CZ2003931A3

CZ2003931A3 - Vakcinační prostředek

Info

Publication number: CZ2003931A3
Application number: CZ2003931A
Authority: CZ
Inventors: Brigitte Desiree Alberte Colau; Marguerite Deschamps
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S. A.
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2003-10-15
Also published as: HUP0302643A2; ZA200302522B; PL362705A1; CN1477971A; KR20030031200A; AU2002213984A1; BR0114393A; NO20031483L; WO2002028422A2; WO2002028422A3; GB0024089D0; NO20031483D0; CA2427842A1; JP2004510744A; IL155072A0; EP1324769A2; US20040022808A1

Description

Oblast techniky

Popisují se nové vakcinační prostředky, způsoby výroby takových vakcín a použití uvedených vakcín pří prevenci nebo léčbě onemocnění. Dále se popisují vakcíny zahrnující prostředky tvořené štěpenými viry s obalem.

Dosavadní stav techniky

Virus s obalem je virus, jehož jádro je obaleno vnějším obalem, který obsahuje virové proteiny a je bohatý na lipidy.

V určitém provedení vynálezu vakcinační prostředky obsahující štěpené viry s obalem se získaly z respiračního syncyciálního viru. Nebezpečí infekce viry s obalem je zobrazeno v publikacích, kde se popisují RSV.

Lidský respirační syncyciální virus (RSV) rodiny Paramyxoviridiae a způsobuje onemocnění dýchacích, zvláště u malých dětí a kojenců, naznačují, že RSV je také důležitý patogen zvláště u přestárlých lidí.

je člen virové spodních cest Jisté zprávy u dospělých,

RSV je virus s obalem obsahující genom tvořený neděleným, negativním řetězcem kyseliny ribonukleové (RNA) obsahujícím 15 222 nukleotidů. Genom kóduje 11 informačních RNA, přičemž každá kóduje jeden polypeptid. Tři z jedenácti proteinů jsou transmembránové povrchové proteiny. Jsou to proteiny G (zachycení), F (fúze) a SH. Jeden protein je matricový protein virionu (Μ) , tři proteiny jsou složky nukleokapsidu (A, P a L) a 2 proteiny se nepodílejí na struktuře viru (NSl a NS2) . Existují dva další proteiny M2-1 a M2-2. Jsou popsány dvě ·· · · ·· ···· • · · · · · • · · · · · · · antigenně odlišné podskupiny Charakterizace kmenů z těchto rozdíly spočívají v proteinu konzervativní.

RSV, označené jako A a B. podskupin ukázala, že hlavní G, zatímco proteiny F jsou

Výskyt respiračního syncyciálního viru (RSV) je sezónní, V mírném pásmu se vrchol jeho výskytu objevuje během zimy a v tropickém pásmu během období dešťů.

RSV způsobuje vážná onemocnění dolních cest dýchacích u dětí. Odhaduje se, že u 40 až 50 % dětí hospitalizovaných s bronchítidou a u 25 % dětí hospitalizovaných se zápalem plic je toto onemocnění způsobené infekcí RSV. Primární infekce RSV se obvykle objevuje u dětí mladších jednoho roku. 95 % dětí ve dvou letech vykazuje seroligicky důkazy o prodělané infekci a stejné důkazy je možné zjistit ve 100 % u dospělých.

U kojenců a malých dětí ve 40 % infekce postupuje z horních cest dýchacích do dolních cest dýchacích a dochází k vývoji bronchitidy nebo pneumonie. U dětí ve věku dvou až šesti měsíců je velké nebezpečí vývoje vážné infekce RSV (primární respirační selhání) a pro děti libovolného věku, které trpí onemocněním srdce nebo plic, pro nedonošené děti a děti, které jsou imunokompromitované, může dojít k vážným komplikacím.

Během celého života může dojít k opakované infekci se všemi symptomy, a je zřejmé, že RSV je důležitý patogen pro dospělé, zvláště pro staré lidi.

U dospělých se většinou infekce RSV podceňuje, protože se považuje převážně za dětskou infekci. Proto se důkaz RSV nepovažuje za podstatný k vysvětlení respiračního onemocnění. Navíc je obtížné RSV identifikovat v nosních sekretech u • •toto · to · ·· · • to to to ···· · * · ·· ··· ·· ··· · · ··· ···· ···· ····· ·· ·· ·· ·>

dospělých, kteří již mají určitý stupeň imunity vůči viru. U mladých a středně starých dospělých jedinců dochází při infekci RSV k vývoji dlouhotrvajícího syndromu podobného rýmě. U starých jedinců dochází k vývoji dlouhotrvajícího respiračního syndromu, který je těžko odlišitelný od chřipky. V tomto případě se projevují symptomy zánětu horních cest dýchacích doprovázených onemocněním dolních cest dýchacích, které zahrnují pneumonii. Zvláště se uvažuje populace starých lidí žijících pohromadě v různých institucích, protože zahrnuje velký počet jedinců náchylných k infekci, kteří žijí pohromadě. Rozšíření infekce v takové populaci, kde jedinci mají řadu zdravotních problémů, které způsobují daleko vážnější průběh infekce, se velmi těžko kontroluje.

Dále, zprávy jistých studií hodnotící dopad infekce RSV, jako příčina hospitalizace u dospělých a v komunitě zdravých starých lidí, zdůrazňují důležitou úlohu infekce RSV u vážných onemocnění dolních cest dýchacích v této populaci. RSV se identifikoval jako jeden ze čtyř nejběžnějších patogenů, který způsobují vážné onemocnění dolních cest dýchacích, které vede k hospitalizaci dospělých. Také se ukázalo, že vážná infekce RSV u starých osob není omezena na pečovatelské domy nebo epidemie. Infekce RSV způsobuje vážné onemocnění pacientů vysokého věku, kteří jsou členy hospitalizace v případě chřipky A, s infekcemi RSV, je také spojena komunity, která je s vysokou

Podobně spoj ena úmrtností, s dlouhým pobytem v nemocnicí, s vysokými náklady intenzivní péče a potřebou podpůrného dýchání.

Tyto studie zdůrazňují nutnost vytvoření účinné vakcíny, která může zabránit vážným komplikacím infekce RSV, zvláště u malých dětí, dospělých a v komunitě starých zdravých nebo nemocných jedinců.

• ·· · • · · · ··· * « · • · · · · ··· 9 9 9 ⁴ ·· · ·· 9 9 9 9 9 9 9 9

Podobná nebezpečí nesou i další viry s obalem a proto je stále nutné účinně bránit propuknutí infekce a onemocnění způsobenými takovými viry.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje použití prostředků tvořených štěpenými viry s obaly, které jsou jiné než prostředky tvořené štěpeným virem chřipky, při výrobě vakcinačního prostředku vytvořeného pro intranasální zavedení.

Prostředek s výhodou zahrnuje farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku.

Vakcinační prostředky podle vynálezu se získaly od virů s obalem, které je možné štěpit. Viry s obalem se získaly z různých zdrojů, které zahrnují viry pocházející z člověka nebo zvířete. V případě, že virus nepochází z člověka, jako je například bovinní virus, jde s výhodou o rekombinantní virus.

Vakcinační prostředky podle vynálezu jsou po zavedení schopny stimulovat ochrannou imunitní odezvu proti viru s obalem.

Termín „virus zahrnuje všechny viry s obalem (mimo libovolný virus chřipky) :

1) Paramyxoviry, jako jsou respirační syncyciální virus (A a Β) , virus parachřipky (jako je PIV-3), metapneumovirus, spalničkový virus, virus příušnic,

2) herpes viry, jako je virus Epstein-Barrové, virus herpes simplex, cytomegalovirus,

3) flavivirus, jako je virus dengue, virus žluté zimnice, virus klíšťové encefalitidy, virus japonské encefalitidy, ····· ·· · • · ····· · · · • · · · » · ···· ··· ·· ·· ·· ·· ··

4) togaviry, jako je virus zarděnek, východní, západní a venezuelský virus koňské encefalitidy a

5) retrovirus, jako je HIV.

Vakcinační prostředek podle vynálezu zahrnuje více než jeden štěpený virový prostředek.

Vakcinační prostředek zahrnuje antigen nebo antigeny patogenů v kombinaci se štěpeným prostředkem, aby došlo k další ochraně proti onemocnění. Vhodné antigeny, které nemusí pocházet ze štěpených prostředků zahrnují například antigeny z libovolných virů uvedených shora v textu a patogeny, které způsobují respirační onemocnění. Jsou to například mikroorganizmy Streptococcus Pneumoniae.

Dělení virů se provádí porušením nebo fragmentací celého viru, který je infekční (virus divokého typu nebo atenuovaný) nebo neinfekční (například deaktivovaný) pomocí činidla, které je v obecném případě, ale ne povrchově aktivní činidlo. Štěpeným virem může chimérický rekombinantní virus, který obsahuje elementy z více jak jednoho odlišného viru. Porušení vede k úplnému nebo částečnému rozpuštění všech virových proteinů, které mění integritu viru.

štěpícího nezbytně, také být imunogenní

Štěpený virus je možné získat tak, že se virus uvede do kontaktu se štěpícím činidlem podle vynálezu, přičemž dojde k plnému porušení virového obalu. Další virové proteiny se stávají zcela nebo částečně rozpustné. Ztrátou integrity po štěpení se virus stává neinfekční a je tak vhodný pro titrační testy in vitro. Po rozštěpení nejsou proteiny virového obalu spojeny s celými neporušenými viriony. Další virové proteiny jsou s výhodou po štěpení zcela nebo částečně rozpouštěny a

	♦ · • · • ·	• · · · • · · • 9 9 9 9	• · ··· · • * · • 99

• ·	• ·	• · 9 9	• · 9 ·

proto nejsou spojeny nebo jsou pouze částečně spojeny s celým neporušeným virionem.

Účinek štěpícího činidla na obal viru a virové proteiny může být následován migrací štěpeného viru a virových proteinů v experimentech na sacharózovém polštáři s vizualizací analýzou Westernovým přenosem a elektronovou mikroskopií.

Příprava štěpených vakcinačních prostředků podle vynálezu může zahrnovat další kroky odstranění štěpících činidel a některých nebo většiny virových lipidových materiálů. Způsob přípravy štěpeného obalového viru může dále zahrnovat řadu různých filtrací a/nebo jiných separačních kroků, jako je ultracentrifugace, ultrafiltrace, zónová centrifugace a chromatografické kroky v různých kombinacích a deaktivační kroky, například s formaldehydem nebo β-propiolaktonem nebo ozářením UV zářením, které je možné provést před štěpením nebo po něm. Proces štěpení se může provést dávkovým, kontinuálním nebo semi-kontinuálním způsobem.

Štěpené vakcinační prostředky podle vynálezu v obecném případě obsahuje membránové fragmenty a proteiny obalu stejně jako membránové proteiny, jako je virový matrixový protein a jaderný protein v případě, že nejsou přítomny podstatné celé viriony. Štěpené vakcinační prostředky podle vynálezu budou obvykle obsahovat většinu nebo všechny virové strukturální proteiny, ačkoliv jejich zastoupení nemusí být ve stejném poměru, jak se vyskytují v celém viru. Výhodné prostředky obsahující štěpený virus zahrnuje alespoň polovinu virových strukturálních proteinů, přednostně všechny takové proteiny. Vakcinační prostředky na druhou stranu obsahují jeden nebo několik vysoce čištěných virových proteinů. Vakcinační prostředky mohou například obsahovat čištěné virové povrchové • · • · · · proteiny, o nichž se ví, že zodpovídají za uvolnění požadovaných protilátek, které neutralizují virus.

Podle vynálezu je možné použít různá štěpící činidla, jako jsou neionogenní a inogenní povrchově aktivní činidla. Příklady štěpících činidel použitelných v souladu s vynálezem zahrnují:

1) Kyseliny žlučové a její deriváty. Žlučové kyseliny zahrnují kyselinu cholovou, deoxycholovou, chenodeoxycholovou kyselinu, litocholovou kyselinu, ursodeoxycholovou kyselinu, hyodeoxycholovou kyselinu a deriváty, jako jsou glyko-, tauro-, amidopropyl-l-propansulfonové deriváty, amidopropyl-2-hydroxy-l-propansulfonové deriváty shora v textu popisovaných žlučových kyselin nebo Ν,Ν-bis(3D-glukonoamidopropyl) deoxycholamid. Zvláštním příkladem je deoxycholát sodný, NaDOC.

2) Neinogenní povrchově aktivní činidla jsou oktoxynoly (série Triton^(tm)) , polyoxyetylenetery, jako je polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80^(tm)) a polyoxyetylenetery nebo polyoxyetylenestery obecného vzorce I:

HO (CH₂CH₂O) _n-A-R (I) kde symbol n je od 1 do 50, symbol A je vazba nebo skupina —C(O)—, symbol R je Ci_₅₀alkyl nebo fenylCi_₅oalkyl a kombinace dvou nebo více uvedených skupin. Zvláštní příklady jsou Tween80^(tm), Triton X-100^(tm) a lauret 9.

3) Alkylglykosidy nebo alkylthioglykosidy, kde řetězec alkylu obsahuje šest až osmnáct uhlíků, v typickém případě osm až čtrnáct uhlíků, cukerná část je libovolná pentóza nebo hexóza nebo její kombinace s různými vazbami, jako l-»6,

1—>5, 1—»4, l-»3, 1-2. Řetězec alkylu může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený.

4) Deriváty sloučenin uvedených v odstavci 3 shora v textu, kde je modifikována jedna nebo více hydroxylových skupin, s výhodou 6 hydroxylových skupin, jako jsou estery, etoxyláty, sulfáty, etery, uhličitany, sulfosukcináty, isethionáty, eterkarboxyláty, sloučeniny kvarterních aminů.

5) Acylové cukry, kde acylový řetězec obsahuje šest a osmnáct uhlíků, v typickém případě 8 a 12 uhlíků, cukernou složkou je libovolná pentóza nebo hexóza nebo jejich kombinace s různými vazbami, jako 1—>6, 1—>5, 1—>4, l->3, 1-2. Acylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený.

6) Sulfobetainy se strukturou R-N,N-(Rl,R2)-3-amino-l-propansulfonát, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec arylalkylový řetězec obsahující 6 až 18 uhlíků, v typickém případě 8 až 16 uhlíků. Alkylový řetězec R může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený. Symbol Rl a R2 znázorňuje alkylové řetězce obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, v typickém případě 1 atom uhlíku.

7) Betainy se strukturou R-N,N-(R1,R2)-glycin, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 18 uhlíků. V typickém případě 8 až 16 uhlíků. Alkylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený. Symbol Rl a R2 jsou alkylové řetězce obsahující 1 až 4 uhlíky, v typickém případě 1 atom uhlíku.

8) Polyoxyetylenalkyleter se strukturou R-(O-CH2-CH2) _n“0H, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 20 uhlíků v typickém případě 8 až 14 uhlíků.

• · · * ·· ·· ♦··· ····· « · · • · »♦·«· 4 4 9

Štěpený vakcinační prostředek obsahuje alespoň jedno povrchově aktivní činidlo, kterým může být určité neionogenní povrchově aktivní činidlo. Po štěpení viru může ve směsi zbýt jedno nebo více neionogenních povrchově aktivních činidel nebo se může ke směsi přidat. Věří se, že štěpený antigenní materiál se stabilizuje v přítomnosti neionogenního povrchově aktivního činidla. Vhodná stabilizující neionogenní povrchově aktivní činidla zahrnují oktoxynoly (série Triton^(tm)) , polyoxyetylenetery, jako je polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80^(trtl)) a polyoxyetylenetery nebo estery obecného vzorce I:

HO (CH₂CH₂O) _n~A-R (I) kde symbol n je 1 až 50, , symbol R je Ci-₅₀alkyl více možností.

symbol A je vazba nebo skupina -C(O)nebo fenylCi-₅o a kombinace dvou nebo

Výhodná neinogenní povrchově aktivní činidla ze série Tritonu zahrnují Triton X-100 (t-oktylfenoxypolyetoxyetanol), Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305 nebo Triton X-405, Triton N-101. Zvláště se preferuje Triton X-100.

Výhodné neionogenní povrchově aktivní zahrnují polyoxyetylenetery obecného vzorce I v textu. Zvláště pak polyoxyetylen-9-stearyleter, polyqxyetylen-4-lauryleter, polyoxyetylen-23-lauryleter.

činidla dále uvedené shora polyoxyetylen-9-lauryleter, polyoxyetylen-8-stearyleter, polyoxyetylen-35-lauryleter a Nejvýhodnejší je, když polyoxyetylen je polyoxyetylen-9-lauryleter (lauret 9). Alternativní termíny nebo názvy pro polyoxyetylenlauryleter se uvádí v registru CAS. Číslo v registru CAS polyoxyetylen-9laurylu je 9002-92-0. Polyoxyetylenetery, jako jsou polyoxyetylen-9-lauryleter se popisují v indexu Merck (12^th, 7717, Merck&Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA, ISBN • * A A * · · A · A A A A

A * A A A · A · ₉ » • · · · A »A A · * a

9) N,N-dialkylglukamidy se strukturou R-(N-Rl)-glukamid, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 18 uhlíků, v typickém případě 8 až 12 uhlíků. Alkylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený nebo cyklický. Symboly Rl a R2 představují alkylové řetězce obsahující 1 až 6 uhlíků, v typickém případě 1 atom uhlíku. Cukerná složka se může upravit pentózami nebo hexózami.

10) Hecameg se strukturou 6-0-(N-heptylkarbamoyl)-metyl-a-Dglukopyranosid.

11) Alkylfenoxypolyetoxyetanol se strukturou R-C6H4-O-(CH2CH2)n-OH, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 18 uhlíků, v typickém případě 8 uhlíků. Alkylový řetezec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený (symbol n je větší nebo roven třem).

12) Kvarterní amonné sloučeniny se strukturou R, -N⁺(-Rl, -R2,

-R3) , kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 20 uhlíků, v typickém případě dvacet uhlíků. Alkylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený. Symboly Rl, R2 a R3 jsou alkylové řetězce obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, v typickém případě jeden atom uhlíku.

13) Sarkosyl, což je sodná sůl N-laurylsarkosinu.

14) CTAB (cetyltrimetylamoniumbromid) nebo Cetavlon.

Nejvýhodnější štěpící činidla jsou NaDoc a sarkosyl. Aby došlo k účinnému štěpení viru, inkubuje se se štěpícím činidlem při teplotě místnosti, například přes noc. Je-li to vhodné, může se použít kombinace štěpících činidel.

• 4

4 4 4

49

0911910-12-3). Lauret 9 se tvoří reakcí etyloxidu s dodecylalkoholem a má v průměru devět etylenoxidových j ednotek.

Konečná koncentrace stabilizujícího povrchově aktivního činidla v konečném vakcinačním prostředku je s výhodou mezi 0,001 až 20 %, výhodněji 0,01 až 10 % a nejvýhodněji až přibližně 2 % (hmotnost/objem). V případě, že je přítomno jedno nebo více povrchově aktivních činidel, jsou v obecném případě přítomny v konečném prostředku v koncentraci až přibližně 2% každý, 1% každý, v typickém případě v koncentraci 0,6 % každý a více typická je koncentrace 0,2 % nebo 0,1 % každý. Libovolná směs povrchově aktivního činidla může být přítomna ve vakcinačních prostředcích podle vynálezu.

Virus s obalem se může produkovat replikací na vhodném substrátu, v séru nebo postupem, pří kterém se nepoužívá sérum. Viry rostoucí na tkáňových kulturách je možné produkovat například na lidských buňkách, jako je MRC-5, WI38, Hep-2 nebo opičích buňkách, jako je AGMK, Věro, LL_C-Mk₂, FrhL, FrhL-2 nebo bovinních buňkách, jako jsou MDBK, nebo na psích buňkách, jako jsou MDCK nebo primární buňky, jako jsou kuřecí embryonální fibroblasty nebo libovolný jiný typ buněk vhodných pro produkci viru vhodného pro vakcinační účely, které zahrnují klony získané ze shora v textu uvedených buněčných linií.

Štěpený vakcinační prostředek je vhodně kombinován s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou. Používané farmaceuticky přijatelné pomocné látky mohou být ty, které jsou běžné v oboru vakcinačních prostředků. Používané pomocné látky v daném vakcinačním prostředku budou vzájemně kompatibilní a budou také kompatibilní s podstatnými složkami sloučenin tak, že neexistují interakce, které mohou poškodit »· ·* ·* <··♦ • * · · · · • ···· · · 1 ··· ** ·· ·· ·· ··* působení složek a aktivních činidel. Všechny pomocné látky nesmí být samozřejmě toxické a musí vykazovat dostatečnou čistotu, aby je bylo možné použít pro člověka. Vhodné příklady pomocných látek jsou dobře známy v oboru.

Vakcinační prostředky mohou také s výhodou zahrnovat adjuvans, kterým může být nosič a imunostimulant. Adjuvans může zbýt po procesu štěpení a/nebo je možné ho přidat k viru po štěpení. Adjuvans vhodná pro použití ve vakcinačních prostředcích podle vynálezu jsou dobře známa v oboru.

Vynález dále popisuje použití vakcinačního prostředku obsahující štěpený virus s obalem, kterým není štěpený virus chřipky, v kombinaci s adjuvans při výrobě vakcinačního prostředku pro intranasální zavedení. Prostředek s výhodou obsahuje farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku.

Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou použít k ochraně nebo léčbě savců náchylných k onemocnění nebo trpících onemocněním tím, že se jim aplikuje vakcinační prostředek nasální cestou. Vynález také popisuje takové metody léčby a ochrany.

Bez ohledu na nutnost aplikace bolestivých injekcí spojených s negativním účinkem (strach z bodnutí), mukozální vakcinační prostředky aplikované intranasální cestou jsou atraktivní, protože se ukázalo u zvířat, že mukozální aplikace antigenů vykazuje dobrou účinnost při vyvolání ochranné odezvy na mukozálním povrchu, který je cestou vstupu řady patogenů. Navíc se ukazuje, že mukozální vakcinační prostředky, jako jsou intranasální vakcinační prostředky mohou vyvolat mukozální imunitu, nikoliv pouze na nosní sliznici, ale také na vzdálených místech sliznic, jako jsou genitální sliznice. Navzdory výzkumu v této oblasti je stále nutné identifikovat • ta ta··· «ta

·· · ·· bezpečné a účinné vakcinační prostředky pro zavedení, které jsou vhodné pro použití u lidí.

ta· intranasální

Intranasální aplikace podle vynálezu se může aplikovat po kapkách, sprejem nebo aplikací suchého prášku. Vynález dále popisuje vakcinační prostředky ve formě zamlžovače nebo aerosolu.

Podle vynálezu je možné použít libovolné vhodné adjuvans a libovolnou vhodnou formu, jako je roztok, suspenze nebo prášek. Výhodné adjuvans zahrnuje ty látky popsané v dokumentu WO 99/52 549. Výhodná adjuvans zahrnují Tween80^ítm), TritonX100^(tm), lauret 9 a jejich kombinace.

Neionogenní povrchově aktivní činidla se mohou s výhodou kombinovat ' s imunostimulantem například netoxickými deriváty lipidu A, které zahrnuj deriváty popsané v patentovém dokumentu US 4 912 094 a GB 2 220 211 obsahující netoxické deriváty monofosforyllipidu A a difosforyllipidu A, jako je 3de-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) a 3-de-O-acylovaný difosforyllipid A. Výhodnou kombinací je lauret-9 kombinovaný s 3D-MPL. Shora popsané imunostimulanty se mohou také použít v prostředcích, které neobsahují neinogenní povrchově aktivní činidla.

Výhodná forma 3D-MPL je ve formě emulze, kde velikost částic je menší než 0,2 pm a způsob výroby se popisuje v patentovém dokumentu WO 94/21 292. Vhodné prostředky obsahující monofosforyllipid A a povrchově aktivní činidlo se popisuje v dokumentu WO 98/43 670 A2.

Adjuvans získané z bakteriálního lipopolysacharídu v prostředcích podle vynálezu se může čistit a připravovat z bakteriálních zdrojů nebo v jiném případě mohou být • ♦ « ♦ » ·

9 9 9 9 9 · · • 9 99999 99 9

9 9999 9 9 9 9

999 9999 99 99 syntetické. Čištěný monofosforyllipid A se popisuje v publikaci Ribi et al., 1986, Immunology and

Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenům Publ. Corp., NY, p407-419 a 3-0-deacylovaný monofosforyl nebo difosforyllipid A získaný z mikroorganizmu Salmonella sp. popisuje v patentovém dokumentu GB 2220211 a US 4912094. Další čištěné a syntetické lipopolysachyridy se popisují v dokumentu Hilgers et al. , 1986, Int. Arch. Allergy.Immunol., 79(4):3926, Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1): 141-6 a EP 0 549

074 Bl. Zvláště výhodným bakteriálním lipopolysacharidovým adjuvans je 3D-MPL.

Deriváty LPS, které se mohou použít podle vynálezu jsou také imunostimulanty, které jsou svou strukturou podobné derivátům LPS nebo MPL nebo 3D-MPL. Deriváty LPS mohou být acylované monosachyridy, které jsou součástí shora v textu uvedené struktury MPL.

V dalším provedení vynálezu adjuvans je ADP-ribosylující toxin nebo jeho mutant. Příklady takových toxinů jsou tepelně labilní toxin (LT) z mikroorganizmu E. coli a jeho mutanti, jako je LTR192G a fragmenty těchto toxinů, jako je složka vázající gangliosid (LTB).

Dalšími výhodnými adjuvans jsou saponiny, jako je QS21.

Zesílený systém zahrnuje kombinaci derivát netoxického lipidu A a derivát saponinu zvláště v kombinaci QS21 a 3D-MPL, jak se popisuje v dokumentu WO 94/00153 nebo méně aktivní prostředek, kde QS21 je zeslaben cholesterolem, jak se popisuje v dokumentu WO 96/33739.

Výhodné zařízení pro intranasální aplikaci vakcinačních prostředků podle vynálezu jsou sprejové aplikátory. Vhodné fcfc fcfcfcfc fcfc fcfcfc • fc « fcfcfc* • fc fcfcfc fcfcfc fcfc fcfc fc« firma Becton Dickinson, aplikátoru pro nasální nasální sprejové aplikátory dodává Pfeiffer GmBH a Valois.

Činnost výhodných sprejových použití nezávisí na tlaku aplikovaném člověkem, který je používá. Zvláště je možné použít zařízení s tlakovým prahem, protože roztok se uvolňuje s injektoru pouze v případě, kdy se dosáhne tlakového prahu. Tyto zařízení snadněji dosáhnou spreje s regulérní velikostí kapek. Zařízení s tlakovým prahem jsou vhodná pro použití podle vynálezu a popisují se například v dokumentu WO 91/13281 a EP 311 863 B. Taková zařízení v současné době dodává firma Pfeiffer GmbH a také se popisují v publikaci Bomraer, R. Advances in Nasal drug delivery Technology, Pharmaceutical Technology Europe, 1999, p. 26-33.

Výhodná intranasálni aplikátory produkují kapky (měřeno za použití vody, jako roztoku), jejichž velikost je v rozmezí 1 až 500 pm. Když velikost kapek je menší než 10 pm, existuje nebezpečí vdechnutí, proto kapalina tvořící sprej nesmí obsahovat více jak přibližně 5% kapek, jejichž velikost je menší než 10 pm.

Dalším výhodným rysem intranasálního systému zavedení vakcinačního prostředku podle vynálezu je dvou dávkové zavedení. Dvou dávkové zařízení obsahuje dvě „sub-dávky jedné dávky vakcinačního prostředku, přičemž se každá sub-dávka aplikuje do jedné nosní dírky.

Vynález dále popisuje intranasálni zaváděcí zařízení obsahující štěpený vakcinační prostředek podle vynálezu.

Vynález dále popisuje farmaceutickou sadu obsahující zde popsané intranasálni aplikační zařízeni nebo intranasálni ·· ·»··

aplikační zařízení a štěpený vakcinační prostředek, který se používá společně s aplikačním zařízení.

• to to · • ·# • · ··· • to· · • ·♦ to ·« «· to ♦ to

Vynález se nezbytně neomezuje na sprejově zavedení kapalných přípravků. Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou aplikovat v jiných formách, například jako prášek.

Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou použít při profylakci a léčbu. Vynález dále popisuje způsob léčby savců, kteří jsou náchylní k infekčním onemocněním nebo jimi trpí. Vynález dále popisuje zde uvedený vakcinační prostředek, který se používá v medicíně. Vakcinační prostředek se popisuje v publikaci New Trends and Developments in Vaccines, Voliér et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978.

Vakcinační prostředky je možné zavést ve vhodném dávkovém režimu, jako je jednodávkový nebo dvoudávkový režim. Vakcinační prostředky se mohou použít v populaci, která se s infekčním onemocněním ještě nesetkala (to je seronegativní) , ale i v populaci, která má protilátky (seropozitivníj .

Je výhodné, aby přípravky obsahovaly adjuvans a/nebo se adjuvans podává jednotlivcům, kteří už byly vystaveni působení viru.

Vynález dále popisuje způsob produkce vakcinačního prostředku, který zahrnuje kroky

a) štěpení viru s obalem,

b) smíchání přípravku štěpeného viru s obalem se stabilizačním činidlem a

c) smíchání přípravku štěpeného viru s adjuvans (kde adjuvans také může být nosič a/nebo imunostimulant).

·* ♦··♦

Je vhodné, aby způsob obsahoval kroky popsané v odstavci a) a b) , kroky a) a c) nebo kroky a) , b) a c) . Je vhodné, aby stabilizační činidlo obsahující alespoň jedno povrchově aktivní činidlo se vybralo ze skupiny obsahující polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween80^(tm)) , t-oktylfenoxypolyetoxyetanol (Triton X100^(tm>), polyoxyetylen-9-lauryleter.

Vakcinační prostředek vytvořený uvedeným způsobem se smíchá s vhodným nosičem.

Vynález dále popisuje způsoby štěpení virů s obalem, jak se popisuje shora v textu, za použití vhodného štěpícího činidla.

Přehled obrázků na výkrese

Na	obrázku	č. 1	je zobrazen	test	westernův	přenos
štěpeného	RSVA s	anti-F	protilátkou.
Na	obrázku	č. 2	je zobrazen	test	westernův	přenos
štěpeného	RSVA s	anti-M2	! protilátkou.
Na	obrázku	č. 3	je zobrazen	test	westernův	přenos
štěpeného	RSVA s	anti-G	protilátkou.
Na	obrázku	č. 4	je zobrazen	test	westernův	přenos
štěpeného	RSVA s	anti-N	protilátkou.

Na obrázku č. 5 je zobrazen počáteční materiál viru RSV/A, který je zviditelněný metodou EM.

Na obrázku č. 6 je zobrazen počáteční materiál viru RSV/A štěpený NaDOC, který je zviditelněný metodou EM.

•00

0

Na obrázku č. 7 je zobrazen počáteční materiál viru PIV 3, který je zviditelněný metodou EM.

Na obrázku č. 8 je zobrazen počáteční materiál viru PIV 3 štěpený NaDOC, který je zviditelněný metodou EM.

Na obrázku č. 9 je zobrazen počáteční materiál viru HSV2, který je zviditelněný metodou EM.

Na obrázku č. 10 je zobrazen počáteční materiál viru HSV2 štěpený sarkosylem, který je zviditelněný metodou EM.

Na obrázku č. 11 jsou zobrazeny titry protilátek proti FG (hodnoty získané z testu ELISA) (postil) u předem připravených myší imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární nebo intranásalní cestou.

Na obrázku č. 12 jsou zobrazeny titry neutralizujících protilátek proti RSV/A (postil) u předem připravených myší imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární nebo intranásalní cestou.

Na obrázku č. 13 jsou zobrazeny odezvy proti izotypu FG IgG (postil) u předem připravených myší imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární nebo intranásalní cestou.

Na obrázku č. 14 jsou zobrazeny titry protilátek proti FG (hodnoty získané z testu ELISA) (posti) u předem připravených myší imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární nebo intranásalní cestou.

Na obrázku č. 15 jsou zobrazeny titry protilátek proti FG (hodnoty získané z testu ELISA) u myší imunizovaných štěpeným virem RSV intranásalní cestou.

·* »«·· • · · · «·

• · · ·· ·· • ♦ * toto toto

Na obrázku č. 16 jsou zobrazeny titry neutralizujících protilátek u myší imunizovaných štěpeným virem RSV intranásalní cestou.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava štěpených virů

Viry s obalem získané z různých virových rodin se štěpily přidáním štěpících činidel, jako jsou povrchově aktivní činidla. Štěpení se hodnotilo charakterizací migrace štěpených virů v sacharózovém gradientu nebo na sacharózovém polštáři a vizualízace se provedla analýzou SDS-PAGE a přímým testem štěpených virových produktů za použití hodnocení elektronovou mikroskopií.

Štěpené viry popsané v uvedeném příkladu reprezentují různé rodiny virů s obalem. Jsou hodnoceni například členi rodiny Paramyxoviridae (respirační synciciální viry A a B, virus parainluenza 3, virus příušnic a spalničkový virus). Dále se hodnotí rodina Togaviridae (virus zarděnek) a rodina Herpesviridae (virus Epstein-Barrové, cytomegalovirus nebo virus herpes simplex).

Porušení virových částic (štěpení) se provádí tak, že k viru bez buněk se přidá štěpící činidlo, jako je povrchově aktivní činidlo v takové koncentraci, aby došlo k jeho rozpuštění. Jako povrchově aktivní činidla je možné použít žlučové kyseliny a alkylglykosidy. Po přidání povrchově aktivního činidla buď samotného nebo v kombinaci se směs inkubuje až do dosažení dokončení postupu.

Hodnocení účinného štěpení se provede za použití centrifugace v sacharózového gradientu nebo na sacharózovém polštáři. Vzorky ošetřené povrchově aktivním činidlem nebo neošetřené vzorky se aplikovaly na sacharózový gradient nebo polštář a jednotlivé frakce se analyzovaly na gelu v testu SDS-Page. Migrace všech typů virionových proteinů ve frakcích ukazuje účinné štěpení. Vzorky, které se hodnotí shora popsanou analýzou za účinně štěpené, se dále analyzují elektronovou mikroskopií. Vzorky se zviditelnily za použití metod standardního negativního barvení.

Následující specifické štěpící experimenty se provedly s viry RSV, HSV a PIV.

1.1 Podmínky kultivace buněk

Lidské viry RSV/A/Long divokého typu a PIV-3 se replikovaly v buňkách VĚRO stacionárním postupem v kultivačním médiu bez séra. Před infekcí se buňky VĚRO nechaly růst po dobu 4 dní až do dosažení konfluence. Podmínky produkce viru se adaptovaly v případě každého viru: MOI 0,03, 4 dny v případě viru RSV/A, MOI 0,001, 3 dny, teplota 35 °C v případě viru HSV2 a MOI 0,01, 5 dní, teplota 37 °C v případě PIV-3. V den shromáždění viru se po lyži odstranila kapalina se zbytkem buněk, přidal se stabilizátor a vše se zamrazilo při teplotě -70 °C.

1.2 Čištění virů

Po vyčiření pomocí centrifugace při 1 000 xg po dobu 10 minut, se virové částice uložily do peletu srážením s PEG 6000. Pelet se opět resuspendoval v pufru obsahujícím 50 mM Tris, 50 mM NaCl a 2 mM MgSO₄ s hodnotou pH 7,5. Pak následuje ošetření benzonázou. Tento roztok se ultrafiltroval přes • 4 44 • 4 4

4 «94 « * 9

4·94

4 4

9 4 4

44 membránu AGT (molekulová hmotnost 500 000) proti pěti objemům fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem a pak se diafiltroval proti pěti objemům fosforečnanového pufru s hodnotou pH 7,5.

Přítomnost neporušených virových částic se potvrdila metodou EM a centrifugací na sacharózovém polštáři, jak se popisuje shora v textu. Stanovila se koncentrace proteinu.

1.3 Štěpení viru

Virové částice se štěpily přidáním štěpícího činidla do virového přípravku,’ který neobsahuje buňky.

Aby štěpení bylo účinné, povrchově aktivní činidlo se musí použít v koncentraci vyšší než je jeho kritická micelární koncentrace (cmc). Všechny detergenty se použily v koncentraci vyšší než je jejich hodnota cmc. Studoval se poměr D/P (poměr detergent/proteinu). Účinného štěpení se dosáhlo s poměrem D/P větší nebo rovno hodnotě 25. Tato hodnota je pro štěpení výhodná. Ke štěpení virových částic se používaly následující detergenty v 2% koncentraci: deoxycholát sodný, sarkosyl a přípravky plantacare a lauret 9.

Po štěpení se roztoky dialyzovaly proti pufru tvořeném 10 mM PO₄, 150 mM NaCI, hodnota pH je 7,5 a odstranil se nadbytek detergentu.

Proces štěpení je shrnut dále v textu v případě RSV.

RSV-A: čištění viru

Centrifugace za použití rotoru Beckman JA10 při 3 500 ot./min. (1 000 x g), při teplotě 4 °C po dobu 10 minut

9999

99 99 99

99 *99 99 9 qq 9 9 9 9 9 999 9 9 9

Z2 ·· ··· 99 999 9 9

999 999 9 9999

999 99 «9 9* 4« 99

-> vyčiřený supernatant srážení s 10 % PEG 6000 pomalé míchání po dobu 90 minut při teplotě 4°C centrifugace při 3 500 ot./min. (1 OOOx g) po dobu 20 minut pelet se resuspendoval v pufru, který zahrnuje 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 2 mM MgSO₄ a hodnota pH je 7,5.

Φ ošetření benzoázou v koncentraci 125 jed./ml inkubace trvala po dobu minimálně 4 hodiny za stálého míchání

Φ ultraf iltrace: AGT - VAGE4A - mol. hmotn. 500 000 -420 cm² objemů proti pufru obsahujícímu 10 mM PO₄(Na), 150 mM NaCl, hodnota pH 7,5

Φ štěpení přidání detergentu => < 2% konečná koncentrace, inkubace přes noc při teplotě místnosti za pomalého míchání

Φ vyčiření filtrace přes membránu sartopure 300 (GF2-hloubka filtru je 1,2 pm) ;

ultrafiltrace: eliminace detergentu - koncentrace 5 objemů 20 mM PO₄(Na), hodnota pH je 7,5 pak 5 objemů 10 mM PO₄(Na)/150 mM NaCl hodnota pH je 7,5 Φ štěpení

1.4 Charakterizace štěpeného viru

	··	··	··	»·	····
• ·	•	• ·	•	• ·	•
• ·	•	• ·	···	• ·	•
• ·	•	• ·	• ·	• ·	• ·
··	··	··	··		··

Integrita počátečních virů a kvalita štěpení se stanovila ultracentrifugací za použití 30 % sacharózového polštáře (po dobu jedné hodiny při 50 000 ot./min na rotoru TL100 Beckman). Frakce se analyzovaly specifickými testy westernovým přenosem. U některých frakcí se provedl test elektronovou mikroskopií a stanovil se infekční titr.

1.4.1 Ultracentrifugace

Centrifugační kivety se naplnily 30 % roztokem sacharózy (450 μΐ), analyzovaný vzorek se jemně a opatrně nanesl na tento sacharózový polštář a pak proběhla centrifugace po dobu 60 minut při 50 000 ot./min. při teplotě 4°C za použití rotoru Beckman TL 100. Po centrifugaci se obsah kivety rozdělil do tří částí. Vrchní vrstva (o objemu asi 300 μΐ) se nazývá supernatant. Střední fáze (o objemu 300 μΐ) je fáze rozhraní mezi vzorkem a sacharózovým polštářem, která se nazývá střední fáze. Nejnižší fáze (o objemu 300 μΐ) je roztok na dně kivety, který obsahuje resuspendovaný pelet. Po centrifugaci dojde k integrací viru v peletu.

Tyto tři frakce se dále analyzovaly.

1.4.2 Analýza westernovým přenosem

Tato analýza umožňuje testovat integritu (pozitivní frakce peletu) a je možné stanovit účinnost štěpení (frakce, ve kterých se vyskytují všechny nebo většina strukturních proteinů, jako jsou obalové proteiny).

Při charakterizaci specifických virových proteinů se mohou použít specifické protilátky.

U štěpených a neštěpených frakcí RSV-A se analyzoval obsah antí-F proteinu (povrchový protein), anti-G proteinu (povrchový protein), anti-N proteinu (nukleokapsid) a anti-M proteinu.

V případě viru PIV-3 se ve štěpených a neštěpených frakcí analyzoval obsah proteinu NH s monoklonální protilátkou a obsah proteinů F, M, HN pomocí polyklonální protilátky.

V případě štěpených a neštěpených frakcí HSV se analyzoval obsah G proteinu, obalový protein a kapsidový protein pomocí protilátek.

Kritéria pro štěpení

Přítomnost pozitivního signálu při westernově přenosu (WB) proti všem čtyřem proteinům se testoval ve frakci peletu a absence signálu ve dvou dalších frakcí před štěpením naznačuje přítomnost celého neporušeného viru ve virovém přípravku.

Štěpení se považuje za účinné v případě, že se porušil obal a proteiny obalu se detekovaly v supernatantu a/nebo ve střední frakci. V případě RSV je štěpení účinné, když se například protein F nebo G stanovil ve frakcích S nebo M. Protein F a G se lokalizovaly s výhodou ve vrstvách S a/nebo M a nikoliv v peletu.

Shrnutí výsledků

Výsledky v případě RSVA jsou zobrazeny na obrázcích 1 až

4.

Ve všech výsledcích westernová.přenosu „split-O znamená virus před štěpením. Symboly „S, „M a „P znamenají • · • ··· • · · · · • · · · • · · · · ··· · · · · ···· • · · · · · · ·· ·· · · supernatant, střední fáze a pelet, které se odebraly po ultracentrifugací vzorku na sacharózovém polštáři. Dráhy se číslují zleva doprava. Objemy značí množství vzorku naneseného do gelu SDS-Page.

Obrázek č. 1 zobrazuje westernův přenos který se testoval monoklonální protilátkou B4 štěpeného anti-F).

RSVA,

V horním panelu:

Ve spodním panelu:

1	STD	10 μΐ
2	SpEt - 0	10 μϊ
3	Split 0 - S	10 μϊ
4	Split 0 - M	10 μϊ
5	Split 0 - P	10 μϊ
6	Split DOC - S	10 μΐ
7	Split DOC-M	10 μϊ
8	Split DOC -P	10 μΐ
9	Split sarfco - S	10 μΐ
10	Split saifco - M	10 μΐ
11	Split sarfeo - P	10 μϊ

1	STD	10 μϊ
2	, νζ. pufr ,	10 μΐ
3	Split Ο - S	10 μϊ
4	Split O - Μ	10 μΐ
5	Split O - P	10 μϊ
6	Split planta - S	10 μ
Ί	SpEt planta - M	10 μϊ
8	SpEt planta - P	10 μϊ
9	SpEt laureti 9 - S	10 μΐ
10	SpEt lauret 9 - M	10 μϊ
11	SpEt lauret 9-P	10 μϊ
12	STD	10 μΐ

Obrázek č. 2 znázorňuje westernův přenos, štěpeného který se testoval monoklonální protilátkou proti proteinu

V horním panelu:

Ve spodním panelu:

RSVA,

M.

1	STD	10 μΐ
2	SpEt- Ο	20 μΐ
3	Split Ο - S	20 μϊ
4	SplitO-M	20 μϊ
5	SpEt Ο - Ρ	20 μϊ
6	SpEt DOC-S	20 μϊ
7	Split DOC - Μ	20 μΐ
8	SpEt DOC-Ρ	20 μϊ
9	SpEt sarfeo - S	20 μϊ
10	Split sarfc.0 - M	20 μϊ
11	Split sarfco - P	20 μϊ

1	STD	10 μϊ
2	,νζ. pufr	20 μϊ
3	SpEt Ο-S	20 μϊ
4	SpEt Ο-Μ '	20 μϊ
5	SpEt Ο-Ρ	20 μΐ
6	Split planta-S	20 μϊ
7	Split planta - Μ	20 μϊ
8	• Split planta-Ρ	20 μϊ
9	SpEt lauret 9-S	20 μϊ
10	Split lauret 9 - M	20 μϊ
11	SpEt lauret 9-P	20 μϊ

Obrázek č. 3 ilustruje westernův přenos štěpeného RSVA testovaného monoklonální protilátkou proti proteinu G.

V horním panelu:

Ve spodním panelu:

1	STD	10 μϊ
2	Split-0	20 μϊ
3	SplitO-S	20 μΐ
4	Split 0 - M	20 μΐ
5	SplitO-P	20 μΐ
6	Split DOC - S	20 μΐ
7	Split DOC -M	20 μΐ
8	Split DOC-P	20 μϊ
9	Split sarko - S	20 μΐ
10	Split saAw - M	20 μΐ
11	Split saifeo - P	20μ1

1	STD	10 μϊ
2	ί νζ. pufr '	20 μΐ
3	SplitO-S	20 μΐ
4	Split Ο - Μ	20 μΐ
5	Split Ο — Ρ	20 μΐ
6	Split planta - S	20 μΐ
7	Split planta - M	20 μΐ
8	Split planta - P	20 μΐ
9	Split lauret 9 - S	20 μΐ
10	Splitlaureť 9-M	20 μϊ
11	Split lauret 9 - P	20 μΐ

Obrázek č. 4 znázorňuje westernův přenos štěpeného RSVA testovaného monoklonální protilátkou proti A.

V horním panelu:

Ve spodním panelu:

1	STD	10 μΐ
2	Split - Ο	20 μΐ
3	Split Ο - S	20 μΐ
4	SplitO-M	20 μΐ
5	Split O-P	20 μΐ
6	Split DOC - S	20 μΐ
7	Split DOC-M	20 μΐ
8	Split DOC-P	20 μΐ
9	Split sarfeo - S	20 μΐ
10	Split sarfeo - M	20 μΐ
11	Split sarfeo - P	20 μΐ

1	STD	10 μΐ
2	νζ. pufr	20 μϊ
3	Split Ο - S	20 μΐ
4	SplitO-M	20 μΐ
5	Split Ο — Ρ	20 μΐ
6	Split planta - S	'20μ1
7	Split planta - M	20 μΐ
8	Split planta - P	20 μΐ
9	Split lauret 9 - S	20 μϊ
10	Split lauret 9-M	20 μΐ
11	Split lauret 9 - P	20 μΐ

• · · · · · · ·· ···· • · · · to to · · • · · · ···· * · · ·· · · · ·· ··· · · ··· ···· ···· ····· ·· ·· ·· ··

Přítomnost signálu v kultivačním médiu a ve frakcích supernatantu a libovolný pruh ve frakci peletu po štěpení proteinů F a G vykazují, že virový obal byl zcela rozštěpen. Přítomnost signálu ve všech frakcích v případě proteinů N a M ukazují přítomnost těchto proteinů ve štěpených přípravcích. Tyto výsledky naznačují, že všechny čtyři testované detergenty štěpí virus RSVA.

Analýza signálů proti všem čtyřem proteinům ve všech frakcích a zvláště porovnávací signály proti proteinům N a M po štěpení v kultivačním médiu a frakci supernatantů naznačují, že za testovaných podmínek NaDOC a sarkosyl neštěpí virus, ale jsou schopny porušit všechny virové struktury a rozpouštět strukturální a nestrukturální proteiny.

Podobné výsledky se získaly štěpením PIV, HSV a viru spalniček, které mohou být úspěšně štěpeny za použití 2 % NaDoc nebo sarkosylu.

NaDoc a sarkosyl jsou výhodná štěpící činidla v případě všech virů.

1.5 Virová titrace in vitro

Ztráta integrity po štěpení vede k tomu, že virus není dále infekční. Analýza úspěšného porušení viru je zobrazena snížením virového titru po štěpení 10⁶log.

1.6 Analýza elektronovou mikroskopií (EM)

Analýza elektronovou mikroskopií se provedla za použití metody standardního negativního barvení ve dvou krocích, kdy se jako kontrastní činidlo použije fosfotungstát sodný (popisuje se v publikaci Hayat and Miller, 1990, Negative ··· · · · · · · fc · • fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc

Staining, McGraw, ed. Hill). Na mřížce se posuzoval štěpený patern materiálu.

Analýza neštěpených virů RSVA, HSV2 a PIV3 a virů štěpených pomocí NaDoc nebo sarkosylem podporuje pozorování získané analýzou westernovým přenosem.

Obrázek č. 5 ilustruje počáteční materiál viru RSV/A zviditelněný EM. Obrázek č. 6 zobrazuje počáteční materiál viru RSV/A po štěpení pomocí NaDOC. Obrázek č. 7 zobrazuje počáteční materiál viru PIV3 zviditelněný elektronovou mikroskopií. Obrázek č. 8 zobrazuje virus PIV 3 po štěpení pomocí NaDOC. Obrázek č. 9 zobrazuje počáteční materiál viru HSV2 zviditelněný elektronovou mikroskopií. Obrázek č. 10 zobrazuje virus HSV2 po štěpení sarkosylem.

Neštěpený virus (celý neporušený virus) obsahoval relativně dobře chráněné nebo slabě poškozené virové částice a nějaký amorfní materiál. Viry štěpené NaDoc a sarkosylem jsou zobrazeny jako heterogenní smír amorfního materiálu, který je do různého stupně agregovaný. Podobná data se získala se všemi testovanými viry. Jsou to RSV, PIV a HSV. Navíc několik identifikovaných struktur, pocházejících z virového obalu nebo jaderných proteinů se pozorovaly v případě RSV nebo PIV.

Příklad 2: Imunogennost štěpených vakcín u myší

Štěpené přípravky RSV a/nebo PIV se používaly jako imunogeny pro vakcinaci myší, aby bylo možné zjistit jejich imunogennost. Osm týdnů staré samice myší se imunizovaly intranasálním štěpeným vakcinačním prostředkem. Myším se neaplikovala kontrola tvořená samotným adjuvans. Dvě dávky se aplikovaly v intervalu sedmi týdnů.

• 4 ·· 44 4444 • 4 4 4 4 4 4

9 4449 4 4 ·

444 4444 4 4··

444 44 44 44 44 44

Dva týdny po aplikaci konečné dávky se zvířata usmrtila, odebrala se krev, slezinné buňky a/nebo se provedl výplach nosu. Humorální imunitní odezva specifická pro virus se odhadla testováním myšího séra za pomocí testů ELISA, které jsou specifické pro virus. Navíc profil izotypu protilátkové odezvy se stanovil za použití testů specifických pro izotyp. Přítomnost neutralizačních látek v séru se odhaduje za použití testu neutralizace specifického viru. Vyvolání relevantní lokální imunitní odezvy se může hodnotit testem, kdy se neutralizují protilátky v nosním výplachu nebo v jiném případě v testu stanovení IgA specifického pro virus v nosním výplachu.

Vyvolání buněčné imunitní odezvy specifické pro virus se hodnotilo stimulací in vitro slezinných buněk a měřením buněčné proliferace (pohlcení tritiovaného thymidinu) a/nebo vylučováním IL-5 a IFNy ve stimulovaných buňkách.

Při odhadu dopadu proměnných v experimentu se klade důraz na kvalitu a sílu odezvy vyvolanou štěpenými přípravky.

2.1 Štěpené přípravky RSV

Následující série experimentů ukazuje, že štěpené viry, jako je RSV, vyvolávají silnou imunitní odezvu, když se aplikují intranasální cestou IN. Za účelem přesněji reagovat na stav imunitního systému dětské (nedotčené) populace nebo přestárlých lidí (už přišli do kontaktu s virem a nesou protilátky) se imunogennost hodnotila buď u zvířat, která nesou nebo nenesou protilátky a demonstrovala se u obou uvedených populací. Pro porovnání se používalo IM zavedení.

V první sadě experimentů se používaly osm týdnů staré samice myši Balb, aby se testovala imunogennost štěpeného přípravku RSV aplikovaného buď cestou IM nebo IN. Primární imunizace se provedla intranasální aplikací 3xl0⁵ jednotek tvořících plaky živého viru RSV v objemu 60 pl (2x30 pl) . Tři týdny po primární imunizaci se zvířatům aplikoval vakcinační prostředek obsahující antigen štěpeného viru RSV. Stanovení množství produktu štěpeného viru je založeno na testu ELISA specifickém pro protein F viru RSV, který stanoví množství proteinu F ve štěpeném produktu srovnávané s rekombinantním proteinovým standardem FG. Myši ve skupině A se imunizovaly dvěmi dávkami antigenu štěpeného viru RSV, které obsahují 4,2 pg proteinu F v objemu 100 pl. Dávky se aplikovaly intranasální cestou v intervalu 21 dní. Myši ve skupině B se imunizovaly dvěmi dávkami antigenu štěpeného viru RSV, který obsahuje 4,2 pg proteinu F upraveného 50 pg A1(OH)₃aplikovaného v objemu 100 pl intranasální cestou v intervalu 21 dní. Myši skupiny C se imunizovaly první dávkou antigenu štěpeného viru RSV, který obsahuje 2,7 pg proteinu F v 60 pl a druhá dávka antigenu štěpeného viru RSV se aplikovala o 21 dní později. Druhá dávka obsahuje 4 pg proteinu F v objemu 60 pl a aplikovala se intranasální cestou. Dva týdny po poslední dávce se všechna zvířata usmrtila a hodnotila se imunitní odezva.

Výsledky experimentu jsou zobrazeny na obrázku č. 11 až 16. První měření imunity se hodnotilo testy ELISA, které měří celkový ímunoglobulin specifický pro FG viru RSV (Ig) nebo izotypy IgG specifické pro FG (IgGi a IgG_2A) přítomné v séru vakcinovaných zvířat. V těchto testech se destičky s 96 prohlubněmi potáhly antigenem FG rekombinantního viru RSV a zvířecí sérum se ředilo sériově a aplikovalo se do potažených prohlubní. Vázané protilátky se detekovaly přidáním biotinem značených anti-myších Ig, IgGi nebo IgG_2A, pak následovala amplifikace se streptavidinem konjugovaným s peroxidázou. Vázané protilátky se uvolnily přidáním substrátu OPDA, pak • · · 4 · · 4444 444 44 44 44 44 44 následovalo ošetření 2N H2SO4 a měření optické hustoty (OD) při vlnové délce 490 nm. Titr protilátek se vypočítal za použití softwaru SoftMax Pro (za použití rovnice se čtyřmi neznámými) a vyjádřil se v EU/ml.

Vedle testů ELISA se při charakterizaci kvality imunitní odezvy vyvolané imunizací použily neutralizační testy. V případě neutralizačního testu se na kultivačních destičkách s 96 prohlubněmi inkubovalo dvojnásobné ředění zvířecího séra s virem RSV/A (3 000 jednotek tvořící plaky) a s komplementem morčete po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Přímo do každé prohlubně se přidaly buňky Hep-2 (10⁴ buněk na jednu prohlubeň) a destičky se inkubovaly po dobu 4 dní při teplotě 37 °C. Supernatanty se odsály a do každé prohlubně se přidal komerčně dostupný roztok WST-1. Destičky se inkubovaly po dobu dalších 18 až 24 hodin při teplotě místnosti. Optická hustota se sledovala při vlnové délce 450 nm a titrace se analyzovala lineární regresní analýzou. Uvedený titr je inverze ředění séra, které vede k 50 % snížení maximální hodnoty optické hustoty pozorované u infikovaných buněk.

Obrázek č. 11 znázorňuje výsledky získané testem ELISA celkového lg. U primárně imunizovaných myší se silná protilátková odezva proti FG vyvolala dvojnásobnou vakcinaci, kdy se antigen štěpeného RSV aplikoval cestou IM (skupina A, B) nebo IN (skupina C).

Ve specifickém případě obrázek č. 11 zobrazuje titry protilátek proti FG (test ELISA) (post sekundární vakcinace) u myší iniciovaných živým virem RSV a imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární (IM) nebo intranasální (IN) cestou. Skupině myší A se aplikovaly 2 dávky IM, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného RSV. Myším ve skupině B se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV upraveného cestou IM pomocí adjuvans alum. Myším skupině C se aplikovaly • toto · to to to toto totototo ······· · · to • · · to to to toto · · to ·· to to · toto · to · · · ··· to to to to to to to · • •••to to · ·· ·· «· dvě dávky cestou IN, kdy první obsahuje 2,7 a druhá 4,0 pg štěpeného viru RSV.

Obrázek č. 12 zobrazuje výsledky neutralizačního testu. Protilátková odezva neutralizující virus se vyvolala u těchto primárně imunizovaných zvířat pomocí vakcinace intramuskulární nebo intranasální cestou dvěmi dávkami produktu štěpeného viru.

Specifický obrázek č. 12 zobrazuje titry neutralizačních protilátek proti viru RSV/A (po sekundární vakcinaci) u myší primárně imunizovaných živým virem RSV a imunizovaných intramuskulárně nebo intranasálně štěpeným virem RSV. Myším skupiny A se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV. Myším skupiny B se aplikovaly 2 dávky, kdy každá obsahuje štěpený virus RSV upravený adjuvans, kterým je alum. Myším skupiny C se aplikovaly 2 dávky intranasální cestou, kdy jedna dávka obsahuje 2,7 pg a druhá 4,0 pg štěpeného RSV.

Obrázek č. 13 zobrazuje výsledky analýzy izotypu. Zvířata primárně imunizovaná intranasálně vykazují vyšší poměr IgG2_a:IgGi ve srovnání s daty vytvořenými u myší, které neprošly primární imunizací (popisuje se dále v textu), což naznačuje trend vyvolání více jak jedné odezvy podobné Thi, v případě, že se myši primárně imunizují živým virem (například přirozená situace u populace starých lidí).

Obrázek č. 14 demonstruje, že dokonce po aplikací jediné dávky antigenu dojde k vyvolání silné imunitní odezvy po vakcinaci štěpeným RSV cestou IN u primárně imunizovaných populací. Tak u primárně imunizovaných populací je štěpený virus RSV silný imunogen, který po vakcinaci intranasální cestou vyvolává vysoký titr protilátek.

• ·* · · 9 9 9 9 9 99 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · • · · · · · · · · · « ·· · *· 9 9 99 99 9 9

Ve specifickém případě obrázek č. 14 zobrazuje titry protilátek proti FG (stanoveno testem ELISA) (po primární vakcinaci) u myší primárně imunizovaných živým virem RSV a imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární (IM) nebo intranasální (IN) cestou. Myším skupiny A se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného RSV, intramuskulární cestou. Myším skupiny B se aplikovaly intramuskulárně dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného RSV upraveného pomocí adjuvans, kterým je alum. Myším skupiny C se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,7 a druhá obsahuje 4,0 pg štěpeného RSV. Myši skupiny D se pouze primárně imunizovaly a neaplikovala se jim vakcina. Titry protilátek zjištěné u myší v této skupině jsou pod prahem detekce a stanovily se 21 dní po primární imunizaci.

V druhé sérii dokumentů se k dokumentaci účinku dávky antigenu a adjuvans použily myši, které nebyly primárně imunizovány. Myším se aplikoval antigen štěpeného RSV, kdy první dávka obsahuje 2,4 pg proteinu F (zavedl se v 60 pl to znamená dvakrát ve 30 pl). V případě druhé dávky zavedené o 30 dní později se myším aplikovalo antigen štěpeného viru RSV, který obsahuje 3,5 pg proteinu. Štěpený virus RSV se aplikoval buď bez adjuvans nebo s adjuvans přidáním 5 pg labilního toxinu mikroorganizmu E. coli (LT) nebo polyoxyetylen-9lauryletar v koncentrací 0,5 % (zde se tato látka označuje jako lauret 9) . Kontrolní skupina se imunizovala intranasálně celým čištěným virem RSV, který obsahuje 2,0 pg proteinu F v první dávce a 3,5 pg stejného proteinu ve druhé dávce. Dva týdny po konečné vakcinaci se zvířata usmrtila a hodnotila se imunitní odezva.

Jak je zobrazeno na obrázku 15 a 16, protilátkové odezvy se u myší vyvolaly intranasálně aplikovanými přípravky, které nebyly primárně imunizovány. Zatímco test ELISA (zobrazeno na obrázku č. 15) naznačuje, že odezvy intranasální vakcinace • ·· 4* ·♦ 44 44··

44 444 · φ 4 • 44 4 4 444 44 4 • · 4 4 4 44 «44 4 4 • 4 · 4 44 4 4 44 4 • 4444 44 44 44 44 jsou nižší než ty vyvolané intramuskulárně (obrázek č. 16) neutralizační testy naznačují, že intranasálně aplikované přípravky štěpeného RSV upravené LT jsou stejně dobré, jako aplikované intramuskulárně v případě vyvolání neutralizačních protilátek a že jiné přípravky jsou také porovnatelné s těmi aplikovanými intramuskulárně. Tak u myší, které nejsou primárně imunizované je štěpený virus RSV aplikovaný intranasální cestou také imunogení.

Ve specifickém případě obrázek č. 15 zobrazuje titry protilátek proti FG (test ELISA) (po sekundární vakcinaci) u myší, které nebyly primárně imunizované, ale jsou imunizovány štěpeným RSV intranasální (IN) nebo intramuskulární (IM) cestou. Myším ve skupině A se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině B se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV upraveného pomocí přípravku lauret 9. Myším ve skupině C se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV upraveného LT. Myším ve skupině D se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,0 a druhá 3,5 pg čištěného celého viru. Myším ve skupině E se intramuskulárně aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV.

Obrázek č. 16 zobrazuje titry protilátek neutralizujících RSV/A (po druhé vakcinaci) u myší, které nejsou primárně imunizovány, imunizovaných intranasálně (IN) nebo

intramuskulárně	(IM) .	Myším ve	skupině	A	se	intranasálně
aplikovaly	dvě	dávky,	kdy první	obsahuj e	2,4	a	druhá 3,5 pg
štěpeného	viru	RSV.	Myším ve	skupině	B	se	intranasálně
aplikovaly	dvě	dávky,	kdy první	obsahuje	2,4	a	druhá 3,5 pg

štěpeného viru RSV upraveného pomocí přípravku lauret 9. Myším ve skupině C se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV upraveného LT.

• ·· ·» ·· 444494 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ~ _r 4 4 4 4 4 444 4 4 4 • · · 4 4 · · · 4 4 4

4 44 4 4 44 4 4 4 4

Myším ve skupině D se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy >

první obsahuje 2,0 a druhá 3,5 pg čištěného celého viru. Myším ve skupině E se intramuskulárně aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV.

Tyto experimenty demonstrovaly, že antigen štěpeného RSV je silně imunogenní jak u naivní tak u primárně imunizované populace. Navíc tyto experimenty ukazují, že štěpený RSV se může účinně aplikovat intranasální cestou a je imunogenní.

ΖϋΟ^ • » ·0» 0

0 0 • 0 · • 0»

0 0 ♦ · · • 0 * 40 0 0 *

0 0 · 00 ·«

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití přípravku obsahujícího štěpený virus s obalem, který neobsahuje štěpený virus influenza, pro výrobu vakcinačního prostředku pro intranasální aplikaci.
2. Použití podle nároku 1, kde přípravek obsahující štěpený virus s obalem je buď samotný respirační syncyciální virus, virus paraínfluenza, spalničkový virus a virus herpes simplex nebo jejich směs.
3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde přípravek štěpeného viru s obalem obsahuje fragmenty virové membrány, proteiny obalu virové membrány, virovou matrici a nukleoproteiny.
4. Použití podle libovolného z nároků 1 až 3, které dále zahrnuje jedno nebo více reziduálních štěpících činidel.
5. Použití podle nároku 4, kde reziduální štěpící činidlo se vybralo ze skupiny obsahující lauret 9, NaDoc, sarkosylovou skupinu, Tween 80^(tm) a Triton X100^<tm)'
6. Použití podle nároku 5, kde štěpící činidlo je NaDoc nebo sarkosyl.

99 99 99 99 9999 • 9 9 9 9 9 « 9 9 • · 9 9 9 999 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9· 9* 99 99 99 99
7. Použití podle libovolného z nároků 1 až 6, kde přípravek obsahuje navíc stabilizační činidlo.
8. Použití podle nároku 7, kde stabilizační činidlo je povrchově aktivní činidlo.
9. Použití podle nároku 8, kde povrchově aktivní činidlo je buď samotný polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween80^(tm!) , toktylfenoxypolyetoxyetanol (Triton X100^(tm)) a polyoxyetylen-9-lauryleter nebo jejich směs.
10. Použití podle libovolného z nároků 1 až 9, kde přípravek navíc obsahuje adjuvans.
11. Způsob produkce intranasálního vakcinačního prostředku, kterým není přípravek štěpeného viru influenza, podle libovolného z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky

a) štěpení viru s obalem a

b) smíchání přípravku štěpeného viru s obalem se stabilizačním činidlem a

c) smíchání přípravku štěpeného viru s obalem s adjuvans (nosič a/nebo imunostimulant).
12. Způsob výroby vakcinačního prostředku podle nároku 11, vyznačující se tím, že stabilizační činidlo je alespoň jedno povrchově aktivní činidlo vybrané ze skupiny zahrnující polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween80^<tm)) , t-oktylfenoxypolyetoxyetanol (Triton X100^(tm)) a polyoxyetylen-9-lauryleter.
13. Použití vakcinačního prostředku, který obsahuje štěpený virus s obalem, kterým není přípravek obsahující štěpený virus influenzae, při výrobě intranasálního vakcinačního přípravku vhodného pro prevenci nebo léčbu onemocnění.
14. Sada pro zavedení intranasálního vakcinačního prostředku podle libovolného z nároků 1 až 10, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje

a) přípravek obsahující štěpený virus s obalem a

b) zařízení pro intranasální zavedení.
15. Zařízení pro intranasální zavedení, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje vakcinační prostředek podle libovolného z nároků 1 až 10.
16. Zařízení podle nároku 15, vyznačuj ící se tím, žejdeo zařízení s prahem tlaku.
17. Způsob ochrany nebo léčby savce náchylného k onemocnění způsobeným virem s obalem nebo trpícího tímto onemocněním, vyznačující se tím, že zahrnuje nasální aplikaci vakcinačního prostředku podle nároků 1 až 10.

39 :::.:: :**. ·:

··· ···· · ····· · · ·· · ·
18. Způsob, použití, sada nebo zařízení podle libovolného nároku 1 až 17, vyznačující se tím, že vakcinační prostředek je u seropozitivních a seronegativních jedinců imunogenní.

Fy ,

1/16

Obr. 1