KR20160056426A - 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강 및 피로 회복용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강 및 피로 회복용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 명월초 열수 추출물은 운동수행시간을 증진시키고, 혈중 및 근육 내 피로물질의 축적을 억제하는 효과가 있으므로 약학적 조성물, 발효유, 음료, 기능성 식품 등 운동능력 증강 및 피로회복 효과를 갖는 제품에 응용될 수 있다.
Description
본 발명은 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강 및 피로 회복용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 '피로'란 '작업을 할 때 작업능률이 저하되는 상태', '항상성의 혼란이 일어나는 상태' 또는'대뇌피질의 제지작용이 일어나는 상태'로서 '육체적· 정신적 활동을 하기 위한 능력의 감소'라고 정의할 수 있다.'피로'라는 신호가 오면 신체는 휴양을 취하고 회복할 수 있는 시간이 필요하나, 바쁜 현대사회에서는 이와 같은 피로와 피로회복의 순환을 제대로 지킨다는 것이 어려운 일이다. 과로로 인한 피로의 축적은 자칫 만성피로를 유발하고, 소화성 궤양, 고혈압, 당뇨병 등의 많은 질병을 유발할 수도 있다. 그리고 암, 뇌졸증, 심장질환은 현대인의 주요 3대 사망원인이기도 하며, 과로는 이들의 주요원인이 되고 있는 실정이다. 최근 웰빙 열풍으로 삶의 여유를 즐기고, 각종 성인병의 예방과 치료를 위하여 운동의 중요성이 부각되고 있다. 이와 같은 사회적 관심으로 운동선수들뿐만 아니라 일반인들도 운동수행능력 향상과 효율적인 피로회복을 위한 과학적인 식품섭취에 대하여 필요성이 증가하고 있다. 피로(fatigue) 혹은 스트레스(stress)가 쌓였다고 표현하는 것은 심신의 기능이 원활히 이루어지지 않는 경우를 이르는 것이다. 주로 피로(fatigue)의 경우 근 수축 활동에 요구되는 힘을 충분히 발휘하지 못하는 상태, 즉 운동수행능력이 감소된 상태(Gibson H, et al, Sports Med., 1985. 2(2):120-32)라고 할 수 있으며, 육체적인 피로와는 대조적으로 스트레스(Stress)는 정신적인 과부하로 인해 오는 신체리듬의 불균형으로 이해할 수 있다. 따라서 넓은 의미의 피로는 피로(fatigue)와 스트레스(stress)를 모두 포함하는 개념으로 육체적 또는 정신적 활동을 하기 위한 능력의 감소라고 할 수 있고, 구체적으로는 피로(fatigue)는 주로 육체적 피로로 작업능률이 저하되는 상태, 그리고 스트레스(stress)는 정신적 피로로 항상성의 혼란이 일어나는 상태를 말한다(식약처 건강기능식품의 피로회복 관련 기능성 평가체계 구축, 연구결과보고서). 일반적으로 신체에 미치는 자극이 일정한 정도 이상이 될 경우 신체에 손상을 주게 되는데, 이때 생체는 그 자극의 종류에 관계없이 일정한 위협에 대한 반응으로 비특이적인 전신증후군(general adaptative syndrome)을 나타내며, 이러한 현상을 스트레스라 한다(Selye, H. :The stress of life, Toronto, Longnans Green and Co.,pp. 1-50, 1958). 이러한 스트레스는 다양한 현상으로 나타나는데, 긴장성 두통, 편두통, 고혈압, 소화불량, 피로, 통증, 갱년기 장해, 발모, 피부의 거칠어짐이 그 예가 된다. 또한 스트레스가 만성적으로 지속되면 각종 신경증, 위궤양 등이 나타나며, 신체의 생리활성, 면역활성 등이 저하하고, 정신적 활동을 위축시키고 정서가 불안정해져 비정상적 행동을 유발하기도 한다. 특히, 현대사회에서는 스트레스가 과도하게 발생하고 있기 때문에 스트레스는 매우 중요한 사회적 문제로 대두되고 있다. 스트레스를 유발하는 원인과 그 신체의 변화는 다양하지만 공통적으로는 교감신경계인 뇌하수체-부신계(HPA)의 기능을 항진시켜 호르몬 분비를 유발하여 부신의 기능항진과 비장의 기능저하를 일으키고, 그 결과 스트레스에 의한 모든 증상이 나타나는 것으로 알려지고 있다. 스트레스가 부가되면 비장은 면역기능의 감퇴로 인하여 무게가 현저히 줄어들며, 부신피질자극호르몬에 의하여 부신의 기능이 항진되어 무게가 증가되며, 지질감소현상이 일어나고, 코르티졸(cortisol)의 분비가 촉진된다. 코르티졸의 양은 연령 및 스트레스에 따라 증가하는 경향이 있으며 이는 또한 비만에 기여한다. 또한, 스트레스가 부가되면 부신은 호르몬을 분비하여 혈액 내에서 콜레스테롤, 혈당, 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase: LDH) 등을 증가시킨다. 운동능력 향상을 위한 기능성 보조제와 관련된 연구는 동서양을 막론하고 활발하게 수행되고 있다. 한편, 스테로이드, 카페인, 탄산수소나트륨 및 구연산나트륨 등과 같은 화합물을 포함하는 보조제는 일정량 이상 복용하면 운동 수행능력을 현저히 증가시킬 수 있으나 상기와 같은 약물은 치명적인 부작용을 수반하여 궁극적으로 건강을 해치게 되는 위험이 있다. 따라서 최근에는 식물 추출물과 같이 안전성이 보장된 천연물을 이용하여 기능성 보조제를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 명월초(Gynura procumbens (Lour.)Merr)는 다년생 식물로 인도에서는 삼붕냐와로, 중국에서는 생명초, 일본에서는 구명초, 또한 당뇨에 탁월한 효과를 지녔다고 하여 당뇨초라고 불리기도 하다. 명월초는 식물분류학적으로 과꽃(Asteraceae)과에 속하며, 줄기가 하나이며, 이 줄기를 기준으로 잎이 퍼진 형태로 자라나고, 잎은 색깔이 초록색이며, 모양은 달걀 모양이고, 잎 상단부는 뾰족하고 하단부는 타원형이다. 잎 가장자리는 평평하거나 파도 꼴이다. 잎의 양 표면부는 부드럽고 선이 선명하다. 명월초는 삽목으로 성장이 가능하며, 잎을 따서 생식하거나, 잎을 식품에 곁들여 먹거나, 또는 잎을 말려 차로 제조하여 마시기도 한다. 또한 명월초는 구전적으로 피를 맑게 하여 노화방지, 혈전용해, 혈당, 혈압, 콜레스테롤 조절 등에 효과가 있고, 위장장애 개선에 도움을 준다고 알려져 있으며, 특히 당뇨와 고혈압의 치료 효과의 재료로 사용될 수 있음이 알려져 있다.
한편, 대한민국 특허등록 제1361846호(발명의 명칭: 세포내 당 소모대사 관련 주요 효소 mRNA 발현을 증감시키는 천연소재 배합물 조성)에서 세포내 당 소모대사 관련 주요 효소의 mRNA를 증감시키는 천연소재 배합물 조성물 중 명월초 추출물이 공개되어 있으나, 아직까지 명월초 추출물이 운동능력증강 및 피로회복개선에 효과가 있다는 사실은 어느 문헌에도 개시나 교시된 바 없다.
이에 본 발명자들은 운동능력증강 및 피로회복에 효과가 있는 천연소재 조성물에 관한 연구를 하던 중 명월초 열수 추출물이 운동능력증강 및 피로회복 효능이 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피로회복용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강 및 피로개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피로 회복용 약학적 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강용 식품 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피로 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 명월초 열수 추출물은 명월초의 원물을 세척 후, 자연 건조하여 분쇄 후 분말화하여 증류수를 넣어 100℃에서 추출을 하여 얻는다.
본 발명의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피로 회복용 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 명월초 열수 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 덱스트린(dextrin), 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 들이 포함될 수 있다.
상기의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피로 회복용 약학적 조성물의 통상적인 1일 투여량은 100 내지 1,000mg/kg 체중, 바람직하게는 200 내지 500mg/kg 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 활성성분의 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 명월초 열수 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강용 및 피로개선용 식품 조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유, 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다. 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 또는 건강기능식품으로 사용되는 경우에, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강용 및 피로개선용 발효유는 유산균 배양액과 본 발명의 명월초 열수 추출물 동결 건조 분말 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 제조한다.
또한, 본 발명의 명월초 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강용 및 피로개선용 야채주스는 고구마, 단호박 등의 혼합야채즙, 당근즙, 토마토즙, 시금치즙, 양상추즙, 셀러리즙, 무수구연산 및 본 발명의 명월초 열수 추출물의 동결건조분말을 균일하게 혼합한 후 살균과정을 거쳐 제조한다.
또한, 본 발명의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강용 및 피로개선용 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 본 발명의 명월초 열수 추출물 동결 건조 분말 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조한다.
한편, 본 발명의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강용 및 피로개선용 건강기능식품은 상기 명월초 열수 추출물 동결 건조 분말을 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
본 발명의 명월초 열수 추출물은 운동수행시간을 증진시키고, 혈중 및 근육 내 피로물질의 축적을 억제하는 효과가 있으므로 약학적 조성물, 발효유, 음료, 기능성 식품 등 운동능력 증강 및 피로회복 효과를 갖는 제품에 응용될 수 있다.
도 1은 명월초 열수 추출물의 미토콘드리아 활성도를 확인하기 위해 시험관 실험 내, 근육 세포주에서 AMPK, SIRT1, PGC-1α의 유전자 발현량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 명월초 열수 추출물의 사료 함유에 대한 체중변화를 알아보기 위하여 실험용 쥐의 체중을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3는 명월초 열수 추출물의 운동수행능력 증강 효과를 실험용 마우스의 수영능력을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4은 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 혈액 내 젖산의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 혈액 내 무기인산염의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 혈액 내 젖산 디하이드로게나아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 혈액 내 암모니아의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 근육 내 젖산 디하이드로게나아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 근육 내 헥소카이네이즈의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 명월초 열수 추출물의 운동수행능력 증강 효과를 실험용 마우스의 트레드밀 운동거리를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 명월초 열수 추출물의 근육 강화 효과를 실험용 마우스의 트레드밀 운동후, 근육량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 명월초 열수 추출물의 사료 함유에 대한 체중변화를 알아보기 위하여 실험용 쥐의 체중을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3는 명월초 열수 추출물의 운동수행능력 증강 효과를 실험용 마우스의 수영능력을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4은 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 혈액 내 젖산의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 혈액 내 무기인산염의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 혈액 내 젖산 디하이드로게나아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 혈액 내 암모니아의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 근육 내 젖산 디하이드로게나아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 명월초 열수 추출물을 투여한 실험용 마우스의 피로회복 효과를 확인하기 위해 수영 후 근육 내 헥소카이네이즈의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 명월초 열수 추출물의 운동수행능력 증강 효과를 실험용 마우스의 트레드밀 운동거리를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 명월초 열수 추출물의 근육 강화 효과를 실험용 마우스의 트레드밀 운동후, 근육량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시 예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
명월초 열수 추출물의 제조
명월초의 원물을 세척 후, 자연 건조하여 분쇄하여 분말화하였다. 명월초 분말의 단위 질량당(g) 4mL의 3차증류수를 넣어 100℃에서 4시간 동안 추출하여 명월초 열수 추출물을 획득하였다. 추출 후, Advantec사 90mm 정성여과지를 사용하여 여과하였으며, 추출 수율을 높이기 위해 여과지에 남아 있는 여과 케이크를 수거하여 2회 반복하여 추출 및 여과하였다. 최종 추출 및 여과된 명월초 열수 추출물을 감압농축하고, 동결건조하여 명월초 열수 추출물의 동결건조 분말을 제조하였다.
<실시예 2>
명월초
열수
추출물을 함유하는 약학적 조성물의 제조
하기에 본 발명에 따른 명월초의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피로회복용 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
액제의 제조
상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물의 동결건조 분말 1g, 이성화당 10g, 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물의 동결건조분말 300㎎에 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 약전 제제총칙 중 캡슐제 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 3>
명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.55~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix0)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP배지에서의 총 유산균 수가 1.0 X 109cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.
그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 10중량%, 백설탕 3중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10중량%, 펙틴 0.1중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.05중량% 및 정제수 73.85중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그런 다음, 상기 유산균배양액 75중량%와 상기 실시예 1의 명월초 열수추출물의 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 23.9중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 운동능력 증강 및 피로개선용 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 야채주스의 제조
본 발명의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 야채주스를 제조하는 방법은 다음과 같다.
고구마, 단호박 등의 혼합야채즙 1.7중량%, 당근즙 52중량%, 토마토즙 42중량%, 시금치즙 1중량%, 양상추즙 2중량%, 셀러리즙 1중량%, 무수구연산 0.2중량%, 상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물의 동결건조분말 0.1중량%를 배합기에서 균일하게 혼합한 후 살균기를 이용하여 85~97℃에서 살균하여 운동능력 증강 및 피로개선용 야채주스를 제조하였다.
<실시예 5>
명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 10중량%, 백설탕 3중량%, 갈색설탕 3중량%, 혼합과즙농축액 56Brix°10중량%, 펙틴 0.1중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.05중량% 및 정제수 73.85중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고, 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 29.9중량%와 상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물의 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 70중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 운동능력 증강 및 피로개선용 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 6>
명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물의 동결건조 분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물의 동결건조 분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량%를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
명월초 열수 추출물에 의한 AMPK 활성에 따른 미토콘드리아 활성화의 유전자 발현 분석
미토콘드리아 기능 이상으로 인한 질병은 미토콘드리아 막전위 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종, 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스로 인한 기능 이상, 유전적 요인으로 인한 기능 이상, 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적· 인산화 기능의 결함으로 인한 질환 등이 포함될 수 있다. 질환 증후군을 포함한 많은 질환들이 에너지 대사 및 산화환원 상태의 불균형에서 시작된다.
이런 이유로, 본 발명의 경우에도 미토콘드리아에 대한 운동능력 증강 및 피로회복 효능을 확인하기 위한 가장 기초적인 1차 검증방법으로써 AMPK(AMP-Activated Protein Kinase)에 대한 활성효과 유무를 확인하는 방법을 사용하였다. AMPK는 세포내 에너지 상태를 감지하여 세포 내의 탄수화물 대사 및 지질합성 대사를 조절하여 체내의 에너지 균형(energy balance)을 유지하는데 매우 중요한 역할을 하는 인산화효소이다. AMPK는 세포 내의 생체에너지인 ATP 함량이 급격히 저하될 때, 즉 심한 운동을 하거나 장기간 음식물을 섭취하지 않았을 때 세포 내의 ATP:AMP 비율이 현저히 저하되면, AMPK 키나아제(kinase)에 의해 AMPK의 알파 서브유닛(subunit)의 트레오닌 172번 잔기가 인산화되어 활성화 형태의 효소로 전환되게 된다. 그 결과 생체에너지인 ATP를 생성하기 위해 해당작용(glycolysis) 및 체지방 분해 과정인 베타산화(β-oxidation) 대사가 활발하게 일어나며(Hardie et. al., FEBS Lett. 546, pp 113-120, 2003), 반대로 ATP를 소모하는 지방합성이나 콜레스테롤의 합성은 억제된다(David Carling et. al., TRENDS in Biochemical Sciences 29, pp 18-24, 2004). AMPK는 SIRT1(NAD-dependent deacetylase sirtuin-1)과 함께 미토콘드리아의 생체내 합성(biogenesis)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)의 유전자 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(Endocr. Rev. 24, 78-90, 2003).
본 시험에 사용된 동물 세포주로는 마우스에서 유래된 골격근세표(skeletal muscle cell)인 C2C12 cell myoblast를 한국 세포주 은행(cellbank.snu.ac.kr)에서 분양받아 사용하였다. 일반적인 세포의 유지를 위해서 90%의 DMEM 배지(Gibco)와 10% FBS(Gibco)가 함유된 배지에서 세포배양을 하였으며, 1:8의 비율로 주 2회 계대 배양을 수행하였다. 상기 세포주를 1 X 106cells/well로 6 well plate에 계대 배양 후 2% FBS가 들어간 DMEM 배지를 이용하여 매일 배양액을 교체하며, 3~4일간 배양하여 분화를 시켰다.
'명월초'는 상기 분화된 근육세포에 상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물 50㎍/㎖의 농도로 처리하여 18시간 배양하였다.
이후, 배양이 완료된 근육세포로부터 RNA는 Qiagen사의 RNA prep. Kit(RNeasy mini kit, Qiagen 74106)을 이용하여 분리하였다. 분리한 RNA로부터 Quantitect reverse transcription kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현 분석은 Taqman probe와 Real-time PCR(applied biosystems, QuantStudio™ 6 real time PCR)을 이용하여 정량하였다.
GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 발현량과 대비하여 해당 유전자(AMPK 유전자, SIRT1 유전자, PGC-1α유전자) 발현량을 상대적으로 나타내었다.
또한, '레스베라트롤'은 상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물 대신에 레스베라트롤(resveratrol)을 투여한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험을 하였다.
또한, '정상군'은 상기 분화된 근육세포에 PBS를 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험을 하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 명월초 열수 추출물을 처리한 군('명월초')에서 AMPK, SIRT1과 함께 PGC-1α의 유전자 발현이 증가하는 것으로 확인되어 미토콘드리아의 활성도 증가로 에너지 대사 촉진, 운동수행능력 향상 및 피로 회복에 도움이 될 것이라 생각되어 운동수행능력 및 피로회복에 대한 동물 효능 평가를 진행하였다.
<시험예 2>
명월초 열수 추출물의 사료 함유에 따른 체중변화 측정
실험동물은 ㈜라온바이오에서 구입하였다. 23~28g의 ICR 5주령 수컷 마우스를 구입하여 1주일 동안 AIN-93G 식이를 공급하면서 23±2℃의 온도와 55±20%의 습도를 유지하는 항온항습 시설 내에서 적응시키며 사육하였다. 1주일의 예비사육이 끝난 쥐는 8마리씩 무작위로 네 그룹으로 나누었다. 즉, '정상군'(AIN-93G 보통사료에 운동하지 않은 군), '대조군'(AIN-93G 보통사료에 운동군), '레스베라트롤'[AIN-93G 보통사료에 레스베라트롤(resveratrol, TOF Co., Ltd.)을 함유한 사료에 운동군 ], '명월초'(AIN-93G 보통사료에 명월초 열수 추출물을 함유한 사료에 운동군)로 나누고, 상기 '정상군'과 '대조군'에는 일반적인 실험용 식이 조성물인 AIN-93G를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, '명월초'에는 AIN-93G 보통사료에 상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물을, '레스베라트롤'에는 AIN-93G 보통사료에 레스베라트롤을 첨가한 식이를 3주간 섭취하도록 하였다(표 1 참조).
상기 네 그룹에 대해 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 상기 네 그룹 중 '정상군'을 제외한 '대조군', '레스베라트롤', '명월초'에 대해 주당 1회의 수영 적응 훈련을 3주간 실시하였다. 수영 적응 훈련 방법은 온도(25~28도)와 수심(50cm)이 일정한 수조를 이용하여 1주차에 5분, 2주차에 8분, 3주차에 10분 및 수영훈련을 실시하는 점증운동부하법을 사용하였다. 최종 3주 후에 각 그룹 쥐의 체중을 측정하여 평균값을 구하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 최종 시험까지 각 그룹의 체중은 유의적인 차이를 확인할 수 없었다.
시험군(각 8마리) | 비 고 |
정상군 | 미운동, AIN-93G diet |
대조군 | 운동, AIN-93G diet |
레스베라트롤 | 운동, AIN-93G diet + 레스베라트롤 100mg/kg |
명월초 | 운동, AIN-93G diet + 명월초 열수 추출물 300mg/kg |
<시험예 3>
명월초 열수 추출물의 총 수영시간 측정
상기 시험예 2와 같이 3주간의 수영훈련과 식이급여가 완료된 네 그룹의 쥐에 대하여 탈진 시까지 강제 수영을 시켰다. 강제 수영은 사지가 모두 움직이도록 막대를 이용해 최소로 자극시키며, 피로는 일정 수준 이하에서 7~10초간 되돌아오지 못하고 가라앉는 경우를 탈진이라 판정하고, 곧바로 희생하여 혈액 및 근육을 채취하였다. 수영 능력의 지수로서 피로상태 전까지의 총 수영시간을 사용하여(Matsumoto K, et al, J. Appl. Physiol. 1996. 81(4):1843-9), 네 그룹의 쥐에 대하여 총 수영시간을 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 명월초 열수 추출물을 섭취한 군('명월초')은 대조군에 비해 총 수영시간이 현저히 긴 것을 알 수 있었다. 이로서 본 발명의 명월초 열수 추출물의 섭취가 운동수행능력을 증강시키는 것을 확인하였다.
<시험예 4>
명월초 열수 추출물의 혈중 젖산 수치 측정
세포에 산소가 충분히 공급되는 상황에서는 TCA 회로가 원활히 진행되므로 혈중 젖산농도가 0.56~2.00 mmol/L의 범위로 유지되고(사람기준), 그 이상으로 축적되지 않는다. 그러나 해당작용과 TCA 회로의 대사적 연계가 당량비로 진행되지 못하고, 해당 작용이 상대적으로 활발한 상황 또는 세포에서 요구되는 산소량보다 산소공급이 부족한 상황에서 근육 내에 젖산이 생성된다고 알려져 있다. 고강도 운동 시 산소공급량이 근육의 산소소모량에 미치지 못하는 경우 근육조직의 젖산농도가 증가하게 되고, 이때 생성된 젖산은 혈액으로 확산되어 심장 및 간에서 처리되는데, 운동으로 인해 젖산이 축적되면 체내 산성화가 초래되어 운동 중 당질대사에 관여하는 포스포릴라아제(phosphorylase) 활성이 저해되고, 결과적으로 무산소 상태에서 운동에너지의 급원이 되는 포도당 신생이 억제된다. 따라서 혈중 젖산의 감소는 근육 내 피로도를 경감시키는 주요 바이오마커로 인지되고 있다.
상기 시험예 3의 탈진 시까지의 수영이 끝난 네 그룹의 쥐를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 다음 희생하였다. 실험동물의 혈액을 분석하기 위해 하부대정맥에서 채혈을 하였다. 그리고 혈액을 채취하여 13,000rpm에서 15분 동안 원심분리 후 혈청을 분리하였다. 혈액 분석 시까지 혈청은 영하 80℃에서 보관하였다. 혈청 내 젖산의 농도는 lactate assay kit(BioVision)를 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈중 젖산 농도는 운동을 하지 아니한 정상군에 비해 운동으로 인하여 대조군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며(P<0.01), 대조군에 비해 명월초 열수 추출물을 섭취한 군('명월초')에서 유의적으로 감소(P<0.05)하는 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 5>
명월초 열수 추출물의 혈중 무기인산염 측정
운동 중인 근육에서는 반복되는 근육수축에 의해 미오신과 액틴의 친화력을 높이는 단계에서 ATP가 가수분해 되고, 이로 인해 혈중 무기인산 농도가 급격히 증가하게 된다. 아울러, 일반적으로 운동 중에 혈청 무기인산 농도가 급격히 증가하면 근섬유의 연결고리가 약화되면서 힘 생성이 저하되는 것으로 알려져 있다.
상기 시험예 3의 탈진 시까지의 수영이 끝난 네 그룹의 쥐를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 다음 희생하였다. 실험동물의 혈액을 분석하기 위해 하부대정맥에서 채혈을 하였다. 그리고 혈액을 채취하여 13,000rpm에서 15분 동안 원심분리 후 혈청을 분리하였다. 혈액 분석 시까지 혈청은 영하 80℃에서 보관하였다. 혈청 내 무기인산염의 농도는 Phosphate Colorimetric Kit(sigma)를 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상군에 비해 운동을 한 대조군에서 혈중 무기 인산염의 농도가 증가하는 것을 알 수 있었고, 명월초 열수 추출물을 섭취한 군('명월초')에서는 유의적으로(P<0.01) 혈중 내 무기인산염의 농도가 감소된 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 6>
명월초 열수 추출물의 혈중 젖산 디하이드로게나아제 측정
젖산 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase; LDH)는 무산소 상태에서 피루베이트(pyruvate)로부터 젖산(lactate) 형성을 촉매하는 효소로서, 고강도 운동 시 그 활성이 증가되며, 근육 피로에 있어서 중요한 인자로 알려져 있다. 과격한 운동을 할 경우 과량의 피루베이트가 생성되어 젖산 형성이 촉진되고, 피루베이트를 젖산으로 전환시키는 과정을 촉매하는 LDH 활성이 증가하게 된다. 또한 혈중 LDH는 근육 손상의 정확한 지표로 확인되고 있다.
상기 시험예 3의 탈진 시까지의 수영이 끝난 네 그룹의 쥐를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 다음 희생하였다. 실험동물의 혈액을 분석하기 위해 하부대정맥에서 채혈을 하였다. 그리고 혈액을 채취하여 13,000rpm에서 15분 동안 원심분리 후 혈청을 분리하였다. 혈액 분석 시까지 혈청은 영하 80℃에서 보관하였다. 혈중 젖산 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase) 활성도는 Lactate dehydrogenase assay kit를 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상군에 비해 운동을 한 대조군에서 혈중 젖산 디하이드로게나아제의 활성도가 증가하는 것을 확인하였고, 명월초 열수 추출물을 섭취한 군('명월초')에서는 유의적으로(P<0.05) 혈중 내 젖산 디하이드로게나아제의 활성이 감소하는 것으로 확인되었다.
<시험예 7>
명월초 열수 추출물의 혈중 암모니아 농도 측정
아스파르트산은 근육 내에서 퓨린 뉴클레오타이드(purine nucleotide) 회로의 주요 구성분으로 극심한 고강도 운동 중에 ATP 풀을 재생시켜 근육에 에너지를 제공하고, 이 과정에서 유리 암모니아를 형성하게 된다. 운동 시 아미노산의 분해 결과, 생성된 암모니아는 근육으로부터 혈액으로 방출되고, 혈중 암모니아는 뇌에 전달되어 중추피로를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 한편 근육세포 내에 축적된 암모니아는 근육의 통증감지와 관련이 있는 구심성 신경을 자극하고, TCA cycle 및 당신생 작용을 저해하며, 젖산 생성을 초래함으로써 근육의 피로를 유발하게 된다.
상기 시험예 3의 탈진 시까지의 수영이 끝난 네 그룹의 쥐를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 다음 희생하였다. 실험동물의 혈액을 분석하기 위해 하부대정맥에서 채혈을 하였다. 그리고 혈액을 채취하여 13,000rpm에서 15분 동안 원심분리 후 혈청을 분리하였다. 혈액 분석 시까지 혈청은 영하 80℃에서 보관하였다. 혈청 내 암모니아의 농도는 ammonia assay kit(BioVision)를 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상군에 비해 운동을 한 대조군에서 혈중 암모니아의 농도가 증가하는 것을 확인하였고, 명월초 열수 추출물을 섭취한 군('명월초')에서는 유의적으로(P<0.05) 혈중 암모니아의 농도가 감소하는 것으로 확인되었다.
<시험예 8>
명월초 열수 추출물의 근육 조직 내 젖산 디하이드로게나아제 활성 감소 측정
상기에서 서술한 바와 같이, 과격한 운동을 할 경우 과량의 피루베이트가 생성되어 젖산 형성이 촉진되고, 피루베이트를 젖산으로 전환시키는 과정을 촉매하는 젖산 디하이드로게나아제의 활성이 증가하며, 근육 내에서도 증가하는 것으로 확인되고 있다.
상기 시험예 3의 탈진 시까지의 수영이 끝난 네 그룹의 쥐를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 다음 희생하였다. 근육 내의 젖산 디하이드로게나아제의 활성을 측정하기 위해 뒷다리의 골격근을 채취하여 정량한 후, 균질화하여 단백질 균질액을 만들었다. 단백질 균질액 내의 총 단백질은 Bradford assay를 통해 정량하여 총 단백질을 일정하게 한 뒤 Lactate dehydrogenase assay kit를 이용하여 근육 조직 내 젖산 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase) 활성도를 측정하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상군에 비해 운동을 한 대조군에서 근육 조직 내 젖산 디하이드로게나아제의 활성도가 증가하는 것을 확인하였고, 명월초 열수 추출물을 섭취한 군('명월초')에서는 유의적으로(P<0.01) 근육 조직 내에서 젖산 디하이드로게나아제의 활성을 감소하는 것으로 확인되었다.
<시험예 9>
명월초 열수 추출물의 근육 조직 내 헥소카이네이즈 활성도 측정
헥소카이네이즈(hexokinase)에 의해 포도당이 Glucose 6 phosphate(G6P)가 되고 G6P는 해당과정에 참여하게 된다. 따라서 헥소카이네이즈는 해당과정의 조절효소로 작용하고 있다.
상기 시험예 3의 탈진 시까지의 수영이 끝난 네 그룹의 쥐를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 다음 희생하였다. 근육 내의 헥소카이네이즈의 활성을 측정하기 위해 뒷다리의 골격근을 채취하여 정량한 후, 균질화하여 단백질 균질액을 만들었다. 단백질 균질액 내의 총 단백질은 Bradford assay를 통해 정량하여 총 단백질을 일정하게 한 뒤 hexokinase assay kit(sigma)를 이용하여 근육 조직 내 헥소카이네이즈 활성도를 측정하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상군에 비해 운동을 한 대조군에서 근육 조직 내 헥소카이네이즈의 활성도가 증가하는 것을 확인하였고, 명월초 열수 추출물을 섭취한 군('명월초')에서는 유의적으로(P<0.05) 근육 조직 내에서 헥소카이네이즈의 활성을 감소하는 것으로 확인되었다. 이는 명월초 열수 추출물에 의하여 근육에 저장되어 있던 글루코스 및 글리코겐이 효율적으로 에너지 대사에 참여하였음을 확인하여 준다.
<시험예 10>
운동 수행능력 증강 및 체력강화 측정을 위한 트레드밀 운동
명월초 열수 추출물에 의한 쥐의 지구성 운동수행 능력의 변화를 측정하기 위하여, '대조군', '크레아틴', '명월초'의 동물들에게 트레드밀 운동(정도비앤피, Korea)을 수행하였다. 운동수행 프로토콜은 경사도 5°에서 10 m/분의 속도로 10분, 15m/분의 속도로 10분, 17.5m/분의 속도로 10분 그리고 20 m/분의 속도로 탈진시까지 운동하도록 구성되었다.
'명월초'은 상기 실시예 1의 명월초 열수 추출물을 AIN-93G 식이에 하루 섭취량이 75mg/kg과 150mg/kg이 되도록 함유하여 섭취시켰다.
'크레아틴'은 양성대조군으로서 근육 및 근력강화에 효과가 있다고 알려져 있는 크레아틴(sigma)을 AIN-93G 식이에 하루 섭취량이 75mg/kg이 되도록 함유하여 섭취시켰다.
'대조군'은 음성대조군으로서 AIN-93G를 하루 섭취량이 75mg/kg이 되도록 섭취시켰다.
실험 전 트레드밀 달리기에 적응시키기 위해 경사도 5°에서 15m/분의 속도로 10~20분간 운동을 시켰다. 실험 당일 트레드밀 운동 2시간 전부터 금식을 시킨 후, 트레드밀 운동을 시켜 실험동물들의 최대운동수행능력을 측정하였다. 최대 운동수행 능력의 결정시점은 운동수행 시작 후 실험동물이 트레드밀 속도를 20초 이상 따라잡지 못하는 현상이 발생하거나 전기 충격 구역에서 5초 이상 머물 때 탈진이라 판정하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 명월초 열수 추출물을 투여 받은 군('명월초')은 농도 의존적으로 더 오랫동안 트레드밀 운동을 수행할 수 있었음을 알 수 있었다(P<0.01). 이로부터 본 발명의 명월초 열수 추출물의 섭취가 체력 증진에 크게 기여함을 확인할 수 있어, 명월초 열수 추출물을 체력강화 보조제로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
<시험예 11>
명월초 열수 추출물의 근육량 증대 효과 측정
운동수행능력 증가 및 피로회복 효과 이외에도 근육량 증대에 어떠한 효과가 있는지를 확인하기 위해 상기 시험예 10의 트레드밀 운동 이후의 네 그룹의 쥐를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 다음 희생하였다. 희생된 마우스의 대퇴부의 근육을 채취하여 근육량을 측정하였다. 채취된 근육은 EDL 및 soleus 근육을 채취하여 일정한 부위에서의 근육량을 정밀형 전자저울로 측정하였다.
'정상군'은 AIN-93G를 하루 섭취량이 75mg/kg이 되도록 섭취시켰으나, 시험예 10과 같은 운동을 시키지 아니하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상군과 운동을 한 대조군 사이에는 대퇴부 근육량의 변화에 유의성이 없었지만, 양성대조군인 크레아틴 섭취군('크레아틴'), 명월초 열수 추출물 섭취 군('명월초')에서는 유의적으로(P<0.01) 마우스의 대퇴부 근육이 증가하는 것으로 확인되었다.
이러한 상기 시험예들을 종합하여 볼 때, 본 발명의 명월초 열수 추출물은 급격한 운동으로 유발된 혈중 및 근육 내 피로요소(젖산, 무기인산, 암모니아)의 생성을 억제하여 피로를 개선시켜 운동 능력을 향상시키는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (5)
- 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피로 회복용 약학적 조성물.
- 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피로 개선용 식품 조성물.
- 명월초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 운동능력 증강용 식품 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 식품 조성물은 야채주스, 기능성 음료, 건강기능식품, 발효유 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피로 개선용 식품 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 식품 조성물은 야채주스, 기능성 음료, 건강기능식품, 발효유 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 운동능력 증강용 식품 조성물.
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KR102028514B1 (ko) * | 2018-04-05 | 2019-10-04 | 정영록 | 형태안정성 및 풍미가 개선된 김자반 스낵의 제조방법 |
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2014
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E601 | Decision to refuse application |