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Die
Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen,
die für
Peptide kodieren, die die Interaktion von Proteinkinase A (PKA)
und Proteinkinase A-Ankerproteinen (AKAP) inhibieren, einen Wirtsorganismus,
der die Nukleinsäuresequenz
umfasst und die erfindungsgemäßen Peptide
exprimiert sowie die Verwendung der Peptide sowie des Wirtsorganismus
bei der Therapie und experimentellen Untersuchung von Krankheiten,
die mit einer modifizierten AKAP-PKA-Interaktion assoziiert sind
sowie die Verwendung der Peptide als pharmazeutisches Mittel für die Behandlung
solcher Krankheiten, insbesondere Diabetes insipidus, Ulcus duodeni,
Hypertonie und Diabetes mellitus.
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Die
biologische Wirkung von Hormonen und Neurotransmittern wird über die
Aktivierung von Signalkaskaden, welche den Phosphorylierungsstatus
von Effektorproteinen verändern,
vermittelt. An diesem reversiblen Prozess sind zwei Klassen von
Enzymen beteiligt: Proteinkinasen und Phosphoproteinphosphatasen. Die
Phosphorylierung erfolgt durch Kinasen, welche die Übertragung
der endständigen
Phosphatgruppe von ATP auf spezifische Serin- oder Threoninreste
katalysieren, die Dephosphorylierung wird durch Phosphoproteinphosphatasen
vermittelt. Ein Mechanismus zur Kontrolle und Regulation dieser
Enzymaktivitäten
ist die Kompartimentierung dieser Enzyme durch die Assoziation mit
Ankerproteinen, die in der Nähe
ihrer Substrate lokalisiert sind. Die Proteinkinase A (PKA) ist
eine der multifunktionellen Kinasen mit einer breiten Substratspezifität, welche
durch die so genannten protein kinase A anchoring proteins (AKAPs)
an subzellulären
Strukturen verankert wird.
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Bei
vielen wichtigen zellulären
Prozessen wie Kontraktion, Sekretion, Stoffwechsel, Gentranskription, Zellwachstum
und -teilung erfolgt die Weiterleitung extrazellulärer Signale über G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren, das G-Protein GS, Aktivierung
einer Adenylylzyklase und Bildung des secondmessenger zyklischen
Adenosinmonophosphats (cAMP). Die Effekte von cAMP werden durch
die cAMP-abhängige
PKA vermittelt.
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Das
Proteinkinase A (PKA)-Holoenzym besteht aus einem Dimer regulatorischer
(R) Untereinheiten, an die jeweils eine katalytische (C) Untereinheit
gebunden ist. Die Aktivierung der Kinase durch die Bindung von zwei
Molekülen
cAMP an jede R-Untereinheit induziert die Dissoziation der C-Untereinheiten,
die die in ihrer Nähe
befindlichen Substrate phosphorylieren. Entsprechend dem Vorhandensein
von Typ I (RI) oder Typ II (RII) regulatorischen Untereinheiten
wird das PKA-Holoenzym als Typ I- oder Typ II-PKA bezeichnet. Bei
den RI-Untereinheiten existieren RIα und RIß, bei den RII-Untereinheiten
RIIα und
RIIβ und
bei den C-Untereinheiten Cα,
Cβ und Cγ. Die unterschiedlichen
PKA-Untereinheiten werden von verschiedenen Genen kodiert (Klussmann,
2004; Tasken und Aandahl, 2004).
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Die
regulatorischen Untereinheiten zeigen ein unterschiedliches Expressionsmuster.
Während
RIα und
RIIα ubiquitär in den
Geweben vorkommen, ist die regulatorische Untereinheit RIß in erster
Linie im Gehirn zu finden.
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Die
Assoziation der beiden R-Untereinheiten mit intrazellulären Kompartimenten
wird durch AKAPs vermittelt. Bei den Ankerproteinen handelt es sich
um eine Gruppe funktionell verwandter Moleküle, die durch die Interaktion
mit Typ I bzw. Typ II der regulatorischen Untereinheiten (RI bzw.
RII) des PKA-Holoenzyms charakterisiert sind. Die ersten Ankerproteine
wurden bei der affinitätschromatographischen
Reinigung der R-Untereinheiten über cAMP-Sepharose
isoliert. Diese assoziierten Proteine zeigten auch nach Transfer
auf eine Nitrozellulosemembran eine RII-Bindung. Auf dieser Beobachtung
beruht auch die gebräuchlichste
Methode (RII-overlay) zur Detektion von AKAPs. Es handelt sich hierbei
um einen modifizierten Western Blot, bei dem statt eines primären Antikörpers radioaktiv
markierte RII-Untereinheiten als Sonde eingesetzt werden.
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Zur
funktionellen Bedeutung der RI-AKAP-Interaktion ist noch wenig bekannt.
Auch wenn RIα hauptsächlich zytosolisch
lokalisiert ist, zeigen verschiedene Studien eine Verankerung in
vivo. Dabei scheint die dynamische Verankerung der RIα-Untereinheiten
im Gegensatz zur statischen Verankerung der RII-Untereinheiten von
entscheidender Bedeutung für
die Zelle zu sein. So wurde die Assoziation der RI-Untereinhei-ten mit
der Plasmamembran von Erythrozyten und aktivierten T-Lymphozyten
beschrieben. Bei der cAMP-vermittelten Inhibition der T-Zell-Proliferation
durch die PKA Typ I könnte
die Lokalisation des Enzyms möglicherweise
auch durch AKAPs vermittelt werden. In knockout-Mäusen, die
im Skelettmuskelgewebe keine regulatorischen Untereinheiten Typ
II exprimieren, binden die RIα-Untereinheiten
an ein mit Kalziumkanälen
assoziiertes AKAP und erhalten so die normale, cAMP-abhängige Kanalleitfähigkeit
durch die korrekte Verfügbarkeit
der katalytischen Untereinheiten der PKA.
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In
vivo konnte weiterhin gezeigt werden, dass die katalytischen Untereinheiten
in der Zelle bevorzugt mit den RII-Untereinheiten assoziieren und
Typ I-PKA-Holoenzym gebildet wird, wenn die Menge der freien katalytischen
Untereinheiten die Menge der freien RII-Untereinheiten übersteigt.
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Die
Spezifität
in der PKA-Verankerung wird durch die targeting-Domäne erreicht,
ein Strukturmotiv, das im Gegensatz zu der anchoring-Domäne weder
in der Sequenz noch in der Struktur der AKAPs konserviert ist. So
werden AKAPs durch Protein-Protein-Interaktionen an strukturelle
Elemente in der Zelle und durch Protein-Lipid-Interaktionen an Membranen
verankert.
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In
der Literatur sind verschiedene AKAPs beschrieben, die mit unterschiedlichen
zellulären
Kompartimenten assoziieren, so zum Beispiel mit den Zentrosomen,
den Mitochondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat,
der Plasma- und Kernmembran und mit Vesikeln.
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Die
genauen Mechanismen der Verankerung sind bisher nur für einige
AKAPs bekannt. So wird das herzmuskelspezifische Ankerprotein mAKAP
durch eine Region mit drei spektrinartigen Wiederholungssequenzen
an der perinukleären
Membran der Kardiomyozyten verankert. Zwei Isoformen der AKAP15/18
werden durch Lipidmodifikationen (Myristoylierung und Palmitoylierung)
an der Plasmamembran verankert. Drei polybasische Regionen in der
targeting-Domäne
des AKAP79 sind an der Lokalisation des Proteins an der inneren postsynaptischen
Membran (PSD, postsynaptic density) beteiligt.
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Die
AKAPs wurden zuerst durch die Interaktion mit der PKA charakterisiert.
Einige dieser Proteine können
jedoch auch andere an der Signaltransduktion beteiligte Enzyme binden.
Durch die gleichzeitige Verankerung von Enzymen, die gegensätzliche
Reaktionen katalysieren, wie zum Beispiel Kinasen und Phosphatasen, können diese,
auch als scaffolding (gerüstbildende)
Proteine bezeichneten AKAPs ganze Signalkomplexe in der Nähe bestimmter
Substrate lokalisieren und so zur Spezifität und Regulation der zellulären Antwort
auf extrazelluläre
Signale beitragen. AKAP79 war das erste AKAP, für das die Interaktion mit mehreren
Enzymen nachgewiesen werden konnte. Dieses Protein bindet die Proteinkinase
A, die Proteinkinase C und die Proteinphosphatase Calcineurin (PP2B),
wobei jedes Enzym in gebundenem Zustand inhibiert ist. Da unterschiedliche
Signale für
die Aktivierung jedes einzelnen Enzyms notwendig sind, können an
dieser Stelle verschiedene second messenger wie cAMP, Kalzium und
Phospholipide zusammentreffen. Weitere Beispiele sind das AKAP220,
welches die PKA und die Proteinphosphatase PP1 an den Peroxisomen
lokalisiert und das AKAP Yotiao, das neben der PKA ebenfalls die
Proteinphosphatase PP1 bindet. Das AKAP CG-NAP bindet nicht nur die
PKA und die Proteinphosphatase PP1, sondern auch noch die Rho-abhängige Kinase
PKN (NGF (nerve growth factor) -aktivierte Proteinkinase) und die
Proteinphosphatase PP2A.
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Auch
andere Proteine können
mit AKAPs assoziieren, so bindet Ezrin, ein Mitglied der zytoskelett-assoziierten
ERM-Familie Ezrin, Radixin und Moesin, das als AKAP identifiziert
wurde, an ein Protein (EBP50/NHERF), welches an der Regulation des
Natrium-Protonen-Transportes in der apikalen Membran von Epithelzellen
beteiligt ist. AKAPs vermitteln die Modulation der Leitfähigkeit
der Ionenkanäle
durch die Lokalisation der Proteinkinasen und -phosphatasen in der
Nähe bestimmter
Kanaluntereinheiten, die wahrscheinlich durch Phosphorylierung und
Dephosphorylierung reguliert werden.
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Die
Aktivität
des NMDA-Rezeptors wird durch das AKAP Yotiao, welches auch die
Proteinphosphatase PP1 bindet, moduliert. Die in gebundenem Zustand
aktive Phosphatase limitiert die Kanalleitfähigkeit des NMDA-Rezeptors,
bis die PKA durch cAMP aktiviert wird und den Ionenkanal oder ein
assoziiertes Protein phosphoryliert, wodurch die Leitfähigkeit
rapide ansteigt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass myristoylierte
Ht31-Peptide, die die Interaktion zwischen PKA und AKAP inhibieren,
die cAMP-abhängige Inhibition
der Interleukin 2-Transkription in Jurkat-T-Zellen aufheben und
dass S-Ht31-Peptide die Spermienmotilität einschränken.
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Auch
bei den wichtigen komplexen biologischen Prozessen, wie die durch
das Hormon GLP-1 (glucagon-like peptide)-vermittelte Verstärkung der
Insulinsekretion in den β-Zellen
des Pankreas und in RINm5F-Zellen (klonale β-Zelllinie der Ratte) sind AKAPs
beteiligt. Die Aktivierung der PKA durch GLP-1 führt zur Phosphorylierung von
L-Typ-Kalziumkanälen
und begünstigt
die Exozytose von Insulin aus sekretorischen Granula. Die Ht31-Peptid-vermittelte
Inhibition der PKA-Verankerung führte
zu einer deutlichen Verringerung der Insulinsekretion. Dabei wurden
weder die cAMP-Bildung noch die Aktivität der katalytischen Untereinheiten der
PKA durch die Peptide beeinflusst. Weiterhin konnte nach Expression
des wildtypischen AKAP18α in RINm5F-Zellen
im Vergleich zu Kontrollzellen, welche AKAP18α nicht exprimierten, eine Erhöhung der
Insulinsektretion nach GLP-1-Applikation nachgewiesen werden.
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Die
vom antidiuiretischen Hormon Arginin-Vasopressin (AVP)-abhängige Umverteilung
des Wasserkanals Aquaporin-2 aus intrazellulären Vesikeln in die Plasmamembran
von Hauptzellen des renalen Sammelrohres, die molekulare Basis der
Vasopressin-vermittelten Wasserrückresorption,
ist ein weiteres Beispiel für einen
Prozess, der die Interaktion der PKA mit AKAP-Proteinen erfordert
(Klussmann et al., 1999). Wird die Interaktion unterbunden, kann
die Umverteilung nicht stattfinden. Die Interaktion spielt jedoch
auch bei zahlreichen anderen Vorgängen in einer Vielzahl unterschiedlicher
Zelltypen eine wichtige Rolle, zum Beispiel erhöht die Interaktion die Herzmuskelkontraktilität (Hulme
et al., 2003).
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Um
die Wirkung der PKA-AKAP-Interaktion zu analysieren, ist es erforderlich,
die Interaktion effizient und selektiv zu modifizieren, insbesondere
zu inhibieren bzw. zu entkoppeln. Derzeit steht für die Entkopplung der
PKA von AKAP-Proteinen ein Ht31 Peptid zur Verfügung. Das Peptid Ht31 kann
an Stearat gekoppelt werden, um membranpermeabel vorzuliegen. Das
Pepdid Ht31 entkoppelt PKA und AKAP jedoch in einer Weise, die für viele
Untersuchungen oder gar für
eine therapeutische Verwendung nicht ausreichend ist. Vor allem
ist das Peptid Ht31 nicht in der Lage, selektiv mit den regulatorischen
Untereinheiten RIIα oder
RIIβ der
PKA zu interagieren, so dass die Bedeutung der Untereinheiten für ausgewählte Prozesse
nicht analysiert werden kann.
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Aufgabe
der Erfindung ist es daher, die genannten Nachteile zu überwinden
und insbesondere neue Nukleinsäuresequenzen
bereitzustellen, die für
Peptide kodieren, die die Interaktion von AKAP und PKA effizient
und spezifisch modifizieren, insbesondere entkoppeln und die weiterhin
als überexpremierende
Stoffe in Wirtsorganismen eingesetzt werden können, um mit Hilfe dieser Wirtsorganismen – beispielsweise
von Mäusen – modellhaft
Krankheiten zu analysieren, die mit der AKAP-PKA-Interaktion assoziiert
sind, vorzugsweise Diabetes insipidus, aber auch Ulcus duodeni,
Hypertonie und Diabetes mellitus.
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Die
vorliegende Erfindung löst
dieses technische Problem durch die Bereitstellung einer isolierten
Nukleinsäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe umfassend
- a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend
eine Nukleotidsequenz kodierend mindestens eine Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 1-35,
- b) ein Nukleinsäuremolekül, welches
mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) unter
stringenten Bedingungen hybridisiert,
- c) ein Nukleinsäuremolekül, umfassend
eine Nukleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um
zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder
b) funktionsanalog zu sein,
- d) ein Nukleinsäuremolekül, das infolge
des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) – c) degeneriert
ist und/oder
- e) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer
Nukleotidsequenz nach a) – d),
welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen,
Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu
einer Nukleotidsequenz gemäß a) bis
d) ist.
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Es
war überraschend,
dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
eingesetzt werden können,
um Peptide gemäß Tab. 1
(SEQ ID Nr. 1 – 35)
zu kodieren, die die Wechselwirkung von AKAP und PKA modifizieren,
vorzugsweise inhibieren, besonders bevorzugt entkoppeln. Mit Vorteil
eignen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Kodierung
von Peptiden, die selektiv an regulatorische Untereinheiten der PKA
binden, insbesondere an RIIα bzw.
RIIβ. Weiterhin
ermöglichen
es die – durch
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten – Peptide,
eine Modifizierung, Inhibition bzw. Entkopplung von AKAP und PKA
in Abhängigkeit
der verwendeten Spezies vorzunehmen. Die Nukleinsäuremoleküle bzw.
die aus diesen abgeleiteten Peptide eignen sich mit Vorteil zur
Herstellung transgener Organismen, beispielsweise von Mäusen, in
denen die AKAP-PKA-Interaktion gewebs- und/oder zellspezifisch modifiziert
ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz,
die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz
funktionsanalog zu sein, zumindest zu 40 % homolog. Im Sinne der
Erfindung heißt,
um zu den genannten Nukleinsäuresequenzen
bzw. den mit diesen Nukleinsäuresequenzen
hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die kodierten
homologen Strukturen eine effiziente und selektive Entkoppelung
der PKA-AKAP-Interaktion ermöglichen
und eine hohe Affinität
für die
Bindung an RII-Untereinheiten von PKA besitzen.
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In
einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist
das Nukleinsäuremolekül mindestens
60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt
90 % Homologie zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen auf.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül eine genomische
DNA und/oder eine RNA; besonders bevorzugt ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA.
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Die
Erfindung betrifft auch einen Vektor, der mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Wirtszelle, die den Vektor
umfasst. Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, das durch mindestens
ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kodiert
wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Polypeptid eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID Nr.
1 bis SEQ ID Nr. 35, bzw. mindestens ein Polypeptid gemäß dieser
Sequenzen. Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, welches durch
Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversion und/oder
Insertion modifiziert ist und funktionsanalog zu einem Polypeptid
nach SEQ ID Nr. 1 bis 35 ist und/oder ein Polypeptid, welches ein
Polypeptid umfasst, das eine auseichende Homologie aufweist, um
zu einem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 1 bis 35 oder deren Mutationen
(Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversion und/oder
Insertionen) funktionsanalog zu sein.
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Ein
funktionsanaloges Peptid ist ein Peptid, das in der Lage ist, die
PKA-AKAP-Interaktion zu modifizieren, bevorzugt zu entkoppeln.
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Die
Erfindung betrifft auch einen Organismus, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül überexprimiert
bzw. einen erfindungsgemäßen Vektor
umfasst und/oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid aufweist. Hierbei
kann es sich zum Beispiel um eine transgene Maus oder Ratte bzw.
um ein Rind, Pferd, Esel, Schaf, Kamel, Ziege, Schwein, Kaninchen,
Meerschwein, Hamster, Katze, Affe oder Hund handeln, in der gewebs-
und/oder zellspezifisch die PKA-AKAP-Interaktion gestört ist.
Derartige Organismen, beispielsweise Mäuse, können insbesondere verwendet
werden, um Pharmaka zu entwickeln, die die PKA-AKAP-Interaktion modifizieren,
bevorzugt entkoppeln.
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Mittels
der erfindungsgemäßen Organismen
können
auch in vivo Stoffwechselprozesse untersucht werden, bei denen die
PKA-AKAP-Interaktion eine Rolle spielt oder bei denen geklärt werden
soll, ob bei einem bestimmten Ereignis die AKAP-PKA-Interaktion
involviert ist.
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Bevorzugt
handelt es sich bei dem Organismus um eine transgene Maus, die das
stark bindende Peptid AKAP18δ-L304T
oder AKAP18δ-L314E
spezifisch in den Hauptzellen von Sammelrohren der Niere überexprimiert.
Vorteilhafterweise führt
die Entkoppelung der PKA von AKAP-Proteinen dazu, dass in primär kultivierten
Sammelrohrzellen die Vasopressin-induzierte Umverteilung von AQP2
verhindert wird, wodurch die Tiere insbesondere einen Diabetes insipidus
aufweisen. Diese Erkrankung zeichnet sich durch großen Wasserverlust
(Polyurie) aus, den beispielsweise humane Patienten durch die Aufnahme
größerer Mengen
Flüssigkeit
zu kompensieren versuchen (Polydipsie).
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Mit
Hilfe der erfindungsgemäßen transgenen
Organismen kann beispielsweise untersucht werden, wie die Entkoppelung
der PKA bzw. von ausgewählten
Untereinheiten von AKAP-Proteinen als therapeutisches Prinzip angesehen
und genutzt werden kann. In der Folge derartiger Untersuchungen
können
dann vorteilhafterweise optimierte Substanzen (Pharmaka) analysiert
werden, die ebenso wirken. Derart optimierte Substanzen wirken bevorzugt
als Aquaretika und können
daher mit Vorteil bei Patienten mit Ödemen, beispielsweise bei Herzinsuffizienz
oder bei Lebercirrhose, eingesetzt werden.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Erkennungsmolekül, das gegen das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die
Wirtszelle und/oder das Polypeptid gerichtet ist. Erkennungssubstanzen
im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die mit den genannten Strukturen
wie Nukleinsäuremolekülen oder
-sequenzen, Vektoren, Wirtszellen und/oder Polypeptiden bzw. deren
Fragmenten wechselwirken können;
insbesondere so wechselwirken, dass eine Detektion bzw. eine Manipulation
dieser Strukturen möglich
ist. Die Erkennungssubstanzen können
insbesondere spezifische Nukleinsäuren sein, die an die genannten
Nukleinsäuremoleküle oder
Polypeptide binden, wie zum Beispiel Antisense-Konstrukte, cDNA
oder mRNA-Moleküle bzw.
deren Fragmente, aber auch Antikörper,
Fluoreszenzmarker, markierte Kohlenhydrate oder Lipide bzw. Chelatoren.
Es ist selbstverständlich auch
möglich,
dass die Erkennungssubstanzen nicht Proteine oder Nukleinsäuren bzw.
Antikörper
sind, sondern gegen diese gerichtete Antikörper. Die Erkennungssubstanzen
können
in solch einem Fall insbesondere sekundäre Antikörper sein.
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In
einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung ist das Erkennungsmolekül ein Antikörper, ein Antikörperfragment
und/oder ein Antisensekonstrukt, insbesondere ein RNA-Interferenzmolekül.
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Die
Antikörper
im Sinne der Erfindung binden die erfindungsgemäßen Peptide spezifisch. Die
Antikörper
können
auch modifizierte Antikörper
sein (zum Beispiel oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte
Antikörper).
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst
sowohl intakte Moleküle
als auch Antikörper-Fragmente, wie Fab,
F(ab')2 und
Fv, die bestimmte Epitop-Determinanten
der Polypeptide binden können.
Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit
des Antikörpers
zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise
erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:
- (1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes
Antigenbindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines
ganzen Antikörpers
mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette
und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden;
- (2) das Fab'-Fragment
eines Antikörper-Moleküls lässt sich
mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion
gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren
Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden
zwei Fab'-Fragmente
erhalten;
- (3) F(ab')2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung
eines ganzen Antikörpers
mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')2 ist
ein Dimer von zwei Fab'-Fragmenten,
die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
- (4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen
Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren
Kette enthält
und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und
- (5) Einzelketten-Antikörper
("SCA"), definiert als
gentechnisch verändertes
Molekül,
das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich
der schweren Kette enthält,
die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem genetisch
fusionierten Einzelketten-Molekül
verbunden sind.
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Die
Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die
das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, den erfindungsgemäßen Vektor,
die erfindungsgemäße Wirtszelle,
das errfindungsgemäße Polypeptid
und/oder das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül, gegebenenfalls
zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, umfasst.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die pharmazeutische Zusammensetzung ein Aquaretika.
Aquaretika im Sinne der Erfindung modifizieren die Wechselwirkung
zwischen PKA und AKAP-Proteinen, insbesondere entkoppeln sie die
Wechselwirkung zwischen diesen beiden. Selbstverständlich ist
es auch möglich,
die erfindungsemäßen Erkennungsmoleküle als pharmazeutische
Zusammensetzung einzusetzen, insbesondere die, die gegen das erfindungsgemäße Peptid
oder die kodierende Nukleinsäure
gerichtet sind.
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Insbesondere
die die erfindungsgemäßen Peptide,
die erfindungsgemäßen Vektoren
oder die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle umfassenden
pharmazeutischen Zusammensetzungen können bevorzugt bei Patienten
mit Ödemen,
insbesondere bei Herzinsuffizienz oder Leberzirrhose eingesetzt
werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren
bzw. Nukleinsäuremoleküle können im
Sinne der Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzung auf der
Nukleinsäureebene
eingesetzt werden, wohingegen die erfindungsgemäßen Peptide, aber zum Teil
auch die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, auf
der Aminosäureebene
eingesetzt werden können.
Je nachdem, ob die Therapie in der Entkoppelung von AKAP und PKA – z.B. mittels
der erfindungsgemäßen Peptide – bzw. in
der Verhinderung der Entkoppelung zwischen AKAP und PKA – z.B. mittels
der erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet
gegen die Peptide – besteht,
kann der Fachmann bevorzugt die erfindungsgemäßen Peptide bzw. die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, die
zum Beispiel gegen diese Peptide oder andere Strukturen gerichtet
sind, als pharmazeutische Zusammensetzung verwenden. Die erfidnungsgemäßen Peptide
sind insbesondere für
die Entkoppelung von AKAP/PKA einsetzbar uns somit beispielsweise
bei Ödemen.
Die erfidnungsgemäßen Erkennungsmoleküle (z.B.
Antikörper)
sind insbesondere bei der Verhinderung der Entkoppelung von AKAP/PKA
einsetzbar z.B. bei Diabetes insipidus.
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Selbstverständlich ist
es möglich,
dass die erfindungsgemäßen Peptide übliche Hilfsstoffe,
bevorzugt Träger,
Adjuvantien und/oder Vehikel umfassen. Bei den Trägern kann
es sich beispielsweise um Füllmittel, Streckmittel,
Bindemittel, Feuchthaltemittel, Sprengmittel, Lösungsverzögerer, Resorptionsbeschleuniger, Netzmittel,
Adsorptionsmittel und/oder Gleitmittel handeln. In diesem Fall wird
das Peptid insbesondere als Arzneimittel oder pharmazeutisches Mittel
bezeichnet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das erfindungsgemäße Mittel als Gel, Puder, Pulver,
Tablette, Retard-Tablette, Premix, Emulsion, Aufgussformulierung,
Tropfen, Konzentrat, Granulat, Sirup, Pellet, Boli, Kapsel, Aerosol,
Spray und/oder Inhalat zubereitet und/oder in dieser Form angewendet.
Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit
den üblichen,
gegebenenfalls Opakisierungsmitteln enthaltenden, Überzügen und
Hüllen
versehen sein und auch so zusammengesetzt sein, dass sie den oder
die Wirkstoffe nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Intestinaltraktes
gegebenenfalls verzögert
abgeben, wobei als Einbettungsmassen zum Beispiel Polymersubstanzen
und Wachse verwendet werden können.
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Die
Arzneimittel dieser Erfindung können
beispielsweise zur oralen Verabreichung in einer beliebigen oral
verträglichen
Dosierungsform verwendet werden, die Kapseln, Tabletten und wässrige Suspensionen
und Lösungen
einschließt,
aber nicht darauf beschränkt
ist. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung schließen Träger, die
häufig
verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat,
werden auch typischerweise zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in
Kapselform schließen
verwendbare Verdünnungsmittel
Lactose und getrocknete Maisstärke
ein. Wenn wässrige
Suspensionen oral verabreicht werden, wird der Wirkstoff mit Emulgier-
und Suspendiermitteln kombiniert. Falls gewünscht, können bestimmte Süßmittel und/oder
Geschmacksstoffe und/oder Farbmittel zugesetzt werden.
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Der
oder die Wirkstoffe können
gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe
auch in mikroverkapselter Form vorliegen.
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Suppositorien
können
neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen
oder wasserunlöslichen
Trägerstoffe
enthalten, zum Beispiel Polyethylenglycole, Fette, zum Beispiel
Kakaofett und höhere Ester
(zum Beispiel C14-Alkohol mit C16-Fettsäure) oder
Gemische dieser Stoffe).
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Salben,
Pasten, Cremes und Gele können
neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel
tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant,
Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum
und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.
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Puder
und Sprays können
neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel
Milchzucker, Talkum, Kieselsäure,
Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische
dieser Stoffe. Sprays können
zusätzlich
die üblichen
Treibmittel, zum Beispiel Chlorfluorkohlenwasserstoffe, enthalten.
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Lösungen und
Emulsionen können
neben den Wirkstoffen CHP und Gemcitabin die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel,
Lösungsvermittler
und Emulgatoren, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol,
Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol,
1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin,
Glycerinformal, Tetrahydofurfurylalkohol, Polyethylenglycole und
Fettsäureester
des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Zur parenteralen
Applikation können
die Lösungen
und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen.
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Suspensionen
können
neben den Wirkstoffen die üblichen
Trägerstoffe
wie flüssige
Verdünnungsmittel,
zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendiermittel,
zum Beispiel ethoxilierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit-
und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid,
Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.
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Die
Arzneimittel können
in Form einer sterilen injizierbaren Zubereitung, zum Beispiel als
sterile injizierbare wässrige
oder ölige
Suspension, vorliegen. Diese Suspension kann auch mit im Fachgebiet
bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder
Netzmittel (wie zum Beispiel Tween 80) und Suspendiermittel formuliert
werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile
injizierbare Lösung oder
Suspension in einem ungiftigen parenteral verträglichen Verdünnungs-
oder Lösungsmittel, zum
Beispiel als Lösung
in 1,3-Butandiol, sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln,
die verwendet werden können,
gehören
Mannit, Wasser, Ringer-Lösung
und isotonische Natriumchloridlösung.
Außerdem
werden üblicherweise
sterile, nichtflüchtige Öle als Lösungsmittel
oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann ein beliebiges
mildes nichtflüchtiges Öl einschließlich synthetischer
Mono- oder Diglyceride verwendet werden. Fettsäuren, wie Ölsäure und ihre Glyceridderivate
sind bei der Herstellung von Injektionsmitteln verwendbar, wie es
natürliche
pharmazeutisch verträgliche Öle, wie
Olivenöl
oder Rizinusöl,
insbesondere in ihren polyoxyethylierten Formen sind. Diese Öllösungen oder
Suspensionen können
auch einen langkettigen Alkohol oder einen ähnlichen Alkohol enthalten
als Verdünnungs-
oder Dispergiermittel.
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Die
genannten Formulierungsformen können
auch Färbemittel,
Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacksverbesserte Zusätze, zum
Beispiel Pfefferminzöl
und Eukalyptusöl
und Süßmittel,
zum Beispiel Saccharin, enthalten. Die erfindungsgemäßen Peptide
sollen in den aufgeführten
pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration
von etwa 0,01 bis 99,9, vorzugsweise von etwa 0,05 bis 99 Gew.-%
der Gesamtmischung vorhanden sein.
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Die
aufgeführten
pharmazeutischen Zubereitungen können
außer
dem Peptid oder Strukturhomologen – z.B. Peptiden mit D-Aminosäuren – oder Funktionsanalogen – z.B. Peptidmimetika – weitere
pharmazeutische Wirkstoffe enthalten. Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen
Zubereitungen erfolgt in üblicher
Weise nach bekannten Methoden, zum Beispiel durch Mischen des oder
der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen.
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Die
genannten Zubereitungen können
bei Mensch und Tier entweder oral, rektal, parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan),
intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, lokal (Puder, Salbe,
Tropfen) und zur Therapie der genannten Krankheiten angewendet werden.
Als geeignete Zubereitung kommen Injektionslösungen, Lösungen und Suspensionen für die orale
Therapie, Gele, Aufgussformulierungen, Emulsionen, Salben oder Tropfen
in Frage. Zur lokalen Therapie können
ophtalmologische und dermatologische Formulierungen, Silber- und
andere Salze, Ohrentropfen, Augensalben, Puder oder Lösungen verwendet
werden. Bei Tieren kann die Aufnahme auch über das Futter oder Trinkwasser
in geeigneten Formulierungen erfolgen. Ferner können die Arzneimittel oder
die Kombinationsmittel in andere Trägermaterialien wie zum Beispiel
Kunststoffe, (Kunststoffketten zur lokalen Therapie), Kollagen oder
Knochenzement eingearbeitet werden.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die Peptide in einer Konzentration von 0, 1 bis
99,5, bevorzugt von 0,5 bis 95, besonders bevorzugt von 20 bis 80
Gew.-% in einer pharmazeutischen Zubereitung eingebracht. Das heißt, die
Peptide sind in den oben aufgeführten
pharmazeutischen Zubereitungen, zum Beispiel Tabletten, Pillen,
Granulaten und anderen, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1
bis 99,5 Gew.-% der Gesamtmischung in einem bestimmten Verhältnis vorhanden.
Die Wirkstoffmenge, das heißt
die Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung,
die mit den Trägermaterialien
kombiniert wird, um eine einzige Dosierungsform zu erzeugen, wird
von dem Fachmann in Abhängigkeit
von dem zu behandelnden Patienten und der besonderen Verabreichungsart
variieren können.
Nach Besserung des Zustandes des Patienten kann der Anteil der wirksamen
Verbindung in der Zubereitung so geändert werden, dass eine Erhaltungsdosis
vorliegt, die die Krankheit zum Stillstand bringt. Anschließend kann
die Dosis oder Frequenz der Verabreichung oder beides als Funktion
der Symptome auf eine Höhe
verringert werden, bei der der verbesserte Zustand beibehalten wird.
Wenn die Symptome auf das gewünschte
Niveau gelindert worden sind, sollte die Behandlung aufhören. Patienten
können
jedoch eine Behandlung mit Unterbrechung auf Langzeitbasis nach
beliebigem Wiederauftreten von Erkrankungssymptomen benötigen. Demgemäß ist der
Anteil der Verbindungen, das heißt ihre Konzentration, in der
Gesamtmischung der pharmazeutischen Zubereitung ebenso wie ihre
Zusammensetzung oder Kombination variabel und kann vom Fachmann
aufgrund seines Fachwissens modifiziert und angepasst werden.
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Dem
Fachmann ist bekannt, dass die erfindungsgemäßen Peptide mit einem Organismus,
bevorzugt einem Menschen oder einem Tier, auf verschiedenen Wegen
in Kontakt gebracht werden können.
Weiterhin ist dem Fachmann bekannt, dass insbesondere die pharmazeutischen
Mittel in verschiedenen Dosierungen appliziert werden können. Die
Applikation sollte hierbei so erfolgen, dass die Erkrankung möglichst
effektiv bekämpft
wird bzw. der Ausbruch einer solchen Krankheit in einer prophylaktischen
Gabe verhindert wird. Die Konzentration und die Art der Applikation
können
vom Fachmann durch Routineversuche eruiert werden. Bevorzugte Applikationen
der erfindungsgemäßen Verbindungen
sind die orale Applikation in Form von Pulver, Tabletten, Saft,
Tropfen, Kapseln oder ähnlichem,
die rektale Applikation in Form von Zäpfchen, Lösungen und ähnlichem, parenteral in Form
von Injektionen, Infusionen und Lösungen sowie lokal in Form
von Salben, Pflastern, Umschlägen,
Spülungen
und ähnlichem.
Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen der erfindungsgemäßen Verbindungen
prophylaktisch oder therapeutisch.
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Die
Eignung der gewählten
Applikationsformen wie auch der Dosis, des Applikationsschemas,
der Adjuvantswahl und dergleichen kann beispielsweise durch Entnahme
von Serum-Alliquoten aus dem Patienten, d.h. dem Mensch oder dem
Tier, und dem Testen auf das Vorhandensein von Krankheitsindikatoren
im Verlauf des Behandlungsprotokolls bestimmt werden. Alternativ
und begleitend hierzu kann der Zustand der Niere, aber auch die
Menge von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems, auf herkömmliche
Weise begleitend bestimmt werden, um einen Gesamtüberblick über die
immunologische Konstitution des Patienten und insbesondere die Konstitution
von stoffwechselwichtigen Organen, zu erhalten. Zusätzlich kann
der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung hin beobachtet
werden. Wenn eine unzureichende therapeutische Effektivität erzielt
wird, kann der Patient mit erfindungsgemäßen Mitteln ggf. mit anderen
bekannten Medikamenten modifiziert weiterbehandelt werden, von denen
eine Verbesserung der Gesamtkonstitution erwartet werden kann. Selbstverständlich ist
es auch möglich,
die Träger
oder Vehikeln des pharmazeutischen Mittels zu modifizieren oder
den Verabreichungsweg zu variieren.
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Neben
der oralen Aufnahme kann es dann zum Beispiel vorgesehen sein, dass
Injektionen beispielsweise intramuskulär oder subkutan oder in die
Blutgefäße ein weiterer
bevorzugter Weg für
die therapeutische Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen
sind. Zeitgleich kann auch die Zufuhr über Katheter oder chirurgische
Schläuche
angewendet werden; beispielsweise über Katheter, die direkt zu
bestimmten Organen wie den Nieren führen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in einer bevorzugten Ausführungsform
in einer Gesamtmenge von bevorzugt 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht
je 24 Stunden eingesetzt werden, bevorzugt von 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht.
Hierbei handelt es sich vorteilhafterweise um eine therapeutische
Menge, die verwendet wird, um die Symptome einer Störung oder
respon-siven, pathologisch physiologischen Kondition zu verhindern
oder zu verbessern.
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Selbstverständlich wird
die Dosis vom Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, dem Grad
der Krankheit, der Art einer notwendigen gleichzeitigen Behandlung,
der Häufigkeit
der Behandlung und der Art der gewünschten Wirkungen und der Nebenwirkungen
abhängen.
Die tägliche
Dosis von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht
kann einmalig oder mehrfach angewendet werden, um die gewünschten
Ergebnisse zu erhalten. Typischerweise werden insbesondere pharmazeutischen
Mittel zur etwa 1- bis 10-maligen Verabreichung pro Tag oder alternativ
oder zusätzlich
als kontinuierliche Infusion verwendet. Solche Verabreichungen können als
chronische oder akute Therapie angewendet werden. Die Wirkstoffmengen,
die mit den Trägermaterialien
kombiniert werden, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen,
können
in Abhängigkeit
von dem zu behandelnden Wirt und der besonderen Verabreichungsart
selbstverständlich
variieren. Bevorzugt ist es, die Targetsdosis auf 2 bis 5 Applikationen
zu verteilen, wobei bei jeder Applikation 1 bis 2 Tabletten mit
einem Wirkstoffgehalt von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden.
Selbstverständlich
ist es möglich, den
Wirkstoffgehalt auch höher
zu wählen,
beispielsweise bis zu einer Konzentration bis 5000 mg/kg. Die Tabletten
können
auch retardiert sein, wodurch sich die Anzahl der Applikationen
pro Tag auf 1 bis 3 vermindert. Der Wirkstoffgehalt der retardierten
Tabletten kann 3 bis 3000 mg betragen. Wenn der Wirkstoff – wie ausgeführt – durch
eine Injektion verabreicht wird, ist es bevorzugt, 1- bis 10-mal pro Tag
bzw. durch Dauerinfusion den Wirt mit den erfindungsgemäßen Verbindungen
in Kontakt zu bringen, wobei Mengen von 1 bis 4000 mg pro Tag bevorzugt
sind. Die bevorzugten Gesamtmengen pro Tag haben sich in der Humanmedizin
und in der Veterinärmedizin
als vorteilhaft erwiesen. Es kann erforderlich sein, von den genannten
Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem
Körpergewicht
des zu behandelnden Wirts, der Art und der Schwere der Erkrankung,
der Art der Zubereitung der Applikation des Arzneimittels sowie
dem Zeitraum bzw. dem Intervall, innerhalb welchem die Verab-reichung
erfolgt. So kann es in einigen Fällen
bevorzugt sein, den Organismus mit weniger als den genannten Mengen
in Kontakt zu bringen, während
in anderen Fällen
die angegebene Wirkstoffmenge überschritten
werden muss. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierungen
und der Applikationsart der Wirkstoffe kann durch den Fachmann aufgrund
seines Fachwissens leicht erfolgen.
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In
einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
das pharmazeutische Mittel in einer Einzelgabe von 1 bis 100, insbesondere
von 2 bis 50 mg/kg Körpergewicht
eingesetzt. Wie auch die Gesamtmenge pro Tag kann auch die Menge
der Einzelgabe pro Applikation von dem Fachmann aufgrund seines
Fachwissens variiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen
können
in den genannten Einzelkonzentrationen und Zubereitungen zusammen
mit dem Futter bzw. mit Futterzubereitungen oder mit dem Trinkwasser
auch in der Veterinärmedizin
gegeben werden. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise die Menge Wirkstoff,
die bei einer Applikation verabreicht wird, und die gewöhnlich einer
ganzen, einer halben Tagesdosis oder einem Drittel oder einem Viertel
einer Tagesdosis entspricht. Die Dosierungseinheiten können demgemäß bevorzugt
1, 2, 3 oder 4 oder mehrere Einzeldosen oder 0,5, 0,3 oder 0,25
einer Einzeldosis enthalten. Bevorzugt wird die Tagesdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen
auf 2 bis 10 Applikationen verteilt, bevorzugt auf 2 bis 7, besonders
bevorzugt auf 3 bis 5 Applikationen. Selbstverständlich ist auch eine Dauerinfusion
der erfindungsgemäßen Mittel
möglich.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden bei jeder oralen Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen
1 bis 2 Tabletten gegeben. Die erfindungsgemäßen Tabletten können mit
dem Fachmann bekannten Überzügen und
Hüllen
versehen sein und auch so zusammengesetzt werden, dass sie den oder
die Wirkstoffe nur bei bevorzugten, in einem bestimmten Teil des
Wirts freigeben.
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Bevorzugt
ist es in einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, dass die Peptidabschnitte gegebenenfalls miteinander
assoziiert oder mit einem Träger
verbunden in Liposomen eingeschlossen sind, wobei der Einschluss
in Liposomen im Sinne der Erfindung nicht zwingend bedeuten muss,
dass die Peptide im Inneren der Liposomen vorliegen, ein Einschluss
im Sinne der Erfindung kann auch bedeuten, dass die Peptide mit
der Membran der Liposomen assoziiert sind, beispielsweise so, dass
diese auf der äußeren Membran
verankert sind. Eine solche Darstellung der erfindungsgemäßen Peptide
in oder auf den Liposomen ist vorteilhaft, wenn der Fachmann die
Liposomen so auswählt,
dass sie eine immunstimulierende Wirkung haben. Dem Fachmann sind
aus der
DE 198 51 282 verschiedene
Möglichkeiten
bekannt, die immunstimulierende Wirkung von Liposomen zu modifizieren.
Bei den Lipiden kann es sich um einfache Lipide handeln, wie beispielsweise
Ester und Amide oder um komplexe Lipide wie zum Beispiel um Glycolipide
wie Cerebroside oder Ganglioside, um Sphingolipide oder um Phospholipide.
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Beispielsweise
ist es möglich,
einzelne oder Gruppen von Aminosäuren
in den Peptiden auszutauschen, ohne dass die Aktivität der Peptide
in Bezug auf die Lösung
der erfindungsgemäßen Aufgabe
nachteilig beeinflusst wird. Für
den Austausch derartiger Aminosäuren
sei auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Genetik
verwiesen.
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Im
Stand der Technik sind verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung
von Peptiden offenbart. Peptide, die von den erfindungsgemäßen Peptiden
ausgehend mit solchen Verfahren entwickelt werden, sind von der
erfindungemäßen Lehre
mit erfasst. Eine Möglichkeit
des Generierens von funktionsanalogen Peptiden ist beispielsweise
in PNAS USA 1998, Oct. 13; 9521:12179-84, WO 99/6293 und/oder WO
02/38592 beschrieben; diese Lehren sind in den Offenbarungsgehalt
der Erfindung mit aufgenommen. Das heißt, sämtliche Peptide, Peptidfragmente
oder Strukturen, die Peptide umfassen, die mit den genannten Verfahren – von den
erfindungsgemäßen Peptiden
ausgehend – generiert
werden, sind Peptide im Sinne der Erfindung, sofern sie die erfindungsgemäße Aufgabe
lösen.
Die erfidnungsgemäßen Peptide
sind auch Leitstrukturen für
die Entwicklung von Peptidmimetika.
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Dem
Fachmann ist weiterhin bekannt, dass einzelne Aminosäuren analoge
physikochemische Eigenschaften aufweisen, die mit Vorteil dazu führen, dass
diese Aminosäuren
untereinander ausgetauscht werden können. Hierzu gehören beispielsweise
die Gruppe der Aminosäuren
(a) Glycin, Alanin, Valin, Leucin und/oder Isoleucin; bzw. die Aminosäuren (b)
Serin und Threonin, die Aminosäuren
(c) Asparagin und Glutamin, die Aminosäuren (d) Asparaginsäure und
Glutaminsäure;
die Aminosäuren
(e) Lysin und Arginin sowie die Gruppe der aromatischen Aminosäuren (f)
Phenylalanin, Tyrosin und/oder Tryptophan. Aminosäuren innerhalb
ein und derselben Gruppe (a-f) können
untereinander ausgetauscht werden. Weiterhin ist es möglich, dass
Aminosäuren
durch modifizierte Aminosäuren
oder spezifische Enantiomere ausgetauscht werden. Weitere Modifikationen
sind gemäß der Lehre
nach der WO 99/62933 oder WO 02/38592 möglich, die in den Offenbarungsgehalt der
erfindungsgemäßen Lehre
mit aufgenommen sind.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Peptid einen Linker und/oder einen Spacer, der ausgewählt ist
aus der Gruppe umfassend: α-Aminocarbonsäuren sowie
deren Homo- und Heterooligomere, α,ω-Aminocarbonsäuren sowie
deren verzweigte Homo- oder Heterooligomere, sonstige Aminosäuren sowie
die linearen und verzweigten Homo- oder Heterooligomere (Peptide);
Amino-oligoalkoxy-alkylamine; Maleinimidocarbonsäure-Derivate; Oligomere von
Alkylaminen; 4-Alkylphenyl-Derivate; 4-Oligoalkoxyphenyl- oder 4-Oligoalkoxyphenoxy-Derivate;
4-Oligoalkylmercaptophenyl- oder 4-Oligoalkylmercaptophenoxy-Derivate;
4-Oligoalkylaminphenyl- oder 4-Oligoalkylaminyphenoxy-Derivate;
(Oligoalkylbenzyl)-phenyl- oder 4-Oligoalkylbenzyl)-phenoxy-Derivate sowie 4-Oligoalkoxybenzyl)-phenyl-
oder 4-Oligoalkoxybenzyl)-phenoxy-Derivate; Trityl-Derivate; Benzyloxyaryl-
oder Benzyloxyalkyl-Derivate; Xanthen-3-yl-oxyalkyl-Derivate; (4-Alkylphenyl)-
oder ω-(4-Alkylphenoxy)-alkansäure-Derivate;
Oligoalkyl-Phenoxyalkyl- oder Oligoalkoxy-phenoxyalkyl-Derivate;
Carbamat-Derivate; Amine; Trialkylsilyl- oder Dialkyl-alkoxysilyl-Derivate; Alkyl- oder Aryl-Derivate
und/oder Kombinationen davon; weitere mögliche Strukturen werden in
der
EP 1 214 350 beschrieben,
die in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen sind.
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Bevorzugt
können
synthetische Peptide oder Fragmente hiervon durch chemische Crosslinker
multimerisiert werden oder an ein Trägermolekül wie BSA, Dextran, KLH oder
andere gekoppelt werden. Die hierzu verwendeten chemischen Crosslinker
sind in "Bioconjugate
Techniques", Greg
T. Hermanson, Academic Press, 1996 aufgelistet, die in den Offenbarungsgehalt
der erfindungsgemäßen Lehre
mit aufgenommen sind. Bevorzugte Crosslinker sind homobifunktionale
Crosslinker, bevorzugt: NHS-Ester, wie DSP, DTSSP, DSS, BS, DST,
Sulfo-DST, BSOCOES, Sulfo-BSOCOES, EGS, Sulfo-EGS, DSG oder DSC,
homobifunktionale Imidoester, wie DMA, DMP, DMS oder DTBP, homobifunktionale
Sulfhydryl-reaktive Crosslinker, wie DPDPB, BMH oder BMOE, Difuorobenzenderivate,
wie DFDNB oder DFDNPS, homobifunktionale photoreaktive Crosslinker,
wie BASED, homobifunktionale Aldehyde, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd,
Bis-Epoxide, wie 1,4-Butandioldiglycidylether, homobifunktionale
Hydrazide, wie Adipinsäuredihydrazide
oder Carbohydrazide, Bis-diazoniumderivate, wie o-Tolidin, bisdiazotisiertes
Benzidin oder Bisallkylhaloid.
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Bevorzugt
sind auch heterobifunktionale Crosslinker, insbesondere aminreaktive
und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie SPDP, LC-SPDP, Sulfo-LC-SPDP,
SMPT, Sulfo-LC-SMPT, SMCC, Sulfo- SMCC, MBS, Sulfo-MBS, SIAB, Sulfo-SIAB,
SMPB, Sulfo-SMBP, GMBS, Sulfo-GMBS, SIAX, SIAXX, SIAC, SIACX oder
NPIA, carbonylreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie MPBH,
M2C2H oder PDPH,
aminreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie NHS-ASA, Sulfo-NHS-ASA,
Sulfo-NHS-LC-ASA, SASD, HSRB, Sulfo-HSAB, SANPAH, Sulfo-SANPAH,
ANB-NOS, SAND, SADP, Sulfo-SADP, Sulfo-SAPB, SAED, Sulfo-SAMCA,
p-Nitrophenyldiazopyruvat oder PNP-DTP, Sulfhydryl und photoreaktive
Crosslinker, wie ASIB, APDP, Benzophenon-4-iodoacetamid oder Benzophenon-4-maleimid,
carbonylreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ABH, carboxylatreaktive
und photoreaktive Crosslinker, wie ASBA, argininreaktive Crosslinker,
wie APG, trifunktionale Crosslinker, wie 4- Azido-2-nitrophenylbiozytin-4-nitrophenylester,
Sulfo-SEBD, TSAT und/oder TMEA.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide und rekombinant
hergestellte Strukturen, durch Peptidbrücken mit einer Länge von
0 bis 50 Aminosäuren
verbunden. Dies beinhaltet auch rekombinante Proteine, die aus zwei
N-terminalen und einer C-terminalen Sequenz bestehen oder Hexamere
bestehend aus drei N-terminalen Sequenzen und drei C-terminalen
Sequenzen, oder Multimere der zuvor aufgeführten rekombinanten Strukturen,
wobei zwischen den N- und den C-terminalen
Sequenzen je eine Peptidbrücke
von 0 bis 50 Aminosäuren
vorhanden sein kann. Die Peptide können zum Zwecke der Aufreinigung,
Solubilisierung bzw. der Konformationsveränderung mit spezifischen Fusionsanteilen
entweder am N- oder am C-Terminus versehen sein, wie zum Beispiel
CBP (Calmodulin-Bindungsprotein), His-Tag und/oder andere. Ähnliche
Konstrukte können
auch von DNA, die zum therapieren verwendet wird, kodiert werden.
-
Die
Erfindung betrifft auch einen Kit, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, einen
erfindungsgemäßen Vektor,
eine erfindungsgemäße Wirtszelle,
ein erfindungsgemäßes Polypeptid,
ein erfindungsgemäßes Erkennungsmolekül und/oder
eine pharmazeutische Zusammensetzung gegebenenfalls zusammen mit
einer Information – zum
Beispiel einem Beipackzettel oder eine Internetadresse, die auf
Homepages mit weiteren Informationen verweist, etc. – über die
Handhabung bzw. über
die Kombination der Inhalte des Kits umfasst. Die Information zur
Handhabung der Inhalte des Kits kann beispielsweise ein Therapieschema
für Ödeme, Herzinsuffizienz,
Leberzirrhose, Hyperinsulinismus, Hypertonie, Ulcus duodeni umfassen.
Die Information kann jedoch auch Angaben darüber umfassen, wie die erfindungsgemäßen Stoffe
und Erzeugnisse innerhalb einer Diagnose von Krankheiten, die mit
der AKAP-PKA-Interaktion oder deren Entkoppelung assoziiert sind,
einzusetzen sind. Der erfindungsgemäße Kit kann auch in der Grundlagenforschung
verwendet werden. Innerhalb der Grundlagenforschung ist der Kit
bevorzugt einsetzbar, um zu detektieren, ob ein Stoffwechselphänomen mit
der Wechselwirkung bzw. mit der nicht vorhandenen Wechselwirkung
von AKAP und PKA assoziiert ist. Insbesondere ist es möglich, mit
Hilfe des erfindunggemäßen. Kits
zu bestimmen, welche Untereinheiten von AKAP und/oder PKA für die Interaktion
dieser beiden Moleküle
oder für
das Nichtzustandekommen der Interaktion zwischen diesen verantwortlich
sind.
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Die
erfindungsgemäßen Erzeugnisse,
wie beispielsweise Peptide, Vektoren, Nukleinsäuremoleküle, können andere vorteilhafte Nukleinsäuren, Aminosäuren, Kohlenhydrate
bzw. Lipide umfassen. Es kann beispielsweise bevorzugt sein, dass
die Peptide mit einem Fettrest, wie zum Beispiel einem Stearat,
so modifiziert werden, dass diese gut membranpermeabel sind. Mit
derartigen Peptiden können
an Zellkulturen Versuche durchgeführt werden. Solche Peptide
können
als Werkzeuge eingesetzt werden, um die PKA besonders effizient
von AKAP-Proteinen in Zellen, Zellkulturen, Gewebekulturen, Organkulturen
oder Organismen zu entkoppeln. Die Peptide im Sinne der Erfindung
werden in Zellkulturen insbesondere zur Beantwortung der Frage herangezogen
werden können,
ob ein bestimmter Prozess von der Verankerung der PKA an AKAP-Proteine abhängt. Aufgrund
der vorteilhaften hohen Affinität
für die
humanen RIIα-Untereinheiten der
PKA eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide insbesondere für Untersuchungen
an humanen Systemen. Durch den Vergleich mit Peptiden, die die PKA
mit anderer Affinität
binden, werden weiterhin quantitative Aussagen möglich sein, die definieren,
bis zu welchem Grad eine PKA-AKAP-Interaktion notwendig ist, um
den Ablauf eines physiologischen Prozesses zu gewährleisten.
Insbesondere die erfindungsgemäßen Kits
können
verwendet werden, um diesen Ablauf des physiologischen Prozesses
zu studieren. Von Vorteil ist es hierbei, dass die erfindungsgemäßen Peptide,
die die RII-Untereinheiten der PKA stärker binden als die typischen
PKA-Bindungsdomänen
von AKAP18δ.
Da die erfindungsgemäßen Peptide
vorteilhafterweise RIIα-
bzw. RIIβ-spezifisch sind,
können
zum Beispiel mit dem Kit besonders detaillierte Erkenntnisse über die
Interaktion gewonnen werden. Die Entkoppelung der einen oder der
anderen regulatorischen Untereinheiten der PKA von AKAP-Proteinen
kann insbesondere Aufschluss darüber
geben, welche PKA, TypIIα oder
TypIIβ,
an dem jeweiligen zu untersuchenden Prozess beteiligt ist. Insbesondere
das Peptid A18δRIIβRn1 bindet
selektiv RIIβ Untereinheiten der
PKA.
-
Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Modifikation, insbesondere
eine Inhibition, bevorzugt eine Entkoppelung, einer AKAP-PKA-Interaktion
bzw. der Interaktion von AKAP bzw. PKA-Untereinheiten umfassend
die Schritte:
- a) Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, eines
erfindungsgemäßen Vektors,
einer erfindungsgemäßen Wirtszelle
und/oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids
und
- b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnisses gemäß a) mit
einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus.
-
Bevorzugt
ist es, dass die Interaktion an einer regulatorischen R-Untereinheit
analysiert bzw. modifiziert wird, besonders bevorzugt an einer RIIα- und/oder
RIIβ-Untereinheit.
-
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinmoleküls, einer
erfindungsgemäßen Wirtszelle,
eines erfindungsgemäßen Organismus,
eines erfindungsgemäßen Polypeptids,
eines erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküls, einer
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung und/oder eines erfindungsgemäßen Kits zur Modifikation,
insbesondere einer Inhibition, einer AKAP-PKA-Interaktion.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, wird die Zelle – beispielsweise
als Zellkultur – oder
der Organismus als Modell für
die gewebs- und/oder zellspezifische AKAP-PKA-Interaktion verwendet, insbesondere
als Modell für
Diabetes insipidus. Weitere bevorzugte Modelle sind Zellkulturen,
oder Gewebe, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder
Peptide umfassen.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird durch die AKAP-PKA-Modifikation die Vasopressin-induzierte
Umverteilung von AQP2 modifiziert, insbesondere verhindert.
-
In
einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform werden das Polypeptid
und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung als Wasserverlust-verursachende
Mittel verwendet, insbesondere als Aquaretika.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, wird die Interaktion
der RIIα-
oder RIIβ-Untereinheit
des PKA mit AKAP modifiziert, insbesondere inhibiert.
-
In
einer weiteren bevorzugten Verwendung sind die Untereinheiten humanem
oder murinem Ursprungs.
-
Im
Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden,
ohne auf dieses beschränkt
zu sein.
-
Peptide zur
Inhibition der Interaktion von Proteinkinase A und Proteinkinase
A-Ankerproteinen
-
Material und
Methoden
-
Herstellung
von Peptidbibliotheken, die von der Sequenz der PKA-Bindungsdomäne von AKAP18δ abgeleitet
sind, auf Membranen
-
Alle
Chemikalien und Lösungsmittel
wurden bei Fluka (Steinheim) oder Sigma Aldrich (München) gekauft
und ohne weitere Reinigungsschritte benutzt. Fmoc-geschützte Aminosäurepentafluorophenylester
wurden bei Novabiochem Merck Biosciences GmbH (Darmstadt) gekauft.
Peptidbibliotheken wurden durch automatische SPOT-Synthese auf Whatman
50 Zellulosemembranen gemäß Standardprotokollen
mittels Fmoc-Chemie und AutoSpot-Robot ASS 222 (Intavis Bioanalytical
Instruments AG, Köln)
synthetisiert. Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten wurden durch
eine Mischung aus Trifluoressigsäure
(TFA) in Dichlormethan (DCM) abgespalten (Frank, 1992; Kramer und
Schneider-Mergener,
1998). Zur Kontrolle wurden Spots (ca. 50 nmol Peptid pro Spot)
aus der Zellulosemembran herausgeschnitten, von der Membran durch
Behandlung mit 0,05m NaOH abgespalten und mit HPLC und MALDI-TOF-Massenspektrometrie
analysiert.
-
Detektion
membranassoziierter Peptide im RII-overlay-Experiment mit regulatorischen
RIIα- und
RIIβ-Untereinheiten der
PKA als Sonde
-
Material
-
- 1. Regulatorische RIIα- (human) und RIIβ- (Ratte)
Untereinheiten der PKA erhalten von Prof. Dr. Friedrich W. Herberg,
Universität
Kassel
- 2. Katalytische Untereinheiten der PKA, Promega, Mannheim, Bestellnr.:
V5161
- 3. [γ32P]ATP 5000 Ci/mmol Amersham Biosciences,
Braunschweig, Bestellnr.: AA0018
- 4. Sephadex G 50, medium Pharmacia, Bestellnr.: 17-0043-01
- 5. Phosphat-gepufferte Saline (PBS)
NaCl | 8
g |
KCl | 0,2
g |
Na2HPO4 | 1,44
g |
KH2PO4 | 0,24
g |
in 800 ml H2O lösen, auf
pH 7,4 einstellen und mit H2O auf 1 l auffüllen.
- 6. Tris-gepufferter Saline mit Tween 20
Tris·HCl | 10
mM |
NaCl | 150
mM |
Tween
20 | 0,05% |
pH
7,5 | |
-
Radioakive
Markierung der regulatorischen Untereinheit von PKA
-
-
2. Einstellung der ATP-Konzentration
-
Die
ATP-Konzentration wurde durch Zugabe von nicht radioaktivem ATP
auf 10 μM
eingestellt (Zugabe von 5 μl
einer 1 mM Lösung).
Der Ansatz wurde weitere 50 min auf Eis inkubiert.
-
3. Stoppen der Reaktion
und Überprüfung der
Reaktion
-
Die
Reaktion wurde durch Zugabe von Dextranblau und Abtrennung freier
Nukleotide gestoppt. Das freie ATP wurde über eine Sephadex G50-Säule abgetrennt.
-
Abtrennung der markierten
RII-Untereinheit der PKA von freien Nukleotiden über Sephadex G50-Säulen
-
Nicht
eingebaute Nukleotide wurden von den RII-Untereinheiten durch die
Fraktionierung über
Sephadex G50-Säulen
getrennt.
- 1. Quellen des Sephadex G 50-Materials:
20 g wurden in 400 ml PBS über
Nacht bei Raumtemperatur gequollen. Nicht abgesetztes Material wurde
anschließend
mit einer Pasteurpipette entfernt. Das gequollene Material wurde
in 50 ml Falcon Röhrchen
aliquottiert und bei 4 °C
gelagert. Zur Konservierung wurde Natriumazid in einer Endkonzentration
von 0,01 % zugesetzt.
- 2. Das Material wurde in eine mit einer Glaskugel verschlossene
10 ml sterile Einmalpipette gegossen. Zum Setzen des Säulenbettes
liefen etwa 50 ml PBS, das 1 mg/ml BSA (bovines Serumalbumin) enthielt,
durch. Bis zur Benutzung der Säule
wurde sie oben mit Parafilm verschlossen.
- 3. Die markierten RII-Untereinheiten (500 μl) wurden mit Dextranblau (70 μl einer 20
mg/ml Lösung)
auf die Säule
aufgetragen (Gesamtvolumen = 570 μl).
- 4. Nachdem die Probe in die Matrix eingewandert war, wurde mit
PBS aufgefüllt.
- 5. Kurz bevor das Dextranblau eluierte, wurde begonnen Fraktionen
zu sammeln (2 Fraktionen je 1,5 ml, die weiteren Fraktionen je 1
ml).
- 6. Zur Bestimmung der Inkorporation von 32P
wurde 1 (5,7 μl)
der Probe vor der Säule
(das entspricht 1 der eingesetzten Radioaktivität) und 3 μl jeder Fraktion eingesetzt.
- 7. Die Fraktionen des ersten Peaks, welcher die Sonde enthielt,
wurden vereinigt. Die Einbaurate wurde in errechnet und die spezifische
Aktivität
(cpm/μg
Protein) bestimmt.
-
RII-overlay
-
- 1. Proteine (40 μg) wurden mittels SDS-PAGE getrennt
und durch das semi dry-Elektroblotverfahren auf eine PVDF-Membran
(PVDF, Polyvinylidenfluorid) übertragen.
Die membranassoziierten Proteine wurde mit Ponceau S gefärbt, um
die Markerproteine auf der Membran zu identifizieren. Entfärbt wurde
mit TBS.
- 2. Die Membran wurde in Blotto/BSA für 16 h bei 4 °C inkubiert:
10
mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.4 | |
0,15
M NaCl | 8,766
g/l |
5 %
(w/v) Magermilchpulver | 50
g/l |
0,1
% (w/v) BSA | 1
g/l |
(0,01
% antifoam (Sigma)) | |
0,02
% NaN3 | 0,2
g/l |
- 3. Das Blotto/BSA wurde durch frisches ersetzt und 32P
markierte RII-Untereinheiten dazugegeben (105 cpm/ml).
Es wurde für
4-6 h bei Raumtemperatur inkubiert.
- 4. Die Membran wurde 4 × 15
min in Blotto/BSA und 2 × 10
min in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.4, 0,15 M NaCl gewaschen.
- 5. RII-bindende Proteine wurden durch Exposition auf eine Phosphoimagerplatte
detektiert.
-
Ergebnisse
-
Es
wurde eine Peptidbibliothek, abgeleitet von der wildtypischen Aminosäuresequenz
der PKA-Bindungsdomäne
von AKAP18δ (PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY;
Henn et al., 2004) auf einer Membran synthestisiert. Dazu wurde
jede Aminosäure
der wildtypischen Sequenz mit den 20 möglichen Aminosäuren substituiert. 1 zeigt
die Detektion der Peptide mittels der RII-overlay-Methode. Als Sonde
wurden in diesem Fall radioaktive PKA RIIα- und RIIβ-Untereinheiten gleichzeitig
eingesetzt. In allen späteren
Experimenten wurden entweder RIIα-
oder RIIβ-Untereinheiten
als Sonde eingesetzt. Das Ergebnis zeigt deutliche Unterschiede
in der Bindungsfähigkeit
der einzelnen Peptide an die R-Untereinheiten (unterschiedliche
Signalintensitäten).
-
2 zeigt eine Wiederholung des Experiments
mit ausgewählten
Peptiden (AKAP18δ-L304T, AKAP18δ-L308D, AKAP18δ-L314E) deren
Bindungsfähigkeit
an RIIα-
bzw. RIIβ-Untereinheiten
aber separat in unterschiedlichen RII-overlay-Experimenten getestet
wurde. Als Kontrollen wurden die Peptide Ht31, Ht31-P, AKAP18δ-RI und AKAP18δ-wt (wildtypische
Sequenz) auf den gleichen Membranen synthetisiert und dem RII-overlay-Experiment
unterzogen. Für
die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet
und auf das Signal, das für
AKAP18δ-wt
erhalten wurde, bezogen. Die Quantifizierung spricht für eine stärkere Bindung
von AKAP18δ-L304T
und AKAP18δ-L314E
sowohl an RIIα-
als auch an RIIβ-Untereinheiten, AKAP18δ-RI und AKAP18δ-L308D dagegen
schwächer.
Das bekannte Peptid Ht31 bindet beide regulatorische Untereinheiten
etwa 5fach schwächer
als das AKAP18δ-wt
und etwa 5-6fach schwächer
als AKAP18δ-L304T
und AKAP18δ-L314E.
Die Bindung von Ht31 an die hier verwendeten regulatorischen RIIα- und RIIβ-Untereinheiten
ist nur unwesentlich stärker
als die Bindung der Untereinheiten an Ht31-P, das die AKAP-PKA-Interaktion
nicht hemmt (Klussmann et al., 1999; Alto et al., 2003). Damit sind
die Peptide AKAP18δ-wt,
AKAP18δ-L304T
und und AKAP18δ-L314E
wesentlich effizientere Inhibitoren einer AKAP-PKA-Interaktion als
Ht31.
-
Alto
et al. (2003) entwickelten ein Peptid, AKAPIS,
das die Interaktion zwischen der murinen RIIα-Untereinheit der PKA mit 5fach
höherer
Affinität
bindet (KD = 0,45 nM) als das Peptid Ht31
(KD = 2,2 nM).
-
In
unseren RII-overlay-Experimenten binden die Peptide AKAPIS und Ht31 sowohl die humane RIIα- als auch
die RIIβ-Untereinheit
der PKA aus der Ratte kaum, die von uns identifizierten Peptide
AKAP18δ-wt und
AKAP18δ-L304T
und und AKAP18δ-L314E
dagegen stark. Dieses Ergebnis spricht für Speziesunterschiede zwischen
den murinen und humanen RIIα-Untereinheiten,
die zu unterschiedlichen Bindungsaffinitäten für die gleichen Peptide führen.
-
Identifizierung von Peptiden,
die spezifisch RIIβ-Untereinheiten
der PKA binden
-
Um
Peptide zu finden, die entweder RIIα- oder RIIβ-Untereinheiten der PKA binden
und damit spezifisch die Interaktion von AKAP-Proteinen mit der
Typ IIα bzw.
der Typ IIβ PKA
hemmen, wurden anhand von dreidimensionalen Strukturmodellen der
PKA-Untereinheiten aus der wildtypischen PKA-Bindungsdomäne von AKAP18δ Peptide
abgeleitet, die die AKAP-Bindungstasche blockieren könnten. Die
Peptide (1-19) wurden parallel auf zwei Membranen synthetisiert
und anschließend
in RII-overlay-Experimenten auf ihre Bindungsfähigkeit an RIIα- oder RIIβ-Untereinheiten der
PKA getestet (3A). Die quantitative Auswertung zeigte
u. a. einen deutlichen Unterschied der Bindung der beiden PKA-Untereinheiten
an das Peptid 7, dessen Sequenz neben derer der anderen Peptide
in der 3B aufgelistet ist.
-
Ausgehend
von der Sequenz des Peptids 7 wurden zwei Peptidbibliotheken auf
Membranen synthetisiert und RII-overlay-Experimenten
mit RIIα-
bzw. RIIβ-Untereinheiten
als Sonden unterzogen. 4 zeigt, dass einige Peptide
RIIα-binden, aber nicht
RIIβ-Untereinheiten
(zum Beispiel die Peptide 10/11 und 10/12) und umgekehrt (zum Beispiel
Peptid 21/4). Darüber
hinaus weisen einige Peptide eine stärkere Bindung an RIIα-Untereinheiten
als an RIIβ-Untereinheiten
auf. Bei anderen ist es umgekehrt. Sie binden RIIα-Untereinheiten
schwächer
als an RIIβ-Untereinheiten.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass wir mit den genannten
Peptiden A18δRIIαHs1 und 2
und A18δRIIβRn1 die ersten
Blocker gefunden haben, die selektiv die Interaktion von RIIα- bzw. RIIβ-Untereinheiten
der PKA mit AKAP-Proteinen
identifiziert haben.
-
-
-
Tabelle
2. Bindungskonstanten für
die Interaktion von humanen RIIα-
und RIIβ-Untereinheiten
aus der Ratte mit den angegebenen Peptiden, die aus der wildtypischen
RII-Bindungsdomäne von AKAP18δ (AKAP18δwt) abgeleitet
wurden. Die Werte wurden durch surface plasmon resonance-Messungen
erhalten. L, Leuzin, T, Threonin, D, Aspartat, P, Prolin, IS, in
silico. 304, 308 und 314 bezeichnen die Position der entsprechenden
Aminosäuren
in AKAP18δ.
-
Bildlegenden
-
1.
-
Identifizierung
von Peptiden, die die Interaktion von AKAP-Proteinen mit der PKA
hemmen. Eine Bibliothek von Peptiden, die von der PKA-Bindungsdomäne des AKAP18δ abgeleitet
wurden, wurde auf einer Membran synthetisiert. Die Membran wurde
mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIα- und RIIβ-Untereinheiten der PKA inkubiert
(RII-overlay-Experiment).
Jeder schwarze Punkt repräsentiert
ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert
mit einem Phosphoimager). Die Aminosäuresequenzen der Peptide lassen
sich anhand der angegebenen Kürzel
(Einbuchstabenkodierung) ablesen. Vertikal: Sequenz der wildtypischen
PKA-Bindungsdomäne
von AKAP18δ;
horizontal: die 20 Aminosäuren,
die für
die Substitution der wildtypischen Sequenz eingesetzt wurden.
-
2
-
Identifizierung
von Peptiden, abgeleitet von AKAP18δ, die die Interaktion von AKAP-Proteinen
mit den regulatorischen RIIα-
und RIIβ-Untereinheiten
der PKA hemmen. A. Peptide, die von der PKA-Bindungsdomäne des AKAP18δ abgeleitet
wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden
mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIα- (obere Reihe)oder RIIβ-Untereinheiten
(untere Reihe) der PKA inkubiert (RII-overlay-Experiment). Jeder
schwarze Punkt repräsentiert
ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden
haben (detektiert mit einem Phosphoimager). Für die Quantifizierung wurden
die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das
für AKAP18δ-wt erhalten
wurde, bezogen. B: Die Aminosäuresequenzen
der Peptide (Einbuchstabenkodierung), die in A angegeben sind.
-
3A
-
Peptide,
abgeleitet von AKAP18δ,
die RIIα-
und RIIβ-Untereinheiten
der PKA unterschiedlich stark binden. A. Die Peptide 1-19, die von
der PKA-Bindungsdomäne
des AKAP18δ abgeleitet
wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden
mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIα- (obere Reihe) oder RIIβ-Untereinheiten (untere
Reihe) der PKA inkubiert (RII-overlay-Experiment).
Jeder schwarze Punkt repräsentiert
ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert
mit einem Phosphoimager). Für
die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet
und auf das Signal, das für AKAP18δ-wt erhalten
wurde, bezogen. Das Peptid 7 ist aufgrund des großen Unterschieds
in der Bindung an die beiden RII-Untereinheiten durch rote Schrift
hervorgehoben. B: Die Aminosäuresequenzen
der Peptide (Einbuchstabenkodierung), die in A mit 1-19 bezeichnet
sind.
-
4
-
Unterschiedliche
Peptide, abgeleitet von AKAP18δ,
binden RIIα-
und RIIβ-Untereinheiten
der PKA unterschiedlich stark. Zwei Bibliotheken von Peptiden, die
von dem Peptid 7 aus 3 abgeleitet
wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden
mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIα- (linke Seite) oder RIIβ-Untereinheiten der
PKA (rechte Seite) inkubiert (RII-overlay-Experiment). Jeder schwarze Punkt
repräsentiert
ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert
mit einem Phosphoimager). Die Aminosäuresequenzen der Peptide lassen
sich anhand der angegebenen Kürzel
(Einbuchstabenkodierung) ablesen. Vertikal: Sequenz des Peptids
7; horizontal: die 20 Aminosäuren,
die für
die Substitution der wildtypischen Sequenz eingesetzt wurden. Horizontale
und vertikale Reihen sind zusätzlich
durch arabische Zahlen beschriftet. Diese Koordinaten erleichtern
die Zuordnung, so bedeutet zum Beispiel 10/11: Reihe 10 Peptid 11.
Die unten aufgelisteten Peptide werden entsprechend ihrer Bindung
an RIIα mit
A18δRIIαHs1 und 2
bzw. entsprechend ihrer Bindung an RIIβ mit A18δRIIβRn1 bezeichnet.
-
Referenzen
-
- Alto, N. M., Soderling, S. H., Hoshi, N., Langeberg,
L. K., Fayos, R., Jennings, P. A., Scott, J. D. Bioinformatic design
of A-kinase anchoring protein-in silico: a potent and selective
peptide antagonist of type II protein kinase A anchoring. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 100, 4445-4450, 2003.
- Bregman, D. B., Bhattacharyya, N., Rubin, C. S. High affinity
binding protein for the regulatory subunit of cAMP-dependent protein
kinase II-B. J. Biol. Chem. 264, 4648-4656, 1989.
- Burns-Hamuro, L. L., Ma, Y., Kammerer, S., Reineke, U., Self,C.,
Cook, C., Olson, G. L., Cantor, C. R., Braun, A., Taylor, S. S.
Designing isoform-specific peptide disruptors of protein kinase
A localization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4072-4077, 2003.
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally
addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.
Tetrahedron 48, 9217-9232, 1992.
- Fraser, I. D., Tavalin, S. J., Lester, L. B., Langeberg, L.
K., Westphal, A. M., Dean, R. A., Marrion, N. V., Scott, J. D. A
novel lipid-anchored A-kinase Anchoring Protein facilitates cAMP-responsive
membrane events. EMBO J. 17, 2261-2272, 1998.
- Henn, V., Edemir, B., Stefan, E., Wiesner, B., Lorenz, D., Theilig,
F., Schmitt, R., Vossebein, L., Tamma, G., Beyermann, M., Krause,
E., Herberg. F. W., Valenti, G., Bachmann, S., Rosenthal, W., Klussmann,
E. Identification of a novel A-kinase anchoring protein 18 isoform
and evidence for its role in the vasopressin-induced aquaporin-2
shuttle in renal principal cells. J. Biol. Chem. JBC published March
22, 2004 as doi:10.1074/jbc.M312835200
- Hulme J. T., Lin, T. W., Westenbroek, R. E., Scheuer, T., Catterall,
W. A. Beta-adrenergic regulation requires direct anchoring of PKA
to cardiac CaV1.2 channels via a leucine zipper interaction with
A kinase-anchoring protein 15. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100,13093-13098, 2003.
- Klussmann, E., Maric, K., Wiesner, B., Beyermann, M., Rosenthal,
W. Protein kinase A anchoring proteins are required for vasopressin-mediated
translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal
cells. J. Biol. Chem. 274, 4934-4938, 1999.
- Klussmann, E. Protein kinase A. Online pharmacology reference
database. Elsevier Science Inc., Amsterdam, The Netherlands. Im
Druck.
- Kramer, A., Schneider-Mergener, J. Synthesis and screening of
peptide libraries on continuous cellulose membrane supports. Meth.
Mol. Biol. 87, 25-39, 1998.
- Tasken, K, Aandahl, E. M. Localized effects of cAMP mediated
by distinct routes of protein kinase A. Physiol. Rev. 84, 137-167,
2004.
-
Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.