KR102136886B1

KR102136886B1 - 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102136886B1
Application number: KR1020180069112A
Authority: KR
Inventors: 박정현; 김민영; 이배진
Original assignee: (주)마린바이오프로세스
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: KR20190142058A

Abstract

본 발명의 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물에 의하면, 굴을 발효시킨, 굴 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 포함하며, 상기 발효 추출물은 근감소증의 예방 또는 치료 효과가 우수하며, 근육세포의 미토콘드리아 대사 및 당 대사 작용을 활성화시켜 운동 수행 능력을 향상시킬 수 있다.
또한, 굴을 이용하여, 다량의 타우린, 비타민, 천연 GABA(gamma-aminobutyric Acid) 및 올리고당을 함유한 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 근육세포의 미토콘드리아 대사와 당 대사 작용을 활성화시켜 ATP 함량을 증가시켜, 운동 수행 능력을 향상시킬 수 있고, 근감소증의 예방 및 억제 효과가 우수하고, 근 기능을 향상시킬 수 있다.

Description

굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물{Composition for prevention and treatment of muscular disorders or improvement of muscular functions comprising functional fermented material using oyster}

본 발명은 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 굴을 이용하여 기능성 발효물을 제조하며, 상기 기능성 발효물에 근감소증 및 근 기능을 개선하기 위한 것이다.

대한민국은 2000년 65세 이상 노인인구가 전체인구의 7.2%를 차지하여 고령화 사회에 진입하였으며, 2017년 8월 14% 이상인 고령사회로 진입하였고 (2017년 행정안전부) 2050년에는 초고령화 사회(20% 이상)에 진입할 것으로 예측된다(2013년 고령자 통계, 통계청). 사람의 근육양은 나이가 들면서 감소하고(50~70세에 10~15% 정도, 70세~80세에서 30% 이상 감소), 이에 따라 근력과 근기능도 약화되는데, 이를 노인성 근감소증(sarcopenia)이라 한다.

노인성 근감소증은 활동장애와 보행장애를 유발하여 노인들의 독립적인 생활을 제한하는 주요 원인이 된다. 또한, 근감소증은 기초 대사율을 저하시켜 인슐린 저항성을 높이고 2형 당뇨병 발생을 촉진하며, 고혈압 및 심혈관계 질환 발생위험을 3-5배 증가시킨다.

현재 근감소증 치료용도로 승인된 의약품은 전무한 실정이며, myostatin 억제물질 또는 기존 FDA 승인을 받은 타질환 치료제를 근감소증에 적용하는 약물재배치(drug repositioning) 기술이 개발 중에 있다.

한편, 근육은 크게 골격근(skeletal muscle), 심장근(cardiac muscle), 평활근(visceral muscle)으로 구분되고, 이 중 골격근은 인체에서 가장 많은 양으로 존재하는 조직으로, 체중의 40-45%를 차지한다. 골격근은 건(tendon)을 통해 뼈(bone)에 붙어서 뼈의 움직임 또는 힘을 만들어 내는 역할을 한다.

하나의 근육은 수많은 근섬유로 구성되어 있으며, 다시 근섬유는 액틴과 미오신으로 구성된 수 많은 근원섬유로 만들어진다. 액틴과 미오신이 서로 겹쳐서 움직이면 근육의 길이가 짧아지거나 길어지면서 전체적인 근육의 수축과 이완을 유발하게 된다. 근원섬유 크기의 증가는 근섬유 두께의 증가를 의미하고, 그 결과 근육의 증가가 일어나게 된다.

근육을 구성하는 근섬유의 유형은 ATP를 발생시키는 대사과정과 수축속도에 의해 주로 Type Ⅰ, Type ⅡA 그리고 Type ⅡB로 구분된다. '타입 근섬유'는 수축속도가 느리고 많은 수의 미오글로빈과 미토콘드리아를 함유하고 있어 지속적이면서 낮은 강도의 유산소활동을 하는데 적절하다.

타입 근섬유는 적색을 띄고 있어서 적색근이라고도 일컬어지며 대표적으로 가자미근(soleus)이 이에 속한다. 반면, '타입 B 근섬유'는 수축속도가 빨라 매우 짧지 만 높은 강도의 무산소 운동을 하는데 쓰이며, 미오글로빈의 함량이 적어 백색을 띄고 있다. '타입 A 근섬유'는 앞서 언급한 두 가지 근섬유의 중간적인 특성을 띈다. 나이가 듦에 따라 근육의 부위별 타입, Ⅱ 근섬유의 조성이 달라질 뿐 아니라 모든 타입의 근섬유가 감소하게 된다.

골격근은 환경에 따라 재생되어 유지되는 특징을 가지고 있으나, 이러한 특징은 나이가 듦에 따라 소실되고 결과적으로 노화가 진행되면서 근육양이 감소될 뿐 아니라 근력 역시 상실된다.

근육의 성장 및 재생에 관여하는 신호전달체계로는 insulin like growth factor 1(IGF-1)/AKT에 의해 매개되어 단백질 합성을 조절하는 신호전달이 있다. 근육세포막에 존재하는 IGF-1 receptor(IGF-1R)가 활성화되면 IRS1 및 PI3K 인산화를 통해 AKT인 산화가 증가되고 후자는 mTORC 인산화를 활성화시킨다.

mTORC의 활성화는 ribosomal protein S6 kinase beta1(P70S6K1)의 인산화를 증가시켜 mRNA 번역(translation)을 증가시키는 동시에 eukaryotic translation initiation factor 4G(eIF4G)의 활성을 증가시키고, eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1(4E-BP1) 단백질을 인산화시킨다.

eIF4G와 4E-BP1은 eIF4F 복합체를 형성하는데 관여하는데 즉, eIF4G는 eIF4A 그리고 eIF4E와 결합하여 eIF4F 복합체를 형성하는 한편, 4E-BP1은 인산화되면 eIF4E와의 결합능이 저해되어 유리상태의 eIF4E를 증가시키게 된다.

후자는 다른 translation initiation factor들(eIF4G 및 eIF4A)와 결합하여 eIF4F 복합체를 형성하고, 이렇게 형성된 eIF4F 복합체는 리보솜 구조를 안정화시킴으로써 번역개시(translation initiation)를 촉진하여 궁극적으로 단백질 합성을 증가시키게 된다(Bodine et al., Akt/mTOR pathway is a crucial regulator of skeletal muscle hypertrophy and can prevent muscle atrophy in vivo. Nature cell biology, 3, 1014-1019, 2001)

또한 AKT 인산화는 glycogen synthase kinase 3(GSK3)를 통해 eIF2B발현을 증가시켜 근섬유 성장을 촉진시키는 한편 단백질 분해 관련 전사인자인 forkhead boxO(FOXO)의 발현을 억제함으로써 근손실을 억제하기도 한다. 근손실은 myostatin, transforming growth factor beta(TGF-β), 그리고 activin을 포함하는 TGF-β family의 receptor에 의해 매개되는 신호전달에 의해 조절된다.

TGF-β type II receptor에 리간드가 결합하면 type I receptor를 인산화시키고, 후자는 smad 2/3 complex를 인산화시켜 결국 FOXO를 활성화시킨다. 후자는 musclespecific ubiquitin-ligase인 muscle RING-finger protein-1(MuRF1), Muscle Atrophy F-Box(MaFbx)/atrogin-1의 유전자 발현을 증가시키고, 이는 ubiquitin을 표적단백질의 lysine 부위에 부착시켜 단백질 분해를 촉진시키고, 결국 근육의 감소를 유도한다(Gumucio et al., Atrogin-1, MuRF-1, and sarcopenia. Endocrine, 43, 12- 21, 2013).

이에, 부작용이 적은 천연물에서 근육 단백질의 분해작용을 억제하고, 합성을 촉진시킴으로써 근육의 증강 및 근손실 개선에 효과가 있는 조성물의 개발이 필요하다.

(특허 문헌 1) KR 10-2017-0124426 A1

본 발명의 목적은 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 굴을 이용하여, 다량의 타우린과 비타민을 함유하고 해조류로부터 천연 GABA(gamma-aminobutyric Acid) 및 해조 올리고당을 함유한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 근육세포의 미토콘드리아 대사와 당 대사 작용을 활성화시켜 ATP 함량을 증가시켜, 운동 수행 능력을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 목적은 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 근감소증의 예방 및 억제 효과가 우수하고, 근 기능을 향상시킬 수 있는 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물 은 굴을 발효시킨, 굴 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 포함하며, 상기 발효 추출물은 근감소증의 예방 또는 치료 효과가 우수하며, 근육세포의 미토콘드리아 대사 및 당 대사 작용을 활성화시켜 운동 수행 능력을 향상시키는 것이다.

상기 발효 추출물은 타우린(taurine) 및 GABA(gammaaminobutyric acid)를 포함한다.

상기 굴은 생굴, 굴의 가수분해액, 굴의 추출 농축액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 굴 발효물은 발효 미생물을 이용하여 발효시킨 것으로, 상기 발효 미생물은 유산균, 효모 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 발효 미생물은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) BJ20(기탁번호: KCTC 11377BP), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) MBP-27, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) JS(균주기탁번호 KCCM10499), 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus Usamii) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 약학 조성물은 상기 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 식품 조성물은 상기 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물은 굴을 발효시킨, 굴 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 포함하며, 상기 발효 추출물은 근감소증의 예방 또는 치료 효과가 우수하며, 근육세포의 미토콘드리아 대사 및 당 대사 작용을 활성화시켜 운동 수행 능력을 향상시킬 수 있다.

상기 굴을 발효시킨 발효물을 이용하여, 발효 추출물을 제조하여, 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선을 위한 용도로 이용할 수 있다.

보다 구체적으로, 굴로부터 타우린, 올리고당 및 천연 GABA를 추출하여, 상기 타우린, 올리고당 및 천연 GABA를 주요 성분으로 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물은 발효 공정에 의해, 해조취 및 비린내가 제거되어, 식용 시 맛과 향이 탁월한 조성물을 제공할 수 있다.

상기 굴(Oyester)은 글리코겐, 비타민, 단백질 등 각종 영양소가 함유되어 있으며, 타이로신 글루탐산 등 18종 이상의 아미노산과 타우린 등의 기능성 물질뿐만 아니라 철분 요오드 등 필수 무기질 등이 풍부한 완전식품으로 인식되며 세계 10대 수산물로써 널리 이용되어 왔다. 통영을 비롯한 남해안에서 대량 양식되고 있는 굴은 1960-70 년대 경제개발 초기 수출 공신이었지만 최근에는 중국산 굴이 세계시장을 급속히 잠식하고 있으며, 냉동 또는 단순 가공품의 형태로 유통되고 있다.

그러나 굴과 같은 해양자원의 이용은 그 대부분이 단순 건조 등의 1차 가공품이나 사료로 사용되는 것에 그치고 있다. 상기와 같이 단순 건조 등의 1차 가공품이나 사료로만 이용하는 경우에는, 굴과 같은 해양 자원에 존재하는 각종 생리활성물질을 최대한 이용하지 못하는 문제가 발생할 뿐만 아니라, 풍부한 비타민이나 무기질 등의 천연 성분을 그대로 유지할 수 없는 문제가 있다.

이에, 본원 발명에서는 굴을 이용하여, 발효시키고, 굴 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 이용함에 따라, 굴에 존재하는 각종 생리활성물질을 최대한 이용할 수 있고, 풍부한 비타민이나 무기질 등의 천연 성분을 그대로 유지할 수 있다.

GABA(gamma-aminobutyric acid)는 분자량이 103.2 달톤(Dalton)으로 피페리인산으로 불리며 용융점이 202℃로 열에 안정한 편이며 C₄H₉NO₂의 분자식을 가지고, 물에 대한 높은 용해성을 가지는 비단백질성 아미노산의 일종으로 포유동물의 뇌나 척수에 존재하는 흥분 억제성 신경전달물질(Inhibitory Neurotransmitter)이다. GABA는 인체의 많은 생리적인 메카니즘의 조절에 관여하여 뇌의 혈류를 활발하게 하고 산소 공급량을 증가시켜 뇌세포의 대사기능을 항진시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

또한 성장호르몬의 분비 조절에도 관여하며 혈압강하 및 통증완화, 정신안정작용, 간, 신장기능 개선작용, 대장암 억제작용 등 여러 생리 조절 작용에 관여하는 것으로 알려져 있어 약리적으로 매우 주목받는 물질이다. 그러나 일반적으로 식품 등을 통하여 섭취되는 타우린과 GABA의 양은 많지 않아 약리작용을 발휘하기 위한 필요량을 식품에서 섭취하는 것은 용이하지 않다.

이에 본원 발명은 자연섭취로는 양적 제한을 가진 타우린과 GABA를 생리활성이 기대되는 양까지 높여 섭취할 수 있도록 굴에 존재하는 글루탐산을 GABA로 대량 전환하면서도 글루탐산 이외의 타우린과 같은 기능성 물질에는 영향을 주지 않는 발효 균주를 이용하여, 발효공법에 의한 인체에 유용한 후코이단 등의 고분자 해조 다당류를 저분자화하고, 굴의 추출 가공시 필연적으로 발생하는 해조취와 비린내 등의 이미, 이취를 제거함으로써 종래의 기능성 식품소재로써의 기호성을 유지한 채 다량의 타우린과 천연GABA 및 저분자 해조 올리고당을 비롯한 해조미네랄을 함유하는 기능성 발효물을 제조하여, 이를 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물로 제공하고자 한다.

상기 굴 발효 추출물은 굴 및 해조류를 발효시킨 굴 및 해조류의 발효 추출물일 수 있다. 해조류에 다수 포함되어 있는 해조 올리고당 및 천연 GABA를 추출하여 이용함에 따라, 근육 질환 예방 및 치료, 근 기능 개선 효과를 높일 수 있다.

해조류는 그 기능성과 더불어 수요가 확대되고 있으며 특히 풍부한 미네랄 및 기능성 다당류로 인하여 항균, 항산화, 항바이러스, 항암활성을 비롯하여 동맥경화, 심근경색, 고혈압, 협심증, 뇌졸중 등의 생활 습관병 예방에 효과적이라는 보고들과 함께 그 잠재적인 가능성이 부각되고 있는데, 이들 중 다시마는 굴과 함께 GABA의 전구물질인 글루탐산(glutamic acid)를 다량 함유한 천연 원료로써, 고농도 천연GABA의 생산을 위한 종래의 생산 방법인 MSG(화학적 합성품)의 인위적인 첨가 없이 발효공법을 통하여 다시마 유래의 고농도 천연 GABA를 생산할 수 있다.

이와 동시에 미생물에 의한 발효 과정에서 후코이단(Fucoidan) 등 고분자 기능성 해조 다당류의 저분자화를 통하여 갈조류 유래의 후코즈(Fucose) 등 단당류와 기능성 저분자 올리고당을 동시에 함유한다.

뿐만 아니라 해조류는 아미노산(Glutamic Acid 및 Aspartic Acid 등)을 다량 함유하고 있으며, 고기능성 천연소재로 각광을 받고 있는 해조 올리고당(Fucoidan 등) 또한 풍부하여 이상적인 천연식품으로 인식되고 있을 뿐 만 아니라 다양한 미네랄과 비타민 등이 풍부하게 함유되어 있고, 최근 해조류의 생리 효용성에 관한 국내·외 전문가들의 활발한 연구 수행 결과 해조류가 다이어트 작용, 정장 작용에 의한 변비 치료, 중금속 및 방사능 물질의 체외 배출 작용 등에 깊이 관여하는 것으로 밝혀지고 있다. 그리고 후코이단으로 통칭되는 함황 다당류의 경 우는 항균, 항산화, 항바이러스, 항암활성을 비롯하여 동맥경화, 심근경색, 고혈압, 협심증, 뇌졸중 등의 성인병 예방에 효과적이라고 보고된 바 있다.

본원발명에 이용되는 굴과 해조류는 수세, 탈염, 분쇄의 전처리 공정이 동일하며, 굴은 생굴, 굴의 가수분해액 또는 굴의 추출농축액을 사용할 수 있다. 굴, 해조류 또는 이들의 혼합물이 30%(v/v)를 초과하는 경우, 굴과 해조류의 염분에 의하여 최종 조성물의 맛에 영향을 미치기 때문에 굴, 해조류 또는 이들의 혼합물은 10 내지 30%(v/v)이 적당하다.

상기 해조류는 다시마, 톳, 미역, 미역줄기, 우뭇가사리, 파래, 풀가사리, 꼬시래기, 매생이 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상세하게는 굴, 굴의 가수분해액, 굴의 추출농축액 및 해조류를 발효원으로써 단독으로 사용할 경우, 이들을 전체 중량의 10 내지 30%(v/v)가 되도록 하며, 이들의 혼합물을 발효원으로써 발효할 경우, 굴, 굴의 가수분해액 또는 굴의 추출농축액과 해조류를 선택적으로 혼합하여, 10 내지 30%(v/v)로 첨가함에 있어 그 비율이 굴, 굴의 가수분해액 또는 굴의 추출농축액과 해조류가 1:2 내지 2:1의 범위에서 선택적으로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 굴의 가수분해액은 전처리된 굴에 물을 혼합한 후, 50 내지 70℃의 온도에서 교반하면서 알카라제를 첨가하여 가수분해하는 단계; 상기 가수분해된 굴의 잔사를 40 내지 200mesh의 진동체로 제거하고 굴의 가수분해액을 수거하는 단계; 및 상기 수거된 굴의 가수분해액을 UF 멤브레인 필터(MEMBRANE FILTER를 이용하는 한외여과법에 의해 분자량 100,000 dalton 이하만 분리하는 정밀여과 공정을 진행한다.

정밀여과하는 단계 이후, 정밀여과된 가수분해액을 첨가하기에 용이하도록 포장하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 굴의 추출 농축액은 굴을 수세, 탈염, 분쇄의 방법으로 전처리하는 단계; 상기 전처리된 굴에 물을 혼합하여 70 내지 90℃에서 20 내지 60분간 교반하면서 추출하는 단계; 상기 추출된 굴의 잔사를 40 내지 200mesh의 진동체로 제거하고 굴의 추출액을 수거하는 단계; 상기 추출이 완료된 굴의 추출액을 UF 멤브레인 필터(MEMBRANE FILTER)를 이용하는 한외여과법에 의해 분자량 100,000 dalton 이하만 분리하는 정밀여과 단계; 및 상기 정밀여과된 굴의 추출액을 30 내지 50℃의 온도에서 감압하여 brix가 20 내지 40%가 되도록 농축하는 단계를 포함하는 제조 방법에 따라 제조될 수 있다.

농축하는 단계 이후, 농축된 농축액을 첨가하기에 용이하도록 포장하는 단계가 추가될 수 있다.

굴의 가수분해액과 추출농축액은 UF 멤브레인 필터(MEMBRANE FILTER)를 이용하는 한외여과법에 의해 분자량 100,000 dalton 이하만 분리하여, 발효공정에 사용되며, 상기 여과 시스템은 여과 과정에서 외부의 노출이 방지됨으로써 여과시 발생하는 향미의 손실을 최소화할 수 있다.

본 발명의 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물은 (1) 굴, 굴의 가수분해액 또는 굴의 추출농축액을 전체 중량의 10 내지 30%(v/v)가 되도록 물을 혼합하여 멸균하고, 30 내지 37℃까지 냉각하여 배지를 준비하는 단계; (2) 상기 배지에 발효 미생물로 유산균, 효모 또는 이들을 혼합하여 접종한 후 발효시키는 단계; (3) 발효가 끝난 발효액을 고온가압 멸균하여 발효기간 중에 대수적으로 증식한 발효 미생물을 사멸시키는 단계; 및 (4) 멸균된 발효액을 0.05 내지 0.1um 이하의 맑고 깨끗한 수용성 물질만을 정밀여과하는 단계의 순서로 제조할 수 있다.

본원발명의 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물은 상기의 생굴을 단독 또는 혼합하여 전제 중량의 10 내지 30%가 되도록 첨가한 후, 115 내지 125℃에서 15 내지 20분간 고온에서 가압하여 멸균한 후, 30 내지 37℃까지 냉각하여, 발효미생물로써 유산균 및 효모를 단독 또는 혼합하여 1 내지 5%(v/v)이 되도록 접종하여 2 내지 7일간 발효함으로써, 다량의 타우린과 천연GABA 및 해조올리고당을 비롯한 미네랄 등을 함유하는 조성물을 제조할 수 있다.

본원발명의 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물은 상기의 굴 가수분해액을 단독 또는 혼합하여 전제 중량의 10 내지 30%가 되도록 첨가한 후, 115 내지 125℃에서 15 내지 20분간 고온에서 가압하여 멸균한 후, 30 내지 37℃까지 냉각하여, 발효 미생물로써 유산균 및 효모를 단독 또는 혼합하여 1 내지 5%(v/v)이 되도록 접종하여 2 내지 7일간 발효함으로써, 다량의 타우린과 천연GABA 및 해조올리고당을 비롯 한 미네랄 등을 함유하는 조성물을 제조할 수 있다.

본원발명의 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물은 상기의 굴의 추출농축액을 전체 중량의 10 내지 30%가 되도록 첨가한 후, 115 내지 125℃에서 15 내지 20분간 고온에서 가압하여 멸균한 후, 30 내지 37℃까지 냉각하여, 발효미생물로써 유산균 및 효모를 단독 또는 혼합하여 1 내지 5%(v/v)이 되도록 접종하여 2 내지 7일간 발효함으로써, 다량의 타우린과 천연GABA 및 해조 올리고당을 비롯한 미네랄 등을 함유하는 조성물을 제조할 수 있다.

근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물은 근육세포에 미치는 세포독성은 없고, 근육세포에 Lactate의 함량, LDH의 단백질 발현에 영향을 주며, 근육세포의 미토콘드리아 대사 및 당 대사 작용을 활성화시켜 ATP 함량 증가에 도움을 주는 것으로 미루어 보아 운동 수행 능력 향상에 도움을 준다.

뿐만 아니라, 강제운동수행으로 인하여 간 조직 내 증가된 효소 농도(glycogen, creatinine, creatinine kinase, LDH, L-Lactate)를 조절해 간의 피로 회복에 도움을 주며, 근육 조직 내 SDH 활성, glycogen 농도 및 PGC1-alpha 함량에도 영향을 미쳐 근육 조직의 미토콘드리아 에너지 대사에 효과적으로 작용하였다.

아울러 미토콘드리아 대사에 영향을 주는 AMPK, PGC1-alpha, Cytochrome C 발현에도 영향을 미쳐 운동수행 능력 및 지구력 능력을 향상시키는데 큰 도움을 준 다.

상기 발효 단계에서 이용하는 유산균과 효모의 일 예시로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) BJ20(기탁번호: KCTC 11377BP) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) MBP-27를 이용할 수 있다.

상기 균주의 경우, 해조취 등의 이미, 이취 제거에 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있고, 항산화 및 항고혈압 효과가 우수한 기능성 발효물을 제거하는데 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

다만, 상기 유산균과 효모를 사용하여 발효물을 제조하는 경우, 항산화 및 항고혈압에 우수한 효과가 있음이 확인되었으나, 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선에 상대적으로 우수한 효과를 나타내지 않음을 확인하였다.

이에, 본원발명에서는 유산균 및 효모로, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) JS(균주기탁번호 KCCM10499) 및 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus Usamii)를 이용할 수 있다.

상기 균주의 경우, 굴 또는 해조취 등의 이미, 이취 제거에 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있고, 근육세포의 미토콘드리아 대사와 당 대사 작용을 활성화시켜, 운동 수행 능력 향상에 큰 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약학 조성물은 상기 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용 제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구 또는 비경구의 여러가지 제형일 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다.

또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물은 인체에 대한 독성이 전혀 없어 장기적으로 섭취 가능하므로 건강기능식품으로도 사용될 수 있다. 건강기능식품으로 제조되는 경우 음료, 스낵 및 제과 제빵류, 죽 및 스프류에 포함된 형태가 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명에 따른 상기 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 통상의 감미제, 비타민류, 아미노산류, 미네랄류, 유기산류, 방향제 또는 방부제 등과 함께 용해시켜 수용액, 수현탁액, 또는 통상의 복용 형태의 제형으로 제조하면, 뇌세포 대사 촉진 및 혈류촉진과 더불어 부족한 영양소들을 보충할 수 있는 우수한 건강식품이 될 수 있다.

따라서 상기 본 발명의 굴을 이용한 기능성 발효물, 해조추출발효액 또는 해조발효분말을 주성분으로 함유하고, 필요에 따라 생약 엑기스, 비타민류, 아미노산류, 감미제, 미네랄류, 유기산류, 방향제, 과일즙 또는 방부제 등에서 선택되는 1 종 이상의 보조 성분을 첨가하고, 여기에 물을 적당량 가하고 멸균하거나, 또는 통상의 복용 형태의 제형으로 하여 얻어지는 신규의 식품을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 보조 성분은 통상적으로 당업자가 사용할 수 있는 성분을 의미하는 것으로 여기에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게 본 발명의 식품 조성물은 기호도를 높이기 위하여, 자귀나무 추출물 및 감초 추출물을 더 포함할 수 있다.

상기 자귀나무 추출물 및 감초 추출물을 더 포함하는 경우, 자귀나무 추출물 및 감초 추출물에 의해, 미세하게 잔존하는 해조취 등의 이미, 이취를 제거할 수 있다. 또한, 감초의 단맛으로 인해 기호성이 높은 식품 조성물을 제공할 수 있다. 다만, 감초만을 사용하는 경우에 비해, 자귀나무 추출물을 혼합하여 사용하는 경우, 감초 고유의 단맛을 상승시킬 수 있다.

상기 자귀나무는 부부의 금실을 상징하는 나무로 합환수(合歡樹), 합혼수, 야합수, 유정수라고도 한다. 이런 연유로 산과 들에서 자라는 나무를 마당에 정원수로 많이 심었다. 자귀대의 손잡이를 만드는데 사용되는 나무였기 때문에 자귀나무라고 하며 소가 잘 먹는다고 소쌀나무라고 부르는 곳도 있다.

또한, 나무의 줄기는 굽거나 약간 드러눕는다. 높이 3∼5m이고 큰 가지가 드문드문 퍼지며 작은 가지에는 능선이 있다. 겨울눈의 아린(芽鱗, 겨울눈을 싸고 있는 단단한 비늘 조각)은 2-3개가 있지만 거의 보기 어려울 정도로 작다. 잎은 어긋나고 2회깃꼴겹잎이다. 작은잎은 낫 같이 굽으며 좌우가 같지 않은 긴 타원형이고 가장자리가 밋밋하다. 작은잎의 길이는 6 내지 15mm, 너비는 2.5 내지 4.0mm 정도로서 양면에 털이 없거나 뒷면의 맥 위에 털이 있다.

꽃은 연분홍색으로 6 또는 7월에 피고 작은 가지 끝에 15 내지 20개씩 산형(傘形)으로 달린다. 열매는 9월 말에서 10월 초에 익으며 편평한 꼬투리이고 길이 15cm 내외로서 5 또는 6개의 종자가 들어 있다.

감초는 콩과 식물에 속하는 다년생 초본으로 아시아계에서 한약재로 많이 이용되는 약용 식물로 알려져있다. 감초의 주성분으로는 glycyrrhizin이 알려져 있고, liquiritin 및 isoliquiritin등의 플라보노이드 배당체, 그리고 아이소플라보노이드인 licoricidin 등이 보고되어 있다. 감초는 항산화, 면역 증강 및 항균 효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다.

보다 바람직하게, 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품 조성물로, 상기 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 포함하며, 상기 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물 100 중량부에 대하여, 자귀나무 추출물 5 내지 10 중량부 및 감초 추출물 5 내지 10 중량부를 포함할 수 있다. 상기 범위 내에서, 미세하게 잔존하는 해조취 등의 이미, 이취를 제거할 수 있다. 또한, 감초의 단맛으로 인해 기호성이 높은 식품 조성물을 제공할 수 있다. 다만, 감초만을 사용하는 경우에 비해, 자귀나무 추출물을 혼합하여 사용하는 경우, 감초 고유의 단맛을 상승시킬 수 있다.

본 발명의 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물에 의하면, 굴을 이용하여, 다량의 타우린, 비타민, 천연 GABA(gamma-aminobutyric Acid) 및 올리고당을 함유한 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 근육세포의 미토콘드리아 대사와 당 대사 작용을 활성화시켜 ATP 함량을 증가시켜, 운동 수행 능력을 향상시킬 수 있고, 근감소증의 예방 및 억제 효과가 우수하고, 근 기능을 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 C2C12 근육 세포의 분화에 미치는 영향에 대한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 C2C12 근육 세포에 대한 세포 독성 실험 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 C2C12 근섬유에 대한 세포 생존력에 관한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 MyoD mRNA의 발현 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 처리 시, C2C12 근육세포에서의 Lactate 농도 측정 결과이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 처리 시, C2C12 근육세포에서의 LDH 단백질 발현 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 미토콘드리아 대사 관련 단백질 수준 및 C2C12 세포에서 ATP 농도에 미치는 영향에 대한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 처리 시, C2C12 근육세포에서의 Glycogen 함량에 대한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 처리 시, C2C12 근육세포에서의 GLUT 4 단백질의 발현양에 대한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 처리 시 체중 변화에 대한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 처리 시, 실험동물의 강제 달리기 운동 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 처리 시, 운동수행능력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 강제수영실험을(탈진할 때까지 수영하는 시간 체크) 측정한 결과이다.
도 13은 혈액 내 glucose와 FFA 양의 변화를 ELISA kit을 이용하여 측정한 결과이다.
도 14는 간 조직 내 glycogen 함량, creatine, creatine Kinase, LDH, L-Lactate의 함량을 측정한 결과이다.
도 15는 운동 후 근육조직 내 ATP 함량, Citrate, glycogen 그리고 SDH 활성을 측정한 결과이다.
도 16은 근육 조직 내에서 미토콘드리아 생성을 조절하는 PGC1-alpha의 발현을 면역화학염색을 통해 확인해 본 결과이다.
도 17은 미토콘드리아의 대사 관련 인자인 UCP3, AMPK, PGC1-alpha, Cytochrome C를 근육 조직 내에서 관찰한 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예 1: 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 제조]

1. 생굴을 이용한 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FO)의 제조

생굴을 수세 및 탈염을 진행하여, 불순물 및 염을 제거하였다. 이후, 건조시키고 분쇄하여 굴 분쇄물을 제조하였다.

상기 굴 분쇄물을 전체중량의 10 내지 30%(v/v)이 되도록 물을 혼합한 후, 121℃에서 15분간 멸균하여 잡균을 제거하였다. 발효적정 온도인 30 내지 37℃까지 냉각하였다.

발효 균주로 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) JS 및 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus Usamii)를 혼합하여 접종하고, 30℃ 내지 37℃의 온도에서 발효하였다. 이때 발효 미생물은 전체 중량의 1 내지 5%(v/v)가 되도록 접종하며, 발효미생물을 접종하고 발효미생물에 의한 발효가 충분히 일어날 수 있도록 2 내지 7일간 발효하였다. 발효가 끝난 발효액을 121℃에서 15 내지 20분간 고온가압 멸균하여 발효기간 중에 대수적으로 증식한 발효미생물을 사멸시켰다. 멸균된 발효액을 0.05~0.1um이하의 수용성 물질만을 정밀 여과하여 맑고 깨끗한 발효액 만을 취하였다. 정밀 여과된 발효액을 분말로 제조하기 위하여 분무건조 또는 동결건조 등의 방법으로 건조한 후, 분쇄하여 분말화하였다.

2. 굴의 가수분해액을 이용한 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 제조

2-1. 굴의 가수분해액의 제조 공정

사용하고자 하는 굴을 수세, 탈염, 분쇄하여 효소에 의한 가수분해가 용이하도록 준비하였다. 전처리된 굴과 물을 1:1로 혼합하여 50 내지 70℃에서 20 내지 60분간 교반하면서 0.2%(v/v)의 알카라제를 첨가하여 가수분해하였다. 가수분해된 굴의 잔사를 40 내지 200mesh의 진동체로 제거하고 굴의 가수분해액을 수거하였다. 수거된 굴의 가수분해액을 공경(pore size)이 0.05 내지 0.1um인 모듈을 가지는 외부순환식 감압형 분리막을 이용하여 수용성 물질만을 정밀여과하였다.

2-2. 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 제조

상기 굴의 가수분해액을 전체중량의 10 내지 30%(v/v)이 되도록 물을 혼합한 후, 121℃에서 15분간 멸균하여 잡균을 제거하였다. 발효적정 온도인 30 내지 37℃까지 냉각하였다.

3. 굴의 추출농축액을 이용한 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 제조

3-1. 굴의 추출농축액의 제조 공정

사용하고자 하는 굴을 수세, 탈염, 분쇄하여 추출이 용이하도록 준비하였다. 전처리된 굴에 10 내지 20배수의 물을 혼합하여 70 내지 90℃에서 20 내지 60분간 교반하면서 추출하였다. 추출된 굴의 잔사를 40 내지 200mesh의 진동체로 제거하고 굴의 추출액을 수거하였다. 수거된 굴의 추출액을 공경(pore size)이 0.05 내지 0.1um인 모듈을 가지는 외부순환식 감압형 분리막을 이용하여 수용성 물질만을 정밀여과하였다. 정밀여과된 굴의 추출액을 30 내지 50℃의 온도에서 감압하여 brix가 20~40%가 되도록 농축하였다.

3-2. 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 제조

[실험예 1: 운동수행능력평가- in vitro]

1. 세포 배양 및 분화 조건

마우스 유래 C2C12 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC) (CRL-1772; Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 세포 배양에는 10% fetal bovine serum (FBS) (Corning, Manassas, VA, USA) 와 1% penicillin-streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Austria)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Corning, Manassas, VA, USA) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2, humidified atmosphere에서 배양하였다.

현미경 (Olympus, CKX41)을 통해 세포의 상태와 오염 여부를 확인한 뒤 3~4일 간격으로 배양하였다. C2C12 근육세포 분화과정 중, 시료에 의한 세포의 손상 정도를 관찰하였다. C2C12 근육세포는 60 mm petridish에 각각 1×10⁶의 seeding한 후, fetal bovine serum(10%) 및 penicillin-streptomycin(1%)을 함유한 고농도 포도당 Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM)(89%)에서 100% confluence될 때까지 배양하였다.

그 후 horse serum 1% (Sigma aldrich, H0146)로 근육세포의 분화 유도와 동시에 시료를 처리하였다. 24시간마다 배지를 교환하면서 96 시간 후, 세포를 확보하였다. (표 1 및 도 1 참조)

GROUP	Differentiation condition	Treatment	Harvest Time
NC (Negative control)	-	DMEM	96 hour
PC (Positive control)	1% Horse serum	1% Horse serum	After co-treatment, 96 hour
FO10 FO50		1% Horse serum + Femented oyster(10, 50㎍/ml)
FO10 FO50		1% Horse serum + Sea Horse(10, 50㎍/ml)

2. 세포 생존율 측정

FO의 C2C12 근육세포에 대한 생존율은 WST-1 용액 (Daeil Lab Service, Seoul, Gyeonggi Korea)을 이용하여 대조군에 대한 생존율을 백분율로 표시하여 나타내었다. 96 well plate에 0.5 x 10⁴ cells/well의 C2C12 cell을 seeding 하고, 24시간 동안 배양한 후 농도별(10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500 μg/mL)로 추출물을 첨가한 배지로 교체한 뒤 48 시간동안 배양하였다.

그 후 WST-1 용액을 10 ul 첨가한 배지로 교체하여 준 뒤, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 Microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 460 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

3. ELISA 측정

항원-항체반응을 이용한 미량분석방법으로 발효 굴 추출물을 처리한 C2C12 근육세포에서 Lactate 함량, Glycogen 함량과 ATP의 활성을 확인하였다. L-Lactate assay (BioAssay Systems, ECLC011, USA), Glycogen (BioAssay Systems, E2GN005, USA), ATP concentration (BioVision, #K354-100, USA)을 사용하였다.

4. Western Blot

단백질 분석을 위해 C2C12 근육세포에 cell lysis buffer 200μl를 넣고 30 분간 ice incubation 한 뒤 14,000 rpm, 4℃, 20 min centrifuge 한다. Bradford assay6)을 이용하여 단백질을 정량 한 후, 단백질의 SDS-PAGE (Poly acrylamide Gel Electrophoresis)를 이용하여 size 별로 분리하였다.

Semi-dry transfer system (Bio-Rad, USA)를 이용하여 NC (nitro cellulose) membrane에 이동시킨 후 5% skim milk를 함유한 Blocking buffer (0.5% skim milk, 1× PBST buffer)를 1시간 동안 처리하였다.

1× PBST buffer로 10 min, 3회 washing 후, Primary antibody인 total-AMPK, p-AMPK (Thr172) (Santa cruz), LDH (Santa cruz), SDHA (Santa cruz), PGC1-alpha (Santa cruz), GLUT-4 (Santa Cruz)를 처리한 후 4 ℃ overnight 반응시켜, 1× PBST buffer로 10min, 3회 washing 한다.

Western Blot detection kit (Biorad, hercules, USA)을 이용하여 membrane과 반응시킨 후 암실에서 X-ray 필름에 15 min간 감광시킨다. 카세트를 열어 필름을 꺼내 developer 통에서 현상 후 Fixer에 담그므로 발현 정도를 관찰하였으며, GAPDH, total-AMPK로 보정하여 비교하였다.

5. 통계처리

실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 군의 유의성 검정은 Statview program에서 Anova t-test를 이용하여 통계분석 하였다.

6. 세포 독성 확인

C2C12 근육세포에 대한 FO의 세포 독성을 확인하고자, WST-1 방법을 이용하여 확인하였다.

시료 농도는 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500 μg/mL로 저 농도부터 고 농도까지 세포독성을 확인한 결과, 세포의 생존율에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 2).

FO의 세포 형상에 미치는 영향을 알아본 결과는 도 3과 같다. 세포 독성과 동일한 농도로 세포형상을 확인해 보았을 때, FO 100μg/mL 이상의 농도 처리군에서 근육 세포 외 동그란 모양을 가진 형상들이 관찰되었다. 이에 따라 분화 유도 및 유효성 평가 실험 진행을 위해서 시료 농도를 10, 50 μg/mL 농도로 C2C12 근육세포에 처리하였다(도 3).

7. MyoD mRNA 발현 확인 (분화 유도 조건 설정)

C2C12 근육세포는 분화 유도 시간에 따라 MyoD의 발현양이 변화되는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 가장 많이 발현되는 time point를 확인하기 위하여, 1% horse serum으로 분화 유도 후 48, 96, 168 hour에서 각각 MyoD mRNA 발현을 확인한 결과, 96 hour에서 MyoD mRNA의 발현이 가장 유의적으로 증가됨을 확인하였다(도 4). 이 실험을 바탕으로, 분화 유도 후 96 hour에 분화 세포를 확보하여 실험을 진행하였다.

8. Lactate 농도 및 LDH 단백질 발현 확인

포도당이 최종 ATP를 합성하기 위해서는 해당과정을 거쳐야 한다. 이 포도당 대사를 결정하는 요인 중 하나가 근육세포의 산소 이용 능력이다. 산소가 부족하게 되면, ATP의 합성양은 적어지고 젖산(Lactic acid)이 부산물로 생성된다.

본 실험에서는 C2C12 근육세포에 분화 유도제인 1% horse serum과 FO 10, 50 μg/mL를 96 hour 처리한 뒤 Lactate 농도 및 LDH 단백질 발현을 확인하였다. 이 실험을 통해 시료 처리군이 운동 수행능력에 미치는 효과를 확인하고자 하였다. (도 5 및 도 6)

FO 처리군의 Lactate 함량은 1% horse serum만 처리하여 분화 유도한 Positive control에 비해 각각 p<0.001, p<0.05 수준으로 증가한 것을 확인하였다. (도 5)

또한 Pyruvate를 Lactate로 전환시키고 근육과 간에 분포되어 있으며, 근육에서 산소 결핍 시, Pyruvate를 조절하여 Lactate의 작용을 조절하는 LDH (Lactate dehydrogenase)의 단백질 발현을 확인한 결과, FO에서 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6).

결과적으로 C2C12 근육세포의 분화 유도와 동시에 FO를 처리함에 따라, 근육세포의 운동수행능력이 향상되어 Lactate의 양이 증가하였으며, LDH 단백질양이 감소한 것을 확인하였다.

9. 미토콘드리아 대사 관련 단백질 확인 및 ATP 함량 측정

골격근에서 AMPK와 같이 미토콘드리아 대사 관련 인자가 활성화되면 지방산 산화와 당 흡수를 촉진시켜, 미토콘드리아 내 ATP 생산을 증가시키는 작용을 한다.

본 실험에서는 FO의 시료 처리로 C2C12 근육 세포의 미토콘드리아 대사 작용을 활성화시켜 운동수행능력을 향상시키는 여부를 확인하고자, SDHA, PGC1-α, AMPK 단백질 발현을 확인하였다.

C2C12 근육세포에 1% horse serum으로 분화 유도한 결과, 미토콘드리아의 대사와 관련된 SDHA, PGC1-α, AMPK 단백질의 발현양이 줄어들었으나, FO 시료를 처리함에 따라 단백질 발현양이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

이는 미토콘드리아 대사와 관련된 SDHA (Succinate dehydrogenase), PGC1-α, AMPK의 단백질 발현이 운동수행 시 발현정도가 감소한다는 보고와 일치하는 결과이며, 발효 굴 추출물 처리로 인해 농도 의존적으로 미토콘드리아 대사 단백질 발현양이 유의하게 증가하는 결과를 확인하였다(도 7).

또한, FO 처리군은 Positive control군에 비해서 통계적으로 유의하게 (p<0.05) ATP 총량을 증가시키는 것을 확인하였다(도 7) 이는 FO가 C2C12 근육세포에 미토콘드리아 대사를 활성화시켜 운동수행능력을 향상시켰으며, 결과적으로 미토콘드리아 내 ATP 총량을 증가시킨 것으로 사료된다.

10. Glycogen 함량 및 GLUT4의 단백질 발현 확인 (당 대사 조절 활성인자)

운동을 하는 동안 free fatty acid, glucose 및 근육 내 Glycogen은 근육의 주된 연료로 운동 수행 능력을 평가하는 지표로 사용된다.

C2C12 근육세포에 FO를 처리함에 따라 Positive control과 유사한 수준의 Glycogen의 함량을 관찰할 수 있었다. 그러나 유의적인 차이는 보이지 않았다(도 8).

한편, C2C12 근육세포에 FO 시료 처리로 인하여 GLUT 4 단백질의 발현양이 각각 p<0.001, p<0.05 수준으로 유의하게 증가한 것을 확인하였다(도 9). 이는 glucose를 운송하는 GLUT4 단백질 발현이 당 대사를 활성화시킴으로 인하여 운동수행능력을 향상시키는 것으로 사료된다.

[실험예 2: 운동수행능력평가- in vivo]

1. 시약 및 기구

실험에 사용된 기기로는 Glass teflon homogenizer (대한과학., Korea), UV- spectrophotometer (Shimadzu UV-1201, Japan), High centrifuge (Hanil HMR-1610V, Korea), Medical freezer (Sanyo, Japan), Microplate Reader (Bio-TEK), Chemi-Doc (BIORAD)를 사용하였다.

2. 실험동물 및 식이

본 시험에 사용한 C57BL/6계, 5주령 모델 (수컷)을 샘타코 BIOKOREA (경기도 오산시, 한국)로부터 분양 받아 (주)동남의화학연구원 동물사(동물시설등록증: 제 412호)에서 일주일간 검역과 순화사육을 거친 건강한 동물로 사육환경을 온도(22 ± 3)℃, 상대습도 (50 ± 10)%, 조명시간 12시간(07:00∼19:00)로 설정하여 실시하였다.

표 2와 같이 각 군당 10마리씩 총 6군으로 나누어 실험하였다. 정상군을 제외한 나머지 운동수행군은 시료 투여와 동시에 4주간 Rotarod로 운동 수행시켰으며, C군과 P군 (Taurine 0.5 mg/kg), FO (FO100, 200군) 시료투여를 각각 용량별로 100 mg/kg, 200 mg/kg (시료접수번호: SEMID1511-04)을 4주간 경구 투여하였다.

사료는 실험동물용 고형사료(샘타코 BIOKOREA, 한국)를 사용하였으며 음수는 자유 섭취시켰다. 해부 전 24시간 동안에는 물만 주고 절식하였다.

이때 효소활성의 일중변동을 고려하여 실험동물을 일정시간(오전 10:00-12:00) 내에 처치하였다.

본 연구는 (주)동남의화학연구원 동물실험위원회 (SEMI, Institutional Animal Care and Use committee)의 방침 및 법규에 따라 진행되었다 (윤리승인번호: SEMI-16-02).

	Group	Dose (mg/kg)	Design		Number
1	Normal	-	Saline, p.o.	-	10
2	Control	-	Saline, p.o.	Exercise	10
3	Positive control	0.5	Taurine, p.o.		10
4	FO 100	100	Fermented Oyster, p.o.		10
5	FO 200	200	Fermented Oyster, p.o.		10

3. 운동수행능력 평가

(1) 강제 달리기 실험 (Rota-rod)

동물 운동수행능력 시험법으로 Rota-rod를 이용한 방법을 이용하였다. 평가하기 1주일 전부터 5rpm에서 미리 훈련을 함으로써 훈련에 익숙할 수 있도록 하였다. 실제 수행 과정에서는 rpm을 증가시키면서 마우스가 떨어지는 시간을 체크하였으며, 이 과정을 3회 반복하여 평균값을 구하여 운동수행능력의 결과에 이용하였다.

(2) 강제수영 실험(Weight-loaded forced swimming test)

강제수영 실험은 본 실험 전날 발이 닿지 않는 수조에 쥐를 빠뜨린 다음 15분간 머물게 하였다. 24 시간 후 5분간 다시 강제 수영을 시행하며 이때 부동 시간을 측정하였다. 초기 수 초간은 적극적인 탈출의지를 보이나 곧 수면 공포에 빠져 부동자세로 움직이지 않으며, 시료 처리군에 따라 부동시간의 변화를 측정하였다.

4. 동물 처치

사육 기간이 종료된 실험동물은 12시간 절식시킨 후, CO₂로 마취시켜 개복한 후 1 mL 주사기를 이용하여 복부대동맥에서 채혈하였다. 피부 및 장기를 적출하여 생리식염수에 세척한 후 여지로 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.

5. Serum을 이용한 ELISA 측정

채혈된 혈액은 실온에 30분간 응고시킨 후 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 한 혈장을 분석시료로 사용하였다. 분리된 혈액 상층액은 ELISA kit (BioAssay Systems, USA)를 이용하여 glucose, free fatty acid를 측정하였다.

6. 조직을 이용한 ELISA 측정

적출한 근육 조직과 간 조직을 측정 인자들에 맞는 각각의 Buffer로 마쇄한 후 흡광도를 측정하였다. Citrate, Creatine kinase, Creatine, Glycogen, L-Lactate, Lactate dehydrogenase (LDH) (BioAssay Systems, USA), ATP, SDH activity (Bio Vision, USA)를 확인하였다.

7. 면역화학염색 (Immunohistochemistry staining)

적출한 근육 조직의 주변 조직들을 깨끗이 제거한 후 Bouin 용액에 고정하고 순차적 농도의 에탄올을 이용하여 탈수시킨 후, 투명과정을 거쳐 파라핀을 침투시겼다. 준비된 조직을 파라핀에 포매하여 순차적으로 박절(4μm) 하였다.

각 개체의 조직마다 임의로 슬라이드 선택하여 xylene으로 탈 파라핀한 후 다시 함수 과정을 거쳤다. 단백질 분해 효소에 의한 항원성의 부활과 열처리에 의한 항원성의 회복 방법을 이용하여 항원성을 충분히 부활시킨 후, 메탄올에 3% 농도가 되게 과산화수소를 넣은 혼합용액을 만들어 절편에 처리함으로써 내인성 효소활성을 제거하였다.

그 다음 2% rabbit serum을 30분간 처리하여 IgG의 비 특이적 결합을 차단시켰다. PGC1-alpha 항체 (AbCam, USA)를 4℃에서 하루 밤 반응시킨 후 PBS로 5분씩 3회 수세하고, peroxidase가 결합되어 있는 anti-IgG로 반응시킨 후 다시 수세과정을 거쳐 3.3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)로 발색시켰다. 희석 배율은 1:100으로 진행하였고, 현미경으로 100배의 배율로 사진을 촬영하였다.

8. 단백질 발현 확인(Western blot)

단백질 분석을 위해 뇌 조직을 Cell lysis buffer 20 mg당 200 μL에 넣은 후 homogenizer를 이용하여 조직을 파쇄한 후, 800 rpm, 10 초 centrifuge하여 상층액만 사용하였다. 24시간 ice incubation 한 뒤 14,000 rpm, 4 ℃, 20 min centrifuge한다. Bradford assay4)를 이용하여 단백질을 정량 한 후, 단백질의 SDS-PAGE(Poly acrylamide Gel Electrophoresis)를 이용하여 size 별로 분리하였다.

Semi-dry transfer system (Bio-Rad, USA)를 이용하여 PVDF (Polyvinylidene fluoride) membrane에 이동시킨 후 5% skim milk를 함유한 Blocking buffer(5% skim milk, 1× TBST buffer)를 1시간 동안 처리하였다.

1× TBST buffer로 10 min, 3회 washing 후, Primary antibody인 MYH2, p-AMPK (Thr172), total-AMPK, PGC1-alpha, Cytochrome C, UCP3를 처리한 후 4 ℃ overnight 반응시켜, 1× TBST buffer로 10 min, 3회 washing 한다.

Western Blot detection kit (Abfrontier, WEST SAVE GOLD)를 이용하여 membrane과 반응시킨 후 Chemi-Doc (BIORAD XRS system) 장비를 이용하여 발현 정도를 관찰하였으며, GAPDH와 total-AMPK로 보정하여 비교하였다.

9. 통계처리

실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 군의 유의성 검정은 Statview program에서 Anova t-test를 이용하여 통계분석하였다.

10. 체중변화

각 실험 군에 FO 100, 200 mg/kg (FO 100, FO 200군)을 4주간 투여한 mouse의 체중변화를 관찰한 결과를 도 10에 나타내었다. 1주 차에는 운동 군에 비해 Taurine을 투여한 P군에서 감소하는 경향을 보였고 4주차에는 운동군에 비해 FO 200 mg/kg (FO 200)에서 증가하는 경향을 보였으나, 실험기간 동안 N, C, 시료 처리 군의 체중은 정상범위인 것을 확인하였다(표 3).

Group	Body weight (g)
Group	1 week	2 week	3 week	4 week
N	20.20±0.85	21.25±0.81	22.13±0.86	22.78±1.16
C	20.70±0.93	21.57±0.90	22.69±1.27	22.90±2.20
P	19.30±1.22*	21.78±1.01	22.11±1.46	23.82±1.54
FO100	21.37±1.03	22.19±0.91	22.95±0.94	24.48±1.62*
FO200	20.41±0.94	22.18±0.89	22.19±0.92	23.06±1.33

(*p<0.05 vs. Control)

11. 장기 무게

시료 투여 4주째 모든 동물을 CO₂가스 마취 후, 개복한 후에 복부 대동맥에서 혈액을 채취하였으며, 간과 신장 조직을 적출하여 무게를 측정한 결과 모두 정상범위였다(표 4).

Group	Liver	Kidney
Group	(g)
N	1.34±0.10	0.73±0.21
C	1.54±0.22	0.77±0.12
P	1.35±0.17	0.75±0.11
FO 100	1.33±0.28	0.76±0.07
FO 200	1.44±0.11	0.71±0.11

3. 운동수행능력 평가 (강제 달리기, 강제 수영 실험)

(1) Rota-rod을 이용한 강제 달리기 운동

N군은 강제 달리기 운동을 수행하지 않았으며, C군, 시료투여군 (P군, FO 100, FO 200, SH 200투여군)은 Rota-rod를 사용하여 강제 달리기 운동을 시행하였다. 도 11은 실험동물의 강제 달리기 운동 결과이다. C군에 비해, taurine을 투여한 P군과 발효굴 추출물을 투여한 군(FO 100, FO 200 투여군)에서 p<0.05 수준으로 달리기하는 시간이 유의적으로 증가하였다.

(2) 강제수영실험을 이용한 최대운동수행능력 확인

도 12는 FO가 운동수행능력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 강제수영실험을 (탈진할 때까지 수영하는 시간 체크) 측정한 결과이다. C군 수영시간은 4분 18초 ± 3분 37초로 수영시간이 짧게 나타났으나, FO 100 투여군, FO 200 투여군에서 유의적인 차이는 없지만 C군 대비 수영시간이 크게 증가한 것으로 나타났다. 특히, taurine을 투여한 P군에서는 C군 대비하여 p<0.05 수준으로 수영시간이 늘어난 것을 확인할 수 있었다. 이는 앞서 강제달리기 실험 결과와 종합해 볼 때, 발효굴 추출물 4주 섭취로 운동 능력과 지구력을 향상시키는 것으로 사료된다.

4. 혈액 내 glucose와 FFA 양의 변화 평가

4주간의 시료 투여 후 혈액 내 glucose와 FFA 양의 변화를 ELISA kit을 이용하여 측정한 결과를 도 13에 나타내었다. Glucose 함량의 경우, 운동만 수행한 C군에 비해, FO 100, FO 200 투여군에서 각각 p<0.05, p<0.001 유의수준으로 농도가 증가하였다. Serum속 glucose농도 증가는 근육 수축의 지속시간을 증가시키며, 근 피로를 지연시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 한편, serum의 free fatty acid 농도의 경우, 4 주간 시료 투여에도 불구하고 크게 영향을 주지 않았다.

5. 간 조직 내 glycogen 함량, creatine, creatine Kinase, LDH, L-Lactate의 함량을 측정한 결과

도 14는 4주간 FO 투여가 실험동물의 운동수행능력에 미치는 효과를 평가하고자, 간 조직 내 glycogen 함량, creatine, creatine Kinase, LDH, L-Lactate의 함량을 측정한 결과이다.

먼저 glycogen 함량의 경우, FO 200군에서 운동군 C군 대비하여 p<0.05 유의수준으로 glycogen 함량이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 발효 굴 추출물의 4주간 투여로 간 조직 내 glycogen을 에너지원으로 더 많이 저장한 결과로 해석된다.

Creatine과 creatinine kinase는 간에 glycogen 축적을 증가시키며 높은 힘을 내는데 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 실험 기간 동안 C군은 운동으로 인하여 creatinine과 creatinine kinase농도가 다소 증가되었고, 시료 투여로 이들 농도가 감소하였으나 유의적인 차이는 나타내지 못하였다.

LDH (Lactate dehydrogenase)는 몸 안의 당이 분해되어 에너지로 변할 때 작용하는 효소로 세포가 파괴되면 간 조직 및 혈중 LDH 농도가 높아지는 것으로 알려져 있다. 특히, 운동수행 이후 피로 회복 및 간 조직 손상 지표로 판단할 수 있다.

C군에서는 124.54±4.72로 N군에 비해 LDH농도가 매우 증가한 것을 관찰할 수 있었다(도 14). 이는 운동수행으로 간의 피로도가 큰 것으로 해석된다. 그러나 P군에서는 C군 대비 p<0.001 유의수준으로 LDH 농도가 감소하였으며, 나머지 FO 100, SH 200 투여 군에서도 LDH 농도가 감소함을 확인할 수 있었다.

Lactate 또한 운동 수행 시, 산소 공급이 근육의 산소 소모에 미치지 못하게 하여 근 피로의 원인이 되는 효소이다. Taurine을 섭취한 P군의 경우 C군과 대비하여 p<0.001 수준으로 Lactate 함량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었으며, FO 100, FO 200 투여 군에서는 p<0.05 유의수준으로 Lactate 함량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

종합하면, 4주간 FO 투여는 강제운동수행으로 인하여 간 조직 내 증가된 glycogen, creatinine, creatinine kinase, LDH (Lactate dehydrogenase), L-Lactate 효소함량을 조절하여 간의 피로를 감소시키고, 운동수행능력을 증가시키는데 도움을 주는 것으로 해석된다.

6. 근육 조직 내 ATP 함량, Citrate, glycogen, SDH 활성 측정

도 15는 운동 후 근육조직 내 ATP 함량, Citrate, glycogen 그리고 SDH 활성을 측정한 결과이다.

Citrate는 근육 조직 내 미토콘드리아의 에너지 대사에 중요한 역할을 하며, 운동 시 산화성 스트레스가 증가함에 따라 이의 함량이 증가하는 것으로 알려져 있다.9-10)

실험 결과 C군에서 citrate 농도가 증가한 것이, 4주간 시료 처리로 인해 P군 및 SH 200 투여 군에서 C군 대비 p<0.05 유의수준으로, FO 100, FO 200 투여 군에서 p<0.001 유의수준으로 근육조직 내 citrate 함량이 감소하였다.

이는 운동 시 근육 조직의 산화성 스트레스가 증가하였으나, FO 투여로 근육 내 산화 스트레스 발생을 억제하였으며, 근육조직 내 Citrate 농도조절에도 영향을 준 것으로 해석된다.

SDH는 근육 내 ATP 함량조절과 미토콘드리아 대사 활성을 증가시키는 인자로 알려져 있다. 강제운동수행을 한 C군의 근육 조직 내 SDH 효소활성은 낮았으나, 4주간 시료 처리로 p<0.001 유의수준으로 SDH 효소활성이 N군 수준으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 4주간 발효 굴 추출물 투여로 근육 내에 ATP의 함량증가에 영향을 주었으나 유의적이지는 않았다(도 15). 이는 시료(taurine, FO)의 4주간 투여가, 강제운동수행에도 불구하고 근육 내 미토콘드리아에 대사를 활성화시켜 SDH 효소활성 및 ATP 함량에도 영향을 준 것으로 보인다.

근육 내 glycogen 함량은 C군에서는 감소하였으나, FO의 4주 투여로 p<0.05 유의수준으로 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 이는 앞서 간에서 glycogen 함량 결과와 유사한 결과였다.

요약해 보면, FO 투여는 근육 조직 내 미토콘드리아 에너지 대사에 효과적으로 작용하며, 이를 조절하는 SDH 활성을 조절하여 ATP 함량 및 glycogen 농도에도 영향을 미치는 것으로 사료된다.

7. 근육 조직 내 PGC1-alpha 면역화학염색

근육 조직 내에서 미토콘드리아 생성을 조절하는 PGC1-alpha의 발현을 면역화학염색을 통해 확인해 본 결과(도 16), 운동으로 인해 줄어들었던 PGC1-alpha의 발현양이 FO 100, 200 mg/kg의 4주간의 투여로 화살표 표시와 같이 발현양이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

MYH2 (Myosin heavy chain 2)는 운동 수행 시 근육 수축에 관련된 인자로 알려져 있다. C군은 운동으로 인해 MYH2 발현양이 증가하였으나, FO의 4 주간 투여로 인해 유의적으로 (p<0.05) MYH2 발현양이 감소하였다(도 17). 이는 운동으로 인해 발생되는 근 피로가 시료 물질 투여로 다소 회복된 것으로 해석된다.

또한 미토콘드리아의 대사 관련 인자인 UCP3, AMPK, PGC1-alpha, Cytochrome C를 근육 조직 내에서 관찰한 결과(도 17), 운동 수행으로 인해 감소한 UCP3의 발현이 FO 100 및 FO 200군에서 p<0.05 유의 수준으로 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 이는 발효 굴 추출물이 근육 조직 내 미토콘드리아를 보호해 결과적으로 근육조직 내 산화성 스트레스를 감소시킨 것으로 사료된다.

세포 내의 항상성을 유지하며 미토콘드리아 대사에 영향을 주는 AMPK, PGC1-alpha, Cytochrome C의 경우, 4주간의 발효굴 추출물 투여로 운동군인 C군에 비해 발현양이 증가하는 경향을 보여 미토콘드리아 대사에 도움을 주는 것으로 사료된다.

[실험예 3: 근 감소증 및 근 기능 분석 및 측정]

1. 연구방법

(1) 연구대상

건강한 중년 여성을 대상으로 시험을 진행하였다.

(2) 기능성 식품 처치방법

- 대상자들에게 8주간 기능성 식품 FO를 다음과 같이 섭취시켰다

	FO	대조식품
일반명	유산균 발효 굴 추출물	유당
성분 및 함량 (캡슐 1정당)	유산균 발효 굴 추출물 1g/일(유산균발효 굴 추출물 500mg)	유당 1g/일 (유당 500mg)
제형	600mg 캡슐	좌동
성상	적갈색 캡슐	좌동
복용방법	1일, 1회, 2정, 식후30분 복용	좌동
포장단위	1병 56정	좌동
저장방법	좌동	좌동
사용기간	좌동

- 시험식품의 설명

특화된 발효균주로 발효함으로써 기능성을 높이고 해양생물 특유의 냄새를 제거하여 향미를 향상시킴과 동시에 식감을 개선한 제품임.

2. 관찰 항목

(1) 혈액 분석 및 측정

혈청(Serum)을 기능성 식품 투여 전과 후에 각각 8ml X 2회, 총 16ml를 수집하여 ELISA 분석법을 이용하여 다음의 혈중 기질 및 성장관련 인자의 농도를 분석하였다.

(2) 대사기능 분석

식품섭취를 통해 소화흡수된 혈중 기질은 인체 주요 조직에 필요한 에너지의 공급원이다. 중추신경과 근골격계는 인체의 가장 주요한 에너지소비 조직으로서, 혈중 기질로부터 에너지 대사를 통해 인지기능과 운동기능을 발휘하게 된다. 따라서 혈중 기질의 농도 변화를 통해 대사기능을 분석함으로써 인체의 인지기능과 운동능력을 분석할 수 있는 biomarker로 삼을 수 있다.

당/지질 성분의 변화는 Glucose, TG, HDL/LDL cholesterol를 통해 확인하였다.

기질 농도에 따른 염증반응는 IL-6, IL-12, TNF-α를 통해 확인하였다.

(3) 근육합성 관련 호르몬 분석

근력 및 근지구력 등 운동능력의 향상은 근육의 합성과 분화를 통한 생화학적 변화를 바탕으로 이루어진다. 따라서 근육합성에 관련된 호르몬 변화는 인체의 운동기능 중 근력 및 근지구력과 관련된 biomarker로서 활용되고 있다.

근육합성 관련 호르몬 변화는 GH, IGF-1 통해 확인하였다.

(4) 근감소증 및 근기능 분석 및 측정

- 근감소증의 측정

DEXA, BIA를 이용한 근감소증의 진단과 기능성 식품의 적용에 따른 근육량의 변화를 장기간에 걸쳐 검증하였다.

하지의 대퇴부에서 Appendicular skeletal muscle mass (kg)/height2(m2)로 근육량의 변화를 판단하였다.

기능성 식품의 지속적인 섭취에 따라 변화하는 근육량은 DEXA에 비해 경제적 비용, 분석과정에서의 방사능 노출부담, 사용의 편리함 면에서 유리한 BIA 분석법을 이용하여 반복 측정함으로써 그 추이변화를 검증하였다.

- 건강관련 체력 분석

EMG, Isokinetic strength test, vestibular test를 실시하여, 기능성 식품섭취에 따른 건강관련 체력(근력 및 근지구력, 심폐지구력, 유연성 및 평형능력)의 개선효과를 확인함으로써 노인들의 일상생활능력 등 삶의 질 개선효과 검증하였다.

-EMG(근전도)

Electromyogram을 이용하여, 근수축시 발생하는 생체전기신호를 피부표면에서 감지하여 근육군별 발휘되는 근력, 근지구력과 근피로 등을 측정함으로써, 근감소증으로 인한 근육의 질적 감소와 함께 기능성 식품섭취에 따른 개선효과를 분석하였다.

-Isokinetic strength test

등속성 및 등장성 근수축시 발생하는 근력과 근지구력, 유연성 등을 측정하여, 노화에 따른 근육의 퇴행이 기능성 식품섭취에 의해 질적으로 개선되는 효과를 규명하였다.

-Vestibular test (평형감각 검사)

개안/폐안(eye open/close)조건에서 몸의 무게중심 흔들림 분석, 검사 결과를 Romberg test 점수로 도출하여 기능성 식품의 섭취에 따른 노인들의 평형능력의 변화와 개선효과를 검증하였다.

3. 효과 평가 기준 및 방법

현재 개발되어 식약처의 안정성 검증을 확보한 노인의 인지기능 개선용 기능성 식품인 FO를 건강한 노인들을 대상으로 8주간 섭취시킨 후, 신체조성과 근력에 미치는 효과에 대해 평가하기 위한 것이다. 이때 효과를 평가하기 위한 적용할 수 있는 기준범위가 없으므로, DEXA, inbody 720, biodex, EMG, Vestibular test를 이용하여 측정되는 결과를 사전. 사후 비교를 통해서 과학적인 차이의 검증을 통한 효과분석을 하고자 하였다.

4. 자료분석과 통계적 방법

본 연구의 자료에 대한 통계처리는 통계패키지를 이용하여 각 집단별 측정항목의 평균(M)과 표준편차(M±SD)를 산출하였고, 종속변인의 변화를 밝히기 위하여 집단 간 효과 검정은 공변량분석(ANCOVA) 검정을 실시하였으며, 각 통계치의 유의수준은 a=.05로 하였다.

5. 유효성 평가

(1) 분석에 포함할 연구 참여자 군의 선정

건강한 중년 여성을 FO 섭취군 10명, 통제군 11명으로 무선배치방식으로 나누어 인체적용시험 유효성 평가분석에 포함할 연구참여자 군은 인체적용 시험계획서에 따라 시험을 완료한 연구참여자 21명으로 하였다.

(2) 유효성 평가결과의 제시 및 분석

1) 혈액분석 결과

8주간의 기능성 소재 섭취 전후의 그룹별 혈액반응을 분석한 결과는 다음 표 6과같다.

① ACE: 8주간의 식품 소재 섭취 후 FO 집단에서 사전, 사후에서의 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 이는 기능성 식품 소재 섭취가 노인의 혈액기능에 긍정적인 영향을 미치고 항노화에 유익한 효과가 있다고 판단된다.

②TNF-a: 8주간의 식품 소재 섭취 후 집단간 차이검증에서 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다. 이는 기능성 식품 소재 섭취가 노인의 염증반응에 영향을 미치는 인자에 긍정적인 영향을 미친다고 생각되며, 이는 노인들의 항노화 작용에 유익한 효과가 있다고 판단된다.

③HGH: 8주간의 식품 소재 섭취 후 근육합성 호르몬 지표인 HGH에서 집단 간 차이 검정에서 또한 통계적 유의한 차이를 보였다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 근육성장에 영향을 미치는 HGH에 유익한 영향을 미쳤다고 판단되며, 이는 노인들의 근감소 예방 및 유지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

④IGF: 8주간의 식품 소재 섭취 후 IGF에서 집단 내 전, 후에서 통계적 유의한 차이를 보였다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 근육성장에 영향을 미치는 IGF에 유익한 영향을 미쳤다고 판단되며, 이는 노인들의 근감소 예방 및 유지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

⑤CK: 8주간의 식품 소재 섭취 후 FO군에서 집단 내 전후에서 통계적 유의한 차이를 보였고, 집단 간 차이검정에서도 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 대사기능에 영향을 미치는 에 유익한 영향을 미쳤다고 판단되며, 이는 노인들의 대사기능 향상 및 유지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

⑥TG: 8주간의 식품 소재 섭취 후 TG에서 집단 간 차이검정에서 통계적 유의한 차이를 보였다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 대사기능에 영향을 미치는 TG에 유익한 영향을 미쳤다고 생각되며, 이는 노인들의 대사기능 향상 및 유지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

Variable	Group	Pre	Post	t	F
ACE(U/L)	FO CON	40.13±16.34 52.34±19.30	35.27± 12.80 43.61±19.45	2.413* 2.322	.135
BDNF(pg/mL)	FO CON	20815.19±2963.59 20260.97±7158.04	21780.18±2851.26 20187.67±2927.66	-.815 2.373	2.588
IL-6(pg/mL)	FO CON	1.45±.92 1.16±.60	1.49±1.07 1.16±.59	-.355 .005	.112
TNF-a (pg/mL)	FO CON	1.05±.19 1.16±.26	.89±.14 1.15±.14	2.241 .119	8.593**
HGH(ng/mL)	FO CON	.75±.54 .58±.37	1.19±1.13 .38±.33	-.932 .918	9.213**
IGF(ng/mL)	FO CON	112.14±31.62 114.72±19.13	141.88±36.73 130.42±31.20	-3.700** -2.364	1.468
AST(u/L)	FO CON	18.66±2.50 22.63±3.50	21.11±4.19 23.63±2.37	-1.976 -1.158	.086
ALT(u/L)	FO CON	12.22±4.84 16.27±8.84	10.55±1.50 13.00±3.89	1.250 1.514	1.441
CK(u/L)	FO CON	117.10±74.63 95.54±27.90	87.00±48.71 98.81±32.00	3.026* -.451	8.066*
Glucose(mg/dL)	FO CON	88.00±5.19 88.72±32.00	87.55±5.91 92.63±5.97	.247 -1.467	3.641
TG(mg/dL)	FO CON	94.55±25.79 115.00±22.41	83.77±23.98 117.00±23.86	1.121 -.254	4.614*
LDL(mg/dL)	FO CON	118.30±37.10 110.09±24.95	120.80±28.39 119.27±17.67	-.440 -2.018	.419
HDL(mg/dL)	FO CON	48.44±8.74 53.44±7.74	48.22±7.90 53.88±9.42	.085 -.144	.950

(그룹 내 전후 테스트의 비교, 시간과 그룹 간의 시간 비교(*p<.05, **p<.01, ***p<.001.))

2)체성분 분석 결과

8주간의 기능성 소재 섭취 전후의 그룹별 체성분을 분석한 결과는 다음 표 7 과 같다.

①Total Fat(kg): 8주간의 식품 소재 섭취 후 Total fat(kg)에서 FO집단에서 전, 후간에서 통계적 유의한 차이를 보였고, 집단 간 차이검정에서도 통계적 유의한 차이를 보였다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 체지방량에 영향을 미쳤다고 생각되며, 이는 노인들의 대사기능 향상 및 유지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

Variable	Group	Pre	Post	t	F
Total Leanmass(g)	FO CON	34573.11±2998.48 34436.18±2912.06	34988.51±2806.27 34105.06±2865.53	-1.143 1.016	2.445
Total Fat(kg)	FO CON	34.55±3.16 34.26±2.75	33.26±2.89 34.31±2.39	2.560 -.153	5.826

(그룹 내 전후 테스트의 비교, 시간과 그룹 간의 시간 비교(*p<.05))3)근력(Biodex, EMG) 분석 결과

8주간의 기능성 소재 섭취 전후의 그룹별 체성분을 분석한 결과는 다음 표8과 같다.

① 60D/S Ext.T/Work: 8주간의 식품 소재 섭취 후 집단 간 차이 검정에서 통계적 유의한 차이를 보였다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 근력에 긍정적인 영향을 미쳤다고 생각되며, 이는 노인들의 근감소 예방 및 유지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

② 60D/S Flex.T/Work: 8주간의 식품 소재 섭취 후 FO집단에서 사전, 사후에서 통계적 유의한 차이를 보였고 집단 간 차이검정에서도 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 근력에 긍정적인 영향을 미쳤다고 생각되며, 이는 노인들의 근감소 예방 및 유지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

③ 60D/S Flex.PeakTQ/BW: 8주간의 식품 소재 섭취 후 집단 간 차이 검정에서 통계적 유의한 차이를 보였다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 근력에 긍정적인 영향을 미쳤다고 생각되며, 이는 노인들의 근감소 예방 및 유지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

Variable	Group	Pre	Post	t	F
60D/S Ext.T/Work	FO CON	381.22±96.62 351.50±69.54	420.36±61.75 349.14±69.52	-2.016 .317	5.098*
60D/S Flex.T/Work	FO CON	166.37±72.19 154.01±59.43	205.86±55.05 163.26±53.56	-3.389** -1.241	6.003*
60D/S Ext.PeakTQ/BW	FO CON	154.89± 31.39 150.96±17.56	157.29±22.44 149.77±19.22	-.488 .402	.777
60D/S Flex.PeakTQ/BW	FO CON	63.28±20.62 61.12±11.41	72.41±11.88 62.05±13.00	-2.029 -.338	6.087*

(그룹 내 전후 테스트의 비교, 시간과 그룹 간의 시간 비교(*p<.05, **p<.01))

4) 균형감각(Balance) 분석 결과.

8주간의 기능성 소재 섭취 전후의 그룹별 균형감각을 분석한 결과는 다음 표 9와 같다.

① eye closed stability score: 8주간의 식품 소재 섭취 후 집단 내, 집단 간에서 통계적 유의한 차이를 보이지는 않았다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 평형성에서는 유익한 영향을 미쳤다고 보기는 어려다고 판단된다.

② eye opened stability score: 8주간의 식품 소재 섭취 후 집단 내, 집단 간에서 통계적 유의한 차이를 보이지는 않았다. 이는 기능성 소재 식품 섭취가 평형성에서는 유익한 영향을 미쳤다고 보기는 어려다고 판단된다.

Variable	Group	Pre	Post	t	F
Closed eyes	FO CON	90.12±3.64 90.54±3.95	88.62±3.54 88.18±3.42	1.557 2.091	.239
Open eyes	FO CON	92.10±2.46 90.36±2.61	92.00±3.59 91.00±2.09	.085 -1.000	.159

[실험예 2: 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물의 뼈 건강 개선 효과 비교]

1. 생굴을 이용한 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FO')의 제조

생굴을 수세 및 탈염을 진행하여, 불순물 및 염을 제거하였다. 이후, 건조시키고 분쇄하여 굴 및 톳의 혼합 분쇄물을 제조하였다. 이후, 발효 균주로 발효 균주로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) BJ20(기탁번호: KCTC 11377BP) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) MBP-27를 이용한 것을 제외하고 제조예 1과 동일하게 복합 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 제조하였다.

2. 생굴 및 톳을 이용한 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FL)의 제조

생굴과 톳을 수세 및 탈염을 진행하여, 불순물 및 염을 제거하였다. 이후, 건조시키고 분쇄하여 굴 및 톳의 혼합 분쇄물을 제조하였다.

상기 굴 및 톳의 혼합 분쇄물을 전체중량의 10 내지 30%(v/v)이 되도록 물을 혼합한 후, 121℃에서 15분간 멸균하여 잡균을 제거하였다. 발효적정 온도인 30 내지 37℃까지 냉각하였다.

3. 복합 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FM1)의 제조

FO 및 FL을 1:0.5의 중량 비율로 혼합하여 복합 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FM1)을 제조하였다.

4. 복합 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FM2)의 제조

FO 및 FL을 1:1의 중량 비율로 혼합하여 복합 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FM2)을 제조하였다.

4. 복합 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FM3)의 제조

FO 및 FL을 1:2의 중량 비율로 혼합하여 복합 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물(FM3)을 제조하였다.

5. MyoD mRNA 발현에 대한 평가

FO, FO', FL, FM1, FM2 및 FM3의 근육 질환의 예방 및 치료, 또는 근 기능 개선 효과를 확인하기 위하여, MyoD mRNA 발현에 대한 실험을 진행하였다. 상기 FO에 대한 결과를 지수 5로 놓고(96h), 상대적인 평가를 진행하였다. 지수가 높을수록 효과가 우수함을 의미한다.

	FO	FO'	FL	FM1	FM2	FM3
MyoD mRNA 발현	5	3	6	4	7	5

상기 표 10에 따르면, FO'의 경우, FO에 비해 MyoD mRNA 발현 정도가 떨어짐을 확인하였다. 또한, FO 및 FO'을 혼합한 FM 1 내지 3에서도 FM2에서 가장 효과가 우수함을 확인하였다.

6. Lactate 농도 및 LDH 단백질 발현에 대한 평가

FO, FO', FL, FM1, FM2 및 FM3의 근육 질환의 예방 및 치료, 또는 근 기능 개선 효과를 확인하기 위하여, Lactate 농도 및 LDH 단백질 발현에 대한 실험을 진행하였다. 상기 FO에 대한 결과를 지수 5로 놓고, 상대적인 평가를 진행하였다. 지수가 높을수록 효과가 우수함을 의미한다.

	FO	FO'	FL	FM1	FM2	FM3
Lactate 농도	5	3	6	4	8	5
LDH 단백질 발현	5	4	6	4	8	6

상기 표 11에 따르면, FO'의 경우, FO에 비해 Lactate 농도 및 LDH 단백질 발현 정도가 떨어짐을 확인하였다. 또한, FO 및 FO'을 혼합한 FM 1 내지 3에서도 FM2에서 가장 효과가 우수함을 확인하였다.

7. SDHA, PGC1-α, AMPK 단백질 발현에 대한 평가

FO, FO', FL, FM1, FM2 및 FM3의 근육 질환의 예방 및 치료, 또는 근 기능 개선 효과를 확인하기 위하여, SDHA, PGC1-α, AMPK 단백질 발현에 대한 실험을 진행하였다. 상기 FO에 대한 결과를 지수 5로 놓고, 상대적인 평가를 진행하였다. 지수가 높을수록 효과가 우수함을 의미한다.

	FO	FO'	FL	FM1	FM2	FM3
SDHA	5	3	5	4	7	5
PGC1-α	5	3	6	3	8	5
AMPK	5	3	6	4	8	5

상기 표 12에 따르면, FO'의 경우, 균주의 차이에 의해 FO에 비해 단백질 발현양이 줄어듬을 확인하였다. 또한, FM1 내지 FM3에서도 혼합 비율에 따른 차이로 인해, FM2에서 단백질 발현 양이 유의적으로 증가함을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

굴을 발효시킨, 굴 발효물로부터 추출한 발효 굴 추출물을 포함하며,
상기 발효 굴 추출물은 굴 및 해조류를 발효시킨 굴 및 해조류의 발효 추출물을 포함하고,
상기 굴 및 해조류의 발효 추출물은 굴 및 톳의 발효 추출물이며,
상기 굴 및 해조류의 발효 추출물은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) JS(균주기탁번호 KCCM10499), 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus Usamii) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 발효 미생물을 이용하여 발효시킨 것으로,
상기 발효 굴 추출물은 근감소증의 예방 또는 치료 효과가 우수하며, 근육세포의 미토콘드리아 대사 및 당 대사 작용을 활성화시켜 운동 수행 능력을 향상시키는 것인
굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근감소증 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 발효 추출물은 타우린(taurine) 및 GABA(gammaaminobutyric acid)를 포함하는
굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근감소증 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 굴은 생굴, 굴의 가수분해액, 굴의 추출 농축액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는
굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 근감소증 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 따른 조성물을 포함하는
근감소증 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 약학 조성물.
제 1항에 따른 조성물을 포함하는
근감소증 예방용, 또는 근 기능 개선용 식품 조성물.