和药品可以用于此类目的。

方法

本发明的一方面涉及用于从禽蛋提供含极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、特别是含极高含量的基本上由如在SEQ.ID.NO.1(AF-16)和/或SEQ.ID.NO.2(AF-8)中所示的氨基酸序列组成的AF蛋白质片段的蛋黄的方法，所述方法包括饲喂家禽(诸如母鸡)用于家禽的包含至少0.14％的游离色氨酸、诸如至少0.4％的游离色氨酸的诱导AF-16和/或AF-8的饲料、优选颗粒饲料至少12周，和此后从所述家禽收集蛋，分离蛋黄与蛋白，和可替选地喷雾干燥、流化床干燥、研磨、沥滤、提取、蒸发、膜过滤和/或冷冻干燥所述蛋黄。

特别地，当用如本文首次所述的用于家禽的诱导AF-16和/或AF-8的颗粒饲料饲喂鸡形目禽至少12周，优选12周至20周，诸如12周至18周，诸如至少12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周或20周时，本发明的方法适用。通过在至少12周期间经由饲料向母鸡提供氨基酸、糖和酰胺的不同组合，可诱导极高水平的抗分泌因子(AF)蛋白质且特别是AF-16和/或AF-8，优选在蛋黄中诱导。

在另一个实施方案中，当用如本文首次所述的用于家禽的诱导AF-16和/或AF-8的颗粒饲料饲喂鸡形目禽至少4周、诸如至少4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周或20周、诸如优选4周至12周时，本发明的方法适用。通过在至少4周期间经由饲料向母鸡提供氨基酸、糖和酰胺的不同组合，可诱导极高水平的抗分泌因子(AF)蛋白质且特别是AF-16和/或AF-8，优选在蛋黄中诱导。

本文获得的极高水平的抗分泌因子(AF)蛋白质且特别是AF-16和/或AF-8，是前所未有的和令人惊讶的。

下面通过以下非限制性实施例来说明本发明。

用于家禽的诱导AF-16和/或AF-8的颗粒饲料

在本文所述的用于从禽蛋提供具有极高含量的抗分泌因子(AF)蛋白质、特别是具有极高含量的基本上由如在SEQ.ID.NO.1(AF-16)和/或SEQ.ID.NO.2(AF-8)中所示的氨基酸序列组成的AF蛋白质片段的蛋黄的方法，所述方法包括饲喂家禽(诸如母鸡)用于家禽的每公斤饲料包含至少0.14％游离色氨酸或1g至2g色氨酸的诱导AF-16和/或AF-8的颗粒饲料至少4周、诸如至少12周。

在本发明的一个实施方案中，所述用于家禽的诱导AF-16和/或AF-8的饲料包含至少0.14％至1％的游离色氨酸，诸如至少0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％的游离色氨酸。

在本发明的一个实施方案中，所述用于家禽的诱导AF-16和/或AF-8的饲料包含至少0.5g的色氨酸(每公斤饲料)，诸如每公斤饲料至少0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3％的色氨酸。

饲料优选呈颗粒形式。术语“颗粒饲料”在上下文中用于描述制成颗粒的浓缩食物。颗粒具有易于处理、无粉尘和浪费以及赋予标准颗粒组成的优点。

在上下文中，术语“饲料”用于描述饲喂给动物的有营养价值的材料。每个物种都有由饲料或饲料原料组成的正常饮食，其适合所述物种的消化道种类且在经济上合理以及营养美味。在牧场的农业动物的饮食是非常可变的，并遭受天然存在的营养缺乏。

一种供应游离色氨酸和其它补充剂和添加剂的方法是制备添加到基本配给中的这些物质的混合物。这些混合物被称为浓缩物或预混物，并且因为它们通常含有高含量的谷类谷物，仅含有谷物的混合物也被称为浓缩物。在上下文中，此类预混物通常包含至少2.5％的游离色氨酸、70％至75％的糖(诸如右旋糖)和25％至30％的基于谷类的基质(例如小麦)。

目前公开的饲料还可以包括牧草饲料，诸如干草、青贮饲料、切碎青草，即任何相对于其它营养素具有高纤维素含量的饲料。

目前公开的饲料还可以包括饲料谷物，诸如用作动物饲料的谷类和其它谷物和豆类，包括小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米、豌豆、油菜、油菜籽、油菜籽粕、大豆粕和高粱。

目前公开的饲料还可包含饲料补充剂，即其本身是饲料原料并且被添加到基础饮食(诸如牧草)以补充其缺乏的营养物质，诸如矿物质和芳香族物质。饲料补充剂通常包括微量元素和常量饲料(macrofeed)，诸如蛋白质补充剂。

参考文献

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7.Lange S,Lonnroth I,Martinsson K.Concentrations of antisecretoryfactor in eggs and in chicken blood plasma.Br Poult Sci 1994；35:615-620.

实验

实验1

使用ELISA和MALDI-MS对

中的AF-16进行的检测和相对定量

方法和材料

的生产，技术方面

通过大鼠结扎袢(ligated loop)测定法体内测定了蛋黄中AF活性的足够的抗分泌浓度后，收集蛋并贮藏在+4℃下。然后将蛋黄与蛋白分离、经巴氏灭菌，之后贮藏在无菌室内，之后在过滤空气室中喷雾干燥。整个过程发生在确保排除蛋白质变性的条件下。在最后一刻，经喷雾干燥的蛋黄被包装在小袋中，每小袋都含有4克蛋黄粉。

可以在室温下容易地溶解于水或果汁中，并且可以优选以菠萝汁施用，这完全消除了蛋的味道。

蛋黄-AF的制备

在连续AF诱导后的

蛋黄以及还有从对照母鸡制备的含低含量的AF的蛋黄溶解(四种蛋黄的汇集物)于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以1000x g离心5min并收集上清液。使用亲和色谱法从蛋黄中纯化AF(Bjorck等，2000)。简而言之，将蛋黄上清液通过3ml琼脂糖柱(Sepharose 6B，GE Healthcare Bio-sciences AB)并在PBS中洗涤后，用1M甲基-a-D-葡糖苷洗脱琼脂糖吸附的AF。将洗脱物在4℃下针对PBS透析24h，然后贮藏在-20℃下直至使用。

蛋黄中AF活性的体内测定

在大鼠中使用霍乱毒素(CT)作为促分泌剂通过结扎袢测定法测定纯化的蛋黄部分的AF活性(1)。因此，介导大鼠空肠袢中CT诱导的流体分泌的50％抑制的AF制剂被指定为“AF-单位”值0.5。先前对人(2)和动物(3)的研究表明，AF值>0.5个AF单位与腹泻分泌减少相关(2)。

AF-16抗体

针对AF肽³⁶-VCHSKTRSNPENNVGL-⁵¹的初级多克隆抗体在兔(aP8)中产生。通过在固相上有机化学合成的方式生产肽，并且下面的抗血清生产由Innovagen AB(Lund，瑞典)进行。

免疫原性AF-16的ELISA测试

采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定蛋黄中AF-16的含量。将亲和纯化的蛋黄样品在Maxisorp微量滴定板(Nunc)中滴定并在4℃下孵育过夜。用PBS中的0.2％牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封闭45min后，用PBS+0.05％吐温20(PBS-T)洗涤板。添加针对AF肽AF-16产生的多克隆抗体aP8(于PBS+0.05％吐温20+0.2％BSA中以1/500稀释)，并将板在室温(RT)下孵育2h。洗涤后，在室温下加入碱性磷酸盐(AP)-缀合的山羊抗兔免疫球蛋白IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)持续1h。洗涤后，将含有1mM MgCl₂的二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中的底物4-硝基苯基磷酸盐(Sigma-Aldrich Sweden AB)加入板，并通过读取405nm处的吸光度显示结合酶。使用兔免疫前血清作为背景，并扣除该值得到净吸光度。

AF-16的MALDI质谱检测

通过基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Mass Spectrometry)(MALDI-MS)检测亲和纯化的蛋黄样品中AF-16肽的相对定量。使用具有30000和10000次令人满意的发射(shot)的2种不同的AutoXecute方法，从用80％激光强度和六角光栅运动在MALDI磨削钢板上沉积的每个样品采集数据。使用HCCA作为基质溶液，并将AF-16的信号强度归一化为基质信号568.2(3HCCA+H)。为了测试该方法，发明人在亲和层析后在蛋黄样品中添加了AF-16的稀释系列，并采用相同的方法收集30000张令人满意的发射。

结果

测试蛋黄的生物活性

在大鼠结扎袢测定法中测试经纯化的蛋黄样品的AF活性。在母鸡摄入刺激高内源性AF产生的饮食期间，每周从蛋中收集蛋黄。表1中的结果表明AF活性增加达饮食摄入14周-15周，此后通过体内测定的方式没有记录到AF活性的进一步增加。在持续摄入刺激AF的饲料18周后最终收集蛋。在这些蛋中，可在以1:1000稀释的蛋黄样品中测定出显著的AF活性(表1)。

表1.在摄入诱导AF的饮食后2-3周、8-9周和14-18周后经纯化的从母鸡收集的蛋黄样品中的AF活性。>0.5AF单位的值与腹泻输出显著降低相关。

测试组	诱导AF的饮食周	N	AF单位平均值±SEM*	测试中的蛋黄稀释
					A	2-3	6	0.2±0.01
B	8-9	6	0.6±0.02
						14-18	8	0.5±0.02	1:1000

显著性：A对B,P＝0.0025

A对C,P＝0.0123

B对C,P＝NS

通过ELISA测试的蛋黄

为了评价不同时间点后AF诱导的作用，用aP8测定AF-16的含量。如图1所示，在诱导达10周后制备的样品中水平较低，在18周后达到大于两倍的增加水平。

图1通过ELISA使用aP8测试经亲和纯化的蛋黄中AF-16的水平。对来自合并的(n＝4)蛋黄的样品进行分析并测定净吸光度。

在经亲和纯化的蛋黄样品中的AF-16肽的相对定量用MALDI-MS进行，如可在图2中所见。两种不同的采集方法(每个样品采集30000和10000次令人满意的发射)呈现类似的结果，并且分别显示从3周至5周、5周至9周和9周至12周的归一化信号强度增加。由于使用HCCA作为基质溶液，将AF-16的信号强度归一化为基质信号568.2(3HCCA+H)。在从3周至12周的样品中观察到的AF-16信号大约两倍增加。

图2从每个样品收集的30000次(红色)和10000次(蓝色)令人满意的激光发射显示在3周至12周范围内的经纯化的蛋黄样品得到的AF-16肽的平均归一化信号强度。

为了评价蛋黄中AF-16肽的相对量，将AF-16肽的稀释系列加入到经亲和层析纯化的蛋黄样品中，并用MALDI分析。结果可在图3中看到。将结果归一化至3个不同的内部质量峰，并且观察到归一化至三个不同的基质信号给出了类似的结果。

图3用MALDI分析蛋黄中AF-16肽的相对量。将结果归一化至3个不同的内部质量峰。根据稀释系列中的归一化信号强度，可以估计蛋黄样品中AF-16肽的相对量在12周后在0.05ng/ml的范围内。

基于稀释系列中的归一化信号强度，可以估计蛋黄样品中AF-16肽的相对量在12周后在0.05ng/ml的范围内。

实验2

抗分泌因子在少于三小时内终止腹泻且无副作用

抗分泌因子(AF)是人类和动物的固有宿主防御系统的一部分。AF与蛋白酶体和蛋白酶体-补体C3复合物组合起作用，从而防止分泌过多和炎症而没有副作用。

AF可以作为蛋黄粉

口服提供。

在患有急性腹泻的巴基斯坦儿童中，先前已经显示

治疗在10小时内减少了排便次数并提高了稠度，而安慰剂组则为18小时。

为了实现更有效的腹泻治疗，生产了比先前制剂具有10²/10³-倍更强抗分泌作用的新批次

(New Salovum)。该批次用于治疗在巴基斯坦拉合尔儿童医院门诊小儿科诊所(Outpatients Paediatric Clinic，Childrens'Hospital，Lahore，Pakistan)所选的患有水样腹泻和中重度脱水的儿童。8名患者接受一小袋(New Salovum)(4克，组1)，而另8名患者接受两小袋(New Salovum)(8克，组2)。

除(New Salovum)的剂量外，所有患者的腹泻管理方案保持一致。其中，自早晨开始的平均排便次数在两组中相似，组1中为15±4.6，组2中为13±4.5，p＝0.429。在(NewSalovum)饮用后，组1记录为在随后的3小时内平均排便4次(减少65％，p<0.001)，而组2中平均排便2.7次(减少68％，p<0.0001)。在两组中，粪便稠度有相似的从最初的水样(8，即100％)到水样(2，即25％)或半固体(6，即75％)的提高。(New Salovum)摄入后，组2中没有患者表现出脱水体征，而组1中有6名(75％)呈现一些体征且两名(25％)呈现严重体征。

在组1中(New Salovum)饮用后的91分钟内以及在组2中68分钟后，观察到排便数减少和稠度提高(p＝0.3302)。没有注意到副作用。

在贫困地区，腹泻发病后不久可例如由乡村护士进行给予New Salovum，优选在疾病发作后不久就开始。这将减少施用更合格的医疗保健的需要。儿童腹泻的New Salovum治疗因此可以导致儿童健康改善、促进生长发育，其以低成本实现并且没有副作用的风险。

表2.患有腹泻病的儿童中New Salovum治疗的剂量响应。其中，组1接受一小袋(4克)和组2接受两小袋(8克)。在前3小时登记期结束时记录对NewSalovum治疗的临床响应，记录在此期间的变化。

表2

___注释：OPD治疗的总持续时间不超过3个小时，在此期间所有送回家的人都报告没有任何状况。

进行T检验和Chisq检验以比较平均值与比例。

*组1中的平均排便次数比较之前和之后是显著的(p<0.0001)

**组2中的平均排便次数比较之前和之后是显著的(p<0.0000)

实验3

用于估计蛋中天然抗分泌蛋白质的方法

将1.75克经干燥的蛋黄粉溶于6.4ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，表示20％的蛋黄干物质。将4ml该溶液加入到6ml的PBS中(50％的原始NASP含量)。将稀释的样品以2000g离心十分钟；将上清液转移到琼脂糖(Sepharose)柱。将吸收的NASP用α-甲基葡糖苷洗脱，并收集1ml含有NASP的洗脱液并透析(产率100％)。本专利申请声明：

如上制备的样品在大鼠肠模型中测试之前稀释500或1000倍。在用霍乱毒素攻击肠之前，静脉内注射稀释样品的1ml等分试样。根据大鼠测试组和对照组的每厘米肠重量计算FIL-单位的数量。

蛋中NASP的含量等于如上测定的结果，并且乘以反比稀释率(inverse diluterate)。

因此，样本中分析的NASP含量等于结果数乘以1000或2000。

Claims (24)

1.一种经喷雾干燥的蛋黄，所述蛋黄包含至少0.05ng/ml的抗分泌因子(AF)蛋白质片段，所述蛋白质片段由如在SEQ.ID.NO.1中所公开的氨基酸序列组成，所述蛋黄是通过包括以下的方法生产的：饲喂家禽用于家禽的诱导AF-16的饲料至少4周，其中，所述用于家禽的诱导AF-16的饲料包含每公斤饲料至少1克至2克色氨酸，所述AF-16是由如在SEQ.ID.NO.1中所公开的氨基酸序列组成的抗分泌因子(AF)蛋白质片段。

2.根据权利要求1所述的蛋黄，其特征还在于，在摄入至少4克所述经喷雾干燥的蛋黄之后的60min至120min之间在有需要的患者中诱导至少0.5个AF-单位。

3.根据权利要求1或2所述的蛋黄，其源自家禽的蛋。

4.根据权利要求3所述的蛋黄，其中，所述蛋黄源自鸡形目禽的蛋，所述鸡形目禽包括母鸡。

5.一种用于生产根据权利要求1-4中任一项所述的蛋黄的方法，所述方法包括：

a.饲喂家禽用于家禽的诱导AF-16的饲料至少4周，和此后

b.从所述家禽收集蛋，

c.分离蛋黄与蛋白，

其中，所述用于家禽的诱导AF-16的饲料包含每公斤饲料至少1克至2克色氨酸，并且其中，所述饲料以颗粒形式提供，

所述AF-16是由如在SEQ.ID.NO.1中所公开的氨基酸序列组成的抗分泌因子(AF)蛋白质片段。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述饲料还包含氨基酸、糖和酰胺，使得在食用所述饲料之后在所述家禽中刺激AF-16的形成。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述饲料还包含发芽谷物，使得在所述家禽中刺激AF-16的形成。

8.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括：

d.研磨、沥滤、提取、蒸发、膜过滤和/或干燥所述蛋黄。

9.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括：冷冻干燥和/或流化床干燥所述蛋黄。

10.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括：

a.饲喂家禽所述用于家禽的诱导AF-16的饲料至少12周。

11.根据权利要求5所述的方法，其中，所述家禽是鸡形目禽，所述鸡形目禽包括母鸡。

12.通过根据权利要求6-10中任一项所述的方法生产的蛋黄。

13.根据权利要求12所述的蛋黄，其中，所述蛋黄包含至少0.05ng/ml的由如在SEQ.ID.NO.1中所公开的氨基酸序列组成的抗分泌因子(AF)蛋白质片段。

14.根据权利要求1-4和12-13中任一项所述的蛋黄用于制备富含抗分泌因子(AF)蛋白质的功能性食品的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述功能性食品包括饲料和/或食物。

16.根据权利要求14所述的用途，其中，所述功能性食品包括食物补充剂。

17.一种功能性食品，包含根据权利要求1-4和12-13中任一项所述的蛋黄。

18.根据权利要求17所述的功能性食品，选自由以下组成的组：煎饼；煎蛋卷；冰激凌；全熟煮蛋或半熟煮蛋；软饮料；酸奶；面包；饼干；意大利面；谷物；薄片；粥；稀糊；及含有肉和肉制品的食物制剂。

19.根据权利要求17所述的功能性食品，选自由以下组成的组：具有或不具有电解质的饮料组合物、及食物棒。

20.根据权利要求17所述的功能性食品，选自含有脂肪和脂肪制品、奶和奶制品的食物制剂。

21.一种药物组合物，包含根据权利要求1-4和12-13中任一项所述的蛋黄和适合的药物载体。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中，所述适合的药物载体选自由水和PBS组成的组。

23.根据权利要求21或22所述的药物组合物，包含0.00005ng/ml的由如在SEQ.ID.NO.1中所公开的氨基酸序列组成的抗分泌因子(AF)蛋白质片段，所述药物组合物的特征还在于，在有需要的患者中诱导至少0.5个AF-单位。

24.根据权利要求1-4和12-13中任一项所述的蛋黄的用于制备有以下用途的医药的用途：用于治疗和/或预防选自由炎症、水肿、腹泻和脱水组成的组的疾病中的任一种。

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