CN107085095A - 用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法 - Google Patents

用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法 Download PDF

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何卫华
龚华岳
韩晓娟
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Abstract

本发明公开了用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，采用麻疹病毒减毒株，培养收获麻疹病毒液，经过超滤或其他方法分离出麻疹病毒浓缩液，加入麻疹病毒抗原保护液调整为一定浓度的麻疹病毒原液保存备用，经裂解处理后用样品稀释液调整浓度得到麻疹病毒裂解液直接用作包被抗原，经过调整包被、固定液的酸碱度（pH值）及离子强度、选择合适的缓冲对，提高检测的敏感性及特异性，满足了临床检测的需求。

Description

用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法
技术领域
本发明涉及临床实验领域，尤其涉及一种用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法。
背景技术
麻疹病毒属副粘病毒科(FamilyParamyxoviridae)麻疹病毒属(GenusMorbillivirus)，为负链RNA病毒，与其它的副粘膜病毒不同之处为无特殊的神经氨酸酶，呈球型，直径只有100-250nm，螺旋对称，有包膜，包膜上含血凝素。基因组全长约16kb,基因组有N、P、M、F、H、L六个基因，分别编码六个结构和功能蛋白：核蛋白NP、磷酸化蛋白P、膜蛋白M、融合蛋白F(fusion protein,F)、血凝素蛋白H(haemagglutinin protein,H)，依赖RNA的RNA聚合酶（Large polymerase,L）.它们的成分都是糖蛋白。
麻疹是由麻疹病毒感染引起、多见于儿童的急性传染病，传染性极强，其临床特征为发热、流鼻涕、咳嗽、眼结合膜炎，出现特殊的麻疹黏膜斑和广泛的皮肤斑丘疹。麻疹病毒主要通过呼吸道飞沫或直接接触感染者的鼻或咽喉分泌物而传播，最多见的并发症为支气管肺炎、心肌炎、喉炎及耳炎，其它可发生脑炎、亚急性硬化性全脑炎、心血管机能不全以及结核病变播散等。患者在感染麻疹病毒后可获得终生免疫力，因为机体产生抗血凝素蛋白H中和抗体。
预防麻疹流行的有效措施主要是接种麻疹疫苗。我国自1965年开始普种麻疹减毒活疫苗后麻疹发病率和病死率已明显降低，麻疹大流行得到完全控制。但是，由于人口流动增加，部分儿童麻疹疫苗漏种，或免疫失败，加之初免后随着年龄增长而免疫力逐渐降低等原因，致使麻疹小规模流行时有发生。现在我国免疫规划已将麻疹减毒活疫苗列入常规免疫程序，每年大约有数千万儿童接受免疫接种。为了更好地开展消除麻疹的工作，必须对麻疹疫苗的群体免疫效果进行评价。
评价疫苗免疫效果最可靠的方法就是检测接种者体内血清中的特异抗体的含量。抗体检测是评价某个地区群体流行病学的主要依据，也是评价某个个体对某种疾病是否达到有效保护的依据。当前市场上检测麻疹抗体的商品化试剂盒多采用酶联免疫法和化学发光法，这些方法灵敏度高、结果准确、进一步开发可以对抗体进行定量检测，抗体检测中需采用到某种相关的病原体作为抗原，而抗原的质量极大的影响到检测的结果，包括特异性及敏感性的检测结果。
目前常用的抗原多数为全病原体（病毒或细菌）或基因工程技术表达的某个蛋白片段。以全病毒作为包被抗原需要对病毒培养液进行浓缩和多步骤纯化，抗原病毒的纯化难度较大、成本较高，且全病毒抗原在酶标板上固定困难。
血凝素蛋白H含有细胞受体结核位点，可与易感细胞的特异性受体相结合，使病毒吸附在细胞表面，在病毒感染细胞过程中起重要作用，H蛋白抗体可中和病毒感染。在基因工程麻疹疫苗研制中，H蛋白基因、F蛋白基因是首选的病毒抗原。使用重组抗原来代替天然全病毒抗原，成本更高，且基因工程技术表达的重组麻疹病毒结构和功能蛋白片段往往抗原决定簇组分不全。另外，利用大肠杆菌原核表达、分离纯化收获的重组抗原含有大肠杆菌的其它杂蛋白，然而受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白结合产生反应而引起假阳性，这些杂蛋白容易影响到检测结果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，通过采用麻疹病毒裂解液作为包被抗原，提高现有试剂的质量。本发明所述的用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，包括：
S1、采用麻疹病毒减毒株，培养麻疹病毒液；
S2、经过超滤方法分离出所述麻疹病毒的浓缩液；
S3、在所述麻疹病毒的浓缩液中加入麻疹病毒抗原保护液，调整为麻疹病毒原液保存备用；
S4、所述麻疹病毒原液经裂解处理后，加入样品稀释液稀释，得到麻疹疫苗接种效果评价IgG抗体检测试剂。
进一步的，所述麻疹病毒抗原保护液为含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸三钠、蔗糖、叠氮钠的混合水溶液，其配方为：超纯水1 L、磷酸氢二钠45.72g、磷酸二氢钠40.624g、柠檬酸三钠8.5g、蔗糖10g、叠氮钠1g。
进一步的，所述样品稀释液为含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和叠氮钠的混合水溶液，其配方为：超纯水1L、磷酸氢二钠5.72g、磷酸二氢钠0.624g、氯化钠8.5g、PEG6000（聚乙二醇） 80g、叠氮钠0.5g。
进一步的，所述麻疹病毒浓缩液的分离方法为超滤浓缩及柱层析法或蔗糖密度区带离心，首先采用超滤法将病毒液浓缩至适宜蛋白质含量范围，超滤浓缩后的病毒液再采用柱层析法或蔗糖密度区带离心法进行纯化，纯化后取样进行蛋白质含量测定。
进一步的，S4中，所述麻疹病毒裂解处理过程为，在2000 ug/ml -4000 ug/ml蛋白质含量范围内进行病毒裂解，将纯化后的病毒液中加入裂解剂，在2℃-8℃条件下进行病毒裂解。其中，裂解剂为非离子表面活性剂Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) ，Triton X-100终浓度为0.3%、0.5%、0.7%、0.8%，裂解时间分别为为1hr、2hr、3hr、4hr，麻疹病毒液浓度范围为2000—4000ug/ml，离子强度终浓度为0.01、0.05、0.1、0.5mol/LPBS，pH7.2。
进一步的，30%的Triton X-100储备液，每100ml包括Triton X-100 28.2ml、0.1mol/L的PBS(pH7.3)或0.05mol/L的TBS(pH7.4)72.8ml；其配制方法为：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合,置37℃～40℃水浴中2～3h,使其充分溶解混匀。
本发明的有益效果是：（1）包被抗原为麻疹病毒裂解液，病毒抗原位点全面，检测结果更准确可信；（2）麻疹病毒抗原作为麻疹病毒裂解液，不需对裂解液进行进一步纯化，直接用作包被抗原，病毒裂解液的抗原位点保证了试剂反应的特异性，使得检测的结果优于用全病毒抗原和重组抗原包被的测试剂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，包括：
S1、采用麻疹病毒减毒株，培养麻疹病毒液；
S2、经过超滤方法分离出所述麻疹病毒的浓缩液，其中，麻疹病毒浓缩液的分离方法为超滤浓缩及柱层析法或蔗糖密度区带离心，首先采用超滤法将病毒液浓缩至适宜蛋白质含量范围，超滤浓缩后的病毒液再采用柱层析法或蔗糖密度区带离心法进行纯化，纯化后取样进行蛋白质含量测定。
S3、在所述麻疹病毒的浓缩液中加入麻疹病毒抗原保护液，调整为麻疹病毒原液保存备用，其中，麻疹病毒抗原保护液为含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸三钠、蔗糖、叠氮钠的混合水溶液，其配方为：超纯水1 L、磷酸氢二钠45.72g、磷酸二氢钠40.624g、柠檬酸三钠8.5g、蔗糖10g、叠氮钠1g。
S4、所述麻疹病毒原液经裂解处理后，加入样品稀释液稀释，得到麻疹疫苗接种效果评价IgG抗体检测试剂，其中样品稀释液为含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和叠氮钠的混合水溶液，其配方为：超纯水1L、磷酸氢二钠5.72g、磷酸二氢钠0.624g、氯化钠8.5g、PEG6000 80g、叠氮钠0.5g。麻疹病毒裂解处理过程为，在2000 ug/ml -4000 ug/ml蛋白质含量范围内进行病毒裂解，将纯化后的病毒液中加入裂解剂，在2℃-8℃条件下进行病毒裂解。其中，裂解剂为非离子表面活性剂Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) ，Triton X-100终浓度为0.3%、0.5%、0.7%、0.8%，裂解时间分别为1hr、2hr、3hr、4hr，麻疹病毒液浓度范围为2000—4000ug/ml，离子强度终浓度为0.01、0.05、0.1、0.5mol/LPBS，pH7.2。
30%的Triton X-100储备液，每100ml包括Triton X-100 28.2ml、0.1mol/L 的PBS(pH7.3)或0.05mol/L的TBS(pH7.4)72.8ml；其配制方法为：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合,置37℃～40℃水浴中2～3h,使其充分溶解混匀。
本发明方法的具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，其特征在于，包括：
S1、采用麻疹病毒减毒株，培养麻疹病毒液；
S2、经过超滤方法分离出所述麻疹病毒的浓缩液；
S3、在所述麻疹病毒的浓缩液中加入麻疹病毒抗原保护液，调整为麻疹病毒原液保存备用；
S4、所述麻疹病毒原液经裂解处理后，加入样品稀释液稀释，得到麻疹病毒裂解液，用作包被抗原生产酶联抗体检测。
2.根据权利要求1中所述的用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，其特征在于，所述麻疹病毒抗原保护液为含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸三钠、蔗糖、叠氮钠的混合水溶液，其配方为：超纯水1 L、磷酸氢二钠45.72g、磷酸二氢钠40.624g、柠檬酸三钠8.5g、蔗糖10g、叠氮钠1g。
3.根据权利要求1中所述的用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，其特征在于，所述样品稀释液为含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和叠氮钠的混合水溶液，其配方为：超纯水1L、磷酸氢二钠5.72g、磷酸二氢钠0.624g、氯化钠8.5g、PEG6000 80g、叠氮钠0.5g。
4.根据权利要求1中所述的用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，其特征在于，所述麻疹病毒浓缩液的分离制备方法为超滤浓缩或蔗糖密度区带离心，采用超滤法将病毒液浓缩，或采用蔗糖密度区带离心法进行纯化，纯化后取样进行蛋白质含量测定。
5.根据权利要求1中所述的进一步的用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，其特征在于，所述S4中，所述麻疹病毒裂解处理过程为，在2000 ug/ml -4000 ug/ml蛋白质含量范围内进行病毒裂解，将纯化后的病毒液中加入终浓度为0.3%、0.5%、0.7%、0.8%的Triton X-100裂解剂，在2℃-8℃条件下进行病毒裂解。
6.根据权利要求5中所述的用作酶联试剂盒包被抗原的麻疹病毒裂解液的制备方法，其特征在于，裂解剂为非离子表面活性剂Triton X-100，所述Triton X-100终浓度为0.3%、0.5%、0.7%、0.8%时，裂解时间分别为1hr、2hr、3hr、4hr，所述麻疹病毒液浓度范围为2000—4000ug/ml。
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