KR20030031200A

KR20030031200A - 비강내 전달용 분할된 외피 바이러스 제조물

Info

Publication number: KR20030031200A
Application number: KR10-2003-7004719A
Authority: KR
Inventors: 브리기테 데시레 알베르테 콜라우; 마르구에리테 데샴프스
Original assignee: 스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2003-04-18
Also published as: US20040022808A1; CN1477971A; BR0114393A; HUP0302643A2; CA2427842A1; PL362705A1; CZ2003931A3; JP2004510744A; EP1324769A2; NO20031483L; WO2002028422A2; IL155072A0; ZA200302522B; WO2002028422A3; NO20031483D0; GB0024089D0; AU2002213984A1

Abstract

특히, 본 발명은 비강내 전달용 백신 제형의 제조에서, 분할된 외피 바이러스 제조물을 포함하는 백신 제형, 이러한 제형의 제조 방법, 및 질환의 예방 또는 치료에 있어서 이러한 백신의 용도에 관한 것이다.

Description

비강내 전달용 분할된 외피 바이러스 제조물 {SPLIT ENVELOPED VIRUS PREPARATION FOR INTRANASAL DELIVERY}

본 발명은 신규한 백신 제형, 이의 제조 방법, 및 이의 질병 예방 또는 치료용 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 분할 외피 바이러스 제조물을 포함하는 백신에 관한 것이다.

외피 바이러스는 그 내부의 바이러스 코아가 바이러스 단백질을 함유하는 지질-다함유 외부 껍질에 의해 둘러싸여 있는 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 백신 제형의 분할 외피 바이러스는 호흡기 합포체 바이러스(RSV)로부터 유래된다. 외피 바이러스에 의한 감염의 위험성은 RSV를 참조로 예시되어 있다.

사람 호흡기 합포체 바이러스(RSV)는 바이러스의 파라믹소비리데(paramyxoviridiae)과의 하나이고 특히 유아 또는 영아에서 하기도 질환을 유발시킨다. 최근 보고에 따르면, RSV는 성인, 특히 노인에게도 중요한 병원체이다.

RSV는 15,222개의 누클레오티드의 비분절된 음성 가닥 리보핵산(RNA) 게놈을 가진 외피 바이러스이며, 15,222개의 뉴클레오티드는 각각 단일 폴리펩티드를 코딩하는 11개의 메신저 RNA를 코딩한다. 11개 단백질 중 3개는 막횡단 표면 단백질인, G(부착), F(융합), 및 SH 단백질이다. 1개의 단백질은 비리온 매트릭스 단백질(M)이고, 세개의 단백질은 뉴클레오캡시드(N, P, 및 N)의 구성요소이며, 2개의 단백질은 비구조적 단백질(NS1 및 NS2)이다. 추가적으로 2개의 단백질 M2-1 및 M2-2이 있다. RSV의 2개의 항원적으로 구별되는 하부군이 존재하는데 이를 하부군 A 및 B라고 한다. 이들 하부군의 스트레인의 특성화로 인해 주요한 차이가 G 단백질에 존재하는 반면에, F 단백질은 보존됨이 결정되었다.

호흡기 합포체 바이러스(RSV)는 계절적으로 발병되는데, 온화한 기후에서 겨울에, 더운 기후에서는 우기에 최고조에 이른다. RSV는 어린이의 심각한 하기도 질병의 주요 원인이다. 기관지염으로 병원치료를 받고 있는 어린이의 40 내지 50%, 폐렴으로 병원치료를 받고 있는 어린이의 25%가 RSV 감염의 직접적인 결과로서 병원치료를 받고 있는 것으로 추정된다. 1차 RSV 감염은 일반적으로 1살 미만의 어린이에게 일어나고, 2살까지의 어린이 중 95%가 과거 감염의 혈청학적 증거를 가지고, 성인의 경우에는 집단의 100%가 그러하다.

영아 및 소아에서 감염은 약 40%의 병례에서 상기도로부터 하기도로 진행되고, 임상학적으로는 기관지염 또는 폐렴으로 나타난다. 2 내지 6개월의 소아는 심각한 징후(주로 호흡기 장애)의 RSV 감염이 발병될 위험이 크다; 그러나, 잠재적인 심장병 또는 폐병을 가진 모든 연령의 소아, 비성숙 영아 및 면역저하된 영아도 또한 심각한 합병증의 위험에 있다.

재감염 징후는 일생을 통하여 일어나고, RSV가 성인 특히, 노인에게도 중요한 병원체라는 것은 점점 명백해지고 있다.

RSV 감염은 성인에게서는 거의 확실하게 진단되지 않는데, 이는 부분적으로RSV가 어린이의 감염병이라고 생각되기 때문이다. 결과적으로, 성인의 경우에는 호흡기 질환을 설명하기 위하여 바이러스를 조사하려 하지 않는다. 또한, RSV는 대부분의 성인이 그러하듯이, 바이러스에 대해 어느 정도의 부분적인 면역을 보이는 개체의 비강내 분비물에서 확인되기 어렵다. 청년에서 중년의 성인은 통상적으로 RSV에 감염된 경우에 지속적인 감기 유사 증상을 보인다. 노인은 폐렴을 포함하는, 하기도가 연루될 수 있는 상기도 징후와 함께 인플루엔자로부터 사실상 구별될 수 없는 연장된 호흡기 징후를 나타낼 수 있다. 공공시설에 수용된 노인 집단이 특히 관심의 대상인데, 이는 이들이 함께 집단을 이루는 많은 감수성 개체를 포함하기 때문이다. 많은 이들이 질병이 보다 심한 상태가 되게 하기 쉬운 복합적인 의료 문제를 가지고 있는 이러한 집단을 통한 감염의 유행은 제어되기 힘들다.

또한, 성인이나 집단 거주하는 건강한 노인의 병원치료의 원인으로서 RSV 감염의 영향을 평가하는 최근 연구의 보고는, 이들 집단의 심각한 하기도 질병에서의 RSV 감염의 중요한 역활을 지적하고 있다. RSV는 성인의 병원치료의 원인이 되는 심각한 하기도 질병을 유발하는 4개의 가장 일반적인 병원체 중 하나로서 확인되었다. 또한 노인의 심각한 RSV 감염이 사립요양원 또는 발병 장소에만 한정되지 않는다는 것이 증명되었다. 오히려, RSV 감염은 집단 내에 거주하는 노인 환자 중에 심각한 병의 예상가능한 원인이다. 인플루엔자 A를 위한 병원치료와 유사하게, RSV 감염과 관련된 이들은 장기간 병원 체류, 매우 집중적인 치료 허가율 및 높은 환기 지원율에서 증명되는 바와 같이 실질적인 사망과 관련된다.

상기 연구는 영아, 성인 및 노인 예를 들어 집단 거주하는 건강한 노인 및사립요양원 노인의 RSV 감염의 심각한 합병증을 예방하는 효과적인 백신의 의학적, 경제적 필요성을 지적하고 있다.

유사한 위험이 기타 외피 바이러스에 의해 초래되며, 따라서 이러한 바이러스에 의해 초래되는 감염 및 질환에 대한 효과적인 보호제가 요구된다.

본 발명은 비강내 전달을 위해 제형화된 백신 제조에서 분할된 인플루엔자 바이러스 제조물이 아닌, 분할된 외피 바이러스 제조물의 용도를 제공한다.

바람직하게는, 제조물을 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

본 발명의 백신 제형은 분할될 수 있는 외피 바이러스로부터 유래될 것이다. 외피 바이러스는 인간 또는 동물 기원의 바이러스를 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 바이러스가 사람이외의 기원 예컨대, 소과 동물 기원인 경우, 바이러스는 바람직하게는 재조합 바이러스이다.

바람직하게는, 본 발명의 백신 제형은 전달 후 외피 바이러스에 대한 보호성 면역 반응을 자극할 수 있다.

본 발명의 용어에 있어서, 바이러스는 하기와 같은 모든 외피 바이러스(인플루엔자 바이러스는 제외)를 포함하나 하기로 제한되는 것은 아니다:

1) 파라믹소바이러스 예컨대, 호흡기 합포체 바이러스(A 및 B), 파라인플루엔자 바이러스(예컨대, PIV-3), 메타뉴모바이러스, 홍역 바이러스, 뭄프바이러스;

2) 포진 바이러스 예컨대, 엡스타인 바르 바이러스, 단순포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스;

3) 플라비바이러스 예컨대, 덴구 바이러스, 황열 바이러스, 진드기 매개 수막염 바이러스, 일본 수막염 바이러스;

4) 토가바이러스 예컨대, 풍진 바이러스, 동부, 서부 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스; 및

5) 레트로바이러스 예컨대, 사람 면역결핍 바이러스.

본 발명의 백신 제형은 선택적으로 1종 이상의 분할된 바이러스 제조물을 포함한다.

본 발명의 백신 제형은 선택적으로 분할된 제조물과 배합되어 병원체로부터의 항원 또는 항원들을 포함한다. 분할된 제조물로부터 유도될 필요가 없는 적합한 항원은 예를 들어스트렙토코커스 뉴모니애와 같은 호흡기 질병을 유발하는 상기 나열된 임의의 바이러스 및 병원체로부터의 항원을 포함한다.

바이러스의 분할은 반드시는 아니나 일반적으로 계면활성제인 분할제의 붕괴 농도로 감염성(야생형 또는 약독형) 또는 비감염성(예를 들어 불활성화된 형태) 바이러스 전체를 붕괴시키거나 단편화시킴으로써 수행된다. 분할될 바이러스는 또한 하나 이상의 상이한 바이러스의 면역원성 요소를 가지는 키메라 재조합 바이러스일 수 있다. 붕괴는 모든 바이러스 단백질의 완전한 또는 부분적인 용해를 초래하며, 이는 바이러스 보전성을 변형시킨다.

적합하게는 분할된 바이러스는 PIV 또는 RSV를 본 발명에 따른 분할제와 접촉시켜 바이러스 외피를 완전히 붕괴시킴으로써 수득될 수 있다. 다른 바이러스 단백질은 바람직하게는 완전히 또는 부분적으로 용해된다. 분할 후에, 바이러스의 보전성의 상실은 바이러스가 비감염성이 되게 하고, 이는 적합한 생체외 역가 검정에 의해 평가될 수 있다. 일단 붕괴되면, 일반적으로 바이러스 외피 단백질은 더 이상 완전한 비리온과 결합되지 않는다. 다른 바이러스 단백질은 바람직하게는 완전히 또는 부분적으로 용해되어 분할 후에 완전한 비리온과 결합되지 않거나 부분적으로만 결합된다.

바이러스 외피 및 바이러스 단백질에 대한 분할제의 효과는, 본원에 기술된 바와 같이 수크로오스 쿠션 실험에서의 분할 단백질 및 바이러스 단백질의 이동과 웨스턴 블롯 분석 및 전자 현미경에 의해 이해될 수 있다.

본 발명에 따른 분할 백신의 제조는 분할제 및 바이러스 지질 물질의 일부 또는 대부분의 제거 단계를 추가로 포함할 수 있다. 분할된 외피 바이러스의 제조 공정은 수차례의 상이한 여과 및/또는 다른 분리 단계 예를 들어 초원심분리, 한외여과, 띠 원심분리 및 다양한 조합의 크로마토그래피 단계 및 선택적으로 분할 전 또는 후에 수행될 수 있는 포름알데히드, β-프로피오락톤 또는 UV 처리에 의한 불활성화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 분할 공정은 회분식, 연속식, 또는 반연속식 공정으로 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 분할 백신은 일반적으로 중요한 완전한 비리온의 부재 하에 막 단편 및 막 외피 단백질 뿐만 아니라 비막 단백질 예를 들어 바이러스 매트릭스 단백질 및 핵단백질을 함유한다. 본 발명에 따른 분할 백신은 통상적으로, 반드시 완전한 바이러스에서와 같이 동일한 비율로는 아닐 지라도 바이러스 구조 단백질의 대부분 또는 모두를 함유할 것이다. 바람직한 분할 바이러스 제조물은 또한 바이러스 구조 단백질의 절반 이상, 바람직하게는 이러한 단백질 모두를 함유한다. 다른 한 편으로 서브유닛 백신은 하나 또는 적은 수의 고도로 정제된 바이러스 단백질을 필수적으로 포함한다. 예를 들어, 서브유닛 백신은 백신접종시에 요망되는 바이러스를 중화하는 항체를 유도하는 역활을 하는 것으로 알려진 정제된 바이러스 표면 단백질을 함유한다.

본 발명에서, 다양한 분할제 예를 들어 비이온성 계면활성제 및 이온성 계면활성제 뿐만 아니라 다양한 다른 시약이 사용될 수 있다. 본 발명의 용태에 유용한 분할제의 예에는 하기의 것이 포함된다:

1. 담즙산 및 이의 유도체. 담즙산에는 콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시 콜산, 리토콜산, 우르소데옥시콜산, 하이오데옥시콜산, 및 앞서 언급된 담즙산의 유도체, 예컨대 글리코 유도체, 타우로 유도체, 아미도프로필-1-프로판설폰 유도체, 아미도프로필-2-히드록시-1-프로판설폰 유도체, 또는 N,N-비스(3D글루코노아미도프로필) 데옥시콜아미드가 포함된다. 특정 예에는 나트륨 데옥시콜레이트-NaDOC가 있다;

2. 비이온성 계면활성제 예를 들어, 옥토시놀(트리톤(Triton)^TM시리즈), 폴리옥시에틸렌 에테르 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(트윈 80(Tween 80)^TM) 및 하기 화학식(I)의 폴리옥시틸렌 에테르 또는 에스테르:

(I) HO(CH₂CH₂O)_n-A-R

상기 식에서, n은 1 내지 50이고, A는 결합 또는 -C(O)-이고, R은 C_1-50알킬또는 페닐 C_1-50알킬 및 이들의 두개 이상의 조합물이다. 특정 예에는 트윈80^TM, 트리톤 X-100^TM및 라우레스 9가 있다;

3. 알킬글리코시드 또는 알킬티오글리코시드, 여기서 알킬 쇄는 C6 내지 C18이고, 통상적으로는 C8 및 C14이고, 당 부분은 임의의 펜토오스, 헥소오스 또는 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1->2와 같은 상이한 연결을 가지는 이들의 조합물이다. 알킬 쇄는 포화형, 불포화형 및/또는 분지형일 수 있다;

4. 하나 이상의 히드록실기 바람직하게는, 6 히드록실기가 변형된 상기 3의 유도체, 예컨대 에스테르, 에톡실레이트, 설페이트, 에테르, 카보네이트, 설포숙시네이트, 이세티오네이트, 에테르카르복실레이트, 4차 암모늄 화합물;

5. 아실 당, 여기서 아실 쇄는 C6 내지 C18이고, 통상적으로는 C8 내지 C12이고, 당 부분은 임의의 펜토오스, 헥소오스 또는 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1->2와 같은 상이한 연결을 가지는 이들의 조합물이다. 아실 쇄는 포화형, 불포화형 및/또는 분지형일 수 있다.

6. 구조 R-N,N-(R1,R2)-3-아미노-1-프로판설포네이트의 설포베타인, 여기서 R은 C6 내지 C18, 통상적으로는 C8 내지 C16의 임의의 알킬 쇄 또는 아릴알킬 쇄이다. 알킬 쇄 R은 포화형, 불포화형 및/또는 분지형일 수 있다. R1 및 R2는 C1 내지 C4, 통상적으로 C1의 알킬쇄이다.

7. 구조 R-N,N-(R1,R2)-글리신의 베타인, 여기서 R은 C6 내지 C8, 통상적으로는 C8 내지 C16의 임의의 알킬 쇄이다. 알킬 쇄는 포화형, 불포화형 및/또는 분지형일 수 있다. R1 및 R2는 C1 내지 C4, 통상적으로 C1의 알킬 쇄이다;

8. 구조 R-(-O-CH₂-CH₂)_n-OH의 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 여기서 R은 C6 내지 C20, 통상적으로 C8 내지 C14의 임의의 알킬 쇄이다. 알킬 쇄는 포화형, 불포화형 및/또는 분지형일 수 있다. n은 5 내지 30, 통상적으로 8 내지 25이다;

9. 구조 R-(N-R1)-글루카미드의 N,N-디알킬-글루카미드, 여기서 R은 C6 내지 C18, 통상적으로 C8 내지 C12의 임의의 알킬 쇄이다. 알킬 쇄는 포화형, 불포화형 및/또는 분지형 또는 시클릭형일 수 있다. R1 및 R2는 C1 내지 C6, 통상적으로 C1의 알킬 쇄이다. 당 부분은 펜토오스 또는 헥소오스로 변형될 수 있다;

10. 헤카메그: (6-0-(N-헵틸-카르바모일)-메틸-알파-D-글루코피라노시드;

11. 구조 R-C6H4-O-(-CH2-CH2)_n-OH의 알킬페녹시폴리에톡시에탄올, 여기서 R은 C6 내지 C18, 통상적으로 C8의 임의의 알킬 쇄이다. 알킬 쇄는 포화형, 불포화형 및/또는 분지형(n≥3)일 수 있다;

12. 구조 R, -N⁺(-R1,-R2,-R3)의 4차 암모늄 화합물, 여기서 R은 C6 내지 C20, 통상적으로 C20의 임의의 알킬 쇄이다. 알킬 쇄는 포화형, 불포화형 및/또는 분지형일 수 있다. R1, R2 및 R3는 C1 및 C4, 통상적으로, C1의 임의의 알킬 쇄이다;

13. 사르코실: N-라우릴사르코신 Na 염;

14: CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드) 또는 세타블론.

NaDoc 및 Sarcosyl이 가장 바람직하다. 분할제는 적합하게는, 실온하에서분할될 바이러스와 함께, 예를 들어 밤새 인큐베이팅되어 분할을 수행한다. 적절하게는 분할제의 조합물이 사용될 수 있다.

분열 백신 제조물은 바람직하게는, 특히 비이온성 계면활성제일 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 함유한다. 하나 이상의 비이온성 계면활성제는 분할 공정으로부터의 잔류될 수 있고/거나 분열 후에 바이러스에 첨가될 수 있다. 본 발명이 반드시 이러한 경우에 좌우되는 것은 아니라고 이해되지만, 분할 항원 물질은 비이온성 계면활성제의 존재 하에 안정화되는 것으로 여겨진다. 적합한 안정화 비이온성 계면활성제에는 옥토시놀(트리톤^TM시리즈), 폴리옥시에틸렌 에테르 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(트윈 80^TM), 및 하기 화학식(I)의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르가 포함된다:

(I) HO(CH₂CH₂O)_n-A-R

상기 식에서, n은 1 내지 50이고, A는 결합 또는 -C(O)-이고, R은 C_1-50알킬또는 페닐 C_1-50 알킬, 및 이들 중 둘 이상의 조합물이다.

트리톤 시리즈 중에서 바람직한 비이온성 계면활성제에는 트리톤 X-100(t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 트리톤 X-165, 트리톤 X-205, 트리톤 X-305 또는 트리톤 X-405, 트리톤 N-101이 포함된다. 트리톤 X-100이 특히 바람직하다.

바람직한 비이온성 계면활성제에는 상기 화학식(I)의 폴리옥시에틸렌 에테르, 특히, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테아릴 에테르,폴리옥시에틸렌-8-스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르가 추가로 포함되나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌 에테르는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(라우레스 9)이다. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르에 대한 대안적인 용어 또는 명칭은 CAS 등록부에 공개되어 있다. 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 CAS 등록 번호는 9002-92-0이다. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 멀크 인덱스(12^th: entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3)에 기술되어 있다. 라우레스 9는 도데실 알코올과 에틸렌 옥시드를 반응시킴으로써 형성되고 평균 9개의 에틸렌 옥시드 유닛을 갖는다.

바람직하게는, 최종 백신 제형중에 존재하는 안정화 계면활성제의 최종 농도는 0.001 내지 20%이고, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10%이고, 가장 바람직하게는 약 2%(w/v)이다. 하나 이상의 계면활성제가 존재하는 경우에, 일반적으로 이들은 각각 약 2% 이하의 농도, 일반적으로 각각 1% 이하의 농도, 통상적으로 각각 약 0.6% 이하의 농도, 및 더욱 통상적으로는 약 0.2% 또는 약 0.1% 미만의 미량으로 최종 제형중에 존재한다. 계면활성제의 혼합물이 본 발명에 따른 백신 제형에 존재할 수 있다.

외피 바이러스는 적합한 세포 기질, 혈청 또는 무혈청 공정에서 복제에 의해 생성될 수 있다. 조직 배양에 의해 증식된 바이러스는 예를 들어, 사람 세포 예컨대, MRC-5, WI-38, HEp-2, 원숭이과 세포 예컨대, AGMK, Vero, LLc-Mk₂, LLc-Mk2, FRhL, FRhL-2, 또는 소 세포 예컨대, MDBK, 또는 개 세포 예를 들어 MDCK, 또는 1차 세포 예컨대, 닭 배아 섬유아세포, 또는 상기 언급된 세포주로부터 유래된 클론을 포함하여 백신용 바이러스 생성에 적합한 임의의 기타 세포 유형에서 생성될 수 있다.

분할 백신 제조물은 적합하게는 약제학적으로 허용되는 부형제와 배합된다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 백신 제조 분야에서 통상적인 부형제일 수 있다. 임의의 백신 제형에 사용되는 부형제는 부형제간에 친화성을 가지고, 또한 조성물의 필수적인 성분과도 친화성을 가져서, 부형제와 활성 제제가 존재하는 경우에 이들의 성능에 손상을 입히는 상호작용이 없을 것이다. 모든 부형제는 비독성이고 충분한 순도를 가져 인간에 사용하기에 적합할 것이다. 부형제의 적합한 예는 당 분야에 널리 공지되어 있다.

백신 제형은 바람직하게는 담체 및/또는 면역증강제일 수 있는 보조제를 포함한다. 보조제는 분할 공정으로부터 잔류될 수 있고/거나 분할 후에 첨가될 수 있다. 본 발명의 백신에 사용되기에 적합한 보조제는 당 분야에 널리 공지되어 있다.

이와 같이, 본 발명의 추가의 양태는 비강내 전달용 백신 제형의 제조에서 보조제와 배합된, 분할 인플루엔자 바이러스 제조물이 아닌 분할 외피 바이러스 백신 제조물의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 제조물을 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

본 발명의 백신 제조물은 비강 경로를 통해 상기 백신을 투여함으로써 질환에 민감하거나 질환에 걸린 포유동물을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.

통증있는 주사의 필요성 및 "주사기 공포"로 인한 환자 순응도에 대한 부정적인 관련 효과를 회피하는 것과 별개로, 비강내 방법에 의하는 것과 같이 점막 백신접종은, 동물에서 항원의 점막 투여가 많은 병원체의 유입 경로인 점막 표면에서 보호성 반응을 유발하는데 우수한 효율을 가지는 것으로 알려져 있기 때문에 관심이 간다. 또한, 비강내 백신접종과 같은 점막 백신접종은 비강 점막에서 뿐만 아니라 생식기 점막과 같은 원거리의 점막 위치에서 점막 면역성을 유발할 수 있다. 당해분야의 많은 연구에도 불구하고, 사람에 사용하기에 적합한 비강내 전달용 백신의 안정성 및 효과는 여전히 확인되어져야 한다.

본 발명에 따른 비강내 투여는 소적, 스프레이 또는 건조 분말 형태일 수 있다. 분무되거나 에어로졸화된 백신 제형은 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

임의의 적합한 보조제가 적합한 형태, 예를 들어, 용액, 비소낭성 용액, 현탁액 또는 분말로 사용될 수 있다. 바람직한 보조제는 본원에 참고문헌으로 인용된 WO 99/52549에 예시된 것들을 포함된다. 바람직한 에쥬번트는 트윈80^TM, 트리톤 X-100^TM및 라우레쓰 9 및 이들의 배합물과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

비이온성 계면활성제는 유리하게는, 모노포스포릴 및 디포스포릴 리피드 A의비독성 유도체 예를 들어 3-데-O-아크릴화된 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL) 및 3-데-O-아크릴화된 디포스포릴 리피드 A를 포함하여, US 4,912,094 및 GB 2,220211에 기술된 것을 포함하여 리피드 A의 비독성 유도체와 같은 면역자극제와 배합될 수 있다. 바람직한 배합물은 3D-MPL과 배합된 라우레스-9이다. 상기 면역자극제는 또한 적절한 경우에 비이온성 계면활성제 없이 제형에 사용될 수 있다.

3D-MPL의 바람직한 형태는 직경이 0.2㎛ 미만인 작은 입자 크기를 갖는 에멀션의 형태를 띠며, 이의 제조 방법은 WO 94/21294에 기재되어 있다. 모노포르포릴 리피드 A 및 계면활성제를 포함하는 수성 제형은 WO9843670A2에 설명되어 있다.

본 발명의 조성물중에 제형화될 수 있는 박테리아 리포폴리사카라이드 유도된 보조제는 박테리아 원으로부터 정제되고 처리될 수 있거나, 대안적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 정제된 모노포스포릴 리피드 A는 리비 등의 문헌[1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Pulb. Corp., NY, p407-419]에 기재되어 있으며, 살모넬라 종으로부터 유도된 3-O-데아실화된 모노포스포릴 또는 디포스포릴 리피드 A는 GB2220211 및 US 4912094에 설명되어 있다. 기타 정제되고 합성된 피로폴리사카라이드는 문헌[Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6; and EP 0 549 074 B1]에 기재되어 있다. 특히 바람직한 박테리아 리포폴리사카라이드 보조제는 3D-MPL이다.

따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 LPS 유도체는 LPS, MPL 또는 3D-MPL의 구조와 유사한 면역자극제이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, LPS 유도체는 아실화된 모노사카라이드이며, 이는 상기 MPL 구조의 하위(sub-portion)에 해당한다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 보조제는 ADP-리보실레이트 독소 또는 이들의변이체이다. 이러한 독소의 예로는 대장균으로부터의 이열성 독소(LT), 및 이들의 변이체 예컨대, LTR192G, 및 이들 독소의 단편 예컨대, 강글리오시드-결합 성분(LTB)이 있다.

추가의 바람직한 보조제는 사포닌 보조제 예컨대, QS21을 포함한다.

강화된 시스템은 비독성 리피드 A 유도체와 사포닌 유도체의 배합물, 특히 WO 94/00153에 기재된 바와 같은 QS21과 3DMPL의 배합물, 또는 WO 96/33739에 설명된 바와 같이 Q21이 콜레스테롤에 의해 켄칭된 덜 반응원성 조성물을 포함한다.

본 발명에 따른 백신의 비강내 투여용의 바람직한 장치는 분무기이다. 적합한 비강용 분무기는 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 프파이페르 게엠베헤(Pfeiffer GmBH) 및 발로이스(Valois)로부터 통상적으로 구입가능하다.

비강내 사용을 위한 바람직한 분무기는 사용자에 의해 가해지는 압력에 따른 이들의 수행능에 의존적이지 않다. 트레스 홀드 압력에 도달되는 경우에만, 액체가 노즐로부터 방출되기 때문에 압력 한계 장치가 특히 바람직하다. 이러한 장치는 일정한 점적 크기를 갖는 분무를 달성하는 것을 용이하게 해준다. 본 발명에 사용하기에 적합한 압력 한계 장치는 당해분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 91/13281 및 EP 311 863 B에 설명되어 있다. 이러한 장치는 프파이페르 게엠베하로부터 통상적으로 구입가능하며, 문헌[Bommer, R. Advances in Nasal drug delivery Technology, Pharmaceutical Technology Europe, September 1999, p26-33]에 설명되어 있다.

바람직한 비강내 장치는 1 내지 500㎛의 소적(액체로서 물을 사용하여 측정)을 생성시킨다. 10㎛ 미만에서 비흡입될 가능성이 있으므로, 10㎛ 미만의 소적이 약 5% 이하로 존재하는 것이 바람직하다.

쌍-용량(bi-dose) 전달은 본 발명에 따른 백신을 사용하는데 비강내 투약 시스템의 추가의 바람직한 특징이다. 쌍-용량 장치는 단일 백신 용량의 2개의 서브용량을 함유하는데, 하나의 서브용량이 각각의 비강으로 투여된다.

본 발명은 또한, 본 발명의 분할 제형을 포함하는 비강내 전달 장치를 제공한다.

본 발명은 추가의 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 비강내 투여기를 포함하거나, 비강내 투여기 및 장치에 사용되는 별도의 백신 제형을 포함하는 약제학적 키트를 제공한다.

본 발명의 이러한 양태에서 반드시 액체 제형의 분무 투약으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 백신은 다른 형태 예를 들어 분말로 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 제형은 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 감염 질환에 민감하거나, 감염 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 의약에 사용하기 위한 본원에 설명된 백신에 제공된다. 백신 제조물은 일반적으로 문헌[New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltmore, Maryland, U.S.A. 1978]에 기재되어 있다.

백신은 적합한 투여법, 예컨대, 1회 투여 또는 2회 투여 법으로 투여될 수 있다. 백신은 나이브한 집단 및 프라이밍된 집단, 즉 혈청반응 음성 개체 및 혈청반응 양성 개체에 사용될 수 있다.

본 발명자는 제형에 보조제를 포함시키고/거나 바이러스에 이미 프라이밍된 개체에 제공하는 것을 선택하였다.

본 발명은 추가로

(a) 외피 바이러스를 분할시키는 단계;

(b) 분할된 외피 바이러스 제조물을 안정화제와 선택적으로 혼합시키는 단계; 및

(c) 분할된 외피 바이러스 제조물을 보조제와 선택적으로 혼합시키는 단계(여기서, 보조제는 담체 및/또는 면역자극제일 수 있음)를 포함하여, 백신 제형을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

적합한 방법은 단계 (a)와 (b), 단계 (a)와 (c), 또는 단계 (a)(b) 및 (c)를 포함한다. 적합하게는, 안정화제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(트윈80^TM); t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤X100^TM); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 계면활성제를 포함한다.

선택적으로, 이러한 방식으로 생성된 백신은 적합한 담체와 혼합된다.

본 발명은 적합한 분할제로 바이러스를 처리하는 것을 포함하여, 본원에 설명된 바와 같은 외피 바이러스를 분할시키는 방법으로 까지 확장된다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 설명될 것이나, 이에 제한되지는 않는다:

도 1은 안티 F 항체와의 분할된 RSVA의 웨스턴 블롯이다;

도 2는 안티 M2 항체와의 분할된 RSVA의 웨스턴 블롯이다;

도 3은 안티 G 항체와의 분할된 RSVA의 웨스턴 블롯이다;

도 4는 안티 N 항체와의 분할된 RSVA의 웨스턴 블롯이다;

도 5는 EM에 의해 가시화된 RSV/A 바이러스 출발 물질이다;

도 6은 EM에 의해 가시화된, NaDOC로 분할된 RSV/A 바이러스이다;

도 7은 EM에 의해 가시화된 PIV 3 바이러스 출발 물질이다;

도 8은 EM에 의해 가시화된, NaDOC로 분할된 PIV 3 바이러스이다;

도 9는 EM에 의해 가시화된 HSV2 바이러스 출발 물질이다;

도 10은 EM에 의해 가시화된, 사르코실로 분할된 HSV2 바이러스이다;

도 11은 근내 또는 비강내로 분할 RSV에 의해 면역화된, 프라이밍된 마우스에서의 안티-FG 항체(ELISA) 역가(포스트 Ⅱ)를 나타낸다;

도 12는 근내 또는 비강내로 분할 RSV에 의해 면역화된, 프라이밍된 마우스에서의 안티-RSV/A 중화 항체 역가(포스트 Ⅱ)를 나타낸다;

도 13은 근내 또는 비강내로 분할 RSV에 의해 면역화된, 프라이밍된 마우스에서 안티-FG IgG 아이소타입 반응(포스트 Ⅱ)를 나타낸다;

도 14는 근내 또는 비강내로 분할 RSV에 의해 면역화된, 프라이밍된 마우스에서 안티-FG 항체(ELISA) 역가(포스트 Ⅰ)를 나타낸다;

도 15는 비강내로 분할 RSV에 의해 면역화된, 프라이밍되지 않은 마우스에서 안티-FG 항체(ELISA) 역가를 나타낸다;

도 16은 비강내로 분할 RSV에 의해 면역화된, 프라이밍되지 않은 마우스에서 안티-RSV/A 중화 항체 역가를 나타낸다.

실시예 1. 분할된 바이러스의 생성

다양한 바이러스계로부터 유도된 외피 바이러스를 계면활성제와 같은 분할제를 첨가함으로써 분할시켰다. 분할은 SDS-PAGE 분석에 의한 수크로스 구배 또는 쿠션에서의 가시화된 분할 바이러스의 이동 특성 및 전자현미경을 사용한 분할 바이러스 생성물의 직접적인 고찰에 의해 평가된다.

본 실시예에 설명된 분할 바이러스는 다양한 외피 바이러스계의 대표적인 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 파라믹소바이러스과(호흡기 합포체 바이러스 A 및 B, 파라인플루엔자비이러스-3, 뭄프 바이러스 및 홍역 바이러스), 토가바이러스과(풍진 바이러스), 및 헤르페스바이러스과(엡스테인 바르 바이러스, 사이토메갈로 바이러스 또는 단순포진 바이러스)를 평가하였다.

바이러스 입자를 분열시키는(분할) 작용은 계면활성제와 같은 분할제를 용해 농도로 무세포 바이러스 제조물에 첨가함으로써 수행된다. 특히, 담즙산 및 알킬글리코시드가 계면활성제로 사용된다. 계면활성제는 단독으로 또는 다양하게 조합되어 첨가되고, 공정이 완료되도록 인큐베이팅된다.

효과적인 분할 평가는 초기에는 수크로스 구배 또는 쿠션 원심분리를 사용하여 수행된다. 간단히, 계면활성제 처리된 샘플 및 미처리된 샘플을 수크로스 구배/쿠션에 가하고, 분획을 SDS-PAGE 겔에서 분석하였다. 가용성 분획에서 모든 유형의 비리온 단백질이 이동하면 효과적으로 분할이 수행됐다는 것을 나타낸다. 수크로스-SDS-PAGE 분석에 의해 효과적으로 분할된 것으로 여겨진 샘플을 추가로 전자 현미경으로 분석하였다. 표준 음성 염색 기법을 이용하여 샘플을 가시화시켰다.

하기 특이적 분할 실험은 RSV, HSV 및 PIV에 대해 수행한 것이다.

1.1. 세포 배양 조건

사람 야생형 RSV/A/장 및 PIV-3을 부동혈청 비함유 공정으로 VERO 세포에서 복제하였다. 감염전에, VERO 세포를 4일 동안 집단으로 성장시켰다. 바이러스 생성 조건을 각각의 바이러스에 대해 하기와 같이 적용시켰다: RSV/A에 있어서 MOI 0.03, 4일, 35℃; HSV2에 있어서 MOI 0.001, 3일, 35℃; PIV-3에 있어서 MOI 0.01, 5일, 37℃. 채취한 날에, 세포를 용해하고, 안정화제를 첨가한 후에 세포 유체를 회수하고, -70℃에서 즉시 저장하였다.

1.2. 바이러스 정제

10분 동안 1,000 x g에서 원심분리에 의해 정화시키고, 바이러스 입자를 PEG 6000 침전에 의해 상청액으로부터 펠렛팅시켰다. 펠렛을 트리스 50mM-NaCl 50mM-MgSO4 2mM pH7.5 완충액중에 재현탁시킨 후, 벤조나아제로 처리하였다. 이 용액을 5배 부피의 인산염-완충된 염수에 대한 500kD AGT 막으로 한외여과시키고, pH7.5의 5배 부피의 인산염 완충액에 대해 투석여과시켰다.

상기 설명된 바와 같은 EM 및 수크로스 쿠션에서의 원심분리에 의해 확인된 바와 같은 손상되지 않은 바이러스 입자를 확인하였다. 단백질 농도를 측정하였다.

1.3. 바이러스 분할

무세포 바이러스 제조물에 분할제를 첨가함으로써 바이러스 입자를 분할하였다.

효과적으로 분할하기 위해서 세정제는 이의 임계 미셀 농도(critical micellar concentration: cmc)를 초과하도록 사용되어야 하였다. 모든 세정제는 이의 cmc 값을 초과하는 최종 농도로 사용되었다. D/P 비(세정제/ 단백질 비)를 연구하였다. 바람직한 D/P ≥25에서 성공적으로 분할이 이루어졌다.

하기 세정제는 바이러스 입자를 분할하는데 2% 농도로 사용되었다; 나트륨 데옥시콜레이트, 사르코실, 플란타케어(Plantacare) 및 라우레스 9.

분할 후, 용액을 제형화 완충액(PO4 10mM/NaCl 150mM pH7.5)에 대해 투석시켜 과량의 세제를 제거하였다.

RSV에 대한 분할 공정이 예로서 하기에 요약되어 있다.

RSV-A: 바이러스 정제 흐름도

채취물 정화

3500RPM(1000 x g)로 벡맨(Beckman) JA 10로터에서 원심분리 + 4℃에서 10분-> 상청액 정화↓10% PEG 6000 침전1시간 30분 동안 서서히 교반 + 4℃3500RPM(1000 x g)으로 원심분리 - 20분트리스 50mM-NaCl 50mM-MgSO4 2mM pH7.5 완충액에 펠렛 재현탁↓

벤조나아제 처리125유닛/ml교반하에 최소 4시간 인큐베이션↓

초여과: AGT-VAGE4A-500Kd-420cm²PO4(Na)10mM-NaCl150mM pH7.5에 대한 5 부피그 후, PO4(Na)20mM pH7.5에 대한 5 부피↓

분할세정제 첨가 -> ≤최종 2% 인큐베이션 O/N 실온하에서 서서히 교반↓

정화사르토퓨어 300(Sartopure 300)에서 전여과(GF2-필터 깊이 1.2㎛)↓

초여과: 세정제 제거-농축5 부피 PO4(Na) 20mM pH7.5그 후, 5 부피 PO4(Na)10mM/NaCl 150mM pH 7.5↓분할된 바이러스 벌크

1.4. 분할된 바이러스 특징화

출발 바이러스의 보전성 및 분할된 바이러스의 특성을 30% 수크로스 쿠션에서 초여과시킴으로써 측정하였다(TL 100 벡맨 로터에서 50.000rpm으로 1시간). 분획물을 특이적 웨스턴 블롯팅 검정에 의해 검정하였다; 이들 분획물 일부를 전자 현미경으로 검사하고, 전염성 역가를 측정하였다.

1.4.1. 초원심분리:

원심분리 튜브의 반을 30% 수크로스 용액(450㎕)으로 채운 후, 검정할 샘플(450㎕)을 서서히 조심스럽게 상기 수크로스 쿠션상으로 첨가하고, 벡맨 TL100 로터에서 4℃하에 1시간 동안 50.000rpm으로 원심분리시켰다. 원심분리 후, 튜브를 3 부분으로 배출시켰다. 상부 상(300㎕)은 '상청액'으로서 불려진다. 중간 상(300㎕)은 샘플과 수크로스 쿠션사이의 층간상, 소위 '중간층'이다. 하부 상(300㎕)은 순수 바이러스에 대해 원심분리가 수행되는 경우 재현탁된 펠렛을 갖는 바닥 용액, 소위 '펠렛'이다.

이러한 3 분획을 추가로 검정하였다.

1.4.2. 웨스턴 블롯팅 검정

이 검정으로 바이러스의 보전성을 검사할 수 있고(펠렛 분획 양성), 분할 효과를 측정할 수 있다(적합하게는, 외피 단백질과 같은 모든 또는 대부분의 구조적 단백질에 대한 상청액 분획 양성).

특이적 항체를 사용하여 특이적 바이러스 단백질을 특징화시켰다.

RSV-A에 있어서, 미분할 분획 및 분할 분획을 안티 F 단백질(표면 단백질); 안티 G 단백질(표면 단백질); 안티 N 단백질(누클레오캡시드) 및 안티 M 단백질(매트릭스) 성분에 대해 검정하였다.

PIV-3 바이러스에 있어서는, 미분할 분획 및 분할 분획을 이들의 HN 단백질 성분과 모노클로날 항체 및 F, M, HN 단백질 성분과 폴리클로날 항체에 대해 검정하였다.

HSV에 있어서는, 미분활 분획 및 분활 분획을 이들의 G 단백질, 외피 단백질 및 캡시드 단백질과 항체에 대해 검정하였다.

분할 기준

분할 전에 펠렛 분획으로 시험된 모든 네개의 단백질에 대한 양성 웨스턴 블롯(WB) 시그널이 나타나고, 두개의 나머지 분획에 대해서는 시그널이 나타나지 않는다는 것은 바이러스 제조물중에 모든 바이러스가 손상되지 않은 채로 존재한다는 것을 시사한다.

외피가 분열되고, 외피 단백질이 상청액 및/또는 중간 분획에서 검출될 경우, 분할이 효과적인 것으로 간주된다. RSV에 있어서는, 예를 들어, F 또는 G가 S 또는 M 분획에서 검출될 경우, 분할이 효과적인 것으로 간주된다. 바람직하게는, F 및 G는 사실상 S 및/또는 M 층에 위치하며, 펠렛에는 존재하지 않는다.

결과 요약:

결과는 RSVA에 대해 도 1-4에 도시되어 있다.

모든 웨스턴 블롯 결과에서, '분할-O'는 분할전의 바이러스를 의미한다. 'S', 'M' 및 'P'는 수크로스 쿠션상의 샘플을 원심분리시킨 후 취해진 각각의 '상청액', '중간층' 및 '펠렛' 분획을 의미한다. 레인의 번호는 왼쪽에서 오른쪽으로 매겼다. 부피는 SDS-PAGE 겔상에 가해진 샘플의 양이다.

도 1은 mAb B4(안티-F)로 프로빙된 분할된 RSVA의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.

상부 패널:

1	STD	10㎕
2	분할-O	10㎕
3	분할 O-S	10㎕
4	분할 O-M	10㎕
5	분할 O-P	10㎕
6	분할 DOC-S	10㎕
7	분할 DOC-M	10㎕
8	분할 DOC-P	10㎕
9	분할 사크로-S	10㎕
10	분할 사크로-M	10㎕
11	분할 사크로-P	10㎕

하부 패널:

1	STD	10㎕
2	샘플 완충액	10㎕
3	분할 O-S	10㎕
4	분할 O-M	10㎕
5	분할 O-P	10㎕
6	분할 플란타-S	10㎕
7	분할 플란타-M	10㎕
8	분할 플란타-P	10㎕
9	분할 라우레스9-S	10㎕
10	분할 라우레스9-M	10㎕
11	분할 라우레스9-P	10㎕
12	STD	10㎕

도 2는 안티-M 모노클로날로 프로빙된 분할된 RSVA의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다;

상부패널:

1	STD	10㎕
2	분할 O	20㎕
3	분할 O-S	20㎕
4	분할 O-M	20㎕
5	분할 O-P	20㎕
6	분할 DOC-S	20㎕
7	분할 DOC-M	20㎕
8	분할 DOC-P	20㎕
9	분할 사크로-S	20㎕
10	분할 사크로-M	20㎕
11	분할 사크로-P	20㎕

하부패널:

1	STD	10㎕
2	샘플 완충액	20㎕
3	분할 O-S	20㎕
4	분할 O-M	20㎕
5	분할 O-P	20㎕
6	분할 플란타-S	20㎕
7	분할 플란타-M	20㎕
8	분할 플란타-P	20㎕
9	분할 라우레스9-S	20㎕
10	분할 라우레스9-M	20㎕
11	분할 라우레스9-P	20㎕

도 3은 안티-G 모노클로날로 프로빙된 분할된 RSVA의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다;

상부패널:

하부패널:

도 4는 안티-N 모노클로날로 프로빙된 분할된 RSVA의 웨스턴 블롯이다;

상부패널:

하부패널:

분할 후, F 및 G 단백질에 대해 중간층 및 상청액 분획에서만 시그널이 존재하고, 펠렛 분획에는 어떠한 밴드도 거의 나타나지 않는다는 것은 바이러스 외피가 완전히 분열됐다는 것을 의미한다. N 및 M 단밸질에 대해 모든 분획에서 시그널이 존재한다는 것은 분할된 제조물중에 이러한 단백질이 존재한다는 것을 의미한다. 이들 결과는 시험한 4개의 모든 세정제가 RSVA 분할된 바이러스를 유도한다는 것을 시사한다.

모든 분획에서 모든 네개의 단백질에 대한 시그널, 특히 중간층 및 상청액 분획에서 분할 후의 N 및 M 단백질에 대한 비교 시그널 검정은, 시험한 조건하에서, NaDOC 및 사르코실이 바이러스를 분할시킬 뿐만 아니라, 모든 바이러스 구조를 분열시키고, 구조적 및 비구조적 단백질을 용해시킬 수 있다는 것을 암시한다.

예를 들어, 2% Nadoc 또는 사크로실로 성공적으로 분할될 수 있는 분할된 PIV, HSV 및 풍진바이러스에서도 유사한 결과가 얻어졌다.

NaDoc 및 사르코실은 모든 바이러스에 대한 바람직한 분할제이다.

1.5. 실험관내 바이러스 역가

분할 후 보전성이 손실되어 바이러스가 전염성을 띠지 않게된다. 분할 후10⁶log 이상의 바이러스 농도의 손실은 바이러스가 성공적으로 분해됐다는 것을 보여준다.

1.6. 전자현미경(EM) 검정

조영제로서 Na 포스포텅스테이트를 사용한 표준 2-단계 음성 염색법을 이용하여 전자현미경 검정을 수행하였다(Hayat and Miller, 1990, Negative Staining, McGraw, ed. Hill). 눈금을 조사하여 물질의 분할 패턴을 평가하였다.

미분할 및 NaDoc 또는 사르코실 분할 RSVA, HSV2 및 PIV3 바이러스 제조물의 전자현미경 검정은, 웨스턴 블롯 검정에 의한 관찰 결과를 지지한다. 결과를 설명하기 위해, RSV, PIV 및 HSV 데이타를 도시하였다.

도 5는 EM에 의해 가시화된 RSV/A 출발 물질이다. 도 6은 NaDOC로 분할된 후의 RSV/A이다. 도 7은 EM에 의해 가시화된 PIV 3 출발 물질이다. 도 8은 NaDOC로 분할된 후의 PIV 3이다. 도 9는 EM에 의해 가시화된 HSV 2 출발 물질이다. 도 10은 사르코실로 분할된 후의 HSV 2이다.

미분할된 바이러스(손상되지 않은 전체 바이러스)는 비교적 잘 보존되거나 거의 손상되지 않은 바이러스 입자 및 일부 무형 물질을 함유하였다. NaDoc 또는 사르코실 분할 바이러스에는 다양한 정도로 집합된 무형 물질이 불균일적으로 확산되어 있다. 유사한 데이타가 시험된 모든 바이러스, 즉 RSV, PIV 및 HSV에 대해서도 수득되었다. 또한, 바이러스 외피 또는 핵산단백질 오리진의 확인가능한 구조가 RSV 또는 PIV에서 거의 관찰되지 않았다.

실시예 2. 마우스의 분할 백신의 면역원성

분할된 RSV 및/또는 PIV 제조물을 면역원으로 사용하여 마우스를 백신접종시켜 이러한 제조물의 면역원성을 평가하였다. 간단하게는, 8주된 암컷 마우스를 비강용 분할 백신 제조물로 면역시켰다. 대조군에는 보조제를 처리하지 않았다. 몇추 간격으로 2회 투여하였다.

최종 투여하고 2주 후, 동물을 희생시키고, 혈액, 지라 세포 및/또는 비강 세척물을 모았다. 바이러스 특이적 ELISA 검정법으로 마우스 혈청을 시험하여 혈청중의 바이러스 특이적 체액성 면역반응을 평가하였다. 또한, 아이소타입-특이적 검정법을 이용하여 항체 반응의 아이소타입 분포를 측정하였다. 특이적 바이러스 중화 검정법을 이용하여 혈청중의 중화 항체 존재 여부를 평가하였다. 비강 세척물중의 중화 항체 검정법 또는 비강 세척물중의 바이러스 특이적 IgA 검정법에 의해 관련된 국소적 면역 반응의 유도성을 평가하였다.

채취한 지라 세포를 실험관내 자극하여, 자극된 세포에 의한 세포 증식(트리티에이트화된 티미딘 흡수) 및/또는 IL-5 및 IFNγ의 분비를 측정함으로써 바이러스 특이적 세포성 면역반응의 유도성을 평가하였다.

분할 제형에 의해 유도된 반응의 특성 및 정도에 주의를 기울여서 실험시 변수의 영향을 평가하였다.

2.1. 분할 RSV 제형

하기 일련의 실험은 RSV 같은 분할 바이러스가 비강 IN 경로로 투여되는 경우 효과적인 면역 반응을 유도한다는 것을 예증한다. 소아(나이브) 또는 노인(프라이밍된) 집단의 면역 상태를 더욱 정밀하게 반영시키기 위해, 프라이밍되거나 되지 않은 동물에서의 면역원성을 평가하고, 두 집단에서의 면역원성을 입증하였다. IM 전달을 이용하여 비교하였다.

실험의 제 1 세트에서는, 8주된 암컷 Balb/c 마우스를 IM 또는 IN 경로에 의해 투여된 분할 RSV 제조물의 면역원성을 시험하는데 사용하였다. 60㎕(2 x 30㎕) 부피로 비강내로 투여된 생 RSV 바이러스의 유닛(pfu)을 형성하는 3 X 10⁵플라크를 투여함으로써 프라이밍시켰다. 프라이밍하고 3주 후, 동물을 RSV 분할된 항원으로 백신접종시켰다. RSV 분할된 생성물의 정량화는 RSV F 단백질 특이적 ELISA를 기초로 하며, 이는 분할된 생성물중의 F 단백질을 재조합 FG 단백질 표준과 비교하여 정량화한다. 4.2㎍ F 단백질을 함유하는 100㎕의 RSV 분할된 항원을 21일 간격으로 근내로 2회 투여하여 군 A 마우스를 면역화시켰다. 군 B 마우스는 50㎍ Al(OH)₃로 보조된 4.2㎍의 F 단백질을 함유하는 100㎕의 RSV 분할된 항원을 21일 간격으로 근내로 2회로 투여하여 면역화시켰다. 군 C 마우스는 2.7㎍의 F 단백질을 함유하는 60㎕의 RSV 분할된 항원을 비강내로 1차 투여하고, 21일 후 4㎍의 F 단백질을 함유하는 60㎕의 RSV 분할된 항원을 비강내로 2차 투여하여 면역화시켰다. 최종 투여하고 2주 후, 모든 동물을 희생시키고, 면역 반응을 평가하였다.

실험 결과를 도 11-16에 요약하였다. 면역 반응을 평가하는데 사용되는 제 1 면역 해독법은 ELISA 검정법이며, 이는 백신접종된 동물의 혈청에 존재하는 총 RSV FG-특이적 면역글로불린(Ig) 또는 FG-특이적 IgG 아이소타입(IgG₁및 IgG_2A)를측정한다. 이러한 검정에 있어서, 96 웰 디쉬를 재조합 RSV FG 항원으로 피복시키고, 동물 혈청을 연속적으로 희석시키고, 피복된 웰에 첨가하였다. 바이오티닐화된 안티-마우스 Ig, IgG₁또는 IgG_2A를 첨가하고, 과산화효소 복합 스트렙타비딘으로 증폭시키므로써 결합된 항체를 검출하였다. OPDA 기질을 첨가하자 결합 항체가 나타났으며, 2N H₂SO₄로 처리하고 490nm에서 광밀도(OD)를 측정하였다. 소프트맥스 프로 소프트웨어(SoftMax Pro software)(4 변수 방정식 이용)를 사용하여 기준치로부터 항체 농도를 계산하고, EU/ml로 나타내었다.

ELISA 검정법 이외에, 중화 검정법이 면역화에 의해 유도된 면역 반응의 특성을 추가로 특징화시키는데 사용된다. 중화 검정법에 있어서, 동물 혈청의 2배 희석물을 RSV/A 바이러스(3000pfu) 및 기니아피그 보체와 함께 1시간 동안 37℃하에서 96웰 조직 배양 디쉬에서 인큐베이팅하였다. Hep-2 세포(10⁴세포/웰)를 각각의 웰에 직접 첨가하고, 플레이트를 4일 동안 37℃에서 인큐베이팅시켰다. 상청액을 빨아내고, 통상적으로 구입가능한 WST-1 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃하에서 18-24시간 동안 추가로 인큐베이팅시켰다. OD를 450nm에서 모니터링하고, 선형회귀분석법(linear regression analysis)에 의해 역가 분석하였다. 기록된 역가는 혈청 희석에 역비례하며, 이는 비감염된 세포에서 관찰된 최대 OD를 50% 감소시킨다.

도 11은 총 Ig ELISA 해독에 의해 수득된 결과이다. 프라이밍된 마우스에서, 효과적인 안티-FG 항체 반응은 분할 RSV 항원 투여된 IM(군 A, B) 또는 IN(군C)으로 2회 백신접종함으로써 유도되었다.

특히, 도 11은 생 RSV로 프라이밍되고, 근내(IM) 또는 비강내(IN)로 분할 RSV로 면역된 마우스에서의 안티-FG 항체(ELISA) 역가(2차 백신접종 후)를 나타낸다. 군 A에는 4.2㎍의 각 분할된 RSV를 IM으로 2회 투여하였다. 군 B에는 알럼으로 보조된 분할된 RSV 4.2㎍을 각각 IM으로 2회 투여하였다. 군 C에는 2.7 및 4.0㎍의 각각의 분할된 RSV를 IN으로 2회 투여하였다.

도 12는 중화 검정법의 결과이다. 효과적인 바이러스 중화 항체 반응은 분할된 RSV 생성물의 2회 투여에 의한 IM 또는 IN 백신접종에 의해 이들 프라이밍된 동물에서 유도되었다.

특히, 도 12는 생 RSV로 프라이밍되고, 근내(IM) 또는 비강내(IN)로 분할 RSV로 면역된 마우스에서의 안티-RSV/A 중화 항체 역가(2차 백신접종 후)를 나타낸다. 군 A에는 4.2㎍의 각 분할된 RSV를 IM으로 2회 투여하였다. 군 B에는 알럼으로 보조된 각 분할된 RSV 4.2㎍을 IM으로 2회 투여하였다. 군 C에는 2.7 및 4.0㎍의 각각의 분할된 RSV를 IN으로 2회 투여하였다.

도 13은 아이소타입 검정 결과이다. 비강내로 프라이밍된 동물에서, IgG_2a:IgG₁의 비는 프라이밍되지 않은 마우스에서의 데이타와 비교하여 증가하였으며(하기 기재), 이는 마우스가 생 바이러스로 프라이밍된 경우(즉, 노인 집단의 자연적인 상태) 더욱 Th1-형 반응을 띠는 경향이 있음을 시사한다.

특히, 도 13은 생 RSV로 프라이밍되고, 근내(IM) 또는 비강내(IN)로 분할RSV로 면역된 마우스에서의 안티-FG IgG 아이소타입(ELISA) 반응(2차 백신접종 후)을 나타낸다. 군 A에는 4.2㎍의 각 분할된 RSV를 IM으로 2회 투여하였다. 군 B에는 알럼으로 보조된 각 분할된 RSV 4.2㎍을 IM으로 2회 투여하였다. 군 C에는 2.7 및 4.0㎍의 각각의 분할된 RSV를 IN으로 2회 투여하였다.

도 14는 항원의 단일 투여 후에도, 프라이밍된 집단에서 분할된 RSV로의 IN 백신접종에 대한 반응에서 강한 면역 반응이 유도됨을 입증한다. 이와 같이, 프라이밍된 집단에서, 분할된 RSV는 IN 백신접종 후 높은 역가 항체 반응을 유도하는 효과적인 면역원이다.

특히, 도 14는 생 RSV로 프라이밍되고, 근내(IM) 또는 비강내(IN)로 분할된 RSV로 면역된 마우스에서의 안티-FG IgG 아이소타입(ELISA) 반응(1차 백신접종 후)을 나타낸다. 군 A에는 4.2㎍의 각 분할된 RSV를 IM으로 2회 투여하였다. 군 B에는 알럼으로 보조된 각 분할된 RSV 4.2㎍을 IM으로 2회 투여하였다. 군 C에는 2.7 및 4.0㎍의 각각의 분할된 RSV를 IN으로 2회 투여하였다. 군 D는 프라이밍만 시키고, 백신접종을 하지 않았다 - 이 군에 대해 보고된 항체 역가는 검출 수준보다 낮았으며, 프라이밍후 21일째에 측정하였다.

제 2의 일련의 실험에서, 프라이밍되지 않은 마우스를 사용하여 항원 투여 및 분할 RSV 생성물의 면역원성에 대한 보조화의 효과를 기록하였다. 2.4㎍의 F 단백질을 함유하는 분할된 RSV 항원(60㎕로 전달됨 -2X 30㎕)을 마우스에 1차 투여하였다. 30일 후, 3.5㎍의 F 단백질을 함유하는 분할된 RSV 항원을 2차 투여하였다. 분할된 RSV는 보조제 없이, 또는 5㎍의 대장균 불안정 독소(LT)가 첨가되거나폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 0.5%(본원에서는 '라우레스9')로 보조되어 IN으로 투여되었다. 대조군은 1차 투여에서는 2.0㎍의 F 단백질 및 2차 투여에서는 3.5㎍ F 단백질을 함유하는 전체 정제된 RSV 바이러스로 비강내로 면역화시켰다. 최종 백신접종하고 2주 후, 동물을 희생시키고, 면역반응을 평가하엿다.

도 15 및 16에 도시된 바와 같이, 항체 반응은 프라이밍되지 않은 마우스에서 IN 제형에 의해 유도되었다. 반면 ELISA 해독(도 15)은 IN 백신화에 대한 반응이 IM에 의해 유도된 반응보다 낮다는 것을 시사하며, 중화 해독(도 16)은 중화 항체의 유도에 있어서 LT 보조된 분할된 RSV IN 제형이 적어도 IM 만큼은 우수하며, 기타 제형은 IM와 거의 유사하였다. 이와 같이, 프라이밍되지 않은 마우스에서, IN으로 투여된 분할된 RSV 또한 면역원성을 띤다.

특히, 도 15는 분할된 RSV에 의해 비강내(IN) 또는 근내(IM)으로 면역화된 프라이밍되지 않은 마우스에서의 안티-FG 항체(ELISA) 역가(2차 백신접종 후)를 나타낸다. 군 A에는 2.4 및 3.5㎍의 각 분할된 RSV를 IN으로 2회 투여하였다. 군 B에는 라우레스9으로 보조된 2.4 및 3.5㎍의 분할된 RSV를 각각 IN으로 2회 투여하였다. 군 C에는 LT로 보조된 2.7 및 3.5㎍의 분할된 RSV를 각각 IN으로 2회 투여하였다. 군 D에는 2.0 및 3.5㎍의 정제된 전체 바이러스를 각각 IN으로 2회 투여하였다. 군 E에는 4.2㎍의 분할된 RSV를 각각 IM으로 2회 투여하였다.

도 16은 분할된 RSV에 의해 비강내(IN) 또는 근내(IM)로 면역된 프라이밍되지 않은 마우스에서 안티-RSV/A 중화 항체 역가(2차 백신 접종 후)를 나타낸다. 군 A에는 2.4 및 3.5㎍의 분할된 RSV를 각각 IN으로 2회 투여하였다. 군 B에는 라우레스9으로 보조된 2.4 및 3.5㎍의 분할된 RSV를 각각 IN으로 2회 투여하였다. 군 C에는 LT로 보조된 2.7 및 3.5㎍의 분할된 RSV를 각각 IN으로 2회 투여하였다. 군 D에는 2.0 및 3.5㎍의 정제된 전체 바이러스를 각각 IN으로 2회 투여하였다. 군 E에는 4.2㎍의 분할된 RSV를 각각 IM으로 2회 투여하였다.

요약하면, 이러한 실험은 분할된 RSV 항원이 나이브 집단 및 프라이밍된 집단 둘 모두에서 강한 면역원성을 띤다는 것을 입증해준다. 또한, 이러한 실험은 RSV가 비강내로 효과적으로 투여될 수 있으며, 면역원성을 띤다는 것을 보여준다.

Claims

비강내 전달용 백신 제형의 제조에서 분할된 인플루엔자 바이러스 제조물이 아닌 분할된 외피 바이러스 제조물의 용도.
제 1 항에 있어서, 분할된 외피 바이러스 제조물이 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 단순포진 바이러스, 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 분할된 외피 바이러스 제조물이 바이러스 막 단편, 바이러스 막 외피 단백질, 바이러스 매트릭스 및 핵산단백질을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 3 항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 잔류성 분할제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 4 항에 있어서, 잔류성 분할제가 라우레스 9(laureth 9), NaDOC, 사르코실 군(Sarcosyl group), 트윈 80^TM(Tween 80) 및 트리톤 X100^TM(Triton X100)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
제 5 항에 있어서, 분할제가 NaDOC 또는 사르코실임을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 6 항중의 어느 한 항에 있어서, 안정화제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 7 항에 있어서, 안정화제가 계면활성제임을 특징으로 하는 용도.
제 8 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(트윈80^TM), t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤 X100^TM), 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 9 항중의 어느 한 항에 있어서, 보조제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 10 항중의 어느 한 항에 따른 백신 제형을 제조하는 방법으로서,

(a) 외피 바이러스를 분할하는 단계,

(b) 분할된 외피 바이러스 제조물을 안정화제와 선택적으로 혼합시키는 단계, 및

(c) 분할된 외피 바이러스 제조물을 보조제(담체 및/또는 면역자극제)와 선택적으로 혼합시키는 단계를 포함하는 방법.
제 11 항에 있어서, 안정화제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(트윈80^TM); t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤 X100^TM); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 계면활성제임을 특징으로 하는 방법.
질환의 예방 또는 치료를 위한 비강용 백신 제형의 제조를 위한, 분할된 인플루엔자 바이러스 제조물이 아닌 분할된 외피 바이러스 백신 제조물의 용도.
제 1 항 내지 제 10 항중의 어느 한 항에 따른 비강용 백신 제형의 전달을 위한 키트로서,

(a) 분할된 외피 바이러스 제조물 및 (b) 비강내 전달 장치를 포함하는 키트.
제 1 항 내지 제 10 항중의 어느 한 항에 따른 백신을 포함하는 비강내 전달 장치.
제 15 항에 있어서, 압력 한계 장치(pressure threshold device)임을 특징으로 하는 장치.
제 1 항 내지 제 10 항중의 어느 한 항에 따른 백신을 비강내 투여하는 것을 포함하여, 외피 바이러스에 의해 초래되는 질환을 앓고 있거나 이에 민감한 포유동물을 예방하거나 치료하는 방법.
제 1 항 내지 제 17 항중의 어느 한 항에 있어서, 백신 제형이 혈청반응 양성 및 혈청반응 음성의 개체에서 면역원성을 띰을 특징으로 하는 방법, 용도, 키트 또는 장치.