DE60118956T2

DE60118956T2 - Calciumkanalantagonisten vom n-typ zur behandlung von schmerzen

Info

Publication number: DE60118956T2
Application number: DE60118956T
Authority: DE
Inventors: AstraZeneca Wilmington Bipinchandra Wilmington CHAUDHARI; AstraZeneca Wilmington Marc Wilmington CHAPDELAINE; Greg Newark HOSTETLER; Lucius Philadelphia KEMP; AstraZeneca Wilmington John Wilmington MCCAULEY
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2000-11-06
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2021-11-01
Also published as: EP1339706B1; JP2004513125A; EP1339706A1; US20040058945A1; ATE323693T1; US6815447B2; AU2002212894A1; DE60118956D1; ES2261496T3; WO2002036586A1; SE0004053D0

Description

Diese Erfindung betrifft Verbindungen und Verfahren für die Behandlung oder Vermeidung von Schmerzen oder Nozizeption.
Stand der Technik
Schmerz ist für ein großes Maß an Leid verantwortlich und ist eine Empfindung, die sich von der Empfindung der Berührung, des Druckes, der Hitze und der Kälte unterscheidet. Er ist von den darunter Leidenden oft mit solchen Begriffen wie hell, dumpf, stechend, prickelnd, schneidend oder brennend beschrieben worden und es wird allgemein angenommen, dass er sowohl die ursprüngliche Empfindung als auch die Reaktion auf die Empfindung einschließt. Diese Breite an Empfindungen sowie die Variation der Wahrnehmung von Schmerzen durch verschiedene Individuen gestaltet die genaue Definition von Schmerz schwierig. Falls der Schmerz durch die Stimulation von nozizeptiven Rezeptoren „verursacht ist" und über intakte neuronale Netzwege übertragen wird, wird er als nozizeptiver Schmerz bezeichnet. Schmerz kann auch durch Beschädigungen von neuronalen Strukturen verursacht werden und Schmerz manifestiert sich oft als neuronale Überempfindlichkeit; dieser Schmerztyp wird als neuropathischer Schmerz bezeichnet.
Das Niveau an Stimulation, das benötigt wird, um als Schmerz wahrgenommen zu werden, wird als „Schmerzgrenze" bezeichnet. Wenn die Schmerzgrenze zum Beispiel durch die Gabe eines analgetischen Arzneimittels angehoben wird, wird eine größere Intensität oder ein längerer Stimulus benötigt, bevor Schmerzen wahr genommen werden. Analgetika sind eine Klasse von pharmazeutischen Verbindungen, die nach der Gabe an einen solch eine Behandlung benötigenden Patienten Schmerz ohne Verlust des Bewusstseins lindert. Dies steht im Gegensatz zu anderen schmerzlindernden Arzneimitteln, zum Beispiel allgemeine Anästhetika, die den Schmerz dämpfen, indem sie ein Hiatus im Bewusstsein verursachen, oder lokale Anästhetika, die die Übertragung in peripherem Nervengewebe blockieren, wodurch Schmerz vermieden wird.
Von Tachykininantagonisten wurde berichtet, dass sie die Antinozizeption in Tieren induzieren, von der angenommen wird, dass sie analog zu der Analgesie in Menschen ist (für eine Übersicht siehe Maggi et al., J. Auton. Pharmacol. (1993) 13, 23–93). Insbesondere wurde von Nicht-Peptid-NK-1-Rezeptorantagonisten gezeigt, dass sie solch eine Analgesie erzeugen, so erzeugte zum Beispiel in klassischen Tests auf Chemonozizeption (Phenzylbenzochinon-induziertes Schmerzkrümmen und Formalintest) der NK-1-Rezeptorantagonist RP 67,580 Analgesie mit einer Potenz, die vergleichbar mit derjenigen von Morphin war (Garret et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 88, 10208–10212).
Opioide Analgetika sind eine gut bekannte Klasse von analgetischen Mitteln. Von diesen Verbindungen ist allgemein akzeptiert, dass sie in einem allgemeinen Verständnis alle Arzneistoffe, natürliche oder synthetische, mit Morphin-ähnlicher Wirkung einschließen. Die synthetischen und halbsynthetischen opioiden Analgetika sind Derivate von fünf chemischen Klassen von Verbindungen: Phenanthrene; Phenylheptylamine; Phenylpiperidine; Morphinane; und Benzomorphane. Pharmakologisch betrachtet weisen diese Verbindungen eine Vielzahl von Wirkungen auf, wobei einige starke Agonisten der Opioid-Rezeptoren (z. B. Morphin) und andere moderate bis schwache Agonisten (z. B. Codein) sind; wieder andere zeigen eine gemischt agonistische antagonistische Aktivität auf (z. B. Nalbuphin); und wiederum andere sind partielle Agonisten (z. B. Nalorphin). Während ein opioider partieller Agonist, wie Nalorphin (das N-Alkylanalogon von Morphin), die analgetischen Wirkungen von Morphin antagonisiert, ist es, falls es alleine verabreicht wird, für sich genommen ein starkes Analgetikum. Von allen opioiden Analgetika ist Morphin immer noch das am meisten verwendete und ist eine geeignete Archetyp-Verbindung. Jedoch weist Morphin neben seinen nützlichen therapeutischen Eigenschaften unglücklicherweise auch eine Reihe von Nachteilen auf, einschließlich eine Unterdrückung des respirativen Systems, eine Abnahme der gastrointestinalen Beweglichkeit (was zu Konstipation führt) und bei einigen Patienten kann Übelkeit und Erbrechen auftreten. Ein anderes Charakteristikum ist die Entwicklung von Toleranz und körperlicher Abhängigkeit, die die klinische Verwendung solcher Verbindungen beschränken könnte.
Entzündungshemmende Verbindungen, die sich auf eine Vermeidung oder Verringerung von synovialer Entzündung beziehen und dadurch die Funktion verbessern, und Analgetika, die sich auf die Verringerung von Schmerzen beziehen, sind gegenwärtig die primäre Methode zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen und Arthritis. Aspirin und andere Salicylatverbindungen werden häufig zur Behandlung zur Unterbrechung der Steigerung des entzündlichen Vorgangs verwendet und erleichtern vorübergehend die Schmerzen. Andere Arzneiverbindungen, die für diese Zwecke verwendet werden, schließen Phenylpropionsäurederivate, wie Ibuprofen und Naproxin, Sulindac, Phenylbutazon, Corticosteroide, Anti-Malariamittel, wie Chloroquin und Hydroxychloroquinsulfat, und Fenemate ein. Für einen umfassenden Überblick über verschiedene zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen verwendeten Arzneimitteln ist Bezug genommen auf J. Hosp. Pharm. 36:622 (Mai 1979).
Calciumtunnel sind Membran-überbrückende aus mehreren Untereinheiten aufgebaute Proteine, die den regulierten Eintritt von Ca⁺⁺-Ionen in die Zellen aus der Extrazellularflüssigkeit erlauben. Solche Kanäle sind im gesamten Tierreich gefunden worden und sind in bakteriellen, pilzlichen und pflanzlichen Zellen identifiziert worden. Herkömmlicherweise sind Calciumkanäle spannungsabhängig. In solchen Kanälen erlaubt das „Öffnen" ein anfängliches Einströmen von Ca⁺⁺-Ionen in die Zellen, was den Potentialunterschied zwischen dem Inneren der Zelle, die den Kanal trägt, und dem extrazellulären Medium, in dem die Zelle badet, verringert. Die Einflussgeschwindigkeit der Ca⁺⁺-Ionen in die Zelle hängt von dieser Potentialdifferenz ab. Alle „anregbaren" Zellen in Tieren, wie Neuronen des zentralen Nervensystems („ZNS)", die peripheren Nervenzellen und die Muskelzellen, einschließlich derjenigen der Skelettmuskeln, der Herzmuskeln und der glatten venösen und arteriellen Muskeln, weisen spannungsabhängige Calciumkanäle auf. Calciumkanäle sind physiologisch wichtig, da die Kanäle eine zentrale Rolle bei der Regulierung der intrazellulären Ca⁺⁺-Ionenniveaus aufweisen. Diese Niveaus sind wichtig für die Zelllebensfähigkeit und -funktion. Somit werden die intrazellulären Ca⁺⁺-Ionenkonzentrationen mit einer Reihe von lebenswichtigen Prozessen in Tieren, wie die Freisetzung von Neurotransmittern, die Muskelkontraktion, die Schrittmacheraktivität und die Sekretion von Hormonen, in Verbindung gebracht.
Es wird angenommen, dass die Calciumkanäle bei gewissen Krankheitsbildern relevant sind. Von einer Reihe von Verbindungen, die zur Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen in Tieren, einschließlich dem Menschen, nützlich sind, wird angenommen, dass sie ihre vorteilhaften Wirkungen durch die Modulation von Funktionen der spannungsabhängigen Calciumkanäle, die kardio- und/oder vaskulären glatten Muskeln vorhanden sind, ausüben. Viele dieser Verbindungen binden an Calciumkanäle und blockieren oder verringern die Geschwindigkeit des Einströmens von Ca⁺⁺-Ionen in diese Zellen als Antwort auf die Depolarisation der Zellmembran. Ein Verständnis der Pharmakologie dieser Verbindungen, die mit den Calciumkanälen in anderen Organsystemen, wie dem zentralen Nervensystem, interagieren, und die Fähigkeit, rational Verbindungen zu entwerfen, die mit diesen spezifischen Subtypen von humanen Calciumkanälen unter Erhalt der gewünschten therapeutischen Wirkungen, z. B. Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, interagieren, wurden durch das Unvermögen behindert, unabhängig zu bestimmen, wie viele verschiedene Typen von Calciumkanälen existieren oder die molekulare Natur der einzelnen Subtypen, insbesondere im ZNS, zu bestimmen, und durch die Nicht-Verfügbarkeit von reinen Präparationen dieser spezifischen Kanalsubtypen, d.h. Systeme zum Bewerten der Spezifität der Calciumkanalbeeinflussenden Verbindungen.
Verschiedene Typen von Calciumkanälen wurden auf Grundlage von elektrophysiologischen und pharmakologischen Untersuchungen von verschiedenen Säugetierellen aus verschiedenen Geweben (z. B. Skelettmuskel, Herzmuskel, Lunge, glatte Muskelzellen und Gehirn) entdeckt, Bean, B.P., Annu. Rev. Physiol. 51:367–384 (1989) und Hess, P., Annu. Rev. Neurosci. 56:337 (1990). Diese verschiedenen Typen von Calciumkanälen sind grob in vier Klassen unterteilt worden, L-, T-, N- und P-Typ, die sich voneinander hinsichtlich der Strömungskinetiken, Haltepotentialempfindlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Calciumkanal-Agonisten und -Antagonisten unterscheiden. Vier Subtypen von neuronalen spannungsabhängigen Calciumkanälen wurden von Swandulla, D. et al., Trends Neurosci. 14:46 (1991) vorgeschlagen. Die L-, N- und P-Typ-Kanäle werden mit der Nocizeption in Verbindung gebracht, jedoch nur der N-Typ-Kanal wurde konsistent mit akuten, persistenten und neuropathischen Schmerzen in Verbindung gebracht. Eine synthetische Version von ω-Conotoxin MVIIA, ein 25-Aminosäurepeptid, das aus dem Gift der piscivoren Meeresschnecke, Conus magus, abgeleitet wurde, wurde intrathekal in Menschen verwendet und weist eine ~ 85 % Erfolgsrate für die Behandlung von Schmerzen mit einer größeren Potenz als Morphin auf.
Obgleich bekannte Arzneimitteltherapien Nützlichkeit aufweisen, ist ihre Verwendung mit Nachteilen verbunden. Zum Beispiel kann es bis zu sechs Monaten durchgängiger Verwendung einiger Medikationen benötigen, damit für das Produkt die Wirkung der Schmerzlinderung des Patienten eintritt. Demgemäß kann ein bestimmter Patient eine Behandlung erhalten und für bis zu sechs Monate weiterleiden, bevor der Arzt beurteilen kann, ob die Behandlung wirksam ist. Viele existierende Arzneistoffe haben auch wesentliche nachteilige Nebenwirkungen bei gewissen Patienten, und die Patienten müssen daher sorgfältig überwacht werden. Zusätzlich ermöglichen die meisten existierenden Arzneistoffe nur eine vorübergehende Linderung für die Leidenden und müssen durchgehend auf einer täglichen oder wöchentlichen Basis für eine fortgesetzte Linderung genommen werden. Weiter kann mit dem voranschreitenden Krankheitsverlauf die Menge der zur Schmerzlinderung notwendigen Medikation zunehmen, was das Potential für Nebenwirkungen erhöht. Daher besteht immer noch die Notwendigkeit für eine effektive und sichere Behandlung zur Schmerzlinderung.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen zur Verfügung, die eine selektive Wirkung auf N-Typ-Calciumkanäle aufweisen und die für die Behandlung von Schmerzen nützlich sind.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung welche eine selektive Wirkung auf Calciumkanäle vom N-Typ zeigen, sind Verbindungen gemäß folgendem Strukturdiagramm I:
wobei:
R¹ für NE¹E² steht, worin E¹ ausgewählt ist aus Wasserstoff und Methyl und E² ausgewählt ist aus Wasserstoff, C_1-4-Alkyl und Phenyl-C_1-4-alkyl,
R² ausgewählt ist aus E³ und E⁴, wobei
E³ ausgewählt ist aus C_1-6-Alkyl, C_1-4-Alkoxy und C_1-6-Alkoxy-C_1-4-alkyl und
E⁴ mit einer Gruppierung, ausgewählt aus Halogen, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Perfluor-C_1-2-alkyl und C_5-7-Cycloalkyl, phenylsubstituiert ist,
R³ ausgewählt ist aus E⁵ und E⁶, wobei
E⁵ ausgewählt ist aus NH₂, Perfluor-C_1-2-alkyl, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy-C_1-4-alkyl, Phenyl-C_1-2-alkoxy und Phenoxy-C_1-2-alkyl und
E⁶ in einer oder zwei Stellungen mit Gruppierungen, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Cyano, Perfluor-C_1-2-alkyl, C_1-4-Alkoxy, Phenyl-C_1-2-alkoxy, Phenoxy-C_1-2-alkyl und C_1-6-Alkoxy-C_1-4-alkyl, phenylsubstituiert ist.
Spezielle Verbindungen der Erfindung sind jene wobei:
R¹ für NE¹E² steht, worin E¹ für Wasserstoff steht und E² ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl und Benzyl,
R² ausgewählt ist aus E³ und E⁴, wobei
E³ ausgewählt ist aus Methyl, Pentyl, Propoxymethyl und
E⁴ mit einer Gruppierung, ausgewählt aus Fluor, Chlor, Methyl, Methoxy, Trifluormethyl und Cyclohexyl, phenylsubstituiert ist,
R³ ausgewählt ist aus E⁵ und E⁶, wobei
E⁵ ausgewählt ist aus Methyl, Pentyl, Trifluormethyl, Propoxymethyl, Benzyloxy und Phenyloxymethyl und
E⁶ in einer oder zwei Stellungen mit Gruppierungen, unabhängig ausgewählt aus Chlor, Fluor, Butyl, Trifluormethyl, Methoxy, Ethoxy, Benzyloxy, Phenoxymethyl, Propoxymethyl und Cyano, phenylsubstituiert ist.
Die speziellsten Verbindungen der Erfindung sind diejenigen, die hier beispielhaft aufgeführt sind.
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung von Verbindungen gemäß dem Strukturdiagramm I für die Behandlung von Schmerzen, wobei das Verfahren die Verabreichung einer zur Linderung der Schmerzen wirksamen Menge irgendeiner dieser Verbindungen umfasst.
Eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst die Verabreichung einer zur Schmerzlinderung wirksamen Menge einer Verbindung im Einklang mit dem Strukturdiagramm I an einen Patienten, der der Behandlung von akuten, persistenten oder neuropathischen Schmerzen bedarf.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß dem Strukturdiagramm I.
In noch einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen gemäß dem Strukturdiagramm I zusammen mit Exzipierten, Verdünnungsmitteln oder Stabilisatoren, wie sie hier weiter offenbart sind, umfassen und für die Behandlung von akutem, persistentem und neuropathischem Schmerz nützlich sind.
Die GB 794 043 offenbart verschiedene 6-[Pyrimidyl-4-amino]-chinoline, die als Ausgangsverbindungen in der Synthese von Chinolinderivaten, die Aktivität bei der Behandlung von Piroplasmose zeigen, verwendet werden. Die explizit offenbarten Verbindungen tragen ein unsubstituiertes Phenyl am C-2 des Chinolinrests oder werden in Form ihrer Salze erhalten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Verbindungen der Erfindung sind diejenigen innerhalb des Umfangs der allgemeinen Beschreibung und insbesondere diejenigen Verbindungen, die nachstehend beispielhaft aufgeführt sind.
Geeignete pharmazeutisch akzeptable Salze von Verbindungen der Erfindung schließen Säureadditionssalze wie Methansulfonat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Citrat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Maleat und Salze, die mit Phosphorsäure und Schwefelsäure gebildet sind, ein.
Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein chirales Zentrum besitzen, versteht es sich, dass die Erfindung alle optischen Isomeren und Diastereomeren dieser Verbindungen umfasst.
Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung tautomerisieren können, versteht es sich, dass die Erfindung alle tautomeren Formen solcher Verbindungen umfasst.
Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in nicht-solvatisierten Formen sowie in solvatisierten Formen, wie zum Beispiel hydratisierten Formen, vorliegen können, versteht es sich, dass die Erfindung alle solchen solvatisierten und nicht-solvatisierten Formen umfasst.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Im Allgemeinen werden Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem Chlorpyrimidin- oder Triflatpyrimidin-Vorstufen von Hydroxypyrimidin-Vorstufen hergestellt werden, und indem die Chlorpyrimidin- oder Triflatpyrimidin-Vorstufen mit Chinolin-Vorstufen unter Bildung von Pyrimidyl-Chinolin-Verbindungen der Erfindung umgesetzt werden.

a) Hydroxypyrimidin-Vorstufen wurden hergestellt, indem ein 3-substituierte-3-Oxopropionsäureethylester mit Guanidinhydrochlorid in N-Dimethylformamid in Gegenwart von Natriumhydrid und aktivierten 5 Å Molekularsieben umgesetzt wurden.
b) Chlorpyrimidin-Vorstufen wurden hergestellt, indem eine Hydroxypyrimidinverbindung gemäß dem Strukturdiagramm II durch Refluxieren mit Phosphoryloxychlorid und Phosphorpentachlorid unter Bildung einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm III chloriert wurde,
c) Triflatpyrimidin-Vorstufen wurden hergestellt, indem eine Hydroxypyrimidinverbindung gemäß dem Strukturdiagramm II durch Erhitzen mit N-Phenyltrifluormethansulfonamid, Triethylamin und trockenem N-Methyl-2-pyrolidinon unter Bildung einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm IV umgesetzt wurde,
d) die neuen Vorstufenchinoline wurden hergestellt gemäß dem folgenden Verfahren: d1) Herstellung neuer 3-substitierte-3-Oxopropionsäureethylester (β-Ketoester) gemäß dem Strukturdiagramm V, wie folgt:
worin R² wie vorstehend definiert ist; d2) Umsetzen der β-Ketoester gemäß dem Strukturdiagramm V zu Enaminen gemäß dem Strukturdiagramm VI, wie folgt
worin R⁶ eine Gruppe ist, die unter -NH-CO-CH₃ oder NO₂ gewählt ist; d3) Zyklisieren der Enamine gemäß dem Strukturdiagramm VI unter Bildung von Verbindungen gemäß dem Strukturdiagramm VII, wie folgt
und d4) wenn R⁶ -NH-CO-CH₃ ist, Umsetzen einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm VII zu einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I durch ein Verfahren gemäß dem folgenden Schema:
oder, wenn R⁶ -NO₂ ist, Umsetzen einer Verbindung des Strukturdiagramms VII oder einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I, wie folgt:
oder, alternativ, falls R⁶ -NO₂ ist, Umsetzen einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm VII zu einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I wie folgt:
e) Umsetzen einer Chinolin-Vorstufe der Struktur VIII mit einer Chlorpyrimidin-Vorstufe der Struktur III gemäß dem folgenden Schema unter Bildung einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I:
oder,
f) Umsetzen einer Chinolin-Vorstufe der Struktur VIII mit einer Triflatpyrimidin-Vorstufe der Struktur IV gemäß dem folgenden Schema unter Bildung einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I:
worin, falls notwendig, in den Schritten a), b), c), d), e) und f) jedwede funktionelle Gruppe mit einer Schutzgruppe geschützt ist und anschließend
g) Entfernen jeglicher dieser Schutzgruppe;
h) Umsetzen einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I zu einer anderen Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I durch Verfahren, die in den Methoden A bis einschließlich L hier beschrieben sind, und
i) Reinigung der Verbindung des Strukturdiagramms I zu einem notwendigen Maß, und, falls notwendig, Bildung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes.

Zur Verwendung einer Verbindung der Erfindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon für die therapeutische Behandlung von Schmerzen in Säugern, die Menschen sein können, wobei die therapeutische Behandlung eine prophylaktische Behandlung einschließen kann, kann die Verbindung gemäß der herkömmlichen pharmazeutischen Praxis als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden. Demgemäß stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die eine Verbindung des Strukturdiagramms I, wie es hier definiert ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Additiv, wie einem Auszug oder Trägermittel, enthält.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung enthalten, können auf herkömmliche Art und Weise verabreicht werden, zum Beispiel durch orale, topische, parenterale, buccale, nasale, vaginale oder rektale Verabreichung oder durch Inhalation. Für diese Zwecke kann eine Verbindung der Erfindung durch im Stand der Technik bekannte Mittel, beispielsweise in der Form von Tabletten, Kapseln, wässrigen oder öligen Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremes, Salben, Gelen, Nasensprays, Suppositorien, fein verteilten Pulvern oder Aerosolen zur Inhalation, und für parenterale Verwendung (einschließlich intravenös, intramuskulär oder Infusion) zu sterilen wässrigen oder öligen Lösungen oder Suspensionen oder sterilen Emulsionen formuliert werden. Ein bevorzugter Verabreichungsweg ist oral mittels einer Tablette oder Kapsel.
Zusätzlich zu einer Verbindung der vorliegenden Erfindung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung auch ein oder mehrere pharmakologisch aktive Mittel enthalten. Alternativ kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung dieser Erfindung, gleichzeitig oder nacheinander mit einem oder mehreren anderen kompatiblen pharmakologisch aktiven Mitteln zusammen verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung werden normalerweise verabreicht, so dass der Patient eine schmerzlindernde effektive Tagesdosis erhält. Die Tagesdosis kann nötigenfalls in getrennten Dosen verabreicht werden, wobei die genaue Menge der erhaltenen Verbindung und der Verabreichungsweg gemäß den im Stand der Technik bekannten Prinzipien von dem Gewicht, dem Alter und dem Geschlecht des behandelten Patienten und von der jeweiligen zu behandelnden Krankheit abhängt. Eine bevorzugte Dosierungsvorschrift ist einmal täglich.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung des Strukturdiagramms I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verfügung, das zum Binden an N-Typ-Calciumkanäle in einem warmblütigen Tier, wie einem menschlichen Wesen, nützlich ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bindung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an N-Typ-Calciumkanäle eines warmblütigen Tieres, wie einem Menschen, das/der eine Behandlung von Schmerzen benötigt, zur Verfügung, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung des Strukturdiagramms I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an das Tier umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, welche eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, wie sie hier definiert ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Additiv, wie einem Auszugsmittel oder einem Träger, einschließt.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, das die Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon einschließt.
Definitionen:
sFalls es hier verwendet wird, steht „Halo" oder „Halogen" für Fluor, Chlor, Brom oder Iod;
wenn hier von Substituenten angegeben wird, dass sie „gewählt sind unter" oder „unabhängig voneinander gewählt sind unter" einer Gruppe von Resten, versteht es sich, dass diejenigen Verbindungen eingeschlossen sind, bei denen alle Substituenten gleich sind, und diejenigen Verbindungen, bei denen jeder Substituent unterschiedlich ist;
wenn er hier verwendet wird, schließt der Ausdruck „Alkyl", wie zum Beispiel C_1-6-Alkyl-, solange es nicht anders definiert ist, sowohl geradkettige als auch verzweigtkettige Alkylgruppen ein. Verweisungen auf einzelne Alkylgruppen, wie „Propyl" bedeuten die normale geradkettige Form, das heißt n-Propyl;
wenn er verwendet wird, bedeutet ein Ausdruck wie „C_1-6-Alkyl" eine Alkylgruppe mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen und kollektive Gruppen wie C_1-4-Alkyl und schließt gerade und verzweigte Reste, wie Methyl, Ethyl, Iso-propyl und t-Butyl ein, in ähnlicher Weise schließt ein Ausdruck wie „C_1-3-Alkoxy" bestimmte Reste, wie Methoxy, Ethoxy und Propoxy, ein und von Ausdrücken, die hier verwendet werden und nicht anderweitig definiert sind, ist beabsichtigt, dass sie ihre herkömmlicherweise verstandene Bedeutung aufweisen.
Von den folgenden Verfahren und Beispielen ist beabsichtigt, dass sie die Erfindung erläutern, aber nicht beschränken. Bei den Verfahren und Beispielen wurde/wurden, solange es nicht anderweitig angegeben ist:
Die Aufkonzentrierungen durch Rotationsverdampfung in vacuo ausgeführt;
Die Arbeitsschritte bei Umgebungstemperatur, das ist der Bereich von 18–26°C, und unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt;
die Säulenchromatographie (durch ein Flash-Verfahren) an Merck Kieselgel Silica (Art 9385) durchgeführt;
die Ausbeuten nur für erläuternde Zwecke angegeben und stellen nicht notwendigerweise das erhältliche Maximum dar;
die Struktur der Verbindungen gemäß dem Strukturdiagramm I wurden im Allgemeinen durch herkömmliche NMR- und massenspektroskopische Techniken bestimmt, wobei die Peak-Multiplizitäten wie folgt gezeigt sind: s, Singulett; bs, breites Singulett; d, Dublett; AB oder dd, Dublett von Dubletts; t, Triplett; dt, Dublett von Tripletts; m, Multiplett; bm, breites Multiplett; FAB m/s-Daten wurden unter Verwendung eines Plattform-Spektrometers (geliefert von Micromass), durchgeführt mit Elektrospray, und, wo geeignet, wurden entweder positive Ionendaten oder negative Ionendaten gesammelt, hier ist (M+H)⁺ angegeben;
die Reinheit der Zwischenprodukte wurde im Allgemeinen durch m/s- oder NMR-Analyse bestimmt; und, wo sie verwendet wurden, haben die folgenden Abkürzungen Bedeutungen wie folgt:

DCM: ist Dichlormethan,
DMF: ist N,N-Dimethylformamid,
DMSO: ist Dimethylsulfoxid,
CDCl₃: ist deuteriertes Chloroform,
FAB: ist schneller Atombeschuss (= Fast atom bombardment),
m/s: ist Massenspektroskopie oder massen spektroskopisch
NMR: ist Nuklearmagnetresonanz,
NMP: ist N-Methylpyrrolidinon, und
THF: ist Tetrahydrofuran.

Biologische Verfahren:
I. N-Kanal-FLIPR-Assay (Fluorescent Laser Imaging Plate Reader).
Die hier beschriebenen Verfahren stellen zuverlässige auf FLIPR basierende Auslesedaten der Wirksamkeit und Stärke, mit denen die Testverbindungen den Calciumfluss durch den Calciumkanal vom N-Typ, exprimiert in seiner nativen Form in einer vom Menschen abgeleiteten Neuroblastoma-Zell-Linie, die chemisch zu einem neuronalen Phänotyp differenziert wurde, inhibieren, zur Verfügung. Das Ausmaß, bis zu dem eine Verbindung bei einer bestimmten Konzentration den Calciumfluß im N-Kanal inhibierte, wurde bestimmt, indem die Zunahme der Amplitude des Calciumpeaks in Gegenwart der Verbindung mit einem von 80 mM K⁺-Stimulus zur Kontrolle in Vertiefungen ohne der Verbindung verglichen wurden. Die von diesem FLIPR-Assay erhaltenen Ergebnisse wurden auf zwei wegen validiert:

a) Das N-Kanal-spezifische Peptidtoxin Conotoxin MVIIA zeigte einen IC₅₀ = 3 nM (bestimmt durch eine Anpassung an eine Fünfpunkt-Konzentration-Antwort-Analyse), der mit dem bekannten Literaturwert kompatibel war; und
b) die IC₅₀-Werte wurden für gewisse Verbindungen der Erfindung bestimmt (IC₅₀-Bereich: 2,37–10,54).

Die Stärke dieser selben Testverbindungen als Inhibitoren des Calciumstroms vom N-Typ wurde auch durch direkte elektrophysiologische Messung entweder in neuronal ausdifferenzierten IMR-32-Zellen oder in aus der Ratte frisch isolierten Neuronen aus dem oberen Halsganglion bestimmt. Für die Verbindung durch die beiden Verfahren bestimmte pIC₅₀-er waren gut miteinander vergleichbar (r = 0,91; p < 0,001).
A. Zellkultur.
Eine immortalisierte Zell-Linie, IMR32, abgeleitet von menschlichen Neuroblastoma-Zellen, erhalten von der ATCC (Produkt #CCL-127) wurden für alle Experimente verwendet. Zellen wurden in T75-Flaschen, die Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) w/Earl-Salze und nicht-essentielle Aminosäuren ohne Glutamin (Kat.-# SLM-034-B, Specialty Media, Philipsburg, NJ), 10% FBS und 1 % Glutamin enthielten, kultiviert. Zellen wurden bis ~ 70–80% Konfluenz (durch visuelle mikroskopische Bestimmung) vor der Subkultivierung kultiviert. Zur Beibehaltung einer Vorratskultur bzw. Stammkultur wurden die Kulturen in einem Verhältnis von 1:3–1:4 aufgeteilt, indem eine Zellsuspension durch Trituration erzeugt wurde und ein Volumen der Zellsuspension, das ausreicht, um dieses endgültige Verhältnis zu erhalten, in neue Flaschen, die ~ 20 mL frisches Medium enthielten, pipettiert wurde. Die Subkultivierung wurde im Allgemeinen zweimal pro Woche durchgeführt. Zur Herstellung einer Platte mit 96 Vertiefungen (schwarzwandig, Kat.-# 3603, Costar Co., Cambridge, MA) wurde eine T75-Flasche, die Zellen mit gewünschter Konfluenz enthielt, auf 120 mL Volumen mit Medium gebracht. Die Zellen wurden dann durch Trituration freigesetzt und die Zellsuspension wurde auf Platten mit 12–96 Vertiefungen ausplattiert, um ein endgültiges Volumen in einer Vertiefung von 100 μL zu erhalten.
B. Zelldifferenzierung zum neuronalen Phänotyp.
Die Differenzierung von Zellen wurde in einem Differenzierungsmedium, bestehend aus MEM, 10% FBS, 1 % Glutamin, 1 μM 2-Butyl-cAMP (49,1 mg/100 mL Medium (Cat. #D-0627, Sigma Corp. St. Louis, MO), und 2,5 mM Bromdeoxyuridin (Vorrat: 30,7 mg/10 mL Medium, 25 mL des obigen Vorrats/100 mL Medium; Sigma Kat.-# B-9285), induziert. Um die Differenzierung zu induzieren, wurden die Zellen mit Differenzierungsmedien (durch vollständigen Mediumaustausch) zwei Tage nach der anfänglichen Plattierung in Platten mit 96 Vertiefungen behandelt. Die Konfluenz zu diesem Zeitpunkt war ~ 40%. Ein vollständiger Mediumaustausch mit frisch hergestelltem differenzierenden Medium wurde anschließend alle 2–3 Tage durchgeführt. Die Zellen wurden diesen Differenzierungsbedingungen für 6 bis 11 Tage vor der Verwendung in FLIPR-Experimenten ausgesetzt.
C. In den Experimenten verwendete Standardlösungen.
Lösungen der folgenden Zusammensetzung (in mM) wurden in den Experimenten verwendet (Puffer ohne Probenicid, erworben von der Specialty Media (Puffer A und B: Kat.-# BSS053A; Puffer C & D: Cat. # BSS056A).

Puffer A (erster Spülpuffer): Krebs-Ringer-HEPES (KRH) Puffer: NaCl: 125, KCl: 5, MgSO₄: 1, 2, KH₂PO₄: 1,2, CaCl₂ 2H₂O: 2, Glukose: 6, HEPES: 25; pH: 7,4, (pH mit NaOH eingestellt).
Puffer B (farbstoffbeladender Puffer): KRH-Puffer mit 2,5 μM Probenicid: gleich wie Puffer A, jedoch wird Probenicid zu einer endgültigen Konzentration von 2,5 μM zugegeben. Probenicid (Cat. #P-8761, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde als Vorratslösung bei 250 mM hergestellt.
Puffer C (Puffer zum Herausspülen des Farbstoffs): KRH-Puffer mit 0 mM K⁺ und 2,5 μM Probenicid: NaCl: 130, MgSO₄: 1, 2, NaH₂PO₄: 1, 2, CaCl₂ 2H₂O: 2, Glukose: 6, HEPES: 25, pH: 7,4 (pH mit NaCH eingestellt)
Puffer D (Puffer zur Verdünnung der Verbindung): Puffer C mit 0,1 % w/v Rinderserumalbumin (BSA; Sigma).

D. Pharmakologische Standards und Verbindungen.
Die folgenden Lösungen wurden verwendet, um die hier offenbarten Daten zu erhalten.

Nitrendipin: (RBI Chemicals, Natick, MA): Vorrat: 10 mM in DMSO; Pipettier-Lösung: 9 μM, pipettiere 20 μL in 120 μL Volumen in Vertiefung für die endgültige Konzentration in der Vertiefung: 1 μM.
w-Conotoxin MVIIA: (Kat.-# H-8210; Bachem Inc. Torrance, CA): Vorrat: 1 mM in H₂O (HPLC-Qualität) mit 0,1 % BSA; Pipettier-Lösung: 4,5 μM; pipettiere 20 μL in 140 μL Volumen in Vertiefung für die endgültige Konzentration in der Vertiefung: 1 μM.
Vorratslösung an Testverbindung und Lösungsvorbereitung: Verbindungen wurden täglich als Vorratslösungen mit 10 mM in 100% DMSO hergestellt; Pipettier-Lösung: 45 μM oder serielle Verdünnungsreihen davon; pipettiere 20 μL in 140 μL Volumen in Vertiefung für die endgültige Konzentration in der Vertiefung: 1 μM oder 10-fache Verdünnung davon.
Hochkonzentrierte Kalium-(Depolarisations-)lösung: Puffer C mit zugegebenen 240 mM K⁺; pipettiere 80 μL in 160 μL Volumen in Vertiefung für die endgültige Konzentration in der Vertiefung von 80 mM K⁺.

E. Zellbeladung mit Fluoreszenzfarbstoffen
Herstellung der Fluoreszenzfarbstofflösung: Ein Calciumindikatorfarbstoff, Fluo-4-acetylinethylester (Fluo-4-AM; Cat. # F-124201; Molecular Proben, Eugene, OR) wurde verwendet, um Veränderung an intrazellulärem freien Calcium mit FLIPR zu messen. 1 mM Fluo-4-AM- Vorratslösung wurde durch Lösen in DMSO hergestellt. Diese Vorratslösung wurde dann auf 4,6 μM mit Puffer B verdünnt (Fluo-4-AM-Arbeitslösung).
Vorschrift zur Zellbeladung: Zellen enthaltende Platten wurden mit Puffer A unter Verwendung einer automatisierten Zellspülvorrichtung (Modell #:5161552, Labsystems Oy, Helsinki, Finland) gespült, wobei die Kontrollen auf die folgenden Parameter eingestellt waren: Zellhöhe: C/D; Zellpuls: 4/5, Spülvorgänge: 3, Volumen: 5; DRY-Positionseinstellung. Diese Einstellungen führten zu einer 70 μL Resttiefe des Puffers über den Zellen in jeder Vertiefung. 100 μL der Fluo-4-AM-Arbeitslösung wurden dann zu jeder Vertiefung zugegeben, was zu einer endgültigen Fluo-4-AM-Konzentration von 2,7 μM führte. Die Zellen wurden in dieser Lösung bei 37°C für 1–1,5 h inkubiert. Die Zellen wurden dann fünfmal unter Verwendung der Zellspülvorrichtung mit Puffer C gewaschen, wobei die gleichen Parameter wie bei den obigen Spülvorgängen vor der Beladung durchgeführt wurde mit den Ausnahmen: Spülvorgänge: 5; WET-Positionseinstellung. Ein letzter Spülvorgang wurde dann durchgeführt, indem die Parameter wie folgt geändert wurden: Spülvorgang: 1; Volumen: 2. Dies führte zu einem endgültigen Volumen in der Vertiefung von 120 μL. Die Zellen wurden dann zur Äquilibrierung unter diesen Bedingungen für 10 Minuten stehen gelassen und dann in dem FLIPR-Protokoll verwendet.
F. FLIPR-Protokoll
Instrumenteller Aufbau: Realzeitveränderungen des intrazellulären freien Calciums als Antwort auf die Kalium-induzierte Depolarisierung in Abwesenheit oder Anwesenheit von mutmaßlichen N-Kanal-Inhibitoren wurden entweder mit einer FLIPR I- oder FLIPR II-Vorrichtung (konfiguriert für ein Format mit 96 Vertiefungen) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen. Identische Einstellungen und Protokolle wurden bei jedem Instrument verwendet und die Ergebnisse, die von den beiden Vorrichtungen erhalten wurden, waren ununterscheidbar für einen Satz von Standardvergleichserbindungen.
FLIPR Hardwareeinstellungen: Die Laserstärke wurde auf etwa 0,3 Watt eingestellt. Die Anregungswellenlänge wurde auf einen Peak mit 488 nm eingestellt und die Emissionswellenlänge auf 540 nm. Die Apertur der Kamera wurde auf 2 eingestellt. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur (20–22°C) durchgeführt.
Plattenanordnung – Referenzsignale: Bestimmte Vertiefungen jeder Platte wurden Standards zugeordnet, um ein minimales und maximales spezifisches Fluoreszenzsignal zu bestimmen, gegen das die inhibitorischen Wirkungen der Verbindungen normalisiert wurden. Die Referenzstandards wurden an Plattenstellen einschließlich an den Rändern und innen liegenden Vertiefungen verteilt.
Maximales Signal (N-Kanal + nicht-spezifisch): 12 Vertiefungen wurden in einer Nitrendipin-Lösung (1 μM) inkubiert und 80 mM K⁺ wurden zugegeben, um eine maximale Ca²⁺-Zunahme, die durch N-Kanäle + nicht-spezifisches (nicht-L-, nicht-N-Kanal-vermittelte Fluoreszenzzunahme) vermittelt wurde, zu bestimmen. Der Variationskoeffizient unter diesen Vertiefungen für die K⁺-evozierte Peakzunahme in Fluoreszenzeinheiten lag typischerweise bei weniger als 12 %.
Minimales Signal (nicht-spezifisch): 6 Vertiefungen wurden in Nitrendipin (1 μM) + w-Conotoxin MVIIA und 80 mM zugegebenem K⁺ inkubiert, um den Ca²⁺-Hintergrund bei allen pharmakologisch besetzten N-Kanälen zu bestimmen. Der Peak der nicht-spezifischen Signalkomponente lag typischerweise bei weniger als 15 % der maximalen Peaksignalamplitude.
N-Kanal-Referenz aus einem kleinen Molekül: Eine Verbindung, die umfassend bezüglich der N-Kanal-Inhibitionsaktivität in sowohl FLIPR als auch elektro physiologischen Test mit arretierten Befestigungselementen charakterisiert worden war, wurde bei jeder Platte in dreifacher Ausführung bei 1 μM (nahe IC₅₀) zur Etablierung eines Referenzpunkts mitverwendet.
Testverbindungen: 5 Testverbindungen wurden auf ihre Wirkstärke auf jeder Platte evaluiert. Jede Verbindung wurde bei 5 zunehmenden Konzentrationen, die halblogarithmische Einheiten abdeckten, und typischerweise eine maximale Konzentration von 10 μM erreichten, getestet. Jede Konzentration wurde in dreifachen Vertiefungen getestet.
Protokollstruktur: Das FLIPR-Protokoll wurde als Drei-Lösungszugabe/Probennahme-Sequenzen (siehe nachfolgend) konfiguriert. Conotoxin (1 μM endgültige Konz.) wurde zu den passenden Vertiefungen vor der Platzierung der Platte in der FLIPR-Vorrichtung zugegeben. Die Vertiefungen enthielten anfänglich ein Gesamtlösungsvolumen von 100 μL und enthielten nach allen drei Lösungszugaben 240 μL. Die aktive Mischoption (durch die Pipette) wurde in keiner Sequenz verwendet.
Nitrendipin-Zugabesequenz: 28 s Gesamtdauer mit einer Fluoreszenzsignal-Probennahme bei 1 Hz für 2 s, gefolgt von der Zugabe von 20 μL Nitrendipin-Standardlösung bei 10 μL/s, gefolgt von einer Probennahme bei 0,5 Hz für 24 s.
Testverbindungszugabesequenz: 64 s Gesamtdauer mit Probennahme bei 0,5 Hz für 4 s, Testlösungszugabe von 40 μL bei 20 μL/s, gefolgt von einer Probennahme bei 0,2 Hz für 60 s.
Verbindungsinkubation, Zellendepolarisation und Calciumauslesesequenz: 1024 s Gesamtdauer mit einer Probennahme bei 0,0167 Hz für 840 s, gefolgt von einer Lösungszugabe, 80 μL, einer hochkonzentrierten K⁺-(Depolarisations-)Lösung, gefolgt von einer Probennahme bei 1 Hz für 180 s. Dieses endgültige 180 s-Probennahmeintervall stellte somit den Zeitraum dar, bei dem die Peakzunahme an intrazellulärem Calcium aufgrund des Flusses durch die aktivierten N-Kanäle auftrat.
G. Datenanalyse
FLIPR-Software: Vor dem Export wurden die Daten innerhalb des FLIPR-Softwaremoduls auf zwei Effekte normalisiert.
Grundlinienkorrektur: Die Grundlinie wurde durch „Nullwerteinstellung" („zeroing") bei Probe # 57 (unmittelbar vor der KCl-Zugabe) korrigiert. Diese Normierung diente zur Korrektur der Y-Achsenversetzung der Fluoreszenzspur jeder Vertiefung, so dass alle Spuren einen gemeinsamen Punkt gerade vor dem Einsetzen der relevanten evozierten Fluoreszenzzunahme aufwiesen.
Raumgleichförmigkeitskorrekturfaktor: Die Daten wurden durch ein Verfahren normalisiert, welches einen Mittelwert über die Platte von Fluoreszenzeinheiten von der ersten Probe an berechnet, und dann die Daten aus jeder Vertiefung mit einem Skalar multipliziert, der den Wert der ersten Probe auf diesen durchschnittlichen Wert anpasst, und somit Unterschiede in der absoluten Basislinienfluoreszenz unter den Vertiefungen, die durch Unterschiede in den Zelldichten oder der Farbstoffbeladung verursacht sind, normalisiert.
Externe Software: Die Daten wurden von FLIPR nach Excel als „*.squ"-Erweiterungs-Dateien exportiert. Nach dem erfolgten Export wurden Rechenschritte in Excel durchgeführt, um die maximale Peakamplitude (relativ zu der Nullwert-eingestellten Basislinie) der Fluoreszenzzunahme im Anschluss an die Kaliumzugabe in jeder Vertiefung zu berechnen. Die Messungen der Vertiefungen, bei denen eine Testverbindung zugegeben worden war, wurden dann als ein Prozentsatz zwischen den mittleren Amplituden der Referenzvertiefungen, die die maximale (100%) und nicht-spezifische (0%) Signalkomponenten wie zuvor beschrieben zur Verfügung stellen, normalisiert. Von dem resultierenden Prozentsatz an Inhibition durch die Testverbindungen wurde angenommen, dass er die Inhibition des Calciumflusses am Kanal vom N-Typ wiedergibt.
II. L-Kanal-FLIPR-Assay
Die nachfolgend beschriebenen Verfahren stellen zuverlässige auf FLIPR basierende Auslesedaten der Wirksamkeit und Stärke, mit der die Testverbindungen den Calciumfluss durch den Calciumkanal vom L-Typ, nativ exprimiert in einer vom Menschen abgeleiteten Neuroblastoma-Zell-Linie, SK-N-SH, inhibiert. Das Ausmaß, bis zu dem eine gegebene Verbindungskonzentration den L-Kanal inhibierte, wurde durch Vergleich der Zunahme der Calciumpeakamplitude auf einen 80 mM K⁺-Stimulus in der Testvertiefung zu der Peakzunahme in Vertiefungen ohne Verbindung bestimmt. Der Assay wurde validiert, indem 5-Punkt-Konzentration-Antwort-Kurven erhalten wurden und dadurch IC₅₀-Werte für die Referenz-L-Kanalblocker, Nitrendipin (30 nM), Nifedipin und Verapamil bestimmt wurden. Diese Werte waren mit den bekannten Literaturwerten für diese Mittel zur Blockierung des Ca²⁺-Flusses durch den L-Kanal vergleichbar.
A. Zellkultur:
Eine immortalisierte Zell-Linie, SK-N-SH, abgeleitet von humanen Neuroblastoma-Zellen (ATCC Produkt # HTB-11) wurde für alle Experimente verwendet. Die Zellen wurden in T75-Flaschen kultiviert, die Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) w/Earl-Salze mit 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1,0 mM Na-Pyruvat und 10% fötales Rinderserum (FBS; Cat. # SLM-034-B, Specialty Media) enthielten. Die Zellen wurden zu 100% Konfluenz kultiviert (durch visuelle mikroskopische Abschätzung), bevor sie subkultiviert wurden. Die Zellen wurden mit einem Verhältnis von 1:3 subkultiviert, indem sie zuerst mit 3 mL PBS gespült wurden, das PBS mit PBS, enthaltend 0,25 Trypsin, ersetzt wurde, bis sich die Zellen von der Oberfläche ablösten. 1 mL der resultierenden Suspension wurde dann in eine neue Flasche gegeben, die 10 mL frisches Medium enthielt. Die Zellen wurden dann inkubiert (37°C, 5 % CO₂) und die Medien wurden etwa 3 Tage nach der Subkultivierung ausgetauscht.
B. Herstellung der Zellen für Experimente:
Für die Experimente verwendete Zellen wiesen ein Wachstumsstadium mit 100% Konfluenz auf. Jede Flasche enthielt genügend Zellen für 3 Platten mit 96 Vertiefungen. Die Zellen wurden von der Flasche durch Zugabe von 0,25 % Trypsin, wie für das Subkultivierungsprotokoll beschrieben, abgelöst. Sobald sie abgelöst waren, wurden 7 mL frische Medien zu der Flasche zugegeben und die Lösung sanft trituriert. 20 mL zusätzliche Medien wurden dann zugegeben und 100 μL dieser endgültigen Zellsuspension wurden zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben. Vor der Verwendung in den Experimenten wurden die Platten bei 37°C in 5 % CO₂ inkubiert, bis die Zellen eine Konfluenz von 100% erreichten (1–2 Tage).
C. Experimentelle Verfahren:
Die Zusammensetzung von Lösungen, Hardware-Einstellungen, das Platten-Layout, die Struktur des FLIPR-Protokolls und die analytischen Einstellungen und Vorgehensweisen waren identisch zu denjenigen, die hier für die N-Kanal-Assays beschrieben wurden, mit den folgenden Unterschieden bezüglich des Platten-Layouts und der Referenzsignale.
Maximales Signal (L-Kanal + nicht-spezifisch): 12 Vertiefungen erhielten nur 20 μL Pufferzugabe (kein Nitrendipin) in der ersten Lösungszugabesequenz, um die maximale K⁺-evozierte Ca²⁺-Zunahme, die durch L-Kanäle + nicht-spezifisches (nicht-L-Kanal- vermittelte Fluoreszenzzunahme) vermittelt wurde, zu definieren. Der Variationskoeffizient unter diesen Vertiefungen für die K⁺-evozierte Peakzunahme in Fluoreszenzeinheiten betrug typischerweise weniger als 12 %.
Minimales Signal (nicht-spezifisch): 6 Vertiefungen wurden in Nitrendipin (1 μM) inkubiert, gefolgt von 80 mM K⁺, die zugegeben wurden, um den Hintergrund an Ca²⁺ mit allen pharmakologisch besetzten L-Kanälen zu bestimmen. Der Peak der nicht-spezifischen Signalkomponente betrug typischerweise weniger als 15 % der maximalen Signalpeakamplitude. Kleines L-Kanal-Referenzmolekül: Nitrendipin wurde in dreifacher Ausführung in Vertiefungen von jeder Platte bei 30 nM (nahe IC₅₀) für einen Referenzauslesewert eingeschlossen.
III. N-Kanal-Elektrophysiologie eines arretierten Befestigungselement
Herkömmliche Aufzeichnungstechniken an der intakten Zelle wurden verwendet, um direkt die Fähigkeit der Testverbindungen zu messen, den Ca²⁺-Strom durch die Calciumkanäle vom N-Typ zu inhibieren. Der N-Typ-Strom wurde sowohl von neuronal differenzierten IMR-32-Zellen als auch von nativen dem oberen Halsganglion von jungen postnatalen Ratten frisch entnommenen Neuronen aufgezeichnet. Jeden Tag wurden die Strömungen in beiden Zelltypen als N-Strömungen bestätigt, was zeigte, dass mehr als 90% der gesamten nach innen gerichteten Strömung während der Depolarisationsschritte durch eine supramaximale Konzentration (3 mM) von w-Conotoxin MVIIA blockiert wurde. Zusätzlich wurde die Stärke von w-Conotoxin MVIIA periodisch mit etwa 3 nM (IC₅₀) bestimmt, was einem Wert entspricht, der mit denjenigen konsistent ist, der in der Literatur beschrieben ist. Die Ergebnisse für einen Untersatz der Verbindungen, die in beiden Zelltypen getestet wurden, unterschieden sich nicht signifikant. Daher wurden die Daten als ein Datensatz angesehen, soweit es nicht anders angegeben ist.
A. IMR-32-Zellkultur und Differenzierung:
IMR32-Zellen wurden kultiviert und neuronal unter Verwendung von Verfahren, die identisch zu denjenigen sind, die für den FLIPR-N-Kanal-Assay beschrieben sind, außer dass für die Differenzierung die Zellen in 35 mm Plexiglaskulturschalen anstatt auf Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert wurden, differenziert.
B. Dissoziation der Neuronen aus dem oberen Halsganglion von Ratten (SCG):
7 bis 10 Tage alte Rattenwelpen wurden in einer Kammer, die eine hohe CO₂-Atmosphäre enthielt, euthanasiert. Unmittelbar anschließend wurde der SCG chirurgisch isoliert, entfernt und in eiskalte ausgeglichene Hanks-Salzlösung (HBSS) gegeben. Die SCGs wurden entblättert, aufgeschnitten und in eine Lösung von HBSS, enthaltend 20 U/mL Papain (37°C), für 15 Minuten gegeben. Die Papainlösung wurde dann gegen HBSS (37°C), enthaltend 16 mg/mL Dispase und 400 U/mL Collagenase, mit sanfter Trituration des Gewebes alle 15 Minuten für 40 Minuten ausgetauscht. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation rückgewonnen und in L-15-Medium bei 4°C für eine Verwendung am selben Tag gelagert. Zur Aufzeichnung wurde ein Tropfen der Zellen enthaltenden Lösung in eine mit Poly-L-lysin beschichtete 35 mm Plexiglaskulturschale gegeben und es wurde den Zellen erlaubt, für mehrere Minuten anzuhaften.
C. Elektrophysiologische Vorschriften:
Lösungen: Die Aufzeichnungslösungen wurden denjenigen angepasst, die von Thompson und Wong (1991) J. Physiol. 439:671–689 beschrieben wurden. Die Lösungen wurden als Aliquote für nicht mehr als einen Monat (intrazellulär, –20°C, extrazellulär, 4°C) vor den Experimenten gelagert. Die Pipettenlösung (intrazellulär) enthielt (in mM): TRIS, 130; CsBAPTA, 10; HEPES, 10; Mg²⁺ATP, 5; pH auf 7,3 mit Methansulfonsäure; Osmolalität ~ 315 mOsm. Die extrazelluläre Lösung enthielt (in mM): TRIS 120; CsCl, 5; HEPES, 10; Mg²⁺Cl, 1; Ba²⁺Cl, 5, Glukose, 25; Tetraethylammoniumchlorid, 15; Tetrodotoxin, 200 (zugegeben zur Zeit des Experiments); pH auf 7,4 mit Methansulfonsäure; Osmolalität ~ 320 mOsm.
Aufzeichnung und Analyse an der intakten Zelle: Die Spannungsbefestigungsvorrichtungskonfiguration für intakte Zellen der Technik mit arretierten Befestigungsvorrichtungen wurde wie von Hamill et al. (1981) Pflügers Arch. 391:85–100 beschrieben verwendet, um spannungsabhängige Calciumströme zu isolieren. Zellen enthaltende Kulturschalen wurden in einer Kammer auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops platziert. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur (20–22°C) durchgeführt. Befestigungspipetten wurden aus dünnwandigem Glas (1,5 mm AD, 1,12 mm ID; World Precision Instruments, New Haven, CN) auf einer Brown-Flaming P-86-Auszugsvorrichtung (DC-Widerstand: 3–6 MΩ; Sutter Instr. Co., Novato, CA) hergestellt. Ein Axopatch 1B-Verstärker (Axon Instruments, Foster City, CA) wurde verwendet, um Strömungssignale zu erhalten und dieser war an einen PC durch entweder ein TL-1 (Scientific Solutions, Solon, OH)- oder Digidata 1200 (Axon Instr.)-Interface verbunden. Das Strömungssignal wurde auf Null mit Hilfe einer Pipette, die in das Bad gerade vor der Bildung eines Siegels auf dem Neuron eingetaucht wurde, ausgeglichen. Der Versiegelungswiderstand lag in dem Bereich von 1 bis mehr als 10 GΩ. Der Serienwiderstand lag für gewöhnlich bei weniger als 10 MΩ und wurde nicht elektronisch kompensiert. Die digitalisierte Datengewinnung und die Spannungs schrittprotokolle wurden mit der Software pClamp 6.0 (Axon Instr.) erstellt. Die Daten wurden bei weniger als der halben digitalen Aufzeichnungsgeschwindigkeit vor der Digitalisierung bei geringem Eingang (low pass) gefiltert. Zur Aufzeichnung der Ströme vom N-Typ zur Bewertung der inhibitorischen Stärke der Verbindung (Gleichgewichtskonzentration-Antwort-Analyse) wurden 200 ms Spannungsschritte auf +10 mV in 15 s Intervallen von einem Haltepotential von –90 mV angelegt. Die aufgezeichneten Strömungen wurden On-Line mit einem P-4 oder P-6-Subpulsprotokoll in der pClamp-Software lecksubtrahiert (leak subtracted). Um den offenen Kanalblock von Verbindungen zu bewerten, wurden 10 ms Spannungsschritte auf +10 mV bei variierenden Frequenzen von einem Haltepotential von –90 mV ohne Verwendung einer On-Line-Lecksubtraktion angelegt. Diese Spannungsprotokolle ergaben konstante Amplituden für nach innen gerichtete Strömungen über einen Aufzeichnungszeitraum von 5–10 Minuten. Die Peakströmungsamplitude wurde unter Verwendung des Clampfit-Moduls der pClamp-Software analysiert. Die Software Origin 5.0 (Microcal Corp., Northampton, MA) wurde verwendet, um iterativ die Konzentrations-Antwort-Daten auf eine Standard-Hill-Funktion anzupassen und graphische Aufbereitungen von Strömungsspuren und analysierten Daten zur Verfügung zu stellen.
Arzneimittel-/Verbindungs-Vorbereitung und Verabreichung: Die Testverbindungen wurden als 10 mM Vorratslösungen in DMSO hergestellt und geeignete Volumina dieser Vorratslösungen wurden in extrazellulärem Puffer gelöst, um die gewünschten Konzentrationen zu erhalten. Die Lösungen, die Arzneistoffe/Verbindungen enthielten, wurden fokal von irgendeinem der sechs linear angeordneten mit Glas ausgekleideten Röhren (200 mm o.d., Hewlett Packard, Wilmington, DE), die 100 mm von dem aufgezeichneten Neuron positioniert waren, appliziert. Jede Lösung wurde von der gewünschten Röhre durch ein elektronisch reguliertes Solenoid-Ventilsystem (BME Systems, Baltimore, MD) freigesetzt. Dieses System erzielte eine schnelle (< 100 ms) Äquilibrierung der Arzneistofflösung in der extrazellulären Phase ohne die Aufzeichnungscharakteristika zu stören.
Die Verbindungen der Erfindung haben im Allgemeinen eine Bindungsaffinität, ausgedrückt als der IC₅₀ (μM), für den Calciumkanal vom N-Typ, gemessen durch den FLIPR-Assay, von etwa 10 μM oder weniger. Zum Beispiel weisen die Verbindungen der Beispiele 4, 66, 74 und 75 jeweils IC₅₀-Werte von 3,57, 2,37, 3,56 und 10,54 μM auf
IV. Formalin-Test
Der Formalin-Test bewertet die inhibitorischen Wirkungen der oral verabreichten Antagonisten des Calciumkanals vom N-Typ auf das Formalin-induzierte nocifensive Verhalten von Ratten. Der Formalin-Test ist ein gut etablierter Schmerztest (Dubuisson und Dennis, 1977; Wheeler-Aceto et al., 1990; Coderre et al., 1993). Dieser Test besteht aus zwei getrennten Phasen von Formalin-induziertem Verhalten. Die Antwort auf die erste Phase, die zwischen 0 und 5 Minuten auftritt, wird durch akute Nocizeption gegenüber der toxischen Chemikalie (Formalin), die in die Pfote eingespritzt wurde, verursacht. Dem schließt sich eine Ruheperiode von etwa 5 bis 15 min nach der Injektion an. Eine zweite Antwortphase, die nach 15 Minuten eintritt und bis zu 60 Minuten andauert, wird durch die Sensibilisierung der zentralen Neuronen in dem dorsalen Horn verursacht. Die zentrale Sensibilisierung verstärkt den schädlichen afferenten Eingang und ein stärkeres Schmerzfeuer wird in das Gehirn übertragen. Die Inhibition der Antwort in der zweiten Phase ist Indikativ für einen zentralen Mechanismus der Arzneimittelwirkung.
Die Prozedur für den Formalin-Test ist wie folgt. Männliche Ratten werden in eine Plexiglaskammer gesetzt und für 30–45 min beobachtet, um ihre Grundlinienaktivität zu beobachten. Mehrere Gruppen von Tieren werden mit entweder Vehikel oder verschiedenen Dosen einer Testverbindung vorbehandelt. Die Tiere werden mit dem Arzneistoff von Interesse entweder 40 min, falls durch die intraperitoneale Route, oder für 90 min, falls durch die orale Route, vor der Injektion von Formalin in eine Hinterpfote (unter die dorsale Haut; 0,05 mL steriles 5%iges Formalin) dosiert. Die Anzahl an Pfotenzuckungen und Leckvorgängen während der ersten Phase (0–5 min) und der zweiten Phase (20–35 min) werden mitgezählt und aufgezeichnet. Zuck- und Leck-Antworten werden als Prozentsatz der Inhibition im Vergleich zu dem durchschnittlichen Zahlenwert einer Kontrollgruppe mit Kochsalz berechnet. Die Arzneimittelwirksamkeit wird als die Dosis ausgedrückt, die 50% der maximalen inhibitorischen Wirkung („ID₅₀") verursachte, ausgedrückt. Student-T-Tests werden für die statistische Analyse verwendet, um die Signifikanz der Arzneimittelwirkungen zu bestimmen. Die Verbindungen werden als aktiv auf Grundlage ihrer Fähigkeit, die Zuckungsantwort zu inhibieren, beurteilt.
V. Chronischer einschränkender Verletzungstest.
Der chronische einschränkende Verletzungstest („CCI") oder das neuropathische Schmerzmodell beurteilt neuropathische Schmerzen, die mit Nervenverletzungen in Verbindung gebracht werden, die direkt durch ein Trauma und eine Quetschung entstehen können oder indirekt aus Krankheiten, die von Infektionen bis Krebs, metabolischen Erkrankungen, Giften, Ernährungsmängeln, immunologischen Fehlfunktionen und muskuloskelettalen Veränderungen reichen. In dem CCI-Modell (Bennett und Xie, 1988) wird eine unilaterale peripherale Neuropathie in Ratten durch ein partielles Abbinden von Nerven erzeugt.
Sprague-Dawley-Ratten (250–350 g) werden mit Natriumpentobarbital betäubt und der gemeine sciatische Nerv wird auf der Höhe des mittleren Oberschenkels durch stumpfe Dissektion durch den Biceps femoris freigelegt. Eine Sektion des Nerven (etwa 7 mm) proximal zu der sciatischen Trifurkation, wird freigelegt und 4 Mal mit einer chromischen Catgut-Naht abgebunden. Die Naht wird mit etwa 1 mm Abstand zwischen den Ligaturen gebunden. Der Einschnitt wird in Schichten geschlossen und es wird den Tieren ermöglicht, sich zu erholen. Die thermische Hyperalgesie wird unter Verwendung des Pfotenrückziehtests (Hargreaves et al., 1988) gemessen. Die Nervenkompression aufgrund der partiellen Nervenligation verursacht kürzere Latenzzeiten für das Zurückziehen der Pfote im Vergleich zu der Latenzzeit für das Zurückziehen von Pfoten bei normalen oder scheinoperierten Füßen. Die Tiere werden auf einem erhöhten Glasboden gehalten. Eine strahlende Hitzequelle wird auf den mittel-plantaren Hinterpfotenbereich (Gebiet des sciatischen Nervs) durch den Glasboden mit einer Unterbrechung nach 20 Sekunden zur Vermeidung der Verletzung der Haut gerichtet. Die Latenzzeiten für den Rückzugsreflex in beiden Pfoten werden aufgezeichnet. Die Antwort auf die Testverbindungen werden zu verschiedenen Zeiten im Anschluss an die orale Verabreichung bewertet, um die Zeit bis zum Einsetzen der Wirkung und die Wirkdauer der Arzneimittelwirkung zu bestimmen. Dosis-Antwort-Studien wurden mit mehreren Gruppen von CCI-Ratten durchgeführt, denen entweder ein Vehikel oder die Testverbindung für 5 Tage oral verabreicht wurde. Die Latenzzeiten für das Zurückziehen der Pfote wurden jeden Tag vor der ersten täglichen Dosis gemessen. Die Datenanalyse wurde durch einen mehrfachen Vergleich der Mittel (Dunnett-Test) durchgeführt und die Wirksamkeit der Arzneistoffe wird als die Dosis ausgedrückt, die 50% der maximalen Wirksamkeit („EC₅₀") verursacht.
Chemische Verfahren:
Verfahren A:
Bestimmte Zwischenprodukte von hierin beschriebenen beispielhaften Verbindungen, siehe Tabelle 1, wurden in einer analogen Weise zu diesem Verfahren hergestellt, welches die Herstellung des Chinolin-Zwischenproduktes, 2-(4-Cyclohexylphenyl)-4,6-chinolindiamin, von Beispiel 58 beschreibt.
3-(4-Cyclohexylphenyl)-3-oxo-propionsäureethylester
Eine 60%ige Öldispersion von Natriumhydrid, 21,7 g (0,543 Mol), wurde in einen 2 Liter großen Dreihals-Rundkolben gegeben, der mit einem Zugabetrichter, Stickstoffeinlass, Magnetrührer, Heizmantel, Thermopaar und Kühler ausgestattet war. Hierzu wurde 1 Liter trockenes Hexan hinzugesetzt. Die resultierende Suspension wurde dann 15 Minuten lang gerührt, das Rühren wurde abgebrochen und die Feststoffe ließ man sich absetzen. Der klare Überstand, welcher das Hexan und gelöstes Öl enthielt, wurde dann mittels einer Kanüle entfernt. Diethylcarbonat (1 L) wurde den Feststoffen hinzugesetzt, und die Suspension wurde auf 120°C erhitzt. Zu dieser Suspension wurde eine Lösung von 100 g (0,494 Mol) 4'-Cyclohexylacetophenon, gelöst in 250 mL Diethylcarbonat, vorsichtig tropfenweise hinzugesetzt, und zwar über 40 Minuten. Im Verlauf der Zugabe wurde eine Reaktion gestartet, Wasserstoff entwickelte sich und die Farbe änderte sich zu gelbbraun. Nachdem die Acetophenonderivat-Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung 1 weitere Stunde erhitzt. Die Reaktion wurde gekühlt und in einen 2 L großen Scheidetrichter gegossen. Die Diethylcarbonatschicht wurde rückgewonnen, zweimal mit 10%iger Essigsäurelösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Diethylcarbonatlösung wurde dann filtriert und auf einem Rotationsverdampfer konzentriert, gefolgt unter einem Pumpen unter hohem Vakuum bei 70°C während 18 h. Nach dem Kühlen für 24 h kristallisierte sich ein farbloser Feststoff. Die erhaltene Titelverbindung wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Ausbeute 133 g (98 %). ¹H NRM enthüllte, dass das b-Keto-Esterprodukt in der Tat als eine Keto-Enol-Tautomermischung in Lösung vorliegt, wobei die Keto-Form in dem Feststoff vorherrscht.
3-(4-Acetylaminophenylamino)-3-(4-cyclohexylphenyl)-acrylsäurebutylester
3-(4-Cyclohexylphenyl)-3-oxo-propionsäureester 50,25 g (0,183 Mol), 4'-Aminoacetanilid 25 g (0,167 Mol), 4'-Aminoacetanilid-Hydrochloridsalz, 1,55 g (0,008 Mol), und 500 mL trockenes n-Butanol wurden in einen 1 Liter großen Einhals-Rundkolben gegeben, der mit einer Soxhlet-Extraktor-Apparatur mit Kühler, Magnetrührer und Stickstoffeinlass ausgestattet war. In das Soxhlet-Röhrchen (33 × 118 mm) wurden stark aktivierte 4
-Siebe (1,7–2,4 mm Kügelchen) gegeben. Die Siebe wurden direkt vor der Verwendung unter hohem Vakuum unter Erhitzen aktiviert (400°C während 30 Minuten). Die Mischung wurde dann bis zum Rückfluss gebracht, so dass das Butanol azeotrop Wasser entfernte, so dass die Gleichgewichtsreaktion angetrieben wurde, und das Wasser wurde von dem Butanol mittels der Siebe entfernt, bevor es zu dem Reaktionstopf rückgeführt wurde. Die Reaktion wurde 48 h lang fortgesetzt. Die Beladung der Siebe wurde nach den ersten 24 h erneuert. Eine Umesterung zu dem Butylester zusammen mit der Entfernung an Ethanol trat gleichzeitig mit der Enaminbildung auf. Nach 48 h wurde der Reaktionstopf gekühlt, in einen –40°C kalten Gefrierschrank gestellt, und es konnten sich 24 h lang Kristalle bilden. Kristalle wurden mittels Vakuumfiltration gesammelt und Feststoffe wurden mit kaltem Ethanol gewaschen. Das Produkt wurde dann in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch man 73,8 g (98 %) des gewünschten Enamins erhielt.
N-[2-(4-Cyclohexylphenyl)-4-hydroxy-chinolin-6-yl]-acetamid
1,2 L an Dowtherm A wurden in einen 2 L großen Dreihals-Rundkolben, der mit einem Kühler, Magnetrührer, Thermopaar, Heizmantel mit einem Regler zur variablen Spannungseinstellung und einem Stickstoffeinlass ausgestattet war, gegeben. Das Lösungsmittel wurde auf 250°C erhitzt und 3-(4-Acetylaminophenylamino)-3-(4-cyclohexylphenyl)-acrylsäurebutylester 48 g (0,11 Mol), wurde vorsichtig in kleinen Portionen hinzugesetzt. Als die Portionen hinzugesetzt wurden, entwickelte sich Gas und ein Schäumen trat auf. Kristalle vom Produkt fingen an sich zu bilden und hafteten an den Seiten des Gefäßes. Nachdem das gesamte Material hinzugesetzt worden war, wurde ein Erhitzen der Mischung 1 h lang fortgesetzt. Die Mischung wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und Hexan wurde hinzugesetzt. Ein festes Produkt wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt und mit Hexan gewaschen. Nach dem Trocknen in einem Vakuumofen wurden 35,7 g (90 %) an Produkt rückgewonnen.
N-[2-(4-Cyclohexylphenyl)-4-methoxy-chinolin-6-yl]-acetamid
N-[2-(4-Cyclohexylphenyl)-4-hydroxy-chinolin-6-yl]-acetamid, 35,7 g (0,099 Mol), wurde in einen 500 mL großen Dreihalsrundkolben, der mit einem Kühler, Magnetrührer und Stickstoffeinlass ausgestattet war, mit 250 mL Toluol gegeben. Das Material wurde mittels rühren suspendiert, und 20,6 ml (0,21 Mol) Dimethylsulfat wurden hinzugesetzt. Die Suspension wurde dann mit einem Silikonöl-Heizbad bis zum sanften Rückfluss 18 h lang erhitzt. Nach diesem Zeitraum wurde die Reaktion abkühlen gelassen, und Hexan wurde hinzugesetzt. Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration gesammelt, und mit Hexan gewaschen. Nach dem Trocknen wurden die Feststoffe in einem 2 L großen Erlenmeyerkolben mit 1 L 5%iger Natriumhydroxidlösung suspendiert. Die Suspension wurde kräftig gerührt und auf 70°C 30 Minuten lang erhitzt. Dies wandelte die Salzform des Materials zu der freien Base um und entfernte einige Verunreinigungen. Nach dem Kühlen wurden die Feststoffe mittels Vakuumfiltration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch man 35,8 g (96 %) an Material erhielt, welches etwa 30 % Nebenprodukte enthielt, wobei das N-methylierte Material die Hauptverunreinigung ausmachte. Das Material wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
N-[4-Amino-2-(4-cyclohexylphenyl)-chinolin-6-yl]-acetamid
N-[2-(4-Cyclohexylphenyl)-4-methoxy-chinolin-6-yl]-acetamid (35 g) wurde in einen 500 mL großen Dreihalsrundkolben gegeben, der mit einem mechanischen Rührer und Kühler, Stickstoffeinlass und Gasauslass, ausgestattet war, und zwar mit 250 g Ammoniumacetat. Die gerührte Feststoffsuspension wurde dann auf 115°C erhitzt. Ammoniak wurde entwickelt, und das Material wurde verschmolzen und in Essigsäure gelöst, welche sich im Zeitverlauf bildete. Die Temperatur wurde langsam auf 140°C innerhalb von 1 h erhöht. Es wurde Vorsicht walten gelassen, um sicherzustellen, dass der Kühler und der Gasauslass klar bezüglich festen Ammoniumacetats war, welches sich auf kalten Oberflächen durch Sublimation von überschüssigem Ammoniumacetat sammelt. Nach 4 Stunden des Erhitzens wurde die Reaktion gekühlt und in 1 L Wasser gegossen. Der pH-Wert wurde dann auf 9,5 durch langsame Zugabe einer konzentrierten NaOH-Lösung unter Anwendung von Eiskühlung eingestellt. Ethylacetat wurde dann hinzugesetzt, und die Mischung wurde filtriert. Feste Verunreinigungen, wobei einige davon N-methylierte Nebenprodukte von dem vorausgehenden Schritt waren, wurden entfernt, und das flüssige Filtrat wurde in einen 2 L großen Scheidetrichter gegossen. Die Ethylacetatschicht wurde rückgewonnen, zweimal mit 5%iger NaOH-Lösung gewaschen und dann über Na₂SO₄ getrocknet. Nach der Filtration wurde das Lösungsmittel abgedampft, wodurch man 22 g (60 %) eines Feststoffes erhielt, welcher hauptsächlich aus dem gewünschten Produkt mit etwa 20 % des N6-deacetylierten Materials, 2-(4-Cyclohexylphenyl)-4,6-chinolindiamin, bestand. Das Material wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
2-(4-Cyclohexylphenyl)-4,6-chinolindiamin
N-[4-Amino-2-(4-cyclohexylphenyl)-chinolin-6-yl]-acetamid (22 g) wurde in einen 1 L großen Kolben gegeben, zu dem 500 mL 6 N HCl hinzugesetzt wurden, und die Mischung wurde unter Rühren auf 95°C 18 h lang erhitzt. Nach diesem Zeitraum wurde die Lösung in Eis gekühlt und dann vorsichtig mit konzentrierter NaOH-Lösung neutralisiert, gefolgt von der Einstellung auf einen pH-Wert von 9,5. Die Lösung wurde dann in einen 2 L großen Scheidetrichter gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde dann über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, wodurch man 17 g des gewünschten Produktes erhielt. Eine wiederholte Kristallisation unter Verwendung von Methanol, Methylenchlorid und Hexan ergab 9,0 g (41 %) der reinen Titelverbindung.
Verfahren B:
Bestimmte Zwischenprodukte von hierin beschriebenen beispielhaften Verbindungen, siehe Tabelle 1, wurden in einer analogen Weise zu diesem Verfahren hergestellt, welches die Herstellung des Chinolin-Zwischenproduktes, 2-(3-Fluorphenyl)-4,6-chinolindiamin, von Beispiel 99 beschreibt.
3-(3-Fluorphenyl)-3-oxo-propionsäureethylester
Diese Verbindung wurde aus m-Fluoracetophenon in einer Weise hergestellt, die analog zu der Herstellung von 3-(4-Cyclohexylphenyl)-3-oxo-propionsäureethylester (Verfahren A) war, außer dass das Produkt Vakuumdestillation (Sdp.: 114–117°C bei 0,8–0,9 mmHg) in einer Ausbeute von 91 % gereinigt wurde.
3-(4-Nitrophenylamino)-3-(3-fluorphenyl)-acrylsäurebutylester
4-Nitroanilin, 63,0 Gramm (0,456 Mol), 4-Nitroanilin-hydrochlorid, 4,0 Gramm (0,023 Mol), 3-(3-Fluorphenyl)-3-oxo-propionsäureethylester, 106,3 Gramm (0,506 Mol) wurden in einen trockenen 2 L großen Rundkolben gegeben. Zu der Mischung wurden 1,3 L n-Butanol gegeben, und der Kolben wurde mit einem Soxhlet-Extraktor (Bechervolumen von 0,3 L), Kühler und Stickstoffeinlass ausgestattet. Trockene aktivierte 4
-Siebe (200 Gramm) wurden in den Extraktorbecher gestellt, und die Reaktionsmischung wurde auf eine Rückflusstemperatur von 118°C unter Stickstoff erhitzt und bei dieser Temperatur 90 h lang gehalten. Die Reaktionsmischung wurde noch heiß von einer kleinen Menge an Feststoffen dekantiert und auf –15°C 48 h lang gekühlt. Kristalline Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration gesammelt. Die Kristalle wurden mit 0,2 L kaltem Ethanol und zwei 0,2 L großen Portionen an Hexanen gewaschen und bei 50°C über Nacht vakuumgetrocknet, wodurch man 35,8 Gramm (20,8 Ausbeute) der Titelverbindung erhielt.
Die Mutterlaugen von der vorstehenden Reaktion wurden konzentriert, mit 1,0 L Toluol verdünnt, und das Toluol wurde im Vakuum entfernt; dieser Prozess wurde zweimal wiederholt. Die Laugen wurden dann in 1, 0 L n-Butanol verdünnt, und 1,75 Gramm (10,0 mMol) 4-Nitroanilinhydrochlorid wurden hinzugesetzt; der Kolben wurde mit einem Soxhlet-Extraktor, wie vorstehend beschrieben, ausgestattet, und der Becher wurde mit frischen 200 Gramm an Sieben befüllt. Die Mischung wurde unter Stickstoff gestellt und auf die Rückflusstemperatur für 90 h gebracht. Die Mischung wurde dann gekühlt und auf ein Endvolumen von 0,6 L im Vakuum reduziert. Die Lösung wurde dann mit kristallinem 3-(4-Nitrophenylamino)-3-(3-fluorphenyl)-acrylsäurebutylester bekeimt und bei –15°C 48 h lang stehen gelassen. Kristalle wurden wie vorstehend beschrieben gesammelt, und 64,3 Gramm wurden nach dem Trocknen erhalten. Die Analyse dieses Materials zeigte, dass sie 4-Nitro-anilin enthielt, und es wurde einer Flash-Chromatographie unterzogen. Das Produkt wurde in 0,5 L 1:1 Methylenchlorid zu Hexan gelöst und auf eine Säule von 3,0 L mit nass gepacktem Silica in 1:1 Methylenchlorid zu Hexan aufgetragen. Die Säule wurde mit 4,0 L 1:1 Methylenchlorid zu Hexan; 9,0 L 2:1 Methylenchlorid zu Hexan; und 2,0 L Methylenchlorid eluiert. Fraktionen von 0,5 L wurden gesammelt, und jene, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt, wodurch man 41,7 Gramm (24,3 %) eines hellgelben Feststoffes erhielt. Die vereinigte Ausbeute betrug 45,1 %.
2-(3-Fluorphenyl)-6-nitro-chinolin-4-ol
Dowtherm A, 0,75 L, wurde in einen 3 L großen Dreihalskolben, der mit einem mechanischen Rührer, Claisen-Adapter, der eine Thermopaar-Sonde hielt, und einem Rückflusskühler mit Stickstoffeinlass ausgestattet war, gegeben und auf 250°C erhitzt. Hierzu wurden vorsichtig in kleinen Portionen 77,0 Gramm (0,215 Mol) 3-(4-Nitrophenylamino)-3-(3-fluorphenyl)-acrylsäurebutylester über einen Zeitraum von 0,25 Stunden gegeben. Die Mischung wurde bei 250°C 1,5 Stunden lang gehalten und dann auf 90°C über einen Zeitraum von 2 Stunden abgekühlt. Die Mischung wurde mit 1,0 L Hexanen behandelt und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, während über Nacht gerührt wurde. Die gelbbraunen Feststoffe wurden mittels Saugfiltration gesammelt und mit drei 0,15 L großen Portionen an Hexanen gewaschen. Die Feststoffe wurden unter Vakuum bei 50°C über Nacht getrocknet, wodurch man 58,63 Gramm (96,0%) der Titelverbindung erhielt.
6-Nitro-4-chlor-2-(3-fluorphenyl)-chinolin
6-Nitro-2-(3-fluorphenyl)-chinolin-4-ol, 5,2 g (16,3 mMol), wurde in einen 500 mL großen Dreihals- Rundkolben, der mit einem Kühler, Magnetrührer und Stickstoffeinlass ausgestattet war, gegeben. Hierzu wurden 15,2 mL (25,0 g, 163 mMol, 10 Äq.) Phosphoroxychlorid unter Rühren hinzugesetzt. Die Mischung wurde dann auf 110°C 4 h lang erhitzt. Am Ende dieses Zeitraums wurde die Reaktion auf Raumtemperatur gekühlt, und Wasser wurde vorsichtig tropfenweise hinzugesetzt, bis das gesamte POCl₃ verbraucht war. Ein Material kristallisierte aus dem Wasser aus, und die Feststoffe wurden mittels Filtration gesammelt. Die Feststoffe wurden dann mit Wasser gewaschen und in einen 250 mL großen Erlenmeyer gegeben und mit Wasser trituriert. Nach dem Sammeln mittels Filtration, Waschen mit Wasser und Trocknen in einem Vakuumofen wurden 4,6 g (84 %) der Titelverbindung erhalten.
6-Nitro-4-azido-2-(3-fluorphenyl)-chinolin
6-Nitro-4-chlor-2-(3-fluorphenyl)-chinolin, 3,2 g (9,50 mMol), wurden in einen 250 mL großen Dreihals-Rundkolben, der mit einem Kühler, Magnetrührer, Silikonöl-Heizbad, Stickstoffeinlass und Gasauslass ausgestattet war, gegeben. Hierzu wurden 75 ml N-Methylpyrrolidinon, dann 6,0 g (95 mMol, 10 Äq.) Natriumazid hinzugesetzt. Die Mischung wurde gerührt und auf 60°C 18 h lang erwärmt. Nach diesem Zeitraum wurde die Mischung gekühlt, in einen 1 L großen Scheidetrichter, der 500 mL Wasser und 250 mL Ethylacetat enthielt, gegossen. Der pH-Wert wurde auf 9,0 eingestellt, und die Schichten wurden getrennt. Die wässrigen Schicht wurde zweimal mit 100 mL Ethylacetat extrahiert, die organischen Schichten wurden vereinigt, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, wodurch man ein Produkt erhielt, welches zu dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung herüber genommen wurde.
2-(3-Fluorphenyl)-4,6-chinolindiamin
6-Nitro-4-azido-2-(3-fluorphenyl)-chinolin wurde in ein 500 mL großen Dreihalskolben, der mit einem Kühler, Magnetrührer, Stickstoffeinlass, Gasauslass und einem Silikonöl-Heizbad ausgestattet war, gegeben und in 250 mL Ethylacetat und 50 mL Ethanol suspendiert. Die Mischung wurde gerührt, bis zum Rückfluss erhitzt, 20 g (89 mMol, 6 Äq.) Zinn (II)-Chlorid-Dihydrat wurden vorsichtig portionsweise während 40 Minuten hinzugegeben, und die Mischung wurde weitere 2 h lang erhitzt. Am Ende dieses Zeitraums wurde die Mischung gekühlt und in 500 mL Wasser gegossen. Der pH-Wert wurde vorsichtig auf 9,0 eingestellt, und die Lösung wurde filtriert. Feststoffe wurden mit 100 mL Ethylacetat gewaschen, die Filtrate wurden vereinigt, und die wässrige Schicht wurde zweimal mit 200 mL Ethylacetat extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde auf einer Silikagelsäule unter Verwendung von 10 % Methanol in Ethylacetat als Elutionsmittel chromatographiert und dann aus Methylenchlorid und Hexan umkristallisiert, wodurch man 3,6 g (88 %) der Titelverbindung erhielt.
Verfahren C:
Ein Zwischenprodukt, 3-(Methyl-propoxy)-3-oxo-propionsäureethylester, verwendet zur Herstellung der hierin beschriebenen Beispielverbindung 21, siehe Tabelle 1, wurde durch das folgende Verfahren hergestellt.
3-(Methyl-propoxy)-3-oxo-propionsäureethylester
Eine Natriumhydriddispersion in Mineralöl, 160,0 Gramm (60 %, 4,0 Mol), wurde in einen 12 L großen Rundkolben, der mit einem mechanischen Rührer, Thermometer, Zugabetrichter und Stickstoffeinlass ausgestattet war, gegeben. Der Kolben wurde mit einem Eisbad gekühlt, und 3,5 L trockenes THF wurden hinzugesetzt, und zwar unter Rühren, während die Temperatur unter 20°C gehalten wurde. Zu der Suspension von gerührtem Natriumhydrid wurden 376,4 Gramm (4,0 Mol) Iso-Butanol, gelöst in 0,3 L THF, hinzugesetzt. Die Zugabe wurde über etwa 2 h bei einer solchen Rate durchgeführt, dass die Temperatur unter 10°C gehalten wurde. Die Mischung konnte sich dann auf Raumtemperatur erwärmen, und sie wurde 1 h lang gerührt. Zu der erneut gekühlten Lösung wurden im Verlauf von 1 h 418 Gramm (2,0 Mol) Ethyl-4-Bromacetoacetat (A. Svendsen and P. M. Boll, Tetrahedron 1973 29, 4251–4258), gelöst in 0,3 L an THF, gegeben. Die Rate der Zugabe wurde so reguliert, dass die Temperatur unter 10°C gehalten wurde. Das Eisbad wurde entfernt, und die braune Aufschlämmung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde gelöscht, indem in 2,2 L 1,0 N Chlorwasserstoffsäure gegossen wurde, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit 0,5 L Diethylether extrahiert, die vereinigte organische Phase wurde mit 1,0 L gesättigter Salzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach der Filtrierung und Entfernung vom Lösungsmittel wurden 830 Gramm eines rotbraunen Öls erhalten. Das Produkt wurde in 0,4 L Hexan gelöst und auf eine Säule von 8,0 L in Hexan nass gepacktem Silica gegeben. Die Säule wurde mit 4,0 L Hexan, 8,0 L 3:1 Hexan zu Diethylether und 12,0 L 2:1 Hexan zu Diethylether eluiert. Die zweite Fraktion, 459,3 Gramm, wurde erneut auf eine Säule von 4,0 L Silica, das in Hexan nass gepackt war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 3,0 L 95:5 Hexan zu Diethylether; 2,0 L 9:1 Hexan zu Diethylether; 2,0 L 4:1 Hexan zu Diethylether und 12,0 L 3:1 Hexan zu Diethylether eluiert. Die Hauptfraktion wurde von Kölbchen zu Kölbchen unter Verwendung einer Kugelrohr-Vorrichtung und einer Ofentemperatur von 40–45°C bei < 1,0 Torr destilliert. Das gewünschte Produkt wurde als ein Öl erhalten, 145,9 Gramm (33 %).
Verfahren D:
Ein Zwischenprodukt, N-[2-(3-Fluorphenyl)-6-amino-4-chinolinyl]-N,N-dimethylamin, verwendet zur Herstellung der hierin beschriebenen beispielhaften Verbindung 124, siehe Tabelle 1, wurde durch das folgende Verfahren hergestellt.
3-(3-Fluorphenyl)-3-oxo-propionsäurethylester:
Eine 60%-in-Öl-Dispersion von Natriumhydrid, 21,7 g (0,543 Mol), wurde in einen 2 L großen Dreihals-Rundkolben, der mit einem Zugabetrichter, Stickstoffeinlass, Magnetrührer, Heizmantel, Thermopaar und Kühler ausgestattet war, mit trockenem Hexan (1 L) gegeben. Die resultierende Suspension wurde 15 Minuten lang gerührt, das Rühren wurde angehalten, und die Feststoffe ließ man sich absetzen. Der klare Überstand, welcher das Hexan und gelöstes Öl enthielt, wurde dann mittels einer Kanüle entfernt. Diethylcarbonat (1 L) wurde hinzugesetzt, und die Suspension wurde auf 120°C erhitzt. Zu dieser Suspension wurde vorsichtig tropfenweise über 40 Minuten eine Lösung von 100 g (0,494 Mol) m-Fluoracetophenon, gelöst in 250 mL Diethylcarbonat, gegeben. Im Verlauf der Zugabe startete eine Reaktion, entwickelte sich Wasserstoff und änderte sich die Farbe zu gelbbraun. Nachdem die Acetophenonderivat-Zugabe abgeschlossen war, wurde die Reaktion eine weitere Stunde lang erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und in einen 2 L großen Scheidetrichter gegossen. Die Diethylcarbonatschicht wurde zweimal mit 10%iger Essigsäurelösung gewaschen und dann mittels Vakuumdestillation (Sdp.: 114–117°C bei 0,8–0,9 mm Hg) in 91%iger Ausbeute gereinigt.
3-(4-Nitrophenylamino)-3-(3-fluorphenyl)-acrylsäurebutylester:
3-(3-Fluorphenyl)-3-oxo-propionsäureethylester, 106,3 Gramm (0,506 Mol), 4-Nitro-anilin, 63,0 Gramm (0,456 Mol) und 4-Nitro-anilin-hydrochlorid, 4,0 Gramm (0,023 Mol), wurden in einen trockenen 2 L großen Rundkolben gegeben. Zu dieser Mischung wurden 1,3 L n-Butanol gegeben, der Kolben wurde mit einem Soxhlet-Extraktor (Bechervolumen von 0,3 L), einem Kühler und Stickstoffeinlass ausgestattet. Trockene, aktivierte 4
-Siebe (200 Gramm) wurden in den Extraktorbecher gegeben, und die Reaktionsmischung wurde bis zum Rückfluss bei 118°C unter Stickstoff erhitzt und bei dieser Temperatur 90 Stunden lang gehalten. Die Reaktionsmischung wurde im heißen Zustand von einer kleinen Menge an Feststoffen dekantiert und auf –15°C 48 Stunden lang gekühlt. Kristalline Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration gesammelt. Die Kristalle wurden mit 0,2 L kaltem Ethanol und zwei 0,2 L großen Portionen an Hexanen gewaschen und bei 50°C über Nacht vakuumgetrocknet, wodurch man 35,8 Gramm (20,8 % Ausbeute) der Titelverbindung erhielt.
Die Mutterlaugen aus der vorhergehenden Reaktion wurden konzentriert, mit 1,0 L Toluol verdünnt, und Toluol wurde im Vakuum entfernt; dieser Prozess wurde zweimal wiederholt. Die Laugen wurden dann in 1,0 L n-Butanol verdünnt, und weitere 1,75 Gramm (10,0 mMol) 4-Nitro-anilin-hydrochlorid wurden hinzugesetzt; der Kolben wurde mit einem Soxhlet-Extraktor wie vorher ausgestattet, und der Becher wurde mit frischen 200 Gramm an Sieben befüllt. Die Mischung wurde unter Stickstoff gestellt und 90 Stunden lang auf Rückflusstemperatur gebracht. Die Reaktion wurde gekühlt und dann auf ein Endvolumen von 0, 6 L im Vakuum reduziert. Die Lösung wurde dann mit kristallinem 3-(4-Nitrophenylamino)-3-(3-fluor-phenyl)-acrylsäurebutylester bekeimt und bei –15°C 48 Stunden lang stehen gelassen. Die Kristalle wurden wie vorher gesammelt; 64,3 Gramm wurden nach dem Trocknen erhalten. Die Analyse zeigte, dass dieses Material mit 4-Nitro-anilin kontaminiert war, und es wurde mittels Flash-Chromatographie gereinigt. Das Produkt wurde in 0,5 L 1:1 Methylenchlorid zu Hexan gelöst und auf eine Säule mit 3,0 L Silica, das in 1:1 Methylenchlorid zu Hexan gepackt war, gegeben. Die Säule wurde mit 4,0 L 1:1 Methylenchlorid zu Hexan; 9,0 L 2:1 Methylenchlorid zu Hexan; und 2,0 L Methylenchlorid eluiert. Fraktionen von 0,5 L wurden gesammelt, und jene, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt, wodurch man 41,7 Gramm (24,3 %) an hellgelbem Feststoff erhielt. Die vereinigte Ausbeute betrug 45,1 %.
2-(3-Fluor-phenyl)-6-nitro-chinolin-4-ol:
Dowtherm A, 0,75 L, wurde in einen 3 L großen Dreihalskolben gegeben, der mit einem mechanischen Rührer, einem Claisen-Adapter, der eine Thermopaar-Sonde hielt, und einem Rückflusskühler mit Stickstoffeinlass ausgestattet war, gestellt und auf 250°C erhitzt. Hierzu wurden vorsichtig in kleinen Portionen 77,0 Gramm (0,215 Mol) 3-(4-Nitrophenylamino)-3-(3-fluorphenyl)acrylsäurebutylester im Verlauf von 0,25 Stunden hinzugesetzt. Die Mischung wurde bei 250°C 1,5 Stunden lang gehalten und im Verlauf von 2 Stunden auf 90°C abkühlen gelassen. Die Mischung wurde mit 1,0 L Hexanen behandelt und auf Raumtemperatur unter Rühren über Nacht abkühlen gelassen. Die gelbbraunen Feststoffe wurden mittels Saugfiltration gesammelt und dreimal mit 0,15 L großen Portionen an Hexanen gewaschen. Die Feststoffe wurden unter Vakuum bei 50°C über Nacht getrocknet, wodurch man 58,63 Gramm (96,0%) der Titelverbindung erhielt.
6-Nitro-4-chlor-2-(3-fluor-phenyl)-chinolin:
6-Nitro-2-(3-fluor-phenyl)chinolin-4-ol, 5,2 g (16,3 mMol), wurden in einen 500 mL großen Dreihals-Rundkolben, der mit einem Kühler, Magnetrührer und Stickstoffeinlass ausgestattet war, gegeben. Hierzu wurden 15,2 mL (25,0 g, 163 mMol, 10 Äq.) Phosphoroxychlorid unter Rühren gegeben. Die Mischung wurde auf 110°C 4 Stunden lang erhitzt. Am Ende dieses Zeitraums wurde die Reaktion auf Raumtemperatur gekühlt, und Wasser wurde vorsichtig tropfenweise hinzugesetzt, bis das ganze POCl₃ verbraucht war. Das Produkt kristallisierte aus dem Wasser aus, und Feststoffe wurden mittels Filtration gesammelt. Die Feststoffe wurden mit Wasser gewaschen, in einen 250 mL großen Erlenmeyer gegeben und mit Wasser trituriert. Nach der Sammlung mittels Filtration, dem Waschen mit Wasser und dem Trocknen in einem Vakuumofen wurden 4,6 g (84 %) des Produkts erhalten.
N-[6-Nitro-2-(3-fluorphenyl)-4-chinolinyl]-N,N-dimethylamin:
6-Nitro-4-chlor-2-(3-fluor-phenyl)-chinolin, 20 g (59,4 mMol), wurde in einen 500 mL großen Dreihals-Rundkolben, der mit einem Magnetrührer, Stickstoffeinlass, Gasauslass, Kühler und Heizbad ausgestattet war, gegeben. Das Material wurde in 150 mL N-Methylpyrrolidinon gelöst, gerührt, und 250 mL einer 40%igen wässrigen Lösung von Dimethylamin wurden hinzugesetzt. Die Mischung wurde dann auf 60°C 48 Stunden lang erwärmt. Am Ende dieses Zeitraums wurde die Reaktion gekühlt, in 3 L Wasser in einen 4 L großen Erlenmeyerkolben gegossen, und die Mischung wurde so lange gerührt, bis sich Feststoffe bildeten. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration gesammelt und im Vakuumofen getrocknet. Das Produkt wurde aus Ethanol in einem –20°C kalten Gefrierschrank umkristallisiert, wodurch man 19,6 g (95 %) Ausbeute des gewünschten Produktes erhielt.
N-[2-(3-Fluorphenyl)-6-amino-4-chinolinyl]-N,N-dimethylamin
N-[6-Nitro-2-(3-fluorphenyl)-4-chinolinyl]-N,N-dimethylamin wurde mit 150 mg eines Katalysators, der aus 5 % Palladium- auf Calciumcarbonat-Träger bestand, in einer 500 mL großen Parr-Schüttelflasche gegeben. Hierzu wurden 150 mL Ethanol hinzugesetzt, gefolgt von der Anwendung einer Wasserstoffatmosphäre von 50 psi. Die Mischung wurde 18 h lang geschüttelt, und die Wasserstoffatmosphäre wurde dann durch Stickstoff ersetzt. Der Katalysator wurde mittels Filtration entfernt, und die Lösung wurde konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit einer 5%igen Natriumhydroxidlösung gewaschen, die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und dann konzentriert. Der Extrakt wurde aus Methylenchlorid und Hexan umkristallisiert wodurch man 2,8 g (77 %) der Titelverbindung erhielt.
N-[2-(3-Fluorphenyl)-6-amino-4-chinolinyl]-N,N-dimethylamin wurde ebenfalls durch die Reduktion der 6-Nitrogruppe unter Verwendung von Zinn(II)-Chlorid wie in dem Verfahren B hergestellt.
Verfahren E:
Zwischenprodukte, die in der Synthese von hierin beschriebenen Beispielverbindungen verwendet wurden, wurden in einer Weise hergestellt, die analog zu der folgenden Prozedur ist.
Hydroxy-Pyrimidine
In einen ofengetrockneten Dreihals-Rundkolben, der mit einem Rückflusskühler und Stickstoffeinlass und zwei Zugabetrichtern mit Stopfen ausgestattet war, wurden ofen-aktivierte 5
-Molekularsiebe unter einem Strom von trockenem Stickstoff gegeben. Natriumhydrid (95 %) 3,03 Gramm (0,126 Mol) wurden zu dem Kolben von Raumtemperatur gegeben, gefolgt von 40 mL trockenem DMF. Es wurde mit dem Rühren begonnen, um eine Suspension der Feststoffe zu erhalten. Eine Lösung von Guanidinhydrochlorid, 11,9 Gramm (0,125 Mol) gelöst in 40 mL trockenem DMF, wurden tropfenweise mittels eines Zugabetrichters während 0,25 Stunden hinzugesetzt, und das Rühren wurde 0,5 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. 3-(4-Fluorphenyl)-3-oxo-propionsäureethylester, 26,28 Gramm (0,125 Mol), wurde in 75 mL trockenem DMF gelöst und zu dem Reaktionskolben mittels eines Tropftrichters während 0,25 Stunden hinzugesetzt. Die Mischung wurde dann bei Rückfluss über Nacht erhitzt. Die Mischung wurde heiß filtriert und konzentriert, um eine heterogene Mischung zu erhalten. Wasser, 100 ml, wurde hinzugegeben, und ein Feststoff, welcher sich gebildet hatte, wurde abfiltriert und getrocknet. Der Feststoff wurde aus Methanol umkristallisiert, wodurch man 4-Hydroxy-6-(4-fluorphenyl)-pyrimidin-2-amin (51 % Ausbeute) erhielt. Hydroxy- Pyrimidin-Verbindungen wurden in der Prozedur vom Verfahren G verwendet.
Verfahren F:
Chlor-Pyrimidine
Trockenes 4-Hydroxy-6-(4-fluorphenyl)pyrimidin-2-amin, 24 g (0,117 Mol), wurde direkt in einen 250 mL großen Rundkolben eingewogen. Unter einem Strom von trockenem Stickstoff wurden 24,1 Gramm (0,117 Mol) Phosphorpentachlorid hinzugesetzt, gefolgt von 100 mL Phosphoryloxychlorid. Die Mischung wurde über Nacht am Rückfluss gehalten, wobei nach diesem Zeitraum die flüssige Phase durch Abdampfung entfernt wurde und Eisstücke dem Reaktionskolben hinzugesetzt wurden. Gesättigtes Natriumcarbonat wurde dann so lange hinzugesetzt, bis die gerührte Mischung basisch war, und sich ein festes Präzipitat bildete. Der Feststoff 4-Chlor-6-(4-fluorphenyl)pyrimidin-2-amin wurde abfiltriert und getrocknet, 14,4 Gramm (55 %). Chlor-Pyrimidin-Verbindungen wurden in der Prozedur vom Verfahren H verwendet.
Verfahren G:
Hierin beschriebene beispielhafte Verbindungen, siehe Tabelle 1, wurden in einer Weise hergestellt, die analog zu dem folgenden Verfahren war, welches die Herstellung von N6-[2-Amino-6-(4-butylphenyl)pyrimidin-4-yl]-2-(4-fluorphenyl)-chinolin-4,6-diamin, der Verbindung von Beispiel 111 aus Triflat-Zwischenprodukten, beschreibt.
In ein Reaktionsgefäß, welches mit Stickstoff befüllt war, wurden 0,121 Gramm (0,5 mMol) 4-Hydroxy-6-(4-butylphenyl)pyrimidin-2-amin und 0,178 Gramm (0,5 mMol) N-Phenyltrifluormethansulfonamid gegeben. Triethylamin, 0,50 Gramm (0,5 mMol), wurde in 0,5 mL trockenem N-Methyl-2-pyrolidinon gelöst, der Mischung hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei 60°C 8 Stunden lang erhitzt. 2-(4-Fluorphenyl)chinolin-4,6- diamin, 0,126 Gramm (0,5 mMol) wurden in 1,0 mL N-Methyl-2-pyrolidinon gelöst und dem Reaktionsgefäß hinzugesetzt, gefolgt von 4 Mol-Äquivalenten an HCl (4,0 M in Dioxan). Die Mischung wurde bei 80°C 10 Stunden lang erhitzt, worauf sich ein Feststoff bildete. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur wurde der gesamte Gefäßinhalt mit 10 mL Methanol verdünnt und filtriert. Der resultierende Feststoff, N6-[2-Amino-6-(4-butylphenyl)pyrimidin-4-yl]-2-(4-fluor-phenyl)-chinolin-4,6-diamin, wurde mit 50 mL Methanol gewaschen, wodurch man 30 mg eines gelben Feststoffes erhielt (13 % Ausbeute).
Verfahren H:
Hierin beschriebene beispielhafte Verbindungen, siehe Tabelle 1, wurden in einer Weise hergestellt, die analog zu dem folgenden Verfahren war, welches die Herstellung von N6-[2-Amino-6-(4-fluorphenyl)-pyrimidin-4-yl]-2-phenyl-chinolin-4,6-diamin, der Verbindung von Beispiel 5, beschreibt.
2-Phenyl-chinolin-4,6-diamin, 0,5 Gramm (2,12 mMol) und 4-Chlor-6-(4-fluorphenyl)pyrinudin-2-amin, 0,83 Gramm (4,25 mMol), wurden direkt in einen Reaktionskolben eingewogen, und 10 mL trockenes N-Methyl-2-Pyrolidinon und 2 Tropfen konzentrierte Chlorwasserstoffsäure wurden dann dem Kolben hinzugesetzt. Die Mischung wurde bei 100°C über Nacht unter einer Stickstoffatmosphäre erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und mit wässrigem Natriumhydroxid verdünnt, woraufhin sich ein dunkelbrauner Feststoff niederschlug. Der Feststoff wurde gesammelt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 0,365 Gramm N6-[2-Amino-6-(4-fluorphenyl)pyrimidin-4-yl]-2-phenylchinolin-4,6-diamin erhielt (92 % Ausbeute).
Beispiele:
Die beispielhaften Verbindungen 1 bis einschließlich 125 sind in der Tabelle 1 veranschaulicht, welche den Namen jeder Verbindung, die Molekularformel und das MS-Ergebnis zeigt. Chinolin-Vorstufen wurden mittels des Verfahrens A, B, C oder D, je nach Eignung, hergestellt, mit einem Hydroxypyrimidin gemäß Verfahren G, wie angegeben, oder mit einem Chlorpyrimidin gemäß Verfahren H, wie angegeben, umgesetzt.
Tabelle 1:
Tabelle Fortsetzung
Tabelle Fortsetzung
Tabelle Fortsetzung
Tabelle Fortsetzung
Tabelle Fortsetzung
Tabelle Fortsetzung

Claims

Verbindungen gemäß dem Strukturdiagramm I,
wobei: R¹ für NE¹E² steht, worin E¹ ausgewählt ist aus Wasserstoff und Methyl und E² ausgewählt ist aus Wasserstoff, C_1-4-Alkyl und Phenyl-C_1-4-alkyl, R² ausgewählt ist aus E³ und E⁴, wobei E³ ausgewählt ist aus C_1-6-Alkyl, C_1-4-Alkoxy und C_1-6-Alkoxy-C_1-4-alkyl und E⁴ mit einer Gruppierung, ausgewählt aus Halogen, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Perfluor-C_1-2-alkyl und C_5-7-Cycloalkyl, phenylsubstituiert ist, R³ ausgewählt ist aus E⁵ und E⁶, wobei E⁵ ausgewählt ist aus NH₂, Perfluor-C_1-2-alkyl, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy-C_1-4-alkyl, Phenyl-C_1-2-alkoxy und Phenoxy-C_1-2-alkyl und E⁶ in einer oder zwei Stellungen mit Gruppierungen, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Cyano, Perfluor-C_1-2-alkyl, C_1-4-Alkoxy, Phenyl-C_1-2-alkoxy, Phenoxy-C_1-2-alkyl und C_1-6-Alkoxy-C_1-4-alkyl, phenylsubstituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei: R¹ für NE¹E² steht, worin E¹ für Wasserstoff steht und E² ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl und Benzyl, R² ausgewählt ist aus E³ und E⁴, wobei E³ ausgewählt ist aus Methyl, Pentyl, Propoxymethyl und E⁴ mit einer Gruppierung, ausgewählt aus Fluor, Chlor, Methyl, Methoxy, Trifluormethyl und Cyclohexyl, phenylsubstituiert ist, R³ ausgewählt ist aus E⁵ und E⁶, wobei E⁵ ausgewählt ist aus Methyl, Pentyl, Trifluormethyl, Propoxymethyl, Benzyloxy und Phenyloxymethyl und E⁶ in einer oder zwei Stellungen mit Gruppierungen, unabhängig ausgewählt aus Chlor, Fluor, Butyl, Trifluormethyl, Methoxy, Ethoxy, Benzyloxy, Phenoxymethyl, Propoxymethyl und Cyano, phenylsubstituiert ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Schmerzbehandlung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- oder Verdünnungsmittel.
Verfahren zur Darstellung von Verbindungen nach Anspruch 1, bei dem man a) Hydroxypyrimidin-Vorstufen gemäß dem Strukturdiagramm II,
durch Umsetzung eines 3-substituierte-3-Oxopropionsäureethylesters mit Guanidinhydrochlorid in N-Dimethylformamid in Gegenwart von Natriumhydrid sowie aktivierten 5Å-Molekularsieben darstellt, b) Chlorpyrimidin-Vorstufen durch Chlorinierung einer Hydroxypyrimidinverbindung gemäß dem Strukturdiagramm II darstellt, indem man mit Phosphoryloxychlorid und Phorsphorpentachlorid unter Bildung einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm III,
am Rückfluß erhitzt, c) Triflatpyrimidin-Vorstufen durch Umsetzen einer Hydroxypyrimidinverbindung gemäß dem Strukturdiagramm III darstellt, indem man mit N-Phenyltrifluormethansulfonamid, Triethylamin und trockenem N-Methyl-2-Pyrolidinon unter Bildung einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm IV,
erhitzt, d) Chinolin-Vorstufen gemäß dem folgenden Verfahren darstellt, bei dem man d1) neue 3-substituierte-3-Oxopropionsäureethylester (-β-Ketoester) gemäß dem Strukturdiagramm V wie folgt darstellt:
wobei R² die oben angegebene Bedeutung besitzt, d2) die β-Keto-Ester des Strukturdiagramms V wie folgt in Enamine gemäß dem Strukturdiagramm VI überführt:
wobei R⁶ für eine Gruppe, ausgewählt aus -NH-CO-CH₃ oder NO₂ steht, d3) die Enamine des Strukturdiagramms VI wie folgt unter Bildung von Verbindungen gemäß dem Strukturdiagramm VII zyklisiert:
und, d4) wenn R⁶ für -NH-CO-CH₃ steht, eine Verbindung des Strukturdiagramms VII nach dem Verfahren des folgenden Schemas in eine Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I überführt:
oder, wenn R⁶ für NO₂ steht, eine Verbindung des Strukturdiagramms VII wie folgt in eine Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I überführt:
oder als Alternative, wenn R⁶ für NO₂ steht, eine Verbindung des Strukturdiagramms VII wie folgt in eine Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I überführt:
e) eine Chinolin-Vorstufe der Struktur VIII mit einer Chlorpyrimidin-Vorstufe der Struktur III gemäß dem folgenden Schema unter Bildung einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I umsetzt:
oder f) eine Chinolin-Vorstufe der Struktur VIII mit einer Triflatpyrimidin-Vorstufe der Struktur IV gemäß dem folgenden Schema unter Bildung einer Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I umsetzt:
wobei, falls notwendig, alle funktionellen Gruppen in den Schritten a), b), c), d), e) und f) jeweils mit einer Schutzgruppe geschützt sind, g) alle Schutzgruppen entfernt, h) eine Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I in eine andere Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I mit hier in Methoden A bis L beschriebenen Verfahrensweisen überführt und i) die Verbindung gemäß dem Strukturdiagramm I bis zum notwendigen Grad auf reinigt und, falls notwendig, ein pharmazeutisch annehmbares Salz bildet.