TW202402190A

TW202402190A - 包含源自乳清蛋白的肽的生長促進用組合物

Info

Publication number: TW202402190A
Application number: TW112124962A
Authority: TW
Inventors: 韓企洙; 愼重哲; 金娜里; 安承一; 徐亨周
Original assignee: 南韓商新克萊瑪股份有限公司
Priority date: 2022-07-05
Filing date: 2023-07-04
Publication date: 2024-01-16
Also published as: WO2024010219A1; KR102540497B1

Abstract

本發明涉及包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的生長促進用組合物。在利用本發明的由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的情况下，可以促進生長，可以有效進行乳清蛋白的酶水解産物的質量管理。

Description

包含源自乳清蛋白的肽的生長促進用組合物

本發明通過韓國農林畜産食品部支持下的課題號爲314077033SB010的課題來實現，上述課題的研究管理專業機構爲韓國農林畜産食品技術計劃評估院，研究事業名稱爲“高附加值食品技術開發”，研究課題名稱爲“利用有機奶酪副産品的有機功能材料的開發及應用其的奶粉的開發”，主管機構爲（株）NEO CREMAR公司，研究期間爲2014年12月17日至2017年12月16日。

本申請要求于2022年7月5日提交且申請號爲第10-2022-0082797號的韓國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本申請中

本發明涉及包含源自乳清蛋白的肽的生長促進用組合物。

生長，通常是指身高的增加，通過營養和生長素等得到促進。尤其，分泌生長激素的包括腦在內的神經系統在幼年期顯著生長，然後生長就緩慢下來。長骨的長度生長决定身高和骨胳，通過特殊的機制調節生長。尤其，長骨的骨骺生長板（epiphyseal growth plate）的生長在骨的長度生長過程中爲重要的尺度。

骨的生長在破骨細胞與成骨細胞的作用下實現，若成骨細胞的活性比破骨細胞高，則實現骨的生長。這樣的成骨細胞的分化通過激素、骨形態發生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）等細胞因子、鹼性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）等多種酶來調節。

近來，由于隨經濟增長的營養狀態的改善及飲食習慣的變化，幼兒及青少年的升上發育呈大爲改善的趨勢。幷且，受到偏好高身高的社會氛圍的影響，大部分人對身高的關心日益增加。近來，對促進矮身高幼兒的生長的關心日漸高潮，對生長激素注射劑的關注也日漸增高，但生長激素注射劑的使用困難，具有可能引起肢端肥大症、甲狀腺功能低下等副作用的問題。因此，在摸索與維生素、無機質等營養供應一同通過食品促進生長的方案。

另一方面，乳清爲牛奶的水溶性部分（除酪蛋白以外的部分），是奶酪的組成要素，是包含蛋白質、乳糖、礦物質、維生素、無機化合物等活性成分的副産物。乳清在營養學和生理上都具有很高的價值，可使用在多種食品中。最近的研究結果表明，乳清蛋白有助于大腸癌、肝癌的預防，還有助于血中膽固醇、免疫力以及幼兒的骨生長。乳清中存在的基于牛奶的蛋白質不僅促進成骨細胞的增殖及膠原蛋白的合成，而且還直接作用于成骨細胞來抑制成骨細胞的形成及分化。然而，乳清因其難以消化的結構特性而難以利用，因此正進行著通過使用多種分解酶來克服難以消化的特性的研究。

因此，需要開發易于消化、具有生長促進功能性、能够進行乳清蛋白的酶水解産物的質量管理的肽。

本說明書全文中參照許多論文呢及專利文獻，幷在標注其引用。引用的論文及專利文獻的公開內容的全部作爲參考插入本說明書中，以使本發明所屬技術領域的水平及本發明的內容更爲明確。

發明所欲解决之問題

本發明人經幾番研究努力來開發易于消化、具有生長促進功能性、能够進行乳清蛋白的酶水解産物的質量管理的肽。結果查明由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽具有促進生長的功能性，從而完成本發明。

因此，本發明的目的在于，提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的生長促進用食品組合物。

本發明的再一目的在于，提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的生長促進用藥物組合物。

本發明的另一目的在于，提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物。

本發明的還一目的在于，提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法。

本發明的又一目的在于，提供預防或治療生長障礙的方法，包括向需要治療的對象給藥上述藥物組合物的步驟。

本發明的其他目的及優點將通過下述詳細說明、發明要求保護範圍以及附圖得以進一步明確。

解決問題之技術手段

根據本發明的一實施方式，本發明提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的生長促進用食品組合物。

本發明人經幾番研究努力來開發易于消化、具有生長促進功能性、能够進行乳清蛋白的酶水解産物的質量管理的肽。結果查明包含Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）的肽具有促進生長的功能性。Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）由序列1來表示。

在本發明的一實例中，本發明的食品組合物可以包含含有由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物。

在本發明的一實例中，本發明的乳清蛋白可以源自奶酪乳清。

在本發明的一實例中，本發明的乳清蛋白可以爲普通乳清粉末（Normal whey powder）、脫鹽乳清粉末（Demineralized whey powder）、乳清蛋白濃縮物（Whey protein concentrate）或乳清蛋白分離物（Whey protein isolate）。

在本發明的一實例中，本發明的乳清蛋白水解産物可以爲去除不溶性物質的水溶性乳清蛋白水解産物。

在本發明的一實例中，以乳清蛋白水解産物總重量爲基準，本發明的由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的含量可以爲0.5mg/g至40mg/g。更具體地，以乳清蛋白水解産物總重量爲基準，上述由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的含量可以爲0.5mg/g至40mg/g、0.5mg/g至25mg/g、0.5mg/g至15mg/g、0.5mg/g至10mg/g、0.5mg/g至8mg/g、0.5mg/g至7mg/g、0.5mg/g至6mg/g、1.0mg/g至40mg/g、1.0mg/g至25mg/g、1.0mg/g至15mg/g、1.0mg/g至10mg/g、1.0mg/g至8mg/g、1.0mg/g至7mg/g、1.0mg/g至6mg/g、1.5mg/g至40mg/g、1.5mg/g至25mg/g、1.5mg/g至15mg/g、1.5mg/g至10mg/g、1.5mg/g至8mg/g、1.5mg/g至7mg/g、1.5mg/g至6mg/g、2.0mg/g至40mg/g、2.0mg/g至25mg/g、2.0mg/g至15mg/g、2.0mg/g至10mg/g、2.0mg/g至8mg/g、2.0mg/g至7mg/g、2.0mg/g至6mg/g、3.0mg/g至40mg/g、3.0mg/g至25mg/g、3.0mg/g至15mg/g、3.0mg/g至10mg/g、3.0mg/g至8mg/g、3.0mg/g至7mg/g、3.0mg/g至6mg/g、4.0mg/g至40mg/g、4.0mg/g至25mg/g、4.0mg/g至15mg/g、4.0mg/g至10mg/g、4.0mg/g至8mg/g、4.0mg/g至7mg/g或4.0mg/g至6mg/g。

在本發明的一實例中，本發明的乳清蛋白水解産物可以爲使用源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）一次水解乳清蛋白後，使用源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）二次水解的水解産物。

在本發明的一實例中，上述源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）可以爲鹼性蛋白酶（Alcalase）、複合蛋白酶（Protamex）或它們的混合酶；上述源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）可以爲風味蛋白酶（Flavourzyme）。

在本發明的一實例中，上述混合酶可以爲鹼性蛋白酶（Alcalase）與複合蛋白酶（Protamex）以1∶0.5至1∶2的重量比混合的混合酶。更具體地，上述混合酶可以爲鹼性蛋白酶（Alcalase）與複合蛋白酶（Protamex）以1∶0.5至1∶2、1∶0.5至1∶1.75、1∶0.5至1∶1.5、1∶0.5至1∶1.25、1∶0.5至1∶1、1∶0.75至1∶2、1∶0.75至1∶1.75、1∶0.75至1∶1.5、1∶0.75至1∶1.25、1∶0.75至1∶1、1∶1至1∶2、1∶1至1∶1.75、1∶1至1∶1.5或1∶1至1∶1.25的重量比混合的混合酶。

在本發明的一實例中，上述生長促進可以爲通過骨生長的生長促進。

在本發明的一實例中，上述生長促進可以爲骨生長促進。

在本發明的具體實例中，上述生長促進可通過骨長度或骨體積的生長促進來實現。

本發明的食品組合物可以爲製備爲粉末、顆粒、片劑、膠囊或飲料等形式。例如，由糖果類的各種食品類、飲料、口香糖、茶、維生素複合物或保健輔助食品類等。

本發明的食品組合物包括視頻、保健功能食品（functional food）、營養輔助劑（nutritional supplement）、保健食品（health food）及食品添加劑（food additives）等所有天然材料的加工形態。上述類型的食品組合物可以根據本發明所屬技術領域中公知的通常的方法製備爲多種形態。例如，保健食品可以製備爲茶、果汁及飲劑的形態來飲用，或者顆粒化、膠囊化及粉末化來攝取。幷且，食品可以通過添加本發明的包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽或由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物來製備爲飲料（包括酒精飲料）、水果及其加工食品（例如水果罐頭、瓶裝罐頭、果醬、橘子醬等）、魚類、肉類及其加工食品（例如火腿、香腸、鹹牛肉等）、麵包類及面類（例如烏冬面、蕎麥面、拉麵、意大利面、通心粉等）、果汁、各種飲劑、餅乾、糖稀、乳製品（例如酸奶、發酵乳、黃油、奶酪等）、食用植物油脂、人造黃油、植物蛋白、甑煮食品、冷凍食品、各種調味料（例如大豆醬、醬油、調味醬等）等。幷且，本發明的本發明的由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽或包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物可以爲了用作食品添加劑的形態而製備爲粉末或濃縮液的形態。

本發明的食品組合物可以長期服用。

本發明食品組合物的有效成分的混合量可以根據其使用目的（預防、改善或治療性處置）適當地調節。通常，在製備食品或飲料時，相對于100重量百分比的食品或飲料，可以加入0.1重量百分比至70重量百分比的本發明的乳清水解産物，優選地，可以加入2重量百分比至50重量百分比。上述本發明的肽的有效用量能够以藥物組合物的有效劑量爲准來使用，在以保健及衛生爲目的或以健康調節爲目的來長期攝取的情况下，可以爲上述範圍以下，有效成分在安全方面沒有任何問題，因此也可以使用上述範圍以上的量。

本發明的食品組合物可以包含製備食品時通常加入的成分，例如，包含蛋白質、碳水化合物、脂肪、營養素、調味劑及香味劑。上述碳水化合物的例爲通常的糖及糖醇，上述通常的糖爲單糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麥芽糖、蔗糖、低聚糖等；以及多糖，例如糊精、環糊精等。上述糖醇爲木糖醇、山梨糖醇、赤蘚糖醇等。香味劑可以使用天然香味劑（索馬甜、甜葉菊提取物（例如萊包迪苷A、甘草甜素等））以及合成香味劑（糖精、阿巴斯甜等）。例如，在將本發明的食品組合物製備爲飲劑的情况下，除本發明的由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽或包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物以外，還可以包含檸檬酸、液體果糖、白砂糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、杜仲提取液、大棗提取液、甘草提取液等。

根據本發明的再一實施方式，本發明提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的用于預防或治療生長障礙的藥物組合物。

在本發明的一實例中，上述生長障礙可以爲骨生長障礙。

在本發明的一實例中，上述生長障礙可以選自由家族性身材矮小、體質性生長遲緩、特發性矮身材、骨軟骨發育不良、唐氏綜合徵引起的矮身材、特納綜合徵引起的矮身材、普拉德-威利綜合徵引起的矮身材、羅素銀綜合徵引起的矮身材、努南綜合徵引起的矮身材、慢性全身性疾病引起的矮身材、生長激素缺乏症引起的矮身材、甲狀腺功能低下引起的矮身材矮身材、性早熟引起的矮身材、庫欣綜合徵引起的矮身材以及心理社會性侏儒症組成的疾病中。

除有效成分以外，本發明的藥物組合物包含藥劑學上可接受的載體。本發明的藥物組合物中包含的藥劑學上可接受的載體爲配製時通常使用的載體，包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油等，但不限定于此。除上述成分以外，本發明的藥物組合物還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、乳化劑、助懸劑、保存劑等。適當的藥劑學上可接受的載體及製劑詳細記錄在Remington's Pharmaceutical Sciences（19th ed., 1995）中。

本發明的藥物組合物的適當給藥量可以根據配製方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、疾病狀態、飲食、給藥時間、給藥途徑、代謝速度及反應敏感度等因素來多種多樣地處方。另一方面，優選地，本發明的藥物組合物的給藥量爲一天mg/kg（體重）0.001-1000mg/kg。

本發明的藥物組合物可以口服或胃腸外給藥，在胃腸外給藥的情况下，可以通過皮膚局部塗敷、靜脉內注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、經皮給藥等來給藥。

本發明的藥物組合物根據本發明所屬技術領域的普通技術人員可以輕鬆實施的方法利用藥劑學上可接受的載體和/或賦形劑來配製單位劑量的形式或裝入多劑量容器內來製備。在此情况下，劑型可以爲油或水性溶劑中的溶液、懸混液或乳化液的形態，或者可以爲誒提取劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑的形態，還可以包含分散劑或穩定劑。

根據本發明的還一實施方式，本發明提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物。

在本發明的一實例中，以乳清蛋白水解産物總重量爲基準，上述由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的含量可以爲0.5mg/g至40mg/g。

在本發明的一實例中，上述源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）可以爲鹼性蛋白酶(Alcalase)、複合蛋白酶（Protamex）或它們的混合酶；上述源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）可以爲風味蛋白酶（Flavourzyme）。

根據本發明的另一實施方式，本發明提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法，包括：步驟（a），將乳清蛋白與水混合來溶解上述乳清蛋白；步驟（b），向上述溶解的乳清蛋白溶解物中放入源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）來一次水解；以及步驟（c），向上述一次水解的水解産物放入源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）來進行二次水解。

在本發明的一實例中，在上述步驟（a）中，能够以1∶3至1∶10、1∶3至1∶8、1∶3至1∶6、1∶4至1∶10、1∶4至1∶8、1∶4至1∶6、1∶5至1∶10、1∶5至1∶8、1∶5至1∶6的重量比混合乳清蛋白與水，最具體地，能够以1∶5的重量比混合，但不限定于此。

在本發明的一實例中，在上述步驟（a），可以使用碱將pH調節爲7.0至7.5。

在本發明的一實例中，在上述步驟（b）中，可以向100重量份的上述溶解的乳清蛋白溶解物中放入0.05重量份至1重量份、0.05重量份至0.7重量份、0.05重量份至0.4重量份、0.05重量份至0.2重量份、0.1重量份至1重量份、0.1重量份至0.7重量份、0.1重量份至0.4重量份、0.1重量份至0.2重量份、0.15重量份至1重量份、0.15重量份至0.7重量份、0.15重量份至0.4或0.15重量份至0.2 重量份的源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）來進行一次水解，最具體地，可以放入0.2的重量份的源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）來進行一次水解。

在本發明的一實例中，上述步驟（b）可以在30℃至80℃的溫度條件下進行。更具體地，可以在30℃至80℃、30℃至70℃、30℃至60℃、30℃至55℃、40℃至80℃、40℃至70℃、40℃至60℃、40℃至59℃、40℃至58℃、40℃至57℃、40℃至56℃、40℃至55℃、42℃至60℃、42℃至59℃、42℃至58℃、42℃至57℃、42℃至56℃、42℃至55℃、44℃至60℃、44℃至59℃、44℃至58℃、44℃至57℃、44℃至56℃、44℃至55℃、46℃至60℃、46℃至59℃、46℃至58℃、46℃至57℃、46℃至56℃、46℃至55℃、48℃至60℃、48℃至59℃、48℃至58℃、48℃至57℃、48℃至56℃、48℃至55℃、50℃至80℃、50℃至70℃、50℃至60℃、50℃至59℃、50℃至58℃、50℃至57℃或50℃至56℃的溫度條件下進行，最具體地，可以在50℃至55℃的溫度條件下進行，但不限定于此。

在本發明的一實例中，上述步驟（b）可以進行1小時至24小時的水解。更具體地，可以進行1小時至24小時、1小時至20小時、1小時至15小時、1小時至10小時、1小時至8小時、1小時至6小時、1小時至5小時、1小時至4小時、2小時至24小時、2小時至20小時、2小時至15小時、2小時至10小時、2小時至8小時、2小時至6小時、2小時至5小時、2小時至4小時、3小時至24小時、3小時至20小時、3小時至15小時、3小時至10小時、3小時至8小時、3小時至6小時、3小時至5小時、3小時至4小時、4小時至24小時、4小時至20小時、4小時至15小時、4小時至10小時、4小時至8小時、4小時至6小時或4小時至5小時的水解,最具體地，可以進行4小時的水解，但不限定于此。

在本發明的一實例中，在上述步驟（c）中，可以向上述一次水解的水解物放入0.05重量份至1重量份、0.05重量份至0.7重量份、0.05重量份至0.4重量份、0.05重量份至0.2重量份、0.1重量份至1重量份、0.1重量份至0.7重量份、0.1重量份至0.4重量份、0.1重量份至0.2重量份、0.15重量份至1重量份、0.15重量份至0.7重量份、0.15重量份至0.4或0.15重量份至0.2重量份的源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）來進行二次水解，最具體地，可以放入0.2的重量份的源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）來進行二次水解，但不限定于此。

在本發明的一實例中，上述步驟（c）可以在30℃至80℃的溫度條件下進行。更具體地，可以在30℃至80℃、30℃至70℃、30℃至60℃、30℃至55℃、40℃至80℃、40℃至70℃、40℃至60℃、40℃至59℃、40℃至58℃、40℃至57℃、40℃至56℃、40℃至55℃、42℃至60℃、42℃至59℃、42℃至58℃、42℃至57℃、42℃至56℃、42℃至55℃、44℃至60℃、44℃至59℃、44℃至58℃、44℃至57℃、44℃至56℃、44℃至55℃、46℃至60℃、46℃至59℃、46℃至58℃、46℃至57℃、46℃至56℃、46℃至55℃、48℃至60℃、48℃至59℃、48℃至58℃、48℃至57℃、48℃至56℃、48℃至55℃、50℃至80℃、50℃至70℃、50℃至60℃、50℃至59℃、50℃至58℃、50℃至57℃或50℃至56℃的溫度條件下進行，最具體地，可以在50℃至55℃的溫度條件下進行，但不限定于此。

在本發明的一實例中，在上述步驟（c）中，可以進行1小時至24小時的水解。更具體地，可以進行1小時至24小時、1小時至20小時、1小時至18小時、1小時至16小時、1小時至15小時、5小時至24小時、5小時至20小時、5小時至18小時、5小時至16小時、5小時至15小時、10小時至24小時、10小時至20小時、10小時至18小時、10小時至16小時、10小時至15小時、13小時至24小時、13小時至20小時、13小時至18小時、13小時至16小時、13小時至15小時、14小時至24小時、14小時至20小時、14小時至18小時、14小時至16小時或14小時至15小時的水解，最具體地，可以進行15小時的水解,但不限定于此。

在本發明的一實例中，本發明的包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法可以在上述步驟（c）之後還包括步驟（d），使上述乳清蛋白水解産物滅活幷過濾。更具體地，可以在90℃的溫度下滅活10分鐘幷冷却後，使用外殼過濾器（1μm）過濾。

在本發明的一實例中，本發明的包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽乳清蛋白水解産物的製備方法還可以在上述步驟（c）之後包括步驟（d），對上述乳清蛋白水解産物進行殺菌。更具體地，可以在90℃的溫度下殺菌30分鐘，但不限定于此。幷且，還可以包括殺菌後在室溫下冷却的步驟。

在本發明的一實例中，本發明的包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法還可以在上述步驟（c）之後包括步驟（d），過濾幷乾燥上述乳清蛋白水解産物。更具體地，可以使用80目（mesh）的濾紙過濾後進行噴霧乾燥（溫度條件爲入口（inlet）：190±10℃，出口（outlet）：95±5℃），但不限定于此。幷且，還可以在乾燥的步驟之後包括使用磁棒去除雜質的步驟。

根據本發明的又一實施方式，本發明提供預防或治療生長障礙的方法，包括向需要治療的對象給藥上述藥物組合物的步驟。

在本發明的一實例中，上述生長障礙可以選自由家族性身材矮小、體質性生長遲緩、特發性矮身材、骨軟骨發育不良、唐氏綜合徵引起的矮身材、特納綜合徵引起的矮身材、普拉德-威利綜合徵引起的矮身材、羅素銀綜合徵引起的矮身材、努南綜合徵引起的矮身材、慢性全身性疾病引起的矮身材、生長激素缺乏症引起的矮身材、甲狀腺功能低下引起的矮身材、性早熟引起的矮身材、庫欣綜合徵引起的矮身材以及心理社會性侏儒症組成的疾病中。

本發明的上述對象爲人類、黑猩猩、大猩猩、除人類以外的靈長類、狗、猫、馬、倉鼠、小鼠、大鼠、沙鼠、猪、羊、牛等哺乳動物，最具體地，爲人類，但不限定于此。

本發明的預防或治療生長障礙的方法爲包括給藥本發明的一實施方式的藥物組合物的步驟的方法，爲避免本說明書過多的重複，將省略記載重複的內容。

對照先前技術之功效

本發明提供包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽生長促進用組合物、包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物及其製備方法。本發明的包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的組合物具有生長促進功能性，利用其可以有效進行乳清蛋白的酶水解産物的質量管理。

以下，通過實施例更爲詳細地說明本發明。本發明所屬技術領域的普通技術人員應該自明的是，這些實施例僅用于更爲具體地說明本發明，根據本發明的要旨，本發明的範圍不限定于這些實施例。

在本说明书全文中，除非另有说明，对于用于表示特定物质浓度的“％”而言，固体/固体为(重量/重量)％、固体/液体为(重量/体积)％、另外，液体/液体为(体积/体积)％。

實施例

實施例I．乳清蛋白水解産物的製備及構成氨基酸的測定

本發明的乳清使用向牛奶中加入凝乳酶（rennet），去除凝乳後濃縮的濃縮乳清蛋白（Whey protein concentrate）。以10重量百分比的乳清水溶液爲基準，上述乳清的pH爲5至6。從美國米爾黑文（Millhaven）公司購入乳清分離蛋白（WPI，Whey Protein Isolate）來使用。

將（株）NEO CREMAR公司提供的粉末製品用作乳清蛋白酶水解物。

將以（株）NEO CREMAR公司的標準工序製備的乳清蛋白酶水解物用作試驗分析用試樣。製備工序如圖1所示。

將濃縮乳清蛋白與水以1∶5的重量比混合物，放入碳酸氫鈉（NaHCO ₃）將pH調節爲7.0至7.5。

使用0.2％的鹼性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG，Novo Nordisk公司）和0.2％的複合蛋白酶（Protamex）作爲用于水解的一級水解酶，在50℃至55℃的溫度下水解4小時，使用0.2％的風味蛋白酶作爲二級水解酶，在50℃至55℃的溫度下水解15小時。在90℃的溫度下使水解産物中的酶滅活10分鐘後，冷却至室溫。使用1μm的外殼過濾器過濾水解産物幷在90℃的溫度下殺菌30分鐘後，在入口溫度190±10℃，出口溫度95±5℃的條件下進行噴霧乾燥。使用8000GAUS的磁棒去除噴霧乾燥物的金屬雜質後包裝來用作分析用試樣。

實施例I的乳清蛋白水解産物的構成氨基酸的組成是使用酸水解法分解乳清蛋白水解産物後通過氨基酸自動分析儀測定的。即，準確稱量25mg的乳清蛋白水解産物放入蓋帽管（cap tube）後，加入2.5ml的6N的鹽酸（HCl）後在的110℃溫度下水解24小時。將使用3G-4玻璃過濾器去除未水解物質的濾液使用旋轉真空蒸發器（N-1110，EYELA公司，東京（Tokyo），日本（Japan））在50℃的溫度下完全揮發溶劑後，使用0.01N的鹽酸定容爲25ml後用作氨基酸分析用試樣。氨基酸分析是注入40μl的試樣溶液幷使用氨基酸自動分析儀（Biochrom 30，劍橋（Cambridge），英國（UK））來分析的（表1）。

表1

氨基酸（mg/g）	實施例I	牛乳清蛋白（Bovine Whey protein）	蛋（Egg）	小麥（Wheat）	大豆蛋白（Soybean）
Asp	86.1±2.8	76.6	60.1	30.8	73.1
Thr	56.1±1.6	52.7	32.0	18.3	24.1
Ser	42.8±1.4	37.4	47.8	28.7	32
Glu	144.9±4.5	123.1	79.6	186.6	116.9
Pro	41.1±0.1	45.0	26.0	62.1	34.3
Gly	15.1±0.5	12.6	20.7	24.5	26.1
Ala	39.0±1.1	34.1	17.0	22.6	26.6
Cys	6.9±0.2	17.4	15.2	15.9	8.3
Val	44.7±1.6	44.9	42.8	27.6	30.0
Met	16.9±0.6	15.1	21.0	9.4	7.9
Ile	48.5±1.5	47.6	39.3	20.4	28.4
Leu	85.9±2.6	73.6	55.1	41.7	48.6
Tyr	24.5±0.8	21.4	26.0	18.7	19.6
Phe	28.4±0.8	22.4	35.8	28.2	30.9
His	15.3±1.1	14.4	15.1	16.3	15.8
Lys	72.9±2.8	70.4	43.6	17.9	39.9
NH ₃	11.0±0.4	-	-	-	-
Arg	20.8±0.5	17.5	38.1	28.8	45.2
Trp	10.6±0.4	14.7	9.3	6.8	8.0
Ile+Leu+Val	179.1	166.1	137.2	89.7	107.0
合計（Total）	801.1±24.1	740.9	644.5	605.3	615.7

如表所示，實施例I的乳清蛋白水解産物的總氨基酸含量爲801.1±24.1mg/g，比牛乳清蛋白的74.09g/100g高一些，比蛋、小麥以及大豆蛋白的64.45g/100g、60.53g/100g以及61.57g/100g顯著高（表1）。尤其，促進生長激素分泌的Lys、Tyr等的含量比其他蛋白質高。參照富含Lys、Tyr的乳清蛋白與幼兒生長功能性具有相關性的報告，上述結果表示實施例I的乳清蛋白水解産物比其他蛋白質的水解物在生長功能性上更爲有效。另一方面，Cys的含量稱量較少的原因推斷爲被半胱氨酸（cysteic acid）氧化。

實施例II．乳清蛋白水解産物的比較及生長功能性評估

比較例1

除不使用風味蛋白酶而只使用鹼性蛋白酶以外，以與實施例I相同的方法製備乳清水解産物。即，使用鹼性蛋白酶水解4小時後，重新進行14小時的水解。

比較例2

除使用中性蛋白酶（neutrase）替代風味蛋白酶以外，以與實施例I相同的方法製備乳清水解産物。即，使用鹼性蛋白酶水解4小時後，使用中性蛋白酶水解14小時。

比較例3

除使用木瓜蛋白酶（collupulin）替代風味蛋白酶以外，以與實施例I相同的方法製備乳清水解産物。即，使用鹼性蛋白酶水解4小時後，使用木瓜蛋白酶水解14小時。

比較例4

除使用無花果蛋白酶（ficin）替代風味蛋白酶以外，以與實施例I相同的方法製備乳清水解産物。即，使用鹼性蛋白酶水解4小時後，使用無花果蛋白酶水解14小時。

比較例5

除使用複合蛋白酶（protamex）替代風味蛋白酶以外，以與實施例I相同的方法製備乳清水解産物。即，使用鹼性蛋白酶水解4小時後，使用複合蛋白酶水解4小時。

實驗例1：比較使用不同酶的乳清蛋白水解産物的鹼性磷酸酶活性

分別使用實施例I及比較例1至比較例5的乳清蛋白水解産物處理MC3T3-E1細胞後，測定作爲生長指標的鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）活性。在此情况下，以62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml孔500μg/ml的不同濃度處理試樣。

結果示出實施例I的乳清蛋白水解産物的鹼性磷酸酶活性最高（圖2）。因此，在以下試驗中利用實施例I的乳清水解産物進行試驗。

實驗例2：分析成骨細胞分化相關基因的表達

分別對MC3T3-E1細胞處理12.5mg/ml、25mg/ml及50mg/ml濃度的實施例I的試樣，評估成骨細胞分化相關指標。

結果如成骨細胞分化相關指標的蛋白印迹法（Western blot）（圖3）及基因表達（圖4）所示，處理實施例I的試樣時，在蛋白質水平中確認到鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、骨形態發生蛋白（BMP，Bone morphogenetic protein）、骨唾液酸蛋白（BSP，bone sialoprotein）、鋅指蛋白CONSTANS-LIKE2（COL2，Zinc finger protein CONSTANS-LIKE 2）顯著增加。幷且，在信使核糖核酸水平中，证实随着样品浓度的增加，確認到鹼性磷酸酶(ALP)、骨形態發生蛋白4（BMP-4）及骨唾液酸蛋白(BSP) 的表达显着增加。鋅指蛋白CONSTANS-LIKE1（COL1，Zinc finger protein CONSTANS-LIKE 1）的情况雖然不顯著，但可以確認基因的表達隨濃度的提高而增加。

如上所述，可以確認實施例I的試樣濃度依賴性地給MC3T3-E1細胞的分化及生長帶來影響。

實驗例3：小鼠實驗

從中央動物研究所（首爾，韓國）中獲得3周齡的Sprague-Dawley雄性白鼠。分爲每組由6只小鼠構成的4個組，每三隻小鼠放入一個塑料籠子裏。实验中保持室内温度为24±1℃，大气湿度为60±5％，轻微的光周期（12小时/12小时）。每周檢測兩次體重和食物攝取量。

實驗結果以平均值±標準差來表示。若有需要，則可以爲組間比較進行分散分析（ANOVA），使用社會科學統計軟件包12.0版本（Statistical Package for Social Sciences version 12.0）（SPSS Inc.公司，芝加哥（Chicago），伊利諾伊州（IL）,美國（USA））進行圖基（Tukey）檢驗來調查樣品間的差异。

在適應時間後，將Sprague-Dawley雄性白鼠分爲4組（NOR：正常飲食組；WPC：乳清蛋白飲食療法組（600mg/kg）；WPH-L：實施例I的乳清蛋白水解産物飲食療法組（300mg/kg）；WPH-H：實施例I的乳清蛋白水解産物飲食療法組（600mg/kg））

給共4組的動物每天口服給藥各個試樣4周。而且，每3天測量飼料攝取量、水攝取量、體重以及脛骨長度。4周後，以血液指數和脛骨爲主要指標，在安樂死小鼠後確認乳清蛋白和乳清蛋白水解産物的生長促進效果。

在實驗性治療即將結束時，在安樂死白鼠前禁食12小時。使用二氧化碳安樂死白鼠後，通過相關血管采血來用于激素水平和血液化學分析。在4℃的溫度下以3000rpm的轉速離心分離采集的血液樣品10分鐘。獲得上清液後，分離爲若干等分試樣放入試管中在-80℃的溫度下保管直至用于分析。

使用大鼠（Rat）用胰島素樣生長因子1酶聯免疫吸附測定試劑盒（ELISA kit）（fine test ER0030,武漢菲恩生物科技有限公司（Wuhan Fine Biological Technology Co.））參照製造公司的使用說明書測量血清內胰島素樣生長因子1的水平。通過血清分析儀（Dri-chem 3500i，富士公司（Fuji Photo Co.），大阪（Osaka），日本（Japan））測量血清內甘油三酯（TG）、葡萄糖（Glu）、總膽固醇（TCHO）以及高密度脂蛋白膽固醇（HDL）的含量。通過血清分析儀（Dri-chem 3500i，富士公司，日本）測量總鈣（Ca）和鹼性磷酸酶（ALP）。

通過下述方法評估解剖的脛骨。使用PIXImus濃度計（GE Lunar，麥迪遜（Madison），威斯康星州（WI））掃描脛骨。爲了設備的校準及確認精密度，在收集數據期間每天掃描製造公司提供的樣品（sample），在掃描脛骨前保持室溫。在相同條件下檢查單個動物的所有骨胳。爲了使脛骨獲得相對于左邊骨相似的方向，在製造公司提供的7mm厚度的膠質玻璃（Plexiglas）平臺上手動向空氣中配置。掃描一個樣品所需的時間約爲5分鐘。爲了排除軟件誤選的骨幷單獨分析各個骨，手動調整關節區域來觀察。通過多元綫性回歸分析說明骨的位置。調節算法是灰化前在PIXImus區域內的多個位置上掃描骨的一副來開發的，BMD是通過階梯式多元回歸分析來建模的，最終模型包括灰化後的礦物含量以及在掃描區域內的X軸坐標以及掃描區域的Y軸坐標中重要的獨立變量。距離掃描區域中心的距離不是重要的獨立變量，整體R2值爲0.95，調整X軸與Y軸坐標來獲得的D R2分別爲0.027和0.003。

骨組織及生長板的染色以如下方式進行。首先，切開脛骨後，在4％的多聚甲醛（para-formaldehyde）中固定切開的脛骨48小時後，浸泡在10％的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid）中24小時進行脫鈣（西格瑪公司（Sigma Chemicals Co），美國）。然後，浸泡在30％的蔗糖（sucrose）溶液中兩天來脫水。使用滑動式切片機（sliding-microtome）將各個樣品沿縱方向切割來製備爲40μm厚度的切片。然後，使用甲酚紫（cresyl-violet）在試樣的生長板中染色軟骨細胞。將切片依次浸泡蒸餾水3分鐘，甲酚紫溶液（cresyl-violet solution）5分鐘，50％的乙醇（ethanol）3分鐘，75％的乙醇3分鐘，90％的乙醇3分鐘，100％的乙醇3分鐘以及二甲苯（xylene）10分鐘。用在切片的0.5％的甲酚紫溶液以如下方式製備。從西格瑪公司（Sigma Chemical Co.，聖路易斯（St. Louis），美國）購入甲酚紫。將2.5ng的甲酚紫、300ml的蒸餾水、1M的乙酸鈉（Sodium acetic acid）（13.6g/92ml，30ml）以及1M的乙酸（acetic acid）（170ml的乙酸/170ml的蒸餾水）攪拌7天來使用。生長板高度爲分別對于三個部分使用Image J軟件（美國NIH公司）在每個樣品的三個不同區域測量來計算平均值。

實驗例3-1：評估生長期小鼠的體重、食物攝取量及飲水量

測量實驗組在實驗期間的體重變化、食物攝取量及飲水量。實驗組的白鼠具有相似的平均初期體重。

結果，處理乳清或乳清水解産物的實驗組（WPC、WPH-L及WPH-H）與對照組（NOR）相比，呈體重增加量大的傾向。然而，未觀察到顯著差异。28天后，給藥WPH-H（8.24g/天）的小鼠獲得比對照組（7.21g/天）的小鼠顯著（p＜0.05）更多的加權值。但是，WPC（7.70g/天）與WPH-L（8.09g/天）之間的體重增加沒有顯著差异。食物攝取量和飲水量在4個組之間沒有差异。基于此可以確認乳清蛋白和乳清蛋白水解産物對小鼠的生長有效（表2）。

表2

-	NOR	WPC	WPH-L	WPH-H
體重增加量（g/day）	7.21 ^b±0.63	7.70 ^ab±0.09	8.09 ^a±0.11	8.24 ^a±0.51
食物攝取量（g/day）	19.93 ^ns±0.31	19.91±0.48	19.34±0.32	19.49±0.62
飲水量（Drink volume）（ml/day）	23.86 ^ns±0.10	23.08±1.78	23.67±0.48	24.59±0.85

實驗例3-2：評估器官重量及血清脂質

測量各實驗組的臟器重量及血清脂質。

結果，4個組的腎臟重量與其他組略有不同，但這種差异不顯著。心臟、肝臟、脾臟的重量在4個組之間沒有沒有顯著差异（表3）。在WPC、WPH-L及WPH-H組內未觀察到器官肥大及萎縮等异常變化。通過上述結果可知，口服施予WPC、WPH-L及WPH-H組的食物和水是安全的。測量NOR與實驗組（WPC、WPH-L、WPH-H）的血清脂質數值變化的結果，血清脂質（中性脂肪（甘油三酯）、總膽固醇、高密度脂蛋白（HDL）膽固醇及低密度脂蛋白（LDL）膽固醇）水平在NOR與實驗組（WPC、WPH-L及WPH-H）之間沒有顯著差异（表4）。根據器官重量和血清脂質水平的差异可知乳清蛋白和乳清蛋白水解産物對小鼠沒有毒性。

表3

器官（g）	對照組（Normal）	WPC	WPH-L	WPH-H
心臟	1.2507ns±0.15	1.2800±0.15	1.2539±0.08	1.2601±0.12
肝臟	11.4748ns±0.96	11.8443±0.92	10.8250±0.83	11.5789±0.67
腎臟	2.4160ab±0.16	2.5623a±0.18	2.3087b±0.13	2.5028a±0.19
脾臟	0.7002ns±0.10	0.7299±0.09	0.7709±0.05	0.7396±0.04

表4

指標	對照組（Normal）	WPC	WPH-L	WPH-H
高密度脂蛋白膽固醇（mg/dL）	56.83ns±7.14	53.17±5.34	50.67±5.28	56.83±9.62
總膽固醇（mg/dL）	102.83ns±10.42	93.17±9.45	90.83±11.13	97.83±15.16
甘油三酯（Triglyceride）（mg/dL）	107.33ns±23.91	88.17±22.76	80.00±16.65	90.67±14.62

實驗例3-3：評估血清鈣（Ca）及鹼性磷酸酶(ALP)

測量各實驗組的血清鈣（Ca）及鹼性磷酸酶(ALP)的濃度。

結果，可以確認試樣處理組（WPC：12.67mg/dL，WPH-L：12.73mg/dL，WPH-H：12.20mg/dL）與對照組（NOR）（13.60mg/dL）相比呈血清鈣濃度减少的傾向。試樣處理組的血清內鹼性磷酸酶濃度與對照組（NOR）相比呈升高的傾向，但差异不顯著。雖然鹼性磷酸酶和鈣濃度在觀察時未顯出顯著差异，但判斷乳清蛋白和乳清蛋白水解産物顯出給小鼠的生長帶來有利影響的傾向（表5）。

表5

參數（Parameter）	對照組（Normal）	WPC	WPH-L	WPH-H
鹼性磷酸酶 (ALP) （U/I）	1231.00ns±115.29	1277.67±252.52	1316.33±75.75	1401.33±57.71
鈣（Calcium）（mg/dL）	13.60ns±0.36	12.67±0.06	12.73±0.12	12.20±0.35
葡萄糖（Glucose）（mg/dL）	287.33ns±52.32	255.00±6.93	259.33±16.62	263.33±49.12

實驗例3-4：評估血清內胰島素樣生長因子1水平

血清胰島素樣生長因子1（IGF-I，Serum Insulin like Growth Factor-1）是隨著生長激素的刺激在肝臟及其他器官中合成幷分泌的胰島素生長因子。它在成骨細胞及軟骨細胞中促進生長、分化及基質合成活性。幷且，據報告，胰島素樣生長因子1在長骨的生長和下颌的生長中起到重要作用。

測量各實驗組的血清內胰島素樣生長因子1水平的結果，乳清蛋白給藥組和乳清蛋白水解産物給藥組（WPC：1580.21pg/ml，WPH-L：1658.61pg/ml，WPH-H：1683.28pg/ml）的血清胰島素樣生長因子1比對照組（NOR）（1575.71pg/ml）略高。尤其，判斷乳清蛋白水解産物在胰島素樣生長因子1的分泌中有效（表6，圖5）。圖5以NOR的結果值爲0來示出NOR的結果值與試樣的結果值之間的差异。

表6

鼠胰島素樣生長因子1 （Rat IGF-1）（pg/ml）	NOR	WPC	WPH-L	WPH-H
1575.71ns±123.18	1580.21±79.55	1658.61±107.72	1683.28±92.36

實驗例3-5：脛骨生長及生長板增加

乳清蛋白（WPC）給藥組以600mg/kg/天的量給藥乳清4周。實施例I的乳清蛋白水解産物給藥組中，WPH-L以300mg/kg/天的量給藥實施例I的乳清蛋白水解産物4周，WPH-H組以600mg/kg/天的給藥量給藥實施例I的乳清蛋白水解産物4周。4周後，對于各組的縱方向骨生長增加，評估試樣處理組與對照組NOR在之間的差异。

結果,WPC、WPH-L、WPH-H組的脛骨生長增加至分別爲39.10mm、39.65mm、40.63mm，作爲對照組的NOR組爲38.18mm，具有顯著差异（p＜0.05）。

另一方面，生長板由從休眠區開始增殖及通過肥大化區域擴張的四個單獨的組織學區域構成。生長板高度與身體生長速度相關，因此測量小鼠的生長板高度。

結果可知，與作爲對照組的NOR組相比，WPC、WPH-L、WPH-H組的生長板的高度顯著高（p＜0.05）。WPC、WPH-L及WPH-H組的生長板高度分別爲345.86μm、353.32μm、399.23μm。NOR組的生長板高度爲289.66μm（圖6，表7）。由此確認WPC、WPH-L及WPH-H在小鼠中促進生長板的生長，尤其可知，在以高含量處理實施例I的乳清蛋白水解産物時，顯著促進小鼠的生長板和脛骨的生長。

表7

試樣	生長板的長度（μm）
NOR	289.66 ^c±39.59
WPC	345.86 ^b±32.96
WPH-L	353.32 ^b±30.30
WPH-H	399.23 ^a±21.59

實驗例3-6：骨分析

對于作爲對照組的NOR組、乳清蛋白給藥組（WPC）、實施例I的乳清蛋白水解産物給藥組（WPH-L及WPH-H組），以各組的脛骨爲對象，測量BMC（骨礦物質總量（Total amount of bone mineral））、BMD（平均骨密度（Average of bone density））、骨面積（bone area）、骨體積以及骨長度。BMD爲BMC除以骨面積的值。利用微型計算機斷層掃描（micro-CT）測量骨面積、骨體積及骨長度。

結果，與NOR組相比，WPC、WPH-L及WPH-H組具有顯出BMC的增加的傾向。BMD通常在試樣處理組中表現出與BMC相同的傾向，NOR示出最高的數值。

BMD爲BMC除以骨面積的值，骨面積值在NOR組中最低，因此NOR組的BMD示出最高的數值。WPC、WPH-L、WPH-H組的BMC值分貝爲298.60g、306.13g、317.35g，NOR組的BMC值爲296.55g。BMD的水平分別爲176.58g/cm ²、176.15g/cm ²及179.83g/cm ²，NOR組的BMD水平爲181.25g/cm ²，但沒有顯著差异。

但骨長度（Bone length）在NOR組與試樣給藥組（WPC、WPH-L及WPH-H組）之間具有顯著差异，尤其在WPH-H組中顯出更爲顯著的差异（表8，圖7）。

表8

-	NOR	WPC	WPH-L	WPH-H
BMC（mg）	296.55 ^ns±7.26	298.60±27.72	306.13±24.10	317.35±27.70
BMD（mg/cm ²）	181.25 ^ns±8.78	176.58±8.59	173.00±7.96	183.03±10.02
骨面積（cm ²）	1.59 ^ns±0.07	1.69±0.12	1.74±0.13	1.76±0.05
骨體積（cm ³）	0.18 ^ns±0.00	0.19±0.01	0.19±0.01	0.20±0.02
骨長度（mm）	38.18 ^b±1.00	39.10 ^ab±1.41	39.65 ^ab±1.25	40.63 ^a±0.30

如上所述，可以確認實施例I的乳清蛋白水解産物濃度依賴性地使骨的體積和長度生長。

實施例III：由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的選擇、定量及功能性評估

實驗例4：由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的選擇、定量及含量比較

質量分析和高效液相色譜（High performance liquid chromatography）分析中使用的試劑都使用高效液相色譜級的試劑，此外的試劑使用分析用試劑。試劑製備中使用的水爲雙蒸餾水。

實驗例4-1：由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的選擇

實施例I的乳清蛋白水解産物的肽按照如下方式依次進行離子交換層析、體積排阻色譜、反相色譜來按照步驟進行分離、純化。

離子交換層析

離子交換層析使用安裝有HiLoad 16/10 Q-Sepharose柱的AKTA Purifier系統（GE Healthcare Life Science公司，馬薩諸塞州（MA），美國）來進行。將0.5g的乳清蛋白放入10ml的25mM的Tris-Cl（pH8.0）中溶解後在7500xg的條件下離心分離20分鐘（Supra 22K，Hanil Scientific Ltd公司，金浦（Gimpo），韓國（Korea））來獲得上清液，使用0.45μm的圓筒過濾器過濾後注入2ml（蛋白質含量65mg），使用包含0.6M的氯化鈉（NaCl）的25mM的Tris-Cl（pH8.0）形成濃度梯度後5ml/min的流速洗脫肽。各分離出5ml的洗脫液在280nm和220nm的波長中檢測波峰。濃度梯度條件如表9所示。

表9

步驟	25mM的Tris-Cl（pH8.0），％	0.6M的NaCl-25mM的Tris-Cl（pH8.0）,％	柱體積（Column volume，CV）
清洗（wash）	100	0	2
梯度（gradient）	0	100	20
清潔（clean）	0	100	5
回收（regeneration）	100	0	5

離子交換層析的結果，共獲得7個分離物（圖8）。按照如下方法測定各分離物的細胞活性。使用分化培養基7天來分化爲MC3T3-E1。處理50μm的試樣幷在48小時後使用顯微鏡觀察。在各組的3張照片中各測量最飽滿的10個細胞的長度。結果如圖9及圖10所示，與處理地塞米松（dexamethasone）的誘導對照組（Control）相比，分離物EX-1和分離物EX-4中的肌管細胞厚度（myotube diameter）分別顯著增加19％和17％，可知細胞活性大。

體積排阻色譜

對表現出最大細胞活性的分離物EX-1和分離物EX-4進行體積排阻色譜。體積排阻色譜是使用安裝有Superdex peptide 10/300的AKTA Purifier系統（GE Healthcare Life Science公司，馬薩諸塞州，美國）來進行的。使用旋轉真空蒸發器揮發掉離子交換層析中獲得的活性分離物的溶劑後，將濃縮物溶于高效液相色譜及的誰最終用作試樣。注入試樣的量爲1ml，爲了獲得去除在粒子交換層析中使用的鹽的效果，使用高效液相色譜級的水作爲洗脫溶劑。在0.5ml/min的流速下，使用1柱體積（CV）清洗柱，使用1.5柱體積一邊洗脫肽一邊在280nm和220nm的波長中檢測波峰。

在分離物EX-1中檢測出S9-10、S13、S19和S26（圖11），但S13和S26分離物由于蛋白質含量過低而予廢弃，采取S9-10和S19分離物。從分離物EX-4中分離出S14-15、S16、S19和S20-21（圖12）。對于各分離物，以與離子交換層析中相同的方法通過細胞實驗來測定細胞活性（給肌管細胞厚度帶來的影響）。結果如圖13所示，可知EX/S9-10、EX1/S19、EX4/S16、EX-4/S19分離物在肌管細胞厚度的生長中表現出顯著差异，因此細胞活性大（p＜0.05）。

反相色譜

對體積排阻色譜中獲得的活性分離物EX-1/S9-10、EX-1/S19,、EX-4/S16、EX-4/S19以及EX-4/S20-21進行反相色譜。使用Speed Vac離心機（HyperVAC-MAX，Hanil Scientific Ltd公司，金浦，韓國）以2000rpm轉速使體積排阻色譜中獲得的活性分離物的溶劑完全揮發後，根據肽濃度範圍，溶于100μl～200μl的包含0.1％的三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液中用作反相色譜製備用試樣。反相色譜製備條件如表10所示。

表10

設備（Instrument）	安捷倫1260 Infinity 高效液相色譜系統（Agilent 1260 Infinity hplc system）
柱（column）	Source 5 RPC ST（4.6×150,4.5μm）
溶劑（solvent）	A，0.1％的三氟乙酸（TFA）/2％的乙腈（acetonitrile）； B，0.1％的三氟乙酸/60％的乙腈
梯度（Gradient）
步驟（Step）	時間（Time），分鐘（min）	溶劑A	溶劑B
	0～5（2CV）	100	0
梯度	5～30（10CV）	0	60
洗脫（washing）	30～35（2CV）	0	100
回收	35～45（4CV）	100	0
上樣量（Sample loading）	25μL～50μL
流速（Flow rate）	1mL/min
檢測（Detection）	紫外光（UV）220nm和280nm

從作爲結果來獲得的反相色譜的圖案中製備波峰不重叠而分離良好的波峰，將其用作用于肽的氨基酸序列分析的質量分析用試樣（表11）。

表11 用作質量分析用試樣的反相色譜波峰

EX-1/S9～S10分離物（一次）	Ex-4/S16分離物（一次）
反向分離物	保留時間（Retention time），分鐘	反向分離物	保留時間，分鐘
RPC-5	12.391	RPC-4	11.182
RPC-9	14.859	RPC-5	11.651
RPC-10	15.459	RPC-7	14.267
RPC-12	20.699	RPC-8	14.640
Ex-1/S19分離物（一次）	RPC-10	16.339
RPC-12	17.231	EX-4/S16分離物（二次）
RPC-14	20.685	RPC-2	13.188
-	-	RPC-3	13.771
-	-	RPC-6	15.747
-	-	EX-4/S19分離物（二次）
-	-	RPC-2	13.595

氨基酸序列分析

利用Speed Vac將反相色譜中分離幷回收製備的相同波峰的溶劑完全蒸發後，溶于80％的乙腈中溶解後，重新使用Speed Vac完全蒸發溶劑後乾燥，向乾燥的試樣加入15μl的蒸餾水完全溶解後用作分析用試樣。將15μl的分析用試樣注入安裝有ACQUITY U- HPLC@BEH 130 C18（1.7μm）的超高效液相色譜（U HPLC）系統（Ultimate 3000，賽默飛世爾公司（Thermo Scientific），聖何塞（San Jose），加利福尼亞州（CA），美國），使用0.1％的甲酸（formic acid）/乙腈濃度梯度分離肽後，在連接網絡（on-line）的質量分析儀Triple TOF 5600+系統（AB SCIEX公司，安大略（Ontario），加拿大（Canada））中使用protein pilot（愛博才思公司（AB SCIEX），peak view）軟件來確定肽的氨基酸序列。分析中使用的液相色譜條件和Q-TOF質量分析條件分別如表12、表13所示。

表12 用于質量分析的液相色譜條件

表13 Q-TOF質量分析條件

質量範圍（Mass range）	300m/z～2500m/z
實驗參數（Experiment parameter）	CUR，25；ISVF，3500；GS1，50；TEM，500；GS2，50
質量範圍參數（Mass range parameter）	CE，44；CES，0，DP，80；IDIx，0；IDUx，5；IRD，66,633；IRDx，15000，IRW，24.917；IRWx，10000；IWIx，0；IWUx5；XA1，70.64

將分析的氨基酸序列與Uniport數據庫的牛和牛奶蛋白質（bovine and milk protein）的氨基酸序列比較。乳清蛋白主要的構成蛋白質α-乳白蛋白（α-lactalbumin）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的Uniprot的氨基酸序列如表14所示。

表14 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的氨基酸序列

α-乳白蛋白	1 11 21 31 41 50
MMSFVSLLLV GILFHATQAE QLTKVEVFRE LKDLKGYGGV SLPEWVCTTE
51 61 71 81 91 100
HTSGYDTQAI VQNNDSTEYG LFQINNKIWC KDDHNPHSSN ICNISCDKFL
101 111 121 131 141
DDDLTDDIMC VKKILDKVGI NYWLAHKALC SEKLDQWLCE KL
β-乳球蛋白	1 11 21 31 41 50
MKCLLLALAL TCGAQALIVT QTMKGLDIQK VAGTWYSLAM AASDISLLDA
51 61 71 81 91 100
QSAPLRVYVE ELKPTPEGDL EILLQKWENG ECAQKKIIAE KTKIPAVFKI
101 111 121 131 141 150
DALNENKVLV LDTDYKKYLL FCMENSAEPE QSLACQCLVR TPEVDDEALE
151 161 171 178
KFDKALKALP MHIRLSFNPT QLEEQCHT

肽DKFLD相當于α-乳白蛋白的第97至第101位氨基酸。肽DKFLD在分離物中檢測出，因此推斷可以用作指標物質肽。

實驗例4-2：合成由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽

根據通常的固相合成法在A&pep公司（首爾，韓國）中合成通過氨基酸序列分析確認的由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽，合成的肽DKFLD的分子量和純度分別爲636.71Da和96.76％。

實驗例4-3：定量由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽形成的肽

由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的定量是利用Watchers 120 ODS-BP（4.6mm×250mm，5μm）柱通過Waters2695高效液相色譜系統（Milford公司，馬薩諸塞州，美國）實施的。除分析設備以外的分析條件設置爲相同。未對乳清蛋白水解産物試樣進行單獨的預處理，將0.5g的乳清蛋白水解産物粉末完全溶解在高效液相色譜級蒸餾水中的定容爲10ml後，使用圓筒過濾器過濾通過離心分離（13000rpm，15分鐘（min））獲得的0.45μm的上清液來用作分析用試樣。用于在高效液相色譜系統中定量由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的分析條件如表15所示。

表15 用于測量由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的高效液相色譜分析條件

在相同的高效液相色譜系統中，在10.400分鐘的檢測時間（Retention Time）中檢測出肽DKFLD，乳清蛋白水解産物也以與臨近波峰沒有干涉值的情况下示出可定量形態的分離能力（圖14）。用于高效液相色譜分析的乳清蛋白水解産物的試樣未進行預處理過程。DKFLD的cLog值爲-0.84，溶解度值爲10.7mg/ml，預測爲親水性肽，在正相及反相Sep-Pak固體柱中有被水洗脫的隱患，因此，預想現場應用時節約預處理時間將是有利的，于是省略預處理過程來定量。

測量了由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的製備工序的各步驟中的含量（圖15）。利用測量3個0.5g的lot乳清蛋白水解産物各三次的共測量9個試樣的平均值和標準差來測量。含量爲4.94±0.59mg/g-sample，RSD（％）值爲4.51％，具有5％以內的精確度。

實驗例4-4：比較各不同乳清蛋白水解産物的由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的含量

比較了本發明的乳清蛋白水解産物（實施例I）與其他公司的乳清蛋白水解産物的由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的含量。其他公司的乳清蛋白水解産物使用Arla乳清蛋白水解産物（Arla Foods Ingredients公司，Arla SP-8011，Arla乳清蛋白）、Hilmar（Hilmar Ingredients公司，Hilmar8010）、Murray Goulburn乳清蛋白水解産物（Murray與Goulburn合作開發（Co-operative），韓國專利授權第1311318號的實施例2）。

結果如表16所示，只在本發明的乳清蛋白水解産物中檢測出由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽，其餘的乳清蛋白水解産物中未檢測出由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽，由此可知，只有通過本發明的製備方法才能够生産由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽。

表16

區分	實施例I	Alra	Hilmar	Murray Goulburn
DKFLD含量	2mg/g～10mg/g	未檢出	未檢出	未檢出

實驗例4-5：比較隨著所使用的酶及酶放入方法的由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的含量

爲了作爲有效成分的肽DKFLD（Asp-Lys-Phe-Leu-Asp）的最大收率，嘗試了多種酶處理方法。結果如表17所示，確認到使用作爲內切（endo）酶的鹼性蛋白酶及複合蛋白酶反應4小時作爲一次酶反應後，使用作爲外切（exo）酶的風味蛋白酶（Flavourzyme）反應15小時的收率最好。所有酶都以相對于原料0.2％的含量來放入。

表17

酶處理方法	有效成分（DKFLD）含量
鹼性蛋白酶(Alcalase)、複合蛋白酶(Protamex)4小時風味蛋白酶(Flavourzyme)15小時	2mg/g～10mg/g
風味蛋白酶(Flavourzyme)4小時，鹼性蛋白酶(Alcalase)及複合蛋白酶(Protamex)15小時	1mg/g～5mg/g
鹼性蛋白酶(Alcalase)及複合蛋白酶(Protamex)19小時	未檢出
風味蛋白酶(Flavourzyme)19小時	未檢出
鹼性蛋白酶(Alcalase)、複合蛋白酶(Protamex)、風味蛋白酶(Flavourzyme)19小時	2mg/g～6mg/g

實驗例5：確認由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的生長功能性

骨爲鈣化的堅固表面與稱爲骨髓的內部細胞成分結合的特殊組織。位于骨表面的成骨細胞在細胞膜具有作爲糖蛋白酶的鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP），起到分泌骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein, BSP）等骨基質幷鈣化的作用。

鹼性磷酸酶尤其與成骨細胞的分化過程相關，可以根據該酶的相對活性度來確認成骨細胞的分化階段。即，骨生長活躍地進行時，存在于骨組織的鹼性磷酸酶的活性也增加。

骨組織生長過程中的最後階段爲原始細胞固化的鈣化階段。骨結節（Bone nodule）爲成骨細胞分化中的重要標識因子，可以利用對鈣的吸附力特异性高的茜素（alizarin）來確認。該植物性染料染色鈣化的細胞外基質，染色隨著鈣化程度的進行而加深。

MC3T3-E1細胞爲源自小鼠顱骨（mouse calvaria）的成骨細胞，具有與生物體內發生的增殖、分化、鈣化等相似的特徵，尤其在作爲細胞膜中的糖蛋白的鹼性磷酸酶與骨形成的相關性的研究中有效使用，因此，在實驗中使用該細胞。

實驗例5-1：測定由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的細胞毒性

利用水溶性四唑鹽1法（WST-1 assay）測定細胞毒性。在96孔培養板中培養細胞直至培養液爲100μl/孔（well）。細胞培養24小時後更換培養基，使用不同濃度的樣品處理。樣品處理後培養2小時至4小時，向每孔加入10μl的預混水溶性四唑鹽1（Premix WST-1）幷反應2小時～4小時後，在450nm的波長中測定吸光度。

圖16爲示出由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽的對MC3T3-E1細胞的細胞毒性的柱狀圖。

如圖16所示，沒有細胞存活率比作爲對照組（Control）增殖培養基（Con）减少的試驗組，確認到由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽直至250ppm的濃度沒有細胞毒性。

實驗例5-2：評估隨由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽處理的鹼性磷酸酶活性

在96孔培養板中設定試樣（實施例I）（80μl）孔及標準（120μl）孔。通過二喹啉甲酸（BCA）分析（Bicinchoninic acid assay）加入相同量的試樣，必要時加以稀釋，稀釋使用鹼性磷酸酶分析緩衝液（ALP assay buffer）。向試樣孔80μl中加入20μl的終止溶液（stop solution），標準孔中不加入終止溶液。然後，只向試樣孔80μl中加入50μl的5mM的pNPP溶液，只向標準孔中加入10μl的鹼性磷酸酶溶液（ALP enzyme solution）。在阻斷光綫的狀態下，在37℃的溫度下培養60分鐘。然後，向試樣孔及標準孔中加入20μl的終止溶液來結束反應，在405nm的波長處測定吸光度。

結果如圖17及圖18所示，在第三天及第七天，作爲正常對照組（Normal）的增殖培養基（Nor）與作爲陽性對照組（Control）的分化培養基（Con）都具有顯著差异，因此確認實驗有效，相對于陽性對照組（Con），各試驗組間也表現出活性濃度依賴性地增加，可知從125ppm開始，在p=0.05中，Duncan事後分析時，在統計學上與陽性對照組（Con）具有顯著差异。

因此，可以確認由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽具有促進成骨細胞分化的功能性。

實驗例5-3：分析隨由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽處理的骨鈣化形成度

使用磷酸鹽緩衝溶液（PBS）洗滌（washing）MC3T3-E1細胞兩次後，使用10％的福爾馬林溶液固定細胞30分鐘。抽取（Suction）後使用茜素紅S（Alizarin red S）（pH4.2）染色溶液充分染色。使用蒸餾水洗滌約兩次後，放入包含10％的氯化十六烷吡啶的10mM的磷酸鹽緩衝溶液（10％ cetylpyridinium chloride in 10mm sodium phosphate buffer）（pH 7.0）來洗脫。然後，在550nm的波長處測定吸光度。

結果如圖19及圖20所示，在第三天及第七天，作爲正常對照組（Normal）的增殖培養基（Nor）與作爲陽性對照組（Control）的分化培養基（Con）都具有顯著差异，因此確認實驗有效，相對于陽性對照組（Con），各試驗組間也表現出活性濃度依賴性地增加，可知從62.5ppm開始，在p=0.05中，Duncan事後分析時，在統計學上與陽性對照組（Con）具有顯著差异。

因此，可以確認由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp（DKFLD）組成的肽具有促進骨鈣化進行的功能性。

以上，詳細記述了本發明的特定部分，但本發明所屬技術領域的普通技術人員應該明白的是，上述具體記述僅爲優選實例，本發明的範圍不受這些內容的限制。

無

圖1示出根據酶種類的乳清蛋白水解産物鹼性磷酸酶（ALP）活性。

圖2爲處理實施例I的乳清蛋白水解産物時在蛋白質水平通過蛋白印迹法分析MC3T3-E1中成骨細胞分化相關基因的表達的結果。

圖3示出處理實施例I的乳清蛋白水解産物時MC3T3-E1細胞內成骨細胞分化相關基因的信使核糖核酸（mRNA）的表達程度。

圖4示出乳清蛋白水解産物給胰島素樣生長因子1（Insulin like Growth Factor-1，IGF-1）的分泌帶來的影響。

圖5示出作爲對照組的NOR組與試樣處理組之間的生長板長度差异。

圖6示出乳清蛋白水解産物給脛骨生長帶來的影響。

圖7示出在Q-Sepharose HiLOad 16/10柱中進行的離子交換色譜圖（7個分離物，Ex-1至Ex-7）。

圖8示出本發明的乳清蛋白水解産物的製備工序。

圖9示出乳清蛋白水解産物離子交換層析分離物的細胞活性。

圖10示出與對照組相比的離子交換層析分離物的肌管細胞厚度生長效果。

圖11示出EX-1分離物的體積排阻色譜（紅色：在220nm中檢測出，藍色：在280nm處檢測出）。

圖12示出EX-4分離物的體積排阻色譜（紅色：在220nm中檢測出，藍色：在280nm處檢測出）。

圖13示出與對照組相比的體積排阻色譜分離物的肌管細胞厚度生長效果。

圖14示出在高效液相色譜（HPLC）系統中的肽DKFLD與乳清蛋白水解産物的反相色譜圖。

圖15示出製備工序的不同步驟中的DKFLD的含量。

圖16爲示出由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽對MC3T3-E1細胞的細胞毒性的柱狀圖。

圖17爲示出處理由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽第三天的鹼性磷酸酶活性的柱狀圖。

圖18爲示出處理由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽第七天的鹼性磷酸酶活性的柱狀圖。

圖19爲示出處理由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽第三天的骨鈣化程度的柱狀圖。

圖20爲示出處理由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽第七天的骨鈣化程度的柱狀圖。

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Claims

一種生長促進用食品組合物，其中，包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽。
如請求項1之生長促進用食品組合物，其中，上述食品組合物包含含有由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物。
如請求項2之生長促進用食品組合物，其中，以乳清蛋白水解産物總重量爲基準，上述肽的含量爲0.5mg/g至40mg/g。
如請求項2之生長促進用食品組合物，其中，上述乳清蛋白水解産物爲使用源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）一次水解乳清蛋白後，使用源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）二次水解的水解産物。
如請求項4之生長促進用食品組合物，其中，上述源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）爲鹼性蛋白酶（Alcalase）、複合蛋白酶（Protamex）或它們的混合酶；上述源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）爲風味蛋白酶（Flavourzyme）。
如請求項5之生長促進用食品組合物，其中，上述混合酶爲鹼性蛋白酶（Alcalase）與複合蛋白酶（Protamex）以1∶0.5至1∶2的重量比混合的混合酶。
如請求項1之生長促進用食品組合物，其中，上述生長促進通過骨長度或骨體積的生長促進來實現。
一種用于預防或治療生長障礙的藥物組合物，其中，包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽。
一種乳清蛋白水解産物，其中，包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽。
如請求項9之乳清蛋白水解産物，其中，以乳清蛋白水解産物總重量爲基準，上述肽的含量爲0.5mg/g至40mg/g。
一種包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法，其中，包括：步驟（a），將乳清蛋白與水混合來溶解上述乳清蛋白；步驟（b），向上述溶解的乳清蛋白溶解物中放入源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）來一次水解；以及步驟（c），向上述一次水解的水解産物放入源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）來進行二次水解。
如請求項11之包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法，其中，在上述步驟（c）之後還包括步驟（d-1），對上述乳清蛋白水解産物進行殺菌。
如請求項11之包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法，其中，在上述步驟（c）之後還包括步驟（d-2），過濾幷乾燥上述乳清蛋白水解産物。
如請求項11之包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法，其中，上述源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的內切蛋白酶（Endo protease）爲鹼性蛋白酶（Alcalase）、複合蛋白酶（Protamex）或它們的混合酶；上述源自米曲黴菌（Aspergillus oryzae）的外切蛋白酶（Exo protease）爲風味蛋白酶。
如請求項14之包含由Asp-Lys-Phe-Leu-Asp組成的肽的乳清蛋白水解産物的製備方法，其中，上述混合酶爲鹼性蛋白酶（Alcalase）與複合蛋白酶（Protamex）以1∶0.5至1∶2的重量比混合的混合酶。