JP2004510744A - ワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は特に、鼻腔内送達用のワクチン製剤の製造における、分割(split)エンベロープウイルス調製物(分割インフルエンザウイルス調製物ではない)を含むワクチン製剤、そのようなワクチン製剤の製造方法、ならびに疾病の予防または治療における前記ワクチンの使用に関する。
Description
【0001】
本発明は、新規なワクチン製剤、該ワクチンの製造方法、ならびに疾患の予防または治療における該ワクチンの使用に関する。特に、本発明は、分割(split)エンベロープウイルス調製物を含むワクチンに関する。
【0002】
エンベロープウイルスとは、ウイルスのコアが脂質に富んだ外膜で覆われているウイルスのことであり、その外膜にはウイルスタンパク質が含まれている。
【0003】
特定の実施形態において、本発明のワクチン製剤の分割エンベロープウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス(Respiratory Syncitial Virus: RSV)に由来するものである。エンベロープウイルスによる感染の危険性を、RSVを例にとって説明する。
【0004】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)はパラミクソウイルス科のメンバーで、特に乳幼児において、下部気道疾患を引き起こす。最近の報告によれば、RSVは成人、特に初老の人々にとっても重大な病原体となることが示唆される。
【0005】
RSVは、11のメッセンジャーRNA(それぞれが単一のポリペプチドをコードしている)をコードする15,222ヌクレオチドの非分節(−)鎖リボ核酸(RNA)ゲノムをもつエンベロープウイルスである。11のタンパク質のうち3つは膜貫通表面タンパク質、すなわち、Gタンパク質(付着)、Fタンパク質(融合)およびSHタンパク質である。1つのタンパク質はビリオン基質タンパク質(M)であり、3つのタンパク質はヌクレオキャプシドの成分(N、PおよびL)であり、そして2つのタンパク質は非構造タンパク質(NS1およびNS2)である。さらに2つのタンパク質M2−1およびM2−2が存在する。RSVには抗原的に区別される2つのサブグループがあり、サブグループAおよびBと呼ばれている。これらサブグループのウイルス株の特性を調べたところ、大きな差異はGタンパク質にあって、Fタンパク質は保存されていることがわかった。
【0006】
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)はある季節に限って突然発生し、温帯では冬に、熱帯では雨期にピークとなる。
【0007】
小児では、重症の下部気道疾患の主な原因がRSVである。細気管支炎で入院している子供の40〜50%、肺炎で入院している子供の25%は、RSV感染が直接の原因で入院していると推定される。通常、一次RSV感染には1才未満の乳児がかかり、2才までに95%の子供が過去に感染したという血清学的証拠を有し、成人になると100%の集団がそうである。
【0008】
乳幼児においては、感染が約40%の症例で上部気道から下部気道へと進行しており、その臨床的徴候は細気管支炎または肺炎のそれである。2ヶ月から6ヶ月までの乳児は重症のRSV感染症(主として、呼吸不全)を発症する危険が最も高い。しかし、心臓や肺の病気をかかえている子供(年齢を問わない)、早産児、および免疫無防備状態の幼児も同様に重大な合併症を起こす危険がある。
【0009】
症状を呈する再感染が生涯を通じて起こり、RSVは成人(特に初老の人)でも重要な病原体となることが次第に明らかになってきた。
【0010】
RSV感染はほとんど必ずといっていいほど成人では過小診断されており、このことは、一部には、RSV感染が子供の病気であると考えられていることによる。その結果、成人では、呼吸器疾患の原因を究明する目的でこのウイルスの証拠が捜し求められることはない。さらに、大多数の成人がそうであるように、このウイルスに対してある程度の部分免疫をもつ個人から採取された鼻腔分泌物中にRSVを見つけ出すことは困難である。若者から中年までの成人は一般的に、RSVに感染すると、長引く風邪に似た症状を呈する。中年を過ぎた人々は、インフルエンザと事実上区別がつかない長期の呼吸器症候群を発症する可能性があり、これは肺炎をはじめとする下部気道症状を伴うことのある上部気道症状を呈する。施設に入所している初老の人々にとっては特に重大である。なんとなれば、彼らは感染しやすい多くの個体が一団となって生活しているからである。そのような集団(その多くは複数の医学的問題を抱えており、こうしたことがこの病気の経過をより重症にする可能性がある)の中で感染の広がりをくい止めるのは容易ではない。
【0011】
さらに、成人および集団で生活している健康な初老の人々が入院する原因としてRSV感染の影響を調べている最近の研究によれば、こうした集団での重症の下部気道疾患におけるRSV感染の重大な役割が指摘されている。RSVは、成人を結果的に入院させることとなる重症の下部気道疾患を引き起こす、最も一般的な4種の病原体のうちの1つとなっている。また、初老の人々における重症のRSV感染は養護施設や突発的状況に限らないことも実証されている。それどころか、RSV感染は集団で居住している初老の人々においては重症疾患の予測可能な原因となる。インフルエンザAによる入院と同様に、RSV感染に関係した入院は、長期の病院滞在によって証明されるように、かなりの死亡率、高い集中治療室での入院率、および高い人工呼吸器装着率と関係している。
【0012】
これらの研究は、特に乳幼児、成人、および集団生活をしている健康な人と施設に入所している初老の人の双方において、RSV感染の重大な合併症を予防することができる有効なワクチンが医療上および経済上必要であることを示している。
【0013】
同様の危険性が他のエンベロープウイルスからも持ち上がっており、かくして、そのようなウイルスが原因で起こる感染症および疾患から効果的に防御することのニーズが依然として存在する。
【0014】
本発明は、鼻腔内送達用に製剤化されたワクチンの製造における、分割インフルエンザウイルス調製物以外の分割エンベロープウイルス調製物の使用を提供する。
【0015】
好ましくは、この調製物は製薬上許容される賦形剤を含有する。
【0016】
本発明のワクチン製剤は、分割され得るエンベロープウイルスに由来するものである。このエンベロープウイルスは、ヒトまたは動物由来のウイルスを含めて、さまざまな起源に由来するものであってよい。ウイルスが例えばウシ由来のようにヒト以外に由来するものである場合は、そのウイルスを組換えウイルスとすることが好ましい。
【0017】
本発明のワクチン製剤は、好ましくは、送達後に該エンベロープウイルスに対する防御免疫応答を刺激することができるものである。
【0018】
本発明において、ウイルスとしては、以下に例示されるがこれらに限定されないあらゆるエンベロープウイルスが含まれる(ただし、インフルエンザウイルスを除く):
1) パラミクソウイルス科、例えば、呼吸器合胞体ウイルス(AおよびB)、パラインフルエンザウイルス(PIV−3など)、メタニューモウイルス(metapneumovirus)、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス;
2) ヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス;
3) フラビウイルス、例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス;
4) トガウイルス、例えば、風疹ウイルス、東部、西部およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス;および
5) レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス。
【0019】
本発明のワクチン製剤は2種以上の分割ウイルス調製物を含んでいてもよい。
【0020】
本発明のワクチン製剤は、疾病に対する更なる保護を与えるため、病原体由来の1種以上の抗原を分割調製物と組み合わせて含むことができる。適当な抗原は、分割調製物に由来する必要はなく、例えば、上に挙げたウイルスおよび肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)のような呼吸器疾患を引き起こす病原体に由来する抗原が含まれる。
【0021】
ウイルスを分割するには、感染性(野生型もしくは弱毒化された)または非感染性(例えば、不活化された)全ウイルス粒子を、一般的には(必ずしもそうではないが)界面活性剤からなる分割剤(splitting agent)を破砕濃度で用いて破砕または断片化することにより行う。分割されるウイルスは、2種以上の異なるウイルス由来の免疫原性エレメントをもつキメラな組換えウイルスであってもよい。こうした破砕により、ウイルスの完全性(integrity)を変えるような、あらゆるウイルスタンパク質の完全なまたは部分的な可溶化が起こる。
【0022】
好ましくは、分割ウイルスは、本発明に従ってウイルスに分割剤を接触させてウイルスのエンベロープを完全に破砕することにより得られる。他のウイルスタンパク質も完全にまたは部分的に可溶化されることが好ましい。分割した後ではウイルスの完全性が失われて、そのウイルスは非感染性になるが、このことは適当なin vitroタイトレーションアッセイで評価することができる。いったん破砕されると、一般的に、ウイルスのエンベロープタンパク質はインタクトな全ウイルス粒子とはもはや会合しない。好ましくは、他のウイルスタンパク質も完全にまたは部分的に可溶化され、したがって、分割した後ではインタクトな全ウイルス粒子とは会合しないか、部分的にしか会合しない。
【0023】
分割剤がウイルスエンベロープおよびウイルスタンパク質に及ぼす効果は、本明細書に記載するような、分割したウイルスおよびウイルスタンパク質のショ糖クッション実験での移動と、ウェスタンブロット分析および電子顕微鏡検査による可視化によって追跡することができる。
【0024】
本発明による分割(スプリット)ワクチンの調製には、分割剤とウイルス脂質分の一部または大部分を除去する追加のステップが含まれていてもよい。さらに、分割エンベロープウイルスの調製方法は、いくつかの異なる濾過および/またはその他の分離ステップ、例えば、超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離、およびクロマトグラフィーの各ステップを様々に組み合わせて含んでいてもよく、場合により、分割の前または後に不活化ステップを、例えばホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンまたはUV処理を用いて、行ってもよい。分割方法はバッチ法、連続法または半連続法として実施することができる。
【0025】
本発明による分割(スプリット)ワクチンは、一般的には、膜断片および膜エンベロープタンパク質、ならびにウイルス基質タンパク質や核タンパク質のような非膜タンパク質を、重大な意味をもつ全ウイルス粒子を存在させないで、含有する。本発明の分割ワクチンは通常、ウイルス構造タンパク質の大半または全部を含んでいるが、それらは必ずしも全ウイルス粒子中に存在するときと同じ割合ではない。好適な分割ウイルス調製物はウイルス構造タンパク質の少なくとも半分、好ましくは全部を含んでいる。一方、サブユニットワクチンは本質的に1種または2,3種の高度に精製されたウイルスタンパク質からなるものである。例えば、サブユニットワクチンは、ワクチン接種後に所望のウイルス中和抗体の誘導に関与することがわかっている精製されたウイルス表面タンパク質を含有する。
【0026】
本発明においては、非イオン性およびイオン性の界面活性剤だけでなく、その他の各種試薬も分割剤として使用することができる。本発明のもとで有用な分割剤の例としては、次のものを挙げることができる:
1.胆汁酸およびその誘導体。胆汁酸には、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および前記胆汁酸のグリコ−、タウロ−、アミドプロピル−1−プロパンスルホン酸−、アミドプロピル−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸誘導体、またはN,N−ビス(3Dグルコノアミドプロピル)デオキシコールアミドのような誘導体が含まれる。具体的な例はデオキシコール酸ナトリウム(NaDOC)である;
【0027】
2.非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノール類(TritonTM系列)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80TM)などのポリオキシエチレンエーテル類、および一般式(I):
(I) HO(CH2CH2O)n−A−R
[式中、nは1〜50であり、Aは結合または−C(O)−であり、RはC1−50アルキルまたはフェニルC1−50アルキルである]
で表されるポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル類、ならびにこれらの2種以上の組合せ。具体的な例はTween 80TM、Triton X−100TM、およびラウレス9である;
【0028】
3.アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシド、ここで、アルキル鎖はC6〜C18、典型的にはC8〜C14であり、糖部分は任意のペントースもしくはヘキソース、または異なる結合(例えば、1→6、1→5、1→4、1→3、1−2)を有するそれらの組合せである。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい;
【0029】
4.上記3の誘導体、ここで、1個以上のヒドロキシル基、好ましくは6ヒドロキシル基が修飾されており、例えば、エステル、エトキシレート、スルフェート、エーテル、カーボネート、スルホスクシネート、イセチオネート、エーテルカルボキシレート、第4級アンモニウム化合物などに修飾される;
【0030】
5.アシル糖、ここで、アルキル鎖はC6〜C18、典型的にはC8〜C12であり、糖部分は任意のペントースもしくはヘキソース、または異なる結合(例えば、1→6、1→5、1→4、1→3、1−2)を有するそれらの組合せである。アシル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい;
【0031】
6.構造R−N,N−(R1,R2)−3−アミノ−1−プロパンスルホネートのスルホベタイン類、ここで、RはC6〜C18、典型的にはC8〜C16のアルキル鎖またはアリールアルキル鎖である。アルキル鎖Rは飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい。R1およびR2はC1〜C4、典型的にはC1のアルキル鎖である;
【0032】
7.構造R−N,N−(R1,R2)−グリシンのベタイン類、ここで、RはC6〜C18、典型的にはC8〜C16のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい。R1およびR2はC1〜C4、典型的にはC1のアルキル鎖である;
【0033】
8.構造R−(−O−CH2−CH2−)n−OHのポリオキシエチレンアルキルエーテル、ここで、RはC6〜C20、典型的にはC8〜C14のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい。nは5〜30、典型的には8〜25である;
【0034】
9.構造R−(N−R1)−グルカミドのN,N−ジアルキル−グルカミド、ここで、RはC6〜C18、典型的にはC8〜C12のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐でも環状でもよい。R1およびR2はC1〜C6、典型的にはC1のアルキル鎖である。糖部分はペントースまたはヘキソースで修飾されていてもよい;
【0035】
10.Hecameg:(6−O−(N−ヘプチル−カルバモイル)−メチル−α−D−グルコピラノシド);
【0036】
11.構造R−C6H4−O−(−CH2−CH2−)n−OHのアルキルフェノキシポリエトキシエタノール、ここで、RはC6〜C18、典型的にはC8のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい(n>=3);
【0037】
12.構造R,−N+(−R1,−R2,−R3)の第4級アンモニウム化合物、ここで、RはC6〜C20、典型的にはC20のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい。R1、R2およびR3はC1〜C4、典型的にはC1のアルキル鎖である;
【0038】
13.サルコシル(Sarcosyl):N−ラウリルサルコシンNa塩;
【0039】
14.CTAB(臭化セチルトリメチルアンモニウム)またはセタブロン(Cetavlon)。
【0040】
最も好ましいものはNaDOCとサルコシルである。分割を行うために、適切には、分割剤を室温で、例えば一夜、分割すべきウイルスとインキュベートする。適宜、分割剤を組み合わせて用いてもよい。
【0041】
分割ワクチン調製物は、好ましくは、少なくとも1種の界面活性剤(特に、非イオン性界面活性剤でありうる)を含有する。その1種以上の界面活性剤は分割方法からの残留物であってよく、かつ/または分割した後でウイルスに添加してもよい。分割された抗原物質は非イオン性界面活性剤の存在下で安定化されると考えられるが、本発明が必ずそのケースに当てはまるとは限らないことが理解されよう。安定化剤として適する非イオン性界面活性剤には、オクトキシノール類(TritonTM系列)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80TM)などのポリオキシエチレンエーテル類、および一般式(I):
(I) HO(CH2CH2O)n−A−R
[式中、nは1〜50であり、Aは結合または−C(O)−であり、RはC1−50アルキルまたはフェニルC1−50アルキルである]で表されるポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル、およびこれらの2種以上の組合せが含まれる。
【0042】
Triton系列の好ましい非イオン性界面活性剤としては、Triton X−100 (t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)、Triton X−165、Triton X−205、Triton X−305、またはTriton X−405 Triton N−101が挙げられる。特に好ましいものはTriton X−100である。
【0043】
好適な非イオン性界面活性剤には、さらに、上記の一般式(I)のポリオキシエチレンエーテル、特にポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−9−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−8−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテルが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましいポリオキシエチレンエーテルはポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(ラウレス 9)である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルの別名がCAS登録に載っている。ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルのCAS登録番号は9002−92−0である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルはMerck index(12版:エントリー7717、Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910−12−3)に記載されている。ラウレス 9はエチレンオキシドをドデシルアルコールと反応させることにより形成され、平均9個のエチレンオキシド単位をもっている。
【0044】
最終ワクチン製剤に含まれる安定化用界面活性剤の最終濃度は0.001〜20%の範囲、より好ましくは0.01〜10%、最も好ましくは約2%(w/v)までである。1種以上の界面活性剤が存在する場合、これらは一般的に最終製剤中にそれぞれが約2%までの濃度で存在し、通常はそれぞれが約1%までの濃度、好ましくはそれぞれが約0.6%までの濃度、より好ましくはそれぞれが約0.2%または0.1%までの微量で存在する。本発明のワクチン製剤には界面活性剤の任意の混合物を存在させることができる。
【0045】
エンベロープウイルスは、血清または無血清法により適当な細胞基体上で複製させることにより生産することができる。組織培養で増えるウイルスは、例えば、MRC−5、WI−38、HEp−2などのヒト細胞、AGMK、Vero、LLc−Mk2、LLc−Mk2、FRhL、FRhL−2などのサル細胞、MDBKなどのウシ細胞、MDCKなどのイヌ細胞、ニワトリ胚性繊維芽細胞などの一次細胞、またはワクチン用ウイルスの生産に適する他の細胞タイプ(上記の細胞系に由来するクローンを含む)で生産することができる。
【0046】
分割ワクチン調製物は、製薬上許容される賦形剤と組み合わせることが好ましい。使用する製薬上許容される賦形剤は、ワクチン製造の分野で慣用のものであってよい。所与のワクチン製剤で用いる賦形剤は、互いに適合性で、しかも組成物の必須成分とも適合するものである。そして、諸成分の性能、もし存在するのであれば活性物質の性能、を損なうような相互作用がまったく起こらないようにする。当然、賦形剤はすべて無毒性で、ヒトに使用するのに十分な純度のものでなければならない。適当な賦形剤の例は当技術分野で周知である。
【0047】
ワクチン製剤はまた、キャリアーおよび/または免疫刺激剤でありうるアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは分割方法からの残存物であっても、かつ/または分割した後でウイルスに添加してもよい。本発明のワクチンで使用するのに適したアジュバントは当技術分野で周知である。
【0048】
かくして、本発明のさらなる態様は、鼻腔内送達用のワクチン製剤の製造における、アジュバントと組み合わせた、分割エンベロープウイルス調製物(分割インフルエンザウイルス調製物ではない)の使用を提供する。好ましくは、この調製物は製薬上許容される賦形剤を含有する。
【0049】
本発明のワクチン製剤は、該ワクチンを鼻腔経路で投与することによって、疾病にかかりやすい、または該疾病にかかっている哺乳動物を保護または治療するために使用することができる。本発明はそのような治療および保護方法にも及ぶものである。
【0050】
痛みを伴う注射の必要性や、それに関連した「針への恐怖」ゆえの患者の応諾に与えるマイナスの影響を回避できることを別にしても、鼻腔内法などによる粘膜へのワクチン接種には興味がもてる。その理由は、動物では、抗原の粘膜投与が多くの病原体の侵入経路である粘膜表面において防御応答を効率よく引き出せるとわかったからである。さらに、鼻腔内ワクチン接種のような粘膜ワクチン接種は、鼻粘膜だけでなく生殖器粘膜などの離れた粘膜部位でも粘膜免疫を引き出しうることが提起されている。この分野での多くの研究にもかかわらず、ヒトへの使用に適した鼻腔内送達用の安全かつ有効なワクチンはまだ確認されていない。
【0051】
本発明に従う鼻腔内投与は、液滴、スプレーまたは乾燥粉末形態で行うことができる。ネブライザー投与またはエーロゾル投与が可能なワクチン製剤も本発明の一部を構成する。
【0052】
適当なアジュバントはどれも、適切な形態(溶液、非小胞性の溶液、懸濁液、粉末など)で本発明において使用することができる。好ましいアジュバントとしては国際公開WO 99/52549に例示されているものがあり、この文献の全内容を参照により本明細書に含めるものとする。好適なアジュバントには、Tween 80TM、Triton X−100TM、ラウレス 9およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限らない。
【0053】
非イオン性界面活性剤はリピドAの無毒性誘導体のような免疫刺激剤と組み合わせることが有利であり、かかるリピドA誘導体としては、モノホスホリルおよびジホスホリルリピドAの無毒性誘導体、例えば、3−脱−O−アシル化モノホスホリルリピドA(3D−MPL)および3−脱−O−アシル化ジホスホリルリピドAを含めて、米国特許第4,912,094号および英国特許第2,220,211号に記載されるものが含まれる。好ましい組合せは3D−MPLと組み合わせたラウレス−9である。上記の免疫刺激剤は非イオン性界面活性剤を含まない製剤にも適宜使用することができる。
【0054】
3D−MPLの好ましい形態は、直径が0.2μmより小さい粒子サイズを有する乳剤の形をしており、その製造方法はWO 94/21292に記載されている。モノホスホリルリピドAと界面活性剤を含む水性配合物がWO 9843670A2に記載されている。
【0055】
本発明の組成物中に処方される細菌性リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製して加工処理を施すことができるが、また、それらを合成することもできる。例えば、精製されたモノホスホリルリピドAはRibiら1986(1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407−419)に記載され、Salmonella sp.由来の3−O−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドAは英国特許第2,220,211号および米国特許第4,912,094号に記載されている。その他の精製されたおよび合成のリポ多糖類もすでに記載されている(Hilgersら、1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392−6; Hilgersら、1987, Immunology, 60(1):141−6; およびヨーロッパ特許第0 549 074 B1)。特に好ましい細菌性リポ多糖アジュバントは3D−MPLである。
【0056】
したがって、本発明において使用できるLPS誘導体は、構造がLPSまたはMPLまたは3D−MPLの構造と類似している免疫刺激剤である。本発明の別の態様において、LPS誘導体はアシル化単糖であってよく、これはMPLの上記構造の下位部分である。
【0057】
本発明のさらなる実施形態において、アジュバントはADP−リボシル化トキシンまたはその突然変異体である。かかるトキシンの例として、大腸菌由来のHeat Labile Toxin (LT)、その突然変異体(例えばLTR192G)、およびこれらのトキシンの断片(例えばガングリオシド結合性成分(LTB))がある。
【0058】
その他の好適なアジュバントとして、QS21のようなサポニンアジュバントが挙げられる。
【0059】
ある促進系は、無毒性のリピドA誘導体とサポニン誘導体の組合せ、特にWO94/00153に記載されるようなQS21と3D−MPLの組合せ、またはWO 96/33739に記載されるようなQS21がコレステロールで抑えられている、比較的反応性の低い組成物を含む。
【0060】
本発明のワクチンを鼻腔内に投与するのに適した装置はスプレー装置である。好適な鼻スプレー装置はBecton Dickinson、Pfeiffer GmBHおよびValoisから販売されている。
【0061】
鼻腔内使用に適したスプレー装置は、その性能が使用者によって加えられる圧力に左右されないものである。圧閾値(pressure threshold)装置が特に有用である。なぜなら、閾値圧に達したときだけノズルから液体が放出されるからである。こうした装置によって、液滴の大きさが一定している噴霧を容易に達成することができる。本発明とともに使用するのに適した圧閾値装置は当技術分野で公知であり、例えば、WO 91/13281およびヨーロッパ特許第311 863 B号に記載されている。現在、かかる装置はPfeiffer GmBHから市販されており、また、Bommer, R. Advances in Nasal drug delivery Technology, Pharmaceutical Technology Europe, September 1999, p26−33にも記載されている。
【0062】
好ましい鼻腔内装置は1〜500μmの範囲の液滴(液体として水を用いて測定)をもたらすものである。10μmより小さいと吸い込む危険があるため、10μm未満の液滴を約5%以下にすることが望ましい。
【0063】
本発明のワクチンとともに使用するのにさらに好ましい鼻腔内送達系の特徴は2用量(bi−dose)送達である。2用量装置は、それぞれの鼻孔に投与するために、1回のワクチン量を2つの小用量に分けて含有するものである。
【0064】
本発明はまた、本発明の分割ワクチン製剤を含む鼻腔内送達装置を提供する。
【0065】
本発明は、さらなる態様において、本明細書に記載する鼻腔内投与装置を含んでなるか、または、鼻腔内投与装置および該装置とともに使用する別のワクチン製剤を含んでなる医薬キットを提供する。
【0066】
本発明のこの態様は、必ずしも液体製剤のスプレー送達に限らない。本発明のワクチンは他の形態で投与することもでき、例えば粉末として投与してもよい。
【0067】
本発明のワクチン製剤は予防と治療の両目的に使用することができる。したがって、本発明は、感染症にかかりやすい、またはかかっている哺乳動物を保護または治療する方法を提供する。本発明の別の態様では、医療に使用するための本明細書に記載されるワクチンを提供する。ワクチン製剤については、New Trends and Developments in Vaccines, Vollerら編, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に概説されている。
【0068】
ワクチンは適切な投与計画、例えば1回量または2回量の投与計画、で送達することができる。ワクチンはナイーブ集団と感作集団、すなわち、セロネガティブ(血清反応陰性)個体とセロポジティブ(血清反応陽性)個体に使用することが可能である。
【0069】
本発明では、より好ましくは、ワクチン製剤がアジュバントを含有し、かつ/または該製剤がウイルスへの曝露によってすでに感作された個体に投与される。
【0070】
本発明はさらに、ワクチン製剤の製造方法であって、
(a) エンベロープウイルスを分割すること、
(b) 場合により、分割したエンベロープウイルス調製物を安定化剤と混合すること、
(c) 場合により、分割したエンベロープウイルス調製物をアジュバント(該アジュバントはキャリアーおよび/または免疫刺激剤でありうる)と混合すること、
を含んでなる上記方法に関する。
【0071】
好ましくは、上記方法はステップ(a)および(b)、ステップ(a)および(c)、またはステップ(a)、(b)および(c)を含んでなる。好ましくは、安定化剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN 80TM)、t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(TRITON X100TM)、およびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルからなる群より選択される少なくとも1種の界面活性剤を含有する。
【0072】
必要に応じて、この方法で製造したワクチンを適当なキャリアーと混合する。
【0073】
本発明はまた、エンベロープウイルスを適当な分割剤で処理することを含む、本明細書に記載するエンベロープウイルスの分割方法に関する。
【0074】
本発明について以下の図面および実施例を用いて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0075】
実施例1. 分割ウイルスの作製
種々のウイルス科に属するエンベロープウイルスを界面活性剤などの分割剤の添加により分割した。この分割を評価するには、ショ糖勾配またはショ糖クッションでの分割ウイルスの移動とSDS−PAGE分析による可視化により特徴づけし、また、分割ウイルス産物を電子顕微鏡で直接検査する。
【0076】
この実施例に記載する分割ウイルスには、様々なエンベロープウイルス科の代表的なウイルスが含まれている。例えば、パラミクソウイルス科(呼吸器合胞体ウイルスAおよびB、パラインフルエンザウイルス−3、流行性耳下腺炎ウイルス、および麻疹ウイルス)、トガウイルス科(風疹ウイルス)、およびヘルペスウイルス科(エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、または単純ヘルペスウイルス)のメンバーについて検討する。
【0077】
ウイルス粒子を破砕(分割)するには、無細胞ウイルス調製物に可溶化濃度の界面活性剤のような分割剤を添加する。特に、界面活性剤として胆汁酸やアルキルグリコシドを使用する。界面活性剤を単独でまたは各種組み合わせて添加し、インキュベートしてこの方法を完結させる。
【0078】
効果的に分割されたかを評価するには、初めに、ショ糖勾配またはクッションによる遠心分離を行う。簡単に述べると、界面活性剤で処理したサンプルと未処理のサンプルをショ糖勾配/クッション遠心分離にかけ、画分をSDS−PAGEゲルで分析する。可溶性画分中のあらゆるタイプのウイルス粒子タンパク質が移動することで、効果的に分割されたことがわかる。ショ糖−SDS−PAGE分析で効果的に分割されたと思われるサンプルを電子顕微鏡検査でさらに分析する。サンプルは標準的な陰性染色法を用いて可視化する。
【0079】
RSV、HSVおよびPIVに対して以下の具体的な分割実験を実施した。
【0080】
1.1 細胞培養条件
ヒト野生型RSV/A/LongおよびPIV−3を、定常的無血清法でVERO細胞内にて複製させた。感染に先立って、VERO細胞を集密状態になるまで4日間増殖させた。各ウイルスに次のウイルス生産条件を適合させた:RSV/Aに対してはMOI 0.03、4日間、HSV2に対してはMOI 0.001、35℃で3日間、PIV−3に対してはMOI 0.01、37℃で5日間。収穫日に、細胞を溶解し、安定化剤を添加した後で細胞溶解液を回収し、直ちに−70℃で保存した。
【0081】
1.2 ウイルスの精製
1,000×gで10分間遠心分離して清澄化した後、PEG6000沈澱により上清からウイルス粒子をペレット化した。このペレットをTris 50mM−NaCl 50mM−MgSO4 2mM pH7.5バッファー中に懸濁し、続いてベンゾナーゼ処理を行った。この溶液を500kD AGT膜で5倍容量のリン酸緩衝溶液に対して限外濾過し、続いて5倍容量のリン酸バッファー pH7.5に対してダイアフィルトレーションを実施した。
【0082】
インタクトなウイルス粒子が生産され、本明細書に記載する電子顕微鏡検査(EM)およびショ糖クッションでの遠心分離により確認された。タンパク質の濃度を測定した。
【0083】
1.3 ウイルスの分割
無細胞ウイルス調製物に分割剤を添加してウイルス粒子を分割した。
【0084】
分割を有効なものとするためには、界面活性剤をその臨界ミセル濃度(cmc)より高い濃度で使用する必要がある。全ての界面活性剤はそのcmc濃度より高い最終濃度で使用した。D/P比(界面活性剤/タンパク質比)を検討した。D/P比≧25のときに分割がうまくいった。D/P比は25以上とすることが好ましい。
【0085】
次の界面活性剤を2%の濃度で使用してウイルス粒子を分割した:デオキシコール酸ナトリウム、サルコシル、プランタケア(Plantacare)およびラウレス9。
【0086】
分割後、この溶液を処方用バッファー(PO4 10mM/NaCl 150mM pH7.5)に対して透析して過剰の界面活性剤を除いた。
【0087】
例として、RSVについての分割方法を以下にまとめて記載する。
【0088】
【0089】
1.4 分割ウイルスの特徴づけ
出発ウイルスの完全性および分割の質を30%ショ糖クッションでの超遠心分離(TL100 Beckmanローターを使って50,000rpmで1時間)により判定した。画分を特異的なウェスタンブロットアッセイと電子顕微鏡検査により分析し、これらの画分の一部に対して感染力のタイトレーションを行った。
【0090】
1.4.1 超遠心分離
遠心チューブに30%ショ糖溶液(450μl)を半分まで満たした後、分析すべきサンプル(450μl)をこのショ糖クッションの上に穏やかにかつ慎重に載せ、その後Beckman TL100ローターで50,000rpm、+4℃にて1時間、遠心分離を実施した。遠心分離後、チューブを3つの部分に分けてドレインした。上部相(300μl)を「上清」と呼ぶ。中間相(300μl)はサンプルとショ糖クッションとの境界相であり、ここでは「中間」と呼ぶ。下部相(300μl)は完全なウイルスに対して遠心分離を行ったときの再懸濁ペレットを含むボトム液であり、ここでは「ペレット」と呼ぶ。
これら3つの画分をさらに分析した。
【0091】
1.4.2 ウェスタンブロット分析
この分析によりウイルスの完全性を調べることができ(ペレット画分が陽性)、また、分割の効力を判定することができる(好ましくは、エンベロープタンパク質のような構造タンパク質の全部または大部分について上清画分が陽性)。
【0092】
特定のウイルスタンパク質を特徴づけるために特異的抗体を使用した。
【0093】
RSV−Aの場合は、非分割および分割画分を、抗Fタンパク質(表面タンパク質)、抗Gタンパク質(表面タンパク質)、抗Nタンパク質(ヌクレオキャプシド)、および抗Mタンパク質(基質)含量について分析した。
【0094】
PIV−3の場合は、非分割および分割画分を、そのHNタンパク質含量についてモノクローナル抗体を用いて、またF、M、HNタンパク質含量についてはポリクローナル抗体を用いて分析した。
【0095】
HSVの場合は、非分割および分割画分を、そのGタンパク質、外皮タンパク質およびキャプシドタンパク質について抗体を用いて分析した。
【0096】
分割の基準
分割を行う前のペレット画分中に試験した4種全てのタンパク質に対する陽性のウェスタンブロット(WB)シグナルが存在し、かつ他の2つの画分中にシグナルが存在しなければ、そのウイルス調製物にはインタクトな完全ウイルスが含まれていることとなる。
【0097】
エンベロープが破砕され、かつエンベロープタンパク質が上清および/または中間画分に検出されたとき、その分割は有効であると見なした。RSVの場合は、例えばFまたはGがSまたはM画分において検出されたときに、分割は有効であるとした。好ましくは、FおよびGは実質的にSおよび/またはM層に検出されて、ペレットには検出されない。
【0098】
結果のまとめ
RSVAについての結果を図1〜4に示す。
全てのウェスタンブロットの結果において、「Split−O」は分割する前のウイルスを意味する。「S」、「M」および「P」は、それぞれ、ショ糖クッションでのサンプルの超遠心分離後に取得された「上清」、「中間」および「ペレット」画分をさす。レーンは左から右へ番号を付けた。容量はSDS−PAGEゲル上に載せたサンプル量をさす。
【0099】
図1は、mAb B4(抗F)でプローブした分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
上のパネル:
下のパネル:
【0100】
図2は、抗Mモノクローナル抗体でプローブした分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
上のパネル:
下のパネル:
【0101】
図3は、抗Gモノクローナル抗体でプローブした分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
上のパネル:
下のパネル:
【0102】
図4は、抗Nモノクローナル抗体でプローブした分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
上のパネル:
下のパネル:
【0103】
FおよびGタンパク質に関して、分割後の中間および上清画分にシグナルが存在し、かつペレット画分にはバンドがほとんど存在しなければ、そのウイルスエンベロープは完全に破砕されたことになる。NおよびMタンパク質に関しては、全ての画分にシグナルが存在すれば、これらのタンパク質が分割調製物中に存在することを示す。これらの結果からは、試験した4種全ての界面活性剤がRSVAウイルスの分割をもたらすことがわかる。
【0104】
全画分における4種全てのタンパク質に対するシグナルの分析、特に中間および上清画分における分割後のNおよびMタンパク質に対する比較可能なシグナルの分析から、試験した条件において、NaDOCとサルコシルはウイルスの分割をもたらすだけでなく、全てのウイルス構造を破壊して構造および非構造タンパク質を可溶化することができることがわかる。
【0105】
同様の結果がPIV、HSVおよび麻疹ウイルスの分割の場合にも得られ、これらのウイルスは例えば2%のNaDOCまたはサルコシルを用いてうまく分割される。
【0106】
NaDOCとサルコシルは全てのウイルスに使える好適な分割剤である。
【0107】
1.5 in vitro ウイルスタイトレーション
分割後にウイルスの完全性が失われることから、そのウイルスは非感染性となる。成功したウイルス破砕の分析は、分割後のウイルス力価が106logまたはそれ以上低下することにより示される。
【0108】
1.6 電子顕微鏡検査 (EM) による分析
電子顕微鏡検査による分析は、コントラスト剤としてホスホタングステン酸Naを用いて標準的な2段階陰性染色法により行った(HayatおよびMiller, 1990, Negative Staining, McGraw, Hill編)。グリッド(格子)を検査して、この材料の分割パターンを評価した。
【0109】
非分割ウイルス調製物と、NaDOCまたはサルコシルで分割したRSVA、HSV2およびPIV3ウイルス調製物の電子顕微鏡検査による分析は、ウェスタンブロット分析で得られた観察を支持するものである。結果を示すために、RSV、HSVおよびPIVのデータを示す。
【0110】
図5は、EMにより可視化されたRSV/A出発材料を示す。図6は、NaDOCで分割した後のRSV/Aを示す。図7は、EMにより可視化されたPIV3出発材料を示す。図8は、NaDOCで分割した後のPIV3を示す。図9は、EMにより可視化されたHSV2出発材料を示す。図10は、サルコシルで分割した後のHSV2を示す。
【0111】
非分割ウイルス(インタクトな完全ウイルス)は、比較的よく保存されたまたは軽度の損傷を受けたウイルス粒子と若干の無定形物質を含んでいた。NaDOCまたはサルコシルで分割したウイルスは、さまざまな程度に集合した無定形の物質が不均一に広がっている外観を示した。同様のデータが試験した全てのウイルスRSV、PIVおよびHSVにおいて得られた。さらに、RSVやPIVの場合には、ウイルスエンベロープまたは核タンパク質起源からの識別可能な構造体がほとんど認められなかった。
【0112】
実施例2. 分割(スプリット)ワクチンのマウスにおける免疫原性
分割したRSVおよび/またはPIV調製物をマウスにワクチン接種するための免疫原として使用して、これらの調製物の免疫原性を評価した。簡単に説明すると、8週齢の雌マウスを鼻腔内送達用の分割ワクチン調製物で免疫する。アジュバントを添加してない対照も含める。数週間の間隔で2回投与する。
【0113】
最後に投与してから2週間後に、動物を犠牲にして血液、脾細胞、および/または鼻洗浄液を採取する。マウス血清をウイルス特異的ELISAアッセイで試験することにより、血清中のウイルス特異的体液性免疫応答を評価する。さらに、抗体応答のアイソタイプ様相をアイソタイプ特異的アッセイで調べる。血清中の中和抗体の存在は、特異的なウイルス中和アッセイを用いて評価する。関連する局所免疫応答の誘導は、鼻洗浄液中の中和抗体をアッセイするか、あるいは鼻洗浄液中のウイルス特異的IgAをアッセイすることにより評価することができる。
【0114】
ウイルス特異的細胞性免疫応答の誘導は、回収した脾細胞のin vitro刺激、および細胞増殖の測定(トリチウム標識チミジンの取り込み)、および/または刺激した細胞からのIL−5およびIFNγの分泌により評価する。
【0115】
この実験における変動要因の影響は、分割(スプリット)製剤により誘発された応答の質および強さに特別の注意を払うことで評価される。
【0116】
2.1 分割 RSV 製剤
以下の一連の実験は、分割したRSVなどのウイルスが、鼻腔内(IN)経路で投与したとき、強力な免疫応答を引き出すことを示すものである。小児(ナイーブ)集団または初老(感作)集団のいずれかの免疫状態をより正確に反映させるために、感作動物または未感作動物において免疫原性を評価し、両集団での免疫原性を実証した。比較のためIM送達を加えた。
【0117】
第1セットの実験では、8週齢の雌Balb/cマウスを用いて、IMまたはIN経路で投与される分割RSV調製物の免疫原性を試験した。初回感作を行うため、3×105プラーク形成単位(pfu)の生存RSVウイルスを60μlの容量(2×30μl)で鼻腔内に投与した。初回感作から3週間後、動物にRSV分割抗原をワクチン接種した。RSV分割産物の数量化は、RSV Fタンパク質特異的ELISA(分割産物中に含まれるFタンパク質を組換えFGタンパク質標準品に対して数量化する)に基づいていた。Aグループのマウスは、100μl中に4.2μgのFタンパク質を含有するRSV分割抗原を21日間隔で2回、筋肉内経路により投与して免疫した。Bグループのマウスは、100μl中に50μgのAl(OH)3アジュバントとともに4.2μgのFタンパク質を含有するRSV分割抗原を21日間隔で2回、筋肉内経路により投与して免疫した。Cグループのマウスは、1回目として60μl中に2.7μgのFタンパク質を含有するRSV分割抗原を、21日後に2回目として60μl中に4μgのFタンパク質を含有するRSV分割抗原を鼻腔内経路により投与して免疫した。最後に投与してから2週間後に全ての動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【0118】
この実験の結果を図11〜16にまとめて示す。免疫応答を評価するために用いた最初の免疫リードアウト(read out)は、ワクチン接種動物の血清中に存在する総RSV FG特異的免疫グロブリン(Ig)またはFG特異的IgGアイソタイプ(IgG1およびIgG2A)を測定するELISAアッセイであった。これらのアッセイでは、96ウェルディッシュに組換えRSV FG抗原をコーティングし、動物の血清を連続希釈してコーティングしたウェルに加える。結合した抗体を検出するには、ビオチン化抗マウスIg、IgG1またはIgG2Aを添加し、次いでペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたストレプトアビジンで増幅する。OPDA基質を加え、続いて2N H2SO4で処理し、490nmで光学密度(OD)を測定することにより結合抗体を定量する。SoftMax Proソフトウェア(4パラメーター式を使用)から抗体力価を算出し、EU/mlで表す。
【0119】
ELISAアッセイに加えて、免疫感作によって引き出された免疫応答の質をさらに特徴づけるために中和アッセイを行った。この中和アッセイでは、動物血清の2倍希釈物を、96ウェルの組織培養ディッシュにおいて、RSV/Aウイルス(3000pfu)およびモルモット補体とともに37℃で1時間インキュベートした。各ウェルにHep−2細胞(104個/ウェル)を直接添加し、このプレートを37℃で4日間インキュベートした。上清を吸引し、各ウェルに市販のWST−1溶液を加えた。プレートを37℃でさらに18〜24時間インキュベートした。ODを450nmでモニターし、タイトレーションを直線回帰分析により分析した。力価は未感染細胞について観察された最大ODの50%減少をもたらす血清希釈率の逆数として記録した。
【0120】
図11は、総Ig ELISAリードアウトを用いて得られた結果を示す。感作マウスにおいては、分割RSV抗原を筋肉内(A、Bグループ)または鼻腔内(Cグループ)経路で2回投与してワクチン接種することにより、強力な抗FG抗体応答が誘導された。
【0121】
詳細には、図11は、生きているRSVで感作し、次に分割RSVを筋肉内(IM)または鼻腔内(IN)経路で投与して免疫したマウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Bグループにはミョウバンアジュバントを加えて4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Cグループにはそれぞれ2.7μgと4.0μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。
【0122】
図12は、中和アッセイの結果を示す。これらの感作動物においては、分割RSV産物をIMまたはINのいずれかで2回投与してワクチン接種することにより強力なウイルス中和抗体応答が誘導された。
【0123】
詳細には、図12は、生きているRSVで感作し、次に分割RSVを筋肉内(IM)または鼻腔内(IN)経路で投与して免疫したマウスにおける抗RSV/A中和抗体力価(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Bグループにはミョウバンアジュバントを加えて4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Cグループにはそれぞれ2.7μgと4.0μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。
【0124】
図13は、アイソタイプ分析の結果を示す。鼻腔内感作した動物では、IgG2a:IgG1の比が未感作マウスで得られたデータ(下記参照)と比べて増加しており、このことは、マウスが生きているウイルスで感作される(すなわち、初老集団における自然な状況)と、Th1様応答のほうに向かう傾向があることを示唆している。
【0125】
詳細には、図13は、生きているRSVで感作し、次に分割RSVを筋肉内(IM)または鼻腔内(IN)経路で投与して免疫したマウスにおける抗FG IgGアイソタイプ(ELISA)応答(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Bグループにはミョウバンアジュバントを加えて4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Cグループにはそれぞれ2.7μgと4.0μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。
【0126】
図14は、1回の抗原投与でさえ、感作集団では分割RSVによるINワクチン接種に応答して強い免疫応答が生起することを示す。したがって、感作集団において、分割RSVはINワクチン接種後に高力価の抗体応答を引き出すことができる強力な免疫原となる。
【0127】
詳細には、図14は、生きているRSVで感作し、次に分割RSVを筋肉内(IM)または鼻腔内(IN)経路で投与して免疫したマウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(1回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Bグループにはミョウバンアジュバントを加えて4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Cグループにはそれぞれ2.7μgと4.0μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。Dグループには感作のみを施して、ワクチン接種を行わなかった−このグループについて報告された抗体力価は、感作後21日目に測定したとき検出レベルより低かった。
【0128】
第2の一連の実験では、未感作マウスを用いて、抗原用量とアジュバント添加が分割RSV産物の免疫原性に及ぼす効果を立証した。マウスに1回目として2.4μgのFタンパク質を含有する分割RSV抗原(送達量60μl−2×30μl)を投与した。30日後に送達した2回目では、3.5μgのFタンパク質を含有する分割RSV抗原をマウスに投与した。分割RSVは、アジュバントを添加しないで、またはアジュバントとして5μgの大腸菌Labile Toxin (LT)を添加して、またはポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル0.5%(本明細書では「ラウレス9」)とともに投与した。対照グループは、1回目に2.0μgのFタンパク質を含有し、2回目に3.5μgのFタンパク質を含有する精製した完全RSVウイルスを鼻腔内投与して免疫した。最後のワクチン接種から2週間後に動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【0129】
図15および16に示すように、未感作マウスにおいて抗体応答がIN製剤により引き出された。ELISAリードアウト(図15)からは、INワクチン接種に対する応答がIMにより引き出される応答より低くなることが示唆されるが、中和リードアウト(図16)からは、LTアジュバントを添加した分割RSV IN製剤が、中和抗体を誘導するうえでIMと少なくとも同じくらいすぐれており、他の製剤もIMに匹敵することが示唆される。かくして、IN経路で投与された分割RSVは未感作マウスにおいても免疫原性がある。
【0130】
詳細には、図15は、分割RSVを鼻腔内(IN)または筋肉内(IM)経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループにはそれぞれ2.4μgと3.5μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。Bグループにはラウレス9アジュバントを加えてそれぞれ2.4μgと3.5μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。CグループにはLTアジュバントを加えてそれぞれ2.4μgと3.5μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。Dグループにはそれぞれ2.0μgと3.5μgの精製した完全ウイルスをIN経路で2回投与した。Eグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。
【0131】
図16は、分割RSVを鼻腔内(IN)または筋肉内(IM)経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗RSV/A中和抗体力価(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには、2回に分けてそれぞれ2.4μgと3.5μgの分割RSVをIN経路で投与した。Bグループには、ラウレス9アジュバントを加えた2.4μgと3.5μgずつの分割RSVを、2回に分けてIN経路で投与した。Cグループには、LTアジュバントを加えた2.4μgと3.5μgずつの分割RSVを、2回に分けてIN経路で投与した。Dグループには、2回に分けてそれぞれ2.0μgと3.5μgずつの精製した完全ウイルスをIN経路で投与した。Eグループには、4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。
【0132】
要約すると、これらの実験から、分割RSV抗原はナイーブ集団と感作集団の両方において強い免疫原性を示すことが実証された。さらに、これらの実験で明らかになったことは、分割RSVの鼻腔内経路による効果的な投与が可能であり、しかも分割RSVが免疫原性を示すことである。
【図面の簡単な説明】
【図1】
抗F抗体による分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
【図2】
抗M2抗体による分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
【図3】
抗G抗体による分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
【図4】
抗N抗体による分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
【図5】
EMにより可視化されたRSV/Aウイルス出発材料を示す。
【図6】
EMにより可視化された、NaDOCで分割したRSV/Aウイルスを示す。
【図7】
EMにより可視化されたPIV3ウイルス出発材料を示す。
【図8】
EMにより可視化された、NaDOCで分割したPIV3ウイルスを示す。
【図9】
EMにより可視化されたHSV2ウイルス出発材料を示す。
【図10】
EMにより可視化された、サルコシルで分割したHSV2ウイルスを示す。
【図11】
分割RSVを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(2回目の投与後)を示す。
【図12】
分割RSVを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗RSV/A中和抗体力価(2回目の投与後)を示す。
【図13】
分割RSVを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗FG IgGアイソタイプ応答(2回目の投与後)を示す。
【図14】
分割RSVを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(1回目の投与後)を示す。
【図15】
分割RSVを用いて鼻腔内経路により免疫した非感作マウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(2回目の投与後)を示す。
【図16】
分割RSVを用いて鼻腔内経路により免疫した非感作マウスにおける抗RSV/A中和抗体力価を示す。
本発明は、新規なワクチン製剤、該ワクチンの製造方法、ならびに疾患の予防または治療における該ワクチンの使用に関する。特に、本発明は、分割(split)エンベロープウイルス調製物を含むワクチンに関する。
【0002】
エンベロープウイルスとは、ウイルスのコアが脂質に富んだ外膜で覆われているウイルスのことであり、その外膜にはウイルスタンパク質が含まれている。
【0003】
特定の実施形態において、本発明のワクチン製剤の分割エンベロープウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス(Respiratory Syncitial Virus: RSV)に由来するものである。エンベロープウイルスによる感染の危険性を、RSVを例にとって説明する。
【0004】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)はパラミクソウイルス科のメンバーで、特に乳幼児において、下部気道疾患を引き起こす。最近の報告によれば、RSVは成人、特に初老の人々にとっても重大な病原体となることが示唆される。
【0005】
RSVは、11のメッセンジャーRNA(それぞれが単一のポリペプチドをコードしている)をコードする15,222ヌクレオチドの非分節(−)鎖リボ核酸(RNA)ゲノムをもつエンベロープウイルスである。11のタンパク質のうち3つは膜貫通表面タンパク質、すなわち、Gタンパク質(付着)、Fタンパク質(融合)およびSHタンパク質である。1つのタンパク質はビリオン基質タンパク質(M)であり、3つのタンパク質はヌクレオキャプシドの成分(N、PおよびL)であり、そして2つのタンパク質は非構造タンパク質(NS1およびNS2)である。さらに2つのタンパク質M2−1およびM2−2が存在する。RSVには抗原的に区別される2つのサブグループがあり、サブグループAおよびBと呼ばれている。これらサブグループのウイルス株の特性を調べたところ、大きな差異はGタンパク質にあって、Fタンパク質は保存されていることがわかった。
【0006】
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)はある季節に限って突然発生し、温帯では冬に、熱帯では雨期にピークとなる。
【0007】
小児では、重症の下部気道疾患の主な原因がRSVである。細気管支炎で入院している子供の40〜50%、肺炎で入院している子供の25%は、RSV感染が直接の原因で入院していると推定される。通常、一次RSV感染には1才未満の乳児がかかり、2才までに95%の子供が過去に感染したという血清学的証拠を有し、成人になると100%の集団がそうである。
【0008】
乳幼児においては、感染が約40%の症例で上部気道から下部気道へと進行しており、その臨床的徴候は細気管支炎または肺炎のそれである。2ヶ月から6ヶ月までの乳児は重症のRSV感染症(主として、呼吸不全)を発症する危険が最も高い。しかし、心臓や肺の病気をかかえている子供(年齢を問わない)、早産児、および免疫無防備状態の幼児も同様に重大な合併症を起こす危険がある。
【0009】
症状を呈する再感染が生涯を通じて起こり、RSVは成人(特に初老の人)でも重要な病原体となることが次第に明らかになってきた。
【0010】
RSV感染はほとんど必ずといっていいほど成人では過小診断されており、このことは、一部には、RSV感染が子供の病気であると考えられていることによる。その結果、成人では、呼吸器疾患の原因を究明する目的でこのウイルスの証拠が捜し求められることはない。さらに、大多数の成人がそうであるように、このウイルスに対してある程度の部分免疫をもつ個人から採取された鼻腔分泌物中にRSVを見つけ出すことは困難である。若者から中年までの成人は一般的に、RSVに感染すると、長引く風邪に似た症状を呈する。中年を過ぎた人々は、インフルエンザと事実上区別がつかない長期の呼吸器症候群を発症する可能性があり、これは肺炎をはじめとする下部気道症状を伴うことのある上部気道症状を呈する。施設に入所している初老の人々にとっては特に重大である。なんとなれば、彼らは感染しやすい多くの個体が一団となって生活しているからである。そのような集団(その多くは複数の医学的問題を抱えており、こうしたことがこの病気の経過をより重症にする可能性がある)の中で感染の広がりをくい止めるのは容易ではない。
【0011】
さらに、成人および集団で生活している健康な初老の人々が入院する原因としてRSV感染の影響を調べている最近の研究によれば、こうした集団での重症の下部気道疾患におけるRSV感染の重大な役割が指摘されている。RSVは、成人を結果的に入院させることとなる重症の下部気道疾患を引き起こす、最も一般的な4種の病原体のうちの1つとなっている。また、初老の人々における重症のRSV感染は養護施設や突発的状況に限らないことも実証されている。それどころか、RSV感染は集団で居住している初老の人々においては重症疾患の予測可能な原因となる。インフルエンザAによる入院と同様に、RSV感染に関係した入院は、長期の病院滞在によって証明されるように、かなりの死亡率、高い集中治療室での入院率、および高い人工呼吸器装着率と関係している。
【0012】
これらの研究は、特に乳幼児、成人、および集団生活をしている健康な人と施設に入所している初老の人の双方において、RSV感染の重大な合併症を予防することができる有効なワクチンが医療上および経済上必要であることを示している。
【0013】
同様の危険性が他のエンベロープウイルスからも持ち上がっており、かくして、そのようなウイルスが原因で起こる感染症および疾患から効果的に防御することのニーズが依然として存在する。
【0014】
本発明は、鼻腔内送達用に製剤化されたワクチンの製造における、分割インフルエンザウイルス調製物以外の分割エンベロープウイルス調製物の使用を提供する。
【0015】
好ましくは、この調製物は製薬上許容される賦形剤を含有する。
【0016】
本発明のワクチン製剤は、分割され得るエンベロープウイルスに由来するものである。このエンベロープウイルスは、ヒトまたは動物由来のウイルスを含めて、さまざまな起源に由来するものであってよい。ウイルスが例えばウシ由来のようにヒト以外に由来するものである場合は、そのウイルスを組換えウイルスとすることが好ましい。
【0017】
本発明のワクチン製剤は、好ましくは、送達後に該エンベロープウイルスに対する防御免疫応答を刺激することができるものである。
【0018】
本発明において、ウイルスとしては、以下に例示されるがこれらに限定されないあらゆるエンベロープウイルスが含まれる(ただし、インフルエンザウイルスを除く):
1) パラミクソウイルス科、例えば、呼吸器合胞体ウイルス(AおよびB)、パラインフルエンザウイルス(PIV−3など)、メタニューモウイルス(metapneumovirus)、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス;
2) ヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス;
3) フラビウイルス、例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス;
4) トガウイルス、例えば、風疹ウイルス、東部、西部およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス;および
5) レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス。
【0019】
本発明のワクチン製剤は2種以上の分割ウイルス調製物を含んでいてもよい。
【0020】
本発明のワクチン製剤は、疾病に対する更なる保護を与えるため、病原体由来の1種以上の抗原を分割調製物と組み合わせて含むことができる。適当な抗原は、分割調製物に由来する必要はなく、例えば、上に挙げたウイルスおよび肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)のような呼吸器疾患を引き起こす病原体に由来する抗原が含まれる。
【0021】
ウイルスを分割するには、感染性(野生型もしくは弱毒化された)または非感染性(例えば、不活化された)全ウイルス粒子を、一般的には(必ずしもそうではないが)界面活性剤からなる分割剤(splitting agent)を破砕濃度で用いて破砕または断片化することにより行う。分割されるウイルスは、2種以上の異なるウイルス由来の免疫原性エレメントをもつキメラな組換えウイルスであってもよい。こうした破砕により、ウイルスの完全性(integrity)を変えるような、あらゆるウイルスタンパク質の完全なまたは部分的な可溶化が起こる。
【0022】
好ましくは、分割ウイルスは、本発明に従ってウイルスに分割剤を接触させてウイルスのエンベロープを完全に破砕することにより得られる。他のウイルスタンパク質も完全にまたは部分的に可溶化されることが好ましい。分割した後ではウイルスの完全性が失われて、そのウイルスは非感染性になるが、このことは適当なin vitroタイトレーションアッセイで評価することができる。いったん破砕されると、一般的に、ウイルスのエンベロープタンパク質はインタクトな全ウイルス粒子とはもはや会合しない。好ましくは、他のウイルスタンパク質も完全にまたは部分的に可溶化され、したがって、分割した後ではインタクトな全ウイルス粒子とは会合しないか、部分的にしか会合しない。
【0023】
分割剤がウイルスエンベロープおよびウイルスタンパク質に及ぼす効果は、本明細書に記載するような、分割したウイルスおよびウイルスタンパク質のショ糖クッション実験での移動と、ウェスタンブロット分析および電子顕微鏡検査による可視化によって追跡することができる。
【0024】
本発明による分割(スプリット)ワクチンの調製には、分割剤とウイルス脂質分の一部または大部分を除去する追加のステップが含まれていてもよい。さらに、分割エンベロープウイルスの調製方法は、いくつかの異なる濾過および/またはその他の分離ステップ、例えば、超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離、およびクロマトグラフィーの各ステップを様々に組み合わせて含んでいてもよく、場合により、分割の前または後に不活化ステップを、例えばホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンまたはUV処理を用いて、行ってもよい。分割方法はバッチ法、連続法または半連続法として実施することができる。
【0025】
本発明による分割(スプリット)ワクチンは、一般的には、膜断片および膜エンベロープタンパク質、ならびにウイルス基質タンパク質や核タンパク質のような非膜タンパク質を、重大な意味をもつ全ウイルス粒子を存在させないで、含有する。本発明の分割ワクチンは通常、ウイルス構造タンパク質の大半または全部を含んでいるが、それらは必ずしも全ウイルス粒子中に存在するときと同じ割合ではない。好適な分割ウイルス調製物はウイルス構造タンパク質の少なくとも半分、好ましくは全部を含んでいる。一方、サブユニットワクチンは本質的に1種または2,3種の高度に精製されたウイルスタンパク質からなるものである。例えば、サブユニットワクチンは、ワクチン接種後に所望のウイルス中和抗体の誘導に関与することがわかっている精製されたウイルス表面タンパク質を含有する。
【0026】
本発明においては、非イオン性およびイオン性の界面活性剤だけでなく、その他の各種試薬も分割剤として使用することができる。本発明のもとで有用な分割剤の例としては、次のものを挙げることができる:
1.胆汁酸およびその誘導体。胆汁酸には、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および前記胆汁酸のグリコ−、タウロ−、アミドプロピル−1−プロパンスルホン酸−、アミドプロピル−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸誘導体、またはN,N−ビス(3Dグルコノアミドプロピル)デオキシコールアミドのような誘導体が含まれる。具体的な例はデオキシコール酸ナトリウム(NaDOC)である;
【0027】
2.非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノール類(TritonTM系列)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80TM)などのポリオキシエチレンエーテル類、および一般式(I):
(I) HO(CH2CH2O)n−A−R
[式中、nは1〜50であり、Aは結合または−C(O)−であり、RはC1−50アルキルまたはフェニルC1−50アルキルである]
で表されるポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル類、ならびにこれらの2種以上の組合せ。具体的な例はTween 80TM、Triton X−100TM、およびラウレス9である;
【0028】
3.アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシド、ここで、アルキル鎖はC6〜C18、典型的にはC8〜C14であり、糖部分は任意のペントースもしくはヘキソース、または異なる結合(例えば、1→6、1→5、1→4、1→3、1−2)を有するそれらの組合せである。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい;
【0029】
4.上記3の誘導体、ここで、1個以上のヒドロキシル基、好ましくは6ヒドロキシル基が修飾されており、例えば、エステル、エトキシレート、スルフェート、エーテル、カーボネート、スルホスクシネート、イセチオネート、エーテルカルボキシレート、第4級アンモニウム化合物などに修飾される;
【0030】
5.アシル糖、ここで、アルキル鎖はC6〜C18、典型的にはC8〜C12であり、糖部分は任意のペントースもしくはヘキソース、または異なる結合(例えば、1→6、1→5、1→4、1→3、1−2)を有するそれらの組合せである。アシル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい;
【0031】
6.構造R−N,N−(R1,R2)−3−アミノ−1−プロパンスルホネートのスルホベタイン類、ここで、RはC6〜C18、典型的にはC8〜C16のアルキル鎖またはアリールアルキル鎖である。アルキル鎖Rは飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい。R1およびR2はC1〜C4、典型的にはC1のアルキル鎖である;
【0032】
7.構造R−N,N−(R1,R2)−グリシンのベタイン類、ここで、RはC6〜C18、典型的にはC8〜C16のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい。R1およびR2はC1〜C4、典型的にはC1のアルキル鎖である;
【0033】
8.構造R−(−O−CH2−CH2−)n−OHのポリオキシエチレンアルキルエーテル、ここで、RはC6〜C20、典型的にはC8〜C14のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい。nは5〜30、典型的には8〜25である;
【0034】
9.構造R−(N−R1)−グルカミドのN,N−ジアルキル−グルカミド、ここで、RはC6〜C18、典型的にはC8〜C12のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐でも環状でもよい。R1およびR2はC1〜C6、典型的にはC1のアルキル鎖である。糖部分はペントースまたはヘキソースで修飾されていてもよい;
【0035】
10.Hecameg:(6−O−(N−ヘプチル−カルバモイル)−メチル−α−D−グルコピラノシド);
【0036】
11.構造R−C6H4−O−(−CH2−CH2−)n−OHのアルキルフェノキシポリエトキシエタノール、ここで、RはC6〜C18、典型的にはC8のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい(n>=3);
【0037】
12.構造R,−N+(−R1,−R2,−R3)の第4級アンモニウム化合物、ここで、RはC6〜C20、典型的にはC20のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ/また分岐していてもよい。R1、R2およびR3はC1〜C4、典型的にはC1のアルキル鎖である;
【0038】
13.サルコシル(Sarcosyl):N−ラウリルサルコシンNa塩;
【0039】
14.CTAB(臭化セチルトリメチルアンモニウム)またはセタブロン(Cetavlon)。
【0040】
最も好ましいものはNaDOCとサルコシルである。分割を行うために、適切には、分割剤を室温で、例えば一夜、分割すべきウイルスとインキュベートする。適宜、分割剤を組み合わせて用いてもよい。
【0041】
分割ワクチン調製物は、好ましくは、少なくとも1種の界面活性剤(特に、非イオン性界面活性剤でありうる)を含有する。その1種以上の界面活性剤は分割方法からの残留物であってよく、かつ/または分割した後でウイルスに添加してもよい。分割された抗原物質は非イオン性界面活性剤の存在下で安定化されると考えられるが、本発明が必ずそのケースに当てはまるとは限らないことが理解されよう。安定化剤として適する非イオン性界面活性剤には、オクトキシノール類(TritonTM系列)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80TM)などのポリオキシエチレンエーテル類、および一般式(I):
(I) HO(CH2CH2O)n−A−R
[式中、nは1〜50であり、Aは結合または−C(O)−であり、RはC1−50アルキルまたはフェニルC1−50アルキルである]で表されるポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル、およびこれらの2種以上の組合せが含まれる。
【0042】
Triton系列の好ましい非イオン性界面活性剤としては、Triton X−100 (t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)、Triton X−165、Triton X−205、Triton X−305、またはTriton X−405 Triton N−101が挙げられる。特に好ましいものはTriton X−100である。
【0043】
好適な非イオン性界面活性剤には、さらに、上記の一般式(I)のポリオキシエチレンエーテル、特にポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−9−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−8−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテルが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましいポリオキシエチレンエーテルはポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(ラウレス 9)である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルの別名がCAS登録に載っている。ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルのCAS登録番号は9002−92−0である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルはMerck index(12版:エントリー7717、Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910−12−3)に記載されている。ラウレス 9はエチレンオキシドをドデシルアルコールと反応させることにより形成され、平均9個のエチレンオキシド単位をもっている。
【0044】
最終ワクチン製剤に含まれる安定化用界面活性剤の最終濃度は0.001〜20%の範囲、より好ましくは0.01〜10%、最も好ましくは約2%(w/v)までである。1種以上の界面活性剤が存在する場合、これらは一般的に最終製剤中にそれぞれが約2%までの濃度で存在し、通常はそれぞれが約1%までの濃度、好ましくはそれぞれが約0.6%までの濃度、より好ましくはそれぞれが約0.2%または0.1%までの微量で存在する。本発明のワクチン製剤には界面活性剤の任意の混合物を存在させることができる。
【0045】
エンベロープウイルスは、血清または無血清法により適当な細胞基体上で複製させることにより生産することができる。組織培養で増えるウイルスは、例えば、MRC−5、WI−38、HEp−2などのヒト細胞、AGMK、Vero、LLc−Mk2、LLc−Mk2、FRhL、FRhL−2などのサル細胞、MDBKなどのウシ細胞、MDCKなどのイヌ細胞、ニワトリ胚性繊維芽細胞などの一次細胞、またはワクチン用ウイルスの生産に適する他の細胞タイプ(上記の細胞系に由来するクローンを含む)で生産することができる。
【0046】
分割ワクチン調製物は、製薬上許容される賦形剤と組み合わせることが好ましい。使用する製薬上許容される賦形剤は、ワクチン製造の分野で慣用のものであってよい。所与のワクチン製剤で用いる賦形剤は、互いに適合性で、しかも組成物の必須成分とも適合するものである。そして、諸成分の性能、もし存在するのであれば活性物質の性能、を損なうような相互作用がまったく起こらないようにする。当然、賦形剤はすべて無毒性で、ヒトに使用するのに十分な純度のものでなければならない。適当な賦形剤の例は当技術分野で周知である。
【0047】
ワクチン製剤はまた、キャリアーおよび/または免疫刺激剤でありうるアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは分割方法からの残存物であっても、かつ/または分割した後でウイルスに添加してもよい。本発明のワクチンで使用するのに適したアジュバントは当技術分野で周知である。
【0048】
かくして、本発明のさらなる態様は、鼻腔内送達用のワクチン製剤の製造における、アジュバントと組み合わせた、分割エンベロープウイルス調製物(分割インフルエンザウイルス調製物ではない)の使用を提供する。好ましくは、この調製物は製薬上許容される賦形剤を含有する。
【0049】
本発明のワクチン製剤は、該ワクチンを鼻腔経路で投与することによって、疾病にかかりやすい、または該疾病にかかっている哺乳動物を保護または治療するために使用することができる。本発明はそのような治療および保護方法にも及ぶものである。
【0050】
痛みを伴う注射の必要性や、それに関連した「針への恐怖」ゆえの患者の応諾に与えるマイナスの影響を回避できることを別にしても、鼻腔内法などによる粘膜へのワクチン接種には興味がもてる。その理由は、動物では、抗原の粘膜投与が多くの病原体の侵入経路である粘膜表面において防御応答を効率よく引き出せるとわかったからである。さらに、鼻腔内ワクチン接種のような粘膜ワクチン接種は、鼻粘膜だけでなく生殖器粘膜などの離れた粘膜部位でも粘膜免疫を引き出しうることが提起されている。この分野での多くの研究にもかかわらず、ヒトへの使用に適した鼻腔内送達用の安全かつ有効なワクチンはまだ確認されていない。
【0051】
本発明に従う鼻腔内投与は、液滴、スプレーまたは乾燥粉末形態で行うことができる。ネブライザー投与またはエーロゾル投与が可能なワクチン製剤も本発明の一部を構成する。
【0052】
適当なアジュバントはどれも、適切な形態(溶液、非小胞性の溶液、懸濁液、粉末など)で本発明において使用することができる。好ましいアジュバントとしては国際公開WO 99/52549に例示されているものがあり、この文献の全内容を参照により本明細書に含めるものとする。好適なアジュバントには、Tween 80TM、Triton X−100TM、ラウレス 9およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限らない。
【0053】
非イオン性界面活性剤はリピドAの無毒性誘導体のような免疫刺激剤と組み合わせることが有利であり、かかるリピドA誘導体としては、モノホスホリルおよびジホスホリルリピドAの無毒性誘導体、例えば、3−脱−O−アシル化モノホスホリルリピドA(3D−MPL)および3−脱−O−アシル化ジホスホリルリピドAを含めて、米国特許第4,912,094号および英国特許第2,220,211号に記載されるものが含まれる。好ましい組合せは3D−MPLと組み合わせたラウレス−9である。上記の免疫刺激剤は非イオン性界面活性剤を含まない製剤にも適宜使用することができる。
【0054】
3D−MPLの好ましい形態は、直径が0.2μmより小さい粒子サイズを有する乳剤の形をしており、その製造方法はWO 94/21292に記載されている。モノホスホリルリピドAと界面活性剤を含む水性配合物がWO 9843670A2に記載されている。
【0055】
本発明の組成物中に処方される細菌性リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製して加工処理を施すことができるが、また、それらを合成することもできる。例えば、精製されたモノホスホリルリピドAはRibiら1986(1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407−419)に記載され、Salmonella sp.由来の3−O−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドAは英国特許第2,220,211号および米国特許第4,912,094号に記載されている。その他の精製されたおよび合成のリポ多糖類もすでに記載されている(Hilgersら、1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392−6; Hilgersら、1987, Immunology, 60(1):141−6; およびヨーロッパ特許第0 549 074 B1)。特に好ましい細菌性リポ多糖アジュバントは3D−MPLである。
【0056】
したがって、本発明において使用できるLPS誘導体は、構造がLPSまたはMPLまたは3D−MPLの構造と類似している免疫刺激剤である。本発明の別の態様において、LPS誘導体はアシル化単糖であってよく、これはMPLの上記構造の下位部分である。
【0057】
本発明のさらなる実施形態において、アジュバントはADP−リボシル化トキシンまたはその突然変異体である。かかるトキシンの例として、大腸菌由来のHeat Labile Toxin (LT)、その突然変異体(例えばLTR192G)、およびこれらのトキシンの断片(例えばガングリオシド結合性成分(LTB))がある。
【0058】
その他の好適なアジュバントとして、QS21のようなサポニンアジュバントが挙げられる。
【0059】
ある促進系は、無毒性のリピドA誘導体とサポニン誘導体の組合せ、特にWO94/00153に記載されるようなQS21と3D−MPLの組合せ、またはWO 96/33739に記載されるようなQS21がコレステロールで抑えられている、比較的反応性の低い組成物を含む。
【0060】
本発明のワクチンを鼻腔内に投与するのに適した装置はスプレー装置である。好適な鼻スプレー装置はBecton Dickinson、Pfeiffer GmBHおよびValoisから販売されている。
【0061】
鼻腔内使用に適したスプレー装置は、その性能が使用者によって加えられる圧力に左右されないものである。圧閾値(pressure threshold)装置が特に有用である。なぜなら、閾値圧に達したときだけノズルから液体が放出されるからである。こうした装置によって、液滴の大きさが一定している噴霧を容易に達成することができる。本発明とともに使用するのに適した圧閾値装置は当技術分野で公知であり、例えば、WO 91/13281およびヨーロッパ特許第311 863 B号に記載されている。現在、かかる装置はPfeiffer GmBHから市販されており、また、Bommer, R. Advances in Nasal drug delivery Technology, Pharmaceutical Technology Europe, September 1999, p26−33にも記載されている。
【0062】
好ましい鼻腔内装置は1〜500μmの範囲の液滴(液体として水を用いて測定)をもたらすものである。10μmより小さいと吸い込む危険があるため、10μm未満の液滴を約5%以下にすることが望ましい。
【0063】
本発明のワクチンとともに使用するのにさらに好ましい鼻腔内送達系の特徴は2用量(bi−dose)送達である。2用量装置は、それぞれの鼻孔に投与するために、1回のワクチン量を2つの小用量に分けて含有するものである。
【0064】
本発明はまた、本発明の分割ワクチン製剤を含む鼻腔内送達装置を提供する。
【0065】
本発明は、さらなる態様において、本明細書に記載する鼻腔内投与装置を含んでなるか、または、鼻腔内投与装置および該装置とともに使用する別のワクチン製剤を含んでなる医薬キットを提供する。
【0066】
本発明のこの態様は、必ずしも液体製剤のスプレー送達に限らない。本発明のワクチンは他の形態で投与することもでき、例えば粉末として投与してもよい。
【0067】
本発明のワクチン製剤は予防と治療の両目的に使用することができる。したがって、本発明は、感染症にかかりやすい、またはかかっている哺乳動物を保護または治療する方法を提供する。本発明の別の態様では、医療に使用するための本明細書に記載されるワクチンを提供する。ワクチン製剤については、New Trends and Developments in Vaccines, Vollerら編, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に概説されている。
【0068】
ワクチンは適切な投与計画、例えば1回量または2回量の投与計画、で送達することができる。ワクチンはナイーブ集団と感作集団、すなわち、セロネガティブ(血清反応陰性)個体とセロポジティブ(血清反応陽性)個体に使用することが可能である。
【0069】
本発明では、より好ましくは、ワクチン製剤がアジュバントを含有し、かつ/または該製剤がウイルスへの曝露によってすでに感作された個体に投与される。
【0070】
本発明はさらに、ワクチン製剤の製造方法であって、
(a) エンベロープウイルスを分割すること、
(b) 場合により、分割したエンベロープウイルス調製物を安定化剤と混合すること、
(c) 場合により、分割したエンベロープウイルス調製物をアジュバント(該アジュバントはキャリアーおよび/または免疫刺激剤でありうる)と混合すること、
を含んでなる上記方法に関する。
【0071】
好ましくは、上記方法はステップ(a)および(b)、ステップ(a)および(c)、またはステップ(a)、(b)および(c)を含んでなる。好ましくは、安定化剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN 80TM)、t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(TRITON X100TM)、およびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルからなる群より選択される少なくとも1種の界面活性剤を含有する。
【0072】
必要に応じて、この方法で製造したワクチンを適当なキャリアーと混合する。
【0073】
本発明はまた、エンベロープウイルスを適当な分割剤で処理することを含む、本明細書に記載するエンベロープウイルスの分割方法に関する。
【0074】
本発明について以下の図面および実施例を用いて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0075】
実施例1. 分割ウイルスの作製
種々のウイルス科に属するエンベロープウイルスを界面活性剤などの分割剤の添加により分割した。この分割を評価するには、ショ糖勾配またはショ糖クッションでの分割ウイルスの移動とSDS−PAGE分析による可視化により特徴づけし、また、分割ウイルス産物を電子顕微鏡で直接検査する。
【0076】
この実施例に記載する分割ウイルスには、様々なエンベロープウイルス科の代表的なウイルスが含まれている。例えば、パラミクソウイルス科(呼吸器合胞体ウイルスAおよびB、パラインフルエンザウイルス−3、流行性耳下腺炎ウイルス、および麻疹ウイルス)、トガウイルス科(風疹ウイルス)、およびヘルペスウイルス科(エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、または単純ヘルペスウイルス)のメンバーについて検討する。
【0077】
ウイルス粒子を破砕(分割)するには、無細胞ウイルス調製物に可溶化濃度の界面活性剤のような分割剤を添加する。特に、界面活性剤として胆汁酸やアルキルグリコシドを使用する。界面活性剤を単独でまたは各種組み合わせて添加し、インキュベートしてこの方法を完結させる。
【0078】
効果的に分割されたかを評価するには、初めに、ショ糖勾配またはクッションによる遠心分離を行う。簡単に述べると、界面活性剤で処理したサンプルと未処理のサンプルをショ糖勾配/クッション遠心分離にかけ、画分をSDS−PAGEゲルで分析する。可溶性画分中のあらゆるタイプのウイルス粒子タンパク質が移動することで、効果的に分割されたことがわかる。ショ糖−SDS−PAGE分析で効果的に分割されたと思われるサンプルを電子顕微鏡検査でさらに分析する。サンプルは標準的な陰性染色法を用いて可視化する。
【0079】
RSV、HSVおよびPIVに対して以下の具体的な分割実験を実施した。
【0080】
1.1 細胞培養条件
ヒト野生型RSV/A/LongおよびPIV−3を、定常的無血清法でVERO細胞内にて複製させた。感染に先立って、VERO細胞を集密状態になるまで4日間増殖させた。各ウイルスに次のウイルス生産条件を適合させた:RSV/Aに対してはMOI 0.03、4日間、HSV2に対してはMOI 0.001、35℃で3日間、PIV−3に対してはMOI 0.01、37℃で5日間。収穫日に、細胞を溶解し、安定化剤を添加した後で細胞溶解液を回収し、直ちに−70℃で保存した。
【0081】
1.2 ウイルスの精製
1,000×gで10分間遠心分離して清澄化した後、PEG6000沈澱により上清からウイルス粒子をペレット化した。このペレットをTris 50mM−NaCl 50mM−MgSO4 2mM pH7.5バッファー中に懸濁し、続いてベンゾナーゼ処理を行った。この溶液を500kD AGT膜で5倍容量のリン酸緩衝溶液に対して限外濾過し、続いて5倍容量のリン酸バッファー pH7.5に対してダイアフィルトレーションを実施した。
【0082】
インタクトなウイルス粒子が生産され、本明細書に記載する電子顕微鏡検査(EM)およびショ糖クッションでの遠心分離により確認された。タンパク質の濃度を測定した。
【0083】
1.3 ウイルスの分割
無細胞ウイルス調製物に分割剤を添加してウイルス粒子を分割した。
【0084】
分割を有効なものとするためには、界面活性剤をその臨界ミセル濃度(cmc)より高い濃度で使用する必要がある。全ての界面活性剤はそのcmc濃度より高い最終濃度で使用した。D/P比(界面活性剤/タンパク質比)を検討した。D/P比≧25のときに分割がうまくいった。D/P比は25以上とすることが好ましい。
【0085】
次の界面活性剤を2%の濃度で使用してウイルス粒子を分割した:デオキシコール酸ナトリウム、サルコシル、プランタケア(Plantacare)およびラウレス9。
【0086】
分割後、この溶液を処方用バッファー(PO4 10mM/NaCl 150mM pH7.5)に対して透析して過剰の界面活性剤を除いた。
【0087】
例として、RSVについての分割方法を以下にまとめて記載する。
【0088】
【0089】
1.4 分割ウイルスの特徴づけ
出発ウイルスの完全性および分割の質を30%ショ糖クッションでの超遠心分離(TL100 Beckmanローターを使って50,000rpmで1時間)により判定した。画分を特異的なウェスタンブロットアッセイと電子顕微鏡検査により分析し、これらの画分の一部に対して感染力のタイトレーションを行った。
【0090】
1.4.1 超遠心分離
遠心チューブに30%ショ糖溶液(450μl)を半分まで満たした後、分析すべきサンプル(450μl)をこのショ糖クッションの上に穏やかにかつ慎重に載せ、その後Beckman TL100ローターで50,000rpm、+4℃にて1時間、遠心分離を実施した。遠心分離後、チューブを3つの部分に分けてドレインした。上部相(300μl)を「上清」と呼ぶ。中間相(300μl)はサンプルとショ糖クッションとの境界相であり、ここでは「中間」と呼ぶ。下部相(300μl)は完全なウイルスに対して遠心分離を行ったときの再懸濁ペレットを含むボトム液であり、ここでは「ペレット」と呼ぶ。
これら3つの画分をさらに分析した。
【0091】
1.4.2 ウェスタンブロット分析
この分析によりウイルスの完全性を調べることができ(ペレット画分が陽性)、また、分割の効力を判定することができる(好ましくは、エンベロープタンパク質のような構造タンパク質の全部または大部分について上清画分が陽性)。
【0092】
特定のウイルスタンパク質を特徴づけるために特異的抗体を使用した。
【0093】
RSV−Aの場合は、非分割および分割画分を、抗Fタンパク質(表面タンパク質)、抗Gタンパク質(表面タンパク質)、抗Nタンパク質(ヌクレオキャプシド)、および抗Mタンパク質(基質)含量について分析した。
【0094】
PIV−3の場合は、非分割および分割画分を、そのHNタンパク質含量についてモノクローナル抗体を用いて、またF、M、HNタンパク質含量についてはポリクローナル抗体を用いて分析した。
【0095】
HSVの場合は、非分割および分割画分を、そのGタンパク質、外皮タンパク質およびキャプシドタンパク質について抗体を用いて分析した。
【0096】
分割の基準
分割を行う前のペレット画分中に試験した4種全てのタンパク質に対する陽性のウェスタンブロット(WB)シグナルが存在し、かつ他の2つの画分中にシグナルが存在しなければ、そのウイルス調製物にはインタクトな完全ウイルスが含まれていることとなる。
【0097】
エンベロープが破砕され、かつエンベロープタンパク質が上清および/または中間画分に検出されたとき、その分割は有効であると見なした。RSVの場合は、例えばFまたはGがSまたはM画分において検出されたときに、分割は有効であるとした。好ましくは、FおよびGは実質的にSおよび/またはM層に検出されて、ペレットには検出されない。
【0098】
結果のまとめ
RSVAについての結果を図1〜4に示す。
全てのウェスタンブロットの結果において、「Split−O」は分割する前のウイルスを意味する。「S」、「M」および「P」は、それぞれ、ショ糖クッションでのサンプルの超遠心分離後に取得された「上清」、「中間」および「ペレット」画分をさす。レーンは左から右へ番号を付けた。容量はSDS−PAGEゲル上に載せたサンプル量をさす。
【0099】
図1は、mAb B4(抗F)でプローブした分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
上のパネル:
下のパネル:
【0100】
図2は、抗Mモノクローナル抗体でプローブした分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
上のパネル:
下のパネル:
【0101】
図3は、抗Gモノクローナル抗体でプローブした分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
上のパネル:
下のパネル:
【0102】
図4は、抗Nモノクローナル抗体でプローブした分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
上のパネル:
下のパネル:
【0103】
FおよびGタンパク質に関して、分割後の中間および上清画分にシグナルが存在し、かつペレット画分にはバンドがほとんど存在しなければ、そのウイルスエンベロープは完全に破砕されたことになる。NおよびMタンパク質に関しては、全ての画分にシグナルが存在すれば、これらのタンパク質が分割調製物中に存在することを示す。これらの結果からは、試験した4種全ての界面活性剤がRSVAウイルスの分割をもたらすことがわかる。
【0104】
全画分における4種全てのタンパク質に対するシグナルの分析、特に中間および上清画分における分割後のNおよびMタンパク質に対する比較可能なシグナルの分析から、試験した条件において、NaDOCとサルコシルはウイルスの分割をもたらすだけでなく、全てのウイルス構造を破壊して構造および非構造タンパク質を可溶化することができることがわかる。
【0105】
同様の結果がPIV、HSVおよび麻疹ウイルスの分割の場合にも得られ、これらのウイルスは例えば2%のNaDOCまたはサルコシルを用いてうまく分割される。
【0106】
NaDOCとサルコシルは全てのウイルスに使える好適な分割剤である。
【0107】
1.5 in vitro ウイルスタイトレーション
分割後にウイルスの完全性が失われることから、そのウイルスは非感染性となる。成功したウイルス破砕の分析は、分割後のウイルス力価が106logまたはそれ以上低下することにより示される。
【0108】
1.6 電子顕微鏡検査 (EM) による分析
電子顕微鏡検査による分析は、コントラスト剤としてホスホタングステン酸Naを用いて標準的な2段階陰性染色法により行った(HayatおよびMiller, 1990, Negative Staining, McGraw, Hill編)。グリッド(格子)を検査して、この材料の分割パターンを評価した。
【0109】
非分割ウイルス調製物と、NaDOCまたはサルコシルで分割したRSVA、HSV2およびPIV3ウイルス調製物の電子顕微鏡検査による分析は、ウェスタンブロット分析で得られた観察を支持するものである。結果を示すために、RSV、HSVおよびPIVのデータを示す。
【0110】
図5は、EMにより可視化されたRSV/A出発材料を示す。図6は、NaDOCで分割した後のRSV/Aを示す。図7は、EMにより可視化されたPIV3出発材料を示す。図8は、NaDOCで分割した後のPIV3を示す。図9は、EMにより可視化されたHSV2出発材料を示す。図10は、サルコシルで分割した後のHSV2を示す。
【0111】
非分割ウイルス(インタクトな完全ウイルス)は、比較的よく保存されたまたは軽度の損傷を受けたウイルス粒子と若干の無定形物質を含んでいた。NaDOCまたはサルコシルで分割したウイルスは、さまざまな程度に集合した無定形の物質が不均一に広がっている外観を示した。同様のデータが試験した全てのウイルスRSV、PIVおよびHSVにおいて得られた。さらに、RSVやPIVの場合には、ウイルスエンベロープまたは核タンパク質起源からの識別可能な構造体がほとんど認められなかった。
【0112】
実施例2. 分割(スプリット)ワクチンのマウスにおける免疫原性
分割したRSVおよび/またはPIV調製物をマウスにワクチン接種するための免疫原として使用して、これらの調製物の免疫原性を評価した。簡単に説明すると、8週齢の雌マウスを鼻腔内送達用の分割ワクチン調製物で免疫する。アジュバントを添加してない対照も含める。数週間の間隔で2回投与する。
【0113】
最後に投与してから2週間後に、動物を犠牲にして血液、脾細胞、および/または鼻洗浄液を採取する。マウス血清をウイルス特異的ELISAアッセイで試験することにより、血清中のウイルス特異的体液性免疫応答を評価する。さらに、抗体応答のアイソタイプ様相をアイソタイプ特異的アッセイで調べる。血清中の中和抗体の存在は、特異的なウイルス中和アッセイを用いて評価する。関連する局所免疫応答の誘導は、鼻洗浄液中の中和抗体をアッセイするか、あるいは鼻洗浄液中のウイルス特異的IgAをアッセイすることにより評価することができる。
【0114】
ウイルス特異的細胞性免疫応答の誘導は、回収した脾細胞のin vitro刺激、および細胞増殖の測定(トリチウム標識チミジンの取り込み)、および/または刺激した細胞からのIL−5およびIFNγの分泌により評価する。
【0115】
この実験における変動要因の影響は、分割(スプリット)製剤により誘発された応答の質および強さに特別の注意を払うことで評価される。
【0116】
2.1 分割 RSV 製剤
以下の一連の実験は、分割したRSVなどのウイルスが、鼻腔内(IN)経路で投与したとき、強力な免疫応答を引き出すことを示すものである。小児(ナイーブ)集団または初老(感作)集団のいずれかの免疫状態をより正確に反映させるために、感作動物または未感作動物において免疫原性を評価し、両集団での免疫原性を実証した。比較のためIM送達を加えた。
【0117】
第1セットの実験では、8週齢の雌Balb/cマウスを用いて、IMまたはIN経路で投与される分割RSV調製物の免疫原性を試験した。初回感作を行うため、3×105プラーク形成単位(pfu)の生存RSVウイルスを60μlの容量(2×30μl)で鼻腔内に投与した。初回感作から3週間後、動物にRSV分割抗原をワクチン接種した。RSV分割産物の数量化は、RSV Fタンパク質特異的ELISA(分割産物中に含まれるFタンパク質を組換えFGタンパク質標準品に対して数量化する)に基づいていた。Aグループのマウスは、100μl中に4.2μgのFタンパク質を含有するRSV分割抗原を21日間隔で2回、筋肉内経路により投与して免疫した。Bグループのマウスは、100μl中に50μgのAl(OH)3アジュバントとともに4.2μgのFタンパク質を含有するRSV分割抗原を21日間隔で2回、筋肉内経路により投与して免疫した。Cグループのマウスは、1回目として60μl中に2.7μgのFタンパク質を含有するRSV分割抗原を、21日後に2回目として60μl中に4μgのFタンパク質を含有するRSV分割抗原を鼻腔内経路により投与して免疫した。最後に投与してから2週間後に全ての動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【0118】
この実験の結果を図11〜16にまとめて示す。免疫応答を評価するために用いた最初の免疫リードアウト(read out)は、ワクチン接種動物の血清中に存在する総RSV FG特異的免疫グロブリン(Ig)またはFG特異的IgGアイソタイプ(IgG1およびIgG2A)を測定するELISAアッセイであった。これらのアッセイでは、96ウェルディッシュに組換えRSV FG抗原をコーティングし、動物の血清を連続希釈してコーティングしたウェルに加える。結合した抗体を検出するには、ビオチン化抗マウスIg、IgG1またはIgG2Aを添加し、次いでペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたストレプトアビジンで増幅する。OPDA基質を加え、続いて2N H2SO4で処理し、490nmで光学密度(OD)を測定することにより結合抗体を定量する。SoftMax Proソフトウェア(4パラメーター式を使用)から抗体力価を算出し、EU/mlで表す。
【0119】
ELISAアッセイに加えて、免疫感作によって引き出された免疫応答の質をさらに特徴づけるために中和アッセイを行った。この中和アッセイでは、動物血清の2倍希釈物を、96ウェルの組織培養ディッシュにおいて、RSV/Aウイルス(3000pfu)およびモルモット補体とともに37℃で1時間インキュベートした。各ウェルにHep−2細胞(104個/ウェル)を直接添加し、このプレートを37℃で4日間インキュベートした。上清を吸引し、各ウェルに市販のWST−1溶液を加えた。プレートを37℃でさらに18〜24時間インキュベートした。ODを450nmでモニターし、タイトレーションを直線回帰分析により分析した。力価は未感染細胞について観察された最大ODの50%減少をもたらす血清希釈率の逆数として記録した。
【0120】
図11は、総Ig ELISAリードアウトを用いて得られた結果を示す。感作マウスにおいては、分割RSV抗原を筋肉内(A、Bグループ)または鼻腔内(Cグループ)経路で2回投与してワクチン接種することにより、強力な抗FG抗体応答が誘導された。
【0121】
詳細には、図11は、生きているRSVで感作し、次に分割RSVを筋肉内(IM)または鼻腔内(IN)経路で投与して免疫したマウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Bグループにはミョウバンアジュバントを加えて4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Cグループにはそれぞれ2.7μgと4.0μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。
【0122】
図12は、中和アッセイの結果を示す。これらの感作動物においては、分割RSV産物をIMまたはINのいずれかで2回投与してワクチン接種することにより強力なウイルス中和抗体応答が誘導された。
【0123】
詳細には、図12は、生きているRSVで感作し、次に分割RSVを筋肉内(IM)または鼻腔内(IN)経路で投与して免疫したマウスにおける抗RSV/A中和抗体力価(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Bグループにはミョウバンアジュバントを加えて4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Cグループにはそれぞれ2.7μgと4.0μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。
【0124】
図13は、アイソタイプ分析の結果を示す。鼻腔内感作した動物では、IgG2a:IgG1の比が未感作マウスで得られたデータ(下記参照)と比べて増加しており、このことは、マウスが生きているウイルスで感作される(すなわち、初老集団における自然な状況)と、Th1様応答のほうに向かう傾向があることを示唆している。
【0125】
詳細には、図13は、生きているRSVで感作し、次に分割RSVを筋肉内(IM)または鼻腔内(IN)経路で投与して免疫したマウスにおける抗FG IgGアイソタイプ(ELISA)応答(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Bグループにはミョウバンアジュバントを加えて4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Cグループにはそれぞれ2.7μgと4.0μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。
【0126】
図14は、1回の抗原投与でさえ、感作集団では分割RSVによるINワクチン接種に応答して強い免疫応答が生起することを示す。したがって、感作集団において、分割RSVはINワクチン接種後に高力価の抗体応答を引き出すことができる強力な免疫原となる。
【0127】
詳細には、図14は、生きているRSVで感作し、次に分割RSVを筋肉内(IM)または鼻腔内(IN)経路で投与して免疫したマウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(1回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Bグループにはミョウバンアジュバントを加えて4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。Cグループにはそれぞれ2.7μgと4.0μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。Dグループには感作のみを施して、ワクチン接種を行わなかった−このグループについて報告された抗体力価は、感作後21日目に測定したとき検出レベルより低かった。
【0128】
第2の一連の実験では、未感作マウスを用いて、抗原用量とアジュバント添加が分割RSV産物の免疫原性に及ぼす効果を立証した。マウスに1回目として2.4μgのFタンパク質を含有する分割RSV抗原(送達量60μl−2×30μl)を投与した。30日後に送達した2回目では、3.5μgのFタンパク質を含有する分割RSV抗原をマウスに投与した。分割RSVは、アジュバントを添加しないで、またはアジュバントとして5μgの大腸菌Labile Toxin (LT)を添加して、またはポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル0.5%(本明細書では「ラウレス9」)とともに投与した。対照グループは、1回目に2.0μgのFタンパク質を含有し、2回目に3.5μgのFタンパク質を含有する精製した完全RSVウイルスを鼻腔内投与して免疫した。最後のワクチン接種から2週間後に動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【0129】
図15および16に示すように、未感作マウスにおいて抗体応答がIN製剤により引き出された。ELISAリードアウト(図15)からは、INワクチン接種に対する応答がIMにより引き出される応答より低くなることが示唆されるが、中和リードアウト(図16)からは、LTアジュバントを添加した分割RSV IN製剤が、中和抗体を誘導するうえでIMと少なくとも同じくらいすぐれており、他の製剤もIMに匹敵することが示唆される。かくして、IN経路で投与された分割RSVは未感作マウスにおいても免疫原性がある。
【0130】
詳細には、図15は、分割RSVを鼻腔内(IN)または筋肉内(IM)経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループにはそれぞれ2.4μgと3.5μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。Bグループにはラウレス9アジュバントを加えてそれぞれ2.4μgと3.5μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。CグループにはLTアジュバントを加えてそれぞれ2.4μgと3.5μgの分割RSVをIN経路で2回投与した。Dグループにはそれぞれ2.0μgと3.5μgの精製した完全ウイルスをIN経路で2回投与した。Eグループには4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。
【0131】
図16は、分割RSVを鼻腔内(IN)または筋肉内(IM)経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗RSV/A中和抗体力価(2回目のワクチン接種後)を示す。Aグループには、2回に分けてそれぞれ2.4μgと3.5μgの分割RSVをIN経路で投与した。Bグループには、ラウレス9アジュバントを加えた2.4μgと3.5μgずつの分割RSVを、2回に分けてIN経路で投与した。Cグループには、LTアジュバントを加えた2.4μgと3.5μgずつの分割RSVを、2回に分けてIN経路で投与した。Dグループには、2回に分けてそれぞれ2.0μgと3.5μgずつの精製した完全ウイルスをIN経路で投与した。Eグループには、4.2μgずつの分割RSVをIM経路で2回投与した。
【0132】
要約すると、これらの実験から、分割RSV抗原はナイーブ集団と感作集団の両方において強い免疫原性を示すことが実証された。さらに、これらの実験で明らかになったことは、分割RSVの鼻腔内経路による効果的な投与が可能であり、しかも分割RSVが免疫原性を示すことである。
【図面の簡単な説明】
【図1】
抗F抗体による分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
【図2】
抗M2抗体による分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
【図3】
抗G抗体による分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
【図4】
抗N抗体による分割RSVAのウェスタンブロットを示す。
【図5】
EMにより可視化されたRSV/Aウイルス出発材料を示す。
【図6】
EMにより可視化された、NaDOCで分割したRSV/Aウイルスを示す。
【図7】
EMにより可視化されたPIV3ウイルス出発材料を示す。
【図8】
EMにより可視化された、NaDOCで分割したPIV3ウイルスを示す。
【図9】
EMにより可視化されたHSV2ウイルス出発材料を示す。
【図10】
EMにより可視化された、サルコシルで分割したHSV2ウイルスを示す。
【図11】
分割RSVを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(2回目の投与後)を示す。
【図12】
分割RSVを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗RSV/A中和抗体力価(2回目の投与後)を示す。
【図13】
分割RSVを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗FG IgGアイソタイプ応答(2回目の投与後)を示す。
【図14】
分割RSVを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(1回目の投与後)を示す。
【図15】
分割RSVを用いて鼻腔内経路により免疫した非感作マウスにおける抗FG抗体(ELISA)力価(2回目の投与後)を示す。
【図16】
分割RSVを用いて鼻腔内経路により免疫した非感作マウスにおける抗RSV/A中和抗体力価を示す。
Claims (18)
- 鼻腔内送達用のワクチン製剤の製造における、分割インフルエンザウイルス調製物以外の分割エンベロープウイルス調製物の使用。
- 分割エンベロープウイルス調製物が、単独または混合物としての、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、および単純ヘルペスウイルスである、請求項1に記載の使用。
- 分割エンベロープウイルス調製物が、ウイルス膜断片、ウイルス膜エンベロープタンパク質、ウイルス基質、および核タンパク質を含む、請求項1または2に記載の使用。
- 1種以上の残留する分割剤をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 残留する分割剤が、ラウレス(laureth)9、NaDOC、サルコシル(Sarcosyl)、Tween 80TM、およびTriton X−100TMからなる群より選択される、請求項4に記載の使用。
- 分割剤がNaDOCまたはサルコシルである、請求項5に記載の使用。
- 安定化剤をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 安定化剤が界面活性剤である、請求項7に記載の使用。
- 界面活性剤が、単独または混合物としての、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN80TM)、t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(TRITON X100TM)、およびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルである、請求項8に記載の使用。
- アジュバントをさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のワクチン製剤の製造方法であって、
(a) エンベロープウイルスを分割すること、
(b) 場合により、分割したエンベロープウイルス調製物を安定化剤と混合すること、
(c) 場合により、分割したエンベロープウイルス調製物をアジュバント(キャリアーおよび/または免疫刺激剤)と混合すること、
を含んでなる、上記方法。 - 安定化剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN 80TM)、t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(TRITON X100TM)、およびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルからなる群より選択される少なくとも1種の界面活性剤である、請求項11に記載のワクチン製剤の製造方法。
- 疾病の予防または治療用の鼻腔内ワクチン製剤の製造における、分割インフルエンザウイルス調製物以外の分割エンベロープウイルス調製物の使用。
- (a) 分割エンベロープウイルス調製物、および(b) 鼻腔内送達装置を含んでなる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の鼻腔内ワクチン製剤の送達用キット。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のワクチンを含んでなる鼻腔内送達装置。
- 圧閾値装置である、請求項15に記載の装置。
- エンベロープウイルスが原因で起こる疾病にかかりやすい、または該疾病にかかっている哺乳動物を保護または治療する方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載のワクチンを鼻腔経路で投与することを含んでなる、上記方法。
- ワクチン製剤がセロポジティブおよびセロネガティブ個体において免疫原性がある、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法、使用、キットまたは装置。
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