KR102540497B1 - 유청단백질 유래 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 조성물 - Google Patents

유청단백질 유래 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 이용하는 경우, 성장이 촉진되며, 유청단백 효소가수분해물의 효율적인 품질관리가 가능하다.

Description

유청단백질 유래 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 조성물{Composition for Promoting Growth Comprising Peptide from Whey Protein}
본 발명은 유청단백질 유래 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다.
성장이란 일반적으로 신장의 증가를 말하며, 영양과 성장호르몬 등에 의하여 촉진된다. 특히, 성장호르몬을 분비하는 뇌를 포함한 신경계는 유년기에 현저하게 성장하고, 그 후는 성장이 완만해진다. 장골의 길이 성장은 신장과 골격을 결정지으며, 특별한 기작에 의해 성장이 조절된다. 특히 장골의 근위부 성장판(epiphyseal growth plate)의 성장이 골의 길이 성장 과정에 있어 중요한 척도가 된다.
골 성장은 파골세포와 조골세포의 작용에 의해 이루어지며, 조골세포의 활성이 파골세포보다 높은 경우 골성장이 이루어진다. 이러한 조골세포의 분화는 호르몬, 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP)과 같은 사이토카인, 알칼라인 포스파테이스(Alkaline phosphatase, ALP)와 같은 다양한 효소에 의해 조절된다.
최근 경제 성장으로 인한 영양상태 개선 및 식습관의 변화로 소아 및 청소년의 성장발육이 크게 개선되는 추세이다. 또한 큰 키를 선호하는 사회적 분위기로 인해 대부분 사람들이 성장에 대해 관심이 증가하는 추세이다. 최근 저신장 아이들의 성장을 촉진시키기 위한 관심이 고조되면서, 성장호르몬 주사제에 대한 관심이 높아지고 있으나, 이는 복용이 어렵고, 말단비대증, 갑상선 기능저하증 등의 부작용을 일으킬 수 있는 문제가 있다. 따라서, 비타민, 무기질 등의 영양공급과 함께 식품을 통하여 성장을 촉진하는 방안이 모색되고 있다.
한편, 유청은 우유의 수용성 부분(카제인 이외의 부분)으로, 치즈의 구성 요소이며 단백질, 유당, 미네랄, 비타민, 무기 화합물과 같은 활성 성분을 포함하는 부산물이다. 유청은 영양학적으로나 생리적으로 높은 가치를 지니며, 다양한 식품에 사용될 수 있다. 최근의 연구에서 유청 단백질은 대장암, 간암 예방과 혈중 콜레스테롤, 면역력, 그리고 어린이의 뼈 성장에 도움을 줄 수 있다는 연구결과가 있다. 유청에 존재하는 우유 기반 단백질은 골아세포의 증식 및 콜라겐 합성을 촉진할 뿐만 아니라 골아세포에 직접 작용하여 골아세포의 형성 및 분화를 억제한다. 그러나 유청은 소화가 어려운 구조적 특성으로 인해 활용이 어려우며, 다양한 분해 효소를 사용하여 소화가 어려운 특성을 극복하기 위한 연구가 수행되고 있다.
따라서, 소화가 잘 되며, 성장 촉진 기능성을 갖고, 유청단백 효소가수분해물의 품질관리를 가능하게 하는 펩타이드의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1863328호 (2018.05.25. 등록)
본 발명자들은 소화가 잘 되며, 성장 촉진 기능성을 갖고, 유청단백 효소가수분해물의 품질관리를 가능하게 하는 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드가 성장을 촉진하는 기능성이 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드로서 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드로서 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 소화가 잘 되며, 성장 촉진 기능성을 갖고, 유청단백 효소가수분해물의 품질관리를 가능하게 하는 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)를 포함하는 펩타이드가 성장을 촉진하는 기능성이 있음을 규명하였다. Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)는 서열번호 1에 나타내었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 식품 조성물은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유청단백은 치즈 유청으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유청단백은 일반유청분말(Normal whey powder), 탈염유청분말(Demineralized whey powder), 유청단백 농축물(Whey protein concentrate) 또는 유청단백 분리물(Whey protein isolate)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유청단백 가수분해물은 불용성 물질이 제거된 수용성 유청단백 가수분해물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드의 함량은 유청단백 가수분해물 총 중량을 기준으로 0.5 mg/g 내지 40 mg/g인 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드의 함량은 유청단백 가수분해물 총 중량을 기준으로 0.5 mg/g 내지 40 mg/g, 0.5 mg/g 내지 25 mg/g, 0.5 mg/g 내지 15 mg/g, 0.5 mg/g 내지 10 mg/g, 0.5 mg/g 내지 8 mg/g, 0.5 mg/g 내지 7 mg/g, 0.5 mg/g 내지 6 mg/g, 1.0 mg/g 내지 40 mg/g, 1.0 mg/g 내지 25 mg/g, 1.0 mg/g 내지 15 mg/g, 1.0 mg/g 내지 10 mg/g, 1.0 mg/g 내지 8 mg/g, 1.0 mg/g 내지 7 mg/g, 1.0 mg/g 내지 6 mg/g, 1.5 mg/g 내지 40 mg/g, 1.5 mg/g 내지 25 mg/g, 1.5 mg/g 내지 15 mg/g, 1.5 mg/g 내지 10 mg/g, 1.5 mg/g 내지 8 mg/g, 1.5 mg/g 내지 7 mg/g, 1.5 mg/g 내지 6 mg/g, 2.0 mg/g 내지 40 mg/g, 2.0 mg/g 내지 25 mg/g, 2.0 mg/g 내지 15 mg/g, 2.0 mg/g 내지 10 mg/g, 2.0 mg/g 내지 8 mg/g, 2.0 mg/g 내지 7 mg/g, 2.0 mg/g 내지 6 mg/g, 3.0 mg/g 내지 40 mg/g, 3.0 mg/g 내지 25 mg/g, 3.0 mg/g 내지 15 mg/g, 3.0 mg/g 내지 10 mg/g, 3.0 mg/g 내지 8 mg/g, 3.0 mg/g 내지 7 mg/g, 3.0 mg/g 내지 6 mg/g, 4.0 mg/g 내지 40 mg/g, 4.0 mg/g 내지 25 mg/g, 4.0 mg/g 내지 15 mg/g, 4.0 mg/g 내지 10 mg/g, 4.0 mg/g 내지 8 mg/g, 4.0 mg/g 내지 7 mg/g, 또는 4.0 mg/g 내지 6 mg/g인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유청단백 가수분해물은 유청단백을 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테이스(Endo protease)로 1차 가수분해하고, 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테이스(Exo protease)로 2차 가수분해한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테이스(Endo protease)는 알칼레이스(Alcalase), 프로타맥스(Protamex), 또는 이들의 혼합효소이고; 상기 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테이스(Exo protease)는 플라보자임(Flavourzyme)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 혼합효소는 알칼레이스(Alcalase)와 프로타맥스(Protamex)가 1:0.5 내지 1:2의 중량비로 혼합된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 혼합효소는 알칼레이스(Alcalase)와 프로타맥스(Protamex)가 1:0.5 내지 1:2, 1:0.5 내지 1:1.75, 1:0.5 내지 1:1.5, 1:0.5 내지 1:1.25, 1:0.5 내지 1:1, 1:0.75 내지 1:2, 1:0.75 내지 1:1.75, 1:0.75 내지 1:1.5, 1:0.75 내지 1:1.25, 1:0.75 내지 1:1, 1:1 내지 1:2, 1:1 내지 1:1.75, 1:1 내지 1:1.5, 또는 1:1 내지 1:1.25의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 성장 촉진은 골 길이 또는 골 부피의 성장 촉진에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등의 형태로 제조될 수 있다. 예컨대 캔디류의 각종　식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조　식품류 등이 있다.
본 발명의　식품조성물은　식품, 기능성　식품　(functional food), 영양보조제 (nutritional supplement), 건강식품　(health food) 및　식품　첨가제 (food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의　식품　조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한,　식품으로는 음료 (알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품　(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품　(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 요거트, 발효유, 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트　식품, 냉동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장, 소스 등) 등 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드 또는 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물을 첨가하여 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드 또는 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물을　식품　첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의　식품　조성물은 장기 복용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 유청 가수분해물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량%에 대하여 0.1 내지 70 중량%, 바람직하게는 2 내지 50 중량%로 첨가될 수 있다. 상기 본 발명의 펩타이드의 유효용량은 약제학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의　식품　조성물은　식품　제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수있다. 예컨대 본 발명의　식품　조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드 또는 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 성장 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 성장 장애는 가족성 저신장, 체질적 성장 지연, 특발성 저신장, 골연골 이형성증, 다운 증후군에 의한 저신장, 터너 증후군에 의한 저신장, 프레더-윌리 증후군에 의한 저신장, 러셀-실버 증후군에 의한 저신장, 누난 증후군에 의한 저신장, 만성 전신성 질환에 의한 저신장, 성장호르몬 결핍증에 의한 저신장, 갑상샘 저하증에 의한 저신장, 성조숙증에 의한 저신장, 쿠싱증후군에 의한 저신장 및 정신사회적 왜소증으로 이루어진 질환으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유청단백은 치즈 유청으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유청단백은 일반유청분말(Normal whey powder), 탈염유청분말(Demineralized whey powder), 유청단백 농축물(Whey protein concentrate) 또는 유청단백 분리물(Whey protein isolate)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유청단백 가수분해물은 불용성 물질이 제거된 수용성 유청단백 가수분해물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드의 함량은 유청단백 가수분해물 총 중량을 기준으로 0.5 mg/g 내지 40 mg/g인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드의 함량은 유청단백 가수분해물 총 중량을 기준으로 0.5 mg/g 내지 40 mg/g인 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드의 함량은 유청단백 가수분해물 총 중량을 기준으로 0.5 mg/g 내지 40 mg/g, 0.5 mg/g 내지 25 mg/g, 0.5 mg/g 내지 15 mg/g, 0.5 mg/g 내지 10 mg/g, 0.5 mg/g 내지 8 mg/g, 0.5 mg/g 내지 7 mg/g, 0.5 mg/g 내지 6 mg/g, 1.0 mg/g 내지 40 mg/g, 1.0 mg/g 내지 25 mg/g, 1.0 mg/g 내지 15 mg/g, 1.0 mg/g 내지 10 mg/g, 1.0 mg/g 내지 8 mg/g, 1.0 mg/g 내지 7 mg/g, 1.0 mg/g 내지 6 mg/g, 1.5 mg/g 내지 40 mg/g, 1.5 mg/g 내지 25 mg/g, 1.5 mg/g 내지 15 mg/g, 1.5 mg/g 내지 10 mg/g, 1.5 mg/g 내지 8 mg/g, 1.5 mg/g 내지 7 mg/g, 1.5 mg/g 내지 6 mg/g, 2.0 mg/g 내지 40 mg/g, 2.0 mg/g 내지 25 mg/g, 2.0 mg/g 내지 15 mg/g, 2.0 mg/g 내지 10 mg/g, 2.0 mg/g 내지 8 mg/g, 2.0 mg/g 내지 7 mg/g, 2.0 mg/g 내지 6 mg/g, 3.0 mg/g 내지 40 mg/g, 3.0 mg/g 내지 25 mg/g, 3.0 mg/g 내지 15 mg/g, 3.0 mg/g 내지 10 mg/g, 3.0 mg/g 내지 8 mg/g, 3.0 mg/g 내지 7 mg/g, 3.0 mg/g 내지 6 mg/g, 4.0 mg/g 내지 40 mg/g, 4.0 mg/g 내지 25 mg/g, 4.0 mg/g 내지 15 mg/g, 4.0 mg/g 내지 10 mg/g, 4.0 mg/g 내지 8 mg/g, 4.0 mg/g 내지 7 mg/g, 또는 4.0 mg/g 내지 6 mg/g인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유청단백 가수분해물은 유청단백을 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테이스(Endo protease)로 1차 가수분해하고, 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테이스(Exo protease)로 2차 가수분해한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테이스(Endo protease)는 알칼레이스(Alcalase), 프로타맥스(Protamex), 또는 이들의 혼합효소이고; 상기 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테이스(Exo protease)는 플라보자임(Flavourzyme)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 혼합효소는 알칼레이스(Alcalase)와 프로타맥스(Protamex)가 1:0.5 내지 1:2의 중량비로 혼합된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 혼합효소는 알칼레이스(Alcalase)와 프로타맥스(Protamex)가 1:0.5 내지 1:2, 1:0.5 내지 1:1.75, 1:0.5 내지 1:1.5, 1:0.5 내지 1:1.25, 1:0.5 내지 1:1, 1:0.75 내지 1:2, 1:0.75 내지 1:1.75, 1:0.75 내지 1:1.5, 1:0.75 내지 1:1.25, 1:0.75 내지 1:1, 1:1 내지 1:2, 1:1 내지 1:1.75, 1:1 내지 1:1.5, 또는 1:1 내지 1:1.25의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유청단백과 물을 중량비로 혼합하여 상기 유청단백을 용해시키는 단계; (b) 상기 용해된 유청단백 용해물 100 중량부에 유청단백을 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테이스(Endo protease)를 투입하여 1차 가수분해를 수행하는 단계; 및 (c) 상기 1차 가수분해된 분해물에 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테이스(Exo protease)를 투입하여 2차 가수분해를 수행하는 단계를 포함하는, Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (a) 단계에서는 유청단백과 물을 1:3 내지 1:10, 1:3 내지 1:8, 1:3 내지 1:6, 1:4 내지 1:10, 1:4 내지 1:8, 1:4 내지 1:6, 1:5 내지 1:10, 1:5 내지 1:8, 1:5 내지 1:6의 중량비로 혼합할 수 있으며, 가장 구체적으로는 1:5의 중량비로 혼합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (a) 단계에서는 염기를 사용하여 pH를 7.0 내지 7.5로 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계에서는 상기 용해된 유청단백 용해물 100 중량부에 유청단백을 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테이스(Endo protease)를 0.05 내지 1, 0.05 내지 0.7, 0.05 내지 0.4, 0.05 내지 0.2, 0.1 내지 1, 0.1 내지 0.7, 0.1 내지 0.4, 0.1 내지 0.2, 0.15 내지 1, 0.15 내지 0.7, 0.15 내지 0.4, 또는 0.15 내지 0.2 중량부로 투입하여 1차 가수분해를 수행할 수 있으며, 가장 구체적으로는 0.2의 중량부로 투입하여 1차 가수분해를 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계는 30℃ 내지 80℃ 의 온도 조건에서 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 30℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 60℃, 30℃ 내지 55℃, 40℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 59℃, 40℃ 내지 58℃, 40℃ 내지 57℃, 40℃ 내지 56℃, 40℃ 내지 55℃, 42℃ 내지 60℃, 42℃ 내지 59℃, 42℃ 내지 58℃, 42℃ 내지 57℃, 42℃ 내지 56℃, 42℃ 내지 55℃, 44℃ 내지 60℃, 44℃ 내지 59℃, 44℃ 내지 58℃, 44℃ 내지 57℃, 44℃ 내지 56℃, 44℃ 내지 55℃, 46℃ 내지 60℃, 46℃ 내지 59℃, 46℃ 내지 58℃, 46℃ 내지 57℃, 46℃ 내지 56℃, 46℃ 내지 55℃, 48℃ 내지 60℃, 48℃ 내지 59℃, 48℃ 내지 58℃, 48℃ 내지 57℃, 48℃ 내지 56℃, 48℃ 내지 55℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 70℃, 또는 50℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 59℃, 50℃ 내지 58℃, 50℃ 내지 57℃, 또는 50℃ 내지 56℃, 가장 구체적으로는 50℃ 내지 55℃의 온도 조건에서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계에서는 1 시간 내지 24 시간 동안 가수분해를 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 1 시간 내지 24 시간, 1 시간 내지 20 시간, 1 시간 내지 15 시간, 1 시간 내지 10 시간, 1 시간 내지 8 시간, 1 시간 내지 6 시간, 1 시간 내지 5 시간, 1 시간 내지 4 시간, 2 시간 내지 24 시간, 2 시간 내지 20 시간, 2 시간 내지 15 시간, 2 시간 내지 10 시간, 2 시간 내지 8 시간, 2 시간 내지 6 시간, 2 시간 내지 5 시간, 2 시간 내지 4 시간, 3 시간 내지 24 시간, 3 시간 내지 20 시간, 3 시간 내지 15 시간, 3 시간 내지 10 시간, 3 시간 내지 8 시간, 3 시간 내지 6 시간, 3 시간 내지 5 시간, 3 시간 내지 4 시간, 4 시간 내지 24 시간, 4 시간 내지 20 시간, 4 시간 내지 15 시간, 4 시간 내지 10 시간, 4 시간 내지 8 시간, 4 시간 내지 6 시간, 또는 4 시간 내지 5 시간, 가장 구체적으로는 4 시간 동안 가수분해를 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계에서는 상기 1차 가수분해된 분해물에 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테이스(Exo protease)를 0.05 내지 1, 0.05 내지 0.7, 0.05 내지 0.4, 0.05 내지 0.2, 0.1 내지 1, 0.1 내지 0.7, 0.1 내지 0.4, 0.1 내지 0.2, 0.15 내지 1, 0.15 내지 0.7, 0.15 내지 0.4, 또는 0.15 내지 0.2 중량부로 투입하여 2차 가수분해를 수행할 수 있으며, 가장 구체적으로는 0.2의 중량부로 투입하여 2차 가수분해를 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계는 30℃ 내지 80℃ 의 온도 조건에서 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 30℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 60℃, 30℃ 내지 55℃, 40℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 59℃, 40℃ 내지 58℃, 40℃ 내지 57℃, 40℃ 내지 56℃, 40℃ 내지 55℃, 42℃ 내지 60℃, 42℃ 내지 59℃, 42℃ 내지 58℃, 42℃ 내지 57℃, 42℃ 내지 56℃, 42℃ 내지 55℃, 44℃ 내지 60℃, 44℃ 내지 59℃, 44℃ 내지 58℃, 44℃ 내지 57℃, 44℃ 내지 56℃, 44℃ 내지 55℃, 46℃ 내지 60℃, 46℃ 내지 59℃, 46℃ 내지 58℃, 46℃ 내지 57℃, 46℃ 내지 56℃, 46℃ 내지 55℃, 48℃ 내지 60℃, 48℃ 내지 59℃, 48℃ 내지 58℃, 48℃ 내지 57℃, 48℃ 내지 56℃, 48℃ 내지 55℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 70℃, 또는 50℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 59℃, 50℃ 내지 58℃, 50℃ 내지 57℃, 또는 50℃ 내지 56℃, 가장 구체적으로는 50℃ 내지 55℃의 온도 조건에서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계에서는 1 시간 내지 24 시간 동안 가수분해를 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 1 시간 내지 24 시간, 1 시간 내지 20 시간, 1 시간 내지 18 시간, 1 시간 내지 16 시간, 1 시간 내지 15 시간, 5 시간 내지 24 시간, 5 시간 내지 20 시간, 5 시간 내지 18 시간, 5 시간 내지 16 시간, 5 시간 내지 15 시간, 10 시간 내지 24 시간, 10 시간 내지 20 시간, 10 시간 내지 18 시간, 10 시간 내지 16 시간, 10 시간 내지 15 시간, 13 시간 내지 24 시간, 13 시간 내지 20 시간, 13 시간 내지 18 시간, 13 시간 내지 16 시간, 13 시간 내지 15 시간, 14 시간 내지 24 시간, 14 시간 내지 20 시간, 14 시간 내지 18 시간, 14 시간 내지 16 시간, 또는 14 시간 내지 15 시간, 가장 구체적으로는 15 시간 동안 가수분해를 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물의 제조방법은 상기 (c) 단계 이후에 (d) 상기 유청단백 가수분해물을 실활시키고 여과하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 90℃에서 10 분간 실활 후 냉각하고, 하우징 필터(1 ㎛)에 여과할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물의 제조방법은 상기 (c) 단계 이후에 (d) 상기 유청단백 가수분해물을 살균하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 90℃에서 30 분간 살균할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 살균 후 실온에서 냉각하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물의 제조방법은 상기 (c) 단계 이후에 (d) 상기 유청단백 가수분해물을 여과하고 건조하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 80 mesh 여과지로 여과시키고 분무건조(온도조건은 inlet: 190±10℃, outlet: 95±5℃)할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 건조하는 단계 이후 자석봉으로 불순물을 제거하는 단계도 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 성장 촉진용 조성물, Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 조성물은 성장 촉진 기능성을 가지며, 이를 활용하는 경우 유청단백 효소가수분해물의 효율적인 품질관리가 가능하다.
도 1은 효소 종류에 따른 유청단백 가수분해물 ALP 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 I의 유청단백 가수분해물 처리 시 MC3T3-E1에서 조골세포 분화 관련 유전자들의 발현을 단백질 레벨에서 웨스턴블랏으로 분석한 결과이다.
도 3은 실시예 I의 유청단백 가수분해물 처리 시 MC3T3-E1 세포내 조골세포 분화 관련 유전자들의 mRNA 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 4는 유청단백 가수분해물의 Insulin like Growth Factor-1(IGF-1) 분비에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 대조군인 NOR군과 시료 처리군 간의 성장판 길이 차이를 나타낸 것이다.
도 6은 유청단백 가수분해물이 경골 성장에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7은 Q-Sepharose HiLOad 16/10 칼럼에서 수행한 이온교환크로마토그램(7개의 분획, Ex-1 내지 Ex-7)을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 유청단백 가수분해물의 제조공정을 나타낸 것이다.
도 9은 유청단백 가수분해물 이온교환크로마토그래피 분획의 세포활성을 나타낸 것이다.
도 10는 정상군 대비 이온교환크로마토그래피 분획의 근관 세포 두께 성장 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 EX-1 분획의 크기배제크로마토그램을 나타낸 것이다. (적색: 220 nm에서 검출, 청색: 280 nm에서 검출)
도 12은 EX-4 분획의 크기배제크로마토그램을 나타낸 것이다. (적색: 220 nm에서 검출, 청색: 280 nm에서 검출)
도 13는 정상군 대비 크기배제크로마토그래피 분획의 근관 세포 두께 성장 효과를 나타낸 것이다.
도 14은 HPLC 시스템에서 펩타이드 DKFLD와 유청단백 가수분해물의 역상크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 15는 제조공정 단계별 DKFLD의 함량을 나타낸 것이다.
도 16은 MC3T3-E1 세포에 대한 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 17는 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드 처리 3 일차의 ALP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 18는 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드 처리 7 일차의 ALP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드 처리 3 일차의 골석회화 형성도를 나타낸 그래프이다.
도 20은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드 처리 7 일차의 골석회화 형성도를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실시예 I> 유청단백 가수분해물의 제조 및 구성아미노산 측정
본 발명의 유청은 우유에 레닛(rennet)을 가하고, 커드를 제거하고 농축한 농축유청단백(Whey protein concentrate)을 사용하였다. 상기 유청의 pH는 유청 10 중량% 수용액 기준으로 pH 5 내지 6이다. WPI(Whey Protein Isolate)는 미국 밀헤븐사의 것을 구입하여 사용하였다.
유청단백 효수가수분해물은 ㈜네오크레마에서 제공하는 분말제품을 사용하였다.
효소 가수분해물의 제조공정은 ㈜네오크레마의 표준제조공정에 따라 제조한 유청단백질 효소 가수분해물을 시험분석용 시료로 사용하였다. 제조공정은 도 8에 나타내었다.
농축 유청단백과 물을 1:5의 중량비로 혼합하고, 탄산수소나트륨(NaHCO3을 투입하여 pH를 7.0 내지 7.5로 조절하였다.
가수분해를 위한 효소는 1단계 가수분해효소로 0.2% 알칼레이스(Alcalase 2.4L FG, Novo Nordisk 사)와 0.2%의 프로타맥스(Protamex)를 사용하여 50℃ 내지 55℃에서 4 시간 동안 가수분해하였고, 2 단계 가수분해효소로 0.2% 플라보자임(Flavourzyme)을 사용하여 50℃ 내지 55℃에서 15 시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물은 90℃에서 10 분 동안 효소를 실활시킨 후 실온으로 냉각시켰다. 가수분해물을 1 ㎛의 하우징 필터로 여과하고 90℃에서 30 분 동안 살균처리한 후 inlet 온도 190±10℃, outlet 온도 95±5℃에서 분무건조하였다. 분무건조물은 8,000 GAUS의 자석봉으로 금속 이물질을 제거한 후 포장하여 분석용 시료로 사용하였다.
실시예 I의 유청단백 가수분해물의 구성아미노산 조성은 유청단백 가수분해물을 산가수분해법으로 분해한 후 아미노산 자동분석기로 측정하였다. 즉 유청단백 가수분해물 25 mg을 캡 튜브(cap tube)에 정확히 칭량하여 넣은 후 2.5 ml의 6 N HCl을 가하고 110℃에서 24 시간 동안 가수분해하였다. 3G-4 글래스 필터로 미가수분해물질을 제거한 여액은 회전진공증발기(N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)로 50℃에서 완전히 용매를 휘발시킨 후 0.01 N HCl를 사용하여 25 ml로 정용하여 아미노산 분석용 시료로 사용하였다. 아미노산 분석은 시료 용액 40 ㎕를 주입하여 아미노산 자동분석기(Biochrom 30, Cambridge, UK)로 분석하였다(표 1).
아미노산
(mg/g)		 실시예 I
 소 유청 단백질(Bovine
Whey protein)		 난(Egg) 밀(Wheat) 대두단백질(Soybean)
Asp 86.1±2.8 76.6 60.1 30.8 73.1
Thr 56.1±1.6 52.7 32.0 18.3 24.1
Ser 42.8±1.4 37.4 47.8 28.7 32
Glu 144.9±4.5 123.1 79.6 186.6 116.9
Pro 41.1±0.1 45.0 26.0 62.1 34.3
Gly 15.1±0.5 12.6 20.7 24.5 26.1
Ala 39.0±1.1 34.1 17.0 22.6 26.6
Cys 6.9±0.2 17.4 15.2 15.9 8.3
Val 44.7±1.6 44.9 42.8 27.6 30.0
Met 16.9±0.6 15.1 21.0 9.4 7.9
Ile 48.5±1.5 47.6 39.3 20.4 28.4
Leu 85.9±2.6 73.6 55.1 41.7 48.6
Tyr 24.5±0.8 21.4 26.0 18.7 19.6
Phe 28.4±0.8 22.4 35.8 28.2 30.9
His 15.3±1.1 14.4 15.1 16.3 15.8
Lys 72.9±2.8 70.4 43.6 17.9 39.9
NH3 11.0±0.4 - - - -
Arg 20.8±0.5 17.5 38.1 28.8 45.2
Trp 10.6±0.4 14.7 9.3 6.8 8.0
Ile+Leu+Val 179.1 166.1 137.2 89.7 107.0
Total 801.1±24.1 740.9 644.5 605.3 615.7
표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 I의 유청단백 가수분해물의 총아미노산 함량은 801.1±24.1 mg/g으로서 소 유청 단백질(bovine whey protein)의 74.09 g/100 g에 비하여 다소 높았고, 난, 밀과 대두단백질의 64.45 g/100 g, 60.53 g/100 g 및 61.57/100 g에 비하여 상당히 높았다(표 1). 특히 성장호르몬 분비를 촉진하는 Lys, Tyr 등의 함량은 다른 단백질에 비하여 높았다. 이 같은 결과는 Lys, Tyr이 풍부한 유청단백질이 어린이 성장기능성과 상관이 있다는 보고에 비추어 실시예 I의 유청단백 가수분해물이 다른 단백질의 가수분해물에 비하여 성장 기능성에 유효한 효과를 가질 것을 보여준다. 한편, Cys의 함량이 다소 적게 정량된 것은 시스테인산(cysteic acid)로 산화되었기 때문으로 추정된다.
<실시예 II> 유청단백 가수분해물의 비교 및 성장 기능성 평가
비교예 1
플라보자임은 사용하지 않고 알칼레이스만을 사용한 것을 제외하고 실시예 I과 동일한 방법으로 유청 가수분해물을 제조하였다. 즉, 알칼레이스 4 시간 가수분해 후 다시 14 시간 가수분해를 수행하였다.
비교예 2
플라보자임 대신 뉴트레이즈(neutrase)을 사용한 것을 제외하고 실시예 I과 동일한 방법으로 유청 가수분해물을 제조하였다. 즉, 알칼레이스 4 시간 가수분해 후 뉴트레이즈 14 시간 가수분해를 수행하였다.
비교예 3
플라보자임 대신 콜루풀린(collupulin)을 사용한 것을 제외하고 실시예 I과 동일한 방법으로 유청 가수분해물을 제조하였다. 즉, 알칼레이스 4 시간 가수분해 후 콜루풀린 14 시간 가수분해를 수행하였다.
비교예 4
플라보자임 대신 피신(ficin)을 사용한 것을 제외하고 실시예 I과 동일한 방법으로 유청 가수분해물을 제조하였다. 즉, 알칼레이스 4 시간 가수분해 후 피신 14 시간 가수분해를 수행하였다.
비교예 5
플라보자임 대신 프로타맥스(protamex)을 사용한 것을 제외하고 실시예 I과 동일한 방법으로 유청 가수분해물을 제조하였다. 즉, 알칼레이스 4 시간 가수분해 후 프로타맥스 4시간 가수분해를 수행하였다.
실험예 1: 사용 효소 별 유청단백 가수분해물의 ALP 활성 비교
실시예 I 및 비교예 1 내지 5의 유청단백 가수분해물들을 각각 MC3T3-E1 세포에 처치하고, 성장지표인 ALP(alkaline phosphatase, 알칼라인 포스파테이스) 활성을 측정하였다. 이때 각 시료는 62.5 μg/ml, 125 μg/ml, 250 μg/ml 및 500 μg/ml로 농도를 달리하여 처리하였다.
그 결과, 실시예 I의 유청단백 가수분해물의 ALP 활성이 제일 높은 것으로 나타났다(도 1). 그러므로 이하, 시험에서는 실시예 I의 유청 가수분해물을 이용하여 시험을 수행하였다.
실험예 2: 조골세포 분화 관련 유전자 발현 분석
실시예 I의 시료를 MC3T3-E1 세포에 12.5 mg/ml, 25 mg/ml 및 50 mg/ml의농도로 처치하고, 조골세포 분화 관련 지표들을 평가하였다.
그 결과, 조골세포 분화 관련 지표의 Western blot(도 2) 및 유전자 발현(도 3)에 나타난 바와 같이, 실시예 I의 시료를 처리 시 단백질 레벨에서 ALP, BMP, BSP, COL2는 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, mRNA 레벨에서는 ALP, BMP-4 및 BSP는 농도가 높아짐에 따라 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. COL1의 경우, 유의적이지는 않지만 농도가 높아짐에 따라 유전자 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같이, 실시예 I의 시료는 농도의존적으로 MC3T3-E1세포의 분화 및 성장에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 마우스 실험
3주령의 Sprague-Dawley 수컷 흰쥐를 중앙 연구소 동물(서울, 한국)에서 수득하였다. 6 마리의 쥐로 구성된 4 그룹으로 나누었고 3 마리의 흰 쥐를 플라스틱 케이지에 넣었다. 실험 중 실내 온도는 24 ± 1℃, 대기 습도는 60 ± 5%, 가벼운 사이클(12 시간/12 시간)이 유지되었다. 체중과 식이 섭취량을 매주 2 회 모니터링하였다.
시험 결과는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 필요한 경우 그룹 간 비교를 위해 분산 분석 (ANOVA)을 수행하고 Statistical Package for Social Sciences version 12.0(SPSS Inc., Chicago IL, USA)을 사용하여 Tukey의 다중 범위 테스트를 사용하여 샘플 간 차이를 조사하였다.
Sprague-Dawley 수컷 흰쥐들을 적응 기간 후에 실험군을 4 그룹으로 나누었다. (NOR; 정상적인 식단 그룹, WPC; 유청단백질 식이요법군(600 mg/kg); WPH-L : 실시예 I의 유청단백 가수분해물 식이요법군 (300 mg/kg); WPH-H : 실시예 I의 유청단백 가수분해물 식이요법군(600 mg/kg).
총 4 그룹의 동물들에게 각 시료들을 4 주 동안 매일 경구투여 하였다. 그리고 사료 섭취량, 물 섭취량, 체중 및 정강이뼈 길이를 3 일마다 측정하였다. 4 주 후 유청 단백질과 유청 단백질 가수 분해물의 성장 촉진 효과는 혈 지수와 정강이뼈를 주된 지표로 설정하여 희생시킴으로써 확인되었다.
실험적 치료 기간의 끝에서, 흰쥐들은 희생하기 전에 12 시간 동안 금식되었다. 흰쥐는 이산화탄소로 안락사 시켰으며 호르몬 수준과 혈액 화학 분석을 위해 하대 정맥에서 채혈하였다. 수집된 혈액 샘플을 4℃에서 10 분간 3,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 수거하고 여러 개의 분취액으로 분리된 튜브로 나누고 분석까지 -80℃에서 보관했다.
혈청 내 Insulin like Growth Factor -1 (IGF-1)의 수준은 Rat용 IGF-1 (Insulin like Growth Factor -1) ELISA kit (fine test ER0030 Wuhan Fine Biological Technology Co., KOR)를 사용하여 제조업체 안내서를 참조하여 측정하였다. 혈청 내 트리글리 세라이드 (TG), 포도당 (Glu), 총 콜레스테롤 (TCHO) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤 (HDL)의 함량은 혈청분석기 (Dri-chem 3500i, Fuji Photo Co., Osaka, Japan)를 통해 측정하였다. 총 칼슘 (Ca)과 Alkaline Phosphatase (ALP)는 혈청분석기(Dri-chem 3500i, Fuji Photo Co., JPN)로 측정하였다.
해부된 정강이 뼈는 하기의 방법으로 평가하였다. 정강이 뼈를 PIXImus 농도계(GE Lunar, Madison, WI)를 사용하여 스캔하였다. 장비의 교정 및 정밀도를 확인하기 위해 데이터 수집 중에 제조업체가 제공한 sample을 매일 스캔했고, 정강이 뼈를 스캔하기 전에 실온으로 유지하였다. 단일 동물의 모든 뼈를 동일한 조건에서 검사하였다. 정강이뼈는 왼쪽 뼈에 대해 유사한 방향을 얻기 위해 장비 제조업체가 제공 한 7mm 두께의 Plexiglas 플랫폼에서 수동으로 공기 중으로 배치되었다. 한 시료를 스캔하는데 걸린 시간은 약 5분이었다. 소프트웨어로 잘못 식별된 뼈를 제외하고 각 뼈를 개별적으로 분석하기 위해 수동으로 관찰 영역을 조정하여 관찰하였다. 뼈의 위치를 다중 선형 회귀 분석으로 설명했다. 조정 알고리즘은 회화 전에 PIXImus 필드 내의 다양한 위치에서 뼈의 세트를 스캔하여 개발되었으며, BMD는 계단식 다중 회귀 분석에 의해 모델링되었고, 최종 모델은 회화에 의한 광물 함량, 스캐닝 필드 내의 X 좌표 및 스캐닝 필드의 Y 좌표가 중요한 독립 변수로서 포함된다. 스캐닝 필드의 중심으로부터의 거리는 중요한 독립 변수가 아니라 전체 R2 값은 0.95이고 X와 Y 좌표를 조정하여 얻은 D R2는 각각 0.027과 0.003이다.
뼈 조직 및 성장판의 염색은 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 경골을 절개하고, 절개된 경골은 48 시간 동안 4 % para-formaldehyde에서 고정시키고, 24 시간 동안 10 % ethylene diamine tetra acetic acid에 담금으로써 탈회를 수행하였다(Sigma Chemicals Co, USA). 그리고 30 % sucrose 용액에 담가 이틀 동안 탈수시켰다. 각 샘플은 sliding-microtome으로 40㎛의 두께로 종 방향으로 절개되어 슬라이드로 제조되었다. 이후 cresyl-violet을 사용하여 시료의 성장판에서 연골 세포를 염색하였다. 슬라이드를 3 분 동안 증류수에, 5 분 동안 cresyl-violet solution, 3 분 동안 50 % ethanol, 3 분 동안 75 % ethanol, 3 분 동안 90 % ethanol, 3 분 동안 100 % ethanol 및 10 분 동안 xylene에 침지시켰다. 절편에 사용된 0.5 % cresyl-violet solution은 다음과 같이 제조하였다. cresyl-violet은 Sigma(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)로부터 구매하였다. cresyl-violet 2.5 ㎎ 증류수 300 ㎖, 1 M Sodium acetic acid(13.6 g / 92 ㎖ 30 ㎖) 및 1 M acetic acid(170 ㎖의 빙초산 / 170 ㎖의 증류수)를 7 일 동안 교반시켜 사용하였다. permount 용액과 커버 글래스. 성장판 높이는 3 개의 섹션 각각에 대해 Image J 소프트웨어(미국 NIH)를 사용하여 샘플 당 3 개의 다른 영역에서 측정하고 평균값을 계산하였다.
실험예 3-1: 성장기 쥐의 체중, 음식 섭취량 및 음수량 평가
실험 그룹의 실험 기간 동안 체중 변화, 음식물 섭취량 및 음료량을 측정하였다. 실험 그룹의 흰쥐는 비슷한 평균 초기 체중을 가졌다.
그 결과, 유청 또는 유청 가수분해물을 처리한 실험군들(WPC, WPH-L 및 WPH-H)은 대조군(NOR)에 비해 체중 증가량이 큰 경향이 있었다. 그러나 유의한 차이는 관찰되지 않았다. WPH-H(8.24 g/일)를 투여한 쥐는 28 일 후에 대조군(7.21 g/일)의 쥐보다 유의하게(p<0.05) 더 많은 가중치를 얻었다. 그러나 WPC(7.70 g/일)와 WPH-L(8.09 g/일) 사이의 체중 증가에는 유의한 차이가 없었다. 음식 섭취량과 음수량은 4 개 그룹 간에 차이가 없었다. 이를 토대로 유청단백질과 유청단백 가수분해물은 쥐의 성장에 효과가 있었음을 확인할 수 있었다(표 2).
- NOR WPC WPH-L WPH-H
체중 증가량 (g/day) 7.21b±0.63 7.70ab±0.09 8.09a±0.11 8.24a±0.51
음식 섭취량(g/day) 19.93ns±0.31 19.91 ± 0.48 19.34 ± 0.32 19.49 ± 0.62
음수량(Drink volume)
(mL/day)		 23.86ns±0.10 23.08 ± 1.78 23.67 ± 0.48 24.59 ± 0.85
실험예 3-2: 장기 무게 및 혈청 지질 평가
각 실험군에 대한 장기 무게 및 혈청 지질을 측정하였다.
그 결과, 4개 그룹의 신장 무게는 다른 군과 약간 달랐으나 이러한 차이는 유의하지 않았다. 심장, 간, 비장 무게는 4 군 간에 유의한 차이가 없었다(표 3). WPC, WPH-L 및 WPH-H 그룹 내에서 기관 비대 및 수축과 같은 비정상적인 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 WPC, WPH-L 및 WPH-H 그룹에 투여된 식수의 경구 투여가 안전하다는 것을 알 수 있다. NOR과 실험 군(WPC, WPH-L, WPH-H)에 대한 혈청 지질 수치의 변화를 측정한 결과, 혈청 지질(중성지방(트라이글리세라이드), 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤) 수준은 NOR와 실험 그룹(WPC, WPH-L 및 WPH-H)간에 유의미한 차이가 없었다(표 4). 장기 무게와 혈청 지질 수준의 차이에 근거하여 유청 단백질과 유청단백 가수 분해물은 쥐에 독성이 없음을 알 수 있었다.
기관 (g) Normal WPC WPH-L WPH-H
심장 1.2507ns±0.15 1.2800 ± 0.15 1.2539 ± 0.08 1.2601 ± 0.12
간 11.4748ns±0.96 11.8443 ± 0.92 10.8250 ± 0.83 11.5789 ± 0.67
신장 2.4160ab±0.16 2.5623a±0.18 2.3087b±0.13 2.5028a±0.19
비장 0.7002ns±0.10 0.7299 ± 0.09 0.7709 ± 0.05 0.7396 ± 0.04
지표 Normal WPC WPH-L WPH-H
HDL-콜레스테롤 (mg/dL) 56.83ns±7.14 53.17 ± 5.34 50.67 ± 5.28 56.83 ± 9.62
총-콜레스테롤 (mg/dL) 102.83ns±10.42 93.17 ± 9.45 90.83 ± 11.13 97.83 ± 15.16
Triglyceride(mg/dL) 107.33ns±23.91 88.17 ± 22.76 80.00 ± 16.65 90.67 ± 14.62
실험예 3-3: 혈청 칼슘(Ca) 및 ALP 평가
각 실험군들에 대하여 혈청 칼슘(Ca) 및 ALP의 농도를 측정하였다.
그 결과, 시료 처리 군(WPC; 12.67 mg/dL, WPH-L; 12.73 mg/dL, WPH-H; 12.20 mg/dL)은 대조군(NOR)(13.60 mg/dL)에 비해 혈청 칼슘 농도가 감소하는 경향이 있을 확인할 수 있었다. 시료 처리군의 혈청 내 ALP 농도는 대조군(NOR)에 비하여 높은 경향을 보였지만 이 차이는 유의하지 않았다. ALP와 칼슘 농도를 관찰했을 때 유의적인 차이를 보이진 않았지만 쥐의 성장에 유청단백질과 유청단백질 가수분해물이 좋은 영향을 끼치는 경향성을 보이는 것으로 판단되었다(표 5).
Parameter Normal WPC WPH-L WPH-H
ALP (U/I) 1231.00ns ± 115.29 1277.67 ± 252.52 1316.33 ± 75.75 1401.33 ± 57.71
Calcium (mg/dL) 13.60ns ± 0.36 12.67 ± 0.06 12.73 ± 0.12 12.20 ± 0.35
Glucose (mg/dL) 287.33ns ± 52.32 255.00 ± 6.93 259.33 ± 16.62 263.33 ± 49.12
실험예 3-4: 혈청 내 IGF-1 수준 평가
IGF-I(Serum Insulin like Growth Factor-1)은 성장 호르몬에 의한 자극에 따라 간 및 기타 기관에서 합성되고 분비되는 인슐린 성장인자이다. 이것은 골아 세포 및 연골 세포에서 성장, 분화 및 기질 합성 활성을 촉진한다. 또한 IGF-I는 긴 뼈의 성장과 하악과 일의 성장에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다.
각 실험군의 혈청 내 IGF-1 수준을 측정한 결과, 혈청 IGF-1은 대조군(NOR) (1575.71 pg/ml)보다 유청단백질 투여군과 유청단백 가수분해물 투여군 (WPC; 1580.21 pg/ml, WPH-L; 1658.61 pg/ml, WPH-H; 1683.28 pg/ml)에서 약간 더 높았다. 특히 유청단백 가수분해물이 IGF-1의 분비에 효과적인 것으로 판단되었다(표 6, 도 4). 도 4는 NOR의 결과 값을 0으로 하여 NOR의 결과 값과 시료들의 결과와의 차이를 나타낸다.
Rat IGF-1
(pg/ml)		 NOR WPC WPH-L WPH-H
1575.71ns± 123.18 1580.21 ± 79.55 1658.61 ± 107.72 1683.28 ± 92.36
실험예 3-5: 정강이 뼈 성장 및 성장판 증가
유청단백질(WPC) 투여군은 유청을 4주간 600 mg/kg/일의 투여량으로 투여하였다. 실시예 I의 유청단백 가수분해물 투여군은 실시예 I의 유청단백 가수분해물을 4 주간 WPH-L 그룹의 경우 300 mg/kg/일의 투여량으로, WPH-H 그룹의 경우 600 mg/kg/일의 투여량으로 투여하였다. 4 주 후 각 그룹에 대한 종 방향 뼈 성장의 증가에 대해 시료 처리 군과 대조군인 NOR 군의 차이점을 평가하였다.
그 결과, WPC, WPH-L, WPH-H 그룹의 경우 정강이 뼈 성장 증가 값은 각각 39.10 mm, 39.65 mm, 40.63mm이었으며, 대조군인 NOR 군의 경우 38.18mm으로, 유의한 차이가 있었다(p<0.05).
한편, 성장판은 휴식 구역에서 시작하여 증식 및 비대화 구역을 통해 확장되는 네 개의 별개의 조직학적 구역으로 구성된다. 성장판 높이는 신체 성장 속도와 관련이 있으므로, 쥐의 성장판 높이를 측정하였다.
그 결과, WPC, WPH-L, WPH-H 군은 대조군인 NOR 군에 비해 성장판의 높이가 유의하게 높아짐을 알 수 있었다(p<0.05). WPC, WPH-L 및 WPH-H 군의 성장판 높이는 각각 345.86 μm, 353.32 μm, 399.23 μm이었다. NOR 군의 경우 289.66μm였다(도 5, 표 7). 이와 같이, WPC, WPH-L 및 WPH-H가 쥐에서 성장판의 성장을 촉진하는 것이 확인되었으며, 특히 실시예 I의 유청단백 가수분해물을 고함량으로 처리 시 쥐의 성장판과 경골의 성장이 유의하게 촉진되는 것을 알 수 있었다.
시료 성장판의 길이(㎛)
NOR 289.66c±39.59
WPC 345.86b±32.96
WPH-L 353.32b±30.30
WPH-H 399.23a±21.59
실험예 3-6: 뼈 분석
대조군인 NOR 군, 유청단백질 투여군(WPC), 실시예 I의 유청단백 가수분해물 투여군(WPH-L 및 WPH-H군)에 대하여 각 그룹의 경골을 대상으로 BMC(Total amount of bone mineral), BMD(Average of bone density), 뼈 영역(bone area), 뼈 부피 및 뼈 길이를 측정하였다. BMD는 BMC를 Bone Area 값으로 나눈 값이다. 뼈 영역, 뼈 부피 및 뼈 길이는 micro-CT를 이용하여 측정하였다.
그 결과, WPC, WPH-L 및 WPH-H 군들은 NOR 군에 비해 BMC의 증가를 나타내는 경향이 있었다. BMD는 일반적으로 시료 처리 군들에서는 BMC와 동일한 경향을 보였으나, NOR 군은 가장 높은 수치를 보였다.
BMD는 BMC를 Bone Area 값으로 나눈 값인데, Bone Area 값이 NOR에서 가장 낮기 때문에 BMD의 경우 NOR 군에서 가장 높은 수치를 보였다. WPC, WPH-L, WPH-H 그룹의 BMC 값은 각각 298.60, 306.13, 317.35 g이었고 NOR 군의 BMC 값은 296.55 g이었다. BMD 수준은 각각 176.58, 176.15 및 179.83 g/cm2 였고, NOR 군의 BMD 수준은 181.25 g/cm2였으나 유의차는 없었다.
그러나 Bone length는 NOR 군과 시료 투여군들(WPC, WPH-L 및 WPH-H 군)간에 유의한 차이가 있었으며, 특히 WPH-H 그룹에서 더 유의한 결과가 나타났다(표 8, 도 6).
- NOR WPC WPH-L WPH-H
BMC (mg) 296.55ns±7.26 298.60 ±27.72 306.13 ±24.10 317.35 ±27.70
BMD(mg/cm2) 181.25ns ±8.78 176.58 ± 8.59 173.00 ± 7.96 183.03 ± 10.02
뼈 영역(cm2) 1.59ns ±0.07 1.69 ± 0.12 1.74 ± 0.13 1.76 ± 0.05
뼈 부피(cm3) 0.18ns ±0.00 0.19 ± 0.01 0.19 ± 0.01 0.20 ± 0.02
뼈 길이 (mm) 38.18b ±1.00 39.10ab±1.41 39.65ab±1.25 40.63a±0.30
이와 같이, 실시예 I의 유청단백 가수분해물은 농도의존적으로 뼈의 부피와 길이를 성장시킴을 확인할 수 있었다.
<실시예 III: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 선정, 정량 및 기능성 평가>
실험예 4: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 선정, 정량 및 함량 비교
질량분석과 HPLC(High performance liquid chromatography) 분석에 사용한 시약은 모두 HPLC급의 시약을 사용하였고, 그 외의 시약은 분석용 시약을 사용하였다. 시약제조에 사용한 물은 이차증류수를 사용하였다.
실험예 4-1: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 선정
실시예 I의 유청단백 가수분해물의 펩타이드는 아래와 같이 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, 역상크로마토그래피를 차례로 수행하여 단계별로 분리ㆍ정제하였다.
이온교환크로마토그래피
이온교환크로마토그래피는 HiLoad 16/10 Q-Sepharose 칼럼을 장착한 AKTA Purifier 시스템(GE Healthcare Life Science, MA, USA)을 사용하여 수행하였다. 유청단백질 0.5 g을 10 ml의 25 mM Tris-Cl (pH 8.0)에 녹여 7,500xg에서 20 분간 원심분리(Supra 22K, Hanil Scientific Ltd, Gimpo, Korea)하여 얻은 상층액을 0.45 ㎛ 실린저 필터로 여과하여 2 ml(단백질 함량 65 mg)을 주입하고 0.6 M NaCl을 포함한 25 mM Tris-Cl (pH 8.0)로 농도균배하여 유속 5 ml/min에서 펩타이드를 용출하였다. 용출액은 5 ml씩 분획하였으며, 280 nm와 220 nm에서 피크를 검출하였다. 농도균배조건은 표 9와 같다.
단계 25 mM Tris-Cl (pH 8.0), % 0.6 M NaCl-25 mM Tris-Cl (pH 8.0), % Column volume (CV)
wash 100 0 2
gradient 0 100 20
clean 0 100 5
regeneration 100 0 5
이온교환크로마토그래피 결과, 총 7 개의 분획을 얻었다(도 7). 분획 별 세포활성을 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 7 일 동안 분화배지를 사용하여 MC3T3-E1로 분화시켰다. 시료를 50 uM 처리하고 48 시간 후에 현미경으로 촬영하였다. 각 군당 사진 3 장에서 가장 굵은 세포의 길이를 각 10 개씩 측정하였다. 그 결과, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 분획 EX-1과 분획 EX-4에서 덱사메타손(dexamethasone)을 처리한 유도군에 비하여 각각 유의적으로 19%와 17%의 근관세포 두께(myotube diameter)가 증가하여 세포활성이 큰 것을 알 수 있었다.
크기배제크로마토그래피
가장 큰 세포활성을 나타낸 분획 EX-1과 분획 EX-4에 크기배제크로마토그래피를 수행하였다. 크기배제크로마토그래피는 Superdex peptide 10/300을 장착한 AKTA Purifier 시스템(GE Healthcare Life Science, MA, USA)을 사용하여 수행하였다. 이온교환크로마토그래피에서 얻은 활성 분획의 용매를 회전진공증발기로 휘발시키고 농축물은 HPLC급 물에 녹여 시료로 사용하였다. 주입시료량은 1 ml였고, 용출용매는 이온교환크로마토그래피에서 사용한 염을 제거하는 효과를 얻기 위해 HPLC급 물을 사용하였다. 유속 0.5 ml/min에서 1 CV를 사용하여 칼럼을 세척하고 1.5 CV로 펩타이드를 용출하면서 280 nm와 220 nm에서 피크를 검출하였다.
분획 EX-1에서 S9-10, S13, S19와 S26을 검출하였으나(도 11), S13과 S26 분획은 단백질 함량이 지나치게 낮아 폐기하고 S9-10과 S19 분획을 취했다. 분획 EX-4로부터는 S14-15, S16, S19와 S20-21를 분획하였다(도 12). 각각의 분획에 대하여 세포실험을 통해 세포활성(근관세포 두께에 미치는 영향)을 이온교환크로마토그래피에서와 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, EX/S9-10, EX1/S19, EX4/S16, EX-4/S19 분획이 근관세포 두께의 성장에 유의적인 차이를 보여 세포활성이 큰 것을 알 수 있었다(p<0.05).
역상크로마토그래피
크기배제크로마토그래피에서 얻은 활성 분획물 EX-1/S9-10, EX-1/S19, EX-4/S16 및 EX-4/S19 및 EX-4/S20-21에 역상크로마토그래피를 수행하였다. 크기배제크로마토그래피에서 얻은 활성 분획물을 Speed Vac 원심분리기(HyperVAC-MAX, Hanil Scientific Ltd, Gimpo, Korea)로 2000 rpm에서 용매를 완전히 휘발시킨 후, 펩타이드 농도 범위에 따라 100~200 ㎕의 0.1% TFA를 포함한 아세토나이트릴 용매에 녹여 역상크로마토그래피 분취용 시료로 사용하였다. 역상크로마토그래피 분취조건은 표 10과 같다.
Figure 112022070216880-pat00001
결과로 얻어진 역상크로마토그램의 패턴 중에서 피크가 겹치지 않고 분리 상태가 양호한 피크만을 분취하여 펩타이드의 아미노산 서열분석을 위한 질량분석용 시료로 사용하였다(표 11).
질량분석용 시료로 사용한 역상크로마토그래피 피크
EX-1/S9~10 분획물(1차) Ex-4/S16 분획물(1차)
역상분획물 Retention time, min 역상분획물 Retention time, min
RPC-5 12.391 RPC-4 11.182
RPC-9 14.859 RPC-5 11.651
RPC-10 15.459 RPC-7 14.267
RPC-12 20.699 RPC-8 14.640
Ex-1/S19 분획물(1차) RPC-10 16.339
RPC-12 17.231 EX-4/S16 분획물(2차)
RPC-14 20.685 RPC-2 13.188
- - RPC-3 13.771
- - RPC-6 15.747
- - EX-4/S19 분획물(2차)
- - RPC-2 13.595
아미노산 서열 분석
역상크로마토그래피에서 분리하여 수회 분취한 동일한 피크의 용매를 Speed Vac을 이용하여 완전히 증발시킨 후, 80% 아세토나이트릴(acetonitrile)에 녹이고 하나로 합쳐 다시 Speed Vac으로 용매를 완전히 증발시킨 후 건조한 시료에 15 ㎕의 증류수를 가하여 완전히 녹여 분석용 시료로 사용하였다. 분석용 시료를 ACQUITY U-HPLC@BEH 130 C18(1.7 um)를 장착한 UHPLC 시스템(Ultimate 3000, Thermo Scientific, San Jose, CA, USA)에 15 ㎕를 주입하여 0.1% formic acid/acetonitrile 농도균배로 펩타이드를 분리하고 on-line으로 연결한 질량분석기 Triple TOF 5600+ 시스템(AB SCIEX, Ontario, Canada)에서 protein pilot (AB SCIEX/peak view)프로그램을 사용하여 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하였다. 분석에 사용한 액체크로마토그래피 조건과 Q-TOF 질량분석조건은 각각 표 12, 표 13과 같다.
Figure 112022070216880-pat00002
Q-TOF 질량분석조건
Mass range 300 m/z ~ 2500 m/z
Experiment parameter CUR, 25; ISVF, 3500; GS1, 50; TEM, 500 GS2, 50
Mass range parameter CE, 44; CES, 0, DP, 80; IDIx, 0; IDUx, 5; IRD, 66,633; IRDx, 15000, IRW, 24.917; IRWx, 10000; IWIx, 0; IWUx5; XA1, 70.64
분석한 아미노산 서열은 Uniport 데이터베이스의 bovine and milk protein의 아미노산 서열과 비교하였다. 유청단백질의 주요 구성단백질인 α-lactalbumin과 β-lactoglobulin의 Uniprot의 아미노산 서열은 표 14와 같다.
α-lactalbumin과 β-lactoglobulin의 아미노산 서열
α-lactalbumin 1 11 21 31 41 50
MMSFVSLLLV GILFHATQAE QLTKVEVFRE LKDLKGYGGV SLPEWVCTTE
51 61 71 81 91 100
HTSGYDTQAI VQNNDSTEYG LFQINNKIWC KDDHNPHSSN ICNISCDKFL
101 111 121 131 141
DDDLTDDIMC VKKILDKVGI NYWLAHKALC SEKLDQWLCE KL
β-lactoglobulin 1 11 21 31 41 50
MKCLLLALAL TCGAQALIVT QTMKGLDIQK VAGTWYSLAM AASDISLLDA
51 61 71 81 91 100
QSAPLRVYVE ELKPTPEGDL EILLQKWENG ECAQKKIIAE KTKIPAVFKI
101 111 121 131 141 150
DALNENKVLV LDTDYKKYLL FCMENSAEPE QSLACQCLVR TPEVDDEALE
151 161 171 178
KFDKALKALP MHIRLSFNPT QLEEQCHT
펩타이드 DKFLD는 α-lactalbumin의 97번째 내지 101번째 아미노산에 해당한다. 펩타이드 DKFLD는 분획물에서 검출되어 지표물질 펩타이드로 사용 가능할 것으로 추정하였다.
실험예 4-2: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 합성
아미노산 서열분석을 통해 확인한 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드는 일반고상합성법에 따라 A&pep(서울, 한국)에서 합성하였으며, 합성 펩타이드 DKFLD의 분자량과 순도는 각각 636.71 Da과 96.76%였다.
실험예 4-3: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 정량
Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 정량은 Watchers 120 ODS-BP(4.6x250 mm, 5 ㎛) 컬럼을 이용하였으며 Waters2695 HPLC 시스템(Milford, MA, USA)으로 실시하였다. 분석장비를 제외한 분석조건은 동일하게 적용하였다. 유청단백 가수분해물 시료는 별도의 전처리를 하지 않고 유청단백 가수분해물 분말 0.5 g을 HPLC급 증류수에 완전히 녹여 10 ml로 정용한 후 원심분리(13,000 rpm, 15 min)하여 얻은 상층액을 0.45 ㎛ 실린저 필터로 여과하여 분석용 시료로 사용하였다. HPLC시스템에서 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드 정량을 위한 분석조건은 표 15와 같다.
Figure 112022070216880-pat00003
펩타이드 DKFLD는 동일한 HPLC 시스템에서 Retention Time 10.400 min에서 검출되었고 유청 단백질 가수분해물에서도 인접한 피크의 간섭없이 정량이 가능한 형태의 분리능을 보였다(도 14). HPLC 분석을 위한 유청단백 가수분해물의 시료 전처리 과정은 수행하지 않았다. DKFLD는 cLog 값이 -0.84이고, 용해도 값이 10.7 mg/mL로서 친수성 펩타이드로 예측되어 순상과 역상 Sep-Pak고상 칼럼에서 물에 용출될 우려가 있고, 현장 적용 시에 시료 전처리에 걸리는 시간을 절약하는 것이 유리할 것으로 예상하여 전처리 과정을 생략하여 정량하였다.
Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 제조공정 단계별 함량을 측정하였다(도 15). 3 개의 lot 유청단백 가수분해물 0.5 g을 각각 3 회 분석한 총 9 개 시료를 측정한 평균값과 표준편차값을 이용하여 측정하였다. 함량은 4.94±0.59 mg/g-sample, RSD(%)값은 4.51%로서 5% 이내의 정밀도를 가지고 있었다.
실험예 4-4: 유청단백 가수분해물 별 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드 함량 비교
본 발명의 유청단백 가수분해물(실시예 I)과 타사 유청단백 가수분해물의 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드 함량을 비교하였다. 타사 유청단백 가수분해물로는 알라 유청단백 가수분해물(Arla Foods Ingredients, Arla SP-8011, 알라웨이프로틴), 힐마 유청단백 가수분해물(Hilmar Ingredients, Hilmar8010), 머레이걸번 유청단백 가수분해물(Murray Goulburn Co-operative, 대한민국 등록특허 제1311318호의 실시예 2)를 사용하였다.
그 결과, 표 16에 나타난 바와 같이, 본 발명의 유청단백 가수분해물에서만 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드가 검출되었으며, 그 외의 유청단백 가수분해물에서는 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드가 검출되지 않아, 본 발명의 제조방법에 의해서만 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드가 생성됨을 알 수 있었다.
구 분 실시예 I Alra Hilmar Murray Goulburn
DKFLD 함량 2~10 mg/g 불검출 불검출 불검출
실험예 4-5: 사용 효소 및 효소 투입 방법에 따른 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 함량 비교
유효성분인 펩타이드 DKFLD(Asp-Lys-Phe-Leu-Asp)의 최대 수율을 위하여 다양한 효소처리 방법을 시도하였다. 그 결과, 표 17에 나타난 바와 같이, 1차효소반응으로 endo 효소인 알칼레이스(Alcalase) 및 프로타맥스(Protamex) 4 시간 반응 후, exo 효소인 플라보자임(Flavourzyme)을 15 시간 반응하는 것이 가장 수율이 좋음을 확인하였다. 모든 효소는 원료 대비 0.2% 투입하였다.
효소 처리 방법 유효성분(DKFLD) 함량
Alcalase, Protamex 4 시간
Flavourzyme 15 시간		 2~10 mg/g
Flavourzyme 4 시간
Alcalase 및 Protamex 15 시간		 1~5 mg/g
Alcalase 및 Protamex
19 시간		 불검출
Flavourzyme
19 시간		 불검출
Alcalase, Protamex, Flavourzyme
19 시간		 2~6 mg/g
실험예 5: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 성장기능성 확인
골은 석회화된 견고한 표면과 골수로 불리는 내부의 세포 성분이 결합된 특수조직이다. 골 표면에 위치하는 조골세포는 세포막에 당단백 효소인 알칼라인 포스파테이스(alkaline phosphatase, ALP)를 가지고 있으며 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테오폰틴(osteopontin, OPN), 골 시알로당단백질(bone sialoprotein, BSP)과 같은 골 기질 물질을 분비하고 석회화시키는 역할을 한다고 알려져 있다.
ALP는 특히 조골세포 분화과정에 관여하며, 이 효소의 상대적인 활성도에 따라 조골세포의 분화단계를 확인할 수 있다. 즉, 골 조직에 존재하는 ALP의 경우 골 성장이 활발히 진행될 때 이 효소의 활성 역시 증가한다.
골조직의 생성과정 중 마지막 단계는 원시 세포가 골화되는 석회화단계이다. 골 결절(Bone nodule)은 조골세포의 분화에 중요한 표식인자로서 칼슘에 특이적으로 흡착력이 높은 알리자린(alizarin)을 이용하여 확인할 수 있다. 이 식물성 염료는 석회화된 세포의 세포외기질에 염색되므로 석회화 정도가 진행될수록 진하게 염색된다.
MC3T3-E1 세포는 마우스 두개관(mouse calvaria)으로부터 유래한 조골세포로 생체 내에서 일어나는 증식, 분화, 석회화 등의 유사한 대사적 특징이 있으며, 특히 세포막에 당단백질인 ALP가 있어 골 형성과 관련된 연구에서 유용하게 사용되고 있으므로, 실험에 사용하였다.
실험예 5-1: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 세포독성 측정
세포 독성은 WST-1 assay를 이용하여 측정하였다. 96 웰 플레이트에 최종 배양액이 100 ㎕/well이 되도록 세포를 배양한다. 세포배양 24 시간 후 배지를 교체하고 농도별로 샘플을 처리한다. 샘플처리 후 2 시간 내지 4 시간 배양한 후 Premix WST-1을 1 웰당 10 ㎕씩 더하고 2~4시간 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 16는 MC3T3-E1 세포에 대한 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 16에 나타난 바와 같이, 증식배지(Control) 세포 생존능이 감소한 시험군이 없으므로, Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드는 250 ppm까지 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
실험예 5-2: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드 처리에 따른 ALP 활성 평가
96 웰 플레이트에 시료(실시예 I)(80 ㎕)웰 및 표준 (120 ㎕)웰을 세팅하였다. 시료는 BCA 분석(Bicinchoninic acid assay)을 통해 동일 양을 첨가하여 주고, 필요 시 희석해주었으며, 희석은 ALP 분석 버퍼(ALP assay buffer)를 이용하였다. 시료 웰 80 ㎕에는 중지 용액(stop solution)을 20 ㎕ 첨가하였으며, 표준 웰에는 중지 용액을 첨가하지 않았다. 그 후, 시료 웰 80 ㎕에만 5 mM pNPP 용액 50 ㎕를 첨가하였으며, 표준 웰에만 ALP 효소 용액(ALP enzyme solution) 10 ㎕을 첨가하였다. 빛을 차단한 상태로 37℃에서, 60 분간 인큐베이션하였다. 이후 시료 웰 및 표준 웰 모두에 중지 용액을 20 ㎕씩 첨가하여 반응을 종결하고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 17 및 도 18에 나타난 바와 같이, 3 일차의 경우 및 7 일차의 경우 모두 Normal(증식배지) 대비 Control(분화배지)는 유의적으로 차이가 있으므로 실험이 유효함을 확인하였고, Control군 대비 시험군 간에도 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며, 125 ppm부터는 p=0.05에서 Duncan 사후분석 시 통계적으로 Control군과 유의한 차이가 있었음을 알 수 있었다.
따라서, Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드는 조골세포의 분화를 촉진하는 기능성이 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5-3: Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드 처리에 따른 골석회화 형성도 분석
MC3T3-E1 세포를 PBS로 2 회 세척(washing)한 후, 10% 포르말린을 이용하여 30 분 간 세포 고정하였다. 석션(Suction) 후 Alizarin red S(pH 4.2) 염색 용액으로 충분히 염색하였다. 증류수로 2 회 가량 세척(washing) 후 10% cetylpyridinium chloride in 10 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 넣어 용출하였다. 이후, 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 19 및 도 20에 나타난 바와 같이, 3 일차의 경우 및 7 일차의 경우 모두 Normal(증식배지) 대비 Control(분화배지)이 유의적으로 차이가 있으므로 실험이 유효함을 확인하였고, Control군 대비 시험군 간에도 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며, 62.5 ppm부터는 p=0.05에서 Duncan 사후분석 시 통계적으로 Control군과 유의한 차이가 있었음을 알 수 있었다.
따라서, Asp-Lys-Phe-Leu-Asp(DKFLD)로 이루어진 펩타이드는 골석회화 진행을 촉진하는 기능성이 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (15)

  1. Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 골 성장 촉진용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유청단백 가수분해물을 포함하는 것인, 골 성장 촉진용 식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은 유청단백 가수분해물 총 중량을 기준으로 0.5 mg/g 내지 40 mg/g인 것인, 골 성장 촉진용 식품 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유청단백 가수분해물은 유청단백을 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테이스(Endo protease)로 1차 가수분해하고, 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테이스(Exo protease)로 2차 가수분해한 것인, 골 성장 촉진용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테이스(Endo protease)는 알칼레이스(Alcalase), 프로타맥스(Protamex), 또는 이들의 혼합효소이고; 상기 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테이스(Exo protease)는 플라보자임(Flavourzyme)인 것인, 골 성장 촉진용 식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 혼합효소는 알칼레이스(Alcalase)와 프로타맥스(Protamex)가 1:0.5 내지 1:2의 중량비로 혼합된 것인, 골 성장 촉진용 식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 성장 촉진은 골 길이 또는 골 부피의 성장 촉진에 의한 것인, 골 성장 촉진용 식품 조성물.
  8. Asp-Lys-Phe-Leu-Asp로 이루어진 펩타이드를 포함하는 골 성장 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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