DE60204232T2

DE60204232T2 - Antagonisten für calciumkanäle vom n-typ zur behandlung von schmerzen

Info

Publication number: DE60204232T2
Application number: DE60204232T
Authority: DE
Inventors: Derin D'amico
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2001-08-27
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2022-08-24
Also published as: EP1430030A1; SE0102858D0; JP2005508894A; US7153865B2; DE60204232D1; EP1430030B1; ATE295837T1; US20050131020A1; WO2003018561A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft substituierte Chinolinverbindungen, Verfahren zur Herstellung derartiger Verbindungen und Verfahren zur Verwendung derartiger Verbindungen zur Behandlung oder Prävention von Schmerzen oder Nozizeption.
Stand der Technik
Schmerz verursacht viel Leid und ist eine Sinneswahrnehmung, die sich von Berührungs-, Druck-, Wärme- und Kälteempfindungen unterscheidet. Er wird von Betroffenen häufig mit Begriffen wie hell, dumpf, pochend, stechend, schneidend oder brennend beschrieben und umfaßt nach allgemeiner Auffassung sowohl die ursprüngliche Empfindung als auch die Reaktion auf diese Empfindung. Diese Palette von Empfindungen sowie die Variation der Wahrnehmung von Schmerz bei verschiedenen Individuen erschwert eine genaue Definition von Schmerzen. Schmerz, der durch Stimulation von nozizeptiven Rezeptoren „verursacht" und über intakte Nervenbahnen übertragen wird, wird als nozizeptiver Schmerz bezeichnet. Schmerz kann auch durch Schädigung von Neuralstrukturen verursacht werden und manifestiert sich häufig als neurale Überempfindlichkeit; diese Art von Schmerz wird als neuropathischer Schmerz bezeichnet.
Das Stimulationsniveau, bei dem Schmerz wahrgenommen wird, wird als „Schmerzschwelle" bezeichnet. Bei Anhebung der Schmerzschwelle, beispielsweise durch Verabreichung eines Analgetikums, ist eine größere Intensität oder ein längerer Stimulus erforderlich, bevor Schmerz empfunden wird. Analgetika sind eine Klasse von Pharmazeutika, die nach Verabreichung an einen Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf, Schmerzen ohne Bewußtseinsverlust lindern. Dies steht in Kontrast zu anderen schmerzlindernden Arzneistoffen, beispielsweise Narkotika, die Schmerzen durch Hervorrufung einer Bewußtseinslücke dämpfen, oder Lokalanästhetika, die die Übertragung in peripheren Nervenfasern blockieren und dadurch Schmerzen verhindern.
Es wurde berichtet, daß Tachykinin-Antagonisten eine Antinozizeption bei Tieren induzieren, von der angenommen wird, daß sie der Analgesie beim Menschen analog ist (für eine Übersicht siehe Maggi et al., J. Auton. Pharmacol. (1993) 13, 23–93). Insbesondere wurde gezeigt, daß nichtpeptidische NK-1-Rezeptorantagonisten eine derartige Analgesie hervorrufen; so erzeugte beispielsweise der NK-1-Rezeptorantagonist RP 67,580 bei klassischen Chemonozizeptionstests (Phenylbenzochinon-induzierte Krümmung und Formalintest) eine Analgesie mit einer Stärke, die mit der von Morphin vergleichbar ist (Garret et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10208–10212 (1993)). In der US-PS 4,357,333 werden analgetisch wirkende N-substituierte Chinolylbenzamide beschrieben, und in der internationalen Patentanmeldung WO 00/64877 werden 2-Aminochinolincarbonsäureamide beschrieben, die zur Verwendung bei der Behandlung des Zentralnervensystems und peripheren Störungen geeignet sind.
Opioid-Analgetika sind eine gut etablierte Klasse von Analgetika. Zu diesen Verbindungen gehören nach allgemeiner Auffassung in allgemeinem Sinne alle natürlichen oder synthetischen Arzneistoffe mit morphinartigen Wirkungen. Die synthetischen und halbsynthetischen Opioid-Analgetika sind Derivate von fünf chemischen Verbindungsklassen: Phenanthrenen, Phenylheptylaminen, Phenylpiperidinen, Morphinanen und Benzomorphanen. Pharmakologisch haben diese Verbindungen verschiedene Wirkungen; so sind einige starke Agonisten an den Opioidrezeptoren (beispielsweise Morphin); andere sind mäßige bis schwache Agonisten (beispielsweise Codein); noch andere weisen gemischte Agonisten-Antagonisten-Aktivität auf (beispielsweise Nalbuphin); und wieder andere sind Partialagonisten (beispielsweise Nalorphin). Ein Opioid-Partialagonist wie Nalorphin (das N-Alkyl-Analogon von Morphin) antagonisiert zwar die analgetischen Wirkungen von Morphin, kann jedoch bei alleiniger Verabreichung an sich schon ein starkes Analgetikum sein. Von allen Opioid-Analgetika findet nach wie vor Morphin die umfangreichste Anwendung und ist eine geeignete Archetyp-Verbindung. Leider hat Morphin neben seinen wertvollen therapeutischen Eigenschaften auch eine Reihe von Nachteilen, u.a. Atemdepression, herabgesetzte gastrointestinale Motilität (die zu Verstopfung führt), und bei manchen Individuen kann Übelkeit und Erbrechen auftreten. Ein weiteres Merkmal ist die Entwicklung von Toleranz und physischer Abhängigkeit, die die klinische Verwendung derartiger Verbindungen einschränken können.
Die Hauptmethode zur Behandlung von rheumatoiden Erkrankungen und Arthritis sind gegenwärtig entzündungshemmende Verbindungen, die auf die Blockierung oder Verringerung der synovialen Entzündung gerichtet sind und dadurch die Funktion verbessern, und auf die Verringerung von Schmerz gerichtete Analgetika. Aspirin und andere Salicylatverbindungen werden häufig bei der Behandlung zur Unterbrechung der Amplifikation des Entzündungsprozesses verwendet und lindern vorübergehend den Schmerz. Andere Arzneistoffverbindungen, die für diese Zwecke verwendet werden, sind u.a. Phenylpropionsäure-Derivate, wie Ibuprofen und Naproxin, Sulindac, Phenylbutazon, Corticosteroide, Antimalariamittel, wie Chloroquin und Hydroxychloroquinsulfat, und Fenemate. Für eine umfassende Übersicht über die verschiedenen bei der Behandlung von rheumatischen Erkrankungen verwendeten Arzneistoffe sei auf J. Hosp. Pharm., 36:622 (Mai 1979), verwiesen.
Calciumkanäle sind membranüberspannende, mehrere Untereinheiten aufweisende Proteine, die den kontrollierten Eintritt von Ca⁺⁺-Ionen in Zellen aus der Extrazellularflüssigkeit ermöglichen. Derartige Kanäle finden sich im gesamten Tierreich und wurden in Bakterien-, Pilz- und Pflanzenzellen identifiziert. Üblicherweise sind Calciumkanäle spannungsabhängig. In derartigen Kanälen erlaubt die „Öffnung" einen anfänglichen Einstrom von Ca⁺⁺-Ionen in die Zellen, was die Potentialdifferenz zwischen dem Inneren der den Kanal tragenden Zelle und dem die Zelle umgebenden extrazellulären Medium verringert. Die Einstromrate von Ca⁺⁺-Ionen in die Zelle hängt von dieser Potentialdifferenz ab. Alle „erregbaren" Zellen in Tieren, wie Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS), periphere Nervenzellen und Muskelzellen einschließlich derjenigen von Skelettmuskeln, Herzmuskeln und glatten Venen- und Arterienmuskeln, weisen spannungsabhängige Calciumkanäle auf. Calciumkanäle sind physiologisch wichtig, da sie bei der Regulierung der intrazellulären C⁺⁺-Ionen-Konzentrationen eine zentrale Rolle spielen. Diese Konzentrationen sind für die Lebensfähigkeit und Funktion der Zelle von Bedeutung. So sind intrazelluläre Ca⁺⁺-Ionen-Konzentrationen an einer Reihe von lebenswichtigen Prozessen bei Tieren beteiligt, wie der Ausschüttung von Neurotransmittern, der Muskelkontraktion, der Schrittmacheraktivität und der Sekretion von Hormonen.
Es wird angenommen, daß Calciumkanäle bei bestimmten Krankheitszuständen relevant sind. Von einer Reihe von Verbindungen, die zur Verwendung bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen bei Tieren einschließich Menschen geeignet sind, wird angenommen, daß sie ihre vorteilhaften Wirkungen durch Modulation der Funktionen von spannungsabhängigen Calciumkanälen im glatten Herz- und/oder Gefäßmuskel ausüben. Viele dieser Verbindungen binden an Calciumkanäle und blockieren oder reduzieren die Rate des Einstroms von Ca⁺⁺-Ionen in die Zelle als Reaktion auf die Depolarisation der Zellmembran. Das Verständnis der Pharmakologie von Verbindungen, die mit Calciumkanälen in anderen Organsystemen, wie dem Zentralnervensystem, wechselwirken, und die Fähigkeit zum rationellen Design von Verbindungen, die mit diesen spezifischen Subtypen von humanen Calciumkanälen wechselwirken, um die gewünschten therapeutischen Wirkungen, z.B. bei der Behandlung von neurodegenerativen Störungen, zu erzielen, wurden dadurch erschwert, daß nicht unabhängig bestimmt werden konnte, wie viele verschiedene Typen von Calciumkanälen es gibt oder wie die einzelnen Subtypen, insbesondere im ZNS, molekular aufgebaut sind, und daß keine reinen Präparationen von spezifischen Kanalsubtypen, d.h. Systemen zur Beurteilung der Spezifizität von auf Calciumkanäle wirkenden Verbindungen, zur Verfügung standen.
Auf der Grundlage von elektrophysiologischen und pharmakologischen Studien verschiedener Säugetierzellen aus verschiedenen Geweben (z.B. Skelettmuskel, Herzmuskel, Lunge, glattem Muskel und Gehirn) sind zahlreiche Typen von Calciumkanälen entdeckt worden; Bean, B. P., Annu. Rev. Physiol. 51:367–384 (1989), und Hess, P., Annu. Rev. Neurosci. 56:337 (1990). Diese verschiedenen Typen von Calicumkanälen wurden grob in vier Klassen eingeteilt, nämlich L-, T-, N- und P-Typ, die sich durch Stromkinetik, Haltepotentialempfindlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Calciumkanal-Agonisten und -Antagonisten unterscheiden. Von Swandulla, D. et al., Trends Neurosci 14:46 (1991) wurden vier Subtypen von neuronalen spannungsabhängigen Calciumkanälen vorgeschlagen. Die Kanäle vom L-, N- und P-Typ wurden jeweils mit Nozizeption in Verbindung gebracht, aber nur der Kanal vom N-Typ ist beständig mit akutem, anhaltendem und neuropathischem Schmerz in Verbindung gebracht worden. Eine synthetische Version von ω-Conotoxin MVIIA, einem aus dem Gift der fischfressenden Meeresschnecke Conus magus gewonnenen Peptid mit 25 Aminosäuren, wurde intrathekal bei Menschen verwendet und hat für die Behandlung von Schmerz mit größerer Wirksamkeit als Morphin eine Erfolgsquote von ungefähr 85%.
Bekannte Arzneistofftherapien haben zwar ihren Nutzen, jedoch ist ihre Anwendung auch mit Nachteilen behaftet. So kann es beispielsweise bei einigen Medikationen bis zu sechs Monate konsequenter Anwendung dauern, bis das Produkt eine schmerzlindernde Wirkung zeigt. Daher kann ein bestimmter Patient trotz Behandlung bis zu sechs Monate weiter leiden müssen, bis der Arzt abschätzen kann, ob die Behandlung wirksam ist. Viele bestehende Arzneistoffe haben auch bei bestimmten Patienten beträchtliche schädliche Nebenwirkungen, so daß eine sorgfältige Überwachung erforderlich ist. Außerdem bringen die meisten bestehenden Arzneistoffe den Betroffenen nur vorübergehende Erleichterung und müssen für eine kontinuierliche Linderung auf täglicher oder wöchentlicher Basis durchgehend eingenommen werden. Schließlich kann mit fortschreitender Erkrankung die zur Linderung des Schmerzes benötige Medikationsmenge zunehmen, was auch die Gefahr von Nebenwirkungen erhöht. Daher besteht nach wie vor Bedarf an einer wirksamen und sicheren Behandlung zur Linderung von Schmerzen.
Kurze Darstellung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen mit selektiver Wirkung an Calciumkanälen vom N-Typ, die zur Verwendung bei der Behandlung von Schmerzen geeignet sind, bereit.
Erfindungsgemäße Verbindungen, die selektive Wirkung an Calciumkanälen vom N-Typ zeigen, sind Verbindungen gemäß Formelbild I
worin:
A unter Phenyl, Heteroaryl oder bicyclischem Heteroaryl ausgewählt ist;
R¹ jeweils unabhängig voneinander unter Halogen, C₁-C₆-Alkyl, Heterocyclyl, OH, C₁-C₆-Alkoxy oder NR² ₂ ausgewählt ist;
b für eine unter 0, 1, 2 oder 3 ausgewählte ganze Zahl steht;
R² jeweils unabhängig voneinander unter H oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist;
R³ jeweils unabhängig voneinander unter Halogen oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist;
d für eine unter 0, 1, 2 oder 3 ausgewählte ganze Zahl steht;
R⁴ unter H oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist;
R⁵ aus der Gruppe bestehend aus H, Halogen, C₁-C₃-Alkyl, C₁-C₃-Perfluoralkyl, C₁-C₃-Alkoxy, Hydroxy, NH₂ oder NHR² ausgewählt ist;
R⁶ unter H, Halogen, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₄-Perfluoralkyl, C₁-C₆-Alkoxy, Hydroxy, C₁-C₆-Alkanoyl, C (=O)NR² ₂ oder NR² ₂ ausgewählt ist und
R⁷ unter H oder Methyl ausgewählt ist.
Besondere erfindungsgemäße Verbindungen sind diejenigen gemäß Formelbild I, worin:
A unter Phenyl oder bicyclischem Heteroaryl ausgewählt ist;
R¹ jeweils unabhängig voneinander unter Halogen, C₁-C₆-Alkyl, Heterocyclyl, OH, C₁-C₆-Alkoxy oder NR² ₂ ausgewählt ist;
b für eine unter 0, 1, 2 oder 3 ausgewählte ganze Zahl steht;
R² jeweils unabhängig voneinander unter H oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist;
R³ jeweils unabhängig voneinander unter Halogen oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist;
d für eine unter 0, 1, 2 oder 3 ausgewählte ganze Zahl steht;
R⁴ für H steht;
R⁵ unter H, Halogen, C₁-C₃-Alkyl, C₁-C₃-Perfluoralkyl oder C₁-C₃-Alkoxy ausgewählt ist;
R⁶ unter H, Halogen, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₄-Perfluoralkyl, C₁-C₆-Alkoxy, Hydroxy, C₁-C₆-Alkanoyl, C(=O)NR² ₂ oder -NR² ₂ ausgewählt ist und
R⁷ für H steht.
Ganz besondere erfindungsgemäße Verbindungen sind die hier exemplifizierten.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung von Verbindungen gemäß Formelbild I zur Behandlung von Schmerzen dar, bei dem man eine schmerzlindernd wirkende Menge einer derartigen Verbindung verabreicht.
Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die Verabreichung einer schmerzlindernd wirkenden Menge einer Verbindung gemäß Formelbild I an einen Patienten, der einer Behandlung für akuten, anhaltenden oder neuropathischen Schmerz bedarf.
In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß Formelbild I.
In noch einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen gemäß Formelbild I zusammen mit Exzipienten, Verdünnungsmitteln oder Stabilisatoren, wie sie hier weiter beschrieben werden, die zur Verwendung bei der Behandlung von akutem, anhaltendem und neuropathischem Schmerz geeignet sind.
Nähere Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäße Verbindungen sind diejenigen, die in den Schutzbereich der allgemeinen Beschreibung fallen, und insbesondere die nachstehend exemplifizierten Verbindungen.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen sind u.a. Säureadditionssalze, wie Methansulfonat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Citrat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Maleat und mit Phosphorsäure und Schwefelsäure gebildete Salze.
Wenn erfindungsgemäße Verbindungen ein Chiralitätszentrum besitzen, versteht es sich, daß die vorliegende Erfindung alle optischen Isomere und Diastereoisomere derartiger Verbindungen umfaßt.
Wenn erfindungsgemäße Verbindungen tautomerisieren können, versteht es sich, daß die vorliegende Erfindung alle tautomeren Formen derartiger Verbindungen umfaßt.
Wenn erfindungsgemäße Verbindungen in unsolvatisierten sowie solvatisierten Formen, wie beispielsweise hydratisierten Formen, vorliegen können, versteht es sich, daß die vorliegende Erfindung alle derartigen unsolvatisierten und solvatisierten Formen umfaßt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen bereit. Die Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgte im allgemeinen durch automatisierte Umsetzung von substituierten 2-Chlor-4-Aminochinolin-Zwischenprodukten mit Aminoaryl-Vorläufern. Die als Zwischenprodukt dienenden substituierten 2-Chlor-4-Aminochinoline wurden durch Chlorierung von substituierten 2-Hydroxy-4-aminochinolin-Vorläufern hergestellt, welche wiederum durch Aminierung von substituierten 2,4-Chinolindiol-Vorläufern hergestellt wurden.

a) Die Herstellung von 2-Hydroxy-4-aminochinolin-Vorläufern gemäß Formelbild III erfolgte durch Umsetzung eines substituierten 2,4-Chinolindiols gemäß Formelbild II mit drei Äquivalenten eines Arylamins in N-Methylpyrrolidinon und 6N HCL in 2-Propanol im Bombenrohr bei einer Temperatur von etwa 180°C
wobei R³, R⁴, R⁵, R⁶ und d die oben angegebene Bedeutung besitzen;
a') alternativ dazu erfolgte die Herstellung von 2-Hydroxy-4-aminochinolin-Vorläufern gemäß Formelbild III durch Umsetzung eines substituierten 2,4-Chinolindiols gemäß Formelbild II mit zwei Äquivalenten eines Arylamins in N-Methylpyrrolidinon und 4M HCL in Dioxan im Teflonbombenrohr. Der Ansatz wurde unter Verwendung eines Mikrowellengeräts der Bauart Ethos 1600 Lab Microwave als Energiequelle bei einer Temperatur von etwa 200°C gehalten.
b) Die Herstellung von 2-Chlor-4-aminochinolin-Vorläufern erfolgte durch Chlorierung einer 2-Hydroxy-4-aminochinolinverbindung gemäß Formelbild III durch Refluxieren mit POCl₃ zu einer Verbindung gemäß Formelbild IV
wobei R³, R⁴, R⁵, R⁶ und d die oben angegebene Bedeutung besitzen;
c) Die Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formelbild I erfolgte durch Umsetzung von 2-Chlor-4-aminochinolin-Vorläufern mit aromatischen Aminen in N-Methylpyrrolidinon bei Temperaturen von 100–180°C
wobei R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁶ , R⁷, b und d die oben angegebene Bedeutung besitzen.

Die Verfahrensweise gemäß Schritt c) kann auch in paralleler Weise unter Verwendung eines Robotergeräts durchgeführt werden. Ein geeignetes Robotergerät für eine derartige multiple Parallelsynthese ist ein ChemSpeed-Roboter.
Zur Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Schmerzen bei Säugetieren, bei denen es sich um Menschen handeln kann, kann man die Verbindung gemäß pharmazeutischer Standardpraxis als pharmazeutische Zusammensetzung formulieren. Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt demgemäß eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung gemäß Formelbild I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Additiv, wie einem Exzipienten oder Träger, enthält.
Bei erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die Behandlung auf beliebige physiologisch annehmbare Art verabreicht wird, wie durch topische Applikation, Einnahme, Inhalation, Insufflation oder Injektion. Die topische Applikation kann beispielsweise auf dermalem, sublingualem, nasalem, vaginalem oder rektalem Wege erfolgen. Die Injektion kann intradermal, subkutan, parenteral, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär oder durch Infusion erfolgen. Bei der Einnahme kann eine Kapsel, eine Tablette oder eine Flüssigkeit eingenommen werden. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, können mit an sich bekannten Mitteln beispielsweise in Form von Tabletten, Kapseln, wäßrigen oder öligen Lösungen oder Suspensionen, Emulsionen, Cremes, Salben, Gelen, Nasensprays, Zäpfchen, feinteiligen Pulvern oder Aerosolen zur Inhalation und sterilen wäßrigen oder öligen Lösungen oder Suspensionen oder sterilen Emulsionen zur Injektion formuliert werden. Bevorzugt ist Verabreichung auf oralem Wege über eine Tablette oder Kapsel.
Neben einer erfindungsgemäßen Verbindung kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung auch ein oder mehrere pharmakologisch wirksame Mittel enthalten. Alternativ dazu kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthält, gleichzeitig oder nacheinander mit einem oder mehreren kompatiblen pharmakologisch wirksamen Mitteln gemeinsam verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden gewöhnlich so verabreicht, daß der Patient eine schmerzlindernd wirkende Tagesdosis erhält. Die Tagesdosis kann gegebenenfalls in Teildosen verabreicht werden, wobei die genaue Menge der verabreichten Verbindung und der Verabreichungsweg gemäß an sich gut bekannten Prinzipien von Gewicht, Alter und Geschlecht des behandelten Patienten und dem jeweiligen behandelten Krankheitszustand abhängen. Ein bevorzugtes Dosierungsschema ist einmal täglich.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung gemäß Formelbild I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines zum Binden an Calciumkanäle vom N-Typ bei einem Warmblüter, wie einem Menschen, geeigneten Arzneimittels bereit.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Binden einer erfindungsgemäßen Verbindung an Calciumkanäle vom N-Typ bei einem Warmblüter, wie einem Menschen, der einer Behandlung für Schmerzen bedarf, bereit, bei dem man dem Warmblüter eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß Formelbild I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon verabreicht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine erfindungsgemäße Verbindung gemäß obiger Definition oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Additiv, wie einem Exzipienten oder einem Träger, enthält.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers bereit, bei dem man eine erfindungsgemäße Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbares Salz davon verabreicht.
Definitionen:
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet „Halogen" Fluor, Chlor, Brom oder Iod;
wenn hier angegeben wird, daß Substituenten „aus einer Gruppe von Gruppierungen ausgewählt" oder „unabhängig aus einer Gruppe von Gruppierungen ausgewählt" sind, versteht es sich, daß Verbindungen, in denen alle Substituenten gleich sind, und Verbindungen, in denen jeder Substituent verschieden sein kann, eingeschlossen sind;
im Rahmen der vorliegenden Beschreibung umfaßt der Begriff Heterocyclyl 5- bis 7-gliedrige Ringe mit 1, 2 oder 3 Heteroatomen aus der Gruppe bestehend aus N, O und S und bicyclische Ringe mit derartigen Atomen und umfaßt solche Gruppen wie Tetrahydrofuryl, Dihydropyrrolinyl, Tetrahydroisochinolinyl, Tetrahydrothiophen, Oxiranyl, Aziridinyl und Oxetanyl;
im Rahmen der vorliegenden Beschreibung umfaßt der Begriff Heteroaryl solche Gruppen wie Pyridinyl, Pyrrol, Thiopehnyl und Furanyl;
im Rahmen der vorliegenden Beschreibung schließt der Begriff „Alkyl", wie beispielsweise in C₁-C₆-Alkyl, sofern nicht anders definiert, sowohl geradkettige als auch verzweigtkettige und cyclische Alkylgruppen ein. Bei Bezugnahme auf einzelne Alkylgruppen wie „Propyl" ist jedoch ausschließlich die normale, geradkettige Variante, d.h. n-Propyl, gemeint;
im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet ein Begriff wie „C₁-C₆-Alkyl" Alkylgruppen mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen und kollektive Gruppen wie C₁-C₄-Alkyl und umfaßt geradkettige, verzweigtkettige und cyclische Gruppierungen; Beispiele für geradkettige Gruppierungen sind Methyl, Ethyl und Propyl, Beispiele für verzweigtkettige Gruppierungen sind Isopropyl und t-Butyl, Beispiele für cyclische Gruppierungen sind Cyclopentyl und Cyclopropylmethyl; ganz analog umfaßt ein Begriff wie „C₁-C₃-Alkoxy" spezielle Gruppierungen wie Methoxy, Ethoxy und Propoxy, und im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendete, aber ansonsten nicht definierte Begriffe sollen ihre konventionelle Bedeutung besitzen.
Die hier beschriebenen Verfahren und Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken. Sofern nicht anders vermerkt, wurde in den Verfahren und Beispielen so verfahren, daß:
Lösungen am Rotationsverdampfer im Vakuum eingeengt wurden;
bei Umgebungstemperatur, d.h. im Bereich von 18–26°C, und unter Stickstoffatmosphäre gearbeitet wurde;
Säulenchromatographie (nach der Flash-Methode) an Merck Kieselgel (Art. 9385) durchgeführt wurde;
Ausbeuten nur zur Erläuterung angegeben sind und nicht unbedingt das erzielbare Maximum darstellen;
die Struktur von Verbindungen gemäß Formelbild I im allgemeinen durch herkömmliche NMR- (Bruker Avance 300) und Massenspektrometrie-Techniken bestätigt wurde, die Signalmultiplizitäten folgendermaßen angegeben sind: s: Singulett, bs: breites Singulett; d: Dublett, AB oder dd: Dublett von Dubletts; t: Triplett, dt: Dublett von Tripletts, m: Multiplett, bm: breites Multiplett; FAB- m/s-Daten unter Verwendung eines in Elektrospray-Modus betriebenen Platform-Spektrometers (von Micromass) erhalten wurden und je nachdem entweder Daten positiver Ionen oder Daten negativer Ionen gesammelt wurden, hier (M+H)⁺ angegeben ist;
die Reinheit von Zwischenprodukten im allgemeinen mittels LC/MS- und/oder NMR-Analyse abgeschätzt wurde;
und die folgenden Abkürzungen, sofern verwendet, die folgenden Bedeutungen haben:

DCM: steht für Dichlormethan,
DMF: steht für N,N-Dimethylformamid,
DMSO: steht für Dimethylsulfoxid,
CDCl₃: steht für deuteriertes Chloroform,
FRB: steht für Fast Atom Bombardment,
LC/MS: steht für Massenspektrometrie mit angeschlossenen Flüssigkeitschromatographiegerätschaften,
m/s: steht für Massenspektrometrie oder massenspektrometrisch,
NMR: steht für kernmagnetische Resonanz,
NMP: steht für N-Methylpyrrolidinon,
TFA: steht für Trifluoressigsäure und
THF: steht für Tetrahydrofuran.

Biologische Verfahren
I. N-Kanal-FLIPR-Assay (FLIPR = Fluorescent Laser Imaging Plate Reader)
Die hier beschriebenen Verfahren liefern eine zuverlässige FLIPR-basierte Ablesung der Wirksamkeit, mit der Testverbindungen den Calciumstrom durch den in seiner nativen Form in einer vom Menschen stammenden, chemisch zu einem neuronalen Phänotyp differenzierten Neuroblastomzellinie exprimierten Calciumkanal vom N-Typ inhibieren. Der Grad, in dem eine Verbindung in einer bestimmten Konzentration den N-Kanal-Calciumstrom inhibierte, wurde durch Vergleich der Amplitude der maximalen Calciumzunahme in Gegenwart der Verbindung mit einem 80-mM-K⁺-Kontrollstimulus in Vertiefungen ohne Verbindung bestimmt. Die für diesen FLIPR-Assay erhaltenen Ergebnisse wurden auf zwei Arten validiert:

a) das N-Kanal-spezifische Peptidtoxin Conotoxin MVILA zeigte einen IC₅₀-Wert von 3 nM (bestimmt aus dem Fit zur Fünfpunkt-Konzentrationsreaktionsanalyse), der mit dem bekannten Literaturwert vereinbar ist; und
b) IC₅₀-Werte wurden für bestimmte erfindungsgemäße Verbindungen bestimmt (IC₅₀-Bereich; 2,37–10,54).

Die Wirksamkeit derselben Testverbindungen als Inhibitoren des Calciumstroms vom N-Typ wurde auch durch direkte elektrophysiologische Messung entweder in neuronal differenzierten IMR-32-Zellen oder in frisch isolierten Neuronen aus dem oberen Halsganglion der Ratte bestimmt. Die nach den beiden Methoden für den Satz von Verbindungen erhaltenen pIC₅₀-Werte waren eng vergleichbar (r = 0,91; p<0,001).
A. Zellkultur
Für alle Versuche wurde die von der ATCC (Produkt-Nr. CCL-127) erhaltene von humanen Neuroblastomzellen abgelietete immortalisierte Zellinie IMR32 verwendet. Zellen wurden in T75-Flaschen mit Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) w/Earle's Salze und nichtessentielle Aminosäuren ohne Glutamin (Kat.-Nr. SLM-034-B, Specialty Media, Philipsburg, NJ, USA), 10% FBS und 1% Glutamin angezogen. Zellen wurden bis zu ~70–80% Konfluenz (gemäß visueller mikroskopischer Schätzung) angezogen und dann subkultiviert. Zur Aufrechterhaltung einer Stammkultur wurden Kulturen in einem Verhältnis von 1:3 – 1:4 geteilt, indem durch Triturieren eine Zellsuspension hergestellt und ein zur Erzielung dieses Endverhältnisses ausreichendes Volumen der Zellsuspension in neue Flaschen mit ~20 mL frischem Medium einpipettiert wurden. Die Subkultivierung wurde im allgemeinen zweimal pro Woche durchgeführt. Für die Herstellung von Platten mit 96 Vertiefungen (schwarzwandig; Kat.-Nr. 3603, Costar Co., Cambridge, MA, USA) wurde eine Zellen der gewünschten Konfluenz enthaltende T75-Flasche mit Medium auf ein Volumen von 120 mL aufgefüllt. Dann wurden die Zellen durch Triturieren befreit, und die Zellsuspension wurde in Platten mit 12–96 Vertiefungen plattiert, was ein Endvertiefungsvolumen von 100 μL ergab.
B. Zelldifferenzierung zu neuronalem Phänotyp
Zellen wurden in einem Differenzierungsmedium aus MEM, 10% FBS, 1% Glutamin, 1 μM 2-Butyl-cAMP (49,1 mg/100 mL Medium (Kat.-Nr. D-0627, Sigma Corp, St. Louis, MO, USA) und 2,5 mM Bromdesoxyuridin (Stammlösung: 30,7 mg/10 mL Medium, 25 mL der obigen Stammlösung/100 mL Medium; Sigma Kat.-Nr. B-9285) zur Differenzierung veranlaßt. Zur Induktion der Differenzierung wurden die Zellen 2 Tage nach einer anfänglichen Plattierung in Platten mit 96 Vertiefungen mit Differenzierungsmedium behandelt (durch vollständigen Medienaustausch). Die Konfluenz betrug zu dieser Zeit ~40%. Danach wurde alle 2–3 Tage ein vollständiger Medienaustausch mit firsch hergestelltem Differenzierungsmedium vorgenommen. Die Zellen wurden diesen Differenzierungsbedingungen 6 bis 11 Tage lang ausgesetzt und dann in FLIPR-Versuchen verwendet.
C. Standardversuchslösungen
Bei den Versuchen wurden Lösungen der folgenden Zusammensetzung (in mM) verwendet (Puffer ohne Probenicid wurden von Specialty Media bezogen (Puffer A und B: Kat.-Nr. BSS053A; Puffer C und D: Kat.-Nr. BSS056A).

Puffer A (erster Waschpuffer): Krebs-Ringer-HEPES-Puffer (KRH-Puffer): NaCl: 125, KCl: 5, MgSO₄: 1,2. KH₂PO₄: 1,2. CaCl₂ 2H₂O: 2, Glucose: 6, HEPES: 25, pH: 7,4 (pH mit NaOH eingestellt)
Puffer B (Farbstoffbeladungspuffer): KRH-Puffer mit 2,5 μM Probenicid: wie Puffer A, aber mit Probenicid-Zusatz bis zu einer Endkonzentration von 2,5 μM. Probenicid (Kat.-Nr. P-8761, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) wurde als Stammlösung mit einer Konzentration von 250 mM hergestellt.
Puffer C (Farbstoffauswaschpuffer): KRH-Puffer mit 0 mM K⁺ und 2,5 μM Probenicid: NaCl: 130, MgSO₄: 1,2. NaH₂PO₄: 1,2. CaCl₂ 2H₂O: 2, Glucose: 6, HEPES: 25, pH: 7,4 (pH mit NaOH eingestellt).
Puffer D (Verbindungsverdünnungspuffer): Puffer C mit 0,1% w/v Rinderserumalbumin (BSA; Sigma).

D. Pharmakologische Standards und Verbindungen
Die hier angegebenen Daten wurden mit den folgenden Lösungen erhalten.
Nitrendipin: (RBI Chemicals, Natick, MA, USA): Stammlösung: 10 mM in DMSO; Pipettierlösung: 9 μM; für eine Vertiefungsendkonzentration von 1 μM 20 μL in ein Volumen von 120 μL in der Vertiefung einpipettieren.
w-Conotoxin MVIIA: (Kat.-Nr. H-8210; Bachem Inc., Torrance, CA, USA): Stammlösung: 1 mM in HPLC-H₂O mit 0,1% BSA; Pipettierlösung: 4,5 μM; für eine Vertiefungsendkonzentration von 1 μM 20 μL in ein Volumen von 140 μL in der Vertiefung einpipettieren.
Testverbindungsstammlösungs- und Lösungsherstellung: Verbindungen wurden täglich als Stammlösungen mit einer Konzentration von 10 mM in 100 DMSO hergestellt; Pipettierlösung: 45 μM oder Reihenverdünnungen davon; für eine Vertiefungsendkonzentration von 1 μM oder 10fache Verdünnungen davon 20 μL in ein Volumen von 140 μL in der Vertiefung einpipettieren.
Kaliumreiche Lösung (Depolarisationslösung): Puffer C mit 240 mM K⁺-Zusatz, für eine Vertiefungsendkonzentration von 80 mM K⁺ 80 μL in ein Volumen von 160 μL in der Vertiefung einpipettieren.
E. Zollbeladung mit Fluoreszenzfarbstoffen
Herstellung von Fluoreszenzfarbstofflösung: Zur Messung der Änderungen des intrazellulären freien Calciums mit FLIPR wurde der Calciumindikatorfarbstoff Fluo-4-acetylmethylester (Fluo 4-AM; Kat.-Nr. F-124201; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) verwendet. Durch Lösen in DMSO wurde eine 1 mM Fluo-4-AM-Stammlösung hergestellt. Diese Stammlösung wurde dann mit Puffer B auf 4,6 μM verdünnt (Fluo-4-AM-Arbeitslösung).
Zellbeladungsmethode: Zellen enthaltende Platten wurden unter Verwendung eines automatischen Zellenwaschgeräts (Modell Nr. 5161552, Labsystems Oy, Helsinki, Finnland) mit Puffer A gewaschen, wobei die Regler auf die folgenden Parameter eingestellt wurden: Zellenhöhe: C/D; Zellenpuls: 4/5; Wäschen: 3; Volumen: 5; Positionseinstellung DRY. Diese Einstellungen ergaben eine Resthöhe von 70 μL Puffer über Zellen in jeder Vertiefung. Dann wurden in jede Vertiefung 100 μL der Fluo-4-AM-Arbeitslösung gegeben, was eine Fluo-4-Am-Endkonzentration von 2,7 μM ergab. Die Zellen wurden in diser Lösung 1–1,5 h bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Zellen unter Verwendung des Zellwaschgeräts mit den gleichen Parametern wie bei den obigen Wäschen vor der Beladung, aber mit Ausnahme von: Wäschen: 5, Positionseinstellung WET, fünfmal mit Puffer C gewaschen. Dann wurde eine Endwäsche durchgeführt, wobei die Parameter folgendermaßen geändert wurden: Wäschen: 1, Volumen: 2. Dies ergab ein Vertiefungsendvolumen von 120 μL. Die Zellen wurden unter diesen Bedingungen 10 min äquilibrieren gelassen und dann im FLIPR-Protokoll verwendet.
F. FLIPR-Protokoll
Instrumentierung: Die Messung von Echtzeitänderungen des intrazellulären freien Calciums als Reaktion auf kaliuminduzierte Depolarisation in An- oder Abwesenheit von vermutlichen N-Kanal-Inhibitoren erfolgte entweder auf einem FLIPR-I- oder FLIPR-II-Instrument (für 96-Vertiefungen-Format konfiguriert; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Bei jedem Instrument wurden die gleichen Einstellungen und Protokolle verwendet, und die auf den beiden Instrumenten erhaltenen Ergebnisse waren für einen Satz von standardmäßigen Benchmark-Verbindungen ununterscheidbar.
FLIPR-Hardware-Einstellungen: Die Laserleistung wurde auf etwa 0,3 Watt eingestellt. Die Anregungswellenlänge wurde auf einen Peak bei 488 nm eingestellt, und die Emissionswellenlänge auf 540 nm. Die Kamerablende wurde auf 2 eingestellt. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur (20–22°C) durchgeführt.
Plattenlayout-Referenzsignale: Bestimmte Vertiefungen auf jeder Platte wurden Standards zur Bestimmung des minimalen und maximalen spezifischen Fluoreszenzsignals, gegen das die inhibitorischen Wirkungen von Verbindungen normalisiert wurden, zugeteilt. Die Referenzstandards wurden auf Plattenstellen einschließlich rand- und innenständiger Vertiefungen verteilt.
Maximalsignal (N-Kanal + nichtspezifisch): 12 Vertiefungen wurden in Nitrendipin-Lösung (1 μM) inkubiert und zur Bestimmung des maximalen durch N-Kanäle vermittelten + nichtspezifischen (nicht-L-, nicht-N-Kanal-vermitteten Fluoreszenzanstiegs) Ca²⁺-Anstiegs mit 80 mM K⁺ versetzt. Der Variationskoeffizient unter diesen Vertiefungen für den durch K⁺ hervorgerufenen Peakanstieg von Fluoreszenzeinheiten betrug in der Regel weniger als 12%.
Minimalsignal (nichtspezifisch): 6 Vertiefungen wurden in Nitrendipin (1 μM) + w-Conotoxin MVIIA inkubiert und zur Bestimmung von Hintergrund-Ca²⁺ bei pharmakologischem Verschluß aller N-Kanäle mit 80 mM K⁺ versetzt. Die nichtspezifische Peaksignalkomponente betrug in der Regel weniger als 15% der maximalen Signalpeakamplitude.
Kleines N-Kanal-Referenzmolekül: Zur Auffindung eines Referenzpunkts wurde auf jeder Platte eine Verbindung, die hinsichtlich ihrer N-Kanal-Hemmwirkung sowohl in FLIPR als auch in der Patch-Clamp-Elektrophysiologie ausgiebig charakterisiert worden war, in dreifacher Ausfertigung in einer Konzentration von 1 μM (nahe dem IC₅₀-Wert) mit aufgenommen.
Testverbindungen: Auf jeder Platte werden 5 Testverbindungen auf ihre Wirksamkeit untersucht. Jede Verbindung wurde in 5 zunehmenden Konzentrationen, die halbe Logarithmuseinheiten umfaßten und in der Regel eine Maximalkonzentration von 10 μM erreichten, getestet. Jede Konzentration wurde in drei Vertiefungen getestet.
Protokollstruktur: Das FLIPR-Protokoll wurde als drei Lösungszugabe/Probenahme-Sequenzen konfiguriert (siehe unten). Entsprechende Vertiefungen wurden vor dem Einbringen der Platte in das FLIPR-Instrument mit Conotoxin (Endkonz. 1 μM) versetzt. Die Vertiefungen enthielten anfangs ein Lösungsgesamtvolumen von 100 μL und nach allen drei Lösungszugaben ein Volumen von 240 μL. Die Möglichkeit des aktiven Mischens (mit der Pipette) wurde bei keiner Sequenz genutzt.
Nitrendipinzugabesequenz: 28 s Gesamtdauer mit Fluoreszenzsignalaufnahme mit 1 Hz über 2 s, gefolgt von Zugabe von 20 μL Nitrendipin-Standardlösung mit 10 μL/s, gefolgt von Aufnahme mit 0,5 Hz über 24 s.
Testlösungszugabesequenz: 64 s Gesamtdauer mit Aufnahme mit 0,5 Hz über 4 s, Testlösungszugabe von 40 μL mit 20 μL/s, gefolgt von Aufnahme mit 0,2 Hz über 60 s.
Verbindungsinkubierung, Zellendepolarisation und Calciumauslesesequenz: 1024 s Gesamtdauer mit Aufnahme mit 0,0167 Hz über 840 s, gefolgt von Lösungszugabe 80 μL K⁺-reicher Lösung (Depolarisationslösung), gefolgt von Aufnahme mit 1 Hz über 180 s. Dieses letzte Meßintervall von 180 s repräsentierte somit den Zeitraum, in dem der Peakanstieg des intrazellulären Calciums aufgrund des Stroms durch aktivierte N-Kanäle erfolgte.
G. Datenanalyse
FLIPR-Software: Vor dem Export wurden die Daten im FLIPR-Softwaremodul für zwei Effekte normalisiert.
Hasislinienkorrektur: Die Basislinie wurde durch Aufnullstellen bei Probe Nr. 57 (unmittelbar vor der KCl-Zugabe) korrigiert. Diese Normalisierung diente zur Korrektur des y-Achsen-Offsets der Fluoreszenzspur von jeder Vertiefung, so daß alle Spuren unmittelbar vor dem Einsetzen des relevanten hervorgerufenen Fluoreszenzanstiegs einen gemeinsamen Punkt aufwiesen.
Raumeinheitlichkeitskorrekturfaktor: Die Daten wurden nach einer Verfahrensweise normalisiert, bei der ein Mittelwert über die Platte von Fluoreszenzeinheiten von der ersten Probe berechnet wird und dann die Daten von jeder Vertiefung mit einem Skalar multipliziert werden, welcher den Wert der ersten Probe auf diesen Durchschnittswert einstellt, wodurch für Differenzen der absoluten Basislinienfluoreszenz unter den Vertiefungen, die durch Differenzen der Zelldichten oder Farbstoffbeladung verursacht werden, normalisiert wird.
Externe Software: Die Daten wurden als Dateien mit der Endung „*.squ" nach Excel exportiert. Danach wurden in Excel Operationen zur Berechnung der maximalen Peakamplitude (bezogen auf die auf Null gestellte Basislinie) des Fluoreszenzanstiegs nach Kaliumzugabe in jeder Vertiefung durchgeführt. Messungen von Vertiefungen mit Zugabe von Testverbindung wurden dann als Prozentsatz zwischen den mittleren Amplituden der die maximalen (100) und nichtspezifischen (0%) Signalkomponenten liefernden Referenzvertiefungen wie oben beschrieben normalisiert. Es wurde davon ausgegangen, daß die resultierende prozentuale Inhibierung durch Testverbindungen die Inhibierung des Calciumstroms am N-Typ-Kanal reflektiert.
II. Formalin-Test
Mit dem Formalin-Test werden die Hemmwirkungen von oral verabreichten Antagonisten von Calciumkanälen vom N-Typ auf das Formalin-induzierte nozifensive Verhalten in Ratten abgeschätzt. Der Formalin-Test ist ein gut etablierter Schmerztest (Dubuisson und Dennis, 1977; H.
Wheeler-Aceto et al., (1990); Coderre et al., 1993). Der Test besteht aus zwei getrennten Phasen von Formalin-induziertem Verhalten. Die Reaktion der ersten Phase, die zwischen 0 und 5 min auftritt, wird durch akute Nozizeption gegenüber der in die Pfote injizierten schädlichen Chemikalie (Formalin) verursacht. Darauf folgt eine Ruheperiode zwischen 5 und 15 min nach der Injektion. Nach 15 min erfolgt eine Reaktion der zweiten Phase, die durch die Sensibilisierung der Zentralneuronen im Dorsalhorn verursacht wird und bis zu 60 min dauert. Die zentrale Sensibilisierung verstärkt den schädlichen afferenten Input, und es wird ein stärkerer Schmerzschwall in das Gehirn übertragen. Die Inhibierung der Reaktion der zweiten Phase deutet auf einen zentralen Mechanismus der Arzneistoffwirkung hin.
Beim Formalintest wird folgendermaßen verfahren: Männliche Ratten werden in eine Plexiglaskammer gesetzt und 30–45 min auf ihre Grundlinien-Aktivität beobachtet. Mehrere Gruppen von Tieren werden entweder mit Vehikel oder verschiedenen Dosen einer Testverbindung vorbehandelt. Der interessierende Arzneistoff wird den Tieren entweder 40 min (bei intraperitonealer Verabreichung) oder 90 min (bei oraler Verabreichung) vor der Injektion von Formalin in eine Hinterpfote (unter der Dorsalhaut; 0,05 mL steriles 5%iges Formalin) verabreicht. Die Zahl der Pfotenzuckungen und -leckungen während der ersten Phase (0–5 min) und der zweiten Phase (20–35 min) wird gezählt und aufgezeichnet. Die Zuck- und Leckreaktionen werden als prozentuale Inhibierung im Vergleich mit der mittleren Zahl einer Kochsalzlösungskontrollgruppe berechnet. Die Arzneistoffwirksamkeiten werden als die Dosis ausgedrückt, die 50% der maximalen Hemmwirkung verursacht („ID₅₀"). Zur statistischen Analyse zwecks Bestimmung der Signifikanz von Arnzeistoffwirkugen werden t-Tests nach Student verwendet. Verbindungen werden auf der Basis ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Zuckreaktion als wirksam erachtet.
Chemische Verfahren:
2-Hydroxychinolin- und 2-Chlorchinolin-Zwischenprodukte von hier beschriebenen beispielhaften Verbindungen, siehe Tabelle 1, wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt.
Chinolindiol-Edukte wurden nach einer Standardmethode hergestellt (Fischer, M., R. Laschober et al. (1996), „3,4,8-Trimethoxy-2-quinolone. Synthesis of a new alkaloid from Eriostemon gardneri", Sci. Pharm. 64 (3/4): 353–358; Patel, G. H. und C. M. Mehta (1960). „Synthesis of 2,4-Dihydroxyquinolines Using Polyphosphoric Acid as the Cyclizing Agent" J. Sci. Industrial Res. 19B: 436). Auf die Methoden und den Gegenstand dieser Zeitschriftenartikel wird hiermit in vollem Umfang ausdrücklich Bezug genommen. Alle anderen Reagentien wurden von Acros Organics bezogen und direkt verwendet.
Zwischenprodukt 1: 6-Methoxy-4-(3,4-dichlorphenyl)amino-2-hydroxychinolin:
Allgemeine Verfahrensweise 1:
sIn ein 100-mL-Teflongefäß zur Verwendung mit einem Mikrowellengerät der Bauart Ethos 1600 Lab Microwave wurden 6-Methoxychinolindiol (2,5 g, 13,08 mmol) und 3,4-Dichloranilin (4,2 g, 26,25 mmol) gegeben. Dann wurde NMP (9 mL) gefolgt von HCl in Dioxan (5 mL, 4 M) zugebeben. Die Aufschlämmung wurde zur Erzielung einer Temperatur von 200°C mit einem oberen Sollwert von 400 W 30 Minuten bestrahlt. Dann wurde die Mischung abgekühlt, in Methanol (20 mL) suspendiert und filtriert, was 1,049 g der Titelverbindung ergab. ¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 3,84 (s,3H), 5,84 (s, 1H), 7,23 (td, ?H, J=8,88, 8,48 Hz), 7,35 (tt, ?H, J=8,88, 2,42 Hz), 7,56 (d, ?H, J=2,42 Hz), 7,66 (~s, 2H), 8,71 (s, 1H), 11, 10 (s, 1H).
Zwischenprodukt 2: 4-(3,4-Dichlorphenyl)amino-2-hydroxychinolin:
Allgemeine Verfahrensweise 2:
2,4-Chinolindiol (10,0 g, 62,1 mmol) und 3,4-Dichloranilin (13,1 g, 80,7 mmol) wurden in 25 mL NMP 48 h auf 190°C erhitzt. Nach Abschalten der Heizung begannen Feststoffe auszufallen. Diese wurden gesammelt, mit 8,5 mL HCl in Isopropanol behandelt und in einer Mischung aus Aceton und Isopropanol im Verhältnis 4:1 beschallt. Nach 2,5 h Beschallung wurden die Feststoffe gesammelt. Der Beschallungszyklus wurde wiederholt, was 6,79 g Substanz (19,9 mmol, 32%) ergab. ¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 12,7 (s, 1H), 9,34 (s, 1H), 8,41 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,71 (m, 3H), 7,6 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,44 (m, 2H), 6,25 (s, 1H), 6,08 (breites s, 1H).
Zwischenprodukt 3: 6-Brom-4-(3,4-dichlorphenyl)amino-2-hydroxychinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 1 hergestellt; 6-Brom-2,4-chinolindiol (3 g, 12,5 mmol), 3,4-Dichloranilin und 6,25 mL 2 M HCl in Et₂O wurden 40 min auf 180°C (max. 400 W) bestrahlt, was 1,94 g (5,05 mmol, 40%) lieferte. ¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 11,36 (s, 1H), 8,83 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 7,70 (dd, 1H, J=8,88, 1,61 Hz), 7,64 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,55 (d, 1H, J=2,02 Hz), 7,33 (dd, 1H, J=8,88, 2,42 Hz), 7,25 (d, 1H, J=8,88 Hz), 5,86 (s, 1H).
Zwischenprodukt 4: 6-Fluor-4-(3,4-dichlorphenyl)amino-2-hydroxychinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 1 hergestellt; 6-Fluor-2,4-chinolindiol (2,5 g, 13,95 mmol), 3,4-Dichloranilin (4,5 g, 27,91 mmol) und 5 mL 4 M HCl in Dioxan wurden 40 min auf 180°C (max. 400 W) bestrahlt. Durch Gießen auf Methanol und Sammeln der Feststoffe wurden 2,136 g Substanz (6,61 mmol, 47%) erhalten. ¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 11,48 (s, 2H), 8,74 (s, 1H), 7,92 (dd, 1H, J=10,70, 2,60 Hz), 7,65 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,56 (d, 1H, J=2,42 Hz), 7,49 (d, 1H), 7,33 (m, 2H), 5,89 (s, 1H).
Zwischenprodukt 5: 8-Hrom-2-hydroxy-4-(2,3-dichlorphenyl)aminochinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 1 hergestellt; 8-Brom-2,4-chinolindiol (4 g, 16,66 mmol), 3,4-Dichloranilin (8 g, 49,38 mmol), 2, 78 mL 6 M HCl (16, 68 mmol) und 20 mL NMP wurden zur Erreichung von 200°C (max. 400 W) 30 min bestrahlt. Durch Abkühlen und Ausfällen durch Gießen auf 100 mL Wasser wurden 3,52 g Produkt (9,16 mmol, 55%) erhalten. ¹H-NMR 300 MHz, DMSO): 9,77 (s, 2H), 8,95 (s, 1H), 8,11 (dd, 1H, J=8,48, 0,81 Hz), 7,89 (dd, 1H, J=7,67, 0,81 Hz), 7,66 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,58 (d, 1H, J=2,42 Hz), 7,36 (dd, 2H, J=8,48, 2,42 Hz), 7,20 (t, 1 H, J=8,07 Hz), 5,88 (s, 1H).
Zwischenprodukt 6: 8-Fluor-2-hydroxy-4-(2,3-dichlorphenyl)aminochinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 1 hergestellt; 8-Brom-2,4-chinolindiol (4 g, 22,33 mmol), 3,4-Dichloranilin (10,88 g, 66,66 mmol), 3,7 6 M HCl (22,2 mmol) und 20 mL NMP wurden zur Erreichung von 200°C (max. 400 W) 30 min bestrahlt. Durch Abkühlen und Ausfällen durch Gießen auf 100 mL Wasser wurden 3,2 g Produkt (9,90 mmol, 44%) erhalten. ¹H-NMR 300 MHz, DMSO): 9,80 (s, 2H), 8,94 (s, 1H), 8,12 (d, 1H, J=8,48 Hz), 7,90 (d, 1H, J=7,67 Hz), 7,66 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,58 (d, 1H, J=2,42 Hz), 7,37 (dd, 1H, J=8,88, 2,42 Hz), 7,12 (t, ?H, J=7,87 Hz), 5,90 (s,1H).
Zwischenprodukt 7: 8-Hrom-2-chlor-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin:
Allgemeine Verfahrensweise 3:
8-Brom-2-hydroxy-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin (3,52 g, 9,16 mmol) und 26 mL POCl₃ wurden 4 h auf 120°C erhitzt. Dann wude der größte Teil des POCl₃ (~18 mL) abdestilliert und der Ansatz abgekühlt. Die Lösung wurde langsam auf warmes Wasser gegossen, was einen gummiartigen Feststoff ergab. Nach Abdekantieren des Wassers wurden die Feststoffe mit einigen Portionen Wasser gewaschen. Ein letztes Waschen mit Toluol und Trocknen unter Vakuum lieferte 1,43 g Substanz (3,55 mmol, 38,8%. ¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 9,58 (s, 1H), 8,39 (d, 1H, J=8,48 Hz), 8,15 (d, 1H, J=7,67 Hz), 7,70 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,66 (d, 1H, J=2,42 Hz), 7,51 (dd, 1H, J=8,48, 7,67 Hz), 7,44 (d, 1H, J=8,88, 2,42 Hz), 6,90 (s, 1H).
Zwischenprodukt 8: 8-Fluor-2-chlor-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 3 hergestellt; 8-Fluor-2-hydroxy-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin (3,2 g, 9,90 mmol) und 23 mL POCl₃ wurden 4 h auf 120°C erhitzt. Die Isolierung lieferte 0,69 g Substanz (1,98 mmol, 20%). ¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 9,50 (s, 1H), 8,17 (d, ?H, J=7,67 Hz), 8,04 (d, 1H, J=5,25 Hz), 7,79 (d, 1H, J=5,65 Hz), 7,71 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,61 (m, 1H), 7,45 (dd, 1H, J=8,88, 2,42 Hz), 6,88 (s, 1H).
Zwischenprodukt 9: 2-Chlor-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 3 hergestellt; 2-Hydroxy-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin (1,5 g, 4,9 mmol) und 9,2 mL POCl₃ wurden 4 h auf 120°C erhitzt. Die Isolierung lieferte 1, 075 g Substanz (3, 32 mmol, 68%). ¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 9,61 (s, 1H), 8,40 (d, 1H, J=8,07 Hz), 7,82 (m, 2H), 7,65 (m, 3H), 7,45 (dd, 1H, J=8,68, 2,63 Hz), 6,87 (s, 1H).
Zwischenprodukt 10: 6-Hrom-2-chlor-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 3 hergestellt; 6-Brom-2-hydroxy-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin (1,94 g, 5,05 mmol) und 30 mL POCl₃ wurden 4 h auf 120°C erhitzt. Die Isolierung lieferte 1,209 g Substanz (3,00 mmol, 60%). ¹H-NMR (300 MHz, DMSO): 9,69 (s, 1H), 8,71 (s, 1H), 7,91 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,78 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,69 (d, 1H, J=8,88 Hz), 7,68 (s, 1H), 7,44 (dd, 1H, J=8,68, 2,22 Hz), 6,91 (m, 1H).
Zwischenprodukt 11: 6-Fluor-2-chlor-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 3 hergestellt; 6-Fluor-2-hydroxy-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin (2,136 g, 6,6 mmol) und 30 mL POCl₃ wurden 4 h auf 120°C erhitzt. Die Isolierung lieferte 0,654 g Substanz (1,914 mmol, 29%). ¹H-NMR 300 MHz, DMSO): 9,55 (s, 1H), 8,27 (dd, 1H, J=10,50, 2,02 Hz), 7,92 (dd, 1H, J=8,88, 5,65 Hz), 7,70 (m, 3H), 7,45 (dd, 1H, J=8,48, 2,02 Hz), 6,90 (s, 1H).
Zwischenprodukt 12: 6-Methoxy-2-chlor-4-(3,4-dichlorphenyl)aminochinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 3 hergestellt; 6-Methoxy-2-hydroxy-4- (3,4-dichlorphenyl)aminochinolin (1,05 g, 3,13 mmol) und 26 mL POCl₃ wurden 4 h auf 120°C erhitzt. Die Isolierung lieferte 0,685 g Substanz (1,94 mmol, 61%).
Zwischenprodukt 13: 4-Chlor-2-(N-2-(4-morpholino)phenylamino)chinolin
In einen 10-mL-Schlenkkolben wurden 2,4-Dichlorchinolin (300 mg, 1,51 mmol), 2-Morpholinoanilin (297 mg, 1,66 mmol), 1 M HCl in Et₂O (3 mL) und NMP (3 mL) gegeben. Nach Entfernung des Ethers mit einem Stickstoffstrom wurde der Kolben 16 h auf 130°C erhitzt. Dann wurde der Ansatz abgekühlt, durch eine 500-mg-tCl8-Dep-Pak^® (Waters Corp) geführt und auf 3 × 100 Novopak-HR-RCM-Segmenten unter Verwendung von Methanol/Wasser/0,1% TFA mit 25 mL/min gereinigt. Durch Abdampfen der Lösungsmittel wurden 326,2 mg Produkt in Form eines TFA-Salzes (0,718 mmol, 48%) zusammen mit dem Produkt der Bisaddition (116 mg, 0,22 mmol, 15%) erhalten. Bisaddition ¹H-NMR (DMSO, 300 mHz): 12,31 (s, 1H), 9,90 (s, 1H), 9,70 (s, 1H), 8,49 (d, 1H, J=8,48 Hz), 7,84 (m, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,33 (m, 4H), 7,14 (m, 4H), 5,85 (s, 1H), 3,38 (s, 8H), 2,87 (s, 4H).
Zwischenprodukt 14: 4-(2-Methoxyethylamino)-2-hydroxychinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 1 hergestellt; Chinolindiol (1 g, 6,2 mmol) und 2-Methoxyethylamin (700 mg, 9,3 mmol) lieferte 722 mg Produkt (53%), das direkt verwendet wurde.
Zwischenprodukt 15: 2-Chlor-4-(2-methoxyethylamino)chinolin:
Diese Verbindung wurde in Analogie zur allgemeinen Verfahrensweise 3 hergestellt; 4-(2-Methoxyethylamino)-2-hydroxychinolin (611 mg, 2,8 mmol) und 2,5 mL POCl₃ wurden 8 Tage auf 120°C erhitzt. Die Isolierung lieferte 610 mg Substanz (92%).
Diversifikationsbibliothek: Allgemeine Verfahrensweise 4:
2-Chlorchinolin-Zwischenprodukte (oben hergestellt) (300 mg) wurden unter Verwendung eines ChemSpeed-Roboters mit 2 Äquivalenten Amin (aus Tabelle I) gekuppelt. Jede Kupplung wurde in NMP über den Zeitraum und die Temperatur gemäß Tabelle 2 durchgeführt, und die isolierte Ausbeute wurde für >50% der Einträge berechnet. Die Verbindungen wurden mittels HPLC und HPLC-MS charakterisiert und mittels präparativer HPLC gereinigt.
Tabelle 1: Bei der Synthese von erfindungsgemäßen Verbindungen verwendete Aminreagentien
Beispiele:
Die beispielhaften Verbindungen 1 bis einschließlich 34 sind in Tabelle 2 aufgeführt, die den Namen jeder Verbindung und die Einzelheiten von Reaktionszeit, Reaktionstemperatur, Ausbeute und Molekülion zeigt. Chinolinvorläufer wurden je nachdem nach den allgemeinen Verfahrensweisen 1, 2 und 3 hergestellt und nach der allgemeinen Verfahrensweise 4 mit einem Amin aus Tabelle 1 wie angegeben umgesetzt.
Tabelle 2:
Biologische Daten für ausgesuchte Verbindungen sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Biologische Daten

Claims

Verbindungen gemäß Formelbild I
worin: A unter Phenyl, Heteroaryl oder bicyclischem Heteroaryl ausgewählt ist; R¹ jeweils unabhängig voneinander unter Halogen, C₁-C₆-Alkyl, Heterocyclyl, OH, C₁-C₆-Alkoxy oder NR² ₂ ausgewählt ist; b für eine unter 0, 1, 2 oder 3 ausgewählte ganze Zahl steht; R² jeweils unabhängig voneinander unter H oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist; R³ jeweils unabhängig voneinander unter Halogen oder C₁-C4-Alkyl ausgewählt ist; d für eine unter 0, 1, 2 oder 3 ausgewählte ganze Zahl steht; R⁴ unter H oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist; R⁵ aus der Gruppe bestehend aus H, Halogen, C₁-C₃-Alkyl, C₁-C₃-Perfluoralkyl, C₁-C₃-Alkoxy, Hydroxy, NH₂ oder NHR² ausgewählt ist; R⁶ unter H, Halogen, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₄-Perfluoralkyl, C₁-C₆-Alkoxy, Hydroxy, C₁-C₆-Alkanoyl, C(=O)NR² ₂ oder -NR² ₂ ausgewählt ist und R⁷ unter H oder Methyl ausgewählt ist.
Verbindungen nach Anspruch 1, worin: A unter Phenyl oder bicyclischem Heteroaryl ausgewählt ist; R¹ jeweils unabhängig voneinander unter Halogen, C₁-C₆-Alkyl, Heterocyclyl, OH, C₁-C₆-Alkoxy oder NR² ₂ ausgewählt ist; b für eine unter 0, 1, 2 oder 3 ausgewählte ganze Zahl steht; R² jeweils unabhängig voneinander unter H oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist; R³ jeweils unabhängig voneinander unter Halogen oder C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist; d für eine unter 0, 1, 2 oder 3 ausgewählte ganze Zahl steht; R⁴ für H steht; R⁵ unter H, Halogen, C₁-C₃-Alkyl, C₁-C₃-Perfluoralkyl oder C₁-C₃-Alkoxy ausgewählt ist; R⁶ unter H, Halogen, C₁-C₆-Alkyl , C₁-C₄-Perfluoralkyl , C₁-C₆-Alkoxy, Hydroxy, C₁-C₆-Alkanoyl, C(=O)NR² ₂ oder -NR² ₂ ausgewählt ist und R⁷ für H steht.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Schmerzen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Verdünnungsmittel.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, umfassend: a) Umsetzung eines substituierten 2,4-Chinolindiols (Formelbild II) mit drei Äquivalenten eines Alkylamins in N-Methylpyrrolidinon und 6N HCL in 2-Propanol im Bombenrohr bei einer Temperatur von etwa 180°C
wobei R³, R⁴, R⁵, R⁶ und b die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen; b) Chlorierung der 2-Hydroxy-4-aminochinolinverbindung gemäß Formelbild III durch Refluxieren mit POCl₃ zu einer Verbindung gemäß Formelbild IV
wobei R³, R⁴, R⁵, R⁶ und d die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen; c) Umsetzung von 2-Chlor-4-aminochinolin-Vorläufern mit aromatischen Aminen in N-Methylpyrrolidinon bei Temperaturen von 100–180°C
wobei R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, b und d die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem Schritt a) die Umsetzung eines substituierten 2,4-Chinolindiols gemäß Formelbild II mit zwei Äquivalenten eines Arylamins in N-Methylpyrrolidinon und 4M HCL in Dioxan im Bombenrohr unter Mikrowellenbestrahlung bei einem oberen Sollwert von 400 W zur Aufrechterhaltung einer Temperatur von 200°C über einen Zeitraum von 30 Minuten umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man Schritt c) in paralleler Weise unter Verwendung von Robotergeräten durchführt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man Schritt c) in paralleler Weise unter Verwendung von Robotergeräten durchführt.