TWI673053B - 松果菊苷作為飢餓素受體促效劑之用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容係關於一種將松果菊苷作為飢餓素受體促效劑，來刺激生長激素分泌之用途，據以改善飢餓素受體活性低下之相關病症。

Description

松果菊苷作為飢餓素受體促效劑之用途

本揭示內容係關於一種飢餓素受體促效劑。具體來說，本揭示內容係關於松果菊苷（echinacoside）作為一種飢餓素受體促效劑之用途，據以刺激生長激素分泌。

就人類正常生理學而言，人類生長激素的分泌會隨著年齡增長而逐漸減少，而生長激素分泌減少目前認為與年長者常見的代謝與老化相關症狀的發生有重要關聯性，例如引發倦怠感、食慾不振、脂肪組織增加、肌肉及骨密度減少、心血管疾病的發生、神經退化性疾病的風險增加、學習認知能力降低、免疫系統功能下降，以及睡眠品質變差等。儘管目前科學界對於生長激素隨年齡增長而分泌減少的原因與機制尚未完全瞭解，在臨床上已有生長激素相關的醫療應用，例如補充生長激素能改善衰老相關現象，包括增加體重、增加肌肉質量及強度、降低體內總脂肪、增加肌肉骨骼密度及提升葡萄糖代謝效率；在中樞神經系統（central nervous system；CNS）中，生長激素具有改善睡眠、提高認知能力及神經細胞存活的功效；而補充適當劑量，能夠減緩急性相關疾病及手術後造成的不適等。然而，直接施用生長激素常引發相關的副作用，例如水腫、關節腫脹、關節疼痛、腕隧道症候群、男性乳房發育症等，並有引發胰島素阻抗而增加糖尿病的風險。

目前醫學研究認為上述副作用可能係直接改變人體生長激素分泌的頻率所導致，為減輕上述直接施用生長激素所引發相關副作用的問題，近年來科學界朝向調控生長激素之相關上游之荷爾蒙：飢餓素（ghrelin），或功能與飢餓素相同的類飢餓素化合物（即飢餓素受體促效劑）方面，來開發藥物以達到調控生長激素分泌的作用，其係刺激生長激素分泌的脈衝而非影響分泌頻率，而可用於治療生長激素分泌不足所引發的相關疾病，進而減輕直接施用生長激素所引發改變分泌頻率而導致相關副作用的問題。

飢餓素是一段由28個胺基酸所組成的多胜肽激素，為一種G蛋白聯偶受體（G protein-couple receptor，GPCR）：生長激素分泌受體（growth hormone secretagogue-1a receptor，GHS-R1a）的配體。該生長激素分泌受體主要分布在下視丘與腦下垂體，飢餓素活化生長激素分泌受體後，主要經由下視丘增加食慾及刺激腦下垂體前葉釋放生長激素等生理作用。此外，飢餓素對於體內代謝、能量平衡與腸胃功能也具有調節的功能。因此，有鑑於飢餓素的上述功能，目前科學界以開發功能與飢餓素相同的類飢餓素化合物（即飢餓素受體促效劑）作為治療生長激素分泌不足相關疾病的方向為主。已有文獻指出，在老化的人類與動物模式中，投予飢餓素與其口服合成衍生物之後發現能刺激食慾、增加生長激素分泌的脈衝、減少脂肪組織與提高骨質轉換率，而投予飢餓素促效劑亦具有改善心血管疾病與學習認知能力的功效。

基於上述，目前認為透過飢餓素受體活化的機制治療該些疾病，是非常具有潛力的治療模式。然而，依據文獻報導，目前合成的飢餓素受體促效劑口服藥物仍有引發輕微水腫、肌肉疼痛、血糖增加、嘔吐與腹瀉的風險，迄今尚未找到無副作用之飢餓素受體促效劑藥物，在市面上也尚未出現適合用於臨床治療的飢餓素受體促效劑。有鑒於此，相關領域亟需開發適用於臨床之飢餓素受體促效劑藥物，來治療生長激素分泌不足所引發的相關疾病。

下文呈現本發明的簡單概要，以利讀者對本發明有基本的理解。本概要並非對本發明的廣泛性概觀，亦非鑑定本揭示內容之關鍵的／決定性的元件，或勾勒本揭示內容的範圍。它唯一的目的在於以一種簡化的形式呈現本發明某些概念，作為後續呈現更多詳細說明的序幕。

本發明基於上述之目的並發現，藉由生物資訊進行分子對接（molecular docking）模擬研究，化合物松果菊苷與文獻報導中的茶飢素（teaghrelin）及銀杏飢素（ginkgoghrelin），三者在與飢餓素受體結合方面，均具有類似於飢餓素與飢餓素受體結合的模擬分子結合數據（數據未顯示），因此，發明人以此作為出發點，進行實驗來驗證松果菊苷可與飢餓素受體結合，具有與飢餓素相同的調控路徑，進而調控生長激素的分泌。

本揭示內容之第一態樣提供一種松果菊苷於製備一用以活化飢餓素受體之藥物的用途，據以刺激生長激素分泌，其中該松果菊苷係作為飢餓素受體促效劑。

在一實施方式中，本揭示內容藥物更包含一毛蕊花苷（acteoside）及／或一管花苷A（tubuloside A）。在一特定實施例中，該松果菊苷、該管花苷A及該毛蕊花苷於該藥物中的含量比例約為20：2：3。

在另一實施方式中，本揭示內容藥物更包含茶飢素、銀杏飢素及／或參首烏飢素（emoghrelin）。

在某些視需要而採用的實施方式中，本揭示內容藥物可為醫藥組合物或食品組合物。

本揭示內容之第二態樣係關於一種用以預防及／或治療一個體之飢餓素受體活性低下之相關病症的方法。

依據某些實施方式，該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容藥物。

依據本揭示內容實施方式，該飢餓素受體活性低下之相關病症係由於生長激素分泌不足所引起。舉例來說，該飢餓素受體活性低下之相關病症包括，但不限於，生長激素缺乏症、惡質症、厭食症、敗血症、多發性硬化症、憂鬱症、功能性消化不良、呼吸道發炎、腸阻塞，以及其組合。

本揭示內容一或多個實施方式的詳細內容及說明闡述如下。在參閱以下的詳細說明及申請專利範圍後，本揭示內容的其餘特徵及優點將顯而易見。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

「個體」（subject或individual）或「病患」（patient）一詞係指脊椎動物。在某些實施方式中，該脊椎動物係指「哺乳動物」（mammal）。此處「哺乳動物」（mammal）一詞係指哺乳綱的所有成員包括，但不限於，人類；靈長類動物（例如猴子及黑猩猩）；家用及農用動物（例如豬、綿羊、山羊、乳牛、馬及牛）；運動用動物、寵物（例如貓、狗及兔）；囓齒類動物（例如小鼠、大鼠及天竺鼠）。在某些實施方式中，該哺乳動物係指可用本揭示內容之發明的方法治療之人。除非有具體指出其中一種性別，「個體」或「病患」一詞意旨性別為男性或女性二者。

此處「施用」（application）與「投予」（administration）等詞在本揭示內容中可交替使用，其係指將本揭示內容藥物給予需要治療的個體。

在本揭示內容中「治療」（treating或treatment）一詞，係指對一個體施用或投予本揭示內容藥物，其中該個體具有飢餓素受體活性低下之相關病症的症狀，或有罹患該病症之傾向；其目的在於治癒（cure）、瘉合（heal）、緩和（alleviate）、緩解（relieve）、改變（alter）、補救（remedy）、改善（ameliorate）、改進（improve），或影響（affect）患病情形、患病症狀，或有患病之傾向。

此處之「有效量」（effective amount）—詞係指一種藥劑（例如本揭示內容藥物）的用量足以產生一期望的治療反應。換句話說，「有效量」一詞係指一種有效的必要劑量，以達到期望的治療性或預防性效果。為治療的目的，一有效量亦指一種藥物之成分的治療利益效果超越該成分的毒性或有害影響。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，並以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的有效量取決於多種因素，諸如所欲治療的特定狀況、個體的生理條件（例如個體體重、年齡或性別）、接受治療的動物種類、治療持續時間、並行療法（若有的話）的本質，及所用的具體劑型，以及該化合物或其衍生物之結構。可利用任何適當的方式來表示有效量。舉例來說，可將藥劑的有效量表示成藥物總重量（例如公克、毫克或微克）或表示成藥物重量相對於體重的比例（例如每公斤體重幾毫克（毫克／公斤，mg/Kg））。或者，可將藥劑的有效量以濃度來表示，例如摩爾濃度（molar concentration）、重量濃度（mass concentration）、體積濃度（volume concentration）、重量摩爾濃度（molality）、摩爾分率（mole fraction）、重量分率（mass fraction）及混合比例（mixing ratio）。適當的劑量範圍介於每公斤體重0.01毫克至100.0毫克。當可理解，大範圍地調整所需劑量也是可預期的，其視多樣化的組合物及各樣的投予路徑所致不同效力而定。舉例而言，相較於靜脈注射，預期口服需要較高的劑量。本領域技術人員可完全理解依據經驗法則來調整劑量。具體而言，有關本揭示內容中的藥劑之「有效量」，在本揭示內容中係指足以緩和（alleviate）或改善（ameliorate）個體體內與飢餓素受體活性低下之相關病症的使用劑量。本領域技術人員可基於實驗動物模式取得的劑量換算成藥物（諸如本揭示內容藥物）的人體等效劑量（human equivalent dose，HED）。舉例來說，本領域技術人員可依據美國食品藥物管理局（US Food and Drug Administration，FDA）所公告的「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式的最大安全起始劑量」（Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers）來估算人體使用的最高安全劑量。

本揭示內容至少部分係基於分子對接的生物資訊模擬研究而意外地發現松果菊苷具有類似於茶飢素或銀杏激素等飢餓素受體促效劑與飢餓素受體結合的位點（數據未顯示），以此為起點而進行實驗來驗證松果菊苷可實際與飢餓素受體相互結合，並具有促進飢餓素受體（例如GHS-R1a）下游基因表現的作用，其中該下游基因之一為生長激素。同時發現，松果菊苷在結合飢餓素受體後所觸發的訊息傳導路徑與GHRP-6與GHS-R1a結合後所觸發的訊息傳導路徑相同。有鑑於此，本揭示內容提出用以治療飢餓素活性低下之相關病症的方法，該方法是以松果菊苷作為活性成分，將包含松果菊苷的藥物投予一有需要治療之個體，其中該個體具有飢餓素活性低下之相關病症。當可理解，本揭示內容亦涵蓋上述活性成分松果菊苷於製備一用以活化飢餓素受體之藥物的用途，以及所述藥物本身。

本揭示內容的第一種態樣是關於一種松果菊苷於製備一用以活化飢餓素受體之藥物的用途，其中該松果菊苷係作為飢餓素受體促效劑來活化飢餓素受體，進而刺激生長激素的分泌。

本揭示內容之松果菊苷可萃取自天然植物或以人工合成，其中該天然植物包括，但不限於，荒漠肉蓯蓉（ Cistanche deserticola）、管花肉蓯蓉（ Cistanche tubulosa）、鹽生肉蓯蓉（ Cistanche salsa）、白花鹽蓯蓉（ Cistanche salsa var. albiflora）或沙蓯蓉（ Cistanche sinensis）。較佳地，本揭示內容松果菊苷係萃取自荒漠肉蓯蓉或管花肉蓯蓉。依據一特定實施例，松果菊苷係萃取自管花肉蓯蓉。在該實施例中，先將管花肉蓯蓉研磨為粉狀後，水煮萃取該粉狀產物，之後藉由過濾及濃縮等步驟處理以製備本揭示內容松果菊苷。

一般來說，可利用蒸餾、再結晶、萃取、昇華、分別沉澱、管柱色層分析（例如凝膠色層分析及蛋白質快速液相色層分析（fast performance liquid chromatography，FPLC））、薄層色層分析等方法來進行純化。在一具體實施例中，係藉由FPLC來純化本揭示內容松果菊苷。

可利用任何本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知之方法來分析（或鑑定）萃取產物（即松果菊苷）。舉例來說，化學分析（例如滴定分析、重量分析及微譜分析）、光譜分析（例如旋光光譜、原子光譜分析及分子光譜分析）、質譜分析、核磁共振譜、色層分析（例如管柱色層分析之離子交換色層分析、凝膠色層分析、親和色層分析及高效能液相色層分析（high performance liquid chromatography，HPLC），或薄層色層分析）、紅外光譜法，或其組合（例如液相層析串聯質譜儀（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS））。在一實施例中，是利用HPLC來分析萃取產物之組成成分。在另一實施例中，是利用LC-MS來分析萃取產物之組成成分。

依據本揭示內容一實施方式，本揭示內容松果菊苷具有式(I)的化學結構： (I)

非必要性地，本揭示內容之藥物更包含毛蕊花苷及／或管花苷A。依據某些實施方式，本揭示內容之藥物包含松果菊苷、管花苷A及毛蕊花苷，其於藥物中的含量比例約為20：0.01-50：0.01-50；較佳為20：1-10：1-10；更佳為20：2：3。在該些實施方式中，管花苷A及／或毛蕊花苷可相加地（additively）或加乘地（synergistically）增加松果菊苷於活化飢餓素受體的功效。

亦非必要性地，本揭示內容之藥物更包含茶飢素、銀杏飢素及／或參首烏飢素。依據某些實施方式，本揭示內容之藥物包含松果菊苷、銀杏飢素及／或參首烏飢素。在該些實施方式中，銀杏飢素及／或參首烏飢素可相加地或加乘地增加松果菊苷於活化飢餓素受體的功效。

當可想見，本揭示內容之藥物可更包含其他已知之飢餓素受體促效劑，以增加松果菊苷於刺激生長激素分泌的功效，例如地爾硫卓（diltiazem）或地爾硫卓類似物（diltiazem analog）、四氫吡唑並吡啶衍生物（tetrahydropyrazolopyridine derivative）、3-螺環哌啶衍生物（3-spirocyclic piperidine derivative）、苯並噻唑（benzothiazole）、腺苷（adenosine）、艾瑞莫瑞林（alexamorelin）、阿拉莫林（anamorelin）、卡普瑞林（capromorelin）、扎來普隆（pyrazolopyridine，CP-464709）、皮質抑素-14（cortistatin-14）、艾沙瑞林（examorelin）、海沙瑞林（hexarelin）、生長激素釋放肽-1（growth hormone releasing peptide-1，GHRP-1）、生長激素釋放肽-3（growth hormone releasing peptide-3，GHRP-3）、生長激素釋放肽-4（growth hormone releasing peptide-4，GHRP-4）、生長激素釋放肽-5（growth hormone releasing peptide-5，GHRP-5）、生長激素釋放肽-6（growth hormone releasing peptide-6，GHRP-6）、伊布莫崙（ibutamoren，MK-0677）、伊帕瑞林（ipamorelin）、馬西瑞林（macimorelin）、普拉莫瑞林（pralmorelin）、瑞拉莫瑞林（relamorelin）、他莫瑞林（tabimorelin）、烏利莫瑞林（ulimorelin）、L-692585、LY-426410、LY-444711、SM-130,686、TZP-101、TZP-102，以及其組合。

當可理解，可將本揭示內容藥物配製成一藥學製劑，其中該藥學製劑適用於所期望的投予模式。依據本揭示內容及所主張的發明概念配製的某些藥物，可為一種適用於病患口服使用的單一單位劑量形式。例示性之口服劑量形式包括，但不限於，錠劑（tablets）、膠囊型錠劑（caplets）；膠囊（例如彈性凝膠膠囊）、錠劑（cachets）、片劑（troches）、粉劑、懸浮液（例如水性或非水性之液態懸浮液、水包油乳液，或油包水液態乳液）、分散液、溶液，以及酏劑（elixirs）。本揭示內容範圍亦涵蓋該些藥學製劑。

本揭示內容的第二種態樣，是關於一種用以預防及／或治療一個體之飢餓素受體活性低下之相關病症的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容藥物。在治療期間內，可於不同的時間間隔、經由不同的途徑對該個體投予本揭示內容藥物。舉例來說，可經由口服（orally）或非口服投予（parenterally）、靜脈注射（intravenously）、皮下注射（injection subcutaneously）或皮下植入（implantation subcutaneously）、肌肉注射（intramuscularly）、脊髓腔內注射（intrathecally）、腹膜内注射（intraperitoneally）、皮內注射（intracuteanously）、胸骨注射（intrasternally）、關節內注射（intraarticularlly）、顱內注射（intracranially）、病灶內注射（intralesionally）、直腸內注射（intrarectually）、陰道內注射（intravaginally）、鼻内注射（intranasally）、腸胃注射（intragastically）、氣管內注射（intratracheally），或肺內注射（intrapulmonarily）等途徑來投予。

本揭示內容藥物之有效量約為每日每公斤體重0.001毫克至1,000毫克；較佳地，約為每日每公斤體重0.01毫克至100毫克；更加地，約為每日每公斤體重0.1毫克至10毫克。在一特定實施例中，本揭示內容藥物之有效量約為每日每公斤體重0.6毫克。

依據本揭示內容實施方式，該飢餓素受體活性低下之相關病症係由於生長激素分泌不足所引起。舉例來說，該飢餓素受體活性低下之相關病症包括，但不限於，生長激素缺乏症、惡質症、厭食症、敗血症、多發性硬化症、憂鬱症、功能性消化不良、呼吸道發炎、腸阻塞，以及其組合。

本揭示內容的第三種態樣提供一種松果菊苷於製備食品、飲料或飼料的用途。

本揭示內容食品、飲料或飼料含有、添加及／或稀釋前述之有效成分，對於飢餓素受體活性低下之相關病症的改善或預防非常有用。本揭示內容食品、飲料或飼料的製造法並無特別限定，僅須遵循一般食品、飲料或飼料的配合、調理或加工等方法製造即可，只要於所得到的食品、飲料或飼料含有、挑加及／或稀釋前述之有效成分，即達到本揭示內容目的。

本揭示內容之食品或飲料種類並無特別限定。舉例來說，可為包含前述之有效成分的穀類加工物（例如小麥粉加工品、澱粉類加工品、增補營養食物加工品、麵類、通心粉、麵包、麵麩、米粉、冬粉、包裝餅）；油脂加工品（例如可塑性油脂、沙拉油、美乃滋、調味汁）；大豆加工品（例如豆腐、味噌、納豆）；食肉加工品（例如火腿、醺豬肉、香腸）；水產製品（例如冷凍磨碎魚肉、魚糕、竹輪、魚肉山芋丸子、魚丸、乾柴魚、魚卵加工品、水產罐頭、佃煮）；乳製品（例如原料乳、奶油霜、乳酪、奶油、起司、煉乳、粉乳、冰淇淋）；蔬果加工品（例如糊狀類、果醬類、漬類、果實飲料、蔬菜飲料、混合飲料）；點心類（例如巧克力、餅乾類、蛋糕、米菓）；酒精飲料（例如日本酒、中國酒、葡萄酒、威士忌、燒酒、伏特加、白蘭地、琴酒、萊母酒、啤酒、果實酒、甜酒飲料）；茶飲（例如綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料）；調味料（例如醬油、醬汁、醋、料理酒）；罐裝／瓶裝／袋裝食品（例如牛飯、釜飯、紅飯、咖哩飯、調理食品）；半乾燥或濃縮食品（例如肝醬、其他塗味食品、蕎麥烏龍麵汁、濃縮湯類）；乾燥食品（例如速食麵、速食咖哩、即溶咖啡、果汁粉、粉沫湯包、速食味噌湯、調理飲料、調理湯類）；冷凍食品（例如壽喜燒、茶碗蒸、燒鰻、肉餅牛排、燒賣、餃子、各種冷凍半加工食品）；固形食品或液體食品；香辛料類等之農林產加工品、畜產加工品、水產加工品等。

本揭示內容之飼料種類並無特別限定。舉例來說，可為包含前述之有效成分的動物性原料（例如魚粉、酪蛋白、章魚腸粉）；植物性原料（例如大豆粕、小麥粉、澱粉）；微生物原料（例如飼料用酵母）；動物性油脂（例如鱈魚肝油、烏賊肝油）；植物性油脂（例如大豆油、菜種油）；其他原料（例如維他命類、礦物質類、胺基酸、抗酸化劑）之人工配合飼料，或魚肉碎末等之魚類用飼料。

本揭示內容的第四種態樣提供一種用以篩選一有潛力之飢餓素調節劑的方法，包含下列步驟：(a) 輸入一GHS-R1a蛋白質序列至一可運算分子對接之軟體，並移除模型表面第V184至N196位置的彈性突出環部分；及(b) 輸入一測試化合物之三維結構至該可運算分子對接之軟體中；其中，以生長激素釋放肽-6（growth hormone-releasing peptide-6，GHRP-6）之三維結構佔據該GHS-R1a之位點為活性中心區域，該測試化合物可進入該活性中心區域者，為一有潛力之飢餓素調節劑。

下文提出多個實施例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實施例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝人士在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

材料與方法

一、實驗材料

（一）肉蓯蓉樣品來源

管花肉蓯蓉購買自和田天力沙生藥物開發有限責任公司（新疆和田）；荒漠肉蓯蓉購買自鴻桭天然生技股份有限公司。

（二）實驗動物

使用購買自樂斯科生物科技股份有限公司（BioLASCO Taiwan Co., Ltd），體重約250至300公克之史－道二氏大鼠（Sprague-Dawley，SD）品系之雄性大鼠。實驗前每兩隻動物飼養於一鼠籠中，置於動物房適應一週，實驗動物採自由進食和自由飲水，飼料使用實驗鼠飼料（laboratory rodent diet 5001）：蛋白質28.672％，脂質13.384％，碳水化合物57.944％。光照週期為12小時光照與12小時黑暗，溫度為23±1°C，濕度為60±10％。所有試驗皆遵照與通過國立中興大學實驗動物照護及使用委員會（IACUC）之規範（IACUC編號：106-079）。

二、實驗方法

（一）樣品萃取步驟與製備

將荒漠肉蓯蓉及管花肉蓯蓉以粉碎機將其粉碎後，各取25克之粉末與500毫升50°C去離子水均勻混和，以50°C水浴1小時，重複三次，收集萃取液（共1500毫升）冷卻後，利用抽氣過濾去除萃取液中不溶之雜質，再以減壓濃縮機使體積濃縮，其中一部分以冷凍乾燥機乾燥成粉末保存，另一部分以0.45微米之濾膜進行過濾，取適當萃取液加入樣品瓶，以利HPLC分析。

（二）樣品成分分析

使用HPLC進行荒漠肉蓯蓉及管花肉蓯蓉成分分析，層析條件如下：層析管柱為Syncronis C18（4.6毫米×250毫米，5微米）、進樣量為40微升、流速為每分鐘0.8毫升、偵測波長為330奈米、流動相A為0.1％甲酸水溶液、流動相B為100％乙腈；沖提梯度為：(1) 0至3分鐘，14％流動相B、(2) 3至4分鐘，17％流動相B、(3) 4至15分鐘，17％流動相B、(4) 15至20分鐘，20％流動相B、(5) 20至50分鐘，20％流動相B、(6) 50至60分鐘，14％流動相B之順序進行梯度沖提。

（三）LC-MS鑑定松果菊苷

使用LC-MS之電灑游離法（electrospray ionization，ESI）負離子模式，樣品圈為5毫升，全掃描（full scan）之掃瞄範圍為質量／電荷比值（質荷比，m/z）400-1000，相對碰撞能量（relative collision energy）為35電子伏特（eV）及45電子伏特；液相層析條件如下：管柱為Syncronis C18（4.6毫米×250毫米，5微米）、流速為每分鐘0.8毫升、流動相A為0.1％甲酸水溶液、流動相B為100％乙腈；分離條件為：(1) 0至24分鐘，14％流動相B、(2) 24至25分鐘，17％流動相B、(3) 25至36分鐘，17％流動相B、(4) 36至37分鐘，20％流動相B、(5) 37至80分鐘，20％流動相B、(6) 80至90分鐘，14％流動相B之順序進行梯度沖提。

（四）純化松果菊苷

將初萃液凍乾之粉末，透過FPLC分離純化得到松果菊苷。FPLC使用約100毫升之凝膠Sephadex LH-20膠體溶液凝結而成之管柱，以每分鐘0.7毫升流速之10％甲醇水溶液進行純化，沖提體積至300毫升，並利用自動集樣器收集各留分，吸光值為245奈米，依據分析圖譜顯示之波峰收集含有松果菊苷之特定留分，利用真空旋轉減壓濃縮機抽乾後，以冷凍乾燥機乾燥成粉末保存。

（五）大鼠腦下垂體初代細胞之培養

本實驗以活體SD品系之雄性大鼠（N=6），體重約250至300公克，作為腦下垂體初代細胞之動物來源。使用舒泰50（每公斤體重40毫克）將大鼠進行腹腔注射麻醉後，斷頭犧牲動物並取出腦下垂體組織並以無DFBS的DMEM清洗，利用手術刀片將組織於無菌組織空盤中切碎，分別以三種（如下述）不同酵素的剪切作用分離出初代細胞。

首先以0.25％（重量體積比，w/v）含第一型膠原酶之無DFBS的DMEM處理60分鐘後，離心5分鐘去除上清液，並加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-乙二胺四乙酸培養15分鐘，接著離心5分鐘去除上清液，最後將細胞液均勻混和於16單位的去氧核糖核酸酶I（DNase I）中，並透過100微米之細胞過濾篩網過濾，最終獲得單一細胞懸浮液，以每孔4×10 ⁴個細胞之細胞密度種於96孔盤，內含有10％DFBS之DMEM進行培養，培養溫度條件為37°C及含有5％CO ₂，培養兩天待細胞穩定。

（六）生長激素分泌測定

培養兩天後，將培養液置換成無DFBS的DMEM，於培養箱培養90分鐘，再依照實驗分組置換成含有藥物的DMEM於細胞培養盤中，靜置於培養箱15分鐘及30分鐘，分別取細胞培養液至離心管，4°C下1000g離心20分鐘，取上清液放置-80°C保存，待後續以大鼠生長激素ELISA套組測試其生長激素分泌量。

生長激素分泌量的實驗分組為：無DFBS的DMEM為對照組，松果菊苷（每升10 ^-5至10 ^-8摩爾；自管花肉蓯蓉取得）為藥物組別，已知藥物GHRP-6（每升10 ^-7摩爾）為正控制組。

在飢餓素受體拮抗實驗中，以[D-Arg ¹,D-Phe ⁵,D-Trp ^7,9,Leu11]-P物質（GHS-R1a拮抗劑，每升0.5微摩爾）為拮抗劑試驗藥物；實驗分組為：含或不含GHS-R1a拮抗劑（每升0.5微摩爾）之無DFBS的DMEM為對照組、含或不含GHS-R1a拮抗劑（每升0.5微摩爾）之松果菊苷（每升10 ^-5摩爾DMEM）為松果菊苷藥物測試組、含或不含GHS-R1a拮抗劑（每升0.5微摩爾）之GHRP-6（每升10 ^-7摩爾DMEM）為GHRP-6藥物測試組。

（七）同源模擬（homology modeling）與分子對接模擬（molecular docking）之運算

從網站SWISS-Model獲得人類GHS-R1a蛋白質序列（AAI13548）作為後續模擬之分子模型，以β1與β2腎上腺素受體結晶結構（PDB：2YCY及3PDS），與其相關配體氰咯吲哚洛爾（cyanopindolol）及FAUC50結合情形為結合依據，來建立GHS-R1a同源模擬之結合模型。其相關之配體結構在進行模擬前已先被移除，藉由環修飾模組（loop refinement（MODELER）module）在介於第H186至L210位置的環區域（loop region），將第C116及C198位置加上雙硫鍵修飾，以利化合物進行分子模擬對接，將飢餓素受體模型表面第V184至N196位置的彈性突出環移除，而建立出來的GHS-R1a結構的機率密度函數（probability density function，PDF）總能量最低。上述所有操作使用軟體平台Discovery Studio 3.5進行運算。

從網站PubChem取得松果菊苷及GHRP-6的三維結構，以GHS-R1a結構中的III-VII細胞外跨膜區連接之空腔（pocket）來定義結合區（binding pocket），並以GHS-R1a中的結合位置以半徑為14Å之球體來界定配體。將松果菊苷及GHRP-6與受體GHS-R1a進行模擬分子對接，程序由GEMDOCK及Discovery Studio 3.5中的LibDock模組進行模擬，其中相關結構之最小化能量計算以CHARMm力場最佳化進行運算，比較松果菊苷及GHRP-6之間的分子作用力，例如氫鍵、離子鍵、陽離子-π鍵及π-π鍵等作用力進行分析。

（八）統計分析

所有數值皆以平均值±標準差表示。使用統計軟體系統GraphPad Prism 6，以T檢定比較對照組與加藥組之間的差異，當p＜0.05時，具有統計的顯著差異。

實施例 1 樣品分析及化合物之純化

（一）HPLC分析管花肉蓯蓉成分

圖一為HPLC分析管花肉蓯蓉成分之結果，其係以吸光值330奈米分析圖譜來呈現。依公開文獻之數據，初步推測本實驗之松果菊苷、管花苷A及毛蕊花苷將分別在滯留時間約為27.33分鐘、49.57分鐘及50.18分鐘時會有波峰訊號出現。以松果菊苷、管花苷A及毛蕊花苷三者作為總含量而言，以曲線下面積代表各別含量，顯示松果菊苷、管花苷A及毛蕊花苷分別約占總含量之79.46％、7.83％及12.71％，據此，松果菊苷為管花肉蓯蓉中苯乙醇苷類的主要化合物。

（二）LC-MS鑑定化合物之結果

藉由LC-MS進一步鑑定管花肉蓯蓉成分之化合物。滯留時間約為27.33分鐘之波峰的分子量為786道爾頓，在第一次負離子掃描模式（質量減去氫原子，[M-H]）掃描後，獲得785質荷比（786-1=785）的訊號（圖二A左欄），並在第二次掃描後，獲得623質荷比的訊號（圖二A右欄），由上述二次掃描結果得出162質荷比（785-623=162）之片段，該片段為該波峰之分子結構中的咖啡酸（caffeic acid）（圖二A右欄），據此確認該波峰之化合物為松果菊苷（分子量為786道爾頓），其化學結構如式(I)所示。

滯留時間約為49.57分鐘之波峰的分子量為828道爾頓，在第一次負離子掃描模式掃描後，獲得827質荷比（828-1=827）的訊號（圖二B左欄），並在第二次掃描後，分別獲得665、623及785質荷比的訊號（圖二B右欄），其計算結果如下：665質荷比（827-665=162）的訊號，其中162質荷比之片段為自圖二B右欄標號1的位置斷裂所得之片段；623質荷比（827-623=204）的訊號，其中204質荷比之片段為自圖二B右欄標號2的位置斷裂所得之片段；785質荷比（827-785=42）的訊號，其中42質荷比之片段為自圖二B右欄標號3的位置斷裂所得之片段，該片段自該波峰之分子斷裂後，剩餘分子即為松果菊苷；根據上述結果確認該波峰之化合物為管花苷A。

滯留時間約為50.18分鐘之波峰的分子量為624道爾頓，在第一次負離子掃描模式掃描後，獲得623質荷比（624-1=623）的訊號（圖二C左欄），並在第二次掃描後，獲得461質荷比（圖二C右欄）的訊號，由上述二次掃描結果得出162質荷比（623-461=162）之片段，該片段為該波峰之分子結構中的咖啡酸（圖二C右欄），據此確定該波峰之化合物為毛蕊花苷。

（三）HPLC分析肉蓯蓉樣品之間的成分差異

藉由HPLC分析管花肉蓯蓉及荒漠肉蓯蓉水性萃取物之成分含量分析圖譜（圖三），可明顯發現管花肉蓯蓉中的各化合物含量遠多於荒漠肉蓯蓉。以曲線下面積代表各化合物含量，則松果菊苷約佔51.56％管花肉蓯蓉水性萃取物的含量（圖三A），而約佔13.96％荒漠肉蓯蓉水性萃取物的含量（圖三B），因此後續純化及收集松果菊苷之來源，皆以管花肉蓯蓉樣品來進行。

基本上，管花肉蓯蓉及荒漠肉蓯蓉水性萃取物於相同濃度（每500微升10毫克）下，管花肉蓯蓉之有效成分含量遠多於荒漠肉蓯蓉。在荒漠肉蓯蓉中，松果菊苷占總含量約20.33％，毛蕊花苷占總含量約21.81％；而在管花肉蓯蓉中，松果菊苷占總含量約58.08％，管花苷A占總含量約8.61％，毛蕊花苷占總含量約13.55％。綜合上述結果，管花肉蓯蓉成分含量確實高於荒漠肉蓯蓉，在兩者中並以松果菊苷占大部分的含量（圖三）。

（四）FPLC純化及收集肉蓯蓉中的松果菊苷

以FPLC純化管花肉蓯蓉水性萃取物中的松果菊苷，利用吸光值254奈米偵測，所得之純化分析圖譜如圖四A所示，並收集分析圖譜中特定波峰進行HPLC確認（圖四B），其中圖四B小圖b至g為圖四A中沖提體積約落在265至390毫升之留分範圍，圖四B小圖h至i為圖四A中沖提體積約落在680至725毫升之留分範圍，可發現松果菊苷會出現在沖提體積約為300毫升之留分範圍中，且落在如圖四B小圖b和c所示之留分範圍中其純度較高，回收該些留分後，經減壓濃縮抽乾後以水回溶，最後以冷凍乾燥得松果菊苷粉末，再經HPLC確認，其純度約90％以上（圖三C）。

實施例 2 大鼠腦下垂體 初代細胞分泌生長激素之測定

圖五闡述以松果菊苷處理大鼠腦下垂體前葉初代細胞來刺激其分泌生長激素之結果。松果菊苷的使用濃度為每升10 ^-5至10 ^-8摩爾，在給藥15分鐘（圖五A）及給藥30分鐘（圖五B）時，生長激素之分泌均呈現藥物濃度依賴性，且在二次試驗中松果菊苷（每升10 ^-5至10 ^-6摩爾）及GHRP-6（每升10 ^-7摩爾）均與對照組具有顯著的差異，且在給藥30分鐘時，松果菊苷在濃度為每升10 ^-5摩爾時，其刺激生長激素分泌量可達GHRP-6（每升10 ^-7摩爾）的1.03倍。

對於一位體重為65公斤的成人而言，其血液的體積約有5公升（65公斤×1/13=5公斤≈5公升），細胞實驗結果顯示松果菊苷的有效劑量為每升10 ^-5摩爾，相當於人體中大約需要約39.3毫克的松果菊苷（5公升×每升10 ^-5摩爾×786=3.93×10 ^-2公克=39.3毫克）。而每50公克的管花肉蓯蓉約有20.1公克的水性萃取物，1公克的管花肉蓯蓉水性萃取物約有0.76公克的松果菊苷，所以1公克的管花肉蓯蓉約有0.3公克的松果菊苷（0.76公克×20.1公克／50公克=0.3公克），以人體中大約需要約39.3毫克的松果菊苷來說，其所需管花肉蓯蓉的量為0.131公克（39.3毫克／0.3=0.131公克）。

[D-Arg ¹,D-Phe ⁵,D-Trp ^7,9,Leu ¹¹]-P物質為GHS-R1a拮抗劑，在本實驗中的使用濃度均為每升0.5微摩爾。圖六闡述以含或不含GHS-R1a拮抗劑之無DFBS的DMEM（對照組）、含或不含GHS-R1a拮抗劑之松果菊苷（每升10 ^-5摩爾DMEM）（松果菊苷組）及含或不含GHS-R1a拮抗劑之GHRP-6（每升10 ^-7摩爾DMEM）（GHRP-6組）來處理大鼠腦下垂體前葉初代細胞15分鐘後之結果，說明在上述三組處理中，GHS-R1a拮抗劑均具有抑制細胞分泌生長激素的作用。並且，GHS-R1a拮抗劑可拮抗由松果菊苷或GHRP-6所引發之刺激細胞分泌生長激素的效果。綜合上述數據結果顯示，松果菊苷及GHRP-6均是經由活化GHS-R1a來刺激生長激素的分泌。

實施例 3 以 GEMDOCK 模擬分子接合

藉由分子模擬軟體GEMDOCK進行運算，以GHRP-6結合GHS-R1a之位點作為GHS-R1a之活性中心區域，來測試松果菊苷是否能進入該活性中心區域。藉由GEMDOCK分子模擬中分數的高低，可判斷配體與受體的接合情形，其分數越低代表所耗費的能量越少，配體與目標受體接合能力越好；反之，其分數越高，代表配體與目標受體接合需耗較高能量。表一（如下文所示）為松果菊苷、茶飢素及銀杏飢素分別與GHS-R1a之活性中心區域模擬結合之結果，顯示三者均可進入GHS-R1a之活性中心區域，其中茶飢素所需之化學能為-176.65千焦耳.摩爾 ^-1，包含凡得瓦力-139.54千焦耳.摩爾 ^-1及氫鍵-37.1千焦耳.摩爾 ^-1；銀杏飢素所需之化學能為-153.96千焦耳.摩爾 ^-1，包含凡得瓦力-121.75千焦耳.摩爾 ^-1及氫鍵-21.59千焦耳.摩爾 ^-1；松果菊苷所需之化學能為-132.35千焦耳.摩爾 ^-1，包含凡得瓦力-111.82千焦耳.摩爾 ^-1及氫鍵-20.53千焦耳.摩爾 ^-1；管花苷A所需之化學能為-122.88千焦耳.摩爾 ^-1，包含凡得瓦力-103.93千焦耳.摩爾 ^-1及氫鍵-18.95千焦耳.摩爾 ^-1；毛蕊花苷所需之化學能為-120.35千焦耳.摩爾 ^-1，包含凡得瓦力-93.65千焦耳.摩爾 ^-1及氫鍵-26.7千焦耳.摩爾 ^-1。 表一、GEMDOCK比較結構接合之能量表

化合物	化學能 （千焦耳 . 摩爾 -1 ）	凡得瓦力 （千焦耳 . 摩爾 -1 ）	氫鍵 （千焦耳 . 摩爾 -1 ）
茶飢素	-176.65	-139.54	-37.1
銀杏飢素	-153.96	-121.75	-21.59
松果菊苷	-132.35	-111.82	-20.53
管花苷 A	-122.88	-103.93	-18.95
毛蕊花苷	-120.35	-93.65	-26.7

實施例 4 松果菊苷及 GHRP-6 於飢餓素受體同源模擬與分子對接模擬之運算

藉由分子模擬軟體Discovery Studio 3.5進行運算，來分析GHRP-6、松果菊苷、管花苷A及毛蕊花苷分別與飢餓素受體活性中心區域的結合情形。如圖七所示，分子模擬軟體模擬GHRP-6（圖七A）、松果菊苷（圖七B）、管花苷A（圖七C）及毛蕊花苷（圖七D）進入飢餓素受體活性中心區域的結果，顯示四者均可進入該活性中心區域。據此，上述之分子對接模擬數據證明本揭示內容松果菊苷可與飢餓素受體結合，並作為有效的非肽類飢餓素類似物。

綜上所述，本揭示內容松果菊苷可透過活化飢餓素受體，作為一種飢餓素受體促效劑，而進一步刺激生長激素分泌的上升。是以，本揭示內容首先證明松果菊苷具有飢餓素受體促效劑之活性，其可萃取自管花肉蓯蓉，是天然、安全且具有活性之化合物，可用以預防及／或治療飢餓素受體活性低下之相關病症。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

在參閱以下的詳細說明、申請專利範圍及附隨圖式後，本揭示內容及其他特徵、態樣及優點將更明顯易懂，其中： 圖一為依據本揭示內容之一實施例所得之HPLC分析圖譜，其闡述管花肉蓯蓉水性萃取物之組成成分； 圖二為依據本揭示內容之一實施例所得之LC-MS訊號顯示圖，據以確認管花肉蓯蓉水性萃取物的組成成分，其中圖二A為松果菊苷的分析結果，圖二B為管花苷A的分析結果，圖二C則為毛蕊花苷的分析結果； 圖三為依據本揭示內容之一實施例所得之HPLC分析圖譜，其中圖三A為荒漠肉蓯蓉之分析圖譜，圖三B為管花肉蓯蓉之分析圖譜，而圖三C則為自管花肉蓯蓉萃取之松果菊苷的分析圖譜； 圖四為依據本揭示內容之一實施例所得之色層分析圖譜，其中圖四A為管花肉蓯蓉水性萃取物原液之FPLC分析圖譜；圖四B為HPLC確認特定樣本沖提留分（fraction）之成分的分析圖譜，其中小圖a為管花肉蓯蓉水性萃取物原液的分析圖譜，小圖b至g為樣本沖提體積約落在265至390毫升之留分的分析圖譜，而小圖h至i為樣本沖提體積約落在680至725毫升之留分的分析圖譜； 圖五為依據本揭示內容之一實施例所繪示之柱狀圖，其闡述對大鼠腦下垂體初代細胞投予特定處理15分鐘（圖五A）或30分鐘（圖五B）後，生長激素的分泌量；所有數據（N=6）均以平均值±標準差（mean±standard error of mean，mean±SEM）表示，以T檢定（T test）比較對照組與加藥組之間的差異，當p＜0.05（以*標示）、p＜0.005（以**標示）及p＜0.001（以***標示）時，表示具有顯著差異； 圖六為依據本揭示內容之一實施例所繪示之柱狀圖，其闡述對大鼠腦下垂體初代細胞投予特定處理15分鐘後，生長激素的分泌量；所有數據（N=6）均以平均值±標準差表示，以T檢定比較組別之間的差異，當p＜0.05（以*標示）表示與對照組具有顯著差異，而p＜0.05（以#標示）及p＜0.005（以##標示）表示同組內含拮抗劑者與不含拮抗劑者之間具有顯著差異；以及 圖七為依據本揭示內容之一實施例所得之分子對接模擬分析結果，圖七A為GHRP-6與GHS-R1a之分子對接模擬分析結果；圖七B為松果菊苷與GHS-R1a之分子對接模擬分析結果；圖七C為管花苷A與GHS-R1a之分子對接模擬分析結果；而圖七D為毛蕊花苷與GHS-R1a之分子對接模擬分析結果。

Claims (9)

1. 一種松果菊苷(echinacoside)於製備一用以活化飢餓素受體之藥物的用途，其中該松果菊苷係作為飢餓素受體促效劑。
2. 如請求項1所述之用途，其中該藥物更包含一毛蕊花苷(acteoside)及/或一管花苷A(tubuloside A)。
3. 如請求項2所述之用途，其中該松果菊苷、該管花苷A及該毛蕊花苷於該藥物中的含量比例為20：2：3。
4. 如請求項1或2任一所述之用途，其中該藥物更包含茶飢素(teaghrelin)、銀杏飢素(ginkgoghrelin)及/或參首烏飢素(emoghrelin)。
5. 如請求項1所述之用途，其中該藥物係用於刺激生長激素分泌。
6. 如請求項1所述之用途，其中該藥物為醫藥組合物。
7. 如請求項1所述之用途，其中該藥物可用以預防及/或治療一個體之飢餓素受體活性低下之相關病症。
8. 如請求項7所述之用途，其中該飢餓素受體活性低下之相關病症係選自由生長激素缺乏症、惡質症、厭食症、敗血症、多發性硬化症、憂鬱症、功能性消化不良、呼吸道發炎、腸阻塞，以及其組合所組成的群組。
9. 如請求項7所述之用途，其中該飢餓素受體活性低下之相關病症係由於生長激素分泌不足所引起。