WO2006122546A1 - Nicht-peptidische inhibitoren der akap-pka-wechselwirkung - Google Patents

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Walter Rosenthal
Jörg Rademann
Frank Christian
Sina Meyer
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    • C07C2603/12—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing at least one ring with less than six ring members containing five-membered rings only one five-membered ring
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    • C07C2603/58—Ring systems containing bridged rings containing three rings
    • C07C2603/70—Ring systems containing bridged rings containing three rings containing only six-membered rings
    • C07C2603/74—Adamantanes

Definitions

  • the invention relates to non-peptidic molecules which modulate, in particular inhibit, the interaction of protein kinase A (PKA) and protein kinase A anchor proteins (AKAP), and a host or target organism which encodes these non-peptidic compounds or recognition molecules are directed, such.
  • PKA protein kinase A
  • AKAP protein kinase A anchor proteins
  • the invention furthermore relates to a pharmaceutical agent, in particular for the treatment of diseases associated with a disorder of the cAMP signaling pathway, in particular diabetes insipidus, hypertension, diabetes mellitus, duodenal ulcer, asthma, cardiac insufficiency, obesity, AIDS, edema, Cirrhosis, schizophrenia and others.
  • the invention also relates to the use of the molecules according to the invention.
  • the ability of cells to receive and respond to external signals is fundamental to their survival and function.
  • the signals are detected by receptors and converted into a cellular response, which always involves a chemical process.
  • a possible signaling pathway that is the cAMP-dependent signaling pathway. It begins by activating a G protein-coupled, heptahelical transmembrane receptor by an extracellular signal, e.g. By a neurotransmitter or a hormone.
  • the most well-studied example of such a signaling pathway is the beta-adrenergic receptor system in which adrenaline or norepinephrine activate G-protein-coupled, beta-adrenergic receptors (GPCR v. G protein-coupled receptor).
  • GPCR v. G protein-coupled receptor the beta-adrenergic receptors
  • a distinction is made between the subtypes beta x , beta2 and beta 3 , which differ in terms of their tissue distribution and ligand affinity.
  • the receptor thus activated transmits the signal to a heterotrimeric, guanosine triphosphate-binding protein (GTP-binding or G protein); this then exchanges bound GDP for GTP and is also activated.
  • GTP-binding or G protein a heterotrimeric, guanosine triphosphate-binding protein
  • trimer After GTP binding, the trimer dissociates into an alpha subunit and a betagamma subunit. Both subunits are membrane-bound via acylations and can each activate or inhibit their own effectors.
  • G proteins have an intrinsic GTPase activity that can cleave the bound GTP and thus deactivate the G protein, and alpha and beta gamma subunits then form a trimer again. So the G-proteins take over the function of a molecular switch.
  • Different classes of G proteins are distinguished (G 3 , Gi, G q , G olf ) whose subunits can activate or deactivate different effector molecules.
  • the effectors include Ca 2+ and K + channels, phospholipase C-beta and adenylate cyclase (AZ).
  • the adenylate cyclase - also a membrane-bound, occurring in several variants - enzyme is stimulated by G alpha .
  • the cAMP can freely diffuse into the cytosol and activate different effectors. These include cyclic nucleotide-gated (CNG) cation channels that open or close upon cAMP binding, and a family of guanine nucleotide exchange factors (GEF), the so-called Epac (ex- change proteins act ⁇ vated by cAMP).
  • CNG cyclic nucleotide-gated
  • GEF guanine nucleotide exchange factors
  • the latter regulate the small monomeric GTPases Rap-1 and Rap-2, which act as suppressors of Ras.
  • CAMP binding to Epac leads to a conformational change that exposes and activates the GEF domain.
  • Ras can be activated by the GEF function.
  • Ras is involved in MAP kinase (mitogen-activated protein kinase) signaling pathways, which are affected by a variety of proliferation or differentiation-inducing signals, e.
  • MAP kinase mitogen-activated protein kinase
  • cytokines activated.
  • CREB cAMP-responsive element binding proteins
  • CRE cAMP-responsive elements
  • PKA cAMP-dependent protein kinase
  • the protein When inactive, the protein is a heterotetramer consisting of two regulatory (R) and two catalytic (C) subunits.
  • the catalytic subunits are inactive. If the intracellular cAMP concentration increases after stimulation, two cAMP molecules bind to each R subunit. By the resulting conformational change releases the catalytic subunits. They then phosphorylate nearby target proteins at Ser and Thr residues, which in turn undergo these conformational and thus functional changes. The recognition of the target proteins takes place via consensus sequences. Since many different extracellular stimuli converge in the cAMP-PKA pathway, and since PKA is an enzyme with broad substrate specificity, the question arises as to how the numerous different stimuli can trigger different specific cell responses.
  • R- and C-subunits RIalpha, RIbeta, RIIalpha, RKbeta or Calpha, Cbeta, Cgamma, PrKX
  • the RI generally have a higher affinity for cAMP than the RII subunits.
  • R subunits can form both homo- and heterodimers, allowing many combinations with fine affinity gradients.
  • cAMP is generated at a certain location near the G protein-coupled receptor through the AZ, and free diffusion in the cytosol is limited by phosphodiesterases (PDEs) - these hydroly - cAMP to adenosine monophosphate. After an extracellular stimulus, only PKA tetramers are activated, which are located in the local PDE-limited cAMP activity range. Not only does an A-kinase anchor protein (AKAP) play an important role in anchoring PKA in such an area, but also in the vicinity of substrates to be phosphorylated.
  • PDEs phosphodiesterases
  • AKAP A-kinase anchor protein
  • AKAP proteins are a family of currently about 50 proteins without significant sequence homology but with similar function. AKAP proteins are defined by the binding domain feature for the R subunits of PKA. This conserved motif is an amphipathic alpha helix of 14 to 18 amino acids, whose hydrophobic side interacts with a hydrophobic pocket of PKA. The hydrophobic pocket is formed by the N-termini of dimerized R subunits. The N-termini assemble in antiparallel fashion, with two helix-turn-helix yiotics forming a four-helix bundle.
  • alpha helices of each subunit closest to the N-terminus form the hydrophobic pocket required for AKAP binding, while the C-terminal alpha helices of the bundle allow dimerization.
  • amino acids involved in the alpha helices other N-terminal amino acid side chains are involved in interactions with AKAP proteins.
  • RI and RII subunits differ in sequence, resulting in different AKAP binding specificities.
  • Most AKAP proteins bind to RII subunits (K d in the nanomolar range), distinguishing low- and high-affinity AKAP proteins.
  • AKAP Lbc / Ht31, AKAP79 and AKAP95 d with ⁇ K values between 1 and 50 nM for the high-affinity include AKA proteins, include Gravin and the
  • D-AKAP dual-specific AKAP proteins
  • AKAP82 (from Caenorhabditis elegans), AKAP82, PAP7 [peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR) associated protein 7) and hAKAP220.
  • PBR peripheral-type benzodiazepine receptor
  • Another characteristic domain of AKAP proteins is the so-called targeting domain, which anchors each AKAP protein in a specific subcellular compartment in the cell.
  • A-KAP proteins can bind additional signaling molecules and enzymes important in the cAMP-PKA system, such as PDE and phosphatases. The latter reverse the phosphorylation reactions by hydrolysis and can thus terminate the action of a stimulus.
  • PDE and phosphatases The latter reverse the phosphorylation reactions by hydrolysis and can thus terminate the action of a stimulus.
  • AKAP proteins close to the substrate provide a scaffold that can recruit all the proteins needed to initiate and terminate the signal.
  • the basically diffuse cAMP signal emanating from the AZ is thus spatially and spatially focused with substrate
  • AKAP proteins are involved in central sites of many cellular processes.
  • One possibility of subdivision is the localization of the AKAP proteins in the cell; there are ion channel, cytoskeletal and mitochondrial-associated AKAP proteins.
  • Another possibility is given by the tissue-specific expression of the AKAP proteins.
  • AKAP proteins In order to demonstrate the importance of AKAP proteins for signal transduction pathways in cells, the functions of three AKAP proteins are described in more detail below: Gravin, AKAP79 and AKAP18.
  • Gravin is an actin-associated A-KAP; polymerized actin is an important component of the cytoskeleton. Gravin serves as a multivalent scaffold protein, which in addition to actin also binds PKA and the Ca 2+ -dependent protein kinase (PKC). This complex is important for the desensitization of the beta 2 adrenergic receptor (see above) after stimulation by agonists. At rest, the gravin complex is bound to the receptor. If the receptor is activated, for. B. by adrenaline binding, this leads to the formation of cAMP (see above). Graken-anchored PKA releases its catalytic subunits, which themselves phosphorylate gravin. Phosphorylation initially strengthens the bond.
  • PKA Ca 2+ -dependent protein kinase
  • Gravin is also phosphorylated by the likewise anchored PKC. This phosphorylation causes the dissociation of the gravin complex from the receptor. Instead, the adapter protein linked to the ubiquitin ligase mouse double minute-2 (MDM2) binds beta-arrestin to the receptor. MDM2-catalyzed ubiquitination characterizes the receptor for proteasomal degradation and endocytosis, thus desensitizing the beta 2 adrenergic receptor system.
  • MDM2 ubiquitin ligase mouse double minute-2
  • AKAP79 is an ion channel-associated AKAP which is involved in the regulation of synaptic plasticity in the hippocampus. pus is involved. There, PKA-mediated Na + currents or Ca 2+ currents are enhanced, which were induced by alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors. AMPA receptors have an intrinsic Ca 2+ / Na + channel function. The enhancement is achieved by modulating the activity of the glutamate receptor by phosphorylation. The task of the AKAP79 is to anchor the PKA in the vicinity of the AMPA receptors.
  • AMPA alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
  • AKAP18 was first described as a membrane-associated, 15 or 18 kDa protein anchoring PKA to the basolateral plasma membrane of epithelial cells and to skeletal muscle cells near the L-type Ca 2+ channels on the plasma membrane, with AKAP18 attached directly to the C Terminus of the Ca 2+ channels interacts.
  • the protein consists of 81 amino acids containing the PKA-binding amphipathic helix and N-terminal myristoyl and palmitoyl lipid anchors that anchor the PKA-AKAP complex to the plasma membrane.
  • the interaction between AKAP18 and the Ca 2+ channel occurs via the C-terminal domain of the alpha subunits of the channel; this is a leucine zipper-like motif involved.
  • the PKA is positioned near an important phosphorylation site in the alpha subunit, allowing for specific phosphorylation. Phosphorylation increases the likelihood of the channel.
  • AKAP18alpha also AKAP15
  • Other splice variants are AKAP18b, gamma and delta.
  • AKAPl ⁇ beta consists of 104 amino acids and contains the same membrane binding domain as the alpha variant. An additional 23 amino acid domain directs the protein to the apical plasma membrane in polarized epithelial cells. The function of AKAPl ⁇ beta is so far unclear.
  • AKAP18delta is a 353 amino acid protein whose RII binding domain is almost identical to those of the alpha-gamma variants. It is for the most part homologous to AKAPl ⁇ gamma. AKAPl ⁇ delta was discovered during the search for AKAP proteins involved in the translocation of the aquaporin-2 (AQP2) water channel from intracellular vesicles into the apical plasma membrane of kidney seed tube cells (see below). It could be shown that AKAPl ⁇ delta is localized to the AQP2-containing vesicles.
  • AQP2 aquaporin-2
  • AQP2 translocation is induced by the antidiuretic hormone arginine vasopressin (AVP, also known as ADH).
  • AVP antidiuretic hormone arginine vasopressin
  • the formation of the hormone and its secretion into the bloodstream are controlled by osmoreceptors in the hypothalamus, which constantly monitor the osmolarity of the blood. If the osmolarity increases, for example as a result of reduced fluid absorption of the organism, AVP is synthesized and secreted into the bloodstream.
  • the start signal for AQP2 redistribution delivers the binding of AVP to the vasopressin receptor (V2R) on the basolateral membrane side of the main renal collecting tube.
  • V2R vasopressin receptor
  • the V2 receptor which is a GPCR, initiates the signaling cascade described above, so that more cAMP is formed.
  • the PKA anchored to the AQP2-containing secretory vesicles by AKAPl ⁇ delta releases its catalytic subunits due to the cAMP-induced conformational change, which phosphorylates the nearby AQP2 water channels.
  • This phosphorylation ensures the transport of the vesicles and their fusion with the apical plasma membrane. In this way, the water permeability of this membrane is increased, and it can be increasingly water from the - located on the other side of the apical membrane in the manifold - reabsorbed primary urine. This counteracts the initial stimulus of the signal chain.
  • AKAPl ⁇ delta In addition to AKAPl ⁇ delta, other proteins are associated with the AQP2 vesicles, but unlike A-KAPl ⁇ delta they do not reach the plasma membrane. This could mean that the PKA anchored to the vesicle membranes by AKAPl ⁇ delta is not limited to the AQP2 Phosphorylation, but also, for example, for the transport process to the plasma membrane regulating phosphorylations is required. Such a function has also been demonstrated for the L-type Ca 2+ channel-associated AKAP79 (see above).
  • peptides can not be administered to experimental animals because they are degraded in the gastrointestinal tract.
  • Another important model for the study of AKAP functions are cell culture models. For use in cell cultures, however, peptides must be acylated to ensure membrane permeability.
  • Prior art peptides dock more tightly to the hydrophobic pocket of the regulatory PKA subunits due to lack of steric hindrance or better interacting (hydrophobic) amino acid side chains complete AKAP proteins. In this way, it can be experimentally verified how the abolition of PKA compartmentalization by AKAP proteins has a physiological effect.
  • the first introduced and hitherto most widely used anchor inhibitor peptide is the 22 to 24 amino acid Ht31 peptide derived from the PKA binding domain of the AKAP protein Ht31, also known as AKAP-Lbc.
  • AKAP-Lbc The first introduced and hitherto most widely used anchor inhibitor peptide is the 22 to 24 amino acid Ht31 peptide derived from the PKA binding domain of the AKAP protein Ht31, also known as AKAP-Lbc.
  • non-peptidic molecules according to Table A can be used as inhibitors or decouplers of PKA and AKAP or as substances for blocking the PKA anchoring.
  • the non-peptidic inhibitors are also lead compounds for new drugs.
  • Such drugs are a new tool for blocking PKA anchoring for in vitro experiments and they are the basis for a new class of drugs. which, unlike classical drugs, attack protein-protein interactions and do not modulate enzyme or receptor activities.
  • preferred claimed compounds have a multiplicity of common physicochemical properties which result in the compounds being very useful as pharmaceutical agents since they comply to the so-called rules of five of Lipinski. correspond.
  • These common physicochemical or structural features of the components according to the invention relate to their molecular weight, which is in the range from 150 to 600 g / mol, preferably from 190 to 300 g / mol, a distribution coefficient of logP ⁇ 10, preferably ⁇ 8, especially preferably ⁇ 1 to ⁇ 5 with a maximum of 10 hydrogen bond donors and a maximum of 10 hydrogen bridge acceptors, a solubility value of logSw of -400 to 0 and a BrotN value of 0 to 7, wherein preferably the AKAP18delta-RII interaction is at least 40% is inhibited.
  • the molecules according to the invention particularly preferably bind to regulatory subunits of the PKA, in particular to RIalpha or RII-alpha or RII-alpha or R-beta.
  • the molecules according to the invention make it possible to modify, inhibit or decouple AKAP, preferably AKAP18, more preferably AKAP18delta and PKA, depending on the species used.
  • recognition molecules against the molecules of the invention may be, for example, antibodies, chelators, complexing agents or other structures known in the art.
  • recognition molecules are easy to generate when their carrying is revealed - as in the present case the decouplers.
  • the decouplers can be administered together with an adjuvant into organisms, thereby producing antibodies that can be obtained by known methods.
  • the aid of these recognition molecules or with the aid of the molecules according to the invention it is possible to provide organisms in which the AKAP-PKA interaction is tissue- and / or cell-specifically modified by bringing the organisms mentioned into contact with the molecules according to the invention or the recognition molecules.
  • Preferred decouplers have a logP value of ⁇ 9, 8, 7, 6, 5, preferably 4, more preferably 3 and very particularly preferably ⁇ 2 and at most 10, 9, 8, 7, 6, preferably 5, particularly preferably 4, 3 and / or 2 water Substance bridge donors and / or acceptors and / or a BrotN value of in particular 1, 2, 3, 4, 5, or 6 and / or a logSw value of -350, -300, -250, -200, - 150, -100 or -50 and a molecular weight of 150 to 550, from 150 to 500, from 150 to 450, from 150 to 400 or from 150 to 350.
  • the decouplers preferably have a maximum of 6 hydrogen-bond donors and / or a maximum of 4 hydrogen-bond acceptors and / or a distribution coefficient of logP of ⁇ 1 to ⁇ 5.
  • the decouplers according to the invention inhibit the interaction of AKAP and PKA subunits by at least 80%.
  • the person skilled in sufficient methods are known with which he can determine the inhibition of the interaction.
  • inhibition means any form of modification of the interaction between AKAP and PKA against unaffected interaction with these two molecules.
  • it is preferred to inhibit the binding between AKAP and PKA it may be desired according to the invention that the interaction of AKAP and PKA be increased.
  • decouplers are those shown in Table A. These decouplers exhibit physicochemical
  • AKAP and PKA properties that not only inhibit the interaction of AKAP and PKA, but that Furthermore, they can be very well absorbed in a target organism, so that it is possible to treat diseases resulting from an imbalance or disruption of cAMP-dependent signal transduction.
  • diseases include diabetes insipidus, diabetes mellitus, obesity, edema, chronic obstructive pulmonary disease, AIDS, schizophrenia, cirrhosis, heart failure, coronary heart disease, hypertension and / or asthma.
  • the diseases caused by the disruption of cAMP-dependent signal transduction are not limited to these.
  • the other diseases mentioned below are also among the preferred diseases which can be treated very well with the agents according to the invention.
  • compositions of the invention are disclosed in Table B. These preferred compounds share common physicochemical properties that result in the compounds being optionally used in conjunction with a pharmaceutically acceptable carrier for the surgical and / or therapeutic treatment of the human or animal body and diagnostic procedures performed on the human or animal body can.
  • the compounds have substance properties that comply with the rules of five by Lipinski et al. (Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 46, 3-26, 2001).
  • a further preferred embodiment of the invention relates to decouplers selected from Table C. These preferred compounds have such a good membrane permeability that they can very well be used in vivo, ie, in particular as a pharmaceutical agent, for PKA anchorage or to modulate the AKAP-PKA interaction, in particular to inhibit.
  • Advantageous molecules according to the invention are disclosed in Table A, B and / or C. Because of their physicochemical properties, such as their low molecular weight, advantageous partition coefficient and solubility and bread N value, as well as the fact that they contain no more than 10 H-bond acceptors, and in particular substantially no more than 7, preferably 6, all particularly preferably have 5 H-bridge donors, these agents are very good in prophylaxis, therapy, post-treatment and / or diagnosis in in vivo systems such.
  • decoupler of the invention have the general ⁇ my formula I which can be guided into one another by resonance ⁇ (R 2 and R 3 are treated as interchangeable) LV
  • X is a non-hydrogen atom, preferably a sulfur atom
  • R 1 is an alkyl or aryl radical, preferably a 1-Naphthylmethylrest
  • R 2 and R 3 is a hydrogen atom or an alkyl or aryl radical, preferably R 2 and R are 3 is two hydrogen atoms, two methyl radicals, one benzyl radical and one methyl radical or one shortcoming radical and one tert-butyl radical, more preferably R 2 and R 3 are a 2-thiazolidinyl radical and a methyl or tert-butyl radical, and a 1-naphthyl radical and Isoproyl, cyclohexyl, benzyl or methyl radical.
  • the invention accordingly also relates to compounds according to the general formula I for use as medicaments or as pharmaceutical active ingredients.
  • the invention also relates to the use of the compounds according to the general formula I for the treatment of the diseases disclosed in the application.
  • the decouplers of the invention have the general formula II, wherein Rl to R3 have the meaning as above:
  • the ratio 1/5 depends on the basicity of the nitrogen next to R 3 .
  • the arrangement of the radicals R 2 and R 1 exchangeable are particularly preferred.
  • the protonated compounds such as. Hydrochloride, for use as a decoupler of the AKAE-PKA interaction.
  • the compound JG5 is particularly preferred the dihydrochloride.
  • the lead structure is 990 (see table).
  • the IC values decrease as the aliphatic residues become larger and, as with JG31 (see Table), the anthracene has additional effects. This means a higher electron thrust to amidine and a higher basicity.
  • the electron density on the amidine is important, so that the radicals R 1 and R 2 are electron donating units (see compounds 6 and 7; ortho- or para-methoxyphenyl, ortho- or para-diaminophenyl).
  • the thiocarbamimic acid esters (such as # 990) are labile to nucleophiles such as e.g. B. Amines. This produces thiols and guanidines, which can also be used for example for the treatment of diseases.
  • the invention relates to the cyclic imidazoles (6) and the dihydroimidazoles (7) for use in medicine, in particular as decouplers of AECAP and PKA, and as tools in basic research in vivo and in vitro.
  • the radicals R 1 and R 2 are preferably aryl radicals or cyclic aliphatic radicals (SM 61, SM63 and SM65). The 6 ring on the amidine is also preferred (compound 8 is based on SM71).
  • R 1 contains SR so that the electron density on the amidine is comparable to the active compounds.
  • R is an alkyl radical. Accordingly, the isomer 10 is also preferred.
  • decouplers according to the general formula 11 and 12 are preferred.
  • R 1 and R 2 may be independent of each other:
  • acyclic aliphatic with a chain length of Cl to C ⁇ cyclic aliphatic having a ring size of C3 to C9, including one or more of a plurality of heteroatoms of the type O or N; aromatic as a monocyclic, heteroaryl and mono- to trisubstituted monocycle radical.
  • the electron-donating substituents eg OMe or NMe2
  • the use of heteroaromatics is particularly advantageous with regard to bioavailability It is furthermore advantageous to use the structure 12 with X as a linker group of the acyclic aliphatic type a chain length of Cl to C6 and R 3 with the same groups as for R 1 and R 2 independently formulated.
  • the sulfur and adjacent position 10 may be sensitive to oxidation in certain embodiments of the invention.
  • the active form does not have the framework of the lead structure (see above), but is either the sulfoxide 2 or the sulfone 3.
  • the position 10 may be acidic after oxidation of the sulfur and may be after deprotonation z.
  • B. undergo a Claisen aldol addition. The latter reaction is exemplified by an acetic acid building block as compound 16 (see below). If R 2 is a hydrogen atom, an intramolecular ring closure also occurs.
  • the two positions are very reactive.
  • position 10 is not modified.
  • these azides can be sensitive to oxidation, as explained below.
  • This position can advantageously without significant change of Jardiner spallung be provided with fluorine atoms, which prevent diversification under physiological conditions and receive the activity advantageously.
  • the structure 16 is thus protected against premature loss.
  • the addition product of an acetyl unit is depicted by way of example as structure 8 after elimination of water in 20 (see below).
  • the position 10 can also be substituted.
  • R 3 and R 4 as shown in connection 21, which may preferably also be F as an extension to R 1 and R 2 .
  • the above to the spacer between N and R 1 / R 2 and the oxidation of the sulfur also applies to the compounds listed below.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may independently, for example, be alkyl and / or aryl radicals.
  • Triple-anilated ring systems may also be preferred (see also compounds SM39 and SM44, Table).
  • guanidines are preferred when R 1 or R 2 is a cyanide (example compound 25).
  • the compounds according to the invention have a solubility in water of 1 mg / ml, preferably at a pH of 2 to 7. In the case of an injection with a daily At a dose of 200 to 400 mg, the water solubility is even higher, to avoid injecting 400 ml solution with a syringe.
  • Further preferred decouplers have a general structure according to FIG. 19 and / or FIG. 20.
  • the preferred decouplers have many surprising advantages over the peptidic inhibitors or decouplers known in the art.
  • the non-peptidic decouplers according to the invention represent ei ⁇ ne shift away from conventional technologies, which follows a new task. With the structures according to the invention a long-unresolved, urgent need is solved, which the experts have hitherto attempted in vain.
  • the simplicity of the solution speaks in favor of an inventive step as it replaces the more complicated teachings of the prior art.
  • the development of the scientific technique with respect to the treatment of the above and below diseases has taken a different direction, so that the teaching according to the invention represents a development-firming achievement, which eliminates misconceptions of the experts over the solution of the corresponding problem.
  • the technical advancement which is realized by the teaching according to the invention, manifests itself in particular through an improvement, increase in performance, cheapening, savings in time, material, work stages, costs or difficult-to-obtain raw materials, increased reliability, elimination of errors, quality enhancement, Freedom from maintenance, greater effectiveness, higher yield, increase of technical possibilities, provision of further means, opening of a further way to the treatment of the diseases, opening of a new area, first solution of a task, provision of reserve resources, alternatives, the possibility of rationalization, automation resp Miniaturization and enrichment of the drug. Accordingly, the teachings of the present invention represent a fortunate handle in which, of the multitude of possibilities, a particular one has been selected whose result could not be predicted.
  • the preferred molecules according to the invention can be used for the treatment of diseases which are caused by a disorder or by a defect of cAMP-dependent signal transduction.
  • This characterization of the disease is not intended to functionally define the ailments to be treated, but the presentation as diseases associated with a modification or defect of compartmentalized cAMP-dependent signal transduction serves as a generic term for a well-defined group of diseases in the sense of the invention. That is, the person skilled in the art can judge which diseases are covered by the definition according to the preamble and thus fall under the claims of the teaching according to the invention of the claim.
  • the abovementioned AKAP proteins can be influenced in their interaction with PKA molecules.
  • the o. G. AKAP18 proteins and their interaction with PKA molecules are modified, and in particular A-KAPl8delta proteins and their interaction with PKA molecules, in particular with subunits and particularly preferably with Rllalpha and / or RIIbeta molecules.
  • the decouplers inhibit substantially 100%, it is also preferred to inhibit 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, preferably 30%, particularly preferably 20% and in particular 10%. Any of these percentage inhibitions may be preferred.
  • decouplers of the invention are on the one hand claimed as new molecules; on the other hand, preferred molecules are claimed as compounds for which a use in medicine is first disclosed.
  • novel molecules in particular the new molecules in the field of medicine, are claimed for the treatment of diseases which according to the definition of the invention are included under the term of the defects associated with the compartmentalized cAMP-dependent signal transduction Illnesses fall.
  • the invention also relates to recognition molecules which are directed against the non-peptidic molecules according to the invention. Because of the disclosure of the non-peptide molecules of the present invention, one of ordinary skill in the art can readily, without undue burden, provide recognition molecules against the non-peptidic molecules of the present invention by routine experimentation so that the recognition molecules are clearly and completely disclosed.
  • the recognition molecules according to the invention are either antibodies, complexing agents or chelators or peptides which interact with the non-peptidic decouplers such that they are impaired in their biological activity, the modulation of the AKAP-PKA interaction ,
  • the recognition molecules it is also possible to use the decouplers in an in vitro or in vivo system. For this purpose, it may be advantageous if the recognition molecules are provided with a detectable probe. The skilled person is aware of such probes.
  • the invention also cells, cell aggregates, tissue cultures or tissue pieces, but also organisms ⁇ men, such as mice, rats, cattle, horses, donkeys, sheep, camels, goats, pigs, rabbits, guinea pigs, hamsters, cats, monkeys , Dogs or humans comprising the decouplers of the invention and / or the recognition molecules of the invention.
  • organisms ⁇ men, such as mice, rats, cattle, horses, donkeys, sheep, camels, goats, pigs, rabbits, guinea pigs, hamsters, cats, monkeys , Dogs or humans comprising the decouplers of the invention and / or the recognition molecules of the invention.
  • various diseases can be investigated, whereby the examination of the diseases relates, for example, to their causes or to possible methods of diagnosis and treatment.
  • Preferred diseases are asthma, hypertension, hypertrophy of the heart, coronary heart disease, duodenal ulcer, heart failure, liver cirrhosis, schizophrenia, AIDS, diabetes mellitus, diabetes insipidus, obesity, chronic obstructive pulmonary disease, learning difficulties, edema (pathological water retention), infectious diseases and / or cancer ,
  • the person skilled in the art knows which decouplers or which recognition molecules he has to use in which concentration, since these are directly and unambiguously determined by routine experiments from the disclosed inventive technology. see doctrine as well as from the prior art, as set forth, for example, in reference works.
  • the organisms can be used to develop drugs that modify, preferably decouple, the PKA-AKAP interaction.
  • the decouplers according to the invention may of course be used as test molecules for pharmaceuticals, but also as lead structures from which the pharmaceuticals are developed.
  • the organisms can also be used in vivo to study metabolic processes in which the AKAP-PKA interaction plays a role or in which it should be clarified whether, for a particular event, such as a specific pathogenic change such as, for example, Degeneration of cells involved in AKAP-PKA interaction.
  • the decouplers or recognition molecules used according to the invention may also be modified decouplers or recognition molecules which have been obtained by combinatorial methods from the compounds according to the invention.
  • the structures thus obtained, in which the molecules according to the invention serve as a guide structure, are essentially functionally analogous to the abovementioned decouplers and recognition molecules according to the invention.
  • Functional analogy means that the homoge- neous structures obtained also allow conclusions to be drawn regarding the interaction of AKAP and PKA or their significance for certain diseases.
  • functionally analogous molecules in the sense of the invention are molecules which the person skilled in the art can identify as having essentially the same effect.
  • the invention accordingly also relates to modified molecules which have substantially the same function in substantially the same way and produce substantially the same result as the invention
  • Decouplers or recognition molecules, or equivalent compounds in which it will be apparent to one of ordinary skill in the art that the same can be achieved with them, which is achieved with the molecules disclosed in the claims.
  • the functional analogues can be obtained by structure-based, combinatorial or another drug design.
  • drug design is clearly defined by those skilled in the art; he refers z. B. on the reference drug design. The path to the drug, or the textbook of clinical pharmacy or standard works.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition which comprises a decoupler according to the invention or a recognition molecule directed against it in the form of a chelator, complexing agent or antibody, if appropriate together with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipients.
  • the adjuvants may be, for example, adjuvants, vehicles or others.
  • the carriers may be, for example, fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, dissolution inhibitors, absorption accelerators, wetting agents, adsorbents and / or lubricants. In this case, ie if carriers, adjuvants and / or vehicles - such.
  • the agent according to the invention is used as gel, powder, powder, tablet, sustained-release tablet, premix, emulsion, pour-on formulation, drops, concentrate, granules, syrup, pellet, fluid, capsule, aerosol, Spray and / or inhalant prepared and / or used in this form.
  • the tablets, dragees, capsules, pills and granules may be provided with the usual coatings and sheaths which optionally contain opacifying agents and may also be composed in such a way that they release the active substance only or preferably delayed in a specific part of the intestinal tract , wherein as embedding masses, for example, polymer substances and waxes can be used.
  • the pharmaceutical compositions of this invention may be used for oral administration in any orally acceptable dosage form including, but not limited to, capsules, tablets, and aqueous suspensions and solutions.
  • carriers that are commonly used include lactose and corn starch.
  • Lubricants such as magnesium stearate, can typically be added.
  • useful diluents such as lactose and dried corn starch are used.
  • aqueous suspensions are administered orally, the active ingredient is combined with emulsifying and suspending agents. If desired, certain sweetening and / or flavoring and / or coloring agents may be added.
  • the active substance (s) may optionally also be present in microencapsulated form with one or more of the excipients specified above.
  • Suppositories can fe of these agents in addition to the active substance contain the customary water-soluble or water-insoluble excipients, for example polyethylene glycols, fats, for example cocoa fat and higher esters (for example Ci-C4 alcohol with C 6 fatty acid) 'or mixtures thereof.
  • customary water-soluble or water-insoluble excipients for example polyethylene glycols, fats, for example cocoa fat and higher esters (for example Ci-C4 alcohol with C 6 fatty acid) 'or mixtures thereof.
  • Ointments, pastes, creams and gels may contain the customary excipients in addition to the active substance (s), for example animal and vegetable fats, waxes, paraffins, starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicic acid, talc and zinc oxide or mixtures of these substances.
  • active substance for example animal and vegetable fats, waxes, paraffins, starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicic acid, talc and zinc oxide or mixtures of these substances.
  • Powders and sprays may contain the customary carriers in addition to the active substance (s), for example lactose, talc, silicic acid, aluminum hydroxide, calcium silicate and polyamide powder or mixtures of these substances.
  • Sprays may additionally contain the usual propellants, for example chlorofluorohydrocarbons.
  • Solutions and emulsions may, in addition to the active compounds, ie the compounds according to the invention, the customary carriers such as solvents, solubilizers and emulsifiers, for example water, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, Propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, oils, in particular cottonseed oil, soil nut oil, maize germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol, glycerol formal, tetrahydofurfuryl alcohol, polyethylene glycols and fatty acid esters of sorbitan or mixtures of these substances.
  • the solutions and emulsions may also be in sterile and blood isotonic form.
  • Suspensions may contain , in addition to the active ingredients, the customary carriers such as liquid diluents, for example water, ethyl alcohol, propylene glycol, suspending agents, for example ethoxylated isostearyl alcohols, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar Agar and tragacanth or mixtures of these substances.
  • liquid diluents for example water, ethyl alcohol, propylene glycol
  • suspending agents for example ethoxylated isostearyl alcohols, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar Agar and tragacanth or mixtures of these substances.
  • the pharmaceutical compositions may be in the form of a lyophilized sterile injectable preparation, for example as a sterile injectable aqueous or oily suspension.
  • This suspension may also be formulated by methods known in the art using suitable dispersing or wetting agents (such as Tween 80) and suspending agents.
  • the sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally-acceptable diluent or solvent, for example, a solution in 1,3-butanediol.
  • Compatible vehicles and solvents that may be used include mannitol, water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile non-volatile oils are commonly used as the solvent or suspending medium.
  • any mild non-volatile oil including synthetic mono- the diglycerides are used.
  • Fatty acids such as oleic acid and its glyceride derivatives, are useful in the preparation of injectables, as are natural pharmaceutically-acceptable oils, such as olive oil or castor oil, especially in their polyoxyethylated forms.
  • These oil solutions or suspensions may also contain a long-chain alcohol or similar alcohol as a diluent or dispersant.
  • the formulation forms mentioned may also contain colorants, preservatives and odour- and taste-improved additives, for example peppermint oil and eucalyptus oil, and sweeteners, for example saccharin.
  • the compounds of the invention should preferably be present in the listed pharmaceutical preparations in a concentration of about 0.01 to 99.9, preferably from about 0.05 to 99 wt .-% of the total mixture.
  • the listed pharmaceutical preparations may contain further pharmaceutically active substances, but in addition to other pharmaceutical active substances also salts, buffers, vitamins, sugar derivatives, in particular saccharides, enzymes, plant extracts and others.
  • the buffers and sugar derivatives advantageously reduce pain on subcutaneous administration, and enzymes such as hyaluronidase increase efficacy.
  • the preparation of the abovementioned pharmaceutical preparations is carried out in the customary manner by known methods, for example by mixing the active substance (s) with the excipient (s).
  • the preparations mentioned can be used in humans and animals either orally, rectally, parenterally (intravenously, intramuscularly, subcutaneously), intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, locally (powder, ointment, drops) and for the therapy of the diseases mentioned below.
  • Suitable preparations are injection solutions, solutions and suspensions for oral therapy, gels, infusion formulations, emulsions, ointments or drops.
  • ophthalmic and dermatological formulations, silver and other salts, ear drops, eye ointments, powders or solutions may be used.
  • uptake can also take place via the feed or drinking water in suitable formulations.
  • the drugs can be incorporated into other carrier materials such as plastics - plastic chains for local therapy -, collagen or bone cement.
  • the compounds are introduced in a concentration of from 0.1 to 99.5, preferably from 0.5 to 95, particularly preferably from 20 to 80,% by weight in a pharmaceutical preparation. That is, the compounds are present in the pharmaceutical compositions listed above, for example, tablets, pills, granules and others, preferably in a concentration of 0.1 to 99.5% by weight of the total mixture.
  • the amount of active ingredient that is, the amount of compounds of the present invention combined with the carrier materials to produce a single dosage form will vary depending on the subject to be treated and the particular mode of administration. After In view of the condition of the patient, the proportion of the active compound in the preparation may be changed so as to provide a maintenance dose that arrests the disease.
  • the dose or frequency of administration, or both as a function of the symptoms may be reduced to a level at which the improved condition is maintained.
  • treatment should cease.
  • patients may require long-term intermittent treatment after any recurrence of disease symptoms. Accordingly, the proportion of the compounds, that is to say their concentration, in the overall mixture of the pharmaceutical preparation, as well as their composition or combination, is variable and can be modified and adapted by a person skilled in the art on the basis of his specialist knowledge.
  • the compounds according to the invention can be brought into contact with an organism, preferably a human or an animal, in various ways. Furthermore, it is known to the person skilled in the art that, in particular, the pharmaceutical agents can be administered in various dosages.
  • the application should be carried out in such a way that the disease is combated as effectively as possible or the onset of a disease in a prophylactic administration is prevented.
  • the concentration and the type of application can be determined by the skilled person through routine experimentation.
  • Preferred applications of the compounds according to the invention are oral administration in the form of powders, tablets, juice, drops, capsules or the like, rectal administration in the form of suppositories, solutions and the like, parenterally in the form of injections, infusions and solutions, and locally in the form of ointments, patches, envelopes, rinses and the like.
  • the contacting of the compounds according to the invention preferably takes place prophylactically or therapeutically.
  • the suitability of the chosen forms of application as well as the dose, the application regimen, the adjuvant choice and the like can be determined, for example, by taking serum aliquots from the patient, ie human or animal, and testing for the presence of disease indicators during the course of the treatment protocol become.
  • the state of the kidneys, the liver or the like, but also the amount of T cells or other cells of the immune system or other markers that characterize or document a course of disease or recovery can be determined concomitantly in a conventional manner
  • the patient's clinical condition can be monitored for the desired effect.
  • the patient may be further treated with agents of the invention modified with other known drugs of which an improvement in overall constitution can be expected.
  • agents of the invention modified with other known drugs of which an improvement in overall constitution can be expected.
  • injections for example intramuscularly or subcutaneously or into the blood vessels, are a further preferred route for the therapeutic administration of the compounds according to the invention.
  • the delivery via catheters or surgical tubes can be used; For example, via catheters that lead directly to specific organs such as the kidneys, liver, spleen, intestine, lungs, etc.
  • the compounds according to the invention can be used in a preferred embodiment in a total amount of preferably 0.05 to 500 mg / kg of body weight per 24 hours, preferably from 5 to 100 mg / kg of body weight. This is advantageously a therapeutic amount used to prevent or ameliorate the symptoms of a disorder or responsive pathological physiological condition.
  • the daily dose of from 0.005 to 500 mg / kg, preferably from 0.05 to 500 mg / kg of body weight may be applied once or several times to obtain the desired results.
  • pharmaceutical agents are used for about 1 to 10 times daily administration or alternatively or additionally as a continuous infusion. Such administrations can be used as a chronic or acute therapy.
  • the Amounts of active ingredient combined with the carrier materials to produce a single dosage form may, of course, vary depending on the host to be treated and the particular mode of administration.
  • each Application for example, 1 to 2 tablets are administered with an active ingredient content of 0.05 to 500mg / kg body weight.
  • the active ingredient content may also be retarded, reducing the number of applications per day to 1 to 3.
  • the active ingredient content of the delayed-release tablets can be 3 to 3000 mg.
  • the active ingredient is administered by injection, it is preferred to contact the host with the compounds of the invention 1 to 10 times a day or by continuous infusion, with amounts of 1 to 4000 mg per day being preferred.
  • the preferred total amounts per day have proven to be advantageous in human medicine and in veterinary medicine.
  • the pharmaceutical agent is used in a single dose of 1 to 100, in particular from 2 to 50 mg / kg of body weight.
  • the amount of the single dose per application can also be varied by the person skilled in the art on the basis of his specialist knowledge.
  • the compounds used according to the invention can also be used in veterinary medicine in the individual concentrations and preparations mentioned together with the feed or with feed preparations or with the drinking water.
  • a single dose preferably contains the amount of active ingredient administered in one application, which usually corresponds to a whole, a half daily dose or a third or a quarter of a daily dose.
  • the dosage units may accordingly preferably contain 1, 2, 3 or 4 or more single doses or 0.5, 0.3 or 0.25 of a single dose.
  • the daily dose of the compounds according to the invention is preferably distributed over 2 to 10 applications, preferably 2 to 7, more preferably 3 to 5 applications. Of course, a continuous infusion of the inventive means is possible.
  • 1 to 2 tablets are given for each oral application of the compounds according to the invention.
  • the tablets according to the invention may be provided with coatings and casings known to the person skilled in the art and may also be composed in such a way that they contain only the active substance (s) in preferred, release in a particular part of the host.
  • the individual constituents of the compounds are optionally associated with one another or bound to a carrier in liposomes, wherein the inclusion in liposomes in the sense of the invention need not necessarily mean that the compounds are inside the liposomes available.
  • An inclusion in the sense of the invention may also mean that the compounds are associated with the membrane of the liposomes, for example, so that they are anchored on the outer membrane.
  • Such a representation of the compounds according to the invention in or on the liposomes is advantageous if the person skilled in the art selects the liposomes in such a way that they have an immunostimulating action.
  • the expert is known from DE 198 51 2 82 different ways to modify the immune stimulating effect of liposomes.
  • the lipids may be simple lipids such as esters and amides or complex lipids such as glycolipids such as cerebrosides or ganglionides, sphingolipids or phospholipids.
  • Preferred diseases that can be treated with the agent according to the invention are selected from the group comprising AIDS, acne, albuminuria (proteinuria), alcohol withdrawal syndrome, allergies, alopecia (hair loss), ALS (amyotrophic lateral sclerosis), Alzheimer's disease, AMD (age-related macular degeneration) , Anemia, anxiety disorders, anthrax (anthrax), aortic sclerosis, arterial occlusive disease, arteriosclerosis, arterial Conclusion, Temporal Arteritis, Atherosclerosis, Arteriovenous Fistulas, Arthritis, Osteoarthritis, Asthma, Respiratory Insufficiency, Autoimmune Disease, AV Block, Acidosis, Herniated Disc, Peritonitis, Pancreatic Cancer, Becker Muscular Dystrophy, Benign Prostate Hyperplasia (BPH), Bladder Carcinoma, Hemorrhage (Haemophilia) , Bronchial carcinoma, breast cancer, BSE
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can also be used for the treatment of cancers selected from the group of cancers or neoplasms of the ear, nose and throat, the lung, the mediastinum, the gastrointestinal tract, the genitourinary system , the gynecological system, the breast, the endocrine system, the skin, bone and soft tissue sarcomas, mesotheliomas, melanomas, neoplasms of the central nervous system, cancers or childhood tumors, lymphomas, leukemias, paraneoplastic syndromes, metastases without a known primary tumor (CUP syndrome ), peritoneal carcinomatosis, immunosuppression-related malignancies and / or tumor metastases.
  • cancers selected from the group of cancers or neoplasms of the ear, nose and throat, the lung, the mediastinum, the gastrointestinal tract, the genitourinary system , the gynecological system, the breast, the
  • the tumors may be the following cancers: adenocarcinoma of the breast, prostate and colon; all forms of lung cancer emanating from the bronchi; Bone marrow cancer; the melanoma; the hepatoma; neuroblastoma; the papilloma; the Apudo, the Choristom; the branchioma; the malignant carcinoid syndrome; carcinoid heart disease; carcinoma (for example, Walker's carcinoma, basal cell carcinoma, basosquamous carcinoma, Brown-Pearce's carcinoma, ductal carcinoma, Ehrlich- Tumor, in situ carcinoma, cancer 2 carcinoma, Merkel cell carcinoma, mucous carcinoma, non-small cell lung carcinoma, oat cell carcinoma, papillary carcinoma, cirrhotic carcinoma, bronchiolo-alveolar carcinoma, bronchial carcinoma, squamous cell carcinoma and transiting nacellar carcinoma); histiocytic dysfunction; Leukemia (for example in connection with B-cell leukemia, mixed cell leukemia
  • the cancer or tumor being treated or prevented is selected from the group: tumors of the ear, nose and throat, including tumors of the internal nose, sinuses, nasopharynx, lips, and the like Oral cavity, oropharynx, larynx, hypopharynx, ear, salivary glands and paragangliomas, tumors of the lung comprising non-small cell lung carcinomas, small cell lung carcinomas, tumors of the mediastinum, tumors of the gastrointestinal tract, tumors of the esophagus, stomach, of the pancreas, liver, gall bladder and biliary tract, small intestine, colon and rectal carcinomas and anal carcinomas, genitourinary tumors including kidney, ureter, bladder, prostate, urethra, penile and thoracic tumors, gynecological tumors including tumors of the cervix, vagina, vulva, corpus carcinoma, malignant trophoblast disease, ovarian carcinoma
  • the cancer or tumor being treated or prevented is selected from the group consisting of cancers or tumors of mammal carcinomas, gastrointestinal tumors including colon carcinomas, gastric carcinomas, pancreatic carcinomas, colonic carcinomas. cancer, small intestine cancer, ovarian cancer, cervical carcinoma, lung cancer, prostate cancer, renal cell carcinoma and / or liver metastases.
  • the disease is selected from the group comprising diseases which are referred to in the context of the invention as infectious diseases associated with a modulation of compartmentalized cAMP-dependent signal transduction, namely: monkey pox, AIDS, anthrax (Bacillus anthracis , Anthrax), avian influenza (avian influenza, bird flu), Lyme disease, Borrelia recurrentis (louse fever), botulism (Clostridium botulinum), brucellosis, Campylobacter infections, chlamydiosis, cholera (Vibrio cholerae), Creutzfeldt-Jakob disease, Coxiella burnetii (Q Fever), Cryptosporidium parvuum (cryptosporidiosis), dengue fever, diphtheria, Ebola virus infections, echinococcosis (fox tapeworm, dog tapeworm), EHEC infections (STEC infections, VTEC infections), enteroviruses, typhus fever
  • agents according to the invention inhibit the enzymes of these pathogens, in particular the phosphatase.
  • the agents may also be membrane destabilizing or otherwise acting.
  • it is preferably essential that the pathogenicity of the pathogens is reduced.
  • the disease to be treated is essentially triggered by bacteria or co-triggered by bacteria; the bacteria may be Legionella, Streptococci, Staphylococci, Klebsiella, Haemophilis influenzae, Rickettsia (spotted fever), Mycobacteria, Mycoplasmas, Ureaplasmas, Neisseria (Meningitis, Waterfridge-Friedrichsen syndrome, Gonorrhea), Pseudomonas, Bordetella (pertussis) , Corynobacteria (diphtheria), chlamydia, Campylobacter (diarrhea), Escherichia coli, pro- teus, Salmonella, Shigella, Yersinia, Vibrio, Dethococci, Clostridia, Listeria, Borrelia, Treponema pallidum, Brucella, Francisellen and / or Leptospira.
  • the bacteria may be Legionella, Str
  • the invention also relates to the use of the decoupler for specific binding to AKAP, preferably AKAP18, particularly preferably AKAP18delta and / or specific binding to PKA, preferably subunits thereof, very particularly preferably to RII subunits.
  • the invention also relates to the inhibition of the interaction of RIalpha, RIIalpha, RIbeta and / or RIIbeta subunits of PKA with AKAP, wherein inhibition in the sense of the invention is any form of modification.
  • the decouplers can be used as aquaretics, contraceptives, as an anti-infective agent, as an anxiolytic agent and / or as an anti-tumor agent.
  • the diseases are selected from the group comprising asthma of any kind, etiology or pathogenesis, or asthma from the group of atopic asthma, non-atopic asthma, allergic asthma, IgE-induced atopic asthma, bronchial asthma, essential asthma, primary asthma, by pathophysiological Disorders induced endogenous asthma, environmental factors, exogenous asthma, essential asthma of unknown or inapparent cause, non-atopic asthma, bronchitis, emphysematous asthma, stress-induced asthma ma, occupational asthma, infectious allergic asthma caused by bacterial, fungal, protozoan or viral infections, non-allergic asthma, inhaled asthma, whez infant syndrome; chronic or acute bronchoconstriction, chronic bronchitis, small airway obstruction, and emphysema; obstructive or inflammatory respiratory disease of any kind, etiology or pathogenesis, or an obstructive or inflammatory respiratory disease from the group of asthma; Pneumoconiosis,
  • Gout inflammation-associated fever, or inflammation-associated pain
  • PAN Polyarterütis nodosa
  • Bone wasting, primary osteoporosis and secondary osteoporosis disorders of the central nervous system of any type, etiology or pathogenesis, or a disorder of the central nervous system from the group depression, Parkinson's disease, learning and memory disorders, dodecious dyskinesia, drug dependence, arteriosclerotic dementia, and dementia as a concomitant of Huntington's disease, Wilson's disease Paralysis agitans and thalamatic atrophy;
  • Infections particularly viral infections, which viruses increase the production of TNF- ⁇ in their host, or which are susceptible to up-regulation of TNF- ⁇ in their host, so as to hamper their replication or other important activities, including viruses from the Group HIV-1, HIV-2 and HIV-3, cytomegalovirus, CMV; Influenza, adenoviruses and herpesviruses, including herpes zoster and herpes simplex; Yeast and fungal infections, wherein these yeasts and fungi are susceptible to upregulation by TNF- ⁇ or induce TNF- ⁇ production in their host, preferably fungal meningitis, especially when co-administered with other drugs of choice for the treatment of systemic yeast and fungal infections, including the polymycins, preferably polymycin B, imidazoles, preferably clotrimazole, econazole, miconazole and / or ketoconazole, the triazoles, preferably fluconazole and / or itrananazole, and the amphotericins,
  • the invention also relates to a method for the modification, in particular an inhibition of an AKAP-PKA interaction comprising the steps:
  • this method is characterized in that the modification takes place on a regulatory RII subunit of the PKA, wherein particularly preferably the RII subunits are RIIalpha and / or Rllbeta subunits.
  • the invention also relates to a kit comprising the products according to the invention - particularly preferably the decouplers and the recognition molecules directed against them - and / or a pharmaceutical composition according to the invention, optionally together with information - eg. As a leaflet or an Internet address that refers to homepages with more information, etc. - about the handling or about the combination of the contents of the kit includes.
  • the information for handling the kit for example, a therapy scheme for the above diseases, especially for the preferred diseases include.
  • the information may also include information on how to use the products of the invention within a diagnosis of diseases associated with, or their decoupling, AKAP-PKA interactions.
  • the kit according to the invention can also be used in basic research.
  • the kit is preferably used to detect whether a metabolic phenomenon is associated with the ACL or PKA interaction and the non-existent interaction.
  • the aid of the kit according to the invention it is possible with the aid of the kit according to the invention to determine which subunits of AKAP and / or PKA are responsible for the interaction of these two molecules or for the non-existence of the interaction between them.
  • the products according to the invention may comprise peptides, vectors, nucleic acids, amino acids, carbohydrates or lipids.
  • the products may be coupled to a fat remnant so that their membrane permeability is changed.
  • the kits of the invention may be used to study this course of the physiological process.
  • the molecules according to the invention can be selected such that they bind the RII subunits of the PKA more strongly than the typical PKA binding domains from AKAP, preferably AKAP18, in particular from AKAP18delta. Since selected molecules according to the invention are advantageously RIIalpha or RIIbeta-specific or, for certain RI-subunits, z.
  • the kit provides particularly detailed insights into the interaction of these molecules. The decoupling with one or the other regulatory subunit of the PKA from AKAP proteins can in particular give information on which PKA, type IIalpha or type IIbeta or the type I, are involved in the particular process under investigation.
  • the invention also relates to a process for the preparation of pharmaceutical agents, which comprises the following steps:
  • the invention also relates to the process product obtained directly by this process.
  • inhibitors or decouplers according to the invention modulate the interaction of AKAP and PKA.
  • the invention will be described in more detail below with reference to a few selected ones.
  • Luria-Bertani (LB) medium 10 g / l tryptone 10 g / l NaCl 5 g / l yeast extract pH 7.0
  • the solution was autoclaved after intensive stirring.
  • the LB agar was heated in a microwave oven until all solid particles were dissolved. After cooling to 40 ° C., the required antibiotic was added and the solution poured into plates.
  • Ampicillin is a penicillin derivative and prevents cell wall synthesis in proliferating bacteria. It was (mg / ml 100) stored as a stock solution at -20 0 C, just before use to a concentration of 100 ug / ml in LB agar or LB medium diluted.
  • Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • ⁇ x deoxyribonucleic acid (DNA) sample buffer 250 mg bromophenol blue 250 mg xylene cyanol 33 ml 150 mM Tris-HCl pH 7.6 60 ml glycerol 7 ml H 2 O Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) solution 1.79 g IPTG 50 ml H 2 O
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • trasylol 0.5 mM benzamidine
  • soybean trypsin inhibitor STI
  • DTT Dithiothreitol
  • Tris-buffered saline 10mM Tris-HCl pH 8.0 150mM NaCl
  • TBS-Tween 20 (TBST) as TBS, with 0.01% Tween 20
  • Binding buffer 80 ⁇ l Protease inhibitor mix 125 ⁇ l PMSF solution 20 ⁇ l DTT stock solution 0.5 M ad 10 ml PBS
  • competent E. coli cells of the strain BL21 (DE3) were prepared by the method of Cohen and Wang.
  • the bacteria stored at -80 ° C were thawed on ice and 2 ng of the plasmid DNA to be transformed was added to 50 ⁇ l of bacterial suspension. After incubation on ice for 30 minutes, the cells were exposed to a heat shock of 42 ° C for 45 seconds to collect the plasmid DNA. Immediately afterwards 250 ul of pre-warmed to 37 ° C was LB medium was added and the cells shaken for 1 h at 37 0 C so that it could express the encoded by the plasmid antibiotic resistance.
  • the pGEX-4T3 plasmid ( Figure 1) with the cloned, pro- teinkoding sequence used.
  • foreign DNA can be introduced into bacterial cells, and the plasmid DNA can, for. B. for control purposes, also be isolated from the cells again.
  • 2-3 ml of LB medium were inoculated with the appropriate antibiotic with single colonies of agar plates. The cultures were incubated at 37 0 C overnight with shaking. The cells were centrifuged at 13,000 xg and the supernatant was discarded as completely as possible.
  • the plasmid isolation from the bacterial sediments was carried out according to the plasmid minipreparation protocol of the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen GmbH, Hilden).
  • the cells were then lysed in alkaline lysis buffer to remove proteins and protein-associated chromosomal DNA.
  • the soluble plasmid DNA was bound to silica gel (in a column) in the presence of a highly concentrated saline solution, washed, and finally eluted using a low concentration saline solution.
  • the isolated plasmid DNA was analyzed by restriction endonuclease digestion followed by agarose gel electrophoresis.
  • Restriction endonucleases such as EcoRI (isolated from E. coli) cut DNA at specific sites defined by the sequence. The enzymes recognize these sequences, bind and cut the DNA hydrolytically. Microorganisms such as E. coli have restriction endonucleases to degrade foreign DNA. The distinction between own and foreign DNA is made possible by different methylation patterns of the DNA.
  • DNA restriction treatment with restriction endonucleases was normally carried out at 37 ° C. for 1 h.
  • a typical reaction mixture contained 5 ⁇ g of DNA, 1 ⁇ l of 10x enzyme buffer and 0.5 ⁇ l of enzyme solution and was made up to a final volume of 10 ⁇ l with sterile water. After incubation, the entire reaction was analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • agarose gels were used.
  • 1% solid agarose was added to TAE buffer and solubilized by boiling in a microwave oven. The solution was clear cooled to 45 0 C, and per 100 ml agarose solution 5 ul of ethidium bromide (EtBr) was added.
  • EtBr ethidium bromide
  • EtBr intercalates into the bases of the nucleic acids and allows their detection under UV light.
  • EtBr fluorescence is enhanced by the delocalized pi-electron systems of the purine and pyrimidine bases of the DNA, between which EtBr inserts.
  • the liquid gel was then poured into a plastic mold where it could cool and polymerize.
  • the DNA samples to be tested were spiked with sample buffer containing TAE, glycerol and bromophenol blue. Glycerol increased the density of the solution, making it easier to run into and stay in the gel pockets. Bromphenol blue allowed the visualization of the sample.
  • 5 ⁇ l of a DNA molecular weight standard were analyzed with DNA fragments of defined size in one lane per gel (HyperLadder I, Bioline GmbH, Luckenwalde, Fig. 2).
  • the electrophoresis was carried out at a voltage of 120 V for 30 minutes.
  • the gels were then photographed with Boehringer Mannheim's Lillimager Fl and analyzed with the associated Lumi Analyst 3.0 software.
  • the detergent used was Triton X-100 at a final concentration of 1%.
  • the suspension was for 30 min at 4 0 C slightly shakes overall.
  • the lysate thus obtained was centrifuged at 17,000 xg and 4 ° C for 10 minutes to remove cell debris.
  • glutathione-Sepharose 4B 50% suspension in lysis buffer, Amersham GmbH & Co. KG, Braunschweig
  • the enzyme GST plays an important role in detoxification reactions, for example in the cytosol of hepatocytes. It catalyzes the reaction of glutathione with various electrophilic, hydrophobic substrates.
  • the GST fused to the desired protein binds with high affinity and high specificity to glutathione, which is coupled to Sepharose beads.
  • Sepharose is a pearl-shaped, agarose-derived base material that is linked to a three-dimensional network. Due to their large volume, the beads and anything that has bound to them can be sedimented by centrifugation at 500 xg for 5 min.
  • GST fusion proteins can also be purified by affinity chromatography over a column filled with glutathione-Sepharose. This application usually results in greater purity, but also in lower yield of proteins.
  • the Sepharose sediment with the GST fusion proteins was then washed three times by resuspending each in 3 ml of lysis buffer and recentrifuging.
  • the pellet was mixed with 300 ⁇ l elution buffer and shaken for 10 min at room temperature.
  • the elution buffer contains excess glutathione in excess and thus competitively displaces the glutathione sepharose from the GST fusion protein.
  • centrifugation at 500 xg for 5 min of the fusion protein containing supernatant was carefully pipetted off, combined with the same volume chen glycerol, aliquoted and stored at -20 0 C. Glycerin prevents the formation of ice crystals, which lead to the degradation of proteins (especially after several freezing and thawing cycles).
  • samples were taken at various points in the procedure and analyzed by SDS-PAGE (see below): before and after the induction of protein synthesis with IPTG, before and after centrifugation of the cell lysate, before and after addition of glutathione -Sepharose and after washing the Sepharose sediment.
  • the method for analyzing the purity and the molecular weight of proteins is the Laemmli discontinuous sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • Disulfide bridges are reduced and cleaved by DTT and beta-mercaptoethanol, which are next to SDS in the sample buffer.
  • the denatured proteins bind SDS according to their size, that is the length of the amino acid chain.
  • a molecular weight standard consisting of proteins of known molecular weight is loaded onto the gel.
  • the BenchMark protein ladder molecular weight standard was used ( Figure 3, Invitrogen GmbH, Düsseldorf).
  • the SDS-PAGE is referred to as discontinuous because the gel consists of two parts, a collection and a separation gel. They differ with regard to their pore size and their pH. Such a discontinuous system provides sharper bands than a continuous one, thus allowing a more precise determination of protein size and molecular weight.
  • Bound protein-linked sepharose jbeads can be used directly for SDS-PAGE because the SDS sample buffer has a high reducing power that results in the elution of the proteins from the beads.
  • the separating gel was prepared using the reagents mentioned in Section 2.1. After pipetting TEMED, polymerization began and 3.75 ml of the solution was pipetted between glass plates clamped in a special plastic holder. Subsequently, the gel was covered with 2-propanol to eliminate air bubbles and to keep air from the gel (oxygen prevents the polymerization reaction). After complete polymerization, the 2-propanol was removed and the stacking gel prepared (see Section 1.1). After overlaying the release gel with the collection gel, the comb forming the sample pockets was placed in the gel solution. The protein samples were denatured by boiling in sample buffer for 5 min at 95 ° C. The samples were briefly centrifuged and injected into the. With a Hamilton syringe Transferred gel cakes.
  • the proteins are transferred by electrical voltage to a nitrocellulose or polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane and detected with specific antibodies (Ab). After binding of the Ab, excess Ab are washed away and the membrane is incubated with a secondary Ab which specifically recognizes and is labeled the primary Ab.
  • the label may consist of radioactive isotopes or an enzyme that catalyzes a dye-forming reaction.
  • an Immobilon P-PVDF membrane was cut to the size of the gel, wetted with ethanol for 15 seconds and then moistened with Semidry transfer buffer for at least 5 minutes. Whatman filter papers were also tailored to the correct size and in Moisten transfer buffer.
  • Protein transfer from the gel to the membrane was carried out with a BioRad TransBlot SD Semi Dry Transfer Cell onto which 2 filters, the membrane, the gel, and again 2 filters were layered. Air bubbles have been removed as they impede protein transfer.
  • the transfer cell was closed and the proteins were transferred to the membrane at 10 V for 1 h.
  • the proteins on the membrane were stained with Ponceau S solution.
  • the membrane was washed off with water and shaken for 20 minutes at room temperature in Ponceau S solution.
  • the bands of the molecular weight standard were traced with a pencil, and the membrane was wrapped in cling film to take a photograph with the Lumilmager Fl (7 s exposure under top illumination).
  • the primary A18delta3-Ab was already present in the workgroup. It was generated by immunizing rabbits against a peptide whose sequence was identical to amino acids 60-76 of the AKAP18delta sequence. The antisera thus obtained had been purified by affinity chromatography via the peptides used for the immunization, coupled to thiopropyl-Sepharose 6B (Amersham GmbH & Co. KG, Braunschweig).
  • the A18delta3-Ab binds both AKAPl ⁇ delta and -gamma.
  • the Ak solution was diluted 1: 500 in Blotto.
  • the membranes were shaken in incubation bags with 3 ml of air-free Ak solution for 2 h at room temperature or overnight at 4 0 C. After washing three times with TBST for 5 min, the membranes were shaken for 1 h in a 1: 100 O dilution of the secondary Ab (anti-rabbit F (ab) 2 fragments) in Blotto.
  • the secondary Ak was coupled to horseradish peroxidase (POD) (Dianova, Hamburg).
  • the membranes were washed three times with TBST for 10 min and for detection, 4 ml of solutions 1 and 2 of the LumiLight Western Blotting Substrate (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) were added to the membrane and shaken for 5 min at room temperature.
  • the detection solution contains luminol, which is oxidized by the coupled POD to produce light (chemiluminescence).
  • a photograph of the membrane wrapped in cling film was taken under the setting of chemiluminescence (exposure time 1 min) on the lumi-lager Fl.
  • the protein concentration was determined by comparison with a calibration set of different ovalbumin dilutions.
  • ELISA is a method of detecting an antigen with a specific antibody. The detection takes place via an enzyme covalently linked to one of the binding partners, which catalyzes a chromogen conversion. In this case, for example, a dye or chemiluminescence is produced quantitatively
  • Detection takes place by recording the intensity (I) of the chemiluminescence with the help of a photomultiplier in a special reader (ELISA reader). The measured values are output in relative light units (RLU).
  • RLU relative light units
  • PKA PKA subunit RIIalpha, to which AKAP proteins bind, was bound to 384-well microtiter plates (MTP).
  • the buffer system used was PBS (pH: 4, phosphate-buffered saline, pH 7.4) in order to maintain a physiological pH for the proteins used.
  • PBS pH: 4, phosphate-buffered saline, pH 7.4
  • a mix of protease inhibitors and PMSF as a non-specific protease inhibitor was added to the buffer to delay the degradation of the proteins.
  • DTT was used to protect the proteins from oxidation.
  • the blocking solution additionally contained 0.3% skimmed milk powder in order to saturate the unspecific binding sites on the MTP with the milk proteins contained.
  • the FMP20000 substance library was used for screening - the systematic, in part automated search for potential inhibitors of AKAP18delta-RIIalpha binding. It contained 574 MTP, each with 384 wells 20064 different, commercially available substances (ChemDiv, San Diego, USA) in 10 mM stock solutions in DMSO. The substances of the library were selected according to certain criteria, which also apply to previously known pharmacological agents. These include, for example, the Lipinski rules (see discussion).
  • Tab. 1.1 Assignment of an MTP with control reactions (columns 1 and 24) and low-molecular substances (2-23). See also pipetting scheme in Tab. 1.2.
  • the non-specific binding sites were blocked with 100 ⁇ l of blocking solution / well for at least 1 h at room temperature.
  • the blocking solution was removed using the automatic Power Washer 384 (Tecan) and all wells were rinsed with TBST. After completion of the washing process, any remaining solvents on a paper stack were knocked off.
  • the MTPs were prepared for the automated pipetting of low-molecular substances. 10 ⁇ l of blocking solution were initially introduced into each well or the controls were pipetted according to the pipetting scheme (Table 1.2).
  • the controls used were reactions without inhibitors, but with increasing amounts of AKAP18delta GST (0, 80, 160 ng / well), as well as with the inhibitory peptide L314E and the control peptide 18d-PP (25 nM and 1 ⁇ M final concentration).
  • the plates were centrifuged briefly.
  • the library MTPs were prepared for the pipetting procedure as follows: After thawing (37 ° C. for 30 minutes), centrifugation was carried out briefly to collect the solutions at the bottom of the plate. In order to dissolve any solid particles, the plates were immersed in an ultrasonic bath for 1 min. Water adhering to the plates was evaporated by treatment in the Eppendorf Concentrator 5301 at 30 ° C. for 5 minutes, and the protective film was carefully removed.
  • the Power Washer After removal of excess protein by washing with PBST the Power Washer the amount of the bound in the presence of the potential inhibitor AKAPl8delta-GST was determined using 20 ul Al8delta3- (1: 1000 in blocking solution for at least 1 h at room temperature or overnight at 4 0 C ) and 20 ⁇ l of anti-rabbit POD-Ab (1: 3000 in blocking solution, at least 15 min at room temperature) per well. Between the individual pipetting steps each time with the help of the Power Washer with PBST was washed. The quantification was carried out by pipetting 20 ⁇ l of LumiLight Western blotting substrate (Roche) per well and incubating for 5 min at room temperature.
  • the generated chemiluminescence was measured using a Tecan Genios Pro MTP reader and Magellan 5.02 software ⁇ Chemiluminescence endpoint measurement, integration time 10 ms / 'well; Tecan Germany GmbH, Crailsheim).
  • the pGEX-4T3 vector suitable for the expression of GST fusion proteins (FIG. 1) with the A-KAP18delta-coding sequence cloned in was already present in the work group.
  • the 1059 base pair A-KAP18delta cDNA fragment was located at the 3 'end of the GST coding sequence, so that in the expressed protein the GST was N-terminal to AKAP18delta. The correctness of the sequence was confirmed shortly before the work started by sequencing.
  • the GST-AKAP18delta construct was transformed into competent BL21 cells.
  • the plasmid DNA was isolated from four of the clones obtained and a DNA restriction was carried out using the restriction endonucleases EcoRI and Xhol. Since these enzymes were also used for cloning, it was expected that fragments of the size of the AKAP18delta (1.0 kb) insert and the linearized pGEX vector (4.9 kb) could be detected by agarose gel electrophoresis (FIG 5).
  • Bacteria that had been transformed with the pGEX-AKAP18delta vector could be induced to express the recombinant protein by incubation in IPTG-containing medium. After the subsequent lysis of the Bak cells, the GST fusion protein released into the solution was bound to glutathione-Sepharose, washed and finally eluted with excess glutathione. In order to achieve the highest possible yield of protein, were based on a standard method different Pa ⁇ varied parameters of the GST-AKAPl8delta purification. The purification procedure thus determined is described in Section 1.6. For the purified, recombinant GST-AKAP18delta, a size of 75 kDa was expected, for the control purposes purified GST alone of 25 kDa.
  • the highest protein yield could be achieved by incubation at room temperature for 30 minutes (FIG. 6B).
  • the protein concentration of pre-optimization purified and used for ELISA establishment was determined by Bradford assay; it was 0.4 ⁇ g / ⁇ l.
  • the error indicators in the figures indicate the standard error of the mean; in some cases (eg Fig. 9A) the standard errors of the means were so small that the indicators are not recognizable.
  • BSA bovine serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • skimmed milk powder ⁇ was used at a final concentration of 0.3% in binding buffer for blocking free binding sites on MTP.
  • Binding buffer solutions with increasing RIIalpha concentration were pipetted into the wells of a MTP. After blocking free binding sites with skim milk solution , the protein amounts bound to the plates were detected with the PKA RIIalpha- Ab and the anti-mouse POD-Ab. Since the optimal antibody concentrations were still unknown, dilutions of 1: 5000 (PKA RIIa ipha) and 1: 10000 (anti-mouse POD) were used. The measured chemiluminescence intensities were plotted against protein concentration to determine if and when saturation of the wells with protein was achieved (Figure 8B).
  • RIIalpha From 45 ng RIIalpha per well, the binding capacity was saturated. In the following experiments were carried out with RIIalpha amounts of 40 ng / well and 25 ng / well.
  • the A18delta3 antibody was diluted 1: 1000
  • a RIIalpha-GST AKAPl ⁇ delta binding series was prepared, which is then excreted with ver ⁇ dilutions of A18delta3-Pc detected (Fig. 9B).
  • the dilution of the anti-rabbit POD Ab was initially left at 1: 10,000.
  • the binding curves showed that at a dilution of 1: 5000 not all GST-AKAP18delta-RIIalpha complexes could be detected. At a concentration five times higher, significantly stronger signals were obtained. Since the background signal, ie the luminescence intensity at 0 ng GST-AKAP18delta, remained low at the same time, a greater sensitivity was thus also obtained.
  • AKAP-derived peptides were therefore used for control reactions in which the interaction of RIIalpha and GST-AKAP16delta with peptides should be prevented.
  • IC 50 values for the established anchor inhibitor peptide Ht31 and for AKAP18-L314E were determined.
  • the IC 50 value is the peptide concentration at which only 50% of the maximum possible protein-protein complexes are formed.
  • the time factor plays a not inconsiderable role in the planning and implementation of a substance library screening. For this reason, a few experiments were carried out, which gave an idea of the incubation times required. It was first tested in which time sufficient protein complexes are formed to obtain sufficient chemiluminescence intensity. Binding sequences were again pipetted and the formation of the protein-protein bonds was interrupted by washing of the MTP after various times - 15, 30 and 60 min. Subsequently, the bound GST-AKAP18delta amount was detected with the Ak (FIG. 12). Already after 30-60 minutes, sufficiently high chemiluminescence signals could be detected.
  • the generation of chemiluminescence by the oxidation of luminol is a time-dependent reaction. Substrate consumption and denaturation of the peroxidase in the course of the reaction, the intensity decreases after a few minutes.
  • Protein-coated MTPs can be stored for extended periods of time To speed up the screening, it was useful to coat several MTPs with RIIalpha and then store them until further use. To find out if the protein was not degraded by storage, it was bound to two rows of an MTP RIIalpha as described, blocking non-specific binding sites. Then, in a series was the after 1 h of storage at room temperature, is completed in the other h after 66 storage at 4 0 C, the ELISA and the amount of bound GST-AKAPl8delta detected (Fig. 14).
  • the substance library was screened.
  • Tab. 2.4 Percentage binding between GST-AKAP18S and RII ⁇ in the presence of inhibitory molecules (A7-H15, I1-P10), peptides (A3-H6, I11-P12), or without inhibitors (binding sequences in A1-H2, I13- P14), calculated from the results in Tab. 2.3.
  • the color coding corresponds to that in Tab. 2.1.
  • AKAP proteins Protein kinase A anchor proteins
  • PKA Protein kinase A anchor proteins
  • log P log P
  • Tab. 2.5 If the value is greater than 1, the largest part of the substance accumulates in the organic phase, if it is less than 1, then the largest part accumulates in the aqueous phase. Since the log P values for the substances found are greater than 1, they are all expected to have good membrane permeability.
  • One factor that adversely affects the membrane permeability of organic molecules is the ability to form hydrogen bonds. This type of noncovalent binding ensures that the molecules are surrounded by a hydrate shell, which must be stripped off again before the membrane is passed through with energy expenditure.
  • the hydrogen bonds are also the most important forces that lead to the noncovalent binding of an active substance to its target structure - in this case to the RIIalpha subunit of PKA or AKAPl ⁇ delta.
  • One way to assess hydrogen bonding ability is to simply count hydrogen bond donors and acceptors. The number The hydrogen bond donors and acceptors are also given in Tab. 2.5.
  • Another possibility is the computer-aided creation of a model; For example, for an HIV-1 protease inhibitor, the contribution of, inter alia, hydrogen bonds to the total bond was determined by calculating possible trajectories of the binding partners taking into account their molecular dynamics. Then, the free-energy fractions were analyzed to obtain information about the forces that drive the formation of the protein-inhibitor complex.
  • Another property that affects the availability of small molecules in cells is their spatial extent. The spatial extent of a molecule can be approximated by its molecular weight. Both absorption of a substance and its elimination via bile have been shown to depend on molecular weight: lower molecular weights result in better absorption and less gelling elimination.
  • AKAP18delta Since selected substances specifically bind to AKAP18delta, the consequences of abolishing the compartmentalization of this signaling pathway can also be investigated in vivo (see below). Other substances bind specifically to other A-KAP proteins, so that they can be used to study other signaling pathways.
  • Advantageous substances specifically bind AKAP18 proteins, ie all splice variants alpha, beta, gamma and delta, thus excluding them from interaction with RII subunits, since all isoforms have the same RII binding domain (Figure 1.5).
  • AKAP-PKA inhibitors are lead compounds for new drugs
  • inhibitors of RIIalpha-GST-AKAP18delta binding are advantageously further developed into a new class of drugs.
  • AKAPl ⁇ delta anchors the PKA to the AQP2-containing vesicles, allowing the catalytic subunits to specifically phosphorylate the water channel proteins following AVP stimulation, thus transporting and fusing the vesicles to the apical plasma membrane entails. This increases the water permeability of the membrane.
  • Diuretics indirectly increase the excretion of water through the kidneys by inhibiting Na + , K + , and Ca 2+ ion transporters, which normally carry ions from the primary urine back to the collecting duct epithelial cells.
  • the osmolarity in the collecting tube increases and water follows osmotically through AQP2 molecules that are constitutively located in the apical cell membrane of the collecting tube epithelial cells.
  • diuretics are also used in heart failure and hypertension, although adverse drug reactions (ADRs) can occur as a result of the severe loss of electrolytes.
  • the inhibitors of RIIalpha-GST-AKAP18delta binding can be further developed into novel aquarium chemicals.
  • Decoupling of PKA from the AQP2-bearing vesicles by specific inhibition of A-KAP18delta-PKA binding interrupts the AVP-mediated signaling cascade, so that in spite of the AVP stimulus, the incorporation of AQP2 molecules is inhibited in the membrane.
  • the water reabsorption can not be increased and there is an increased water extraction with the urine.
  • the ion transport back into the collecting duct epithelial cells is not impaired.
  • An active substance with this property would thus be an aquarium, with which the diuresis could be specifically enforced.
  • AKAPl ⁇ delta is not only expressed in the kidney, but also in other tissues. Particularly strong is the expression in the heart, where other AKAP proteins take over important functions. It could be shown in the cell culture model of cardiomyocytes that beta-adrenergic regulation of Ca 2+ currents via L-type Ca 2+ channels (Ca v l .2 channels) leads to AKAP-mediated PKA anchoring Requirement is.
  • Beta-blockers are drugs that competitively inhibit the action of the neurotransmitters epinephrine and norepinephrine on the beta-adrenergic receptors of the respective target cells.
  • betai-, beta2 ⁇ and beta3 ⁇ receptors which are expressed tissue-specific. Norepinephrine has stronger effects on the former and weaker effects on the latter.
  • the new drugs could lead to ADRs in skeletal muscle, as they also express L-type Ca 2+ channels and AKAP18alpha.
  • Ca v l.2 channels and A-KAP18alpha also occur in dendrites and cell bodies of neurons in the brain. Therefore, it is possible that AKAPl ⁇ alpha is also involved in the regulation of Ca v l .2 channels. This opens up another potential application for the inhibitory molecules.
  • RII-binding domains of AKAP proteins are very similar, it is questionable whether with small molecules a specific inhibition of certain AKAP-PKA complexes is possible. On the other hand, the slight differences in the RII binding domains may allow a specific inhibition of the AKAP-PKA interaction after optimization (see below) of the substances.
  • Another disadvantage of the peptides is that they are not membrane permeable. For experiments in which membrane permeability is needed, for example on cell culture models, the peptides therefore had to be acylated. With the help of the low molecular weight inhibitors described here, this disadvantage can be overcome.
  • the chemical-physical properties of the substances according to the invention allow the direct use in cell cultures and also in animal models, thus for the first time the investigation of the function of AKAP proteins in vivo is possible.
  • the low molecular weight inhibitors of the preferred RIIalpha GST-AKAP18delta interaction allow additional experiments that provide further information on their properties, their mode of action and their specificity.
  • the established ELISA can be used to check whether the substances do not exert non-specific effects - such as denaturation - on proteins.
  • RIIalpha or GST-AKAP18delta can be bound to MTP and admixed with increasing concentrations of the substances. Subsequently, the proteins can use the PCA R ii a ipha- Al8delta3 or antibodies to be detected.
  • IMCD cells inner medulla of rat kidneys
  • AVP inner medullary collecting duct
  • immunofluorescent stains can be performed.
  • the cells are fixed and permeabilized after incubation.
  • fluorescence-dye-coupled antibodies the intracellular localization of AQP2 can then be determined under the fluorescence microscope.
  • Another experiment is the measurement of Ca 2+ currents by L-type Ca 2+ channels in primary cultured neonatal rat heart muscle cells using patch clamps.
  • Membrane sections of a single cell are fixed with a buffer-filled glass capillary and a constant voltage is applied across the membrane.
  • a current pulse By means of a current pulse, a measurable increase in the Ca 2+ current can be triggered by the voltage-dependent L-type Ca 2+ channels located in the fixed membrane region.
  • the Ca 2+ distribution in the cell can be visualized, and with the aid of a laser scarming microscope (LSM), the Ca 2+ concentration changes can also be analyzed in a time-resolved manner.
  • LSM laser scarming microscope
  • weaker changes in the Ca 2+ concentration are expected if they have an inhibitory effect on the AKAP-PKA interaction and thus on the phosphorylation of the Ca 2+ channel.
  • an optimization can be carried out with the aim of improving the concentration-dependent efficacy.
  • the first step in an optimization is computational modeling to get an idea of which functional groups of the molecules could interact with which amino acids in the proteins.
  • Fusion proteins used vector pGEX-4T3.
  • a - without inhibitor binds GST-AKAP18delta to the plate-bound RIIalpha and is therefore detectable with the antibodies by chemiluminescence.
  • B If small molecules are added which bind to one of the two binding partners (here GST-AKAP18delta), both GST-AKAPl ⁇ delta and the antibodies are removed in the subsequent washing steps and no chemiluminescence can be generated.
  • C The same applies to the inhibition of binding by inhibitory peptides. However, these always bind to Rllalpha.
  • Competent E. coli cells were transformed with pGEX-AKAPl ⁇ delta, the plasmid DNA was prepared from 4 clones, subjected to restriction digestion and analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • Clone 1 ung untreated plasmid from clone 1
  • clones 1-4 EcoRI and Xhol-treated plasmids of clones 1-4.
  • the digested plasmids show the expected fragments of 4.9 kb and 1 kb.
  • GST product of the empty pGEX vector
  • GST-I8delta product of pGEX-
  • AKAP18delta French Press
  • DTT addition of DTT before one-time French Press lysis
  • Lyso lysis with lysozyme
  • RT room temperature
  • M standard molecular weight standard.
  • Fig. 7 By stepwise alteration of the elution buffer composition, elution of GST-AKAP18delta from the glutathione (GSH) -sepharose beads could be optimized.
  • GSH glutathione
  • J Western Blots
  • the arrows in the last column indicate which elution conditions were applied to the beads before being analyzed. It will be respectively the section between 70 and 80 kDa shown.
  • the applied sample volumes are shown, in the penultimate the elution fraction and in the remaining columns the composition of the elution buffer.
  • V volume
  • c concentration
  • TX Triton X-100
  • T-20 Tween 20
  • E eluate no.
  • a - BSA, BSA ELISA and skimmed milk powder were placed in binding buffer. After addition of chemiluminescent substrate, the intensity of the nonspecific signals was determined (individual determinations).
  • B binding buffer with increasing RIIalpha concentrations (expressed as total mass m (RIIalpha)) was pipetted into MTP, blocking nonspecific binding sites with blocking buffer, and the amount of bound protein with PKA RIIa ip ha - and anti-mouse POD-Ab detected.
  • C - Bindepuf ⁇ fer with constant amounts Rllalpha (25 and 40 ng / well) was pipetted onto MTP, nonspecific binding sites with blocking buffer, blocked, blocking buffer with increasing concentrations of GST-AKAP18delta added and the amount of bound GST-AKAP18delta with A18delta3- and anti Rabbit POD Ab detected.
  • I intensity
  • RLU relative light units
  • m mass.
  • a - Constant RIIalpha levels were given 0, 80 or 160 ng GST-AKAP18delta.
  • the detection was carried out with constant A18delta3 dilutions and with 1: 3000 (3k) or 1: 10000 (10k) dilutions of the secondary (2) anti-rabbit POD Ab. Each experiment was performed in the presence (+) or absence (-) of 1% DMSO.
  • B - Binding of constant GST-AKAP18delta levels to constant RIIalpha levels was monitored in the presence of increasing DMSO concentrations (0-2.5 %) detected.
  • C - Bonding sequences were prepared with 0 and 25 ng Rllalpha and detected to detect the specificity of the signals.
  • Binding series were prepared in which the RIIalpha-GST-AKAP18delta interaction was disrupted by washing after 15, 30 or 60 minutes. Then the amount of bound GST-AKAP18delta was detected.
  • the peptides L314E and 18d-PP were added at concentrations of 0.01 or 10 ⁇ M for 15, 30 or 60 min. Subsequently, the amount of bound GST-AKAP18b was detected
  • B - RIIalpha-GST-AKAP18delta complexes at constant concentrations were detected with the A18delta3 and the anti-rabbit POD Ab for all possible combinations of incubation times 15, 30 and 60 min. The display of error indicators was not possible in this figure.
  • Fig. 14 MTP were coated with equal amounts of RIIalpha for 1 h. Then blocking buffer was added and the MTP incubated for 1 h at room temperature or for 66 h at 4 0 C. Subsequently, GST-AKAP18delta was added in increasing concentrations. The amount of bound GST-AKAPl ⁇ delta was detected with A18delta3 and anti-rabbit POD-Ab.
  • Fig. 15 MTP were coated with equal amounts of RIIalpha for 1 h. Then blocking buffer was added and the MTP incubated for 1 h at room temperature or for 66 h at 4 0 C. Subsequently, GST-AKAP18delta was added in increasing concentrations. The amount of bound GST-AKAPl ⁇ delta was detected with A18delta3 and anti-rabbit POD-Ab.
  • Fig. 15 MTP were coated with equal amounts of RIIalpha for 1 h. Then blocking buffer was added and the MTP incubated for 1 h at room temperature
  • B - Binding was also inhibited in a concentration-dependent manner using the inhibitory peptide L314E.
  • C Summary of validation experiments with increasing inhibitor concentrations. Shown are the 9 hits and, for comparison, the non-active compound 2348.
  • D L - Concentration-dependent effect of each inhibitor, structural formula and adaptation of a one-binding-site competition model (see Section 1.11) to the measured values (individual determinations, therefore no error indicators) calculated IC 50 values (DL: individual determinations). Continued (HL) on the next page.
  • FIG. 16 Part 2 of FIG. 15. Part 1 and legend see FIG. 15.
  • Fig. 18 Inhibition of vasopressin (AVP) -dependent redistribution of the aquaporin-2 (AQP2) water channel in renal main cells by the indicated substances (see Table B, concentrations of inhibitors in ⁇ M). Primarily cultured main cells from the inner medulla of rat kidneys (IMCD).
  • AVP vasopressin
  • AQP2 aquaporin-2
  • FIG. 19 Clusters of substances that influence the interaction of A-
  • FIG. 21 FIG.
  • the low-molecular weight substance 990 inhibits the interaction of AKAP18 ⁇ elta with regulatory RIIalpha subunits of PKA in IMCD cells (see Fig. 22). Similarly, 990 prevents AVP-induced AQP2 redistribution. Substance SM61, a 990 derivative, also inhibits AVP-induced AQP2 redistribution. In contrast, the substances 18882 and 990 derivative SM65 have no influence on the AVP-induced AQP2 redistribution at the concentrations used.
  • FIG. 22 The low molecular weight substance 990 inhibits the interaction of AKAP18delta with regulatory RIIalpha subunits of PKA in IMCD cells.
  • the substance (see TABLES A, B and D) was identified by screening a substance library comprising 20064 compounds by means of the ELISA-based experimental set-up shown in FIG. Primarily cultured IMCD cells remained untreated (control), were incubated with substance 990 (100 ⁇ M) or as a negative control with cAMP for 30 min. Subsequently, the cells were lysed and subjected to cAMP agarose precipitation (Henn et al., JBC 279, 26654, 2004). A.
  • AKAPl ⁇ delta was used in the lysates and the cAMP agarose precipitates (cAMP agarose) of the anti-AKAP18delta specific antibody A18delta4 detected in Western blot (Henn et al., 2004).
  • cAMP cAMP agarose
  • A18delta4 detected in Western blot
  • cAMP was added to the batch. This competitively inhibits the binding of regulatory subunits of PKA to cAMP agarose. Therefore, no AKAPs are precipitated and thus AKAP18delta can not be detected in this sample.
  • the positive control used was recombinantly produced AKAP18delta.
  • AKAP18delta is indicated by arrows in A. and B.
  • the small molecule 18882 inhibits the interaction of AKAP18 ⁇ elta with regulatory RIIalpha subunits of PKA in cardiomyocytes.
  • substance 990 has no influence on this interaction.
  • the substances (see Tables A, B and D) were identified by screening a substance library comprising 20064 compounds by means of the ELISA-based experimental set-up shown in FIG. Primarily cultured neonatal cardiomyocytes remained untreated (control), were incubated with the substances 990, 18882 (100 ⁇ M each) or as a negative control with cAMP for 30 min.
  • AKAP18delta was detected in the lysates and cAMP agarose precipitates (cAMP agarose) using the anti-AKAP18delta specific antibody A18delta4 detected in Western blot (Henn et al., JBC 279, 26654, 2004).
  • cAMP was added to the batch. This competitively inhibits the binding of regulatory subunits of PKA to cAMP agarose. As a result, no AKAPs are precipitated and A-KAPl ⁇ delta can not be detected in this sample.
  • AKAP18 delta The positive control used was recombinantly produced AKAP18 delta.
  • B Regulatory Rllbeta subunits of PKA were detected by Western blot in the same samples as in A. As expected, no Rllbeta was detected in the sample containing cAMP (see A.). As expected, the antibody does not recognize AKAP18delta.
  • C For non-selective detection of AKAPs in the lysates and cAMP agarose precipitates, a RII overlay was performed (Henn et al., JBC 279).
  • L-type Ca2 + channel currents were measured by patch-clamp technique in rat neonatal cardiomyocytes. The cells were maintained at -70 mV and repeatedly depolarized to a test potential of 0 mV (after 400 ms increase to -35 mV).
  • Upper Fig. The substances 18882 (see Tables A and B) and the solvent DMSO as a control were added to the cells in the concentrations indicated.
  • the cells were incubated with isoproterenol (1 ⁇ M, ISO; ta receptor agonist) at the indicated times. Isoproterenol was washed out through the ES medium.
  • the figure shows time courses of the normalized currents (normalized current, n corresponds to the number of measured cells, the error bars are means + SEM).
  • Table A Low molecular weight substances that inhibit the interaction of A-KAP18delta with regulatory RIIalpha subunits of PKA.
  • the table shows 142 substances that inhibit interaction by at least 40%. Binding (in%), this value indicates the relative binding of GST-AKAP18delta to PKA-RIIalpha in the presence of the respective substance in percent relative to the control (binding of GST-AKAP18delta to PKA-RIIalpha in the absence of substance).
  • the substances were identified by screening a substance library comprising 20064 compounds by means of the ELISA-based experimental set-up shown in FIG. Structures of the substances are shown. The substances are sorted according to their inhibitory effect. The list begins with the substances that most potently inhibit the interaction of AKAPl ⁇ delta with PKA regulatory RIIa subunits.
  • MW (in g / mol), this value indicates the molecular mass of the substance.
  • the molecular mass also represents an approximation of the spatial extent of the substance that is important for bioavailability (small molecules more easily pass through cellular membranes).
  • Comp_ID these numbers represent the passing substance Coding of the Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (20064). Plate ID number of the sub-library ⁇ punched plate in which the substance was stored; Pos ID, position in the substance library plate where the substance was stored.
  • Formula the sum formula mentioned here, indicates the composition of the substances from the elements. logP, this value is the calculated logarithm of the distribution coefficient of the substance. It makes it possible to estimate the solubility of the substance in polar (aqueous) or non-polar ones
  • logSw this value is the calculated logarithm of the solubility coefficient, which gives an indication of the solubility of the substance in water.
  • H_acceptor indicates the number of hydrogen bond acceptors (N and O atoms) in the substance.
  • H_donor indicates the number of hydrogen-bond donors (NH and OH groups) in the substance. Hydrogen bonds are the most important type of noncovalent bond between small molecules and proteins; therefore, hydrogen-bond donors and acceptors favor the potential of the substances to interact with proteins.
  • B_rotN this value corresponds to the number of atomic bonds in the substance, around which there is free rotation.
  • Selected low-molecular-weight substances that inhibit the interaction of AKAP18delta with regulatory RIIalpha subunits of PKA The table shows 9 substances from Table A that inhibit interaction by at least 80%. Binding (in%), this value indicates the relative binding of GST-AKAP18delta to PKA-RIIalpha in the presence of the respective substance in percent relative to the control (binding of GST-AKAP18delta to PKA-RIIalpha in the absence of substance).
  • the IC50 value was determined by titration of the respective substance.
  • the IC50 for inhibition of interaction was determined in the ELISA experiment described in FIG. MW (in g / mol), this value indicates the molecular mass of the substance.
  • the molecular mass also represents an approximation of the spatial extent of the substance, which is important for bioavailability (small molecules easily pass through cellular membranes).
  • Comp_ID these numbers represent the continuous substance coding of the Leibniz Institute of Molecular Pharmacology (in particular overall 20064).
  • Plate ID number of the substance library plate in which the substance was stored;
  • Pos ID position in the substance library plate where the substance was stored.
  • Formula the formulas mentioned here, indicate the composition of the substances in the elements.
  • logP this value is the calculated logarithm of the distribution coefficient of the substance. It allows an estimation of the solubility of the substance in polar (aqueous) or non-polar (membrane (lipid)) phases and therefore provides a first statement about the bioavailability in cellular systems.
  • logSw this value is the calculated logarithm of the solubility coefficient, which gives an indication of the solubility of the substance in water.
  • H_acceptor indicates the number of hydrogen bond acceptors (N and O atoms) in the substance.
  • H_donor indicates the number of hydrogen-bond donors (NH and OH groups) in the substance. Hydrogen bonds are the most important type of noncovalent bond between small molecules and proteins; therefore, hydrogen-bond donors and acceptors favor the potential of the substances to interact with proteins.
  • B_rotN this value corresponds to the number of atomic bonds in the substance, around the free rotation prevails. A higher number of such bonds increases the conformational flexibility of the substance and thus the probability of accurately binding to a protein surface.
  • Table C Low molecular weight substances that modulate the interaction of A-KAP17 ⁇ with regulatory RIIalpha subunits of PKA.
  • the substances represent derivatives the substance 990 shown in Tables A and B, which were developed by chemical modification of the substance 990.
  • the structures, their chemical formulas (formula), their molecular weight (MW) and the logP value, the number of H-acceptors and H donors of each substance are shown. (Explanations of these parameters in the legends to Tab. A and B.)
  • the inhibitory effect of each substance on the interaction of A-KAP18delta with regulatory Rllalpha subunits of PKA was up to three times (Screening no. 1-3) in the in Fig.
  • Low-molecular-weight substances SM-FP and 990 which inhibit the interaction of AKAP18delta with regulatory RIIalpha subunits of PKA.
  • the substance SM-FP represents a derivative of the substance 990 shown in Tables A and B.
  • SM-FP is characterized by the presence of a fluorescein group.
  • the structures, their chemical formulas (formula), their molecular weight (MW) and the logP value, the number of H-acceptor and H-donors of each substance are shown. (Explanations of these parameters in the legends to Tab. A and B.)
  • the inhibitory effect of each substance on the interaction of AKAP18delta with regulatory RIIalpha subunits of PKA was checked up to three times (screening no.

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Abstract

Die Erfindung betrifft nicht-peptidische Moleküle, die die Interaktion von Proteinkinase A (PKA) und Proteinkinase A-Ankerproteinen (AKAP) modulieren, insbesondere inhibieren und einen Wirts- oder Zielorganismus, der diese nicht-peptidischen Verbindungen oder Erkennungsmoleküle, die gegen diese gerichtet sind, wie z. B. Antikörper oder Chelatoren, umfasst; die Erfindung betrifft weiterhin ein pharmazeutisches Mittel, insbesondere für die Behandlung von Krankheiten, die mit einer Störung des cAMP-Signalweges assoziiert sind, insbesondere Diabetes insipidus, Hypertonie, Diabetes mellitus, Ulcus duodeni, Asthma, Herzinsuffizienz, Adipositas, AIDS, Ödeme, Leberzirrhose, Schizophrenie und andere. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Moleküle.

Description

Nicht-peptidische Inhibitoren der AKAP-PKA-Wechselwirkung
Besehreibung
Die Erfindung betrifft nicht-peptidische Moleküle, die die Interaktion von Proteinkinase A (PKA) und Proteinkinase A-Ankerproteinen (AKAP) modulieren, insbesondere in- hibieren und einen Wirts- oder Zielorganismus, der diese nicht-peptidischen Verbindungen oder Erkennungsmoleküle, die gegen diese gerichtet sind, wie z. B. Antikörper oder Chelatoren, umfasst; die Erfindung betrifft weiterhin ein pharmazeutisches Mittel, insbesondere für die Behandlung von Krankheiten, die mit einer Störung des cAMP- Signalweges assoziiert sind, insbesondere Diabetes insi- pidus, Hypertonie, Diabetes mellitus, Ulcus duodeni, Asthma, Herzinsuffizienz, Adipositas, AIDS, Ödeme, Leberzirrhose, Schizophrenie und andere. Die Erfindung be- trifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Moleküle.
Die Fähigkeit von Zellen, Signale von außerhalb zu empfangen und auf sie zu reagieren, ist für ihr Überleben und ihre Funktion von grundlegender Bedeutung. Die Signale werden von Rezeptoren detektiert und in eine zelluläre Antwort konvertiert, woran immer ein chemischer Prozess beteiligt ist.
Da eine große Anzahl möglicher Signale und eine noch größere Zahl an möglichen Reaktionen existiert, sind viele Signalwege erforderlich. Ein möglicher Signalweg, der be- schritten werden kann, ist der cAMP-abhängige Signalweg. Er beginnt mit der Aktivierung eines G-Protein- gekoppelten, heptahelikalen Transmembran-Rezeptors durch ein extrazelluläres Signal, z. B. durch einen Neurotrans- mitter oder ein Hormon. Das bestuntersuchte Beispiel eines solchen Signalweges ist das beta-adrenerge Rezeptorsystem, in dem Adrenalin oder Noradrenalin G-Protein- gekoppelte, beta-adrenerge Rezeptoren (GPCR v. G protein- coupled receptor) aktivieren. Bei den beta-adrenergen Re- zeptoren unterscheidet man die Subtypen betax, beta2 und beta3, die sich hinsichtlich ihrer Gewebeverteilung und der Ligandenaffinität unterscheiden.
Der so aktivierte Rezeptor überträgt das Signal auf ein heterotrimeres, Guanosintriphosphat-bindendes Protein (GTP-bindendes- oder G-Protein) ; dieses tauscht daraufhin gebundenes GDP gegen GTP aus und wird ebenfalls aktiviert.
Nach der GTP-Bindung dissoziiert das Trimer in eine al- pha-Untereinheit und eine betagamma-Untereinheit . Beide Untereinheiten sind über Acylierungen membrangebunden und können jeweils eigene Effektoren aktivieren bzw. inhibieren.
G-Proteine besitzen eine intrinsische GTPase-Aktivität, die das gebundene GTP spalten und das G-Protein so wieder deaktivieren kann, alpha- und betagamma-Untereinheiten bilden dann wieder ein Trimer. Die G-Proteine übernehmen also die Funktion eines molekularen Schalters. Es werden verschiedene Klassen von- G-Proteinen unterschieden (G3, Gi, Gq, Golf) , deren Untereinheiten verschiedene Effekto- ren aktivieren oder deaktivieren können. Zu den Effektoren zählen Ca2+- und K+-Kanäle, Phospholipase C-beta und Adenylatzyklase (AZ) . Die Adenylatzyklase - ebenfalls ein membranständiges, in mehreren Varianten vorkommendes Enzym - wird durch Galphas stimuliert. Sie wandelt ATP in den second messenger cAMP um. Das cAMP kann frei in das Zytosol diffundieren und verschiedene Effektoren aktivieren. Dazu gehören zyklisches Nukleotid-gesteuerte (CNG) - Kationenkanäle, die sich bei cAMP-Bindung öffnen oder schließen, und eine Familie von Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (guanine nuc- leotide exchange factors; GEF), die sogenannten Epac (ex- change proteins actϊvated by cAMP) . Letztere regulieren die kleinen monomeren GTPasen Rap-1 und Rap-2, die als Suppressoren von Ras wirken. Eine cAMP-Bindung an Epac führt zu einer Konformationsänderung, die die GEF-Domäne exponiert und aktiviert. Damit wird die supprimierende Wirkung aufgehoben, und Ras kann durch die GEF-Funktion aktiviert werden. Ras ist an MAP-Kinase (mitogenaktivier- te Proteinkinase) -Signalwegen beteiligt, die von einer Vielzahl proliferations- oder differenzierungsinduzieren- der Signale, z. B. von Cytokinen, aktiviert werden. Über cAMP-responsives Element-Bindeproteine (CREB) kann cAMP außerdem die Genexpression beeinflussen; CREB binden an die cAMP-responsiven Elemente (CRE) der DNA und wirken so als Transkriptionsfaktoren. Der am umfangreichsten beschriebene und am besten charak- terisierte Effektor von cAMP aber ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA oder A-Kinase) . Im inaktiven Zustand liegt das Protein als Heterotetramer vor, bestehend aus zwei regulatorischen (R) und zwei katalytischen (C) Untereinheiten. Im diesem gebundenen Zustand sind die kata- lytischen Untereinheiten inaktiv. Steigt nach einer Stimulation die intrazelluläre cAMP-Konzentration an, so binden an jede R-Untereinheit zwei cAMP-Moleküle. Durch die so ausgelöste Konformationsänderung werden die kata- lytischen Untereinheiten freigesetzt. Sie phosphorylieren dann in der Nähe befindliche Zielproteine an Ser- und Thr-Resten, wodurch wiederum diese konformationelle und damit funktionelle Veränderungen erfahren. Die Erkennung der Zielproteine erfolgt über Konsensusseguenzen. Da viele verschiedene extrazelluläre Stimuli im cAMP-PKA- Weg zusammenlaufen, und da PKA ein Enzym mit breiter Sub- stratspezifität ist, stellt sich die Frage, wie die zahl- reichen verschiedenen Stimuli unterschiedliche spezifische Zellantworten auslösen können.
Einen ersten Beitrag zur Spezifität im cAMP-PKA-Signalweg liefern die je nach Zelltyp in verschiedenen Isoformen vorliegenden R- und C-Untereinheiten (RIalpha, RIbeta, Rllalpha, Rllbeta bzw. Calpha, Cbeta, Cgamma, PrKX), die sich zu funktionell verschiedenen PKA-Isoformen zusammenlagern können. Dabei besitzen die RI- allgemein eine höhere Affinität zu cAMP als die RII-Untereinheiten. R- Untereinheiten können sowohl Homo- als auch Heterodimere bilden, die viele Kombinationsmöglichkeiten mit feinen Affinitätsabstufungen ermöglichen .
Daneben spielen lokale Aspekte eine wichtige Rolle für die Spezifität im Signalweg: cAMP wird an einem bestimm- ten Ort nahe des G-Protein-gekoppelten Rezeptors durch die AZ erzeugt, und die freie Diffusion im Cytosol wird durch Phosphodiesterasen (PDE) begrenzt - diese hydroly- sieren cAMP zu Adenosinmonophosphat . Nach einem extrazellulären Stimulus werden so nur PKA-Tetramere aktiviert, welche sich in dem durch PDE lokal begrenzten cAMP- Wirkungsbereich befinden. Einem A-Kinase-Ankerprotein (AKAP) fällt nicht nur die wichtige Rolle zu, die PKA in einem solchen Wirkungsbereich zu verankern, sondern auch in der Nähe der zu phosphorylierenden Substrate.
Bei AKAP-Proteinen handelt es sich um eine Familie von derzeit etwa 50 Proteinen ohne signifikante Sequenzhomologie, aber mit ähnlicher Funktion. AKAP-Proteine sind durch das Merkmal der Bindedomäne für die R- Untereinheiten der PKA definiert. Bei diesem konservierten Motiv handelt es sich um eine amphipathische alpha- Helix aus 14 bis 18 Aminosäuren, deren hydrophobe Seite mit einer hydrophoben Tasche der PKA wechselwirkt. Die hydrophobe Tasche wird durch die N-Termini dimeri- sierter R-Untereinheiten gebildet. Die N-Termini lagern sich in antiparalleler Weise zusammen, wobei aus zwei he- lix-turn-helix-yiotiven ein Vier-Helix-Bündel entsteht. Die alpha-Helices jeder Untereinheit, die dem N-Terminus am nächsten sind, formen die für die AKAP-Bindung erfor- derliche hydrophobe Tasche, während die sich in C- terminaler Richtung anschließenden alpha-Helices des Bündels die Dimerisierung ermöglichen. Neben den an den alpha-Helices beteiligten Aminosäuren sind auch weitere N- terminale Aminosäureseitenketten an Wechselwirkungen mit AKAP-Proteinen beteiligt.
Der N-terminale Teil der RI- und RII-Untereinheiten unterscheidet sich bezüglich der Sequenz, woraus sich verschiedene AKAP-Bindungsspezifitäten ergeben. Die meisten AKAP-Proteine binden an RII-Untereinheiten (Kd im nanomo- laren Bereich) , wobei man niedrig- und hochaffine AKAP- Proteine unterscheidet. Während AKAP-Lbc/Ht31, AKAP79 und AKAP95 mit Kd~Werten zwischen 1 und 50 nM zu den hochaf- finen AKAP-Proteinen zählen, gehören Gravin und die zur
Ezrin/Radixin/Moesin-Proteinfamilie zählenden AKAP-
Proteine zu den niedrigaffinen (Kd-Werte im mikromolaren
Bereich) . Daneben existieren auch einige dual-spezifische AKAP-Proteine (D-AKAP) , die beide R-Typen binden. Als RI- spezifische AKAP-Proteine kennt man bisher nur AKAPCE
(aus Caenorhabditis elegans) , AKAP82, PAP7 [peripheral- type benzodiazepine receptor (PBR) associated protein 7) und hAKAP220. Eine weitere charakteristische Domäne der AKAP-Proteine ist die sogenannte Targeting-Domäne, welche jedes AKAP- Protein an einem bestimmten subzellulären Kompartiment in der Zelle verankert. Zusätzlich zu PKA und subzellulären Strukturen können A- KAP-Proteine noch weitere Signalmoleküle und im cAMP-PKA- System wichtige Enzyme wie PDE und Phosphatasen binden. Letztere machen Phosphorylierungsreaktionen durch Hydrolyse rückgängig und können so die Wirkung eines Stimulus terminieren. Auf diese Weise stellen AKAP-Proteine in der Nähe des Substrates ein Gerüst zur Verfügung, an dem alle für die Initiation und Termination des Signals nötigen Proteine rekrutiert werden können. Das von der AZ ausgehende, prinzipiell diffuse cAMP-Signal wird so mit der Substratphosphorylierung durch die AKAP-fixierte PKA zeitlich und räumlich fokussiert.
AKAP-Proteine sind an zentralen Stellen vieler zellulärer Prozesse beteiligt. Eine Möglichkeit der Unterteilung ist die Lokalisation der AKAP-Proteine in der Zelle; so gibt es Ionenkanal-, Cytoskelett- und Mitochondrien- assoziierte AKAP-Proteine. Eine andere Möglichkeit ist durch die gewebespezifische Expression der AKAP-Proteine gegeben.
Um die Bedeutung von AKAP-Proteinen für Signaltransdukti- onswege in Zellen aufzuzeigen, sollen im Folgenden die Funktionen dreier AKAP-Proteine genauer beschrieben werden: Gravin, AKAP79 und AKAPl8.
Bei Gravin handelt es sich um ein Aktin-assoziiertes A- KAP; polymerisiertes Aktin ist ein wichtiger Bestandteil des Zytoskeletts . Gravin dient als multivalentes Gerüst- protein, welches neben Aktin auch PKA und die Ca2+- abhängige Proteinkinase (PKC) bindet. Dieser Komplex ist für die Desensibilisierung des beta2~adrenergen Rezeptors (s. o.) nach Stimulation durch Agonisten wichtig. Im Ruhezustand ist der Gravin-Komplex an den Rezeptor gebun- den. Wird der Rezeptor aktiviert, z. B. durch Adrenalin- Bindung, so führt dies zur Bildung von cAMP (s. o.) . Die von Gravin verankerte PKA setzt ihre katalytischen Untereinheiten frei, welche Gravin selbst phosphorylieren. Durch die Phosphorylierung wird die Bindung zunächst ver- stärkt. Dauert die Stimulation durch den Agonisten an, so wird Gravin auch durch die ebenfalls verankerte PKC phosphoryliert . Diese Phosphorylierung verursacht die Dissoziation des Gravin-Komplexes vom Rezeptor. Stattdessen bindet das mit der Ubiquitin-Ligase mouse double mi- nute-2 (MDM2) verbundene Adapterprotein beta-Arrestin an den Rezeptor. Die von MDM2 katalysierte Ubiquitinierung kennzeichnet den Rezeptor für proteasomalen Abbau und En- dozytose, womit das beta2~adrenerge Rezeptorsystem desensibilisiert ist.
AKAP79 ist ein Ionenkanal-assoziiertes AKAP, welches an der Regulation der synaptischen Plastizität im Hippocam- pus beteiligt ist. Dort werden PKA-vermittelt Na+-Ströme oder Ca2+-Ströme verstärkt, die durch alpha-Amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren induziert wurden. AMPA-Rezeptoren besitzen eine intrinsi- sehe Ca2+/Na+-Kanalfunktion. Die Verstärkung wird erreicht, indem die Aktivität des Glutamat-Rezeptors durch Phosphorylierung moduliert wird. Dem AKAP79 kommt dabei die Aufgabe zu, die PKA in der Nähe der AMPA-Rezeptoren zu verankern. Dazu ist es mit N-terminalen, basischen Re- gionen ausgestattet, die eine Bindung an das Membranlipid Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphat erlauben. Die Bindung von AKAP79 an den Rezeptor erfolgt nicht direkt, sondern es bindet an membranassoziierte Guanylatkinase- Proteine (MAGÜK) , die wiederum an den Rezeptor binden.
AKAP18 wurde zuerst als membranassoziiertes, 15 oder 18 kDa großes Protein beschrieben, welches die PKA an der basolateralen Plasmamembran von Epithelzellen und in Skelettmuskelzellen in der Nähe der L-Typ-Ca2+-Kanäle an der Plasmamembran verankert, wobei AKAP18 direkt mit dem C- Terminus der Ca2+-Kanäle interagiert.
Das Protein besteht aus 81 Aminosäuren, enthält die PKA- bindende amphipathische Helix und N-terminale Myristoyl- und Palmitoyl-Lipidanker, die den PKA-AKAP-Komplex an der Plasmamembran verankern. Die Interaktion zwischen AKAP18 und dem Ca2+-Kanal findet über die C-terminale Domäne der alphai-Untereinheiten des Kanals statt; daran ist ein Leucin-Zipper-ähnliches Motiv beteiligt. Auf diese Weise wird die PKA nahe einer wichtigen Phosphorylierungsstelle in der alphaχ-Untereinheit positioniert, wodurch spezifische Phosphorylierung ermöglicht wird. Die Phosphorylierung erhöht die Offenwahrscheinlichkeit des Kanals. Weitere Studien zeigten, dass mehrere Spleißvarianten aus dem AKAPl8-Gen hervorgehen; daher wurde das oben beschriebene AKAPlδ-Protein als AKAP18alpha (auch AKAP15) bezeichnet. Weitere Spleißvarianten sind AKAPl8beta, gamma und -delta.
AKAPlδbeta besteht aus 104 Aminosäuren und enthält die gleiche Membranbindedomäne wie die alpha-Variante . Eine zusätzliche, 23 Aminosäuren umfassende Domäne leitet das Protein zur apikalen Plasmamembran in polarisierten Epi- thelzellen. Die Funktion von AKAPlδbeta ist bislang unklar.
Im Unterschied zu den meisten AKAP-Proteinen ist das aus 326 Aminosäuren bestehende AKAP18gamma auch in löslichen Zellfraktionen lokalisiert. In Maus-Oozyten verankert es PKA-RI-Untereinheiten im Nukleus, was auf eine Beteiligung an der Regulierung der Transkription hindeutet. Bei AKAP18delta handelt es sich um ein 353 Aminosäuren umfassendes Protein, dessen RII-Bindedomäne mit denen der Varianten alpha-gamma nahezu identisch ist. Es ist zum großen Teil homolog zu AKAPlδgamma. AKAPlδdelta wurde während der Suche nach AKAP-Proteinen, die an der Translokation des Wasserkanals Aquaporin-2 (AQP2) aus intrazellulären Vesikeln in die apikale Plasmamembran von Sam- melrohrzellen der Niere beteiligt sind (s. u.), entdeckt. Es konnte gezeigt werden, dass AKAPlδdelta an den AQP2- haltigen Vesikeln lokalisiert ist.
Da außerdem seine Verteilung stark der von AQP2 ähnelt, und da es nach entsprechender Stimulation der Nierenzellen zusammen mit AQP2 zur Plasmamembran transloziert wird, wird eine Beteiligung an der AQP2-Translokation vermutet. Die AQP2-Translokation wird durch das antidiuretische Hormon Arginin-Vasopressin (AVP, auch ADH) induziert. Die Bildung des Hormons und seine Sekretion in die Blutbahn werden durch Osmorezeptoren im Hypothalamus gesteuert, die ständig die Osmolarität des Blutes überwachen. Steigt die Osmolarität an, beispielsweise durch verminderte Flüssigkeitsaufnahme des Organismus, so wird AVP synthetisiert und in die Blutbahn sezerniert. Das Startsignal für die AQP2-Umverteilung liefert die Bindung von AVP an den Vasopressin-Rezeptor (V2R) auf der basolateralen Membranseite von Häuptzellen des renalen Sammelrohres. Der V2-Rezeptor, bei dem es sich um einen GPCR handelt, setzt die oben beschriebene Signalkaskade in Gang, so dass vermehrt cAMP gebildet wird. Die durch AKAPlδdelta an den AQP2-haltigen, sekretorischen Vesikeln verankerte PKA setzt aufgrund der durch cAMP-Bindung ausgelösten Konformationsänderung ihre kata- lytischen Untereinheiten frei, welche die in der Nähe befindlichen AQP2-Wasserkanäle phosphorylieren. Diese Phosphorylierung sorgt für den Transport der Vesikel zu und deren Verschmelzung mit der apikalen Plasmamembran. Auf diese Weise wird die Wasserdurchlässigkeit dieser Membran erhöht, und es kann verstärkt Wasser aus dem - auf der anderen Seite der apikalen Membran im Sammelrohr befindlichen - Primärharn rückresorbiert werden. So wird dem anfänglichen Stimulus der Signalkette entgegengewirkt.
Neben AKAPlδdelta sind mit den AQP2-Vesikeln noch weitere Proteine assoziiert, die aber im Unterschied zu A- KAPlδdelta nicht mit zur Plasmamembran gelangen. Dies könnte bedeuten, dass die durch AKAPlδdelta an den Vesi- kelmembranen verankerte PKA nicht nur für die AQP2- Phosphorylierung, sondern beispielsweise auch für den Transportprozess zur Plasmamembran regulierende Phosphorylierungen erforderlich ist. Eine solche Funktion wurde auch für das L-Typ-Ca2+-Kanal~assoziierte AKAP79 (s. o.) gezeigt.
Es besteht die Möglichkeit - wie bereits oben dargestellt -, mithilfe von synthetischen Peptiden, die die amphi- pathische Helix der PKA-Bindedomäne nachahmen, die Bin- düng der PKA an AKAP-Proteine zu hemmen. Obwohl die genannten inhibitorischen Peptide eine wichtige Rolle bei der Aufklärung der physiologischen Bedeutung der PKA- Kompartimentierung durch AKAP-Proteine zukommt, haben sie Nachteile. Als Peptide sind sie z. B. nicht besonders stabil und teuer in der Synthese. Da AKAP-Proteine in vielen zellulären Prozessen für Spezifität sorgen und gewebespezifisch exprimiert werden, sind sie ein attraktives Ziel für neue Pharmaka. Vor der Entwicklung neuer Wirkstoffe müssen die AKAP-Proteine allerdings als Ziel validiert werden. Dadurch muss die Interaktion zwischen AKAP-Proteinen und der PKA im Tier- und später auch im Humanmodell aufgehoben werden. Peptide können aber nicht an Versuchstiere verabreicht werden, da sie im Gastroin- testinaltrakt degradiert werden. Ein weiteres wichtiges Modell zur Untersuchung von AKAP-Funktionen stellen Zellkulturmodelle dar. Zum Einsatz in Zellkulturen müssen Peptide allerdings acyliert werden, um Membranpermeabilität zu gewährleisten. Peptide des Standes der Technik docken aufgrund fehlender sterischer Hinderung oder wegen besser interagierender (hydrophober) Aminosäureseitenketten fester an die hydrophobe Tasche der regulatorischen PKA-Untereinheiten als vollständige AKAP-Proteine. Auf diese Weise kann experimentell überprüft werden, wie sich die Aufhebung der PKA- Kompartimentierung durch AKAP-Proteine physiologisch auswirkt . Das zuerst eingeführte und bisher am häufigsten benutzte Anker-Inhibitor-Peptid ist das aus 22 bis 24 Aminosäuren bestehende Ht31-Peptid, welches von der PKA-bindenden Domäne des AKAP-Proteins Ht31, auch bekannt als AKAP-Lbc, abgeleitet wurde. Mithilfe bioinformatischer Methoden und mit Peptid-Ärray- Screenings, bei denen von einer aus verschiedenen AKAP- Proteinen berechneten Konsensus-Bindungsstelle für RII- Untereinheiten ausgehend systematisch Aminosäuren ausgetauscht und die Peptide für Bindungsexperimente an Cellu- lose-Membranen gekoppelt wurden, konnte ein stärker inhibierendes Peptid, das AKAPi3 (in silico) , generiert werden. Dieses ist ein 17-mer und kann durch veränderte Positionen zweier Aminosäureseitenketten zusätzliche hydrophobe Wechselwirkungen mit der RII-Untereinheit eingehen, und es kann eine zusätzliche Salzbrücke ausbilden, die seine Konformation stabilisiert.
Inhibitorische Peptide noch höherer Affinität konnten ausgehend von der RII-Bindedomäne des zu den hochaffinen AKAP-Proteinen gehörenden AKAPlδdelta erzeugt werden. Diese haben u.a. den Vorteil, dass sie niedriger dosiert werden können, was unspezifische Effekte des Peptids unwahrscheinlicher macht.
Hierbei wurden zunächst alle Aminosäuren eines die A- KAPl8delta-RII-Bindedomäne enthaltenden 25-mers einzeln durch alle möglichen anderen biogenen Aminosäuren ersetzt. Ausgehend von den höheraffinen Peptiden wurden weitere Aminosäure-Substitutionen, basierend auf einem Strukturmodell der Bindung des Peptids in der hydrophoben Tasche, vorgenommen. Eine weitere Affinitätsverstärkung war aber nicht möglich. Die resultierenden Peptide wurden auf ihre Spezifität und ihre biologische Funktion als globale Inhibitoren der AKAP-RII-Bindung getestet.
Überraschend hat sich gezeigt, dass die nicht- peptidischen Moleküle gemäß Tabelle A als Inhibitoren bzw. Entkoppler von PKA und AKAP bzw. als Substanzen zur Blockierung der PKA-Verankerung eingesetzt werden können. Die nicht-peptidischen Inhibitoren stellen auch Leitstrukturen für neue Wirkstoffe dar. Derartige Substanzen stellen zum einen ein neues Werkzeug zur Blockierung der PKA-Verankerung für in-vitro Experimente dar und zum an- deren stellen sie die Grundlage für eine neue Klasse von Pharmaka dar, die im Gegensatz zu klassischen Pharmaka Protein-Protein-Wechselwirkungen angreifen und nicht Enzym- oder Rezeptor-Aktivitäten modulieren.
All diesen Molekülen ist gemein, dass sie nicht- peptidische Blocker bzw. Entkoppler der PKA-AKAP- Interaktion sind, die bisher im Stand der Technik noch nicht offenbart waren. All diese Substanzen können auch zur Blockierung der PKA-Verankerung verwendet werden. Mit den beanspruchten Verbindungen ist eine gezielte Hemmung eines AKAP-RII-Komplexes möglich. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen ermöglichen überraschenderweise den direkten Einsatz in Zellkulturen, Tiermodellen, sowie im Primaten- und hu- manen Bereich, womit erstmals die Untersuchung der Funktion von AKAP-Proteinen in vivo möglich wird. Bisher ist im Stand der Technik die Untersuchung der Funktion von AKAP-Proteinen in vivo nicht beschrieben. Diese in vivo- Tauglichkeit ist ein gemeinsames Merkmal aller erfindungsgemäßen Verbindungen.
Nicht alle der erfindungsgemäßen Verbindungen weisen ein neues Strukturelement auf, was aber nicht zur Folge hat, dass die Einheitlichkeit der anmeldungsgemäßen Lehre nicht mehr gegeben ist. Die beanspruchten alternativen chemischen Verbindungen haben eine gemeinsame Eigenschaft oder Wirkung.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung weisen bevorzugte beanspruchte Verbindungen überraschenderweise eine Vielzahl von gemeinsamen physikochemischen Eigenschaften auf, die dazu führen, dass die Verbindungen sehr gut als pharmazeutisches Mittel eingesetzt werden können, da sie den so genannten Lipinski-Regeln (rules of five) weitestge- hend entsprechen. Diese gemeinsamen physikochemischen o- der strukturellen Merkmale der erfindungsgemäßen Kompo- nenten betreffen ihr Molekulargewicht, welches im Bereich von 150 bis 600 g/mol, bevorzugt von 190 bis 300 g/mol liegt, einem Verteilungskoeffizienten von logP ≤ 10, bevorzugt ≤ 8, besonders bevorzugt ≥ 1 bis ≤ 5 mit maximal 10 Wasserstoffbrücken-Donatoren und maximal 10 Wasser- stoffbrücken-Akzeptoren, einem Löslichkeitswert von logSw von -400 bis 0 und einem BrotN-Wert von 0 bis 7, wobei bevorzugt die AKAPl8delta-RII-Interaktion um mindestens 40% gehemmt wird. Die Summe der strukturellen Gemeinsamkeiten führt zu dem funktionellen Zusammenhang der Inhi- bition der Wirkung von PKA und AKAP bzw. zur Blockierung der PKA-Verankerung. Die gemeinsamen physikochemischen Merkmale stellen daher keine willkürliche Summe von Merk- malen dar, sondern sind sozusagen der gemeinsame Fin- gerprint der beanspruchten Verbindungen, der vorteilhafterweise die gute in-vivo-Tauglichkeit der Verbindungen ermöglicht und charakterisiert. Besonders bevorzugt bin- den die erfindungsgemäßen Moleküle an regulatorische Untereinheiten der PKA, insbesondere an RIalpha oder RII- alpha bzw. RII alpha oder Rllbeta. Die erfindungsgemäßen Moleküle ermöglichen eine Modifizierung, Inhibition bzw. Entkopplung von AKAP, bevorzugt AKAP18, besonders bevor- zugt AKAPlδdelta und PKA in Abhängigkeit der verwendeten Spezies. Für den Fachmann ist es mittels einfacher Routine-Versuche ohne weiteres möglich, Erkennungsmoleküle gegen die erfindungsgemäßen Moleküle bereitzustellen. Hierbei kann es sich beispielsweise um Antikörper, um Chela- toren, um Komplexbildner oder andere im Stand der Technik bekannte Strukturen handeln. Derartige Erkennungsmoleküle sind einfach zu generiere, wenn ihr Traget - wie vorliegend die Entkoppler - offenbart ist. Beispielsweise können die Entkoppler zusammen mit einem Adjuvans in Orga- nismen appliziert werden, wodurch Antikörper entstehen, die nach bekannten Methoden gewonnen werden können. Mithilfe dieser Erkennungsmoleküle bzw. mithilfe der erfindungsgemäßen Moleküle können Organismen bereitgestellt werden, in denen die AKAP-PKA-Interaktion gewebs- und/oder zellspezifisch modifiziert ist, indem die genannten Organismen mit den erfindungsgemäßen Molekülen bzw. den Erkennungsmolekülen in Kontakt gebracht werden.
Bevorzugte Entkoppler weisen einen logP Wert von < 9, 8, 7, 6, 5, bevorzugt 4, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt < 2 auf und maximal 10, 9, 8, 7, 6, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 4, 3 und/oder 2 Wasser- stoffbrücken-Donatoren und/oder -Akzeptoren und/oder einen BrotN-Wert von insbesondere 1, 2, 3, 4, 5, oder 6 und/oder eine logSw-Wert von -350, -300, -250, -200, - 150, -100 oder -50 und ein Molekulargewicht von 150 bis 550, von 150 bis 500, von 150 bis 450, von 150 bis 400 oder von 150 bis 350.
Bevorzugt weisen die Entkoppler maximal 6 Wasserstoffbrücken-Donatoren und/oder maximal 4 Wasserstoffbrücken- Akzeptoren auf und/oder einen Verteilungskoeffizienten von logP von ≥ 1 bis ≤ 5.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hemmen die erfindungsgemäßen Entkoppler die Wechsel- Wirkung von AKAP und PKA-Untereinheiten um mindestens 80%. Dem Fachmann sind ausreichend Methoden bekannt, mit denen er die Hemmung der Wechselwirkung bestimmen kann. So gibt es beispielsweise zahlreiche Offenbarungen, die beschreiben, wie die Inhibition der AKAP-PKA-Bindung mit- hilfe von Ht31-Peptid realisiert werden kann. Im Sinne der Erfindung heißt jedoch Hemmung jegliche Form der Modifizierung der Wechselwirkung zwischen AKAP und PKA gegenüber einer nicht beeinflussten Wechselwirkung gegenüber diesen beiden Molekülen. Auch wenn es bevorzugt ist, die Bindung zwischen AKAP und PKA zu inhibieren, kann es erfindungsgemäß gewünscht sein, dass die Wechselwirkung von AKAP und PKA erhöht wird.
Besonders bevorzugte Entkoppler sind die in Tabelle A dargestellten. Diese Entkoppler weisen physikochemische
Eigenschaften auf, die nicht nur dazu führen, dass sie die Wechselwirkung von AKAP und PKA hemmen, sondern dass sie weiterhin sehr gut in einem Zielorganismus aufgenommen werden können, so dass eine Behandlung von Krankheiten möglich ist, die aus einer Inbalance oder Störung der cAMP-abhängigen Signaltransduktionen hervorgehen. Durch den derzeitigen Stand der Technik sind dem Fachmann derartige Krankheiten bekannt; der Fachmann weiß also, wel¬ che Krankheiten erfasst und gemeint sind. Bekannte Krankheiten sind beispielsweise Diabetes insipidus, Diabetes mellitus, Adipositas, Ödeme, chronische obstruktive Lun- generkrankungen, AIDS, Schizophrenie, Leberzirrhose, Herzinsuffizienz, koronare Herzkrankheiten, Hypertonie und/oder Asthma. Die durch die Störung der cAMP- abhängigen Signaltransduktion verursachten Krankheiten sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die unten genann- ten weiteren Erkrankungen gehören ebenfalls zu den bevorzugten Erkrankungen, die sehr gut mit den erfindungsgemäßen Mitteln behandelt werden können.
Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Moleküle sind in Ta- belle B offenbart. Diese bevorzugten Verbindungen weisen gemeinsame physikochemische Eigenschaften auf, die dazu führen, dass die Verbindungen ggf. zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur chirurgischen und/oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und Diagnoseverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden, verwendet werden können. Vorteilhafterweise weisen die Verbindungen Substanzeigenschaften auf, die den rules of five von Lipinski et al. (Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 46, 3-26, 2001) entsprechen. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Entkoppler ausgewählt aus der Tabelle C. Diese bevorzugten Verbindungen weisen eine solch gute Membranper- meabilität auf, dass sie sehr gut in vivo, d. h. insbe- sondere als pharmazeutisches Mittel, eingesetzt werden können, um die PKA-Verankerung zu blockieren bzw. umd die AKAP-PKA-Wechselwirkung zu modulieren, insbesondere zu inhibieren.
Vorteilhafte Moleküle gemäß der Erfindung sind in Tabelle A, B und/oder C offenbart. Aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften wie ihrem geringen Molekulargewicht, ihrem vorteilhaften Verteilungskoeffizienten und Löslich- keits- und BrotN-Wert, sowie der Tatsache, dass sie nicht mehr als 10 H-Brücken-Akzeptoren und insbesondere im wesentlichen nicht mehr als 7, bevorzugt 6, ganz besonders bevorzugt 5 H-Brücken-Donatoren aufweisen, sind diese Mittel sehr gut in der Prophylaxe, Therapie, Nachbehandlung und/oder der Diagnose in in vivo Systemen, wie z. B. Zielorganismen, bevorzugt in Menschen oder in Versuchstieren, wie z. B. Primaten, Ratten oder Mäusen, ein- setzbar. Weitere bevorzugte Entkoppler sind in Tabelle D offenbart .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die erfindungsgemäßen Entkoppler die allge¬ meine Formel I auf, die durch Mesomerie ineinander über¬ führbar sind (R2 und R3 werden als austauschbar behandelt) LV
Figure imgf000020_0001
wobei X ein Nicht-Wasserstoffatom ist, vorzugsweise ein Schwefelatom, wobei R1 ein Alkyl- oder Arylrest ist, vorzugsweise ein 1-Naphthylmethylrest, wobei R2 und R3 ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl- oder Arylrest sind, vorzugsweise sind R2 und R3 zwei Wasserstoffatome, zwei Methylreste, ein Benzylrest und ein Methylrest oder ein Be- nyzlrest und ein tert-Butylrest, besonders bevorzugt sind R2 und R3 ein 2-Thiazolidinylrest und ein Methyl oder tert-Butylrest, sowie ein 1-Naphthylrest und ein Isopro- pyl-, Cyclohexyl-, Benzyl- oder Methylrest. Die Erfindung betrifft demgemäß auch Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel I für die Verwendung als Arzneimittel bzw. als pharmazeutische Wirkstoffe. Die Erfindung betrifft in ei- ner weiteren bevorzugten Ausführungsform auch die Verwendung der Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel I zur Behandlung der in der Anmeldung offenbarten Krankheiten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin- düng weisen die erfindungsgemäßen Entkoppler die allgemeine Formel II auf, wobei Rl bis R3 die Bedeutung wie oben haben:
Figure imgf000021_0001
Rotation um Einfachbindung
Das Verhältnis 1/5 hängt von der Basizität des Stick- Stoffs neben R3 ab. Vorteilhafterweise ist ab der Struktur 2 die Anordnung der Reste R2 und R1 austauschbar. Besonders bevorzugt sind die protonierten Verbindungen, wie z. B. das Hydrochlorid, zur Verwendung als Entkoppler der AKÄP-PKA-Interaktion. Bei Verbindungen mit mehreren basi- sehen Zentren, wie z. B. die Verbindung JG5 (siehe Tabelle) ist insbesondere das Dihydrochlorid bevorzugt. Bevorzugt ist die Leitstruktur 990 (siehe Tabelle) .
Figure imgf000021_0002
Die IC-Werte nehmen ab, je größer die aliphatischen Reste werden, wobei, wie beim JG31 (siehe Tabelle) , das Anthra- cen zusätzliche Wirkungen aufweist. Dies bedeutet einen höheren Elektronenschub zu Amidin und eine höhere Basizität. Für bestimmte Anwendungen ist die Elektronendichte am Amidin wichtig, so dass die Reste R1 und R2 elektronenschiebende Einheiten sind (siehe Verbindungen 6 und 7; ortho- oder para-Methoxyphenyl, orto- oder para- Diaminophenyl) .
Vorteilhaft können auch bestimmte Abbauprodukte der erfindungsgemäßen Entkoppler sein. Die Thiocarbamimidsäure- ester (wie Nr. 990) sind unter gewissen Bedingungen labil gegen Nukleophile wie z. B. Amine. Dabei entstehen Thiole und Guanidine, die ebenfalls beispielsweise zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden können. Die Erfindung betrifft demgemäß in einer bevorzugten Ausführungs- form die zyklischen Imidazole (6) und die Dihydroimidazo- Ie (7) zur Verwendung in der Medizin, insbesondere als Entkoppler von AECAP und PKA, sowie als Werkzeug in der Grundlagenforschung in vivo und in vitro. Die Reste R1 und R2 sind bevorzugt Arylreste oder zyklisch aliphati- sche Reste (SM 61, SM63 und SM65) . Auch der 6Ring am Ami- din ist bevorzugt (die Verbindung 8 baut auf SM71 auf) .
Figure imgf000022_0001
8
Vorteilhaft ist auch, das Amidin vom Schwefel zu trennen und an der 2-Position des Naphtalins anzubringen (Verbindung 9) . In einer vorteilhaften Ausführungsform bleibt der Abstand N/S hierbei nahezu gleich. Bevorzugt enthält R1 S-R, damit die Elektronendichte am Amidin vergleichbar den aktiven Verbindungen ist. Bevorzugt ist R ein Alkyl- rest. Bevorzugt ist demgemäß auch das Isomere 10.
Figure imgf000023_0001
10
Bevorzugt sind demgemäß Entkoppler gemäß der allgemeinen Formel 11 und 12.
Figure imgf000023_0002
Beansprucht werden die Verbindungen an sich, wie auch ihre HCl-Salze. In bevorzugten Ausführungsvarianten können R1 und R2 unabhängig voneinander sein:
acyclisch aliphatisch mit einer Kettenlänge von Cl bis Cβ; cyclisch aliphatisch mit einer Ringgröße von C3 bis C9 unter Beinhaltung eines oder unabhängig davon mehrerer Heteroatome vom Typ O oder N; aromatisch als Monocyclus-, Heteroaryl- und ein- bis dreifach substituierter Monocyclus-Rest . Auf die elektronenschiebenden Substituenten (z. B. OMe oder NMe2 wurde oben verwiesen. Die Verwendung von Hete- roaromaten ist insbesondere in Hinsicht auf die Bioverfügbarkeit vorteilhaft. Vorteilhaft ist ferner die Ver- Wendung der Struktur 12 mit X als Linkergruppe vom Typ acyclischer Aliphat mit einer Kettenlänge von Cl bis C6 und R3 mit den gleichen Gruppen wie für R1 und R2 unabhän- ging voneinander formuliert.
Zu der Chemie der genannten Verbindungen wird ausgeführt, dass der Schwefel und die daneben liegende Position 10 in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung oxidationsemp- findlich sein können. Für den Fall, dass nur der Schwefel oxidiert wird, ist es vorteilhaft, dass die wirksame Form nicht das Gerüst der Leitstruktur hat (siehe oben) , sondern entweder das SuIfoxid 2 oder das SuIfon 3 ist. Darüber hinaus kann die Position 10 nach Oxidation des Schwefels azide sein und kann nach Deprotonierung z. B. eine Claisensche Aldoladdition eingehen. Letztere Reakti- on wird exemplarisch mit einem Essigsäurebaustein als Verbindung 16 (siehe unten) dargestellt. Falls R2 ein Wasserstoffatom ist, erfolgt auch ein intramolekularer Ringschluss .
Vorteilhafterweise sind die beiden Positionen (Schwefel und die Nr. 10) sehr reaktiv.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass, für die Wirksamkeit von Struktur 11 die Position 10 nicht modifiziert wird. Wie bereits ausgeführt, kann diese azide und wie weiter unten ausgeführt oxidationsempfindlich sein. Diese Position kann vorteilhafterweise ohne signifikante Änderung der Raumerfüllung mit Fluoratomen versehen werden, die eine Diversifizierung unter physiologischen Bedingungen verhindern und die Aktivität vorteilhafterweise erhalten. Insbesondere die Struktur 16 ist damit gegen vorzeitigen Verlust geschützt.
Figure imgf000025_0001
Als bevorzugte Ausführungsform für Folgeprodukte aus der Oxidation der 10-Position (Oxidation ergibt Verbindung 18) wird beispielhaft das Additionsprodukt einer Acety- leinheit als Struktur 8 nach Eliminierung von Wasser in 20 abgebildet (siehe unten) . Vorteilhafterweise kann auch die Position 10 substituiert werden. Dies betrifft insbesondere die Reste R3 und R4 wie in Verbindung 21 dargestellt, die bevorzugt als Erweiterung zu R1 und R2 auch F sein können. Das oben ausgeführte zu den Spacern zwischen N und R1/R2 und der Oxidation am Schwefel gilt auch für die unten aufgeführten Verbindungen.
Figure imgf000026_0001
18 19 20
Figure imgf000026_0002
21
R1, R2, R3 und R4 können unabhängig voneinander beispielsweise sein Akyl- und/oder Aryl-Reste.
Bevorzugt ist also die Verwendung des 1-substituierten Naphtalin. In den lipophilen Taschen eines Zielmoleküls kann es jedoch sein, dass deren Affinität einer lipophilen Seitengruppe, wie eines aromatischen Bicyclus, einen wichtigen Beitrag zur Akzeptanz des Substrates leistet. Demgemäß sind auch Verbindungen mit der allgemeinen Forme gemäß der Verbindungen 22, 23 und 24 bevorzugt, die vor- teilhafterweise eine gleichwertige Affinität aufweisen.
Figure imgf000027_0001
22 23 24, R=H oder F
Solche Bicyclen gemäß der Verbindungen 22 bis 24 weisen in vorteilhaften Ausführungsformen X = Sauerstoff auf, aber auch N, NH oder S. Auch dreifach anilierte Ringsysteme können bevorzugt sein (siehe auch Verbindung SM39 und SM44; Tabelle) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind Guani- dine bevorzugt, wenn R1 oder R2 ein Cyanid ist (Beispiel Verbindung 25) .
Figure imgf000027_0002
25
Bevorzugt ist weiterhin ein Schwefel-Amidin, welches in vitro und in vivo unterschiedliche Stabilitäten aufweisen kann (Leitstruktur gemäß Verbindung 11) . Bei einer oralen Applikation weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Wasserlöslichkeit von 1 mg/ml auf, bevorzugt bei einem pH-Wert von 2 bis 7. Bei einer Injektion mit einer Tages- dosis von 200 bis 400 mg ist die Wasserlöslichkeit noch höher, um zu vermeiden, 400 ml Lösung mit einer Spritze zu injizieren.
Bevorzugt ist daher auch eine Verbindung, bei der das Naphtalin durch Chinolin oder Isochinolin ersetzt wird, welches man beispielsweise als HCl-SaIz verabreichen kann, insbesondere um die Wasserlöslichkeit zu erhöhen.
Figure imgf000028_0001
Chinolin Isochinolin
Bevorzugt ist demgemäß ein Entkoppler mit der allgemeinen Formel III, d. h. gemäß der Struktur 1' und der mit ihm im Gleichgewicht stehenden Formel 2'
Figure imgf000028_0002
Wenn 2' , 2" um die Einfachbindung S-C gedreht und mit 1' verglichen wird, so kommen die Doppelbindung un der Wasserstoff zur Deckung, während R2 auf R3 (und umgekehrt) kommt. Weitere bevorzugte Entkoppler weisen eine allgemeine Struktur gemäß Fig. 19 und/oder Fig. 20 auf. Die bevorzugten Entkoppler weisen zahlreiche überraschende Vorteile gegenüber den im Stand der Technik bekannten peptidi- sehen Inhibitoren bzw. Entkopplern auf. Zunächst stellen die nicht-peptidischen Entkoppler gemäß der Erfindung ei¬ ne Abkehr vom technisch Üblichen dar, die einer neuen Aufgabenstellung folgt. Mit den erfindungsgemäßen Strukturen wird ein seit langem ungelöstes, dringendes Bedürf- nis gelöst, um welches sich die Fachwelt bisher vergeblich bemüht hatte. Die Einfachheit der Lösung spricht insbesondere für eine erfinderische Tätigkeit, da sie die komplizierteren Lehren des Standes der Technik ersetzt. Die Entwicklung der wissenschaftlichen Technik bezüglich der Behandlung der oben bzw. unten genannten Krankheiten gingen in eine andere Richtung, so dass die erfindungsgemäße Lehre eine entwicklungsstraffende Leistung darstellt, die Fehlvorstellungen der Fachwelt über die Lösung des entsprechenden Problems beseitigt. Der techni- sehe Fortschritt, der durch die erfindungsgemäße Lehre realisiert wird, zeigt sich insbesondere über eine Verbesserung, Leistungssteigerung, Verbilligung, Ersparnis an Zeit, Material, Arbeitsstufen, Kosten oder schwer beschaffbaren Rohstoffen, erhöhte Zuverlässigkeit, Beseiti- gung von Fehlern, Qualitätshebung, Wartungsfreiheit, größere Effektivität, höhere Ausbeute, Vermehrung der technischen Möglichkeiten, Bereitstellung eines weiteren Mittels, Eröffnung eines weiteren Weges zur Behandlung der Krankheiten, Eröffnung eines neuen Gebietes, erstmalige Lösung einer Aufgabe, Bereitstellung von Reservemitteln, Alternativen, die Möglichkeit der Rationalisierung, Automatisierung bzw. Miniaturisierung und die Bereicherung des Arzneimittelschatzes. Demgemäß stellt die erfindungsgemäße Lehre einen glücklichen Griff dar, bei dem aus der Vielzahl von Möglichkeiten eine bestimmte ausgewählt wurde, deren Ergebnis nicht vorausgesagt werden konnte. Es handelt sich bei der erfindungsgemäßen Lehre um ein sehr junges Gebiet der Technik, welche von der Fachwelt gelobt wird und zu wirtschaftlichem Erfolg bzw. zu Lizenzvergaben führt. Insbesondere die bevorzugten Moleküle gemäß der Erfindung können zur Behandlung von Krankheiten ein- gesetzt werden, die durch eine Störung bzw. durch einen Defekt der cAMP-abhängigen Signaltransduktion hervorgerufen werden. Diese Charakterisierung der Darstellung der Krankheiten gilt nicht dazu, die zu therapierenden Leiden funktionell zu definieren, sondern die Darstellung als Krankheiten, die mit einer Modifikation oder einem Defekt der kompartimentalisierten cAMP-abhängigen Signaltransduktion assoziiert sind, dient als Oberbegriff für eine klar definierte Gruppe von Krankheiten im Sinne der Erfindung. D. h., der Fachmann kann beurteilen, welche Krankheiten durch die Definition gemäß Oberbegriff er- fasst werden und damit unter ddie Ansprüche der erfindungsgemäßen Lehre des Anspruchs fallen. Durch die Nennung der einzelnen konkreten - unter den Oberbegriff fallenden - Krankheiten soll demgemäß auch keine schwer ü- berschaubare Anzahl von Therapiemöglichkeiten beansprucht werden, für die keine Versuche vorgelegt werden, sondern sie dienen lediglich der Klarstellung und der konkreten Definition der beanspruchten Krankheiten, die mit einer Störung der o. g. Signaltransduktion hervorgerufen wer- den. Mittels der erfindungsgemäßen Moleküle können die o. g. AKAP-Proteine in ihrer Wechselwirkung mit PKA- Molekülen beeinflusst werden. Insbesondere können die o. g. AKAP18-Proteine und ihre Wechselwirkung mit PKA- Molekülen modifiziert werden und insbesondere A- KAPl8delta-Proteine und ihre Wechselwirkung mit PKA- Molekülen, insbesondere mit Untereinheiten und besonders bevorzugt mit Rllalpha- und/oder RIIbeta-Molekülen. D. h., es kann beispielsweise die Wechselwirkung von AKAP79, Gravin, AKAP 82 oder anderen oben genannten AKAPs, insbesondere aber von AKAP18 wie AKAP18alpha, -beta, -gamma, - delta, besonders bevorzugt aber von AKAP18delta in ihrer Wechselwirkung mit PKA moduliert, insbesondere inhibiert werden. Bevorzugt ist, dass die Entkoppler im wesentlichen 100% hemmen, bevorzugt ist es auch 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 20% und insbesondere 10% zu hemmen. Jede dieser prozentualen Hem- mungen kann bevorzugt sein.
Die erfindungsgemäßen Entkoppler werden zum einen als neue Moleküle beansprucht; zum anderen werden bevorzugte Moleküle als Verbindungen beansprucht, für die erstmals eine Verwendung in der Medizin offenbart wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die neuen Moleküle, insbesondere die neuen Moleküle auf dem Gebiet der Medizin, zur Behandlung von Krankheiten beansprucht, die gemäß der Definition der Erfindung unter den Begriff der mit den Defekten der kom- partimentalisierten cAMP-abhängigen Signaltransduktion assoziierten Krankheiten fallen.
Dies sind in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe umfassend Diabetes insipidus, Diabetes mellitus, Adipositas, ödeme, chro- nisch obstruktive Lungenerkrankungen, AIDS, Schizophrenie, Leberzirrhose, Herzinsuffizienz, koronare Herzkrankheiten, Hypertonie, Ulcus duodeni und/oder Asthma.
Die Verbindungen gemäß Tabelle B, bevorzugt von Tabelle C oder D, sind neue Moleküle, die im Stand der Technik noch nicht beschrieben wurden. Für die weiteren offenbarten Verbindungen (bevorzugt gemäß Tabelle A) ist noch nicht offenbart worden, dass sie im Bereich der Therapie- oder Diagnoseverfahren eingesetzt werden können. Diese Verbindungen können jedoch auch dann als völlig neue Verbindungen aufgefasst werden, wenn ihre Neuheit dadurch gegeben ist, dass sie zwar in einem Archiv bzw. in einer Bibliothek aufgenommen waren, aber die Öffentlichkeit mangels Katalogisierung nicht von ihrer Existenz erfuhr (insbesondere Tabelle A und B) .
Die Erfindung betrifft auch Erkennungsmoleküle, die gegen die erfindungsgemäßen, nicht-peptidischen Moleküle ge- richtet sind. Aufgrund der Offenbarung der erfindungsgemäßen nicht-peptidischen Moleküle kann der Durchschnittsfachmann ohne unzumutbaren Aufwand mittels von Routine- Versuchen Erkennungsmoleküle gegen die erfindungsgemäßen nicht-peptidischen Moleküle bereitstellen, so dass die Erkennungsmoleküle deutlich und vollständig offenbart sind. Bei den Erkennungsmolekülen handelt es sich erfindungsgemäß entweder um Antikörper, um Komplexbildner oder um Chelatoren bzw. Peptide, die so mit den nicht- peptidischen Entkopplern interagieren, dass diese in ih- rer biologischen Aktivität, der Modulation der AKAP-PKA- Wechselwirkung, beeinträchtigt sind. Mittels der Erkennungsmoleküle ist es ebenfalls möglich, die Entkoppler in einem in vitro oder in vivo System zu detektieren. Hierzu kann es vorteilhaft sein, wenn die Erkennungsmoleküle mit einer detektierbaren Sonde versehen sind. Dem Fachmann sind derartige Sonden bekannt.
Gegenstand der Erfindung sind auch Zellen, Zellansammlungen, Gewebekulturen oder Gewebestücke, aber auch Organis¬ men, wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Rinder, Pferde, Esel, Schafe, Kamele, Ziegen, Schweine, Kaninchen, Meer- schweinchen, Hamster, Katzen, Affen, Hunde oder Menschen, die die erfindungsgemäßen Entkoppler und/oder die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle umfassen. Mittels dieser Zellen, Gewebekulturen oder Organismen können verschiedene Krankheiten untersucht werden, wobei sich die Untersu- chung der Krankheiten beispielsweise auf ihre Ursachen bzw. auf mögliche Diagnose- und Behandlungsmethoden bezieht. Bevorzugte Krankheiten sind Asthma, Hypertonie, Hypertrophie des Herzens, koronare Herzkrankheiten, Ulcus duodeni, Herzinsuffizienz, Leberzirrhose, Schizophrenie, AIDS, Diabetes mellitus, Diabetes insipidus, Adipositas, chronische obstruktive Lungenerkrankungen, Lernschwierigkeiten, Ödeme (pathologische Wassereinlagerungen) , Infektionskrankheiten und/oder Krebs. Selbstverständlich kann es auch bevorzugt sein, einen Organismus zum Studium die- ser Krankheiten heranzuziehen, der nicht die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, sondern die erfindungsgemäßen Entkoppler bzw. beide Strukturen gleichzeitig aufweist. Aufgrund der Offenbarung der erfindungsgemäßen Lehre weiß der Fachmann, welche Entkoppler bzw. welche Erkennungsmo- leküle er in welcher Konzentration einsetzen muss, da sich diese unmittelbar und eindeutig durch Routine- Versuche aus der offenbarten erfindungsgemäßen techni- sehen Lehre sowie aus dem Stand der Technik, wie er beispielsweise in Nachschlagewerken dargelegt ist, ergibt. Die Organismen können verwendet werden, um Pharmaka zu entwickeln, die die PKA-AKAP-Interaktion modifizieren, bevorzugt entkoppeln. Hierbei können die erfindungsgemäßen Entkoppler selbstverständlich selbst als Testmoleküle für Pharmaka eingesetzt werden, aber auch als Leitstrukturen, aus denen die Pharmaka entwickelt werden. Mittels der Organismen können auch in vivo Stoffwechselprozesse untersucht werden, bei denen die AKAP-PKA-Interaktion eine Rolle spielt oder bei denen geklärt werden soll, ob für ein bestimmtes Ereignis, wie beispielsweise eine bestimmte pathogene Veränderung wie z. B. die Entartung von Zellen, die AKAP-PKA-Interaktion involviert ist. Bei den eingesetzten erfindungsgemäßen Entkopplern oder Erkennungsmolekülen kann es sich auch um abgewandelte Entkoppler oder Erkennungsmoleküle handeln, die durch kombinatorische Methoden aus den Verbindungen gemäß der Erfindung gewonnen wurden. Die so gewonnen Strukturen, bei denen die erfindungsgemäßen Moleküle als Leitstruktur dienen, sind im wesentlichen funktionsanalog zu den genannten erfindungsgemäßen Entkopplern und Erkennungsmolekülen. Funktionsanalog zu sein heißt, dass die homoigen gewonnenen Strukturen ebenfalls Rückschlüsse auf die Wechselwir- kung von AKAP und PKA bzw. deren Bedeutung für bestimmte Krankheiten zulässt. Funktionsanaloge Moleküle sind demgemäß im Sinne der Erfindung Moleküle, die der Fachmann als im wesentlichen gleichwirkend identifizieren kann. Gegenstand der Erfindung sind demgemäß auch abgewandelte Moleküle, die im wesentlichen dieselbe Funktion auf dem im wesentlichen selben Weg aufweisen und im wesentlichen dasselbe Ergebnis hervorrufen, wie die erfindungsgemäßen Entkoppler bzw. Erkennungsmoleküle oder aber solche äquivalenten Verbindungen, bei denen es für den Durchschnittsfachmann offensichtlich ist, dass mit ihnen das gleiche erreicht werden kann, was mit den in den Ansprü- chen offenbarten Molekülen erreicht wird. Diese funkti- onsanalogen Strukturen werden also gewonnen, indem die erfindungsgemäßen Entkoppler oder Erkennungsmoleküle als Leitstrukturen eingesetzt werden. Die Funktionsanalogen können durch strukturbasiertes, kombinatorisches oder ein anderes Wirkstoffdesign gewonnen werden. Der Begriff des Wirkstoffdesigns ist für den Fachmann klar definiert; er bezieht sich z. B. auf die Referenz Wirkstoffdesign. Der Weg zum Arzneimittel, oder das Lehrbuch der klinischen Pharmazie oder auch Standardwerke.
Die Erfindung betrifft demgemäß auch ein pharmazeutisches Mittel, welches einen erfindungsgemäßen Entkoppler bzw. ein gegen diesen gerichtetes Erkennungsmolekül in Form eines Chelators, Komplexbildners oder Antikörpers um- fasst, ggf. zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Hilfsstoffen. Die Hilfsstoffe können beispielsweise Adjuvantien, Vehikel oder andere sein. Bei den Trägern kann es sich beispielsweise um Füllmittel, Streckmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Sprengmit- tel, Lösungsverzögerer, Resorptionsbeschleuniger, Netzmittel, Adsorptionsmittel und/oder Gleitmittel handeln. In diesem Falle, d. h. wenn Träger, Adjuvantien und/oder Vehikel - wie z. B. Liposomen - zusammen mit den erfindungsgemäßen Entkopplern oder deren Erkennungsmolekülen vorliegen, werden diese als Arzneimittel oder als pharmazeutisches Mittel bezeichnet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße Mittel als Gel, Puder, Pulver, Tablette, Retard-Tablette, Premix, Emulsion, Auf- gussformul-ierung, Tropfen, Konzentrat, Granulat, Sirup, Pellet, BoIi, Kapsel, Aerosol, Spray und/oder Inhalat zubereitet und/oder in dieser Form angewendet. Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit den üblichen, gegebenenfalls Opakisierungsmitteln enthaltenden, Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt sein, dass sie den oder die Wirkstoffe nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Intesti- naltraktes gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen zum Beispiel Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können.
Die Arzneimittel dieser Erfindung können beispielsweise zur oralen Verabreichung in einer beliebigen oral verträglichen Dosierungsform verwendet werden, die Kapseln, Tabletten und wässrige Suspensionen und Lösungen ein- schließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung schließen Träger, die häufig verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesium-stearat, können typischerweise zugesetzt werden. Zur oralen Verabreichung in Kapselform werden verwendbare Verdünnungsmittel wie Lactose und getrocknete Maisstärke eingesetzt. Wenn wässrige Suspensionen oral verabreicht werden, wird der Wirkstoff mit Emul- gier- und Suspendiermitteln kombiniert. Falls gewünscht, können bestimmte Süßmittel und/oder Geschmacksstoffe und/oder Farbmittel zugesetzt werden. Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.
Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel Polyethylenglycole, Fette, zum Beispiel Kakaofett und höhere Ester (zum Beispiel Ci4-Alkohol mit Ci6-Fettsäure)' oder Gemische dieser Stof- fe.
Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid o- der Gemische dieser Stoffe.
Puder und Sprays können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calcium- silikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel, zum Beispiel Chlor-fluorkohlenwasserstoffe, enthalten.
Lösungen und Emulsionen können neben den Wirkstoffen, das heißt der erfindungsgemäßen Verbindungen, die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und E- mul-gatoren, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Isopropy- lalko-hol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylben-zoat, Propylenglykol, 1, 3-Butylenglykol, Di- methylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erd- nussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl, GIy- cerin, Glycerinformal, Tetrahydofurfurylalkohol, Polye- thylenglycole und Fettsäure-ester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Zur parenteralen Applika- tion können die Lösungen und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen.
Suspensionen können ' neben den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendiermittel, zum Beispiel ethoxilierte Isostearylalkohole, Polyoxye- thylen-sorbit- und Sorbitan-Ester, mikrokristalline CeI- lulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.
Die Arzneimittel können in Form einer lyophilisierten sterilen injizierbaren Zubereitung, zum Beispiel als sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspension, vorliegen. Diese Suspension kann auch mit im Fachgebiet bekann- ten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- o- der Netzmittel (wie zum Beispiel Tween 80) und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem ungiftigen parenteral verträgli- chen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, zum Beispiel eine Lösung in 1, 3-Butandiol, sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Mannit, Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden üblicherweise sterile, nichtflüchtige Öle als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann ein beliebiges mildes nichtflüchtiges Öl einschließlich synthetischer Mono- o- der Diglyceride verwendet werden. Fettsäuren, wie Ölsäure und ihre Glyceridderivate sind bei der Herstellung von Injektionsmitteln verwendbar, wie es natürliche pharmazeutisch verträgliche Öle, wie Olivenöl oder Rizinusöl, insbesondere in ihren polyoxyethylierten Formen sind. Diese Öllösungen oder Suspensionen können auch einen langkettigen Alkohol oder einen ähnlichen Alkohol als Verdünnungs- oder Dispergiermittel enthalten.
Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacks- verbes-serte Zusätze, zum Beispiel Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süßmittel, zum Beispiel Saccharin, enthalten. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sollen in den aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 99,9, vorzugsweise von etwa 0,05 bis 99 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den Verbindungen weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten, aber neben weiteren pharmazeutischen Wirkstoffen auch Salze, Puffer, Vitamine, Zuckerderivate, insbesondere Saccaride, Enzyme, Pflanzenextrakte und andere. Die Puffer und Zuckerderivate reduzieren mit Vorteil den Schmerz bei subkutaner Applikation und Enzyme wie beispielsweise Hyaluronidase erhöhen die Wirksamkeit. Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach bekannten Metho- den, zum Beispiel durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen. Die genannten Zubereitungen können bei Mensch und Tier entweder oral, rektal, parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan) , intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, lokal (Puder, Salbe, Tropfen) und zur Thera- pie der unten genannten Krankheiten angewendet werden. Als geeignete Zubereitung kommen Injektionslösungen, Lösungen und Suspensionen für die orale Therapie, Gele, Aufgussformulierungen, Emulsionen, Salben oder Tropfen in Frage. Zur lokalen Therapie können ophtalmologische und dermatologische Formulierungen, Silber- und andere Salze, Ohrentropfen, Augensalben, Puder oder Lösungen verwendet werden. Bei Tieren kann die Aufnahme auch über das Futter oder Trinkwasser in geeigneten Formulierungen erfolgen. Ferner können die Arzneimittel in andere Trägermateria- lien wie zum Beispiel Kunststoffe - Kunststoffketten zur lokalen Therapie -, Kollagen oder Knochenzement eingearbeitet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin- düng sind die Verbindungen in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5, bevorzugt von 0,5 bis 95, besonders bevorzugt von 20 bis 80 Gew.-% in einer pharmazeutischen Zubereitung eingebracht. Das heißt, die Verbindungen sind in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen, zum Beispiel Tabletten, Pillen, Granulaten und anderen, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden. Die Wirkstoffmenge, das heißt die Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen, die mit den Trägermaterialien kombiniert wird, um eine einzi- ge Dosierungsform zu erzeugen, wird von dem Fachmann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten und der besonderen Verabreichungsart variieren können. Nach Bes- serung des Zustandes des Patienten kann der Anteil der wirksamen Verbindung in der Zubereitung so geändert werden, dass eine Erhaltungsdosis vorliegt, die die Krankheit zum Stillstand bringt. Anschließend kann die Dosis oder Frequenz der Verabreichung oder beides als Funktion der Symptome auf eine Höhe verringert werden, bei der der verbesserte Zustand beibehalten wird. Wenn die Symptome auf das gewünschte Niveau gelindert worden sind, sollte die Behandlung aufhören. Patienten können jedoch eine Be- handlung mit Unterbrechung auf Langzeitbasis nach beliebigem Wiederauftreten von Erkrankungssymptomen benötigen. Demgemäß ist der Anteil der Verbindungen, das heißt ihre Konzentration, in der Gesamtmischung der pharmazeutischen Zubereitung ebenso wie ihre Zusammensetzung oder Kombina- tion variabel und kann vom Fachmann aufgrund seines Fachwissens modifiziert und angepasst werden.
Dem Fachmann ist bekannt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem Organismus, bevorzugt einem Menschen oder einem Tier, auf verschiedenen Wegen in Kontakt gebracht werden können. Weiterhin ist dem Fachmann bekannt, dass insbesondere die pharmazeutischen Mittel in verschiedenen Dosierungen appliziert werden können. Die Applikation sollte hierbei so erfolgen, dass die Erkrankung möglichst effektiv bekämpft wird bzw. der Ausbruch einer Krankheit in einer prophylaktischen Gabe verhindert wird. Die Konzentration und die Art der Applikation können vom Fachmann durch Routineversuche eruiert werden. Bevorzugte Applikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die orale Applikation in Form von Pulver, Tabletten, Saft, Tropfen, Kapseln oder ähnlichem, die rektale Applikation in Form von Zäpfchen, Lösungen und ähnlichem, parenteral in Form von Injektionen, Infusionen und Lösungen sowie lokal in Form von Salben, Pflastern, Umschlägen, Spülungen und ähnlichem. Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt- Bringen der erfindungsgemäßen Verbindungen prophylaktisch oder therapeutisch.
Die Eignung der gewählten Applikationsformen wie auch der Dosis, des Applikationsschemas, der Adjuvantswahl und dergleichen kann beispielsweise durch Entnahme von Serum- Alliquoten aus dem Patienten, das heißt dem Mensch oder dem Tier, und dem Testen auf das Vorhandensein von Krankheitsindikatoren im Verlauf des Behandlungsprotokolls bestimmt werden. Alternativ und begleitend hierzu kann der Zustand der Nieren, der Leber o. a., aber auch die Menge von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems oder anderer Marker, die einen Krankheits- oder Genesungsverlauf charakterisieren oder dokumentieren, auf herkömmliche Weise begleitend bestimmt werden, um einen Gesamtüberblick über die immunologische Konstitution des Pati- enten und insbesondere die Konstitution von stoffwechselwichtigen Organen, zu erhalten. Zusätzlich kann der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung hin beobachtet werden. Wenn eine unzureichende therapeutische Effektivität erzielt wird, kann der Patient mit erfindungsgemäßen Mitteln ggf. mit anderen bekannten Medikamenten modifiziert weiterbehandelt werden, von denen eine Verbesserung der Gesamtkonstitution erwartet werden kann. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Träger oder Vehikeln des pharmazeutischen Mittels zu modifizie- ren oder den Verabreichungsweg zu variieren. Neben der oralen Aufnahme kann es dann zum Beispiel vorgesehen sein, dass Injektionen beispielsweise intramuskulär oder subkutan oder in die Blutgefäße ein weiterer bevorzugter Weg für die therapeutische Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen sind. Zeitgleich kann auch die Zufuhr über Katheter oder chirurgische Schläuche angewendet werden; beispielsweise über Katheter, die direkt zu bestimmten Organen wie den Nieren, der Leber, der Milz, dem Darm, der Lunge etc. führen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer bevorzugten Ausführungsform in einer Gesamtmenge von bevorzugt 0,05 bis 500mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden eingesetzt werden, bevorzugt von 5 bis 100mg/kg Körpergewicht. Hier- bei handelt es sich vorteilhafterweise um eine therapeutische Menge, die verwendet wird, um die Symptome einer Störung oder responsiven, pathologisch physiologischen Kondition zu verhindern oder zu verbessern.
Selbstverständlich wird die Dosis vom Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, dem Grad der Krankheit, der Art einer notwendigen gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wirkungen und der Nebenwirkungen abhängen. Die tägliche Dosis von 0,005 bis 500mg/kg, bevorzugt von 0,05 bis 500mg/kg Körpergewicht kann einmalig oder mehrfach angewendet werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Typischerweise werden insbesondere pharmazeutischen Mittel zur etwa 1- bis 10-maligen Verabreichung pro Tag oder alternativ oder zusätzlich als kontinuierliche Infusion verwendet. Solche Verabreichungen können als chronische oder akute Therapie angewendet werden. Die Wirkstoffmengen, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, können in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt und der besonderen Verabreichungsart selbstverständlich variie- ren. Bevorzugt ist es, die Tagesdosis auf 2 bis 5 Applikationen zu verteilen, wobei bei jeder Applikation zum Beispiel 1 bis 2 Tabletten mit einem Wirkstoffgehalt von 0,05 bis 500mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Selbstverständlich ist es möglich, den Wirkstoffgehalt auch höher zu wählen, beispielsweise bis zu einer Konzentration bis 5000mg/kg. Die Tabletten können auch retardiert sein, wodurch sich die Anzahl der Applikationen pro Tag auf 1 bis 3 vermindert. Der Wirkstoffgehalt der retardierten Tabletten kann 3 bis 3000mg betragen. Wenn der Wirkstoff - wie ausgeführt - durch eine Injektion verabreicht wird, ist es bevorzugt, 1- bis 10-mal pro Tag beziehungsweise durch Dauerinfusion den Wirt mit den erfindungsgemäßen Verbindungen in Kontakt zu bringen, wobei Mengen von 1 bis 4000mg pro Tag bevorzugt sind. Die be- vorzugten Gesamtmengen pro Tag haben sich in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen. Es kann erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Wirts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. dem Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen bevorzugt sein, den Organismus mit weniger als den genannten Mengen in Kon- takt zu bringen, während in anderen Fällen die angegebene Wirkstoffmenge überschritten werden muss. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierungen und der Applikationsart der Wirkstoffe kann durch den Fachmann aufgrund seines Fachwissens erfolgen.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das pharmazeutische Mittel in einer Einzelgabe von 1 bis 100, insbesondere von 2 bis 50mg/kg Körpergewicht eingesetzt. Wie auch die Gesamtmenge pro Tag (siehe oben) kann auch die Menge der Einzelgabe pro Applikation von dem Fachmann aufgrund seines Fachwissens variiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können in den genannten Einzelkonzentrationen und Zubereitungen zusammen mit dem Futter bzw. mit Futterzubereitungen oder mit dem Trinkwasser auch in der Veterinärmedizin gegeben werden. Eine Einzeldosis enthält vor- zugsweise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird, und die gewöhnlich einer ganzen, einer halben Tagesdosis oder einem Drittel oder einem Viertel einer Tagesdosis entspricht. Die Dosierungseinheiten können demgemäß bevorzugt 1, 2, 3 oder 4 oder mehrere Ein- zeldosen oder 0,5, 0,3 oder 0,25 einer Einzeldosis enthalten. Bevorzugt wird die Tagesdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen auf 2 bis 10 Applikationen verteilt, bevorzugt auf 2 bis 7, besonders bevorzugt auf 3 bis 5 Applikationen. Selbstverständlich ist auch eine Dauerinfu- sion der erfindungsgemäßen Mittel möglich.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden bei jeder oralen Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen 1 bis 2 Tabletten gegeben. Die er- findungsgemäßen Tabletten können mit dem Fachmann bekannten Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt werden, dass sie den oder die Wirkstoffe nur bei bevorzugten, in einem bestimmten Teil des Wirts freigeben.
Bevorzugt ist es in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, dass die einzelnen Bestandteile der Verbindungen gegebenenfalls miteinander assoziiert oder mit einem Träger verbunden in Liposomen eingeschlossen sind, wobei der Einschluss in Liposomen im Sinne der Erfindung nicht zwingend bedeuten muss, dass die Verbindungen im Inneren der Liposomen vorliegen. Ein Einschluss im Sinne der Erfindung kann auch bedeuten, dass die Verbindungen mit der Membran der Liposomen assoziiert sind, beispielsweise so, dass diese auf der äußeren Membran verankert sind. Eine solche Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen in oder auf den Liposomen ist vorteilhaft, wenn der Fachmann die Liposomen so auswählt, dass sie eine immunstimulierende Wirkung haben. Dem Fachmann sind aus der DE 198 51 2 82 verschiedene Möglichkeiten bekannt, die immunstimulierende Wirkung von Liposomen zu modifizieren. Bei den Lipiden kann es sich um einfache Lipide handeln, wie beispielsweise Ester und Amide oder um komplexe Lipide wie zum Beispiel um Glycolipide wie Cerebroside oder Ganglio- side, um Sphingolipide oder um Phospholipide .
Bevorzugte Krankheiten, die mit dem erfindungsgemäßen Mittel behandelt werden können, sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend AIDS, Akne, Albuminurie (Proteinurie) , Alkoholentzugssyndrom, Allergien, Alopezie (Haarausfall) , ALS (Amyotrophe Lateralsklerose) , Alzheimer Erkrankung, AMD (Altersbedingte Makuladegeneration) , Anämie, Angststörungen, Anthrax (Milzbrand) , Aortensklerose, arterielle Verschluss-krankheit, Arterienverkalkung, Arterienver- Schluss, Arteriitis temporalis, Arteriosklerose, Arteriovenöse Fisteln, Arthritis, Arthrose, Asthma, Ateminsuffizienz, Autoimmunerkrankung, AV-Block, Azidose, Bandscheibenvorfall, Bauchfellentzündung, Bauchspeicheldrüsen- krebs, Becker Muskeldystrophie, Benigne Prostata Hyperplasie (BPH) , Blasenkarzinom, Bluterkrankheit (Hämophilie) , Bronchialkarzinom, Brustkrebs, BSE, Budd-Chiari- Syndrom, Bulimia nervosa, Bursitis (Schleimbeutelentzündung) , Byler-Syndrom, Bypass, Chlamydien-Infektion, Chro- nische Schmerzen, Cirrhose, Commotio cerebri (Gehirnerschütterung) , Creutzfeld-Jakob-Erkrankung, Darmkarzinom, Darmkrebs, Darmtuberkulose, Depression, Diabetes insipi- dus, Diabetes mellitus, Diabetes mellitus juvenilis, Diabetische Retinopathie, Duchenne-Muskeldystrophie, Duode- nalkarzinom, Dystrophia musculorum progressiva, Dystrophie, Ebola, Ekzem, Erektile Dysfunktion, Fettsucht, Fibrose, Gebärmutterhalskrebs, Gebärmutterkrebs, Gehirnblutung, Gehirnentzündung, Haarausfall, Halbseitenlähmung, Hämolytische Anämie, Hämophilie, Haustierallergie (Tier- haarallergie) , Hautkrebs, Herpes zoster, Herzinfarkt, Herzinsuffizienz, Herzklappenentzündung, Hirnmetastase, Hirnschlag, Hirntumor, Hodenkrebs, Ischämie, Kahler- Krankheit (Plasmozytom) , Kinderlähmung (Poliomyelitis) , Knochenschwund, Kontaktekzem, Lähmung, Leberzirrhose, Leukämie, Lungenfibrose, Lungenkrebs, Lungenödem, Lymphdrüsenkrebs (Morbus Hodgkin) , Lymphogranulomatose, Lymphom, Lyssa, Magenkarzinom, Mammakarzinom, Meningitis, Milzbrand, Mukoviszidose (zystrische Fibrose), Multiple Sklerose (MS) , Myokardinfarkt, Neurodermitis, Neurofibro- matose, Neuronale Tumoren, Nierenkrebs (Nierenzellkarzi- nom) , Osteoporose, Pankreaskarzinom, Pneumonie, Polyneuropathien, Potenzstörungen, Progressive Systemische SkIe- rose (PSS), Prostatakrebs, Quaddelauschlag (Urtikaria), Querschnitts-syndrom, traumatisches, Rektumkarzinom, Rippenfellentzündung, Schädel-Hirn-Trauma, Scheidenkrebs (Vaginalkarzinom) , Sinusitis, Speiseröhrenkrebs, Tremor, Tuberkulose, Tumorschmerz, Vaginalkarzinom, Verbrennung, Verbrühung, Vergiftungen, Virale Meningitis, Wechseljahre, Weichteil-sarkom, Weichteiltumor, Zerebrale Durchblutungsstörungen und/oder ZNS-Tumore.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel auch zur Behandlung von Krebserkrankungen verwendet werden, ausgewählt aus der Gruppe von Krebserkrankungen oder Tumorerkrankungen des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs, der Lunge, des Mediastinums, des Gastrointestinaltraktes, des Urogeni- tal-Systems, des gynäkologischen Systems, der Brust, des endokrinen Systems, der Haut, Knochen- und Weichteilsarkomen, Mesotheliomen, Melanomen, Neoplasmen des zentralen Nervensystems, Krebserkrankungen oder Tumorerkrankungen im Kindesalter, Lymphomen, Leukämien, paraneoplastischen Syndromen, Metastasen ohne bekannten Primärtumor (CUP- Syndrom) , peritonealen Karzinomastosen, Immunsuppression- bezogenen Malignitäten und/oder Tumor-Metastasen. Insbesondere kann es sich bei den Tumoren um folgende Krebsarten handeln: Adenokarzinom der Brust, der Prostata und des Dickdarms; alle Formen von Lungenkrebs, der von den Bronchien ausgeht; Knochenmarkkrebs; das Melanom; das Hepatom; das Neuroblastom; das Papillom; das Apudo;, das Choristom; das Branchiom; das maligne Karzinoid-Syndrom; die Karzinoid-Herzerkrankung; das Karzinom (zum Beispiel Walker-Karzinom, Basalzellen-Karzinom, basosquamöses Karzinom, Brown-Pearce-Karzinom, duktales Karzinom, Ehrlich- Tumor, in-situ-Karzinom, Krebs-2-Karzinom, Merkel-Zellen- Karzinom, Schleimkrebs, nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom, Haferzellen-Karzinom, papilläres Karzinom, szirrhöses Karzinom, bronchiolo-alveoläres Karzinom, Bronchial-Karzinom, Plattenepithelkarzinom und Transitio- nalzell-Karzinom) ; histiocytische Funktionsstörung; Leukämie (zum Beispiel in Zusammenhang mit B-Zellen- Leukämie, Gemischt-Zellen-Leukämie, Nullzellen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische T-Zellen-Leukämie, HTLV-II- assoziierte Leukämie, akut lymphozytische Leukämie, chro- nisch-lymphozythische Leukämie, Mastzeil-Leukämie und myeloische Leukämie) ; maligne Histiocytose, Hodgkin- Krankheit, non-Hodgkin-Lymphom, solitärer Plasmazelltumor; Reticuloendotheliose, Chondroblastom; Chondrom, Chondrosarkom; Fibrom; Fibrosarkom; Riesenzell-Tumore; Histiocytom; Lipom; Liposarkom; Leukosarkom; Mesotheliom; Myxom; Myxosarkom; Osteom; Osteosarkom; Ewing-Sarkom; Sy- noviom; Adenofribrom; Adenolymphom; Karzinosarkom; Chordom; Craniopharyngiom; Dysgerminom; Hamartom; Mesenchy- mom; Mesonephrom; Myosarkom; Ameloblastom; Cementom; O- dontom; Teratom; Thymom; Chorio-blastom; Adenokarzinom; Adenom; Cholangiom; Cholesteatom; Cylindrom; Cystadeno- carcinom; Cystadenom; Granulosa-zelltumor; Gy- nadroblastom; Hidradenom; Inselzelltumor; Leydig- Zelltumor; Papillom; Sertoli-Zell-Tumor; Thekazell-tumor; Leiomyom; Leiomyosarkom; Myoblastom; Myom; Myosarkom; Rhabdomyom; Rhabdomyosarkom; Ependynom; Ganglioneurom; Gliom; Medulloblastom; Meningiom; Neurilemmom; Neuroblastom; Neuroepitheliom; Neurofibrom; Neurom; Para- gangliom; nicht-chromaffines Paragangliom; Angiokeratom; angiolymphoide Hyperplasie mit Eosinophilie; sclerosie- rendes Angiom; Angiomatose; Glomangiom; Hemangioendothe- liom; Hemangiom; Hemangiopericytom, Hemangiosarkom; Lymphangiom, Lymphangio-myom, Lymphangiosarkom; Pinealom; Cystosarkom phyllodes; Hemangiosarkom; Lymphangiosarkom; Myxosarkom; Ovarialkarzinom; Sarkom (zum Beispiel Ewing- Sarkom, experi-mentell, Kaposi-Sarkom und Mastzell- Sarkom) ; Neoplasmen (zum Beispiel Knochen-Neoplasmen, Brust-Neoplasmen, Neoplasmen des Verdauungssystems, colo- rektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen, Pankreas- Neoplasmen, Hirnanhang-Neoplasmen, Hoden-Neoplasmen, Or- bita-Neoplasmen, Neoplasmen des Kopfes und Halses, des Zentralnervensystems, Neoplasmen des Hörorgans, des Beckens, des Atmungstrakts und des ürogenitaltrakts) ; Neu- ro-fibromatose und zervikale Plattenepitheldysplasie.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert wird, ausgewählt aus der Gruppe: Tumoren des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs umfassend Tumoren der inneren Nase, der Nasennebenhöhlen, des Nasopharynx, der Lippen, der Mundhöhle, des Oropharynx, des Larynx, des Hypopha- rynx, des Ohres, der Speicheldrüsen und Paragangliome, Tumoren der Lunge umfassend nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome, kleinzellige Bronchialkarzinome, Tumoren des Mediastinums, Tumoren des Gastrointestinaltraktes umfas- send Tumoren des Ösophagus, des Magens, des Pankreas, der Leber, der Gallenblase und der Gallenwege, des Dünndarms, Kolon- und Rektumkarzinome und Analkarzinome, Urogenitaltumoren umfassend Tumoren der Nieren, der Harnleiter, der Blase, der Prostata, der Harnröhre, des Penis und der Ho- den, gynäkologische Tumoren umfassend Tumoren des Zervix, der Vagina, der Vulva, Korpuskarzinom, maligne Trophoblastenerkrankung, Ovarialkarzinom, Tumoren des Eileiters (Tuba Faloppii) , Tumoren der Bauchhöhle, Mammakarzinome, Tumoren endokriner Organe umfassend Tumoren der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Nebennierenrinde, endokrine Pankreastumoren, Karzinoidtumoren und Karzinoidsyndrom, multiple endokrine Neoplasien, Knochen- und Weichteilsarkome, Mesotheliome, Hauttumoren, Melanome umfassend kutane und intraokulare Melanome, Tumoren des zentralen Nervensystems, Tumoren im Kindesalter umfassend Retinoblastom, Wilms Tumor, Neurofibromatose, Neu- roblastom, Ewing-Sarkom Tumorfamilie, Rhabdomyosarkom, Lymphome umfassend Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-ZeIl- Lymphome, primäre Lymphome des zentralen Nervensystems, Morbus Hodgkin, Leukämien umfassend akute Leukämien, chronische myeloische und lymphatische Leukämien, Plasma- zell-Neoplasmen, myelodysplastische Syndrome, paraneoplastische Syndrome, Metastasen ohne bekannten Primärtumor (CUP-Syndrom) , peritoneale Karzinomastose, Immunsup- pression-bezogene Malignität umfassend AIDS-bezogene Ma- lignitäten wie Kaposi-Sarkom, AIDS-assoziierte Lymphome, AIDS-assoziierte Lymphome des zentralen Nervensystems, AIDS-assoziierter Morbus Hodgkin und AIDS-assoziierter anogenitale Tumoren, Transplantations-bezogene Malignitä- ten, metastasierte Tumoren umfassend Gehirnmetastasen, Lungen-metastasen, Lebermetastasen, Knochenmetastasen, pleurale und perikardiale Metastasen und maligne Aszites.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert wird, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Krebserkrankungen oder Tumorerkrankungen der Mammakarzinome, der Gastrointestinaltumore, einschließlich Kolonkarzinome, Magenkarzinome, Pankreaskarziome, Dickdarm- krebs, Dünndarm-krebs, der Ovarialkarzinome, der Zervi- kalkarzinome, Lungen-krebs, Prostatakrebs, Nierenzellkar- zinome und/oder Lebermetastasen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Krankheit ausgewählt aus der Gruppe umfassend Krankheiten, die im Sinne der Erfindung als Infektionskrankheiten bezeichnet werden, die mit einer Modulation der kompartimentalisierten cAMP-abhängigen Signaltransduktion assoziiert sind, nämlich: Affenpocken, AIDS, Anthrax (Bacillus anthracis, Milzbrand) , Aviäre Influenza (Geflügelpest, Vogelgrippe) , Borreliose, Borrelia recurrentis (Läuserückfallfieber) , Botulismus (Clostridium botulinum) , Brucellose, Campylobacter-Infektionen, Chlamydiose, Cholera (Vibrio cholerae) , Creutzfeldt- Jakob-Krankheit, Coxiella burnetii (Q-Fieber) , Cryptospo- ridium parvuum (Kryptosporidiose) , Dengue-Fieber, Diphtherie, Ebolavirus-Infektionen, Echinokokkose (Fuchsbandwurm, Hundebandwurm) , EHEC-Infektionen (STEC-Infektionen, VTEC-Infektionen) , Enteroviren, Fleckfieber (Rickettsia prowazeckii) , Francisella tularensis (Tularämie) , Frühsommermeningoenzephalitis (FSME) , Gelbfieber, Giardiasis, Gonorrhoe, Grippe (Influenza) , Haemophilis influenzae, Hantavirus, Helicobacter pylori, Hepatitis A, Hepa- titis B, Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Herpes, HUS (hämolytisch urämisches Syndrom) , Keratoconjunctivitis epidemica, Keuchhusten (Pertussis) , Kinderlähmung (Poliomyelitis) , Kopflausbefall, Krätzemilbenbefall, Krim-Kongo-Fieber, Lassa-Fieber, lebensmittelbedingte Krankheiten, Legionellose, Leishmaniose, Lepra, Leptospi¬ rose, Listeriose, Lyme-Borreliose, Lymphogranuloma vene- reum, Malaria (Plasmodien-Infektionen) , Marburgvirus- Infektionen, Masern, Meliodose, Meningokokken- Erkrankungen, MRSA (Staphylokokken) , Mumps, Mykosen (Pilzinfektionen) , neu und vermehrt auftretende Infektionskrankheiten, Noroviren, Ornithose (Papageienkrank- heit) , Papillomaviren, Paratyphus, Pest (Yersinia pestis) , Pneumokokken-Infektionen (Streptococcus pneumoniae) , Pocken, reiseassoziierte Infektionskrankheiten, Rinderbandwurm-Infektion beim Menschen, Rotaviren, Röteln, RSV-Infektionen, Salmonellose, Scharlach, Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom (SARS) , sexuell übertragbare Infektionen, Shigellose, Syphilis, Tetanus, Tollwut, Toxoplasmose, Thrichinellose, Tuberkulose, Typhus, Varizellen (Windpocken) , Variante Creutzfeldt-Jakob- Krankheit, virale hämorrhagische Fieber, West-Nil-Fieber, Yersiniose und/oder Zecken-übertragene Erkrankungen. Es ist nicht zwingend, dass erfindungsgemäße Mittel die Enzyme dieser Erreger, insbesondere die Phosphatase hemmen. Die Mittel können auch membrandestabilisierend oder anders wirken. Im Sinne der Erfindung ist es bevorzugt we- sentlich, dass die Pathogenität der Erreger herabgesetzt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die zu behandelnde Krankheit im wesentlichen durch Bakterien ausgelöst bzw. durch Bakterien mitausgelöst; bei den Bakterien kann es sich um Legionellen, Streptokokken, Staphylokokken, Klebsiellen, Haemophilis influenzae, Rickettsien (Fleckfieber), Mykobakterien, Mykoplasmen, Ureaplasmen, Neisserien (Meningitis, Waterhou- se-Friedrichsen-Syndrom, Gonorrhoe) , Pseudomonaden, Bordetellen (Pertussis) , Corynobakterien (Diphtherie) , Chlamydien, Campylobacter (Durchfall) , Escherichia coli, Pro- teus, Salmonellen, Shigellen, Yersinien, Vibrionen, Ente- rokokken, Clostridien, Listerien, Borrelien, Treponema pallidum, Brucellen, Francisellen und/oder Leptospira handeln.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Entkoppler zur spezifischen Bindung an AKAP, bevorzugt AKAP18, besonders bevorzugt AKAP18delta und/oder eine spezifische Bindung an PKA, bevorzugt Untereinheiten dieser, ganz be- sonders bevorzugt an RII-Untereinheiten.
Die Erfindung betrifft auch die Inhibition der Interaktion von RIalpha-, Rllalpha-, RIbeta- und/oder Rllbeta- Untereinheiten der PKA mit AKAP, wobei Inhibition im Sin- ne der Erfindung jede Form der Modifizierung ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Entkoppler als Aquaretika, Kontrazeptiv, als antiinfektiöses Mittel, als anxiolytisches Mittel und/oder als Antitumormittel eingesetzt werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform sind die Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe umfassend Asthma jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Asthma aus der Gruppe atopisches Asthma, nichtatopisches Asthma, allergisches Asthma, IgE-venmitteltes atopisches Asthma, Bronchialasthma, essentielles Asthma, Primärasthma, durch pathophysiologische Störungen hervorgerufenes endogenes Asthma, durch Umweltfaktoren hervorgerufenes exogenes Asthma, essentielles Asthma unbekannter oder inapparenter Ursache, nichtatopisches Asthma, bronchitisches Asthma, emphysematöses Asthma, durch Belastung induziertes Asth- ma, Berufsasthma, durch Bakterien-, Pilz-, Protozoen- o- der Virusinfektion hervorgerufenes infektallergisches Asthma, nichtallergisches Asthma, inzipientes Asthma, "wheezy infant Syndrome"; chronische oder akute Bronchokonstriktion, chronische Bronchitis, Obstruktion der kleinen Atemwege sowie Emphysem; obstruktive oder entzündliche Atemwegserkrankung jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder eine obstruk- tive oder entzündliche Atemwegserkrankung aus der Gruppe Asthma; Staublunge, chronische eosinophile Pneumonie; chronischer obstruktive pulmonaler Krankheit (COPD) ; COPD inklusive chronische Bronchitis, Lungenemphysem oder damit assoziierte Atemnot, durch irreversible, fortschrei- tende Obstruktion der Atemwege gekennzeichnete COPD, Schocklunge (adult respiratory distress Syndrome, ARDS) sowie Verschärfung der Überempfindlichkeit der Atemwege aufgrund Therapie mit anderen Arzneistoffen; Staublunge jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, o- der Staublunge aus der Gruppe Aluminose oder Aluminiumstaublunge, Anthrakose (-Asthma) , Asbestose oder Asbeststaublunge, Chalikose oder Kalkstaublunge, durch Einatmen von Straußenfedernstaub verursachte Ptilose, durch Einatmung von Eisenteilchen verursachte Siderose, Siliko- se oder Steinstaublunge, Byssinose oder Baumwollstaubp- neumokoniose sowie Talk-pneumokoniose;
Bronchitis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, o- der Bronchitis aus der Gruppe akute Bronchitis, akute Ia- ryngotracheale Bronchitis, durch Erdnüsse ausgelöste Bronchitis, Bronchialkatarrh, kruppöse Bronchitis, Bronchitis ohne Auswurf, infektiöse Asthmabronchitis, Bron- chitis mit Auswurf, Staphylokokken- oder Streptokokkenbronchitis; sowie Vesikulärbronchitis;
Bronchiektasie jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Bronchiektasie aus der Gruppe zylindrische Bron- chiektasie, sackförmige Bronchiektasie, spindelförmige Bronchiektasie, Bronchiolendilatation, zystische Bronchiektasie, Bronchiektasie ohne Auswurf, sowie follikuläre Bronchiektasie; jahreszeitlich bedingte allergische Rhinitis, perenniale allergische Rhinitis, oder Sinusitis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Sinusitis aus der Gruppe eitriger oder nichteitriger Sinusitis, akute oder chronische Sinusitis, Ethmoiditis, Stirnhöhlenentzündung, Kieferhöhlenentzündung oder Sphenoiditis; rheumatoide Arthritis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder rheumatoide Arthritis aus der Gruppe akute Arthritis, akute Gichtarthritis, primär-chronische Polyarthritis, Osteoarthrose, Infektarthritis, Lyme- Arthritis, progrediente Arthritis, Arthritis psoriatica, sowie Spondylarthritis;
Gicht sowie mit Entzündung assoziiertes Fieber bzw. mit Entzündung assoziierter Schmerz; eine mit Eosinophilen in Zusammenhang stehende krankhafte Störung jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder eine mit Eosinophilen in Zusammenhang stehende krankhafte Störung aus der Gruppe Eosinophilie, eosinophiles Lungeninfiltrat, Löffler-Syndrom, chronische eosinophile Pneumonie, tropische Lungeneosinophilie, bronchopneumoni- sche Aspergillose, Aspergillom, eosinophiles Granulom, allergische granulomatöse Angütis bzw. Churg-Strauss- Syndrom, Polyarterütis nodosa (PAN) , sowie systemische Vasculitis necroticans; atopische Dermatitis, allergische Dermatitis, oder allergisches oder atopisches Ekzem;
Nesselsucht jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Nesselsucht aus der Gruppe immunbedingte Nessel- sucht, Komplementbedingte Nesselsucht, durch Nesselsucht auslösendes Material induzierte Nesselsucht, durch physikalische Reize ausgelöste Nesselsucht, durch Stress ausgelöste Nesselsucht, idiopatische Nesselsucht, akute Nesselsucht, chronische Nesselsucht, angioneurotisches Ödem, Urticaria cholinergica, Kälteurtikaria in ihrer autoso- mal-dominanten Form oder in ihrer erworbenen Form, Kon- takturtikaria, Urticaria gigantean sowie Papelurtikaria; Konjunktivitis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Konjunktivitis aus der Gruppe Conjunctivitis actini- ca, akute katarrhalische Konjunktivitis, akute 'contagiöse Konjunktivitis, allergische Konjunktivitis, atopische Konjunktivitis, chronische katarrhalische Konjunktivitis, eitrige Konjunktivitis sowie Frühjahrskonjunktivitis; Uveitis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese oder Uveitis aus der Gruppe Entzündung der ganzen Uvea oder eines Teils davon, Uveitis anterior, Iritis, Cyclitis, Iridocyclitis, granulomatöse Uveitis, nichtgranulomatöse Uveitis, phakoantigene Uveitis, Uveitis posterior, Cho- roiditis sowie Choriorethinitis; Schuppenflechte; multiple Sklerose jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder multiple Sklerose aus der Gruppe primär progrediente multiple Sklerose sowie multiple Sklerose mit schubweisem Verlauf und Neigung zu Remissionen; Autoimmun~/Entzündungserkrankungen jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder eine Autoimmun-/ Entzündungserkrankung aus der Gruppe autoimmunhämatologi- sehe Störungen, hämolytische Anämie, aplastische Anämie, aregenerative Anämie, idiopatische thrombozytopene Purpura, systemischer Lupus erythematosus, Polychondritis, Skleroderm, Wegener-Granulomatose, Lichtkrankheit, chro- nisch-aktive Hepatitis, Myasthenia gravis, Stevens- Johnson-Syndrom, idiopathische Sprue, Autoimmun- Reizkolonerkrankungen, Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, endokrine Opthamopathy, Basedow-Krankheit, Sarkoidose, Alveolitis, chronische Hypersensitivitätspneumonitis, primär biliäre Zirrhose, Insulinmangeldiabetes oder Typ 1 Diabetes mellitus, Uveitis anterior, granulomatöse Uveitis oder Uveitis posterior, Keratoconjunctivitis sicca, Keratoconjunctivitis epidemica, (diffuse) interstitielle Lungenfibrose, Lungenzirrhose, Mukoviszidose, Arthritis psoriatica, Glomerulonephritis mit und ohne Nephrose, a- kute Glomerulonephritis, idiopathische Nephrose, Minimal- Change-Nephropathie, entzündliche/hyperproliferative Hauterkrankungen, Schuppenflechte, atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis, allergische Kontaktdermatitis, famili- ärer gutartiger Pemphigus, Pemphigus erythematosus, Pemphigus foliaceus sowie Pemphigus vulgaris; Vorbeugung einer Fremdtransplantatabstoßung nach Organtransplantation, Reizdarm (inflammatory bowel disease, IBD) jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Reizdarm aus der Gruppe ulzerative Kolitis (UC) , kollagenöse Kolitis, Colitis po- lyposa, transmurale Kolitis sowie Morbus Crohn (CD) ; septischer Schock jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder septischer Schock aus der Gruppe Nierenversa- gen, akutes Nierenversagen, Kachexie, Malariakachexie, hypophysäre Kachexie, uremämische Kachexie, Herzkachexie, Cachexia suprarenalis bzw. Addison-Krankheit, karzinoma- töse Kachexie sowie Kachexie auf Grund von Infektion durch Human Immunodeficiency Virus (HIV) ; LeberSchädigung; pulmonaler Hochdruck sowie durch Sauerstoffmangel hervor- gerufener pulmonaler Hochdruck;
Knochenschwunderkrankungen, primäre Osteoporose und sekundäre Osteoporose; krankhafte Störungen des Zentralnervensystems jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder eine krankhafte Störung des Zentralnervensystems aus der Gruppe Depression, Morbus Parkinson, Lern- und Gedächtnisstörungen, tar- dive Dyskinesie, Drogenabhängigkeit, arteriosklerotische Demenz, sowie Demenz als Begleiterscheinung von Chorea Huntington, Morbus Wilson, Paralysis agitans sowie Thala- musatrophien;
Infektionen, insbesondere Virusinfektionen, wobei diese Viren die Produktion von TNF-α in ihrem Wirt erhöhen oder wobei diese Viren gegenüber Hinaufregulierung von TNF-α in ihrem Wirf, empfindlich sind, so dass ihre Replikation oder andere wichtigen Aktivitäten behindert werden, darunter Viren aus der Gruppe HIV-I, HIV-2 und HIV-3, Zyto- megalievirus, CMV; Grippe, Adenoviren und Herpesviren, darunter Herpes zoster und Herpes simplex; Hefe- und Pilzinfektionen, wobei diese Hefen und Pilze gegenüber Hinaufregulierung durch TNF-α empfindlich sind oder die TNF-α-Produktion in ihrem Wirt auslösen, bevorzugt Pilzmeningitis, insbesondere bei gemeinsamer Verabreichung mit anderen Arzneistoffen der Wahl zur Behandlung systemischer Hefe- und Pilzinfektionen, darunter den Polymycinen, bevorzugt Polymycin B, Imidazolen, bevorzugt Clotrimazol, Econazol, Miconazol und/oder Ketoconazol, den Triazolen, bevorzugt Fluconazol und/oder Itranazol, sowie den Amphotericinen, bevorzugt Amphotericin B und/oder liposomales Amphotericin B.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Modifikati- on, insbesondere einer Inhibition einer AKAP-PKA- Interaktion umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellung des erfindungsgemäßen Entkopplers oder eines Erkennungsmoleküls, welches gegen diesen ge- richtet ist und
(b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnisses gemäß (a) mit einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation an einer regulatorischen RII-Untereinheit der PKA erfolgt, wobei besonders bevorzugt die RII-Untereinheiten Rllalpha- und/oder Rllbeta-Untereinheiten sind.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der die erfindungsgemäßen Erzeugnisse - besonders bevorzugt die Ent- koppler und die dagegen gerichteten Erkennungsmoleküle - und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung, ggf. zusammen mit einer Information - z. B. einem Beipackzettel oder einer Internet-Adresse, die auf Homepages mit weiteren Informationen verweist etc. - über die Handhabung bzw. über die Kombination der Inhalte des Kits umfasst. Die Information zur Handhabung des Kits kann beispielsweise ein Therapie-Schema für die o. g. Krankheiten, insbesondere für die bevorzugten Krankheiten umfassen. Die Information kann jedoch auch Angaben darüber umfassen, wie die erfindungsgemäßen Erzeugnisse innerhalb einer Diagnose von Krankheiten, die mit AKAP-PKA- Interaktionen oder deren Entkopplung assoziiert sind, einzusetzen sind. Der erfindungsgemäße Kit kann auch in der Grundlagenforschung verwendet werden. Innerhalb der Grundlagenforschung ist der Kit bevorzugt einsetzbar, um zu detektieren, ob ein Stoffwechselphänomen mit der We- cheslwirkung bzw. mit der nicht vorhandenen Wechselwir- kung von AKAP und PKA assoziiert ist. Insbesondere ist es möglich, mithilfe des erfindungsgemäßen Kits zu bestimmen, welche Untereinheiten von AKAP und/oder PKA für die Interaktion dieser beiden Moleküle oder für das Nichtzu- standekommen der Interaktion zwischen diesen verantwort- lieh sind.
Die erfindungsgemäßen Erzeugnisse können in einer vorteilhaften Ausführungsform Peptide, Vektoren, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Kohlenhydrate bzw. Lipide umfassen. Es kann beispielsweise bevorzugt sein, dass die Erzeugnisse an einen Fettrest gekoppelt werden, so dass ihre Membranpermeabilität geändert wird. Durch den Vergleich mit Substanzen, die .die PKA mit anderer Affinität binden, werden weiterhin quantitative Aussagen möglich sein, die defi- nieren, bis zu welchem Grad eine PKA-AKAP-Interaktion notwendig ist, um den Ablauf eines physiologischen Prozesses zu gewährleisten. Insbesondere die erfindungsgemäßen Kits können verwendet werden, um diesen Ablauf des physiologischen Prozesses zu studieren. Von Vorteil ist es hierbei, dass die erfindungsgemäßen Moleküle so ausgewählt sein können, dass sie die RII-Untereinheiten der PKA stärker binden als die typischen PKA-Bindungsdomänen von AKAP, bevorzugt AKAP18, insbesondere von AKAP18delta. Da ausgewählte erfindungsgemäße Moleküle vorteilhafterweise Rllalpha- bzw. Rllbeta-spezifisch sind bzw. für bestimmte RI-üntereinheiten, können z. B. mit dem Kit be- sonders detaillierte Erkenntnisse über die Interaktion dieser Moleküle gewonnen werden. Die Entkopplung mit der einen oder anderen regulatorischen Untereinheit der PKA von AKAP-Proteinen kann insbesondere darüber Aufschluss geben, welche PKA, Typ Ilalpha oder Typ Ilbeta bzw. die vom Typ I, an dem jeweiligen untersuchten Prozess beteiligt sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln, welches folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Entkopplers, bevorzugt als eine Leitstruktur,
(b) chemische Modifikation der Leitstruktur, bevorzugt mittels eines kombinatorischen und/oder strukturbasierten Wirkstoffdesigns, wobei Substanzen gewonnen werden und gegebenenfalls
(c) Testung der Substanzen auf ihre Fähigkeit der Beeinflussung der AKAP-PKA-Wechselwirkung und gegebenenfalls
(d) Auswahl geeigneter Substanzen als pharmazeutische Mittel. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung um- fasst dieses Verfahren auch die Formulierung der getesteten Substanzen in einer pharmazeutisch akzeptablen Form.
Die Erfindung betrifft auch das unmittelbar mit diesem Verfahren gewonnene Verfahrensprodukt.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen nä- her erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren bzw. Entkopp- ler modulieren die Wechselwirkung von AKAP und PKA. Exemplarisch soll im Folgenden die Erfindung anhand weniger ausgewählter näher beschrieben werden.
1. Material und Methoden
Die verwendeten Reagenzien und Chemikalien stammen, falls nicht anders angegeben, von den Firmen Merck (Darmstadt) , Sigma (Deisenhofen) oder Carl Roth (Karlsruhe) .
1.1 Medien und Puffer
Luria-Bertani (LB) -Medium 10 g/l Trypton 10 g/l NaCl 5 g/l Hefeextrakt pH 7,0
Die Lösung wurde nach intensivem Rühren autoklaviert .
LB-Agar
Zu LB-Medium wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt und dann autoklaviert .
Für die Präparation von Agarplatten wurde der LB-Agar in einem Mikrowellenherd erhitzt, bis alle festen Partikel gelöst waren. Nach Abkühlen auf 40 0C wurde das benötigte Antibiotikum zugesetzt und die Lösung in Platten gegossen.
Ampicillin
Ampicillin ist ein Penicillinderivat und verhindert die Zellwandsynthese in proliferierenden Bakterien. Es wurde als Stammlösung (100 mg/ml) bei -20 0C gelagert und kurz vor Gebrauch auf eine Konzentration von 100 μg/ml in LB-Agar bzw. LB-Medium verdünnt.
2Ox Tris-Essigsäure-Ethylendiamintetraacetat (EDTA)- Puffer (TAE)
242 g Tris (hydroxymethyl) -aminomethan (Tris) in 0,5 1
H2O
40 ml 0,5 M EDTA pH 8 22,8 ml Essigsäure ad 1 1 H2O
Ethidiumbromid-Lösung
1 g Ethidiumbromid 100 ml H2O
βx Desoxyribonukleinsäure (DNA) -Probenpuffer 250 mg Bromphenolblau 250 mg Xylencyanol 33 ml 150 mM Tris-HCl pH 7,6 60 ml Glycerin 7 ml H2O Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) -Lösung 1,79 g IPTG 50 ml H2O
Phosphate-buffered saline (PBS) 28,5 g Na2HPO4 • 2 H2O 5,5 g NaH2PO4 • H2O 164 g NaCl ad 1 1 H2O
Proteaseinhibitoren-Mix
1,4 μg/μl Trasylol (Aprotinin) 0,5 mM Benzamidin 3,2 μg/μl Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI)
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) -Lösung (40 mM)
14 mg PMSF
2 ml Ethanol
Dithiothreitol (DTT) -Stammlösung (0,5 M)
771 mg DTT
10 ml H2O
Lysepuffer
PBS
Proteaseinhibitoren-Mix (1:125)
PMSF-Lösung (1:80)
DTT-Stammlösung (1:100)
Lysozym-Lösung
10 mg Lysozym 10 ml H2O
Glutathion-Elutionspuffer
40 mM reduziertes Glutathion 200 mM NaCl
0,2 % Tween 20
100 mM Tris-HCl pH 8,5
Natriumdodecylsulfat (SDS) -Probenpuffer 100 mM Tris-HCl pH 6,8
4 % SDS
20 % Glycerin 10 % beta-Mercaptoethanol 0,02 % Bromphenolblau 30 mM DTT
Trenngel (10 %) ; die angegebenen Mengen reichen für zwei Gele:
3,75 ml Acrylamid 30 % mit Bisacrylamid 0,8 % 5,625 ml Tris-HCl 0,75 M, pH 8,8
56,5 μl SDS 20 %
2,5 ml H2O
79 μl Ammoniumperoxodisulfat (APS) 10 %
5,65 μl N, N, N1 ,N ' -Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Sammelgel; die angegebenen Mengen reichen für zwei Gele:
835 μl Acrylamid 30 % mit Bisacrylamid 0,8 %
625 μl Tris-HCl 0,625 M, pH 6,8
25 μl SDS 20 % 3,5 ml H2O
25 μl APS 10 %
5 μl TEMED SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -Laufpuffer 250 mM Glycin 25 mM Tris 0,1 % SDS
Coomassie-Färbelösung
2 g Coomassie-Brillantblau G 250 75 ml Essigsäure 500 ml Methanol ad 1 1 H2O
Entfärbelösung
75 ml Essigsäure 100 ml Ethanol ad 1 1 H2O
Semi-dry-Transferpuffer
25 mM Tris 190 mM Glycin
20 % Methanol
Tris-buffered saline (TBS) 10 mM Tris-HCl pH 8,0 150 mM NaCl
TBS-Tween 20 (TBST) wie TBS, mit 0,01 % Tween 20
Ponceau S-Färbelösung
2 g Ponceau S 30 g Trichloressigsäure 30 g SuIfosalicylsäure 100 ml H2O
Blotto
50 g/l Magermilchpulver in TBST
Bradford-Reagenz 100 mg Coomassie-Brillantblau G 250
50 ml Ethanol, unvergällt
800 ml H2O
Lösung über Nacht stehen lassen, dann 100 ml Phosphorsäure dazugeben ad 1 1 H2O
Die Lösung wurde geschüttelt und filtriert,
Bindepuffer 80 μl Proteaseinhibitoren-Mix 125 μl PMSF-Lösung 20 μl DTT-Stammlösung 0,5 M ad 10 ml PBS
Blockierlösung
150 mg Magermilchpulver
100 μl 0,5 M DTT-Stammlösung
0,05 % Tween-20
625 μl PMSF-Lösung 400 μl Proteaseinhibitoren-Mix ad 50 ml PBS PBST
0,05 % Tween 20 in PBS
1.2 Transformation kompetenter Bakterien mit Plasmid-DNA
Für die Transformation wurden kompetente E. coli-Zellen des Stammes BL21 (DE3) nach der Methode von Cohen und Wang hergestellt.
Die bei -80 °C gelagerten Bakterien wurden auf Eis aufgetaut, und es wurden 2 ng der zu transformierenden Plasmid-DNA zu 50 μl Bakteriensuspension gegeben. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurden die Zellen zur Aufnahme der Plasmid-DNA für 45 s einem Hitzeschock von 42 °C ausgesetzt. Anschließend wurde sofort 250 μl auf 37 °C vorgewärmtes LB-Medium zugegeben und die Zellen für 1 h bei 37 0C geschüttelt, damit diese die von dem Plasmid kodierte Antibiotikum-Resistenz exprimieren konnten. Von der Zellsuspension wurden dann 30 μl abgenommen und auf antibiotikumhaltigem LB-Agar ausplattiert; der Rest wurde 1 min bei 8000 x g zentrifugiert , in 100 μl Medium resuspendiert und ebenfalls ausplattiert. Die Agarplatten wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Kolonien gezählt, um die Transformationseffizienz zu quantifizieren.
1.3 Plasmid-DNA-Präparation
Für die Expression von GST-Fusionsproteinen wurde das pGEX-4T3-Plasmid (Fig. 1) mit der hineinklonierten, pro- teinkodierenden Sequenz verwendet. Mithilfe eines solchen Vektors kann Fremd-DNA in Bakterienzellen eingebracht werden, und die Plasmid-DNA kann, z. B. zu Kontrollzwecken, auch wieder aus den Zellen isoliert werden. Um 5-10 μg Plasmid-DNA aus E. coli zu isolieren, wurden 2-3 ml LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum mit Einzelkolonien von Agarplatten inokuliert. Die Kulturen wurden bei 37 0C über Nacht unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden bei 13000 x g zentrifugiert, und der Überstand wurde möglichst vollständig verworfen.
Die Plasmidisolierung aus den Bakterien-Sedimenten wurde entsprechend dem Plasmid-Minipräparationsprotokoll des QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen GmbH, Hilden) durchgeführt. Die Zellen wurden dabei in alkalischem Lysepuffer Iy- siert, um Proteine und proteinassoziierte chromosomale DNA zu entfernen. Die lösliche Plasmid-DNA wurde in Gegenwart einer hochkonzentrierten Salzlösung an Silicagel (in einer Säule) gebunden, gewaschen, und schließlich mithilfe einer niedrig konzentrierten Salzlösung eluiert. Die isolierte Plasmid-DNA wurde mittels Restriktionsendo- nuklease-Verdau und nachfolgender Agarose-Gel- elektrophorese analysiert.
1.4 DNA-Restriktion
Restriktionsendonukleasen wie EcoRI (isoliert aus E. coli) schneiden DNA an spezifischen Stellen, die durch die Sequenz definiert sind. Die Enzyme erkennen diese Sequen- zen, binden und schneiden die DNA hydrolytisch. Mikroorganismen wie E. coli besitzen Restriktionsendonukleasen, um fremde DNA zu degradieren. Die Unterscheidung zwischen eigener und fremder DNA wird durch unterschiedliche Me- thylierungsmuster der DNA ermöglicht.
Die von verschiedenen Herstellern (New England BioLabs (NEB), Beverly, USA; Fermentas GmbH, St. Leon-Rot; In- vitrogen GmbH, Karlsruhe) bezogenen Endonukleasen wurden entsprechend den Angaben der Hersteller verwendet. DNA-Restriktionen (Behandlung mit Restriktionsendonuklea- sen) wurden normalerweise für 1 h bei 37 0C durchgeführt. Ein typischer Reaktionsansatz enthielt 5 μg DNA, 1 μl 10x Enzym-Puffer und 0,5 μl Enyzmlösung und wurde auf ein Endvolumen von 10 μl mit sterilem Wasser aufgefüllt. Nach der Inkubation wurde der gesamte Reaktionsansatz mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
1.5 Agarose-Gelelektrophorese
Bei einer Elektrophorese werden Moleküle nach ihrer Größe und elektrischen Ladung in einem Gel durch Anlegen einer elektrischen Spannung getrennt. Es wurden 1 %ige Agarosegele verwendet. Zur Herstellung wurde 1 % feste Agarose In TAE-Puffer gegeben und durch Aufkochen in einem Mikrowellenherd in Lösung gebracht. Die klare Lösung wurde auf 45 0C abgekühlt, und pro 100 ml Agaroselösung wurden 5 μl Ethidiumbromidlösung (EtBr) zugesetzt.
EtBr interkaliert in die Basen der Nukleinsäuren und ermöglicht deren Detektion unter UV-Licht. Die EtBr- Fluoreszenz wird durch die delokalisierten pi- Elektronensysteme der Purin- und Pyrimidinbasen der DNA, zwischen denen sich EtBr einlagert, verstärkt.
Das flüssige Gel wurde dann in eine Plastikform gegossen, in der es auskühlen und polymerisieren konnte. Die zu untersuchenden DNA-Proben wurden mit Probenpuffer, der TAE, Glycerin und Bromphenolblau enthielt, versetzt. Glycerin erhöhte die Dichte der Lösung, so dass sie leichter in die Geltaschen hineinlief und dort verblieb. Bromphenolblau ermöglichte die Visualisierung der Probe. Um die Größe der DNA-Fragmente in der Probe zu bestimmen, wurden 5 μl eines DNA-Molekulargewichtsstandards mit DNA- Fragmenten definierter Größe in einer Bahn pro Gel mitanalysiert (HyperLadder I, Bioline GmbH, Luckenwalde; Fig. 2) .
Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von 120 V für 30 min durchgeführt. Danach wurden die Gele mit dem Lu- milmager Fl von Boehringer Mannheim fotografiert und mit der zugehörigen Lumi Analyst 3.0-Software analysiert.
1.6 Expression und Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen
150 ml ampicillinhaltiges LB-Medium wurden mit E. coli- Zellen eines transformierten Klons von einer Agarplatte angeimpft. Die Kulturlösung wurde bei 30 0C über Nacht (ÜN) inkubiert. (Bei 37 0C vermehren sich die Zellen zu schnell, so dass am nächsten Tag die Kultur bereits die logarithmische Phase des Wachstums überschritten hat; außerdem führt die höhere Inkubationstemperatur zu stärke- rer Basal-Expression des Fusionsproteins. Dies kann durch Bildung von unlöslichen Einschlusskörpern (ϊnclusion bo- dies) die Aufreinigung erschweren.)
Am nächsten Tag wurden 20 ml der Übernachtkultur in 500 ml frisches, ampicillinhaltiges LB-Medium übertragen. Während der Inkubation bei 37 0C wurde die Vermehrung der Bakterien über Messungen der optischen Dichte (OD) bei 600 nm kontrolliert. Nach Erreichen einer OD60O von ca. 0,6 - dann befinden sich die Bakterien in der logarithmischen Wachstumsphase, in der die Proteinexpression maximal ist - wurde die Expression des Glutathion-S- Transferase (GST) -Fusionsproteins durch Zusatz von IPTG in einer Endkonzentration von 1,5 mM induziert. IPTG ist ein synthetischer Induktor des lac-Operons. Es bindet an den Repressor und inhibiert so dessen Bindung an die DNA. Nach Inkubation bei 37 0C für 30 min wurden die Bakterien durch Zentrifugation für 10 min bei 5000 x g und 4 0C se- dimentiert.
Ab hier wurden alle weiteren Aufreinigungsschritte auf Eis durchgeführt, um die Aktivität von Proteasen niedrig zu halten. Das Sediment wurde in 30 ml kaltem Lysepuffer resuspendiert und DTT in einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt. Die Zellsuspension wurde dreimal mit der French Pressure Cell Press („French Press") mechanisch lysiert. Während dieser Behandlung wurden die bakteriellen Zellwände durch den hohen Druck zerstört und so die nachfolgende Lyse der Plasmamembranen durch ein Detergens erleichtert.
Als Detergens wurde Triton X-100 in einer Endkonzentration von 1 % eingesetzt. Um die Plasmamembranen zu lösen und die zytosolischen Proteine in die Lösung freizusetzen, wurde die Suspension für 30 min bei 4 0C leicht ge- schüttelt.
Das so erhaltene Lysat wurde für 10 min bei 17000 x g und 4 °C zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen. Der Über¬ stand enthielt die GST-Fusionsproteine, und um diese auf- zureinigen, wurde er mit 600 μl Glutathion-Sepharose 4B (50 %-Suspension in Lysepuffer; Amersham GmbH & Co. KG, Braunschweig) für 30 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. In vivo spielt das Enzym GST eine wichtige Rolle in Entgiftungsreaktionen beispielsweise im Zytosol von Hepato- zyten. Es katalysiert die Reaktion von Glutathion mit verschiedenen elektrophilen, hydrophoben Substraten. In der Proteinaufreinigung bindet das mit dem gewünschten Protein fusionierte GST mit hoher Affinität und hoher Spezifität an Glutathion, welches an Sepharose-beads gekoppelt ist. Sepharose ist ein perlenförmiges, von Agaro- se abgeleitetes Grundmaterial, welches zu einem dreidi- mensionalen Netzwerk verknüpft ist. Aufgrund ihres großen Volumens können die beads und alles, was an sie gebunden hat, durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min sedimen- tiert werden. Alternativ können GST-Fusionsproteine auch mittels Affi- nitätschromatographie über eine mit Glutathion-Sepharose gefüllte Säule gereinigt werden. Diese Anwendung resultiert meist in größerer Reinheit, aber auch in geringerer Ausbeute der Proteine. Das Sepharose-Sediment mit den GST-Fusionsproteinen wurde dann dreimal gewaschen, indem es jeweils in 3 ml Lysepuf- fer resuspendiert und erneut zentrifugiert wurde. Um die aufgereinigten Proteine von der Glutathion- Sepharose zu eluieren, wurde das Pellet mit 300 μl Eluti- onspuffer versetzt und für 10 min bei Raumtemperatur ge- schüttelt. Der Elutionspuffer enthält freies Glutathion im Überschuss und verdrängt so kompetitiv die Glutathion- Sepharose vom GST-Fusionsprotein. Nach Abzentrifugieren bei 500 x g für 5 min wurde der das Fusionsprotein enthaltende Überstand vorsichtig abpipettiert, mit dem glei- chen Volumen Glycerin versetzt, aliquotiert und bei -20 0C gelagert. Glycerin verhindert die Bildung von Eiskristallen, die zur Degradation der Proteine führen (v.a. nach mehreren Einfrier- und Auftauzyklen) . Um den Aufreinigungsprozess kontrollieren zu können, wurden an verschiedenen Stellen der Prozedur Proben genommen und mittels SDS-PAGE (s. u. ) analysiert: vor und nach der Induktion der Proteinsynthese mit IPTG, vor und nach der Zentrifugation des Zelllysats, vor und nach dem Zusatz der Glutathion-Sepharose sowie nach dem Waschen des Sepharose-Sediments .
1.7 SDS-PAGE
Die Methode zur Analyse der Reinheit und des Molekulargewichtes von Proteinen ist die diskontinuierliche Natrium- dodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli.
Zur Detektion des Molekulargewichtes muss der Einfluss der Ladung und Tertiärstruktur auf die Migrationsgeschwindigkeit der Proteine im Gel eliminiert werden. Dann hängt die (logarithmische) Mobilität der Proteine allein von ihrem Molekulargewicht ab.
Diese Situation kann durch Denaturierung der nativen Proteine mit dem Detergens SDS nahezu erreicht werden. Es führt zur Dissoziation oligomerer Proteine in ihre Untereinheiten. Die negativen Ladungen der SuIfonsäuregruppen von SDS überlagern die Eigenladungen der einzelnen Aminosäureseitenketten und sorgen so für eine einheitlich negative Ladung der Proteine.
Disulfidbrücken werden durch DTT und beta-Mercaptoethanol reduziert und gespalten, welche sich neben SDS im Proben- puffer befinden. Die denaturierten Proteine binden SDS gemäß ihrer Größe, also der Länge der Aminosäurekette. Ebenso wie in der Agarose-Gelelektrophorese von Nuklein- säuren wird ein Molekulargewichtsstandard, bestehend aus Proteinen bekannten Molekulargewichts, mit auf das Gel geladen. Dazu wurde der BenchMark protein ladder- Molekulargewichtsstandard benutzt (Fig. 3; Invitrogen GmbH, Karlsruhe) .
Die SDS-PAGE wird als diskontinuierlich bezeichnet, weil das Gel aus zwei Teilen besteht, einem Sammel- und einem Trenngel. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Porengröße und ihres pH-Wertes. Ein solches diskontinuier- liches System liefert schärfere Banden als ein kontinuierliches und erlaubt daher eine präzisere Bestimmung der Proteingröße und des Molekulargewichts.
Sepharose-jbeads mit gebundenen Proteinen können direkt für die SDS-PAGE eingesetzt werden, weil der SDS- Probenpuffer eine hohe Reduktionskraft besitzt, die zur Elution der Proteine von den beads führt.
Das Trenngel wurde mit den in Abschnitt 2.1 genannten Reagenzien hergestellt. Nach dem Zupipettieren von TEMED begann die Polymerisierung, und 3,75 ml der Lösung wurden zwischen Glasplatten, die in eine spezielle Kunststoff- halterung eingespannt worden waren, pipettiert. Anschließend wurde das Gel mit 2-Propanol bedeckt, um Luftblasen zu eliminieren und um Luft vom Gel fernzuhalten (Sauerstoff verhindert die Polymerisierungsreaktion) . Nach vollständiger Polymerisierung wurde das 2-Propanol entfernt und das Sammelgel vorbereitet (s. Abschnitt 1.1). Nach dem Überschichten des Trenngels mit dem Sammelgel wurde der die Probentaschen formende Kamm in die Gellösung eingesetzt. Die Proteinproben wurden durch Kochen in Probenpuffer für 5 min bei 95 C denaturiert. Die Proben wurden kurz zentrifugiert und mithilfe einer Hamilton-Spritze in die Geltaschen transferiert.
Nach etwa 15 min Elektrophorese bei 90 V erreichten die Proteinproben das Trenngel, und die Spannung wurde für 1,5 h auf 120 V erhöht. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die aufgetrennten Proteine im Gel entweder mit Coomassie-Brillantblau G 250-Lösung gefärbt oder mittels Western Blot-Analyse (s. u.) weiter untersucht. Für die Coomassie-Färbung wurde das Gel für 30-60 min in Coomassie-Färbelösung und anschließend in Entfärbelösung geschüttelt, bis der überschüssige Farbstoff entfernt und der Kontrast zwischen ungefärbtem Gel und gefärbten Proteinen ausreichend stark war. Abschließend wurde mit dem Bio-Rad ChemiDoc EQ und der zugehörgien Software Quantity One ein Foto aufgenommen. 1.8 Western Blot
Bei einem Western Blot werden nach der Trennung durch SDS-PAGE die Proteine mithilfe elektrischer Spannung auf eine Nitrocellulose- oder Polyvinylidenfluorid (PVDF)- Membran transferiert und mit spezifischen Antikörpern (Ak) detektiert. Nach Bindung der Ak werden überschüssige Ak weggewaschen, und die Membran wird mit einem sekundären Ak inkubiert, welcher spezifisch den primären Ak er- kennt und markiert ist. Die Markierung kann aus radioaktiven Isotopen oder einem Enzym, das eine farbstoffbildende Reaktion katalysiert, bestehen.
Zunächst wurde eine Immobilon P-PVDF-Membran auf die Größe des Gels zurechtgeschnitten, für 15 s mit Ethanol und anschließend für mindestens 5 min mit Semidry- Transferpuffer befeuchtet. Whatman-Filterpapiere wurden ebenfalls auf die richtige Größe zugeschnitten und in Transferpuffer befeuchtet.
Der Proteintransfer vom Gel auf die Membran wurde mit einer BioRad TransBlot SD Semi Dry Transfer Cell durchgeführt, auf welche 2 Filter, die Membran, das Gel und wie- der 2 Filter geschichtet wurden. Luftblasen wurden entfernt, da sie den Proteintransfer behindern. Nach dem Pipettieren von 4 ml Transferpuffer auf den Stapel wurde die Transferzelle geschlossen, und die Proteine wurden bei 10 V für 1 h auf die Membran transferiert. Anschließend wurden die Proteine auf der Membran mit Pon- ceau S-Lösung angefärbt. Dazu wurde die Membran mit Wasser abgewaschen und für 20 min bei Raumtemperatur in Pon- ceau S-Lösung geschüttelt. Die Banden des Molekulargewichtsstandards wurden mit einem Bleistift nachgezeich- net, und die Membran wurde in Klarsichtfolie eingeschlagen, um mit dem Lumilmager Fl ein Foto aufzunehmen (7 s Belichtung unter Top-Illumination) .
Vor der Ak-Inkubation müssen die freien Bindungsstellen auf der Membran blockiert werden, da sich sonst große Mengen Ak unspezifisch dort anheften können, die die spezifischen Signale stören. Die Absättigung der Membran wurde mit Schütteln für 1 h in Blotto erreicht. Der primäre A18delta3-Ak war bereits in der Arbeitsgruppe vorhanden. Er war durch Immunisierung von Kaninchen gegen ein Peptid, dessen Sequenz identisch mit den Aminosäuren 60-76 der AKAPlδdelta-Sequenz war, erzeugt worden. Die so erhaltenen Antiseren waren affinitätschromatografisch ü- ber die für die Immunisierung verwendeten Peptide, gekoppelt an Thiopropyl-Sepharose 6B (Amersham GmbH & Co. KG, Braunschweig), aufgereinigt worden. Der A18delta3-Ak bindet sowohl AKAPlδdelta als auch -gamma. Die Ak-Lösung wurde 1:500 in Blotto verdünnt. Um die Men- ge benötigter Ak zu reduzieren, wurden die Membranen in Inkubationsbeuteln mit 3 ml luftblasenfreier Ak-Lösung für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 0C geschüttelt. Nach dreimaligem Waschen mit TBST für 5 min wurden die Membranen für 1 h in einer 1: 100O-Verdünnung der sekundären Ak (anti-Kaninchen-F (ab) 2-Fragmente) in Blotto geschüttelt. Der sekundäre Ak war an Meerrettich-Peroxidase (POD) gekoppelt (Dianova, Hamburg). Die Membranen wurden dreimal für 10 min mit TBST gewaschen, und zur Detektion wurden 4 ml der Lösungen 1 und 2 des LumiLight Western Blotting Substrats (Roche Di- agnostics GmbH, Mannheim) zur Membran gegeben und für 5 min bei Raumtemperatur geschüttelt. In der Detektionslö- sung befindet sich Luminol, welches von der Ak- gekoppelten POD unter Erzeugung von Licht (Chemilumines- zenz) oxidiert wird. Ein Foto der in Klarsichtfolie eingeschlagenen Membran wurde unter der Einstellung Chemilu- minescence (Belichtungszeit 1 min) am Lumilmager Fl auf- genommen.
1.9 Bradford-Protein-Konzentrationsbestimmung
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration in den GIu- tathion-Sepharose-Eluaten ist die Bradford-Methode am besten geeignet, da das hierbei verwendete Chromogen (Coomassie-Brillantblau G 250) nicht an das ebenfalls im Eluat befindliche überschüssige Glutathion bindet, son¬ dern v.a. an kationische und hydrophobe Aminosäureseiten- ketten.
Zur Messung wurden 50 μl der proteinhaltigen Probe (verdünntes Eluat) zu 50 μl 2 M NaOH gegeben und für 10 min bei 60 °C inkubiert. Dann wurde 1 ml Bradford-Reagenz zugesetzt, die Probe in eine Küvette transferiert und die Absorption bei 595 nm bestimmt.
Die Proteinkonzentration wurde durch Vergleich mit einer Eichreihe aus verschiedenen Ovalbumin-Verdünnungen ermittelt.
1.10 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Bei ELISA handelt es sich um eine Methode, bei der ein Antigen mit einem spezifischen Antikörper detektiert wird. Die Detektion erfolgt über ein kovalent mit einem der Bindungspartner verknüpftes Enzym, welches eine Chro- mogenumwandlung katalysiert. Dabei wird quantitativ bei- spielsweise ein Farbstoff oder Chemilumineszenz erzeugt
(wie schon für den Western Blot beschrieben) .
Da einer der beiden Bindungspartner immobilisiert ist, ist die Entfernung von nicht gebundenen Antikörpern bzw.
Antigenen sehr leicht. Die Detektion erfolgt durch Erfas- sung der Intensität (I) der Chemilumineszenz mithilfe eines PhotomultipHers in einem speziellen Lesegerät (ELI- SA-Reader) . Die Messwerte werden in relative light units (RLU) ausgegeben. Im vorliegenden Fall sollte untersucht werden, ob die Bindung eines Proteins (PKA) an ein anderes (AKAP18delta- GST) durch die Gegenwart von kleinen organischen Molekülen inhibiert wird. Daher wurde ein Sandwich-ELISA entwickelt, bei dem die PKA-Untereinheit Rllalpha, an welche AKAP-Proteine binden, an 384-well-Mikrotiterplatten (MTP) gebunden wurde.
Es wurden weiße MTP aus Polystyrol mit hoher Protein- Bindekapazität verwendet (384 Well White Fiat Bottom Po- lystyrene High Bind Microplate, Produkt-Nr . 3703, Corning GmbH, Wiesbaden) . Die weiße Färbung verbessert die Detek- tion der entstehenden Chemilumineszenz durch Reflexion und verhindert gleichzeitig das Überstrahlen von benach- barten wells. Nach der Bindung wurden freie Bindungsstellen blockiert (s. u.), und das zweite Protein GST- AKAPlδdelta wurde zusammen mit den potenziellen niedermolekularen Inhibitoren bzw. - als Kontrolle - inhibitorischen Peptiden (s. u.) zugegeben. Anschließend erfolgte die Quantifizierung des gebundenen GST-AKAP18delta über Antikörper und Chemilumineszenz. Das Prinzip des ELISA ist in Fig. 4 dargestellt.
Als Puffersystem wurde PBS (v. engl, phosphate-buffered saline, pH 7,4) benutzt, um für die verwendeten Proteine einen physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Dem Puffer wurde ein Mix aus Proteaseinhibitoren sowie PMSF als unspezifischer Proteaseinhibitor zugesetzt, um die Degradation der Proteine zu verzögern. Außerdem wurde DTT eingesetzt, um die Proteine vor Oxidation zu schützen. Der Blockierlösung enthielt zusätzlich 0,3 % Magermilchpulver, um mit den enthaltenen Milchproteinen die unspezifischen Bindungsstellen auf den MTP abzusättigen. Für die Etablierung des ELISA, die im Ergebnisteil detailliert beschrieben wird, wurden zusätzlich zu den ge- nannten und in Abschnitt 1.8 (Western Blot) beschriebenen noch weitere Antikörper für den Nachweis von PKA-RIIalpha benötigt: Der kommerziell erhältliche Maus-PKARnaipha~ Antikörper (BD Biosciences, San Jose, USA) und ein anti- Maus-POD-Ak (Dianova, Hamburg) .
1 . 11 Berechnung von Bindungskurven und ICso-Werten Die aus den Experimenten gewonnenen Daten wurden zum Teil mithilfe von GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, USA) ausgewertet.
Für die Anpassung von Bindungskurven an die Messwerte (s. Ergebnisse) wurde das Eine-Bindungsstelle-Modell [One si- te binding) zugrunde gelegt, welches auf die Bindung von GST-AKAP18delta an Rllalpha zutrifft. Die dazugehörige Formel lautete
Figure imgf000082_0002
Die Messwerte zur ICso-Berechnung wurden an das Eine- Bindungsstelle-Kompetition-Modell {One site competition) angepasst. Dabei wurde festgelegt, dass die untere Asymptote (Bottom) größer als 0,0 sein sollte, um fehlerhafte Anpassungen mit negativen Bindungswerten auszuschließen. Die verwendete Formel lautete
Figure imgf000082_0001
1.12 Screening- der Substanzbibliothek
Für das Screening - die systematische, zum Teil automatisierte Suche nach potentiellen Inhibitoren der AKAPlδdelta-RIIalpha-Bindung - wurde die FMP20000- Substanzbibliothek verwendet. Diese enthielt auf 57 MTP mit jeweils 384 wells 20064 verschiedene, kommerziell erhältliche Substanzen (ChemDiv, San Diego, USA) in 10 mM Stammlösungen in DMSO. Die Substanzen der Bibliothek waren nach bestimmten Kriterien ausgewählt worden, die auch auf bisher bekannte pharmakologische Wirkstoffe zutref- fen. Dazu gehören beispielsweise die Lipinski-Regeln (s. a. Diskussion) .
Zur Vorbereitung einer MTP für das Screening wurden in 380 wells jeweils 20 μl RIIalpha-Lösung der Konzentration 0,75 ng/μl (in Bindepuffer) mithilfe von elektronisch ge- steuerten 24-Kanalpipetten (Eppendorf) gefüllt. In die restlichen 4 wells wurden jeweils 10 μl AKAPl8delta-GST (8 ng/μl) pipettiert, um eine Positivkontrolle für die Detektion zu erhalten (s. a. MTP-Belegung in Tab. 1.1 und Pipettierschema in Tab. 1.2). Nach dem Zentrifugieren der MTP (1 min bei 2500 x g) wurden die MTP für mind. 1 h bei
Tab. 1.1: Belegung einer MTP mit Kontrollreaktionen (Spalten 1 und 24) und niedermolekularen Substanzen (2-23). Siehe auch Pipettierschema in Tab. 1.2.
Figure imgf000083_0001
Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Proteinlösung durch Abschlagen auf einen Papierstapel wurden für mind. 1 h bei Raumtemperatur die unspezifischen Bindungsstellen mit 100 μl Blockierlösung/well blockiert. Der Blockierlösung wurde mithilfe des automatischen Power Washer 384 (Tecan) entfernt, und alle wells wurden mit TBST gespült. Nach Beendigung des Waschvorgangs wurden eventuell noch vorhandene Lösungsreste auf einem Papierstapel abgeschlagen. Im nächsten Schritt wurden die MTP für das automatisierte Pipettieren der niedermolekularen Substanzen vorbereitet. Es wurden in jedem well 10 μl Blockierlösung vorgelegt bzw. die Kontrollen gemäß dem Pipettierschema (Tab. 1.2) pipettiert. Als Kontrollen dienten Reaktionen ohne Inhi- bitoren, aber mit steigenden AKAP18delta-GST-Mengen (0, 80, 160 ng/well) , sowie mit dem inhibitorischen Peptid L314E und dem Kontrollpeptid 18d-PP (25 nM und 1 μM Endkonzentration) . Die Platten wurden kurz zentrifugiert . Gleichzeitig wurden die Bibliotheks-MTP folgendermaßen für den Pipettiervorgang vorbereitet: Nach dem Auftauen (30 min bei 37 0C) wurde kurz zentrifugiert, um die Lösungen am Plattenboden zu sammeln. Um eventuell vorhandene feste Partikel zu lösen, wurden die Platten für 1 min in ein Ultraschallbad getaucht. An den Platten haftendes Wasser wurde durch fünfminütige Behandlung im Eppendorf Concentrator 5301 bei 30 0C verdunstet, und die Schutzfolie wurde vorsichtig entfernt.
Mithilfe der Sciclone ALH 3000 Workstation (Caliper Li- feSciences, Hopkinton, USA) wurden 0,5 μl jedes poten- tiellen niedermolekularen Inhibitors (10 mM Stammlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) , Endkonzentration 244 μM) von den Bibliotheks-MTP auf die Screening-MTP übertragen. In die Kontrollspalten 1 und 24 wurden dabei jeweils 0,5 μl DMSO übertragen, so dass auch die Kontrollen mit dem gleichen DMSO-Anteil wie die restlichen Proben versetzt wurden. Nach dem Zentrifugieren der Screening-MTP wurde gemäß dem Pipettierschema (Tab. 2.2) AKAP18delta-GST (8 ng/μl in Blockierlösung) zugegeben, zentrifugiert und für mindestens 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Entfernen überschüssigen Proteins durch Waschen mit PBST im Power Washer wurde die Menge des in Gegenwart des potenziellen Inhibitors gebundenen AKAPl8delta-GST mithilfe von 20 μl Al8delta3- (1:1000 in Blockierlösung, mindestens 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 0C) und 20 μl anti-Kaninchen-POD-Ak (1:3000 in Blockier- lösung, mindestens 15 min bei Raumtemperatur) pro well nachgewiesen. Zwischen den einzelnen Pipettierschritten wurde jedesmal mithilfe des Power Washer mit PBST gewaschen. Die Quantifizierung erfolgte durch Zupipettieren von 20 μl LumiLight Western Blotting-Substrat (Roche) pro well und 5 min Inkubation bei Raumtemperatur. Die erzeugte Chemilumineszenz wurde mit einem Tecan Genios Pro MTP- Lesegerät und der zugehörigen Magellan 5.02 Software er- fasst {Chemiluminescence endpoint measurement, Integrationszeit 10 ms/'well; Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim) .
Tab. 1.2: Pipettierschema für eine MTP des Screening. In den Spalten 1 und 24 befinden sich die Kontrollreaktionen, in 2-23 die Reaktionen mit den niedermolekularen Substanzen.
* In 1E/1F/24K/24L: Nach dem Pipettieren der kleinen Moleküle wurden die 10 μl Blockierpuffer durch 20 μl GST-AKAP18delta ersetzt.
Figure imgf000086_0001
2. Ergebnisse
2.1 Die Aufreinigung von rekombinantem AKAPl8delta
2.1.1 Das für AKAPl8delta-GST-Fusionsprotein kodierende Plasmid
Der für die Expression von GST-Fusionsproteinen geeignete pGEX-4T3-Vektor (Fig. 1) mit der hineinklonierten A- KAPlδdelta-kodierenden Sequenz war bereits in der Ar- beitsgruppe vorhanden. Das 1059 Basenpaare umfassende A- KAPl8delta-cDNA-Fragment befand sich am 3' -Ende der GST- kodierenden Sequenz, so dass sich im exprimierten Protein die GST N-terminal von AKAP18delta befand. Die Richtig- keit der Sequenz war kurz vor Beginn der Arbeit durch Se- quenzierung bestätigt worden.
Zur Expression wurde das GST-AKAPl8delta-Konstrukt in kompetente BL21-Zellen transformiert. Um die Transformation zu überprüfen, wurde aus vier der erhaltenen Klone die Plasmid-DNA isoliert und mithilfe der Restriktionsen- donukleasen EcoRI und Xhol eine DNA-Restriktion durchgeführt. Da diese Enzyme auch für die Klonierung verwendet worden waren, konnten erwartungsgemäß Fragmente in der Größe des AKAP18delta-Inserts (1,0 kb) und des lineari- sierten pGEX-Vektors (4,9 kb) in einer Agarose- Gelelektrophorese nachgewiesen werden (Fig. 5).
2.1.2 Optimierung der Lyse von GST-AKAPl8delta- exprimierenden Bakterien
Bakterien, die mit dem pGEX-AKAP18delta-Vektor transfor- miert worden waren, konnten durch Inkubation in IPTG- haltigem Medium zur Expression des rekombinanten Proteins veranlasst werden. Nach der anschließenden Lyse der Bak- terienzellen wurde das in die Lösung freigesetzte GST- Fusionsprotein an Glutathion-Sepharose gebunden, gewaschen und abschließend mit überschüssigem Glutathion elu- iert. Um eine möglichst hohe Proteinausbeute zu erzielen, wurden ausgehend von einer Standardmethode verschiedene Pa¬ rameter der GST-AKAPl8delta-Aufreinigung variiert. Die auf diese Weise ermittelte Aufreinigungsprozedur wird in Abschnitt 1.6 beschrieben. Für das aufgereinigte, rekombinante GST-AKAPl8delta wurde eine Größe von 75 kDa, für die zu Kontrollzwecken aufgereinigte GST allein von 25 kDa erwartet.
Nach der Transformation von kompetenten E. coli-BL21- Zellen mit dem pGEX-AKAPl8delta-Plasmid wurden die Zellen vermehrt, und die Proteinsynthese wurde mit IPTG induziert. Es wurde zunächst untersucht, ob und wie sich die Lyse der Bakterien unter verschiedenen Bedingungen auf die Proteinausbeute auswirkt. Neben Variationen der Standardmethode, der Lyse mit der French Press, wurden Zellen aus der gleichen Induktionskultur auch mit Lysozym und nach DTT-Zusatz lysiert. Es wurden folgende Variationen untersucht:
■ einmal mit der French Press
■ dreimal mit der French Press ■ Zusatz von 5 mM DTT vor einmaliger French Press- Lyse
■ 30 min bei RT mit Lysozym (1 mg/ml)
■ 30 min bei 37° C mit Lysozym (1 mg/ml)
Nach der weiteren Aufreinigungsprozedur und der Bindung an die Glutathion-Sepharose (s. Abschnitt 1.6) wurden von jedem Ansatz 5 μl Beads entnommen und per SDS-PAGE mit nachfolgender Coomassie-Färbung analysiert (Fig. 7) . Als Kontrolle wurden mit einem leeren pGEX-Vektor transformierte Zellen mitgeführt; für diese wurde als Aufreini- gungsprodukt nur die GST erwartet.
Wie aus den Fig. 6A und 6B hervorgeht, konnten Proteine der erwarteten Größen detektiert werden.
Der Zusatz von 5 mM DTT zur Zellsuspension vor der Lyse führte zu einer höheren Proteinausbeute (Fig. 6A) . Ein visueller Vergleich der Coomassie-gefärbten Gele zeigte, dass Lysozym weniger effektiv war als die French Press, um die Zellen zu lysieren (Fig. 6A) .
Die höchste Proteinausbeute konnte durch 30 min Inkubation bei Raumtemperatur erzielt werden (Fig. 6B) .
2.1.3 Die Bindungseffizienz des GST-Fusionsproteins an Glutathion-Sepharose wurde verbessert
Durch Variation der Inkubationszeit und der Inkubationstemperatur des Zelllysats mit den Sepharose-jbeads wurde versucht, die Effizienz der Bindung von GST-AKAPl8delta an die Glutathion-Sepharose zu optimieren (Fig. 6B) .
Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine Inkubation des Zelllysats bei Raumtemperatur für 30 min die größte Proteinausbeute erbrachte.
2.1.4 Die Elutionsbedingungen wurden optimiert
Da sich die Elution von GST-AKAP18delta von den Sepharo- se-beads unter den Standardbedingungen als wenig effektiv herausstellte, wurden die Elutionsbedingungen angepasst, um die Proteinausbeute zu maximieren.
Da Variationen in der Elutionsdauer und -temperatur im Vergleich zu den Herstellerangaben (10 min bei Raumtempe- ratur) nicht zu Verbesserungen führten, wurde die Zusammensetzung des Elutionspuffers verändert. Dessen Zusammensetzung wurde vom Hersteller mit 10 mM Glutathion (GSH) in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 empfohlen. Nachdem sich der Zusatz von 100 mM NaCl oder von 0,1 % Triton X-100 als nicht effektivitätssteigernd erwiesen hatte (Fig. 7, A und B), wurde die GSH-Konzentration schrittweise auf 40 mM, die Tris-Ronzentration auf 100 mM, der pH-Wert auf 9,0, und die NaCl-Konzentration auf 200 mM erhöht. Außerdem wurden dem Elutionspuffer noch 0,2 % Tween-20 zugesetzt. Schließlich wurde noch überprüft, ob sich durch mehrfache Elution mehr Protein gewinnen ließ (Fig. 7, C-I). Mittels Western Blot (mit A18delta3- und Peroxidase (POD) -gekoppelten anti-Kaninchen-Ak) wurde das aufgereinigte Protein als GST-AKAP18delta identifiziert. (Fig. 7J) .
Die Proteinkonzentration einer vor der Optimierung durchgeführten und für die ELISA-Etablierung verwendeten Auf- reinigung wurde durch Bradford-Ässay bestimmt; sie betrug 0,4 μg/μl.
Für das Screening wurde eine weitere Aufreinigung des re- kombinanten GST-AKAP18delta-Proteins erforderlich, die unter den optimierten Bedingungen durchgeführt wurde. Die Konzentration des Eluats aus dieser Aufreinigung wurde mithilfe des etablierten ELISA durch Vergleich mit der ersten Aufreinigung ermittelt; sie betrug 8 μg/μl.
2.2 Etablierung eines ELISA zur Quantifizierung von Pro- tein-Protein-Interaktionen Für die quantitative Detektion der Protein-Protein- Bindung zwischen der Rllalpha-Üntereinheit der PKA und GST-AKAP18delta wurde ein ELISA-basierter Nachweis entwickelt; der für alle anderen AKAP-Proteine und PKA- Untereinheiten entsprechend durch Routineversuche optimiert eingesetzt werden kann.
Die Vorteile dieser Methode liegen, wie bereits in Abschnitt 1.10 beschrieben, vor allem in der hohen Sensiti- vität und der einfachen Handhabung. Hinzu kommt, dass die benötigten Substanzen bereits etabliert waren und in ausreichenden Mengen zur Verfügung standen. Während der an- ti-Kaninchen-POD-Ak und die Chemilumineszenz-Lösung kommerziell erhältlich waren, wurden der A18delta3-Ak und GST-AKAP18delta selbst produziert (s. o.). Zunächst war die prinzipielle Fragestellung, ob zuerst GST-AKAPl8delta an die Mikrotiterplatten (MTP) gebunden und dann die Bindung von Rllalpha detektiert werden sollte, oder umgekehrt. Da bei ersterem die Sensitivität geringer und der Proteinbedarf höher war, und der benötigte PKaRIIalpha-Antikörper nicht selbst produziert werden konnte, wurde nach den ersten Schritten der Etablierung nur noch die zweite Möglichkeit, also Bindung von Rllalpha an die MTP und dann Nachweis der Bindung von GST-AKAP18delta daran, weiter verfolgt. Folgende wichtige Aspekte waren bei der Entwicklung des Assays zu untersuchen:
• Zusammensetzung von geeignetem Binde- bzw. Blockierpuffer
• Menge des an die MTP zu bindenden Rllalpha-Proteins • Menge des GST-AKAP18delta, welches an das plattengebundene Rllalpha bindet • Geeignete Verdünnung der Antikörper für die Detekti- on
• Einfluss des Lösungsmittels Dimethylsulfoxid (DMSO) auf den ELISA (Peptide und organische Substanzen wurden in DMSO gelöst)
• Konzentration inhibitorischer Peptide für Kontrollreaktionen
• Inkubationszeiten für Rllalpha, GST-AKAP18delta, Antikörper und Chemilumineszenz-Detektionslösung • Lagerungsbedingungen für MTP mit gebundenem Protein
• Detektion der Chemilumineszenz
Im Folgenden wird die Etablierung des ELISA unter Beachtung dieser Aspekte beschrieben. Wenn nicht anders angegeben, wurden bei allen Experimenten der Etablierung Dop- pelbestimmungen durchgeführt, d.h., es wurden jeweils zwei wells mit den gleichen Proteinmengen und unter gleichen- Bedingungen untersucht.
Obwohl für jedes Experiment nur zwei Messungen durchgeführt wurden, wurde für den jeweiligen Mittelwert der Standardfehler berechnet, um ein Maß für die Präzision des Mittelwertes zu erhalten. Die Angaben sollten nicht zur Ermittlung von Signifikanzen herangezogen werden. Die Fehlerindikatoren in den Abbildungen geben den Standardfehler des Mittelwertes an; in manchen Fällen (z. B. Fig. 9A) waren die Standardfehler der Mittelwerte so klein, dass die Indikatoren nicht erkennbar sind.
2.2.1 Zum Blockieren freier Bindungsstellen auf MTP ist Magermilch am besten geeignet
Es wurden Magermilchpulver, Rinder-Serumalbumin (BSA, v. engl, bovine serum albumin) und BSA, welches speziell für ELISA-Applikationen vorbehandelt wurde (ELISA-BSA) , als Blockierungsreagenzien untersucht (Fig. 8A; es handelt sich hier um Einzelbestimmungen) .
BSA enthält oft Stoffe, die unspezifische Lumineszenz- signale erzeugen, wie auch hier gezeigt werden konnte. Allerdings zeigte auch ELISA-BSA noch beträchtliche unspezifische Signale, während Magermilchpulver so gut wie keine Chemilumineszenz erzeugte. Daher wurde Magermilch¬ pulver in einer Endkonzentration von 0,3 % in Bindepuffer zum Blockieren freier Bindungsstellen auf MTP verwendet.
2.2.2 Ein MTP-well lässt sich mit 50 ng PKA-RIIalpha sättigen
Bindepuffer-Lösungen mit steigender Rllalpha- Konzentration wurden in die wells einer MTP pipettiert. Nach dem Blockieren freier Bindungsstellen mit Magermilchlösung wurden die an die Platten gebundenen Proteinmengen mit dem PKARIIalpha-Ak und dem anti-Maus-POD-Ak de- tektiert. Da die optimalen Antikörper-Konzentrationen noch unbekannt waren, wurde mit Verdünnungen von 1:5000 (PKARIIaipha) und 1:10000 (anti-Maus-POD) gearbeitet. Die gemessenen Chemilumineszenz-Intensitäten wurden gegen die Proteinkonzentration aufgetragen, um festzustellen, ob und wann die Sättigung der wells mit Protein erreicht war (Fig. 8B) .
Ab 45 ng Rllalpha pro well war die Bindekapazität abgesättigt. Im Folgenden wurden Versuche mit RIIalpha-Mengen von 40 ng/well und 25 ng/well durchgeführt.
2.2.3 Die Chemilumineszenzintensität erreicht bei 200 ng GST-AKAPl8delta pro well ein Maximum 25 ng bzw. 40 ng Rllalpha wurden an die wells von jeweils zwei Reihen einer MTP gebunden. Nach dem Blockieren wurden Blockierpufferlösungen mit steigender GST- AKAPl8delta-Konzentration (zwischen 0 und 200 ng/well) in die wells pipettiert. Diese Versuchsanordnung wird im folgenden als Bindungsreihe bezeichnet. Die Detektion des gebundenen Proteins erfolgte mit A18delta3- und anti- Kaninchen-POD-Ak (1:5000 bzw. 1:10000). Die gemessenen Signalintensitäten wurden gegen die Masse von GST- AKAPl8delta pro well aufgetragen (Fig. 8C) . Es zeigte sich, dass ab 200 ng GST-AKAPl8delta pro well die Bindungskurve nahezu die Sättigung erreichte. Eine erste Auswertung der Messwerte ließ auf einen Wert von 80 ng GST-AKAP18delta pro well zum Erreichen halbmaximaler Sättigung schließen. Bei halbmaximaler Sättigung einer Bindung wird die größtmögliche Sensitivität erreicht. Daher wurden die folgenden Experimente mit einer GST- AKAPlδdelta-Konzentration von 80 ng/well durchgeführt. Eine spätere Auswertung mit der Anpassung des Eine- Bindungsstelle-Modells (s. Abschnitt 1.11) an die Messwerte ist in Fig. 8C gezeigt; hieraus ließ sich auf einen niedrigeren Wert von 50-60 ng GST-AKAP18delta für die halbmaximale Sättigung schließen. Da es keinen nennenswerten Unterschied zwischen den Lumineszenzintensitäten der mit 25 ng Rllalpha und der mit 40 ng Rllalpha beschichteten wells gab, wurden die folgenden Versuche mit 25 ng Rllalpha/well durchgeführt, um Protein einzusparen. Später wurde untersucht, ob für das Screening auch eine RIIalpha-Menge von 15 ng/well ausreichte, um Protein einzusparen (Fig. 9A) . Auch dabei wurde keine Beeinträchti- gung der Lumineszenzintensität festgestellt, so dass das Screening mit dieser Proteinmenge durchgeführt werden konnte.
2.2.4 Der A18delta3-Antikörper wurde 1:1000 verdünnt
Wie im vorherigen Versuch wurde eine RIIalpha-GST- AKAPlδdelta-Bindungsreihe hergestellt, die dann mit ver¬ schiedenen Verdünnungen des A18delta3-Ak detektiert wurde (Fig. 9B) . Die Verdünnung des anti-Kaninchen-POD-Ak wurde zunächst bei 1:10000 belassen.
Die Bindungskurven zeigten, dass bei einer Verdünnung von 1:5000 nicht alle GST-AKAPl8delta-RIIalpha-Komplexe detektiert werden konnten. Bei einer fünffach höheren Kon- zentration wurden deutlich stärkere Signale erhalten. Da das Hintergrundsignal, also die Lumineszenzintensität bei 0 ng GST-AKAP18delta, gleichzeitig gering blieb, wurde damit auch eine größere Sensitivität erhalten.
2.2.5 Für den sekundären Antikörper ist eine 1:3000- Verdünnung sinnvoll
Es wurde der gleiche Versuch wie im vorherigen Abschnitt gemacht, wobei die Verdünnung des primären Al8delta3- An- tikörpers 1:1000 betrug (Fig. 9C). Auch für den anti- Kaninchen-POD-Ak konnte eine Signalintensitäts- und Sen- sitivitätssteigerung festgestellt werden, wenn die Verdünnung von 1:10000 auf 1:3000 verringert wurde. Daher wurden die folgenden Experimente und das Substan- zen-Screening mit den ermittelten Verdünnungen 1:1000 für den A18delta3-Ak und 1:3000 für den anti-Kaninchen-POD-Ak gemacht . 2.2.6 DMSO beeinträchtigt den ELISA nicht
Der Einfluss des organischen Lösungsmittels Dimethylsul- foxid (DMSO) auf die Protein-Protein-Bindung bzw. deren Detektion musste untersucht werden, da die als Kontrollen verwendeten inhibitorischen Peptide L314E und Ht31 wie auch die Substanzbibliothek; selbst in DMSO gelöst waren. In einem ersten Versuch wurde der Einfluss von 1 % DMSO bezogen auf das Gesamt-Reaktionsvolumen (von 20 μl) getestet, wobei gleichzeitig noch einmal verschiedene sekundäre Ak-Verdünnungen und GST-AKAP18delta- Konzentrationen eingesetzt wurden (Fig. 10A). Hierbei zeigte sich, dass DMSO keinen wesentlichen Einfluss auf die Ergebnisse hatte; die zuvor erhaltenen Ergebnisse für die verschiedenen GST-AKAP18delta-Konzentrationen und Ak- Verdünnungen konnten bestätigt werden.
In einem weiteren Experiment, in dem zu konstanten RII- alpha- und GST-AKAP18delta-Mengen steigende DMSO- Konzentrationen von bis zu 2,5 % gegeben wurden (Fig. 10B), wurde das erhaltene Signal nur leicht verringert. Im Screening betrug die maximale DMSO-Konzentration ebenfalls 2,5 %. In einem Kontrollexperiment wurde das an die MTP gebunde- ne Rllalpha mittels PKARIIaipha- und anti-Maus-POD-Ak de- tektiert (Fig. 1OA, vorletzter Wert) .
In einer weiteren Kontrolle (ebenfalls Fig. 1OA, letzter Wert) wurde kein Rllalpha an die Platte gebunden und der restliche Assay wie bekannt durchgeführt. Überraschend wurde hier eine hohe Chemilumineszenz-Intensität gemessen, sodass sich die Frage stellte, ob die gemessenen Signale überhaupt die Menge des gebundenen GST- AKAP18delta widerspiegelten. Zur Überprüfung wurde ein weiteres Experiment (s. nächster Abschnitt) durchgeführt.
2.2.7 Die Detektion von Rllalpha-gebundenem GST- AKAP18delta ist spezifisch
Zur Kontrolle der Signalspezifität wurden in einer Reihe einer MTP 25 ng Rllalpha/well gebunden, in einer zweiten Reihe dagegen kein Rllalpha. Nach dem Blockieren unspezi- fischer Bindungsstellen wurden Lösungen mit steigenden GST-AKAP18delta-Konzentrationen in beide Reihen pipettiert, und mithilfe der Antikörper spezifisch gebundenes Protein nachgewiesen (Fig. 10C) . Während die Signale in der RIIalpha-Reihe stiegen und schließlich in die Sättigung gelangten, war in der Reihe ohne Rllalpha nur ein geringer Anstieg aufgrund unspezifischer Bindung von GST-AKAPl8delta zu beobachten. Das Ergebnis zeigte, dass die Detektion spezifisch war. Bei der Kontrolle in Fig. 10A, letzter Wert, hat es sich da- her wahrscheinlich um einen Pipettier- oder anderen Fehler gehandelt.
2.2.8 Inhibitorische Peptide verhindern die Bindung von GST-AKAPl8delta an Rllalpha
Es ist bekannt, dass sich die Bindung zwischen AKAPs und den R-Untereinheiten der PKA spezifisch und kompetitiv mithilfe von AKAP-abgeleiteten Peptiden hemmen lässt. Solche Peptide wurden daher für Kontrollreaktionen ver- wendet, in denen die Interaktion von Rllalpha und GST- AKAPlδdelta mit Peptiden verhindert werden sollte. Um auch hier eine möglichst sensitive Detektion zu erhalten, wurden zunächst die IC50-Werte für das etablierte Anker- Inhibitor-Peptid Ht31 und für AKAP18-L314E ermittelt. Der IC50-Wert ist diejenige Peptid-Konzentration, bei der nur noch 50 % der maximal möglichen Protein-Protein-Komplexe gebildet werden.
Zur Ermittlung dieser Werte wurden 25 ng Rllalpha/well an MTP gekoppelt und jeweils 80 ng GST-AKAPl8delta zugegeben. Anschließend wurden die Peptide in steigenden Konzentrationen zupipettiert. Weil das L314E-Peptid die Bindung stärker hemmte, wurde dieses für die Kontrollreaktionen in der IC50-nahen Konzentration von 25 nM eingesetzt (Fig. 11) . Die Peptidhem- mung war spezifisch, da die Prolin-enthaltenden Kontroll- peptide 18d-PP bzw. Ht31-P die Bindung nicht bzw. nur schwach hemmten.
2.2.9 Eine Inkubationszeit von 30-60 min ist für die Protein-Protein-Bindung ausreichend
Der Zeitfaktor spielt eine nicht unerhebliche Rolle bei der Planung und Durchführung eines Substanzbibliothek- Screenings. Aus diesem Grunde wurden noch einige Experimente durchgeführt, die AufSchluss über die benötigten Inkubationszeiten gaben. Zuerst wurde getestet, in wel- eher Zeit hinreichend Proteinkomplexe gebildet werden, um genügend Chemilumineszenzintensität zu erhalten. Dazu wurden wieder Bindungsreihen pipettiert, und die Bildung der Protein-Protein-Bindungen wurde nach verschiedenen Zeiten - 15, 30 und 60 min - durch Waschen der MTP unter- brochen. Anschließend wurde die gebundene GST- AKAP18delta-Menge mit den Ak detektiert (Fig. 12) . Bereits nach 30-60 min konnten genügend hohe Chemilumi- neszenzsignale detektiert werden.
2.2.10 Für die Hemmung durch inhibitorische Peptide rei- chen 30-60 min aus
Die Bindung von GST-AKAPl8delta an Rllalpha wurde auch in Gegenwart des kompetitiv hemmenden Peptids L314E und des Kontrollpeptids 18d-PP untersucht. Die Peptide wurden in Konzentrationen von 0,01 oder 10 μM für 15, 30 oder 60 min zu den Reaktionsansätzen gegeben, und anschließend wurde die Menge des gebundenen GST-AKAP18delta detektiert (Fig. 13A) . Auch hier erwies sich die bereits zuvor ermittelte Inkubationszeit von 30-60 min als ausreichend.
2.2.11 Optimale Antikörper-Inkubationszeiten betragen 60 bzw. 15 min
Die Bindung von Antikörpern an ihre Antigene erfolgt zeitabhängig, wobei die Spezifität mit längerer Inkubationsdauer zunächst zunimmt. Später kann z. B. aufgrund der Degradation von Proteinen die Spezifität wieder abnehmen. Um hier die für sensitive Messungen erforderliche Inkubationsdauer zu erhalten, wurden zu RIIalpha-GST- AKAPlδdelta-Komplexen die A18delta3- und anti-Kaninchen- POD-Antikörper gegeben, und die Bindungsreaktionen nach 15, 30 und 60 min durch Waschen unterbrochen. Dabei wurden alle möglichen Kombinationen der Inkubationszeiten für die primären und sekundären Antikörper berücksichtigt (Fig. 13B) .
Hier wurde ermittelt, dass bei 60 min Inkubation mit beiden Antikörpern die höchste Signalintensität erzielt wur- de. Allerdings schien es vertretbar, die Inkubationszeit des sekundären Antikörpers zu verkürzen, wenn der primäre für 60 min binden konnte.
2.2.12 Die Chemilumineszenz kann über einen Zeitraum von 8 min detektiert werden
Die Erzeugung von Chemilumineszenz durch die Oxidation von Luminol ist eine zeitabhängige Reaktion. Durch Sub- stratverbrauch und Denaturierung der Peroxidase im Laufe der Reaktion nimmt die Intensität nach einigen Minuten ab.
Durch Zusatz von Hilfsreagenzien, die die Abnahme der Intensität verlangsamen, stellt dies bei kommerziell er- hältlichen Produkten wie der hier verwendeten LumiLight- Lösung allerdings kein großes Problem dar. Es wurde dennoch überprüft, innerhalb welches Zeitrahmens nach der Zugabe der Substratlösung zu den Reaktionsansätzen die Messung durchgeführt werden sollte. Dazu wurde eine Bin- dungsreihe pipettiert (s. o.), und die Messung der Chemilumineszenz wurde 2, 4 und 8 min nach Zugabe der Lumi- Light-Lösung wiederholt (Fig. 13C) .
Innerhalb von 8 min nach LumiLight-Zugabe konnte die Messung durchgeführt werden, ohne dramatische Verluste in der Signalintensität hinnehmen zu müssen. In diesem Zeitrahmen ließ sich der gesamte Messvorgang problemlos abschließen.
2.2.13 Mit Proteinen beschichtete MTP können über längere Zeit gelagert werden Zur Beschleunigung des Screenings war es sinnvoll, mehrere MTP mit RIIalpha zu beschichten und dann bis zum weiteren Gebrauch zu lagern. Um herauszufinden, ob das Protein durch die Lagerung nicht degradiert wurde, wurde an zwei Reihen einer MTP RIIalpha wie beschrieben gebunden und unspezifische Bindungsstellen blockiert. Dann wurde in einer der Reihen nach 1 h Lagerung bei Raumtemperatur, in der anderen nach 66 h Lagerung bei 4 0C der ELISA vervollständigt und die Menge von gebundenem GST-AKAPl8delta detektiert (Fig. 14) .
Im untersuchten Zeitrahmen hatte die Lagerungsdauer keinen erkennbaren Einfluss auf das Ergebnis.
Mit den so ermittelten Konzentrationen und Inkubationszeiten wurde dann das Screening der Substanzbibliothek durchgeführt.
2.3 Screening- einer Substanzbibliothek zum Auffinden niedermolekularer Inhibitoren der RIIalpha~GST-AKAPl8delta~ Interaktion
Nachdem die MTP wie in Abschnitt 1.12 beschrieben pipettiert und gemessen worden waren, wurde zunächst überprüft, ob die gemessenen Chemilumineszenz-Intensitäten hoch genug waren. War dies der Fall, so wurde die Chemi- lumineszenz eines jeden wells mithilfe des Tabellenkalku- lationsprogramms Microsoft Excel in den entsprechenden Anteil RIIalpha-GST-AKAP18delta-Bindung im Vergleich zur Kontrolle in Prozentwerte umgerechnet. Dazu wurde der Mittelwert der Messwerte der Kontrollen mit 80 ng GST- AKAP18delta [wells Cl, Dl, M24, N24; s. Tab. 1.1 und 1.2) als 100 % festgelegt. Anschließend wurden die Ergebnisse zur Erleichterung der optischen Auswertung mit einer automatisierten Farbzuordnung (durch ein in Microsoft Visu-
Figure imgf000102_0001
al Basic geschriebenes Programm) eingefärbt, wobei in 10%-Abständen eine andere Farbe verwendet wurde. Als Beispiel sind in Tab. 2.1 die Rohdaten einer MTP (Chemilumi- neszenz in RLU) und der dazugehörigen Umrechnung in Pro- zent der Bindung mit Einfärbung gezeigt. Die vollständigen Daten des Screenings befinden sich im Anhang. Nach der Einfärbung wurden bei manchen MTP Auffälligkeiten deutlich, beispielsweise viele Inhibitor-Kandidaten in einem bestimmten Plattenbereich. Wurde bei einer Über- prüfung der Kontrollwerte festgestellt, dass die 100 %- Werte in Spalte 1 und 24 stark verschieden waren (mehr als 20 % Differenz), so wurde diese MTP neu ausgewertet. Dabei wurden dann für jede Hälfte der Platte nur die Kontrollwerte dieser Hälfte (z. B. für die Spalten 1-12 die Kontrollwerte aus Spalte 1) zugrunde gelegt.
Wenn die auffälligen Plattenbereiche trotzdem bestehen blieben, wurde die gesamte Platte erneut pipettiert, gemessen und ausgewertet. Dies war bei den Platten 4, 6, 7, 13, 21, 38 und 50 erforderlich. Jeder Substanz der Bibliothek war eine sogenannte Com- pound-ID zugeordnet, die die EDV-gestützte Auswertung der Daten erleichterte. Nach Abschluss des Screenings wurden alle Messergebnisse in einer Tabelle den entsprechenden Compound-IDs zugeordnet. Durch Sortieren der Ergebnisse nach steigenden Bindungs-Prozentwerten wurden die in Tab. 2.2 dargestellten Substanzen ermittelt, mit denen eine Inhibition der Protein-Protein-Bindung zwischen Rllalpha und GST-AKAP18delta auf 20 % des Kontrollwerts oder weniger erzielt werden konnte. Tab. 2.2: Durch das Screening der 20064 Substanzen umfassenden Bibliothek konnten 19 Kandidaten gefunden werden, die bei einer Substanzkonzentration von 244 μM eine Inhibition der Bindung zwischen Rllα und GST-AKAP18δauf 20 % oder weniger im Vergleich zu den Kontrollen bewirkten. PlateJD = Nr. der Bibliotheks-MTP, PosJD = Position des wells mit der Kandidaten-Substanz. 5
Figure imgf000104_0001
Tab. 2.3: Pipettierschema und Messergebnisse der Validierung. Für jeden potentiellen Inhibitor (A7- H15, I1-P10; angegeben sind die Compound-IDs) und für die Peptide (A3-H6, I11-P12) wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt, um die Konzentrationsabhängigkeit der inhibitorischen Wirkung zu untersuchen. Zusätzlich wurden Bindungsreihen ohne Inhibitoren hergestellt (A1-H2, I13-P14). Die Lumineszenzintensitäten wurden außerdem - wie in Tab. 3.1 beschrieben - in Prozentwerte umgerechnet und eingefärbt (s. Tab. 3.4). Comp.-ID = Compound-ID, I = Intensität
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2.4 Validierung der potentiellen Inhibitoren
Zur Validierung der im Screening der Substanzbibliothek gefundenen potentiellen Inhibitoren wurden diese aus den Bibliotheks-MTP herausgesucht, und gemäß dem in Tab. 2.3 gezeigten Pipettierschema wurden - zusammen mit Kontrollreaktionen - Verdünnungsreihen hergestellt. Mithilfe der Verdünnungsreihen sollte die Konzentrationsabhängigkeit der gefundenen potentiellen Inhibitoren gezeigt werden, welche nur im Falle spezifischer Hemmung der GST- AKAPlδdelta-RIIalpha-Bindung zu erwarten war. Für diese Verbindungen (Tab. 2.4) wurden mithilfe der ermittelten Daten die IC5o-Werte wie in Abschnitt 1.11 beschrieben berechnet (Fig. 15) . Diese Werte geben an, bei welcher Konzentration der Substanz die Hälfte der maximal möglichen Inhibition erreicht wird. Aufgrund der begrenzten Substanzmengen wurden Einzelbestimmungen durchgeführt, weshalb außer für die Kontrollen keine Fehlerindikatoren in Fig. 15 angegeben sind. Die Identität und Reinheit der identifizierten Substanzen wurden mithilfe von Flüssigchromatografie- Massenspektroskopie-Messungen (LC-MS) bestätigt. Die Substanzen wurden für weitere Untersuchungen in größeren Mengen bei ChemDiv (San Diego, USA) nachbestellt.
Tab. 2.4: Prozentuale Bindung zwischen GST-AKAP18S und Rllα in Gegenwart von inhibitorischen Molekülen (A7-H15, I1-P10), Peptiden (A3-H6, I11-P12), oder ohne Inhbitoren (Bindungsreihen in A1- H2, I13-P14), berechnet aus den Ergebnissen aus Tab. 2.3. Die Farbkodierung entspricht der in Tab. 2.1.
Figure imgf000107_0001
Tab. 2.5: Eigenschaften der neun Substanzen, die in der Validierung konzentrationsabhängige Inhibition der Rllalpha-GST-AKAP18delta-Bindung zeigten. MW = Molekulargewicht in G/mol, logP = Verteilungskoeffizient (V engl, partition coefficient), H-Akzept. = Anzahl der Atome, die in Wasserstoffbrückenbindungen als Akzeptoren wirken können, H-Donor. = Anzahl der Atome, die in Wasserstoffbrückenbindungen als Donoren wirken können
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3. Diskussion
Proteinkinase A-Ankerproteine (AKAP-Proteine) haben wichtige Funktionen in cAMP-abhängigen Signalwegen. Sie wer- den gewebespezifisch exprimiert, und verschiedene AKAP- Proteine verankern die Proteinkinase A (PKA) an verschiedenen subzellulären Kompartimenten. Gleichzeitig können sie Gerüstproteine für Schlüsselkomponenten weiterer Signalwege sein. Es wurde u. a. ein ELISA zum Screening einer Bibliothek niedermolekularer, wirkstoffähnlicher Substanzen entwickelt. Mit dieser Methode wurden n konzentrationsabhängig wirksame Inhibitoren der AKAP18delta-RIIalpha-Bindung gefunden. Durch spezifische Inhibition der PKA-Verankerung in Kombination mit den Eigenschaften niedermolekularer Substanzen könnten die Substanzen nicht nur für die Validierung von AKAP-Proteinen als potentielle Ziele neuartiger Wirkstoffe dienen, sondern stellen außerdem selbst Leitstruk- turen für deren Entwicklung dar.
3.1 Die Inhibitoren der RIIalpha-AKAPl8delta-Bindung besitzen pharmakologisch interessante Eigenschaften
Eine wichtige Anforderung an Wirkstoffe ist die Fähig- keit, biologische Membranen durchqueren zu können. Vor allem davon hängt ihre Verfügbarkeit in Zellen ab, und zwar sowohl im Organismus, als auch in Zellkulturmodellen. Voraussetzung für die Membranpermeabilität ist die Lipophilität einer Substanz. Andererseits ist die trei- bende Kraft für einen Membrantransfer eine mögriehst: hohe Konzentration auf einer Membranseite, welche nur durch gute Löslichkeit in wässrigem Milieu erreicht werden kann, die zur Lipophilität umgekehrt proportional ist. Eines von mehreren Modellen für die Vorhersage der Membranpermeabilität ist die Verteilung der Substanz in einem 1-Octanol-Wasser-Gemisch. Aus der Verteilung kann der Verteilungskoeffizient P (v. engl, partition coefficient) berechnet werden:
P = [Substanz ]i_octanoi/ [Substanz]H2o
Angegeben wird meist der Logarithmus dieses Wertes, log P. Für die wirksamen Inhibitoren sind die log P-Werte in Tab. 2.5 angegeben. Ist der Wert größer als 1, so reichert sich der größte Teil der Substanz in der organischen Phase an, ist er kleiner als 1, so reichert sich der größte Teil in der wässrigen Phase an. Da für die ge- fundenen Substanzen die log P-Werte größer als 1 sind, ist für sie alle gute Membranpermeabilität zu erwarten. Ein Faktor, der die Membranpermeabilität organischer Moleküle negativ beeinflusst, ist die Fähigkeit zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen. Diese Art der nichtkovalenten Bindung sorgt dafür, dass sich die Moleküle mit einer Hydrathülle umgeben, die vor dem Membrandurchtritt unter Energieaufwand wieder abgestreift werden muss . Allerdings sind die Wasserstoffbrückenbindungen neben den hydrophoben Wechselwirkungen auch die wichtigsten Kräfte, die zur nichtkovalenten Bindung eines Wirkstoffes an seine Zielstruktur - in diesem Fall an die Rllalpha- Untereinheit der PKA oder an AKAPlδdelta - führen. Eine Möglichkeit, die Fähigkeit zur Wasserstoffbrücken- ausbildung zu beurteilen, ist das einfache Zählen der Wasserstoffbrücken-Donatoren und -Akzeptoren. Die Anzahl der Wasserstoffbrücken-Donatoren und -Akzeptoren ist e- benfalls in Tab. 2.5 angegeben.
Eine andere Möglichkeit ist die rechnergestützte Erstellung eines Modells; so wurde beispielsweise für einen HIV-1-Protease-Inhibitor der Beitrag u. a. von Wasserstoffbrückenbindungen zur Gesamtbindung ermittelt, indem mögliche Bewegungsbahnen der Bindungspartner unter Berücksichtigung ihrer molekularen Dynamik berechnet wurden. Dann wurden die Freie-Energie-Anteile analysiert, um Informationen über die Kräfte zu erhalten, die die Bildung des Protein-Inhibitor-Komplexes antreiben. Eine weitere Eigenschaft, die die Verfügbarkeit von kleinen Molekülen in Zellen beeinflusst, ist deren räumliche Ausdehnung. Die räumliche Ausdehnung eines Moleküls kann durch dessen Molekulargewicht angenähert werden. Es wurde gezeigt, dass sowohl die Resorption einer Substanz als auch ihre Eliminierung über die Galle vom Molekulargewicht abhängen: geringere Molekulargewichte führen zu besserer Resorption und geringerer Gallen-Eliminierung. Ein wesentliches Merkmal aller in der Substanzbibliothek enthaltenen Substanzen ist das relativ kleine Molekulargewicht von durchschnittlich 250 g/mol (s. Tab. 2.5). Da keine der genannten Methoden allein zuverlässige Vorhersagen ermöglicht - vor allem, da das Wasserstoffbrü- ckenbindungspotential im Zusammenhang mit der Lipophili- tät betrachtet werden muss - wurden von Lipinski et al. die sogenannten rules of five aufgestellt. Diese Regeln definieren, welche Substanzeigenschaften schlechte Membranpermeabilität verursachen: ■ Mehr als fünf H-Brücken-Donatoren (= Summe der OH- und NH-Gruppen) ■ Mehr als zehn H-Brücken-Akzeptoren (Summe der N- und O-Atome)
■ Molekulargewicht über 500 g/mol
■ Verteilungskoeffizient log P > 5 Die durch das Screening ermittelten Wirkstoffe erfüllen alle diese Bedingungen (Tab. 2.5), so dass sie membran- permeabel sind.
Dennoch gilt als Ziel für neue Wirkstoffe und für die systematische Abwandlung der gefundenen Strukturen zur Verbesserung ihrer Wirksamkeit, diese Werte möglichst abzusenken; bevorzugte erfindungsgemäße Strukturen weisen diese abgesenkten Werte auf.
3.2 Die Anwendungsbereiche der Inhibitoren werden durch ihre Spezifitäten festgelegt
Nach dem Screening konnte in der Validierung (Tab. 2.4, Abb. 2.11 und 2.12) für bestimmte Inhibitoren gezeigt werden, dass sie die Bindung der PKA-Untereinheit RII- alpha an GST-AKAPl8delta konzentrationsabhängig hemmen. Da alle identifizierten Substanzen hydrophobe aromatische Ringsysteme besitzen, ist eine Bindung in der von den RII-Untereinheiten ausgebildeten hydrophoben Tasche möglich. Andererseits ist über Wasserstoffbrücken auch eine Bin- düng direkt an die RII-Bindedomäne des AKAP-Proteins denkbar.
Da ausgewählte Substanzen spezifisch an AKAP18delta binden, können die Folgen der Aufhebung der Kompartimentie- rung dieses Signalwegs auch in vivo (s. u.) untersucht werden. Andere Substanzen binden spezifisch an andere A- KAP-Proteine, so dass mit diesen andere Signalwege untersucht werden können. Vorteilhafte Substanzen binden spezifisch AKAP18- Proteine, also alle Spleißvarianten alpha, beta, gamma und delta und schließen sie so von der Interaktion mit RII-Untereinheiten aus, da alle Isoformen die gleiche RII-Bindedomäne besitzen (Abb. 1.5).
Bindet eine der Substanzen aber an die RII-Untereinheit, so hat man ein Werkzeug, mit dessen Hilfe sich Interaktionen zwischen AKAP-Proteinen und RII-Untereinheiten allgemein hemmen lassen. Die Aufklärung der Bindungsstellen ist mit rechnergestützten Modellerstellungen möglich, bei denen die Strukturen der ermittelten Substanzen mit den Strukturen von Rllalpha oder der AKAP-RII-Bindedomäne auf mögliche wechselwirkende Bereiche überprüft werden können.
3.3 Die AKAP-PKA-Inhibitoren stellen Leitstrukturen für neue Wirkstoffe dar
Die Inhibitoren der RIIalpha-GST-AKAPl8delta-Bindung werden vorteilhafterweise zu einer neuen Klasse von Pharmaka weiterentwickelt.
Eine Möglichkeit, Inhibitoren der PKA-AKAP18delta-Bindung (aber auch der Bindung mit anderen AKAP-Molekülen) als neuartige Pharmaka anzuwenden, ergibt sich aus der Beteiligung von AKAPlδdelta an der AVP-induzierten Transloka- tion von AQP2 in die apikale Membran von Sammelrohrzellen der Niere (AQP2-Shuttle) .
AKAPlδdelta verankert dabei die PKA an den AQP2-haltigen Vesikeln, so dass die katalytischen Untereinheiten nach AVP-Stimulation die Wasserkanalproteine spezifisch phosphorylieren können, was den Transport zur und die Verschmelzung der Vesikel mit der apikalen Plasmamembran zur Folge hat. Dadurch wird die Wasserdurchlässigkeit der Membran erhöht.
Im Rattenmodell konnte gezeigt werden, dass es bei bestimmten Krankheiten wie Herzinsuffizienz, Leberzirrho- sen, Bluthochdruck, aber auch in der Schwangerschaft, zu Wasserretention kommen kann. Dies kann sich u. a. in Ödemen äußern.
Bisher wird die Retention von Wasser mit sogenannten Diuretika behandelt. Diuretika sorgen indirekt für eine er- höhte Exkretion von Wasser über die Nieren, indem sie Na+-, K+- und Ca2+-Ionentransporter hemmen, die normalerweise Ionen aus dem Primärharn in die Sammelrohrepithel- zellen zurücktransportieren. Dadurch erhöht sich die Os- molarität im Sammelrohr, und Wasser folgt osmotisch durch konstitutiv in der apikalen Zellmembran der Sammelrohre- pithelzellen befindliche AQP2-Moleküle nach. Außer bei Wasserretention werden Diuretika auch bei Herzinsuffizienz und Hypertonie eingesetzt, allerdings können durch die auftretenden starken Verluste von Elektrolyten uner- wünschte Arzneimittelwirkungen (UAW) auftreten.
Eine Klasse von Pharmaka ohne die durch Elektrolytverlust bedingten UAW sind die Aquaretika. Sie bewirken eine erhöhte Wasserexkretion und stellen einen potentiellen Ersatz für konventionelle Diuretika dar. Als aquaretisch wirkende Pharmaka sind bisher nur die Vasopressin- Rezeptorantagonisten bekannt.
Aufgrund der Beteiligung von AKAPl8delta an der AQP2- Translokation können die Inhibitoren der RIIalpha-GST- AKAP18delta-Bindung zu neuartigen Aquaretika weiterentwi- ekelt werden. Eine Entkopplung der PKA von den AQP2 tragenden Vesikeln durch spezifische Inhibition der A- KAP18delta-PKA-Bindung (s. Abschnitt 1.7) unterbricht die AVP-vermittelte Signalkaskade, so dass trotz des AVP- Stimulus der Einbau von AQP2-Molekülen in die Membran gehemmt wird. So kann die Wasserrückresorption nicht gesteigert werden und es kommt zu verstärkter Wasserexkre- tion mit dem Harn. Bei dieser Wirkungsweise wird - im Unterschied zu der von Diuretika (s. o.) - der Ionenrücktransport in die Sammelrohrepithelzellen nicht beeinträchtigt. Ein Wirkstoff mit dieser Eigenschaft wäre damit ein Aquaretikum, mit dem sich die Diurese spezifisch forcieren ließe.
Voraussetzung für die Entwicklung zu einem Pharmakon ist eine Optimierung der inhibitorischen Moleküle. Diese sind in geringeren Konzentrationen wirksam, so dass sie auch im Tiermodell eingesetzt werden können, um die erwartete Wirkung als Aquaretikum experimentell zu überprüfen. Würden beispielsweise Ratten nach der Gabe von optimierten Inhibitoren verstärkt Wasser ausscheiden, so wären damit auch AKAP-Proteine als mögliches Ziel für Pharmaka vali- diert . AKAPlδdelta wird nicht nur in der Niere, sondern auch in anderen Geweben exprimiert. Besonders stark ist die Expression im Herz, wo auch andere AKAP-Proteine wichtige Funktionen übernehmen. Es konnte im Zellkulturmodell von Herzmuskelzellen ge- zeigt werden, dass für die beta-adrenerge Regulation von Ca2+-Strömen über L-Typ-Ca2+-Kanäle (Cavl .2-Kanäle) eine AKAP-vermittelte PKA-Verankerung Voraussetzung ist. AKAP18alpha (= AKAP15) bindet über ein Leucin-Zipper- Motiv an den C-Terminus der porenbildenden alphai- Untereinheit des Ca2+-Kanals. Die vom AKAP-Protein gebun¬ dene PKA setzt nach Aktivierung des beta-adrenergen Re- zeptor-/cAMP-Signalweges ihre katalytischen Untereinhei- ten frei, welche dann einen Serinrest in der alphai- Untereinheit des Kanals phosphorylieren können. Dadurch wird die Offenwahrscheinlichkeit des Kanals erhöht, und der Ca2+-Einstrom wird verstärkt. Dies wirkt positiv i- notrop und positiv chronotrop.
In derselben Studie wurde gezeigt, dass durch den Einsatz des Anker-Inhibitor-Peptids Ht31 die durch beta-adrenerge Rezeptoren aktivierte PKA-abhängige Steigerung der Cavl .2-Kanalaktivität aufgehoben wird. Die erfindungsge- mäßen niedermolekularen Inhibitoren zeigen in Herzmuskelzellen die gleiche Wirkung wie beta-Blocker. Beta-Blocker sind Pharmaka, die die Wirkung der Neurotransmitter Adrenalin und Noradrenalin an den beta- adrenergen Rezeptoren der jeweiligen Zielzellen kompeti- tiv hemmen. Man unterscheidet betai-, beta2~ und beta3~ Rezeptoren, die gewebespezifisch exprimiert werden. An ersteren zeigt Noradrenalin stärkere, an zweiteren schwächere Wirkung. In Herzmuskelzellen werden überwiegend be- tai-Rezeptoren exprimiert, und es gibt betai-selektive (= kardioselektive) und nichtselektive beta-Blocker. Beta- Blocker wirken auf das Herz negativ inotrop und negativ chronotrop. Da dies zu einem verminderten Sauerstoffbedarf des Herzmuskels führt, werden beta-Blocker zur Behandlung von koronarer Herzkrankheit eingesetzt. Daneben wirken beta-Blocker über einen unbekannten Mechanismus relaxierend auf die Gefäßmuskulatur, weshalb sie auch zur Behandlung von Bluthochdruck eingesetzt werden. Inhibitoren der Bindung von AKAP-Proteinen an RII- Untereinheiten sind eine mögliche Alternative zu beta- Blockern. Durch die gezielte Blockierung des AKAP18alpha- abhängigen Signalweges wirken sie unter Umständen spezifischer als beta-Blocker, da letztere alle Signalwege ab- wärts des Rezeptors blockieren. Die AKAPl8-Inhibitoren könnten außerdem bei Kontraindikation von beta-Blockern eingesetzt werden, z. B. bei Asthma.
Allerdings könnten die neuen Wirkstoffe zu UAW in Ske- lettmuskeln führen, da dort ebenfalls L-Typ-Ca2+-Kanäle und AKAP18alpha exprimiert werden.
Außer in Herzmuskelzellen kommen Cavl.2-Kanäle und A- KAP18alpha' auch in Dendriten und Zellkörpern von Neuronen im Gehirn vor. Daher ist es möglich, dass AKAPlδalpha auch dort an der Regulierung von Cavl .2-Kanälen involviert ist. Dies eröffnet ein weiteres potentielles Anwendungsgebiet für die inhibitorischen Moleküle.
3.4 Die Substanzen stellen neue Werkzeuge zur Blockierung der PKA-Verankerung dar
Wie in Abschnitt 1.8 beschrieben wurde, wurde die Protein-Protein-Interaktion zwischen AKAP-Proteinen und RII- üntereinheiten der PKA bislang mit Peptiden (Ht31, AKA- Pis) inhibiert. Auf diese Weise ist allerdings keine ge- zielte Hemmung eines bestimmten AKAP-RII-Komplexes möglich, da die Peptide der RII-Bindedomäne von Ht31 entsprechen bzw. ausgehend von einer aus verschiedenen AKAP- Proteinen berechneten Konsensus-Bindungsstelle generiert wurden und so alle im untersuchten System vorhandenen re- gulatorischen Untereinheiten blockieren.
Da alle RII-Bindedomänen von AKAP-Proteinen sehr ähnlich sind, ist es fraglich, ob mit kleinen Molekülen eine spezifische Hemmung bestimmter AKAP-PKA-Komplexe möglich ist. Andererseits ermöglichen die geringfügigen Unter- schiede der RII-Bindedomänen unter Umständen eine spezifische Hemmung der AKAP-PKA-Interaktion nach Optimierung (s. u.) der Substanzen. Ein anderer Nachteil der Peptide ist, dass sie nicht membranpermeabel sind. Für Experimente, in denen Membran- permeabilität benötigt wird, beispielsweise an Zellkulturmodellen, mussten die Peptide daher acyliert werden. Mithilfe der hier beschriebenen, niedermolekularen Inhibitoren kann dieser Nachteil überwunden werden. Die chemisch-physikalischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen ermöglichen den direkten Einsatz in Zellkulturen und auch in Tiermodellen, womit erstmals auch die Untersuchung der Funktion von AKAP-Proteinen in vivo möglich wird.
Daneben kann die nahezu unbeschränkte strukturelle Diver- sität von kleinen organischen Molekülen ausgenutzt werden, um nach der Identifizierung von Ausgangssubstanzen eine Optimierung mit dem Ziel einer stärkeren Bindung an die Proteinoberfläche, einer besseren Stabilität, weniger unspezifischer Nebeneffekte und erhöhter in vivo- Verfügbarkeit durchzuführen.
Die niedermolekularen Inhibitoren der bevorzugt Rllalpha- GST-AKAP18delta-Interaktion ermöglichen zusätzliche Experimente, die über ihre Eigenschaften, ihre Wirkungsweise und ihre Spezifität weitere Auskunft geben. Zunächst kann mithilfe des etablierten ELISA überprüft werden, ob die Substanzen keine unspezifischen Effekte - wie beispielsweise Denaturierung - auf Proteine ausüben. Dazu können Rllalpha oder GST-AKAP18delta an MTP gebunden und mit steigenden Konzentrationen der Substanzen versetzt werden. Anschließend können die Proteine mithilfe der PKARiiaipha- bzw. Al8delta3-Antikörper detektiert werden. Eine erste Überprüfung der Spezifität der niedermolekularen Inhibitoren ist ebenfalls mit dem ELISA möglich, indem RIIalpha an MTP gebunden wird, und in Gegenwart steigender Inhibitorkonzentrationen verschiedene rekombinante AKAP-Proteine dazugegeben werden. Werden alle AKAP- Rllalpha-Interaktionen inhibiert, so deutet dies auf eine Bindung des Inhibitors an RIIalpha hin. Ist die Hemmung von AKAP-Protein zu AKAP-Protein verschieden stark, so binden die Inhibitoren vermutlich an die geringfügig ver- schiedenen RII-Bindedomänen der AKAP-Proteine.
Außer diesen Untersuchungen seien hier drei weitere Experimente genannt, die mit bereits erprobten Reagenzien und Methoden sofort durchgeführt werden können. Sie können Auskunft darüber geben, welche der ermittelten Substanzen auch in Zellen, insbesondere wenn die Zellen Teil eines Organismus sind, wirksam sind, und daher für eine Optimierung in Frage kommen.
Zunächst können Sammelrohrzellen aus der inneren Medulla von Rattennieren (IMCD-Zellen, v. inner medullary collec- ting duct) in Gegenwart oder Abwesenheit der Substanzen mit AVP stimuliert werden, um die AQP2-Translokation zu stimulieren. Anschließend können Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt werden. Dabei werden die Zellen nach der Inkubation fixiert und permeabilisiert . Mithilfe von flu- oreszenzfarbstoffgekoppelten Antikörpern kann dann die intrazelluläre Lokalisation von AQP2 unter dem Fluoreszenzmikroskop ermittelt werden. Auf diese Weise kann der Einfluss der Substanzen auf die vermutlich AKAPlδdelta- abhängigen AQP2-Translokation untersucht werden. Ein weiteres Experiment ist die Messung von Ca2+-Strömen durch L-Typ-Ca2+-Kanäle in primär kultivierten Herzmuskelzellen aus neonatalen Ratten mittels Patch-Clamp- Technik. Dabei werden Membranabschnitte einer einzelnen Zelle mit einer puffergefüllten Glaskapillare fixiert und es wird eine konstante Spannung über die Membran angelegt. Durch einen Stromimpuls kann ein messbarer Anstieg des Ca2+-Stromes durch die in dem fixierten Membranbereich befindlichen, spannungsabhängigen L-Typ-Ca2+-Kanäle ausgelöst werden.
Nach Stimulation der Zellen mit dem unspezifischen beta- Adrenozeptor-Agonisten Isoproterenol ist eine Erhöhung des Ca2+-Kanalstroms zu erwarten, da durch die Rezeptoraktiv-ierung die in Abschnitt 3.3 beschriebene, von A- KAP18alpha abhängige Signalkaskade ausgelöst wird. Dadurch wird der L-Typ-Ca2+-Kanal phosphoryliert, wodurch sich seine Offenwahrscheinlichkeit erhöht. Solche Messun- gen können in Gegenwart oder Abwesenheit der Substanzen durchgeführt werden, so dass die Auswirkung auf den Signalweg indirekt über die gemessenen Ströme quantifiziert werden kann. Schließlich ist ein weiteres Experiment mit den genannten Herzmuskelzellen möglich, bei dem die Zellen mit Isoproterenol und den Substanzen präinkubiert werden. Danach wird ein membranpermeabler, fluoreszierender Ca2+- Indikator zu den Zellen gegeben. Damit kann die Ca2+- Verteilung in der Zelle visualisiert, und mithilfe eines Laser-Scarming-Mikroskops können (LSM) die Ca2+- Konzentrationsänderungen auch zeitlich aufgelöst analysiert werden. In Gegenwart der Substanzen werden schwächere Veränderungen der Ca2+-Konzentration erwartet, falls sie einen inhibitorischen Effekt auf die AKAP-PKA- Interaktion und damit auf die Phosphorylierung des Ca2+- Kanals haben. Sollte sich in diesen Experimenten zeigen, dass mit den Substanzen auch im Zellkulturmodell eine AKAPl8delta- spezifische oder eine unspezifische Hemmung der Interaktion mit der PKA möglich ist, so kann eine Optimierung durchgeführt werden mit dem Ziel, die konzentrationsabhängige Wirksamkeit zu verbessern.
Der erste Schritt einer Optimierung ist die rechnergestützte Modellerstellung, um eine Vorstellung davon zu bekommen, welche funktionellen Gruppen der Moleküle mit welchen Aminosäuren in den Proteinen interagieren könnten.
Auf dieser Basis können funktionelle Gruppen der Moleküle unter Beachtung der Lipinski-Regeln (s. Abschnitt 3.1) systematisch ausgetauscht werden, um die Affinität zum Bindungspartner zu erhöhen.
Daneben kann versucht werden, ob durch einen kombinierten Einsatz der Inhibitoren ein additiver oder synergistischer Effekt erzielt werden kann. Falls auf diese Weise Verbesserungen erzielt werden können, kann versucht wer- den, gezielt ein Molekül zu synthetisieren, welches die am effektivsten interagierenden funktionellen Gruppen miteinander verknüpft.
Von den so erhaltenen Substanzen wären geringere Konzentrationen erforderlich, um die gleiche Wirkung zu erzie- len. Dies ermöglicht vorteilhafter einen Einsatz in vivo, wobei die Wahrscheinlichkeit unspezifischer oder toxischer Wirkungen reduziert ist.
Die Figuren stellen folgende Sachverhalte dar: Fig. 1 :
Schematische Darstellung des für die Expression von GST-
Fusionsproteinen verwendeten Vektors pGEX-4T3.
Fig. 2:
Der Molekulargewichtsstandard HyperLadder I DNA Marker.
Fig. 3:
Der Molekulargewichtsstandard Invitrogen BenchMark prote- in ladder für SDS-PAGE.
Fig. 4:
Schematische Darstellung des ELISA zur quantitativen De- tektion der Protein-Protein-Bindung zwischen PKA-RIIalpha und GST-AKAPl8delta. In jedem well einer 384-well MTP
(links) findet eine der folgenden Reaktionen statt: A - ohne Inhibitor bindet GST-AKAP18delta an das plattengebundene Rllalpha und ist daher mit den Antikörpern durch Chemilumineszenz nachweisbar. B - werden kleine Moleküle zugesetzt, die an einen der beiden Bindungspartner binden (hier an GST-AKAP18delta) , so werden sowohl GST- AKAPlδdelta als auch die Antikörper in den folgenden Waschschritten entfernt, und es kann keine Chemilumineszenz erzeugt werden. C - gleiches gilt für die Inhbition der Bindung durch inhbitorische Peptide. Diese binden allerdings immer an Rllalpha.
Fig. 5:
Kompetente E. coli-Zellen wurden mit pGEX-AKAPlδdelta transformiert, die Plasmid-DNA aus 4 Klonen präpariert, einem Restriktionsverdau unterzogen und mittels Agarose- Gelelektrophorese analysiert. Klon 1 ung. = unbehandeltes Plasmid aus Klon 1, Klone 1-4 = mit EcoRI und Xhol behandelte Plasmide der Klone 1-4. Bei den verdauten Plasmiden sind die erwarteten Fragmente von 4,9 kb und 1 kb zu sehen.
Fig. 6 A und B:
Analyse von SDS-PAGE-Probenpuffereluaten von Glutathion- Sepharose-beads, an die das rekombinante GST-AKAPl8delta (75 kDa) bzw. die GST (25 kDa) nach der Aufreinigung mit verschiedenen Lyse- und Bindungsbedingungen gebunden hatten, mittels SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung. Es wurden jeweils 5 μl der Probenpuffer-Eluate aufgetragen.
A: Variation der Lyse-Bedingungen. GST = Produkt des lee- ren pGEX-Vektors; GST-I8delta = Produkt von pGEX-
AKAP18delta; FP = French Press; DTT = Zusatz von DTT vor einmaliger French Press-Lyse; Lyso = Lyse mit Lysozym; RT = Raumtemperatur; M-Standard = Molekulargewichtsstandard.
B: Variation der Bindungsbedingungen. Die Bakteriensuspension wurde jeweils dreimal mittels French Press Iy- siert .
Fig. 7: Durch schrittweise Veränderung der ElutionspufferZusammensetzung konnte die Elution von GST-AKAPl8delta von den Glutathion (GSH) -Sepharose-beads optimiert werden. In der ersten und letzten Spalte sind Ausschnitte aus Coomassie-gefärbten SDS-PAGE (A-I) bzw. Western Blots (J) zu sehen. Die Pfeile in der letzten Spalte geben an, welche Elutionsbedingungen auf die beads angewendet worden waren, bevor sie analysiert wurden. Es wird jeweils der Ausschnitt zwischen 70 und 80 kDa gezeigt. In der zweiten und dritten Spalte sind die aufgetragenen Probenvolumina, in der vorletzten die Elutionsfraktion und in den restlichen Spalten die Zusammensetzung des Eluti- onspuffers dargestellt. V = Volumen, c = Konzentration, T-X = Triton X-100, T-20 = Tween 20, E = Eluat-Nr.
Fig. 8:
A - BSA, BSA-ELISA und Magermilchpulver wurden in Binde- puffer gegeben. Nach Zugabe von Chemilunαineszenzsubstrat wurde die Intensität der unspezifischen Signale ermittelt (Einzelbestimmungen) .
B - Bindepuffer mit steigenden RIIalpha-Konzentrationen (angegeben als Gesamtmasse m(RIIalpha) ) wurde in MTP pi- pettiert, unspezifische Bindungsstellen mit Blockierpuffer blockiert, und die Menge des gebundenen Proteins mit PKARIIaipha- und anti-Maus-POD-Ak detektiert. C - Bindepuf¬ fer mit konstanten Mengen Rllalpha (25 bzw. 40 ng/well) wurde auf MTP pipettiert, unspezifische Bindungsstellen mit Blockierpuffer blockiert, Blockierpuffer mit steigenden Konzentrationen GST-AKAP18delta zugegeben und die Menge des gebundenen GST-AKAP18delta mit A18delta3- und anti-Kaninchen-POD-Ak detektiert. I = Intensität, RLU = relative light units, m = Masse.
Fig. 9:
A-C - Es wurden jeweils Bindungsreihen (wie in Fig. 8C) hergestellt .
A - Für Bindungsreihen mit 15 bzw. 25 ng konstanter RII- alpha-Menge wurden die Chemilumineszenzintensitäten ermittelt. B - Bindungsreihen wurden mit verschiedenen Al8delta3- und konstanten anti-Kaninchen-POD-Ak-Verdünnungen detek- tiert.
C - Bindungsreihen wurden mit konstanten A18delta3- und verschiedenen anti-Kaninchen-POD-Ak-Verdünnungen detek- tiert.
Fig. 10:
A - Zu konstanten RIIalpha-Mengen wurden 0, 80 oder 160 ng GST-AKAP18delta gegeben. Die Detektion erfolgte mit konstanten A18delta3-Verdünnungen und mit 1:3000 (3k)- oder 1:10000 (10k) -Verdünnungen des sekundären (2.) anti- Kaninchen-POD-Ak. Jedes Experiment wurde in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) von 1 % DMSO durchgeführt.. B - Die Bindung von konstanten GST-AKAP18delta-Mengen an konstante RIIalpha-Mengen wurde in Gegenwart von steigenden DMSO-Konzentrationen (0-2,5 %) detektiert. C - Es wurden Bindungsreihen mit 0 bzw. 25 ng Rllalpha hergestellt und detektiert, um die Spezifität der Signale nachzuweisen.
Fig. 11:
Um ICöo-Werte zu berechnen, wurde die Bindung zwischen konstanten Rllalpha- und GST-AKAPl8delta-Mengen in Gegen- wart steigender Peptidkonzentrationen detektiert. Ein Ei- ne-Bindungsstelle-Modell wurde an die Messwerte angepasst (s. Abschnitt 1.11). Während L314E und Ht31 die Bindung kompetitiv hemmen, werden 18d-PP und Ht31-P als Negativkontrollen verwendet. Fig . 12 :
Es wurden Bindungsreihen hergestellt, bei denen die Bildung der RIIalpha-GST-AKAP18delta-Interaktion nach 15, 30 oder 60 min durch Waschen unterbrochen wurde. Dann wurde die Menge des gebundenen GST-AKAP18delta detektiert.
Fig. 13:
A - Zu konstanten Rllalpha- und GST-AKAP18delta-Mengen wurden für 15, 30 oder 60 min die Peptide L314E und 18d- PP in Konzentrationen von 0,01 oder 10 μM gegeben. Anschließend wurde die Menge des gebundenen GST-AKAPl8delta detektiert
B - RIIalpha-GST-AKAP18delta-Komplexe in konstanten Konzentrationen wurden mit dem A18delta3- und dem anti- Kaninchen-POD-Ak für alle möglichen Kombinationen der Inkubationszeiten 15, 30 und 60 min detektiert. Die Darstellung von Fehlerindikatoren war in dieser Abb. nicht möglich. C - Zu derselben RIIalpha-GST-AKAPl8delta-Bindungsreihe wurden die Ak und das Chemilumineszenzsubstrat gegeben. Die Chemilumineszenzintensität wurde nach 2, 4 und 8 min gemessen.
Fig. 14: MTP wurden 1 h mit gleichen Mengen Rllalpha beschichtet. Anschließend wurde Blockierpuffer zugegeben und die MTP für 1 h bei Raumtemperatur oder für 66 h bei 4 0C inkubiert. Anschließend wurde GST-AKAP18delta in steigenden Konzentrationen zugegeben. Die Menge des gebundenen GST- AKAPlδdelta wurde mit A18delta3- und anti-Kaninchen-POD- Ak detektiert. Fig 15 :
A - Die RIIalpha-GST-AKAPl8delta-Bindungskurve zeigt, dass die restlichen Experimente, die alle mit 50 nM GST- AKAP18delta durchgeführt wurden, im sensitiven Messbe- reich lagen.
B - Mithilfe des inhibitorischen Peptids L314E konnte die Bindung ebenfalls konzentrationsabhängig inhibiert werden. C - Zusammenfassung der Validierungsexperimente mit stei- genden Inhibitorkonzentrationen. Gezeigt sind die 9 Hits sowie zum Vergeich die nicht wirksame Verbindung 2348. D- L - Konzentrationsabhängige Wirkung jedes einzelnen Inhibitors, Strukturformel und aus der Anpassung eines Eine- Bindungsstelle-Kompetition-Modells (s. Abschnitt 1.11) an die Messwerte (Einzelbestimmungen, daher keine Fehlerindikatoren) berechnete IC50-Werte (D-L: Einzelbestimmungen) . Fortsetzung (H-L) auf der nächsten Seite.
Fig. 16: Teil 2 von Fig. 15. Teil 1 und Legende siehe Fig. 15.
Fig. 17:
Schematische Darstellung des ELISA zur quantitativen De- tektion der Protein-Protein-Bindung zwischen PKA-RIIalpha oder PKA-RIIbeta und GST-AKAP18delta (Glutathion S-
Transferasefusion mit AKAP18delta) . Die Interaktion erfolgt in Ab- oder Anwesenheit niedermolekularer Substanzen in 384-Loch-ELISA-Platten. Der Nachweis der Interaktion der Proteine erfolgt mit primären anti-AKAP18delta- und sekundären Peroxidase-gekoppelten Antikörpern und Chemilumineszenz . Fig. 18: Hemmung der Vasopressin (AVP) -abhängigen Umverteilung des Wasserkanals Aquaporin-2 (AQP2) in renalen Hauptzellen durch die angegebenen Substanzen (s. Tab. B; Konzentrationen der Hemmstoffe in μM) . Primär kultivierte Hauptzel- len aus der inneren Medulla von Rattennieren (IMCD-
Zellen) stellen ein Modell für die AVP-induzierte Translokation von AQP2 dar. Diese Umverteilung bildet die molekulare Grundlage der AVP-induzierten Wasserrückresorption in der Niere. AQP2 wurde mittels eines spezifischen Antiserums und Cy3-markierter Sekundärantikörper in unbehandelten (Kontrolle) und mit AVP- bzw. Substanzen behandelten Zellen mit dem laser scanning-Mikroskop detektiert {Tamma et al. , 2003; Henn et al. , 2004). Fig. 19: Cluster von Substanzen, die die Interaktion von A-
KAPlδdelta mit regulatorischen Rllalpha Untereineheiten der PKA hemmen. Alle Substanzen, die die Interaktion hemmen (s. Tab. A und B) wurden bezüglich struktureller Ähnlichkeiten untersucht. Die Zahlen unter den Bezeichnungen Strukturen 1-18 entsprechen der Com_ID (s. Tabellen A und B) . Es zeigte sich eine strukturelle Ähnlichkeit zwischen den Substanzen 1-4, 5 und 6, 7 - 9, 11 und 12, 13 und 14, 15 und 16 sowie zwischen 17 und 18. Substanz 10 hatte kein Ähnlichkeit mit anderen interaktionshemmenden Sub- stanzen. Verallgemeinerungen der Strukturen sind in Fig. 20 abgebildet. Fig. 20
Verallgemeinerung der Strukturen 1 - 17, die in Fig. 19 dargestellt sind Fig. 21:
Wirkung der niedermolekularen Substanzen 18882, 990 und der 990-Derivate SM61 und SM65 auf die AVP-induzierte Um- Verteilung von AQP2 in IMCD-Zellen (s. Fig. 18) . Die Strukturen und chemischen Eigenschaften der Substanzen sind in den Tab. A, B und C dargestellt (Konzentrationen der Hemmstoffe in μM) . AQP2 wurde mittels eines spezifi- sehen Antiserums und Cy3~markierter Sekundärantikörper in unbehandelten (Kontrolle) und mit AVP- bzw. Substanzen behandelten Zellen mit dem laser scanning-Mikroskop de- tektiert {Tamma et al. r 2003; Henn et al., 2004). Die niedermolekulare Substanz 990 hemmt die Interaktion von AKAPlδdelta mit regulatorischen Rllalpha-Untereinheiten der PKA in IMCD-Zellen (s. Fig. 22). Entsprechend verhindert 990 die AVP-induzierte AQP2-Umverteilung. Die Substanz SM61, ein 990-Derivat, inhibiert die AVP-induzierte AQP2-Umverteilung ebenfalls. Die Substanzen 18882 und das 990 Derivat SM65 haben dagegen in den verwendeten Konzentrationen keinen Einfluss auf die AVP-induzierte AQP2- Umverteilung .
Fig. 22: Die niedermolekulare Substanz 990 hemmt die Interaktion von AKAPlδdelta mit regulatorischen Rllalpha- Untereinheiten der PKA in IMCD-Zellen. Die Substanz (s. Tab. A, B und D) wurde durch das Durchmustern einer 20064 Verbindungen umfassenden Substanzbibliothek mittels des in Fig. 17 dargestellten ELISA-basierten Versuchsaufbaus identifiziert. Primär kultivierte IMCD-Zellen blieben unbehandelt (Kontrolle) , wurden mit der Substanz 990 (100 μM) oder als Negativkontrolle mit cAMP für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und einer cAMP-Agarose-Präzipitation unterzogen (Henn et al., JBC 279, 26654, 2004). A. AKAPlδdelta wurde in den Lysaten und den cAMP-Agarose-Präzipitaten (cAMP-Agarose) mittels des anti-AKAP18delta spezifischen Antikörpers A18delta4 im Western Blot detektiert (Henn et al . , 2004). Als Negativkontrolle wurde cAMP in den Ansatz gegeben. Dadurch wird die Bindung von regulatorischen Untereinheiten der PKA an die cAMP-Agarose kompetitiv gehemmt. Daher werden keine AKAPs präzipitiert und AKAP18delta kann in dieser Probe folglich nicht nachgewiesen werden. Als Positivkontrolle wurde rekombinant hergestelltes AKAP18delta verwendet. B. Zur Detektion von AKAPs in den Lysaten und cAMP-Agarose-Präzipitaten wurde ein RII overlay durchgeführt (Henn et al . , JBC 279, 26654, 2004). Als Positivkontrolle wurde rekombinant hergestelltes AKAP18delta detektiert. AKAP18delta ist in A. und B. durch Pfeile angezeigt.
Fig. 23:
Die niedermolekulare Substanz 18882 hemmt die Interaktion von AKAPlδdelta mit regulatorischen Rllalpha- Untereinheiten der PKA in Kardiomyozyten. Die Substanz 990 hat dagegen keinen Einfluss auf diese Wechselwirkung. Die Substanzen (s. Tab. A, B und D) wurden durch das Durchmustern einer 20064 Verbindungen umfassenden Substanzbibliothek mittels des in Fig. 17 dargestellten ELI- SA-basierten Versuchsaufbaus identifiziert. Primär kulti- vierte neonatale Kardiomyozyten blieben unbehandelt (Kontrolle) , wurden mit den Substanzen 990, 18882 (jeweils 100 μM) oder als Negativkontrolle mit cAMP für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und einer cAMP-Agarose-Präzipitation unterzogen (Henn et al . , JBC 279, 26654, 2004) . A. AKAP18delta wurde in den Lysaten und den cAMP-Agarose-Präzipitaten (cAMP-Agarose) mittels des anti-AKAP18delta spezifischen Antikörpers A18delta4 im Western Blot detektiert (Henn et al . , JBC 279, 26654, 2004) . Als Negativkontrolle wurde cAMP in den Ansatz gegeben. Dadurch wird die Bindung von regulatorischen Untereinheiten der PKA an die cAMP-Agarose kompetitiv ge- hemmt. Dadurch werden keine AKAPs präzipitiert und A- KAPlδdelta kann in dieser Probe nicht nachgewiesen werden. Als Positivkontrolle wurde rekombinant hergestelltes AKAPlδdelta verwendet. B. In den gleichen Proben wie in A angegeben wurden regulatorische Rllbeta-Untereinheiten der PKA mittels Western Blot detektiert. In der Probe, die cAMP enthält wird erwartungsgemäß kein Rllbeta detektiert (s. A.). Der Antikörper erkennt erwartungsgemäß nicht AKAP18delta. C. Zur nicht-selektiven Detektion von AKAPs in den Lysaten und cAMP-Agarose-Präzipitaten wurde ein RII overlay durchgeführt (Henn et al., JBC 279,
26654, 2004) . Als Positivkontrolle wurde rekombinant hergestelltes AKAPlδdelta detektiert.
Fig. 24: Hemmung von L-Typ-Ca2+-Kanalstömen durch die Substanz
18882. L-Typ-Ca2+—Kanalströme wurden mittels der patch- clamp-Technik in neonatalen Kardiomyozyten der Ratte gemessen. Die Zellen wurden bei -70 mV gehalten und wiederholt auf ein Testpotential von 0 mV depolarisiert (nach 400 ms Anstieg auf -35 mV) . Obere Abb. : Die Substanzen 18882 (s. Tab. A und B) und das Lösungsmittel DMSO als Kontrolle wurden in den angegebenen Konzentrationen zu den Zellen gegeben. Untere Abb.: Die Substanzen 990 und das 990-Derivat SM61 (s. Tab. C) wurden in den angegebe- nen Konzentrationen zu den Zellen gegeben. Ströme wurden 400 s nach Establierung der Ganzzellkonfiguration gemessen. Die Zellen wurden mit Isoproterenol (1 μM, ISO; be- ta-Rezeptoragonist) zu den angegebenen Zeiten stimuliert. Isoproterenol wurde durch das ES-Medium ausgewaschen. Die Abb. zeigt Zeitverläufe der normalisierten Ströme (norma- lized current; n entspricht der Anzahl gemessener Zellen, die Fehlerbalken sind means + SEM) .
Tabellen A, B, C und D stellen folgende Sachverhalte dar:
Tabelle A Niedermolekulare Substanzen, die die Interaktion von A- KAP18delta mit regulatorischen Rllalpha-Untereinheiten der PKA hemmen. Die Tabelle zeigt 142 Substanzen, die die Interaktion um mindestens 40 % hemmen. Bindung (in %) , dieser Wert gibt die relative Bindung von GST-AKAP18delta an PKA-RIIalpha in Gegenwart der jeweiligen Substanz in Prozent bezogen auf die Kontrolle (Bindung von GST- AKAP18delta an PKA-RIIalpha in Abwesenheit von Substanz) an. Die Substanzen wurden durch das Durchmustern einer 20064 Verbindungen umfassenden Substanzbibliothek mittels des in Fig. 17 dargestellten ELISA-basierten Versuchsaufbaus identifiziert. Strukturen der Substanzen sind dargestellt. Die Substanzen sind entsprechend ihrer inhibitorischen Wirkung sortiert. Die Liste beginnt mit den Substanzen, die die Interaktion von AKAPlδdelta mit regula- torischen Rlla-Untereinheiten der PKA am potentesten hemmen.
MW (in g/mol) , dieser Wert gibt die molekulare Masse der Substanz an. Die molekulare Masse stellt auch eine Annäherung der räumlichen Ausdehnung der Substanz dar, die für die biologische Verfügbarkeit wichtig ist (kleine Moleküle passieren leichter zelluläre Membranen) . Comp_ID, diese Nummern stellen die durchlaufende Substanz- Kodierung des Leibniz-Instituts für Molekulare Pharmakologie dar (insgesamt 20064) . Plate ID, Nummer der Sub¬ stanzbibliothek-Platte, in der die Substanz aufbewahrt wurde; Pos-ID, Position in der Substanzbibliothek-Platte, in der die Substanz aufbewahrt wurde. Formula, die hier genannten SummenformeIn geben die Zusammensetzung der Substanzen aus den Elementen an. logP, dieser Wert ist der berechnete Logarithmus des Verteilungskoeffizienten der Substanz. Er ermöglicht eine Abschätzung der Löslich- keit der Substanz in polaren (wässrigen) bzw. unpolaren
(membranären (Lipid-) ) Phasen und liefert daher eine erste Aussage über die biologische Verfügbarkeit in zellulären Systemen. logSw, dieser Wert ist der berechnete Logarithmus des Löslichkeitskoeffizienten, der eine Aussage über die Löslichkeit der Substanz in Wasser macht. H_acceptor, gibt die Anzahl der Wasserstoffbrücken- Akzeptoren (N- und O-Atome) in der Substanz an. H_donor, gibt die Anzahl der Wasserstoffbrücken-Donatoren (NH- und OH-Gruppen) in der Substanz an. Wasserstoffbrückenbindun- gen sind die wichtigste Art der nichtkovalenten Bindung zwischen kleinen Molekülen und Proteinen; daher begünstigen Wasserstoffbrücken-Donatoren und -Akzeptoren das Potenzial der Substanzen für Wechselwirkungen mit Proteinen. B_rotN, dieser Wert entspricht der Anzahl an Atom- bindungen in der Substanz, um die freie Drehbarkeit herrscht. Eine höhere Anzahl solcher Bindungen erhöht die konformationelle Flexibilität der Substanz und damit die Wahrscheinlichkeit der passgenauen Bindung an eine Proteinoberfläche. Zusammengenommen ermöglichen diese Angaben Vorhersagen über die Bioverfügbarkeit von chemischen Substanzen, wie von Lipinski et al. gezeigt wurde (Lipinski, C. A., Lom- bardo, F., Dominy, B. W. & Feeney, P. J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and per- meability in drug discovery and development settings . Adv. Drug Deliv. Rev. 46, 3-26 (2001).); dazu sollten Substanzen die sog. „rule of five" erfüllen:
■ maximal fünf H-Brücken-Donatoren (= Summe der OH- und NH-Gruppen)
■ maximal zehn H-Brücken-Akzeptoren (Summe der N- und O-Atome) ■ Molekulargewicht max. 500 g/mol
■ Verteilungskoeffizient log P <= 5
Tabelle B
Ausgewählte niedermolekulare Substanzen, die die Interak- tion von AKAP18delta mit regulatorischen Rllalpha Untereinheiten der PKA hemmen. Die Tabelle zeigt 9 Substanzen aus Tabelle A, die die Interaktion um mindestens 80 % hemmen. Bindung (in %), dieser Wert gibt die relative Bindung von GST-AKAP18delta an PKA-RIIalpha in Gegenwart der jeweiligen Substanz in Prozent bezogen auf die Kontrolle (Bindung von GST-AKAPl8delta an PKA-RIIalpha in Abwesenheit von Substanz) an. Der IC50-Wert wurde durch Titration der jeweiligen Substanz bestimmt. Die IC50 für die Hemmung der Interaktion wurde in dem in Fig 17 be- schriebenen ELISA-Experiment bestimmt. MW (in g/mol) , dieser Wert gibt die molekulare Masse der Substanz an. Die molekulare Masse stellt auch eine Annäherung der räumlichen Ausdehnung der Substanz dar, die für die biologische Verfügbarkeit wichtig ist (kleine Moleküle pas- sieren leichter zelluläre Membranen) . Comp_ID, diese Nummern stellen die durchlaufende Substanz-Kodierung des Leibniz-Instituts für Molekulare Pharmakologie dar (ins- gesamt 20064) . Plate ID, Nummer der Substanzbibliothek- Platte, in der die Substanz aufbewahrt wurde; Pos-ID, Position in der Substanzbibliothek-Platte, in der die Substanz aufbewahrt wurde. Formula, die hier genannten Surα- menformeln geben die Zusammensetzung der Substanzen aus den Elementen an. logP, dieser Wert ist der berechnete Logarithmus des Verteilungskoeffizienten der Substanz. Er ermöglicht eine Abschätzung der Löslichkeit der Substanz in polaren (wässrigen) bzw. unpolaren (membranären (Li- pid-) ) Phasen und liefert daher eine erste Aussage über die biologische Verfügbarkeit in zellulären Systemen. logSw, dieser Wert ist der berechnete Logarithmus des Löslichkeitskoeffizienten, der eine Aussage über die Löslichkeit der Substanz in Wasser macht. H_acceptor, gibt die Anzahl der Wasserstoffbrücken-Akzeptoren (N- und O- Atome) in der Substanz an. H_donor, gibt die Anzahl der Wasserstoffbrücken-Donatoren (NH- und OH-Gruppen) in der Substanz an. Wasserstoffbrückenbindungen sind die wichtigste Art der nichtkovalenten Bindung zwischen kleinen Molekülen und Proteinen; daher begünstigen Wasserstoffbrücken-Donatoren und -Akzeptoren das Potenzial der Substanzen für Wechselwirkungen mit Proteinen. B_rotN, dieser Wert entspricht der Anzahl an Atombindungen in der Substanz, um die freie Drehbarkeit herrscht. Eine höhere Anzahl solcher Bindungen erhöht die konformationelle Flexibilität der Substanz und damit die Wahrscheinlichkeit der passgenauen Bindung an eine Proteinoberfläche.
Tabelle C Niedermolekulare Substanzen, die die Interaktion von A- KAPlδdelta mit regulatorischen Rllalpha-Untereinheiten der PKA modulieren. Die Substanzen repräsentieren Deriva- te der in Tabellen A und B dargestellten Substanz 990, die durch chemische Modifikation aus der Substanz 990 entwickelt wurden. Die Strukturen, ihre chemische Summen- formeln (Formula) , ihr Molekulargewicht (MW) sowie der logP-Wert, die Zahl der H-Acceptor und H-Donatoren jeder Substanz sind dargestellt. (Erläuterungen zu diesen Parametern in den Legenden zu Tab. A und B.) Die inhibitorische Wirkung jeder Substanz auf die Interaktion von A- KAP18delta mit regulatorischen Rllalpha-Untereinheiten der PKA wurde bis zu dreimal (Screening no. 1-3) in dem in Fig. 17 abgebildeten ELISA-Experiment überprüft und daraus die IC50 (mean in μM) bestimmt. Das Verhältnis der IC50 des Derivates und der Substanz 990 wurde berechnet (Ratio IC50 (comp. /990). Werte > 1 spiegeln eine größere und Werte < 1 eine geringere Hemmung der Interaktion gegenüber der Ursprungssubstanz wider. Mean IC50 gibt die aus den durchgeführten Experimenten berechnete und in Bezug auf den mittleren IC50 von 990 normalisierte, durchschnittliche IC50 an. Bei Substanzen, die keine Hemmung zeigten, wurde ein „-" eingetragen.
Tabelle D
Niedermolekulare Substanzen SM-FP und 990, die die Interaktion von AKAPl8delta mit regulatorischen Rllalpha- Untereinheiten der PKA hemmen. Die Substanz SM-FP repräsentiert ein Derivat der in Tabellen A und B dargestellten Substanz 990. SM-FP zeichnet sich durch die Anwesenheit einer Fluoreszeingruppe aus. Die Strukturen, ihre chemische Formeln (Formula) , ihr Molekulargewicht (MW) sowie der logP-Wert, die Zahl der H-Acceptor und H- Donatoren jeder Substanz sind dargestellt. (Erläuterungen zu diesen Parametern in den Legenden zu Tab. A und B.) Die inhibitorische Wirkung jeder Substanz auf die Inter- aktion von AKAP18delta mit regulatorischen Rllalpha- Untereinheiten der PKA wurde bis zu dreimal (Screening no. 1-3) in dem in Fig. 17 abgebildeten ELISA-Experiment überprüft und daraus die IC50 (mean in μM) bestimmt. Das Verhältnis der IC50 des Derivates und der Substanz 990 wurde berechnet (Ratio IC50 (comp. /990). Werte > 1 spiegeln eine größere und Werte < 1 eine geringere Hemmung der Interaktion gegenüber der ürsprungssubstanz wider. Mean IC50 gibt die aus den durchgeführten Experimenten berechnete und in Bezug auf den mittleren IC50 von 990 normalisierte, durchschnittliche IC50 an. Bei Substanzen, die keine Hemmung zeigten, wurde ein „-" eingetragen.

Claims

Patentansprüche
1. Nicht-peptidische Proteinkinase A / Proteinkinase A- Ankerprotein-Entkoppler gemäß Tabelle A.
2. Nicht-peptidische Proteinkinase A / Proteinkinase A- Ankerprotein-Entkoppler mit einem Molekulargewicht im Bereich von 150 bis 600 g/mol, bevorzugt von 190 bis 300 g/mol, einem Verteilungskoeffizient von logP ≤ 10, bevorzugt ≤ 8, mit maximal 10 Wasserstoff- Brücken-Donatoren und maximal 10 Wasserstoff- Brücken-Akzeptoren, einem Löslichkeitswert von logSw -400 bis 0 und einem BrotN-Wert von 0 bis 7.
3. Entkoppler nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie maximal 7, bevorzugt 6 H-Brücken-Donatoren, maximal 6, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 4 Wasser- stoff-Brücken-Akzeptoren aufweisen und/oder einen logP-Wert von ≥ 1 bis ≤ 8, bevorzugt ≥ 1 bis ≤ 5.
4. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Wechselwirkung von AKAP und PKA-
Untereinheiten um mindestens 40%, bevorzugt um mindestens 80% hemmen.
5. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ausgewählt aus der Tabelle B.
6. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ausgewählt aus der Tabelle C.
7. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ausgewählt aus der Tabelle D.
8. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche gemäß der allgemeinen Formel I, die durch Mesomerie ineinander überführbar sind (R2 und R3 werden als austauschbar behandelt)
Figure imgf000139_0001
wobei X ein Nicht-Wasserstoffatom ist, vorzugsweise ein Schwefelatom,
wobei R1 ein Alkyl- oder Arylrest ist, vorzugsweise ein 1-Naphthylmethylrest,
wobei R2 und R3 ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl- oder Arylrest sind, vorzugsweise sind R2 und R3 zwei Wasserstoffatome, zwei Methylreste, ein Benzylrest und ein Methylrest oder ein Benyzlrest und ein tert- Butylrest,
besonders bevorzugt sind R2 und R3 ein 2- Thiazolidinylrest und ein Methyl oder tert-
Butylrest, sowie ein 1-Naphthylrest und ein Isopro- pyl-, Cyclohexyl-, Benzyl- oder Methylrest; oder a- ber gemäß der allgemeinen Formel II
Figure imgf000140_0001
( Rotation um Einfachbindung^
1 2 3 4 5
wobei X, R1, R2 und R3 die gleiche Bedeutung wie bei Formel .1 haben.
9. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Struktur gemäß Fig. 19 umfassen.
10. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Struktur gemäß Fig. 20 umfassen.
11. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungen von AKAP18-Proteinen, bevorzugt A- KAPlδdelta-Proteinen und/oder RI alpha und/oder RII- alpha und/oder RIbeta und/oder Rllbeta inhibiert werden.
12. Entkoppler nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und/oder zur Verwendung von Diagnoseverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden.
13. Pharmazeutisches Mittel umfassend mindestens einen Entkoppler nach einem der Ansprüche 1 bis 12, zusätzlich umfassend mindestens einen pharmazeutischen Träger und/oder Hilfsstoffe.
14. Pharmazeutisches Mittel nach dem vorhergehenden An- spruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Füllmittel, Sprengmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Streckmittel, Lösungsverzögerer, Resorpti- onsbeschleuniger, Netzmittel, Adsorptionsmittel und/oder Gleitmittel.
15. Pharmazeutisches Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kapsel, eine Tablette, ein Dragee, ein Zäpfchen, eine Salbe, eine Creme, ein Pflaster, eine Injektionslösung und/oder eine Infusionslösung ist.
16. Erkennungsmolekül gerichtet gegen den Entkoppler gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Erkennungsmolekül ein Antikörper, ein Komplexbildner und/oder ein Chelator ist.
17. Kit umfassend einen Entkoppler nach einem der Ansprüche 1 bis 12, ein pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 13 bis 15 und/oder ein Erken- nungsmolekül nach Anspruch 16, gegebenenfalls zusammen mit einer Information über die Kombination und/oder Handhabung der Bestandteile des Kits.
18. Verwendung des Entkopplers und/oder des pharmazeutischen Mittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche und/oder des Erkennungsmoleküls nach Anspruch 16 zur Modifikation, insbesondere einer Inhibition einer AKAP-PKA-Interaktion.
19. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation der Interaktion in einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielor- ganismus durchgeführt werden.
20. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Modifikation der Interaktion, die Vasopres- sin-induzierte Umverteilung von AQP2 modifiziert wird, insbesondere verhindert wird.
21. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion von RIalpha-, Rllalpha-, Rlbeta- und/oder Rllbeta-Üntereinheiten der PKA mit AKAP modifiziert, insbesondere inhibiert wird.
22. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel nach Anspruch 1 bis 17 spezifisch an A- KAP, bevorzugt AKAP18, besonders bevorzugt A- KAPlδdelta und/oder spezifisch and PKA, bevorzugt Untereinheiten dieser, ganz besonders bevorzugt an RII-Untereinheiten binden.
23. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Untereinheiten humanen und/oder murinen Ursprungs sind und/oder aus Ratten gewonnen werden.
24. Verwendung des Entkopplers oder des pharmazeutischen Mittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche in vitro oder in vivo zur Beeinflussung von einer bevorzugt kompartimentalisierten cAMP-abhängigen Signaltransduktion .
25. Verwendung des Entkopplers oder pharmazeutischen
Mittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikamentes für die Prophylaxe oder Behandlung von Krankheiten, die mit Defekten einer kompartimentalisierten cAMP-abhängigen
Signaltransduktion assoziiert sind, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Asthma jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Asthma aus der Gruppe atopisches Asthma, nichtatopisches Asthma, allergisches Asthma, IgE-venmitteltes atopisches Asthma, Bronchialasthma, essentielles Asthma, Primärasthma, durch pathophysiologische Störungen hervorgerufenes endogenes Asthma, durch Umweltfaktoren hervorgerufenes exogenes Asthma, essentielles Asthma unbekannter o- der inapparenter Ursache, nichtatopisches Asthma, bronchitisches Asthma, emphysematöses Asthma, durch Belastung induziertes Asthma, Berufsasthma, durch Bakterien-, Pilz-, Protozoen- oder Virusinfektion hervorgerufenes infektallergisches Asthma, nichtallergisches Asthma, inzipientes Asthma, "wheezy in- fant Syndrome"; chronische oder akute Bronchokonstriktion, chronische Bronchitis, Obstruktion der kleinen Atemwege sowie Emphysem; obstruktive oder entzündliche Atemwegserkrankung jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder eine obstruktive oder entzündliche Atemwegserkrankung aus der Gruppe Asthma; Staublunge, chronische eosinophile Pneumonie; chronischer obstruktive pulmonaler Krankheit (COPD) ; COPD inklusive chronische Bronchitis, Lungenemphysem oder damit assoziierte Atemnot, durch irreversible, fortschreitende Obstruktion der Atemwege gekennzeichnete COPD, Schocklunge (adult respiratory distress Syndrome, ARDS) sowie Verschärfung der Überempfindlichkeit der Atemwege aufgrund Therapie mit anderen Arzneistoffen; Staublunge jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Staublunge aus der Gruppe Aluminose oder Aluminiumstaublunge, Anthrakose (-Asthma) , Asbestose oder AsbestStaublunge, Chalikose oder Kalkstaublunge, durch Einatmen von Straußenfedernstaub verur- sachte Ptilose, durch Einatmung von Eisenteilchen verursachte Siderose, Silikose oder Steinstaublunge,
Byssinose oder Baumwollstaubpneumokoniose sowie
Talk-pneumokoniose;
Bronchitis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogene- se, oder Bronchitis aus der Gruppe akute Bronchitis, akute laryngotracheale Bronchitis, durch Erdnüsse ausgelöste Bronchitis, Bronchialkatarrh, kruppöse Bronchitis, Bronchitis ohne Auswurf, infektiöse Asthmabronchitis, Bronchitis mit Auswurf, Staphylokokken- oder Streptokokkenbronchitis; sowie Vesiku- lärbronchitis ; Bronchiektasie jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Bronchiektasie aus der Gruppe zylindrische Bronchiektasie, sackförmige Bronchiektasie, spindelförmige Bronchiektasie, Bronchiolendilatati- on, zystische Bronchiektasie, Bronchiektasie ohne Auswurf, sowie follikuläre Bronchiektasie; jahreszeitlich bedingte allergische Rhinitis, perenniale allergische Rhinitis, oder Sinusitis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Sinusitis aus der Gruppe eitriger oder nichteitriger Sinusitis, akute oder chronische Sinusitis, Ethmoiditis, Stirnhöhlenentzündung, Kieferhöhlenentzündung oder Sphe- noiditis; rheumatoide Arthritis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder rheumatoide Arthritis aus der Gruppe akute Arthritis, akute Gichtarthritis, primär-chronische Polyarthritis, Osteoarthrose, Infektarthritis, Lyme-Arthritis, progrediente Arthritis, Arthritis psoriatica, sowie Spondylarthritis; Gicht sowie mit Entzündung assoziiertes Fieber bzw. mit Entzündung assoziierter Schmerz; eine mit Eosinophilen in Zusammenhang stehende krankhafte Störung jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder eine mit Eosinophilen in Zusammenhang stehende krankhafte Störung aus der Gruppe Eo- sinophilie, eosinophiles Lungeninfiltrat, Löffler-
Syndrom, chronische eosinophile Pneumonie, tropische Lungeneosinophilie, bronchopneumonische Aspergillo- se, Aspergillen, eosinophiles Granulom, allergische granulomatöse Angiitis bzw. Churg-Strauss-Syndrom, Polyarteriitis nodosa (PAN), sowie systemische Vascu- litis necroticans; atopische Dermatitis, allergische Dermatitis, oder allergisches oder atopisches Ekzem;
Nesselsucht jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Nesselsucht aus der Gruppe immunbedingte Nesselsucht, Komplementbedingte Nesselsucht, durch Nesselsucht auslösendes Material induzierte Nesselsucht, durch physikalische Reize ausgelöste Nesselsucht, durch Stress ausgelöste Nesselsucht, idiopa- tische Nesselsucht, akute Nesselsucht, chronische Nesselsucht, angioneurotisches Ödem, Urticaria cho- linergica, Kälteurtikaria in ihrer autosomal- dominanten Form oder in ihrer erworbenen Form, Kon- takturtikaria, Urticaria gigantean sowie Papelurtikaria; Konjunktivitis jeglicher Art, Ätiologie oder Patho- genese, oder Konjunktivitis aus der Gruppe Conjunctivitis actinica, akute katarrhalische Konjunktivitis, akute contagiöse Konjunktivitis, allergische Konjunktivitis, atopische Konjunktivitis, chronische katarrhalische Konjunktivitis, eitrige Konjunktivi- tis sowie Frühjahrskonjunktivitis;
Uveitis jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese oder Uveitis aus der Gruppe Entzündung der ganzen Uvea oder eines Teils davon, Uveitis anterior, Iritis, Cyclitis, Iridocyclitis, granulomatöse Uveitis, nichtgranulomatöse Uveitis, phakoantigene Uveitis, Uveitis posterior, Choroiditis sowie Choriorethini- tis; Schuppenflechte; multiple Sklerose jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder multiple Sklerose aus der Gruppe primär progrediente multiple Sklerose sowie multiple Sklerose mit schubweisem Verlauf und Neigung zu Remissionen;
Autoimmun-/EntZündungserkrankungen jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder eine Autoimmun- /Entzündungserkrankung aus der Gruppe autoimmunhäma- tologische Störungen, hämolytische Anämie, aplasti- sche Anämie, aregenerative Anämie, idiopatische thrombozytopene Purpura, systemischer Lupus erythematosus, Polychondritis, Skleroderm, Wegener- Granulomatose, Lichtkrankheit, chronisch-aktive He- patitis, Myasthenia gravis, Stevens-Johnson-Syndrom, idiopathische Sprue, Autoimmun-
Reizkolonerkrankungen, Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, endokrine Opthamopathy, Basedow-Krankheit, Sarkoidose, Alveolitis, chronische Hypersensitivi- tätspneumonitis, primär biliäre Zirrhose, Insulinmangeldiabetes oder Typ 1 Diabetes mellitus, Uveitis anterior, granulomatöse Uveitis oder Uveitis posterior, Keratoconjunctivitis sicca, Keratoconjunctivitis epidemica, (diffuse) interstitielle Lungenfibro- se, Lungenzirrhose, Mukoviszidose, Arthritis psoriatica, Glomerulonephritis mit und ohne Nephrose, akute Glomerulonephritis, idiopathische Nephrose, Mini- mal-Change-Nephropathie, entzündli- che/hyperproliferative Hauterkrankungen, Schuppen- flechte, atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis, allergische Kontaktdermatitis, familiärer gutartiger Pemphigus, Pemphigus erythematosus, Pemphigus foliaceus sowie Pemphigus vulgaris;
Vorbeugung einer Fremdtransplantatabstoßung nach Organtransplantation, Reizdarm (inflammatory bowel disease, IBD) jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder Reizdarm aus der Gruppe ulzerative Kolitis (UC) , kollagenöse Kolitis, Colitis polyposa, transmurale Kolitis sowie Morbus Crohn (CD) ; septischer Schock jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder septischer Schock aus der Gruppe Nierenversagen, akutes Nierenversagen, Kachexie, Ma- lariakachexie, hypophysäre Kachexie, uremämische Kachexie, Herzkachexie, Cachexia suprarenalis bzw. Ad- dison-Krankheit, karzinomatöse Kachexie sowie Kachexie auf Grund von Infektion durch Human Immunodeficiency Virus (HIV) ; LeberSchädigung; pulmonaler Hochdruck sowie durch Sauerstoffmangel hervorgerufener pulmonaler Hochdruck;
Knochenschwunderkrankungen, primäre Osteoporose und sekundäre Osteoporose; krankhafte Störungen des Zentralnervensystems jeglicher Art, Ätiologie oder Pathogenese, oder eine krankhafte Störung des Zentralnervensystems aus der Gruppe Depression, Morbus Parkinson, Lern- und Gedächtnisstörungen, tardive Dyskinesie, Drogenabhängigkeit, arteriosklerotische Demenz, sowie Demenz als Begleiterscheinung von Chorea Huntington, Morbus Wilson, Paralysis agitans sowie Thalamusatrophien; Infektionen, insbesondere Virusinfektionen, wobei diese Viren die Produktion von TNF-α in ihrem Wirt erhöhen oder wobei diese Viren gegenüber Hinaufregulierung von TNF-α in ihrem Wirf, empfindlich sind, so dass ihre Replikation oder andere wichtigen Aktivitäten behindert werden, darunter Viren aus der Gruppe HIV-I, HIV-2 und HIV-3, Zytomegalievirus, CMV; Grippe, Adenoviren und Herpesviren, darunter Herpes zoster und Herpes simplex; Hefe- und Pilzinfektionen, wobei diese Hefen und Pilze gegenüber Hinaufregulierung durch TNF-α emp- findlich sind oder die TNF-α-Produktion in ihrem
Wirt auslösen, bevorzugt Pilzmeningitis, insbesondere bei gemeinsamer Verabreichung mit anderen Arzneistoffen der Wahl zur Behandlung systemischer Hefe- und Pilzinfektionen, darunter den Polymycinen, be- vorzugt Polymycin B, Imidazolen, bevorzugt Clotrimazol, Econazol, Miconazol und/oder Ketoconazol, den Triazolen, bevorzugt Fluconazol und/oder Itranazol, sowie den Amphotericinen, bevorzugt Amphotericin B und/oder liposomales Amphotericin B.
26. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutische Mittel gemäß einem der Ansprüche 13 - 15 als Gel, Puder, Pulver, Tablette, Retard- Tablette, Premix, Emulsion, Aufgussformulierung,
Tropfen, Konzentrat, Granulat, Sirup, Pellet, BoIi, Kapsel, Aerosol, Spray und/oder Inhalat zubereitet und angewendet wird.
27. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass ein pharmazeutisches Mittel gemäß einem der Ansprüche 13 - 15 in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5, bevorzugt von 0,5 bis 95,0, besonders bevorzugt von 20,0 bis 80,0 Gew.-% in einer Zubereitung vorliegt.
28. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung oral, subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal und/oder topisch gesetzt wird.
29. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein pharmazeutisches Mittel gemäß einem der Ansprü- che 13 - 15 in Gesamtmengen von 0,05 bis 500 mg pro kg, bevorzugt von 5 bis 100 mg pro kg Körpergewicht, je 24 Stunden eingesetzt wird.
30. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein pharmazeutisches Mittel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 mit einem Organismus, bevorzugt einem Menschen oder einem Tier, in Kontakt gebracht werden.
31. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Kontakt-Bringen oral, über Injektion, topisch, vaginal, rektal und/oder nasal erfolgt.
32. Verwendung des Entkopplers oder des pharmazeutischen Mittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikamentes für die Prophylaxe oder Behandlung von Asthma, Hypertonie, koronaren Herzkrankheiten, Hypertrophie des Herzens, Ulcus du- odeni, Herzinsuffizienz, Leberzirrhose, Schizophre- nie, AIDS, Diabetes mellitus, Diabetes insipidus,
Adipositas, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung und/oder Ödemen.
33. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche als Aquaretika, als Kontrazeptiva, als antiinfektiöses Mittel, als anxiolytisches Mittel und/oder als Antitumormittel .
34. Organismus umfassend den Entkoppler gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 und/oder das Erkennungsmolekül gemäß Anspruch 16.
35. Organismus nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus, vorzugsweise durch das Vorhandensein des Erkennungsmoleküls, eine Krankheit ausgewählt aus der Gruppe umfassend Asthma, Hypertonie, Hypertrophie des Herzens, koronare Herzkrankheiten, Ulcus duodeni, Herzinsuffizienz, Leberzirrhose, Schizo- phrenie, AIDS, Diabetes mellitus, Diabetes insipidus, Adipositas, Krebs, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Lernschwierigkeiten und/oder Ödeme aufweist .
36. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus nach Anspruch 28 als Modell für die gewebs- und/oder zellspezifischen AKAP-PKA- Interaktion verwendet wird, insbesondere als Modell für Diabetes insipidus, Diabetes mellitus, Adiposi- tas, Ödeme, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen, AIDS, Schizophrenie, Leberzirrhose, Herzinsuffizienz, koronare Herzkrankheiten, Hypertrophie des Herzens, Verbesserung des Lernens, Hypertonie, Ulcus duodeni und/oder Asthma.
37. Verfahren zur Modifikation, bevorzugt einer Inhibition einer AKAP-PKA-Interaktion umfassend die Schritte
(a) Bereitstellung eines Entkopplers nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und/oder eines Erkennungsmoleküls nach Anspruch 16 und
(b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnis- ses gemäß (a) mit einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus .
38. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation an einer regulatorischen RII- Untereinheit der PKA erfolgt.
39. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die RII-Untereinheiten Rllalpha- und/oder Rllbeta- üntereinheiten sind.
40. Verwendung der Entkoppler gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 als Leitstrukturen zur Entwicklung von pharmazeutischen Mitteln, insbesondere mittels kom- binatorischem und/oder strukturbasiertem Wirkstoffdesign.
41. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln, welches die folgenden Schritte umfasst:
(a) Bereitstellung eines Entkopplers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 als eine Leitstruktur,
(b) chemische Modifikation der Leitstruktur, be- vorzugt mittels eines kombinatorischen und/oder strukturbasierten Wirkstoffdesigns, wobei Substanzen gewonnen werden und ggf.
(c) Testung der Substanzen auf ihre Fähigkeit der Beeinflussung der AKAP-PKA-Wechselwirkung und
Auswahl geeigneter Substanzen als pharmazeutische Mittel.
42. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch umfassend die Formulierung der Substanz in einer pharmazeutisch akzeptablen Form.
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281 ,137 3502 10 N22 22,33 1,7106 -4,86333
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260,34 19588 56 D16 24,43 4,185 -5,6794
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181,238 18803 54 C11 24,88 2,84 -4,00302
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298,273 14617 42 113 43,50 2,7939 -4,91081
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185,226 14542 42 N08 45,52 2,6414 -3,17019
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166,224 4712 14 H10 45,55 1,6398 -1,406
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