DE19851282A1

DE19851282A1 - Zusammensetzung einer pharmazeutisch wirksamen Substanz, appliziert in einem spezifischen Delivery-System zur Prävention und Behandlung von Infektions-Krankheiten

Info

Publication number: DE19851282A1
Application number: DE19851282A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Glueck; U Glueck; Andrn Collioud
Original assignee: Schweiz Serum und Impfinstitut Bern; Schweiz Serum und Impfinstitut und Institut zur Erforschung der Infektionskrankheiten
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2000-05-11
Also published as: KR20010080955A; HUP0202931A2; EP1126875B1; ATE353224T1; AU1161200A; CA2348474C; WO2000027430A2; BR9915123A; PL348202A1; ES2279650T3; EP1126875A2; WO2000027430A3; CN1331604A; DE59914183D1; CZ20011567A3; JP2002529427A; HRP20010300A2; CA2348474A1; AU776669B2; ZA200103607B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Antigene, welche mit einem mukosalen Adjuvans vermischt sind und mit einem spezifischen Sprayapplikator so auf die Nasenschleimhaut gebracht werden können, dass eine bisher noch nie erzielte Wirksamkeit erreicht werden kann. Die Antigene sind Influenza-Oberflächenglykoproteine, welche liposomal formuliert sind (sog. Virosomen). Diese Virosomen werden mit einem mukosalen Adjuvans gemischt, welches bakteriellen Ursprungs ist. Idealerweise kommt es aus der Klasse der aktiven oder inaktiven Toxine, wie Heat Labile Toxin (HLT), Choleratoxin (CT) oder Procholeragenoid (PCG). Der nasale Sprayapplikator ist so konstruiert, dass die wirksame Substanz vollumfänglich auf die Nasenschleimhaut appliziert werden kann. Die der Erfindung zugrundeliegende Formel kann für verschiedene medizinische Indikationen verwendet werden, wie Impfung gegen Grippe oder andere Infektionskrankheiten sowie zur therapeutischen Behandlung von verstopfter Nase, Rekonstitution von lädierter Nasenschleimhaut oder allgemein mukosal lokalisierten Krankheiten.

Verschiedene Autoren haben die immunstimulierende Wirkung von Liposomen (künstlichen Membranen) beschrieben (Gregoriadis, G.: Immunological adjuvants: A role for liposomes. Immunol. Today 11 (1990) 89-97). Diese immunstimulierende Wirkung wird erzielt, wenn die Antigene auf die Oberfläche der Liposomen gekoppelt werden (Glück R, Mischler R, Finkel B, Que JU, Scarpa B, Cryz SJ Jr: Immunogenicity of new virosome influenza vaccine in the elderly people. Lancet 344 (1994) 160-163), im Innern der Liposomen eingeschlossen werden (Gregoriadis G, Davis D. Davis A: Liposomes as immunological adjuvants: Antigen incorporation studies. Vaccine 5 (1987) 145-151) oder nur mit Liposomen vermischt werden (De Haan A, Geerligs HJ, Huckshorn JP, Van Scharrenburg GJM, Palache AM, Wilschut J: Mucosal immunoadjuvant activity of liposomes: induction of systemic IgG and secretory IgA responses in mice by intranasal immunization with an influenza subunit vaccine and coadministered liposomes. Vaccine 13 (1995) 613-616). Eine zusätzliche immunstimulierende Wirkung wurde beobachtet, wenn solche Liposomen mit transmembranen und fusogenen Glykoproteinen "gespiked" wurden (z. B. Influenzaglykoproteine (Glück, R., Mischler, R., Brantschen, S., Just, M., Althaus, B., Cryz, S. J., Jr.: Immunopotentiating reconstituted influenza virosome (IRIV) vaccine delivery system for immunization against hepatitis A. J. Clin. Invest. 90 (1992) 2491-2495) oder Sendaiglykoproteine (Gould-Fogerite, S., Mazurkiewicz, J. E., Bhisitkul, D., Mannino, R. J.: The reconstitution of biologically active glycoproteins into large liposomes. Use as a delivery vehicle to animal cells. In: C. H. Kim, J. Diwan, H. Tedeschi und J. J. Salerno (Hrsg.), Advances in Membrane Biochemistry and Bioenergetics, Plenum Publishing Corp., New York (1987) S. 569).

Bisher wurde jedoch diese Wirkung meistens nach parenteraler Applikation (i. m., s. c. oder i. p.) beschrieben. Einige Autoren fanden jedoch, dass solche Formulierungen mit herkömmlichen Methoden (Tropfer oder herkömmliche Nasensprays) erfolgreich verabreicht werden können. Die Ergebnisse beziehen sich jedoch fast ausschliesslich auf Experimente mit Labortieren, meist die Maus, welche im Vergleich zum Körpergewicht eine viel grössere Nasenschleimhaut besitzt als vergleichsweise der Mensch. Zudem war die verabreichte Antigenmenge so hoch, dass alleine aus wirtschaftlichen sowie Produktsicherheits-Gründen eine Anwendung beim Menschen nicht in Frage käme. Auch wir konnten zeigen, dass bei einer vernünftigen Dosierung des Antigens (Influenza) trotz liposomaler Formulierung und richtiger nasaler Applikation keine befriedigende Wirkung erzielt werden konnte (Glück U, Gebbers J-O, Glück R: Intranasal application of virosome influenza vaccine. (1998) zur Veröffentlichung eingereicht).

Andere Autoren versuchten deshalb, eine wirksame nasal applizierbare Vakzine zu entwickeln, indem sie anstatt der liposomalen Formulierung die Antigene mit einem mukosalen Adjuvans bakteriellen Ursprungs vermischten. Dabei wurden insbesondere HLT, CT oder nicht toxische Derivate von HLT oder CT (Elson CO, Ealding W: Generalized systemic and mucosal immunity in mice after mucosal stimulation with cholera toxin. J. Immunol. 132 (1984) 2736-2741) verwendet.

Die Ergebnisse in der Literatur zeigten in der Tat vielversprechende Wirkungen nach nasaler Applikation, welche erneut vor allem in Labortieren erzielt worden waren. Jedoch einige wenige klinische Versuche im Menschen bestätigten eine gewisse Wirksamkeit (Tamura S-J, Ishihira K. Miyata K, Aizawa C, Kurata T: Mechanism of enhancement of the immune responses to influenza vaccine with cholera toxin B subunit and a trace amount of holotoxin. Vaccine 13 (1995) 339-341). Doch erneut war die zu verwendende Antigen- und Adjuvansmenge sehr hoch, was erneut Vorbehalte betreffend Produktsicherheit und Kommerzialisierungsmöglichkeit offenliess.

Weitere Nachteile der bisher beschriebenen Versuche zur Entwicklung einer nasal applizierbaren, präventiv oder therapeutisch wirksamen Vakzine sind die heute zur Verfügung stehenden ungenügenden Applikatorsysteme.

Zur Zeit gibt es Nasensprays als Mono-, Bi- und Multidosis-Applikatoren. Eingehende Untersuchungen und Prüfungen der bisherigen Nasensprays mittels Farbstoffapplikation (Methylenblau) und Nasenendoskopie haben ergeben, dass die zu versprühende Substanz (Vakzine, pharmazeutische Lösung) nur höchstens zu 25% an die Schleimhaut des Mukosa-assoziierten Immunsystems der Turbinalien gelangt.

Die Schleimhaut des Mukosa-assoziierten Immunsystems befindet sich in der Nasenhöhle an der lateralen Nasenwand in Bereich der Turbinalien (Nasenmuscheln) (s. Fig. 1/Humane Turbinalien und Turbinalien eines Rehs). Bei den bisherigen Nasensprays gelangt die pharmazeutisch aktive Substanz zum grössten Teil nur in den Nasenvorhof (Vestibultun nasi) (s. Fig. 2) sowie an die Nasenschleimhaut, die mit immunologisch inaktivem Plattenepithel und Talgdrüsen ausgekleidet ist (Walter Becher, Hans Heinz Naumann, Carl Rudolf Pfaltz: Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Thieme Verlag, Stuttgart, New York 1992).

Ursachen für das Unvermögen bisheriger Nasenapplikatoren, eine suffiziente Dosis auf die respiratorische Schleimhaut (Ort der spezifischen und unspezifischen Abwehr) zu versprühen, sind verschiedener Art:

1. Auf Grund ungenügender Anatomiekenntnisse wird die Längsachse des Sprayapplikators bei der Sprayapplikation in eine falsche Richtung gelenkt. Dabei geht die pharmazeutisch aktive Substanz praktisch ausschliesslich im Nasenvorhof verloren.
2. Der Sprühansatz beim Nasenteil ist in seinem Durchmesser nicht den anatomischen Verhältnissen angepasst. Das innere Nasenloch ist natürlicherweise spaltförmig und hat die Funktion einer Düse (s. Abb. 2). Die üblicherweise breiten Nasenstücke vermögen diese anatomische Enge nicht zu überwinden. Nur eine kleine Portion des Sprayinhalts vermag dieses spaltförmige innere Nasenloch zu passieren.
3. Der Sprühwinkel liegt bei den herkömmlichen Nasensprays zwischen 50-70°. Das innere Nasenloch würde bei der herkömmlichen Konstruktion eines Sprayapplikators nur einen Sprühwinkel von 25° tolerieren. Damit ist der erhebliche Verlust von bis 90% des applizierten Volumens ebenfalls erklärlich.
4. Herkömmliche Nasensprays haben ein zu kurzes Nasenstück. Die Distanz von der Fingermanschette bis zur Sprühöffnung ist zu kurz. Man gelangt mit den bisherigen Sprays nicht einmal bis zum inneren Nasenloch.

Die Lösung für die oben beschriebenen Nachteile ist in der nachfolgenden Erfindung beschrieben. Die wirksamste Zusammensetzung für die präventive und therapeutische Wirkung besteht aus der Formel des überraschend kostimulierenden Effektes von Liposomen, gemischt mit einem mukosalen Adjuvans und appliziert in einem neuen Nasenspray. Diese Formel wird in den Patentansprüchen charakterisiert.

Dementsprechend besteht das neue Medikament aus folgenden Komponenten:

a) einer aktiven Substanz (Antigen)
b) die ausgewogene Mischung von Liposomen und mukosalem Adjuvans
c) einem neuen medizinischen Gerät, einem spezifischen Nasenspray-Apparat.

Die aktive Substanz bezieht sich auf Antigene, insbesondere auf Influenzaglykoproteine, welche wegen ihrer transmembranen Domänen leicht in künstliche Membranen (Liposomen) eingebaut werden können. Es können jedoch leicht noch weitere Antigene allein oder in Kombination mit den Influenzaantigenen auf die Oberfläche der Liposomen gekoppelt werden. Die Koppelung geschieht je nach chemischer Beschaffenheit der Antigene spontan oder mittels eines chemischen Crosslinkermoleküls, wie dies schon früher beschrieben worden war (Martin FJ, Papahadiopoulos D: Irreversible coupling of immunoglobulin fragments to preformed vesicles. J. Biol. Chem. 257 (1982) 286-288). Es kann sich auch um ein DNS-Plasmid handeln, welches für ein Antigen kodiert und in die Liposomen eingeschlossen werden kann.

Der Begriff "ausgewogene Mischung aus Liposomen und mukosalem Adjuvans" bezieht sich einerseits auf das richtige Verhältnis von Antigen und Phospholipiden sowie mukosalem Adjuvans, das nötig ist für eine zufriedenstellende Wirksamkeit. Das ideale Verhältnis Phospholipid (z. B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, neutrale, anionische oder kationische Phospholipide) zu Influenza-Antigen liegt zwischen 1 : 1 bis 20 : 1. Am idealsten liegt es bei 3 : 1. Das Verhältnis Influenza-Antigen zum aktiven mukosalen Adjuvans (Toxin) HLT oder CT liegt zwischen 1 : 2 bis 20 : 1. Das vorteilhafteste Verhältnis liegt bei 7,5 : 1.

Das Verhältnis Influenza-Antigen zum inaktiven mukosalen Adjuvans (inaktives Toxin) PCG oder nicht toxischen Derivat von HLT und CT liegt zwischen 3 : 1 und 1 : 20, idealerweise bei 1 : 2.

In vitro-Experimente zur Messung der immunstimulierenden mukosalen Wirkung haben überraschenderweise gezeigt, dass eine Mischung der Adjuvantien Liposomen und mukosales Adjuvans nicht eine Addition der Wirkungen bewirkt, sondern dass die Addition um einen Faktor von mindestens 5 erhöht wird.

Der Begriff "neues medizinisches Gerät, ein neuer spezifischer Nasenspray- Applikator" bezieht sich auf einen Spray-Applikator, der sich besonders für die intranasale Immunisierung (Vakzination) eignet. Es genügt nicht, eine mukosal wirksame Substanz zusammenzustellen, wenn die Applikation schlecht oder ungenügend ist.

Das neue Gerät zeichnet sich dadurch aus, indem es die anatomischen Gegebenheiten der Nase vollständig berücksichtigt:

1. Die Distanz von Fingermanschetten bis Sprühkopf beträgt mindestens 4,0 cm. (2) Der vordere Teil des Nasenstücks besteht aus einem zylindrischen Aufsatz, der mindestens 10 mm lang und höchstens 5 mm im Durchmesser sein muss.
2. Der Sprühwinkel des in dieser Erfindung beschriebenen Applikators beträgt 15°-40° zur Horizontalen.
3. Die Achse der Hauptrichtung des Sprayapplikators wird durch eine spezielle Manschette determiniert: Die Manschette (s. Abbildung) wird auf das Vorderteil des Nasenstücks aufgesteckt und bei der nasalen Sprayapplikation auf die Oberlippe gestützt, so dass die Richtung der Sprühung genau zur lateralen Wand der Nasenhöhle zielt.

Das schmale Nasenstück muss demnach eine Mindestlänge von 1 cm haben, mit Vorteil 2 cm, sowie muss das nachfolgende dickere Nasenstück mindestens 2 cm, mit Vorteil 3 cm, aufweisen. Die Distanz zwischen dorsaler Fingeroberfläche und Sprayspitze muss 2,5 cm, mit Vorteil 3 cm. betragen resp. die Distanz von Fingerabsatz (Manschette) bis Sprayspitze muss mindestens 4 cm, mit Vorteil 5 cm betragen. Der Sprühwinkel des Sprays muss idealerweise 25° zur Horizontalen betragen.

Zudem muss der Hauptvektor des Sprühstosses zwischen mittlerer und unterer Nasenmuschel gerichtet sein. D. h. er soll auf den mittleren Nasengang gerichtet sein. Dies setzt in der Regel eine beinahe horizontale Richtung des Applikators voraus. Eine solche kann, wie in unserer Erfindung beschrieben, durch das Anbringen einer speziellen Applikator-Manschette fixiert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim Sprayapplikator um einen Apparat, dessen Nasenstück mit Sprühkopf höchstens 3 mm dick und mindestens 10 mm, besser 7 mm, breit ist, dessen Distanz zwischen Fingermanschette bis Sprühkopfspitze mindestens 3 cm beträgt und der mit einer montierbaren Manschette das Einführen in das Nasenloch so erlaubt, dass der Sprühwinkel ca. 25° zur Horizontalen zu liegen kommt (s. Abbildungen).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen ein Gemisch aus Influenza-Oberflächenantigenen (Hämagglutinin und Neuraminidase), das an der Oberfläche von Liposomen präsentiert wird. Dieses Mittel kann mit Antigenen von anderen pathogenen Mikroorganismen kombiniert werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das mukosale Adjuvans das Heat Labile Toxin (HLT) von Escherichia coli.

In einer weiteren Ausführungsform dient das vorstehend beschriebene Verfahren zur Prophylaxe von Infektionskrankheiten, zur Behandlung einer verstopften Nase und verschiedener Störungen der Nasenschleimhaut.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 Vergleich zwischen humanen Turbinalien und Turbinalien eines Rehs

Fig. 2 Anatomischer Bau des inneren Nasenlochs

Fig. 3 Korrekter Bau eines wirksamen Nasenspray-Applikators

Fig. 4 Korrekter Sprühwinkel bei wirksamer Nasenspray-Applikation

Fig. 5 Nasenzytologie: Quantifizierung der verschiedenen Zellpopulationen, die durch Nasenabstrichtechnik von den Individuen (20 jeder Gruppe) bis zu 29 Tage nach drei verschiedenen Arten der intranasalen Vakzination erhalten wurden. Man beachte den deutlichen Anstieg der Centroblasten als Anzeichen einer lokalen Immunantwort in Gruppe A im Gegensatz zum signifikant geringeren Anstieg in den Gruppen B und C (p < 0,005).

Fig. 6 eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sprayapplikators ohne Manschette

Fig. 7a und 7b zwei Ansichten der Manschette für den Sprayapplikator gemäß Fig. 6

BEISPIEL 1 Herstellung einer mukosalen virosomalen Influenzavirusvakzine mit HLT als zusätzlichem mukosalen Adjuvans

Die Herstellung einer Influenzavirosomenvakzine ist am anderen Ort beschrieben (Glück R, Wegmann A: Liposomal presentation of influenza antigens. In: Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ, Hrsg., Textbook of Influenza (1998) S. 400409. London: Blackwell). In Kürze: Die Stämme H1N1 A/Singapur/6/86, H3N2 A/Wuhan/359/95 und B/Beijing/184/93 des Influenzavirus, die in angebrüteten Hühnereiern kultiviert wurden, wurden vom National Institute of Biological Standards and Control, London, GB, geliefert. Intakte Virionen wurden aus der Chorioallantois-Flüssigkeit durch Zonenzentrifugation isoliert und mit β-Propiolacton inaktiviert. Gereinigte Virionen wurden in einen Puffer gegeben, der 0.1 M Octaethylenglycolmono(N-dodecyl)ether (OEG) (Nikko Chemicals, Japan) in PBS-NaCl enthielt. Diese wurden 20 Minuten bei 21°C inkubiert, um die vollständige Zersetzung der Viruskomponenten zu ermöglichen.

Zur Extraktion von Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) wurde das Gemisch 60 Minuten bei 100000xg zentrifugiert. Der Überstand, der HA, NA und virale Phospholipide (PL) enthielt, wurde zur Herstellung der verschiedenen intranasalen Vakzinformulierungen verwendet. Zusätzliche Phospholipide (Phosphatidylcholin [Lipoid, Deutschland)] wurden zugegeben und löslich gemacht. Die Virosomen wurden spontan während der Entfernung des OEG-Detergens durch Chromatographie gebildet. Zu einer mukosalen Vakzindosis (100 µl), die 3.75 µg HA von jedem von drei Influenzavirusstämmen, wie von der WHO empfohlen, und 35 µg Lecithin enthielt, wurden 0,5 µg Heat Labile Toxin (HLT) von E. coli aus dem Produktionsstamm E. coli HE22VK (Vogel FR, Powell MF: A compendium of vaccine adjuvants and excipients. In: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (4. F. Powell. M. J. Newmann, Hrsg.), Plenum Press. New York (1995) S. 141) als mukosales Adjuvans gegeben.

BEISPIEL 2 Herstellung einer mukosalen virosomalen Influenzavakzine mit PCG als zusätzlichem mukosalen Adjuvans

Die Herstellung einer Influenzavirosomvakzine ist im Beispiel (1) beschrieben. Zu einer mukosalen Vakzindosis (100 µl), die 3,75 µg HA von jedem von drei Influenzavakzinstämmen, wie von der WHO empfohlen, und 35 µg Lecithin enthielt, wurden 6 µg Procholeragenoid, hergestellt durch Erhitzen von gereinigtem CT, das aus V. cholerae (Inaba 569B) stammte, als mukosales Adjuvans gegeben (Pierce NF, Cray WC, Sacci JB, Craig SP, Germanier R, Fürer E: Procholeragenoid: A safe and effective antigen for oral immunization against experimental cholera. Inf. Immunity 40, 3 (1983) 1112-1118).

BEISPIEL 3 Herstellung einer mukosalen Hepatitis-B-(HBs-)Vakzine

Phosphatidylethanolamin (R. Berchtold, Biochemisches Labor, Bern, Schweiz) wurde in Methanol gelöst, und 0,1% (Vol./Vol.) Triethylamin wurde zugegeben. Die Lösung wurde dann mit γ-Maleimidobuttersäure-N-hydroxysuccinimidester (GMBS) (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) (Verhältnis Phosphatidylethanolamin : GMBS = 2 : 1) gemischt, das zuvor in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst worden war. Nach 1Sminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel 1 Stunde unter Vakuum in einer Speedvac-Zentrifuge verdampft. Rekombinante HBs-Partikel wurden gemäß bekannter Verfahren in CHO-Zellinien hergestellt und gereinigt.

Um ein reduziertes HBs-Partikel mit freien Cysteinresten zu erhalten, wurden die Partikel mit 40 mMol/l DL-Dithiothreitol (DTT) für 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Das DTT wurde unter Verwendung einer Sephadex-G10-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) entfernt, und Octaethylenglycol (Fluka Chemicals, Schweiz) (OEG) wurde in einer Endkonzentration von 100 mMol/l zugegeben. Das verdampfte Phosphatidylethanolamin-GMBS wurde dann mit der HBs-Lösung 1 Stunde gemischt (Verhältnis HBs : GMBS = 1 : 2), ungebundenes GMBS wurde dann durch Cystein abgefangen. Die Umsetzungen wurden mittels Dünnschichtchromatographie überwacht.

32 mg Phosphatidylcholin (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Deutschland) und 6 mg Phosphatidylethanolamin wurden zu den zuvor vernetzten Phosphatidylethanolamin-GMBS- HBs gegeben, und dieses Gemisch wurde in einem Gesamtvolumen von 2,66 ml PBS, die 100 mM OEG enthielt (PBS-OEG), gelöst.

Das Influenza A/Singapur-Hämagglutinin wurde gereinigt, wie vorstehend im Beispiel (1) beschrieben. Eine Lösung, die 4 mg Hämagglutinin enthielt, wurde 30 Minuten bei 100000 g zentrifugiert, und das Sediment wurde in 1,33 ml PBS-OEG gelöst.

Die Phospholipide und die Hämagglutininlösung wurden gemischt und 1 Minute mit Ultraschall behandelt. Das Gemisch wurde dann 1 Stunde bei 100000 g zentrifugiert und der Überstand sterilfiltriert (0,22 µm).

Virosomen mit adsorbiertem HBs wurden dann durch Entfernung des Detergens unter Verwendung von BioRad-SM-Bio-Beads gemäß Beispiel (1) entfernt.

BEISPIEL 4 BEISPIEL 5 In-vitro-Test zum Testen der Aktivität des mukosalen Adjuvans

Die biologischen Aktivitäten der mukosalen Adjuvantien wurden mit Influenzavirosomen, HLT, PCG, einem Gemisch von Virosomen und HLT gemäß Beispiel (1) und einem Gemisch von Virosomen und PCG gemäß Beispiel (2) gemessen. Die nachstehenden Lösungen wurden zu Y-1-Nebennierenzellen in Minikultur gemäß Sack DA und Sack RB (Sack DA und Sack RB: Test for enterotoxigenic Escherichia coli using Y-1 adrenal cells in miniculture. Infect. Immun. 11 (1974) 334-336) gegeben:
(a) HLT (5 µg/ml), (b) PLG (60 µg/ml), (c) Intluenzavirosomen und HLT: 37 µg/ml Influenzahämagglutinin von jeweils 3 Stämmen (H1N1. H3N2, B), 100 µg/ml Phosphatidylcholin und 5 µg/ml sowie (d) Influenzavirosomen und PCG: 37 µg/ml Influenzahämagglutinin von jeweils 3 Stämmen, 100 µg/ml Phosphatidylcholin und 60 mg/ml PCG.

Die nachstehenden Adjuvansaktivitäten (in Einheiten) wurden bestimmt:
(a) 15 Einheiten, (b) 6 Einheiten, (c) 80 Einheiten. (d) 36 Einheiten. Die höchste biologische Adjuvansaktivität wurde mit dem Gemisch aus Virosomen und HLT oder Virosomen und PCG durchgeführt.

BEISPIEL 6 Klinische Bewertung verschiedener Sprayapplikatoren

1% Methylenblaulösung wurde in 5 verschiedene Typen von nasalen Applikatoren eingefüllt:

a) Ein Sprayapplikator gemäss dieser Erfindung mit Richtmanschette, welche die Richtung des Spraystosses fixiert;
b) ein Sprayapplikator gemäss dieser Erfindung ohne Richtmanschette;
c) ein herkömmlicher kommerzieller Sprayapplikator ohne schmales Nasenstück von 2 cm Länge und 4 mm Durchmesser mit einem Sprühwinkel von 50°;
d) ein Sprayapplikator gemäss dieser Erfindung, jedoch mit einem Sprühwinkel von 50°;
und schliesslich
e) ein Sprayapplikator gemäss dieser Erfindung, jedoch mit Fingermanschetten, die lediglich 3 cm vom Sprühkopf entfernt waren.

Sämtliche Sprayapplikatoren waren sog. Bidosis-Applikatoren. Jeder Sprayapplikator wurde von je 5 Versuchspersonen unter ärztlicher Aufsicht ausprobiert. Die Versuchspersonen sprayten je eine Dosis Methylenblaulösung in das eigene rechte und linke Nasenloch. Mittels Nasenendoskopie wurden die Mukosa-Turbinalien ausgeleuchtet und photographisch festgehalten. Die Intensität der Blaufärbung sowie die blaugefärbte Fläche auf den Turbinalien wurden mittels einer Skala von 1-4 ausgewertet. Die Auswertung ergab folgendes Resultat (geometrisches Mittel):
Gruppe (a): 19 Punkte, Gruppe (b): 16 Punkte, Gruppe (c): 7 Punkte, Gruppe (d): 9 Punkte, Gruppe (e): 12 Punkte.

Nur in der Gruppe (a) wurde die Sprayflüssigkeit fast ausschliesslich auf die Nasenschleimhaut appliziert. Auch in der Gruppe (b) wurde ein grosser Teil des Sprayinhalates auf die Schleimhaut gesprayt. In den übrigen Gruppen wurde ein wichtiger Anteil des Sprayinhalates in den Nasenvorhof gesprayt. Dort kann die zu applizierende Sprayflüssigkeit keine Wirksamkeit ausüben.

BEISPIEL 7 Vergleich der klinischen Wirksamkeit von intranasalen virosomalen Influenzavakzinen mit und ohne HLT, angewendet in einem neuen Spraygerät, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, in menschlichen Freiwilligen verglichen mit einer parenteralen kommerziellen Influenzavakzine

Die offene randomisierte klinische Studie wurden in völliger Übereinstimmung mit den Prinzipien der Erklärung von Helsinki und mit den örtlichen Gesetzen und Richtlinien bezüglich klinischer Studien durchgeführt. Nach der Genehmigung des Protokolls durch das Ethikkomittee des Kantons Luzern und der Bekanntgabe an die Schweizer Bundesgesundheitsbehörde gaben 80 gesunde Freiwillige (18-64 Jahre alt) ihre schriftliche informierte Einwilligung zur Teilnahme. Freiwillige wurden ausgeschlossen, wenn sie Anzeichen für eine akute oder chronische Erkrankung zum Zeitpunkt der Immunisierung aufwiesen oder wenn eine gleichzeitige Behandlung mit immunsuppressiven Arzneimitteln oder eine bekannte Immunschwäche vorlagen.

Die intranasalen Vakzinformulierungen wurden an jede von drei Gruppen mit 20 Freiwilligen verabreicht (Tabelle 1). Die Gruppen A und B erhielten 2 Dosen der Formulierung A bzw. B in jedes Nasenloch am Tag 1 und 2 Dosen eine Woche später. Die Gruppe C erhielt zwei Dosen doppeltkonzentrierter Formulierung A am Tag 1. Die Gruppe D wurde intramuskulär im Deltoidbereich mit der parenteralen Formulierung geimpft. Blut- und Speichelproben (Omnisal®, GB) wurden unmittelbar vor der ersten Vakzination und einen Monat nach der ersten Immunisierung (Tag 29 ± 2) abgenommen. Aufgrund eines technischen Problems konnten nur die Speichelproben der ersten 47 Personen bewertet werden. Die Bürstenzytologie der Nasenhöhle wurde vor der Immunisierung und an den Tagen 4, 8 und 1 Monat nach der Erstimmunisierung durchgeführt.

Für die Analysen wurden die Blutproben und Speichelproben kodiert.

Die Serumimmunantwort auf die HA-Vakzinkomponente wurde durch einen Standardtest unter Verwendung von vier Hämagglutinineinheiten der entsprechenden Antigene bestimmt. Die Seren wurden vor dem Test 30 Minuten bei 56°C behandelt. Die Titer sind als reziproker Wert der höchsten Verdünnung des Serums ausgedrückt, die die Hämagglutination vollständig verhinderte. Ein Titer von ≧ 1 : 40 wurde als schützend angesehen.

Gesamt- und influenzaspezifische IgA-Antikörper wurden mittels bekannter ELISA- Verfahren bestimmt (Tamura SI, Ito Y, Asanuma H et al., Cross-protection against influenza virus infection afforded by trivalent inactivated vaccines inoculated intranasally with cholera toxin B subunit. J. Immunol. 149 (1992) 981-987). Die virusspezifischen IgA-Werte wurden als ELISA-Einheiten von spezifischen IgA pro µg Gesamt-IgA-Konzentration ausgedrückt.

Die Nasenepithelzellen wurden ausschließlich von den Maxillo-Turbinaten beider Nasenhöhlen in jeder Person mit dem gleichen Typ einer kleinen Nylonbürste gesammelt, die bei zytopathologischen Untersuchungen während der Bronchoskopie eingesetzt wird (Glück U, Gebbers J-O, Nasal cytopathology in smokers: a possible biomarker of air pollution? Am. J. Rhinol. 10 (1996) 55-57). Die Probennahme wurde durch den gleichen Untersucher (U. G.) unter rhinoskopischer Kontrolle mit einer rotierenden und translationalen Bewegung entlang der unteren Turbinatanheftung durchgeführt. Die Zellen wurden auf einen Glasobjektträger überführt und sofort in einer Lösung von 200 ml Ethanol + 100 ml Aceton + 6 Tropfen Trichloressigsäure fixiert.

Die Papanicolaou-gefärbten Objektträger wurden durch Pathologen untersucht, die am Institut für Pathologie in Cytopathologie, Kantonshospital Luzern, ausgebildet werden und nicht über den Vakzinationszustand informiert waren.

Die durchschnittlichen Zellzahlen von Flimmerzellen, Becherzellen, Lymphozyten, Centroblasten, Neutrophilen, Eosinophilen und Schuppenepithelzellen wurden in 25 repräsentativen Bereichen pro Objektträger bei 100x bestimmt.

Die Signifikanz zwischen den Grundlinien- und Postimmunisierungstitern wurde durch den Paired-T-Test bestimmt. Unterschiede in der Fähigkeit der 4 Vakzinationen, Anti- HA-Schutzantikörper in der Studiengruppe hervorzurufen, wurden durch χ² bestimmt.

Alle während der klinischen Studie beobachteten nachteiligen Ereignisse mußten aufgezeichnet werden. Ein nachteiliges Ereignis war definiert als eine nachteilige Änderung vom Grundlinien-(Vorvakzinations-)Zustand der Personen, ungeachtet dessen, ob das Ereignis als mit der Vakzination in Zusammenhang stehend betrachtet wird oder nicht. Nachteilige Ereignisse (lokale oder systemische Reaktion), die nach der Immunisierung auftraten, wurden durch den Kliniker auf einem speziellen Berichtsformular für nachteilige Ereignisse aufgezeichnet. Die Grundlinienrate der nachteiligen Ereignisse wurde vor der Immunisierung bestimmt.

80 Personen mit einem durchschnittlichen Alter von 40 Jahren und mit vergleichbarem sozialen Status wurden für die Studie rekrutiert. 27,5% der Teilnehmer waren weiblich. Alle 3 nasalen Vakzinationszubereitungen sowie die parenteralen Vakzine wurden gut vertragen. Anamnetisch gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den 3 Nasenvakzinstoff-Gruppen, und alle 3 Formulierungen wurden gut vertragen. In einzelnen Fällen wurden die nachstehenden möglichen begleitenden Reaktionen berichtet: Fieber, Müdigkeit, Übelkeit, Rhinitis, verstopfte Nase und Rhinopharyngitis. Auch die parenterale virosomale Vakzine wurde äußerst gut vertragen.

Die serologische Immunantwort ist in der Tabelle 2 gezeigt. Signifikante Anstiege im Titer wurden in der Gruppe A (2 nasale Vakzinationen in 7 Tagen Abstand), Gruppe C (1 nasale Vakzination, doppelt dosiert) sowie in Gruppe D (parenterale Vakzination gegen alle 3 Virusstämme) gemessen. Die höchsten geometrischen Mittel der Antikörpertiter (GMT) wurden in den Gruppen A und D gefunden. Die Gruppe D hatte signifikant die höchsten GMT-Werte gegen den H1N1-Stamm (p ≦ 0,05). Im Fall des H3N2-Stamms gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen A und D.

Diese Gruppen reagierten signifikant besser als die Gruppen B und C. Beim B- Stamm gab es keine signifikanten Unterschiede in den Gruppen A, C und D. Diese zeigten jedoch signifikant höhere Titer als Gruppe B. Die Serumkonversionsraten waren am höchsten in den Gruppen A und D. Gewöhnlich waren sie signifikant höher als die Raten in den Gruppen B und C und erfüllten für alle 3 Stämme die serologischen Anforderungen an parenterale Influenzavakzine gemäß der Europäischen Gemeinschaft (Kommission der Europäischen Gemeinschaft, Richtlinien für Medizinprodukte in der Europäischen Gemeinschaft. Harmonisierung der Anforderungen an Influenzavakzine. (1992) S. 93-98. Luxemburg: European Community Publication Office).

Die humorale mukosale Immunantwort (Speichel) ist in der Tabelle 3 gezeigt. Die höchsten Anstiege im IgA-Titer wurden in Gruppe A gemessen. Diese waren signifikant besser als in den anderen Gruppen. Unter Berücksichtigung des Gesamt-IgA waren die GMT in Gruppe A ebenfalls am höchsten. Die Mukokonversionsrate (vierfacher Anstieg im IgA- Titer) war wiederum deutlich am höchsten in Gruppe A. Im Falle der intramuskulären Vakzination gab es nur sehr schwache Mukokonversionsraten.

Die Bürstenzytologie der Nasenschleimhaut wurde in den Gruppen A, B und C durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 zusammengefaßt. Wir bestimmten die Zellzahl des Nasenschleimhautepithels (Flimmer- und Nicht-Flimmer-Säulenzellen, Becherzellen und Schuppenepithelzellen) und der Zellen der Myelo/Mono- und Lymphopoese (Lymphozyten, Eosinophile, Neutrophile und Centroblasten). In Gruppe A konnte eine deutliche Becherzellhyperplasie am 4. und 8. Tag nach der ersten Vakzination nachgewiesen werden. Außerdem beobachteten wir einen starken Anstieg an Lymphozyten und Centroblasten an den gleichen Tagen. Zusätzlich wurden ein Anstieg an Eosinophilen und Neutrophilen am 8. Tag nach der anfänglichen Vakzination beobachtet. Die Anzahl der Säulenzellen blieb unverändert.

In Gruppe B gab es nur einen leichten Anstieg an Lymphozyten, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten. Es gab kein Anzeichen für aktivierte Lymphozyten in dieser Gruppe.

In Gruppe C wurde eine sogar noch stärkere Becherzellhyperplasie festgestellt als in Gruppe A. Außerdem waren die eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in dieser Gruppe am stärksten an den Tagen 4 und 8 angestiegen. Der Anstieg an Lymphoblasten war in dieser Gruppe schwächer als in Gruppe A. p 0,05. Einen Monat nach der ersten Vakzination war der vorherige Zustand der Zellzusammensetzung in allen Gruppen wiederhergestellt.

Fig. 1:
Nasenzytologie: Quantifizierung der verschiedenen Zellpopulationen, die durch Nasenabstrichtechnik von den Individuen (20 jeder Gruppe) bis zu 29 Tage nach drei verschiedenen Arten der intranasalen Vakzination erhalten wurden. Man beachte den deutlichen Anstieg der Centroblasten als Anzeichen einer lokalen Immunantwort in Gruppe A im Gegensatz zum signifikant geringeren Anstieg in den Gruppen B und C (p < 0,005).

BEISPIEL 8 Vergleich der klinischen Wirksamkeit von intranasalen virosomalen Influenzavakzinen mit HLT oder PCG in menschlichen Freiwilligen, verabreicht in einem neuen Spraygerät, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist

Die Immunantwort und Tolerierbarkeit von zwei Anti-Influenzasprayvakzinen wurden in einer Doppelblindstudie untersucht, die mit insgesamt 158 gesunden Schweizer Freiwilligen im Alter von 18 bis 67 Jahren durchgeführt wurde.

Eine trivalente virosomale Influenzavakzine (gereinigtes HA, formuliert mit Phosphatidylcholin) wurde mit Heat Labile Toxin (HLT) von E. coli in einem Format kombiniert, das sich zur intranasalen Verabreichung eignet. Eine menschliche Dosis enthielt 7,5 µg HA von jedem Influenzastamm und 2 µg HLT. Eine Dosis wurde in jedes Nasenloch an den Tagen 1 und 8 an Gruppen von Individuen im Alter von 18-59 oder ≧ 60 Jahren verabreicht. Serumproben wurden etwa 4 Wochen nach der Immunisierung entnommen. Reaktionen waren selten und schwach. Die Prozentsätze der Personen (Erwachsene bzw. Ältere), die schützende Serum-Anti-HA-Antikörpertiter erreichten (≧ 40) waren wie nachstehend: A/Bayern (92%, 91%), A/Wuhan (92%, 78%) und B/Beijing (59%, 50%). Die GMT nach der Immunisierung und die Vielfachen des Anstiegs der GMT waren zwischen den zwei Altersgruppen vergleichbar. Der Prozentsatz der Personen (Erwachsene bzw. Ältere), die nicht-schützende Grundlinientiter besaßen, aber nach der Immunisierung schützende Spiegel erreichten, war wie nachstehend: A/Bayern (79%, 85%), A/Wuhan (86%, 56%) und B/Beijing (48%, 41%).

Eine zweite mukosale Vakzinzubereitung enthielt 7,5 µg HA und 12 µg Procholeragenoid (PCG). Diese Zubereitung wurde ebenfalls gut vertragen und erwies sich als etwas weniger immunogen als die HLT-Zubereitung. Der Prozentsatz der Personen, die schützende Serum-Anti-HA-Antikörpertiter erreichten, war wie nachstehend: A/Bayern 94,2%, A/Wuhan 80,8% und B/Beijing 36,5%. Die Serokonversionsraten aller Gruppen sind in Tabelle 4 gezeigt.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die auf intranasalem Weg verabreichte virosomale Influenzavakzine sicher und sehr immunogen bei erwachsenen Personen, einschließlich Älteren, ist.

BEISPIEL 9 Mukosale Immunantwort in Mäusen nach intranasaler Anwendung einer virosomalen Influenzavakzine mit HLT, mit PCG oder ohne zusätzliches mukosales Adjuvans

Gruppen von 10 erwachsenen weiblichen Balb/c-Mäusen wurden intranasal mit 30 µl entweder der im Beispiel (1) beschriebenen Influenzavakzine oder der im Beispiel (2) beschriebenen Influenzavakzine geimpft. Eine Kontrollgruppe von 10 Mäusen erhielt eine virosomale Vakzinzubereitung ohne zusätzliches Adjuvans, aber mit der gleichen Virosomenzusammensetzung. Eine Hälfte jeder Gruppe erhielt eine zweite intranasale Dosis eine Woche später. Nasenwäschen (NW) und Bronchoalveolarspülungen (BAL) wurden 3 Wochen später durchgeführt. Tabelle 5 zu Bsp. 9. Die Bestimmung des spezifischen IgA wurde durch ein bekanntes ELISA-Verfahren durchgeführt. Die Ergebnisse (GMT) sind in der Tabelle 6 zusammengefaßt.

Die höchsten GMT für alle drei Vakzinstämme (A/Johannesburg, A/Nanching, B/Harbin) konnten in der Gruppe nachgewiesen werden, die zweimal mit der Vakzine gemäß Beispiel (1) geimpft worden war. Diese Gruppe reagierte sogar mit den höchsten IgA- Spiegeln in BAL, nachdem sie nur einmal geimpft worden war.

Eine zufriedenstellende IgA-Antwort wurde auch in der Gruppe von Mäusen erhalten, die zweimal intranasal mit der Zubereitung von Beispiel (2) geimpft worden war. Die Kontrollgruppe, auf die die Virosomenzubereitung ohne zusätzliches mukosales Adjuvans angewendet worden war, zeigte nur eine sehr schwache mukosale Immunantwort.

Die Ergebnisse zeigen, daß in Mäusen eine intranasal verabreichte virosomale Influenzavakzine, die ein mukosales Adjuvans enthält, eine hohe mukosale Antikörperantwort induzieren konnte.

Tabelle 5 zu Bsp. 9

VORKLINISCHE STUDIE DER VIROSOMALEN INFLUENZAVAKZINE IN MÄUSEN: INTRANASALE ANWENDUNG

Tabelle 6 zu Bsp. 9

IgA-Influenza-Antikörper in Mäusen

GMT der reziproken Titer (ELISA)

BEISPIEL 10 Klinische Bewertung einer mukosalen Hepatitis-B-(HBs-)Vakzine

Die Vakzine wurde gemäss Beispiel (3) hergestellt und in einem Nasenspray- Applikator gemäss Beispiel (4) abgefüllt. Das Produkt wurde in 10 Freiwilligen getestet: Je 100 µl in jedes Nasenloch wurden an Tag 1 appliziert und eine Woche später wiederholt. Blutproben wurden am Tag 1 (vor der Impfung) sowie am Tag 29 entnommen. Die Anti- HBs-Antikörper wurden mittels RIA (Abbott) bestimmt. Das geometrische Mittel des Titers vor der Impfung war 7 IU/ml und am Tag 29 159 IU/ml.

BEISPIEL 11 Mukosale Immunantwort von Mäusen nach intranasaler Anwendung eines DNA-Plasmids, das für das IN-Antigen von Mumpsvirus kodiert, eingebracht in Influenzavirosomen, die 10% kationische Phospholipide enthalten, und gemischt mit HLT (5 µg/ml)

Wir immunisierten Gruppen von Mäusen intranasal mit a) nackter DNA, die für das HN-Antigen des Mumpsvirus kodierte (Gruppe C) oder b) in Virosomen eingeschlossener DNA nach Vorimmunisierung mit Virosomen (Gruppe A) oder c) ohne Vorimmunisierung (Gruppe B). Eine Kontrollgruppe (H) wurde i. n. mit lebendem Urabe-Mumpsvirus immunisiert. Wie in Tabelle 7 gezeigt ist, war das geometrische Mittel des Titers (GMT) der IgG in der Gruppe von Mäusen, die die Präimmunisierung erhalten hatten (A), höher als der in den Gruppen B und C der Mäuse beschriebene (Lovell GH: Proteosomes, hydrophobic anchors, iscoms and liposomes for improved presentation of peptide and protein vaccines. In: New Generation Vaccines (1990) (G. C. Woodrow und M. M. Levine, Hrsg.) Dekker, New York, S. 141-168; Cusi MG und Glück R: Intranasal immunization of mice with mumps DNA entrapped into influenza virosomes. IBC's 4th Annual Conference on Genetic Vaccines, 25.-27. Okt. 1998, Washington D. C.). Die Gruppe von Mäusen, die i. n. mit nackter DNA immunisiert worden war, entwickelte einen sehr niedrigen IgG-Spiegel, wogegen die i. n. mit dem Mumpsvirus immunisierten Mäuse (Gruppe H) eine gute IgG- Antwort zeigten. Bei der Analyse der mukosalen Immunität fanden wir, daß alle Gruppen von Mäusen, außer den mit nackter DNA immunisierten, IgA entwickelten. Nur in den Nasenwäschen (NW) der i. n. mit dem Mumpsvirus immunisierten Mäuse konnten wir einen erhöhten Titer an IgA nachweisen (Gruppe H).

Cytokinmessungen wurden unter Verwendung von Milzzellen durchgeführt, die zwölf Tage nach der Immunisierung entnommen wurden. Die Tabelle 8 faßt repräsentative Messungen zusammen, die aus zwei getrennten Experimenten erhalten wurden. Mit Mumpsvirusantigen stimulierte Zellen aus Mäusen, die zuvor (i. n.) mit DNA-Virosomen geimpft worden waren, induzierten die Produktion von IL-2 und IFN-γ. Außerdem induzierten mit Grippe infizierte Mäuse die Produktion von IL-4. Aus den mit Mumpsvirus immunisierten Tieren entnommene Zellen produzierten IFN-γ, IL-2. IL-4 und IL-10 nach in- vitro-Stimulation mit Mumpsantigen. Die Immunisierung mit DNA-Virosomen wie die Kontrollimmunisierung mit den gereinigten Mumpsantigenen korrelierten mit dem Th1- Phänotyp. Außerdem dominierte, berücksichtigt man das Verhältnis zwischen dem IgG- Gesamtspiegel und dem virusspezifischen IgG1 oder IgG2a, die Menge an IgG2a-Isotyp in der Gruppe A, was eine Th2-Antwort anzeigt.

Tabelle 7

Das geometrische Mittel der Titer (GMT) von humoralen IgG, IgA in der Bronchoalveolarspülung (BAL) und IgA in der Nasenwäsche bei Mäusen

Tabelle 8

Repräsentationsmessungen der Cytokinproduktion in Mäusen, erhalten aus zwei getrennten Experimenten

BEISPIEL 12 Behandlung von verstopfter Nase bei Freiwilligen mittels Influenzavirosomen mit und ohne HLT in einem neuen Sprayapplikator

In einer Klinik wurden 30 Freiwillige mit Erkältungssymptomen und akut verstopfter Nase ausgewählt. Bei sämtlichen Freiwilligen wurde die Atmungsintensität durch jedes einzelne Nasenloch rhinomanometrisch (in Pascal) gemessen. Anschliessend wurden sie randomisiert und in 3 Gruppen zu 10 eingeteilt. Gruppe A erhielt eine Dosis Impfstoff (100 µl in jedes Nasenloch) gemäss Beispiel (1), Gruppe B erhielt die gleiche Dosis, jedoch ohne das mukosale Adjuvans HLT, Gruppe C erhielt je 100 µl 0,9% NaCl (physiologische Kochsalzlösung) in jedes Nasenloch. Die Luftströme wurden 15 min, 30 min, 1 Stunde sowie 2 Stunden später gemessen.

Die Messdaten sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Sowohl in Gruppe A und B waren die Werte signifikant besser als in Gruppe C. In beiden Gruppen konnte eine deutliche Besserung der Atemfunktionen festgestellt werden.

Tabelle 9

Rhinomanometrische geometrische Mittelwerte bei Freiwilligen vor und nach Spray-Behandlung

BEISPIEL 13 Behandlung von Mukosaläsionen in Freiwilligen mittels Influenzavirosomen und HLT

Freiwillige wurden intranasal geimpft, wie im Bsp. (7) beschrieben. Wie hier beschrieben, wurden die durchschnittlichen Becherzellen 3, 7 und 28 Tage nach der intranasalen Vakzination bestimmt. Wir konnten Epithelveränderungen mit Becherzellhyperplasie in cytologischen Abstrichen bestimmen (Glück U, Gebber J-O: Nasal cytopathology in smokers: a possible biomarker of air pollution? Am. J. Rhinol. 10 (1996) 55-57). Becherzellen haben eine Schutzfunktion für die muköse Schicht. Einen Monat nach der ersten nasalen Vakzination war der zelluläre Zustand der Mukosa signifikant besser verglichen mit dem vorherigen Zustand.

Diese neue Vakzine kann daher als Therapeutikum zur Behandlung einer Nasenschleimhaut im geschädigten Zustand verwendet werden.

BEISPIEL 14 Prävention von enterotoxischer E. coli-Diarrhoe mittels nasaler Applikation von HLT mit und ohne Influenzavirosomen

Eine Gruppe von Reisenden, die Tunesien besuchten, bestand aus 38 Personen. Nach der informierten Einwilligung stimmten alle der Teilnahme an der Studie zu. Nach Randomisierung wurden 19 Freiwillige zweimal im Abstand von 1 Woche mit der Zubereitung gemäß Bsp. (1) geimpft, wogegen 19 Personen keinen Impfstoff erhielten. 28 Tage nach der ersten intranasalen Impfung wurden Blutproben von allen Freiwilligen abgenommen. Die 19 geimpften Personen zeigten hohe IgG-Spiegel im Serum gegen das mukosale Adjuvans (HLT). Die Kontrollgruppe blieb Anti-HLT-negativ. Bevor sie Tunesien verließen, einen Monat später, wurde ein spezielles Gesundheitsereignisformular an alle Teilnehmer verteilt. Die Gruppe kehrte 20 Tage später aus Tunesien zurück, und das ausgefüllte Gesundheitsereignisformular wurde auf Diarrhoeerkrankungen ausgewertet. In der Gruppe der Geimpften berichteten nur zwei Personen über Diarrhoeprobleme, wogegen in der nichtgeimpften Gruppe 9 Personen während des Aufenthalts in Tunesien an Diarrhoe litten. Diese Daten zeigen, daß die Vakzine auch zur Verhinderung von Diarrhoe der enterotoxischen E.-coli-Erkrankung wirksam ist.

Beispiel 7

Tabelle 1

Klinisches Protokoll

Claims

1. Eine Influenzavakzine zur intranasalen Applikation, bestehend aus:

a) Influenzaoberflächenproteinen (Hämagglutinin HA und Neuraminidase NA), welche liposomal formuliert sind (Virosomen);
b) mukosalem Adjuvans bakteriellen Ursprungs;
c) spezifischem Sprayapplikator, der so konstruiert ist, dass nahezu 100% des Spraystosses vollumfänglich auf die für die Wirksamkeit wichtige Nasenschleimhaut appliziert werden kann.

2. Eine Influenzavakzine gemäss Anspruch 1, welche zur Prävention von Influenzaerkrankung sowie zur Behandlung von verstopfter Nase sowie allgemeiner Infektionen und Verletzungen von Nasenschleimhäuten angewandt werden kann.

3. Eine Influenzavakzine gemäss Anspruch 1, wo der Hämagglutinin-Gehalt pro Dosis (100 µl) zwischen 1-30 µg, mit Vorteil zwischen 3-10 µg und am besten bei 3,75 µg liegt.

4. Eine Influenzavakzine gemäss Anspruch 1, wo das Verhältnis Liposomen- Phospholipid zu HA zwischen 1 : 10 und 20 : 1, mit Vorteil zwischen 1 : 1 bis 10 : 1 und am besten bei 3 : 1 liegt. In Frage kommen neutrale, kationische und anionische Phospholipide.

5. Eine Influenzavakzine gemäss Anspruch 1, welche Heat Labile Toxin (HLT) oder Choleratoxin (CT) als mukosales Adjuvans enthält, welches im Verhältnis HA : HLT (oder CT) zwischen 1 : 2 bis 20 : 1 liegt, besser zwischen 1 : 1 und 1 : 10 und am besten bei 7,5 : 1.

6. Eine Influenzavakzine gemäss Anspruch 1, welche das hitzeinaktivierte Procholeragenoid (PCG) oder durch Rekombinantentechnologie inaktive HLT oder CT als mukosales Adjuvans enthält, welches im Verhältnis HA : PCG (oder rHLT resp. rCT) zwischen 3 : 1 bis 1 : 20 liegt, besser zwischen 1 : 1 und 1 : 10 und am besten bei 1 : 2.

7. Eine Influenzavakzine gemäss Anspruch 1, welche in einem Sprayapplikator verabreicht wird, der ein Nasenstück besitzt, dessen vorderer Teil aus einem zylindrischen Aufsatz besteht, der im Durchmesser höchstens 10 mm und mindestens 3 mm breit sein muss, am idealsten 7 mm, und eine Länge von zwischen 0,5-5 cm, am besten 2 cm aufweisen muss. Das nachfolgende dickere Nasenstück muss eine Länge von 1-4 cm, mit Vorteil 3 cm aufweisen. Die Distanz von Fingermanschette bis Sprayspitze muss mindestens 3 cm, am idealsten 4,5 cm betragen. Der Sprühwinkel sollte zwischen 15°-40°, am besten 25° zur Horizontalen betragen. Um die Achse der Hauptrichtung des. Sprayapplikators bei der nasalen Applikation richtig zu halten, wird eine spezielle Manschette auf das Vorderteil des Nasenstücks aufgesteckt und bei der Sprayapplikation auf die Oberlippe gestützt.

8. Eine Vakzine gemäss Anspruch 1-7, welche prophylaktisch gegen enterotoxische E. coli-Diarrhoe (ETEC) angewandt werden kann.

9. Eine Vakzine gemäss Anspruch 1-7, welche weitere Antigene (wie Hepatitis A und B, respiratorisches Syncytial-Virus, Parainfluenza und HIV, Diphtherie, Tetanus, Pneumokokken und Haemophilus influenzae sowie Malaria) an der Oberfläche der Virosomen gebunden enthält.

10. Eine Vakzine oder pharmazeutisch wirksames Produkt gemäss Ansprüchen 1-7, welche DNS- oder RNS-Plasmide gebunden an oder in Virosomen enthält.