JP2004513125A - 疼痛治療のためのｎ−型カルシウムチャンネル拮抗薬 - Google Patents

Abstract

本発明は疼痛治療のためのＮ−型カルシウムチャンネル拮抗薬を提供することを目的とする。
疼痛の治療に有用な構造式Ｉ（式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は本明細書で定義された通りである）の化合物、このような化合物を使用する医薬組成物および治療法が開示されている。
【化１】

Description

【０００１】
本発明は疼痛または侵害受容の治療または予防のための化合物および方法に関する。
【０００２】
疼痛はかなりの苦痛をもたらし、触覚、圧力、熱および冷たさの感覚とは異なる知覚経験である。それはしばしば患者により「鮮やかな、鈍い、うずく、チクチクする、鋭い、またはヒリヒリする」のような言葉で表現され、一般に元の感覚とその感覚に対する反応の両方を含むと考えられる。この感覚の幅および様々な個体による疼痛感覚のばらつきは疼痛の正確な定義を困難なものにしている。疼痛が侵害受容器の刺激により“起こり”、無傷の神経経路を伝わる場合、これは侵害受容性疼痛と呼ばれる。疼痛は神経構造の損傷により起こることもあり、また疼痛はしばしば神経性過敏として現われ、このタイプの疼痛は神経因性疼痛と呼ばれる。
【０００３】
疼痛が感知される刺激のレベルを“痛覚閾値”という。痛覚閾値が例えば鎮痛剤の投与により上昇する場合、痛みを感じるまでより大きい強度またはより長時間の刺激が必要である。鎮痛剤はこのような治療が必要な患者への投与後に意識を失うことなく痛みを緩和する薬剤の類である。これは他の痛みを緩和する薬剤、例えば意識を途切れさせることにより痛みを緩和する全身麻酔薬、または末梢神経線維の伝達をブロックし、それにより疼痛を予防する局所麻酔薬とは著しく異なる。
【０００４】
タキキニン拮抗薬は動物での抗侵害受容作用を誘発することが報告されており、それはヒトでの鎮痛作用と似ていると考えられる（ＭａｇｇｉらのＪ． Ａｕｔｏｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３， ２３〜９３（１９９３年）を参照）。特に、非ペプチドＮＫ−１受容体拮抗薬はこのような鎮痛作用を示すことがわかっており、例えば化学的侵害受容の典型的な試験（フェニルベンゾキノンが誘発する身もだえおよびホルマリン試験）においてＮＫ−１受容体拮抗薬ＲＰ６７， ５８０はモルヒネに匹敵する効力の鎮痛作用を示した（ＧａｒｒｅｔらのＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 米国， ８８， １０２０８〜１０２１２（１９９３年））。
【０００５】
オピオイド鎮痛薬は良く知られている類の鎮痛剤である。一般に、これらの化合物は総称的な意味でモルヒネ様作用を有するすべての天然または合成の薬剤を包含する。合成および半合成のオピオイド鎮痛薬は５種の化学物質：フェナントレン；フェニルヘプチルアミン；フェニルピペリジン；モルフィナンおよびベンゾモルファンの誘導体である。これらの化合物は薬理学的に異なる活性を有し、あるものはオピオイド受容体の強力なアゴニストであり（例えばモルヒネ）、他のものは中程度〜軽度のアゴニストであり（例えばコデイン）、また他のものは混合したアゴニスト−アンタゴニスト活性を示し（例えばナルブフィン）、さらに他のものは部分アゴニストである（例えばナロルフィン）。ナロルフィンのようなオピオイド部分アゴニスト（モルヒネのＮ−アルキル類似体）はモルヒネの鎮痛作用を中和するが、それは単独で投与されるとそれ自体で強力な鎮痛剤となる。すべてのオピオイド鎮痛薬のうち、モルヒネが最も広く使用されており、好適な典型化合物である。残念なことに、モルヒネはその有用な治療的特性の他に呼吸抑制、胃腸運動の低下（便秘を引き起こす）を含む幾つかの欠点も有し、患者によっては嘔気嘔吐を催すことがある。他の特徴はこのような化合物の臨床使用を限定する耐性の発生および身体的依存である。
【０００６】
滑膜炎症の阻止または軽減に関し、それにより機能を改善する抗炎症化合物、および疼痛の軽減に関する鎮痛薬は現在リウマチ性疾患および関節炎を治療する主要な方法である。アスピリンおよび他のサリチル酸塩化合物はしばしば炎症性過程の進行を止め、一時的に痛みを和らげる治療に使用される。これらの目的に使用される他の薬剤化合物にはイブプロフェンおよびナプロキシンのようなフェニルプロピオン酸誘導体、スリンダク、フェニルブタゾン、コルチコステロイド；クロロキンおよびヒドロキシクロロキンスルフェートのような抗マラリア薬、およびフェネメートがある。リウマチ性疾患の治療に使用される種々の薬剤の詳細な検討のために、Ｊ． Ｈｏｓｐ． Ｐｈａｒｍ．， ３６：６２２（１９７９年５月）を参照されたい。
【０００７】
カルシウムチャンネルは細胞外液から細胞へのＣａ^＋＋イオンの制御された流入を可能にする膜貫通性の多重−サブユニットタンパク質である。このようなチャンネルは動物界全体に存在し、細菌、真菌および植物細胞で確認されている。一般に、カルシウムチャンネルは電位に依存する。このようなチャンネルにおいて、“開放”は細胞へのＣａ^＋＋イオンの初期流入を可能にし、チャンネルを有する細胞の内部と細胞を浸す細胞外媒質の間の電位差を少なくする。細胞へのＣａ^＋＋イオンの流入率はこの電位差に依存する。動物のすべての“興奮性”細胞、例えば中枢神経系（“ＣＮＳ”）の神経細胞、末梢神経細胞、並びに骨格筋、心筋、静脈および動脈の平滑筋などの筋細胞は電位依存性カルシウムチャンネルを有する。カルシウムチャンネルは細胞内のＣａ^＋＋イオン濃度を調整するのに中心的な役割を果たすため生理学的に重要である。これらの濃度は細胞の生存および機能に関して重要である。したがって、細胞内のＣａ^＋＋イオン濃度は動物における幾つかの重要な過程、例えば神経伝達物質の放出、筋収縮、ペースメーカー活動、およびホルモンの分泌に関与する。
【０００８】
カルシウムチャンネルは特定の疾患状態に関与すると考えられる。ヒトを含む動物の様々な心臓血管疾患を治療するのに有用な化合物の幾つかは心臓および／または血管の平滑筋に存在する電位依存性カルシウムチャンネルの機能を調整することにより有益な効果を示すと考えられる。これらの化合物の多くはカルシウムチャンネルと結合し、細胞膜の脱分極に反応して細胞へのＣａ^＋＋イオンの流入を阻止する、またはその流入率を減少させる。中枢神経系のような他の臓器系のカルシウムチャンネルと相互作用する化合物の薬理学的特性、およびこれらの特定のサブタイプのヒトカルシウムチャンネルと相互作用して、例えば神経変性疾患の治療において所望の治療効果を示す化合物を合理的に設計する能力の理解は特にＣＮＳに存在する異なるタイプのカルシウムチャンネルの数または個々のサブタイプの分子的性質を独立して測定することができないことや特定のサブタイプのチャンネルの純粋な標本、すなわちカルシウムチャンネルに作用する化合物の特異性を評価する系を入手できないことにより妨げられている。
【０００９】
多重タイプのカルシウムチャンネルは様々な組織（例えば骨格筋、心筋、肺、平滑筋および脳）からの様々な哺乳動物細胞の電気生理学的および薬理学的試験に基づいて検出されている（Ｂｅａｎ， Ｂ． Ｐ． のＡｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１：３６７〜３８４（１９８９年）およびＨｅｓｓ， Ｐ． のＡｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ５６：３３７（１９９０年））。これらの異なるタイプのカルシウムチャンネルは現在の速度論、保有する潜在的感受性やカルシウムチャンネルアゴニストおよびアンタゴニストに対する感受性により区別されるＬ−、Ｔ−、Ｎ−およびＰ−型の４つのクラスに幅広く分類されている。４つのサブタイプの神経細胞電位依存性カルシウムチャンネルが提唱されている（Ｓｗａｎｄｕｌｌａ， Ｄ．らのＴｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， １４：４６（１９９１年））。Ｌ−、Ｎ−およびＰ−型のチャンネルはそれぞれ侵害受容に関与しているが、Ｎ−型チャンネルだけが常に急性、持続性および神経因性の疼痛に関与している。合成ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ、すなわち食魚性の海生巻き貝、ヤキイモ（Ｃｏｎｕｓ ｍａｇｕｓ）の毒由来の２５−アミノ酸ペプチドはヒトにおいて鞘内的に使用されており、疼痛の治療ではモルヒネよりも高い効力を示し、〜８５％の成功率である。
【００１０】
既知の薬物療法を応用することができるが、それらの使用には欠点がある。例えば、患者の痛みを軽減するのに医薬品が効果を示すためには６ヶ月の継続使用を要する薬剤が幾つかある。結果として、特定の患者は医者がその治療が有効であるかどうかを判断するまで６ヶ月は治療を受け、病気に苦しまなければならない。多くの現存の薬剤は特定の患者に対して相当の有害な副作用を示すため患者を注意深く監視しなければならない。また、殆んどの現存の薬剤は患者の苦痛を一時的に取り除くに過ぎず、除痛を持続させるためには毎日または毎週継続して投与しなければならない。最終的に、病気の進行に伴なって痛みを和らげるのに必要な薬剤の量は増加するため、潜在的な副作用も増大する。したがって、痛みを和らげる有効で安全な治療法が必要である。
【００１１】
ある見地において、本発明は疼痛の治療に有用なＮ−型カルシウムチャンネルで選択的な作用を示す化合物を提供する。
【００１２】
Ｎ−型カルシウムチャンネルで選択的な作用を示す本発明の化合物は構造式Ｉ
【化１３】

［式中、Ｒ^１はＮＥ^１Ｅ^２ であり、ここでＥ^１は水素およびメチルから選択され、そしてＥ^２は水素、Ｃ_１−４アルキルおよびフェニルＣ_１−４アルキルから選択され；
Ｒ^２はＥ^３およびＥ^４から選択され、ここでＥ^３はＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−４アルコキシおよびＣ_１−６アルコキシＣ_１−４アルキルから選択され、そして
Ｅ^４はハロゲン、Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−４アルコキシ、ペルフルオロＣ_１−２アルキルおよびＣ_５−７シクロアルキルから選択される基で置換されたフェニルであり；
Ｒ^３はＥ^５およびＥ^６から選択され、ここでＥ^５はＮＨ_２、ペルフルオロＣ_１−２アルキル、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシＣ_１−４アルキル、フェニルＣ_１−２アルコキシおよびフェノキシＣ_１−２アルキルから選択され、そして
Ｅ^６は１または２個の位置が独立してハロゲン、シアノ、ペルフルオロＣ_１−２アルキル、Ｃ_１−４アルコキシ、フェニルＣ_１−２アルコキシ、フェノキシＣ_１−２アルキル、Ｃ_１−６アルコキシＣ_１−４アルキルから選択される基で置換されたフェニルである］の化合物である。
【００１３】
特定の本発明の化合物はＲ^１はＮＥ^１Ｅ^２ であり、ここでＥ^１は水素であり、そしてＥ^２は水素、メチルおよびベンジルから選択され；
Ｒ^２はＥ^３およびＥ^４ から選択され、ここでＥ^３はメチル、ペンチル、プロポキシメチルから選択され、そして
Ｅ^４はフルオロ、クロロ、メチル、メトキシ、トリフルオロメチルおよびシクロヘキシルから選択される部分で置換されたフェニルであり；
Ｒ^３はＥ^５およびＥ^６から選択され、ここでＥ^５はメチル、ペンチル、トリフルオロメチル、プロポキシメチル、ベンジルオキシおよびフェニルオキシメチルから選択され、そして
Ｅ^６は１または２個の位置が独立してクロロ、フルオロ、ブチル、トリフルオロメチル、メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ、フェノキシメチル、プロポキシメチルおよびシアノから選択される部分で置換されたフェニルである化合物である。
【００１４】
多くの特定の本発明の化合物を本明細書で例示する。
別の見地において、本発明は疼痛を軽減するのに有効な量の構造式Ｉの化合物を投与することからなる疼痛の治療にこのような化合物を使用する方法を提供する。
本発明の方法の一態様は急性、持続性または神経因性疼痛の治療が必要な患者に疼痛を軽減するのに有効な量の構造式Ｉの化合物を投与することからなる。
他の見地において、本発明は構造式Ｉの化合物を製造する方法を提供する。
さらに他の見地において、本発明は構造式Ｉの化合物を下記のような賦形剤、希釈剤または安定剤と一緒に含有する急性、持続性および神経因性疼痛の治療に有用な医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明の化合物は一般的な説明の範囲内の化合物、特に下記で例示する化合物である。
本発明の化合物の適当な薬学的に許容しうる塩にはメタンスルホン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、マレイン酸塩、およびリン酸や硫酸と生成する塩のような酸付加塩がある。
【００１６】
本発明の化合物がキラル中心を有する場合、本発明はこのような化合物のすべての光学異性体およびジアステレオマーを包含する。
本発明の化合物が互変異性化する場合、本発明はこのような化合物のすべての互変異性体を包含する。
本発明の化合物が非溶媒和物および溶媒和物形態、例えば水和物形態として存在する場合、本発明はすべてのこのような溶媒和物および非溶媒和物形態を包含する。
【００１７】
他の見地において、本発明は本発明の化合物の製造法を提供する。一般に、本発明の化合物はヒドロキシ−ピリミジン前駆体からクロロ−ピリミジンまたはトリフレート−ピリミジン前駆体を製造し、そして前記クロロ−ピリミジンまたはトリフレート−ピリミジン前駆体をキノリン前駆体と反応させて本発明のピリミジル−キノリン化合物を生成することにより製造した。
【００１８】
ａ） ヒドロキシ−ピリミジン前駆体は３−置換−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステルを水素化ナトリウムおよび活性５Åモレキュラーシーブの存在下、Ｎ−ジメチルホルムアミド中でグアニジン塩酸塩と反応させることにより製造した。
ｂ） クロロ−ピリミジン前駆体はオキシ塩化リンおよび五塩化リンと一緒に還流して構造式ＩＩのヒドロキシ−ピリミジン化合物を塩素化して構造式ＩＩＩの化合物を生成することにより製造した。
【００１９】
【化１４】

【００２０】
ｃ）トリフレート−ピリミジン前駆体は構造式ＩＩのヒドロキシ−ピリミジン化合物をＮ−フェニルトリフルオロメタンスルホンアミド、トリエチルアミンおよび乾燥Ｎ−メチル−２−ピロリジノンと一緒に加熱して反応させて構造式ＩＶの化合物を生成することにより製造した。
【化１５】

【００２１】
ｄ）新規な前駆体キノリンを次の工程に従って製造した：
ｄ１）下記のようにして構造式Ｖの新規な３−置換−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル（β−ケトエステル）を製造し
【化１６】

（式中、Ｒ^２は前記で定義された通りである）
【００２２】
ｄ２）下記のようにして構造式Ｖのβ−ケトエステルを構造式ＶＩのエナミンに変換し
【化１７】

（式中、Ｒ^６は−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_３またはＮＯ_２から選択される基である）
【００２３】
ｄ３）下記のようにして構造式ＶＩのエナミンを環化して構造式ＶＩＩの化合物を生成し
【化１８】

【００２４】
そして
ｄ４）Ｒ^６が−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_３である場合、下記スキームの工程に従って構造式ＶＩＩの化合物を構造式Ｉの化合物に変換し
【化１９】

【００２５】
または
Ｒ^６が−ＮＯ_２である場合、下記のようにして構造式ＶＩＩの化合物を構造式Ｉの化合物に変換し
【化２０】

【００２６】
または別法として
Ｒ^６が−ＮＯ_２である場合、下記のようにして構造式ＶＩＩの化合物を構造式Ｉの化合物に変換し
【化２１】

【００２７】
ｅ） 下記スキームに従って構造式ＶＩＩＩのキノリン前駆体を構造式ＩＩＩのクロロ−ピリミジン前駆体と反応させて構造式Ｉの化合物を生成し
【化２２】

【００２８】
または
ｆ）下記スキームに従って構造式ＶＩＩＩのキノリン前駆体を構造式ＩＶのトリフレート−ピリミジン前駆体と反応させて構造式Ｉの化合物を生成し
【化２３】

【００２９】
工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）において、必要に応じて何れかの官能基を保護基で保護し、その後
ｇ）上記保護基を除去し
ｈ）本明細書で開示した方法ａ〜Ｌに記載の手順に従って構造式Ｉの化合物を他の構造式Ｉの化合物に変換し、そして
ｉ）構造式Ｉの化合物を必要な程度まで精製し、必要に応じて製薬上許容しうる塩を生成した。
【００３０】
ヒトなどの哺乳動物における疼痛の治療的処置（予防的処置を含む）に本発明の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を使用するために、本化合物を標準的な製薬実務に従って医薬組成物として製剤化することができる。したがって、別の見地において、本発明は本明細書で定義されたような構造式Ｉの化合物またはその薬学的に許容しうる塩を賦形剤または担体のような薬学的に許容しうる添加剤と一緒に含有する医薬組成物を提供する。
【００３１】
本発明の化合物を含有する適当な医薬組成物は慣用の方法で、例えば経口、局所、非経口、口腔内、鼻腔内、膣内または経腸投与により、あるいは吸入により投与することができる。これらの目的のために、本発明の化合物を当該技術分野で知られている方法により、例えば錠剤、カプセル剤、水性または油性液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、鼻腔内スプレー剤、座剤、微細粉末または吸入用エアゾル剤、さらに非経口使用（静脈内、筋肉内または注入を含む）のためには無菌の水性または油性液剤または懸濁剤または無菌乳剤の形態に製剤化することができる。好ましい投与経路は錠剤またはカプセル剤による経口投与である。
【００３２】
本発明の化合物の他に、本発明の医薬組成物はさらに１種以上の別の薬理学的に活性な物質を含有することができる。あるいは、本発明の化合物を含有する医薬組成物は１種以上の別の適合する薬理学的に活性な物質と同時にまたは連続的に投与することができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は一般に患者が疼痛を軽減するのに有効な１日量を服用するように投与される。１日量は必要に応じて分割投与量で投与することができ、投与する化合物の厳密な量および投与経路は治療する患者の体重、年齢および性別、並びに当該技術分野で知られている方法に従って治療される特定の疾患状態に依存する。好ましい投薬計画は１日に１回である。
【００３４】
他の本発明の態様はヒトのような温血動物のＮ−型カルシウムチャンネルと結合させるのに有用な薬剤の製造における構造式Ｉの化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用を提供する。
さらに他の本発明の態様は動物に有効な量の構造式Ｉの化合物またはその薬学的に許容しうる塩を投与することからなる、本発明の化合物を疼痛の治療が必要なヒトのような温血動物のＮ−型カルシウムチャンネルと結合させる方法を提供する。
【００３５】
他の見地において、本発明は本明細書で定義されたような本発明の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を賦形剤または担体のような薬学的に許容しうる添加剤と一緒に含有する医薬組成物を提供する。
さらに他の見地において、本発明は本発明の化合物またはその薬学的に許容しうる塩の投与を含むヒトまたは動物体の治療法を提供する。
【００３６】
定義
本明細書で使用される「ハロ」または「ハロゲン」はフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する；
置換基が一群の置換基から「選択される」または「独立して選択される」場合、包含される化合物はすべての置換基が同じである化合物および各置換基が異なる化合物である；
本明細書で使用される「アルキル」なる用語、例えばＣ_１−６アルキルは特に断りがなければ直鎖状および分枝鎖状のアルキル基を包含する。個々のアルキル基に言及すると、例えば「プロピル」は通常の直鎖形態、すなわちｎ−プロピルを意味する；
【００３７】
本明細書で使用される「Ｃ_１−６アルキル」のような用語は１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキル基およびＣ_１−４アルキルのような集合基を意味し、メチル、エチル、イソプロピルおよびｔ−ブチルのような直鎖状および分枝状基を包含し、同様に「Ｃ_１−３アルコキシ」のような用語はメトキシ、エトキシおよびプロポキシのような特定の基を包含し、特に断りがなければ本明細書で使用される用語はそれらの慣用的に理解されている意味を有する。
【００３８】
下記の方法および実施例は本発明を説明するためのものであって限定するものではない。方法および実施例において、特に断りがなければ：
濃縮は真空下で回転蒸発により行なった；
操作は窒素雰囲気下、周囲温度、すなわち１８〜２６℃で行なった；
カラムクロマトグラフィー（フラッシュ法による）はメルク・キーゼルゲル・シリカ（Ａｒｔ．９３８５）において行なった；
収率は単なる例示であり、必ずしも達成可能な最大値ではない；
構造式Ｉの化合物の構造は一般に慣用のＮＭＲおよび質量スペクトルにより確認し、ピーク多重度をｓ，一重線；ｂｓ，幅広い一重線；ｄ，二重線；ＡＢまたはｄｄ，二重線の二重線；ｔ，三重線；ｄｔ，三重線の二重線；ｍ，多重線；ｂｍ，幅広い多重線で示し；ＦＡＢｍ／ｓデータはプラットホーム分光計（マイクロマス製）を使用してエレクトロスプレー法により得、適切な場合には陽イオンデータまたは陰イオンデータを集めた。（Ｍ＋Ｈ）^＋を示す；
中間体の純度は一般にｍ／ｓまたはＮＭＲ分析により評価した；
【００３９】
使用される次の略語は下記の通りの意味を有する：
ＤＣＭはジクロロメタンであり、
ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、
ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドであり、
ＣＤＣｌ_３は重水素化クロロホルムであり、
ＦＡＢは高速原子衝撃であり、
ｍ／ｓは質量分析または質量スペクトルであり、
ＮＭＲは核磁気共鳴であり、
ＮＭＰはＮ−メチルピロリジノンであり、そして
ＴＨＦはテトラヒドロフランである。
【００４０】
生物学的方法：
Ｉ． Ｎ−チャンネルＦＬＩＰＲ（蛍光レーザーイメージングプレートリーダー）アッセイ
ここで開示した方法は化学的に神経表現型に分化したヒト由来の神経芽細胞腫細胞株において天然形態で発現するＮ−型カルシウムチャンネルを通過するカルシウム流を阻害する試験化合物の有効性および効力の信頼できるＦＬＩＰＲに基く読み出し法を提供する。化合物が特定の濃度でＮ−チャンネルカルシウム流を阻害する程度は化合物が存在するピークカルシウム増加の振幅を化合物を含まないウェル中の８０ｍＭの Ｋ^＋刺激（対照）と比較することにより定量した。このＦＬＩＰＲアッセイで得られた結果を２つの方法により有効であると確認した：
ａ）Ｎ−チャンネル特異的ペプチド毒、コノトキシンＭＶＩＩＡは既知の文献値に適合するＩＣ_５０＝３ｎＭ（５点濃度−反応分析に適合させて定量した）を示し；そして
ｂ） ＩＣ_５０値は特定の本発明の化合物について定量した（ＩＣ_５０範囲：２．３７〜１０．５４）。
Ｎ−型カルシウム電流の阻害剤としてのこれらの試験化合物の効力はまた、神経細胞的に分化したＩＭＲ−３２細胞、または単離したばかりのラット上頚部神経節神経細胞の直接電気生理学的測定により定量した。２つの方法による化合物のｐＩＣ_５０は非常に似ていた（ｒ＝０．９１；ｐ＜０．００１）。
【００４１】
Ａ． 細胞培養
ＡＴＣＣ（製品番号ＣＣＬ−１２７）から入手したヒト神経芽細胞腫細胞由来の不死化細胞株、ＩＭＲ３２をすべての実験で使用した。細胞をイーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）ｗ／アール塩、およびグルタミンを含まない非必須アミノ酸（カタログ番号ＳＬＭ−０３４−Ｂ，スペシャリティ・メディア， フィリプスバーグ，ＮＪ）、１０％ ＦＢＳおよび１％グルタミンを含有するＴ７５フラスコ中で増殖させた。継代培養前に細胞を（目視顕微鏡検査により）約７０〜８０％の培養密度まで増殖させた。培養ストックを維持するために、摩砕により細胞懸濁液を生成し、約２０ｍＬの新鮮な培地を含有する新しいフラスコ中に最終比を達成するのに十分な量の細胞懸濁液をピペットで加えることにより培養物を１：３〜１：４の比で分けた。一般に、継代培養を週に２回行なった。９６ウェルプレートの標本（黒壁；カタログ番号３６０３， コスター社，ケンブリッジ， ＭＡ）のため、所望の培養密度の細胞を含有するＴ７５フラスコを培地で１２０ｍＬの容量にした。次に、細胞を摩砕により遊離させ、細胞懸濁液を１２〜９６のウェルプレートに注入して１００μＬの最終ウェル容量にした。
【００４２】
Ｂ． 神経表現型への細胞分化
細胞をＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１％グルタミン、１μＭの２−ブチル−ｃＡＭＰ（４９．１ｍｇ／１００ｍＬの培地（カタログ番号Ｄ−０６２７， シグマ社，セントルイス， ＭＯ）、および２．５ｍＭのブロモ−デオキシ−ウリジン（ストック：３０．７ｍｇ／１０ｍＬの培地、２５ｍＬの上記ストック／１００ｍＬの培地；シグマ，カタログ番号Ｂ−９２８５）からなる分化培地で分化させた。分化を引き起こすために、細胞を９６ウェルプレートでの平板培養開始２日後に（完全な培地交換により）分化培地で処理した。この時点で培養密度は約４０％であった。その後、新しく調製した分化培地との完全な培地交換を２〜３日毎に行なった。 細胞をこれらの分化条件に６〜１１日間暴露してからＦＬＩＰＲ実験に使用した。
【００４３】
Ｃ． 標準実験溶液
次の組成（ｍＭ）の溶液を実験に使用した（スペシャリティ・メディアから購入したプロベネシドを含まない緩衝液（緩衝液ＡおよびＢ：カタログ番号ＢＳＳ０５３Ａ；緩衝液ＣおよびＤ：カタログ番号ＢＳＳ０５６Ａ））。
緩衝液Ａ（最初の洗浄緩衝液）：クレブス−リンガー−ＨＥＰＥＳ（ＫＲＨ）緩衝液：ＮａＣｌ：１２５、ＫＣｌ：５、ＭｇＳＯ_４：１．２、ＫＨ_２ＰＯ_４：１．２、ＣａＣｌ_２ ２Ｈ_２Ｏ：２、グルコース：６、ＨＥＰＥＳ：２５、ｐＨ：７．４ （ＮａＯＨで調整したｐＨ）。
緩衝液Ｂ（色素ローディング緩衝液）：２．５μＭのプロベネシドを含むＫＲＨ緩衝液：緩衝液Ａと同じであるが、プロベネシドを２．５μＭの最終濃度まで加えた。プロベネシド（カタログ番号Ｐ−８７６１， シグマ・ケミカル社，セントルイス，ＭＯ）の２５０ｍＭストック溶液を作った。
緩衝液Ｃ（色素ウォッシュアウト緩衝液）：０ｍＭのＫ^＋および２．５μＭのプロベネシドを含むＫＲＨ緩衝液：ＮａＣｌ：１３０、ＭｇＳＯ_４：１．２、ＮａＨ_２ＰＯ_４：１．２、ＣａＣｌ_２ ２Ｈ_２Ｏ：２、グルコース：６、ＨＥＰＥＳ：２５、ｐＨ：７．４（ＮａＯＨで調整したｐＨ）。
緩衝液Ｄ（化合物希釈緩衝液）：０．１％ ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ）を含む緩衝液Ｃ。
【００４４】
Ｄ． 薬理学的標準および化合物
次の溶液を使用して本明細書に記載のデータを得た。
ニトレンジピン：（ＲＢＩケミカル，ナティック，ＭＡ）：ストック：１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液；ピペットで加える溶液：９μＭ；ピペットで２０μＬをウェル中の１２０μＬの容量に加えて最終ウェル濃度：１μＭとした。
ｗ−コノトキシンＭＶＩＩＡ：（カタログ番号Ｈ−８２１０；バケム社，トランス，ＣＡ）：ストック：０．１％ ＢＳＡを含むＨＰＬＣグレードの１ｍＭ水溶液；ピペットで加える溶液：４．５μＭ；ピペットで２０μｌをウェル中の１４０μｌの容量に加えて最終ウェル濃度：１μＭとした。
試験化合物ストックおよび溶液の調製：化合物を毎日、１００％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭストックとして調製した；ピペットで加える溶液：４５μＭまたはその連続希釈液；ピペットで２０μＬをウェル中の１４０μＬの容量に加えて最終ウェル濃度：１μＭまたはその１０倍希釈液とした。
高カリウム（脱分極）溶液：２４０ｍＭのＫ^＋を加えた緩衝液Ｃ；ピペットで８０μＬをウェル中の１６０μＬの容量に加えて最終ウェル濃度：８０ｍＭのＫ^＋とした。
【００４５】
Ｅ． 蛍光色素による細胞ローディング
蛍光色素溶液の調製：カルシウム指示色素、フルオ−４アセチルメチルエステル（フルオ４−ＡＭ；カタログ番号Ｆ−１２４２０１；モレキュラー・プローブ，ユージン，ＯＲ）を使用してＦＬＩＰＲにより細胞内遊離カルシウムの変化を測定した。１ｍＭのフルオ−４ ＡＭストック溶液をＤＭＳＯに溶解することにより作った。次に、このストックを緩衝液Ｂで希釈して４．６μＭ（フルオ−４ＡＭ使用液）にした。
細胞ローディングの手順：自動細胞洗浄器（型番号：５１６１５５２，ラボシステムＯｙ，ヘルシンキ，フィンランド）を使用し、その制御設定を次のパラメーター：細胞の高さ：Ｃ／Ｄ；細胞パルス：４／５、洗浄：３；容量：５；ドライ位置設定にして細胞を含有するプレートを緩衝液Ａで洗浄した。これらの設定により各ウェルにおいて細胞上の緩衝液の残余の深さが７０μＬになった。次に、１００μＬのフルオ−４ ＡＭ使用液を各ウェルに加えて最終フルオ−４ＡＭ濃度を２．７μＭとした。この溶液中で細胞を３７℃で１〜１．５時間インキュベートした。次に、洗浄：５；ウェット位置設定であることを除けば上記のプレ−ローディング洗浄と同じパラーメーターで細胞洗浄器を使用して細胞を緩衝液Ｃで５回洗浄した。次に、パラメーターを洗浄：１；容量：２に変えて最終洗浄を行なった。これにより最終ウェル容量は１２０μＬになった。細胞をこの条件下で１０分間平衡させ、ＦＬＩＰＲプロトコルに使用した。
【００４６】
Ｆ． ＦＬＩＰＲプロトコル
計測：想定上のＮ−チャンネル阻害剤の不在または存在下でカリウムが誘発する脱分極に反応する細胞内遊離カルシウムの実時間変化をＦＬＩＰＲ ＩまたはＦＬＩＰＲ ＩＩ（９６ウェルの構成に合わせて設定された）計測器（モレキュラー・デバイス，サニーベール， ＣＡ）により測定した。それぞれの計測器について同じ設定およびプロトコルを使用し、２つの計測器から得られた結果は一連の標準ベンチマーク化合物に関して見分けがつかなかった。
ＦＬＩＰＲハードウェア設定：レーザー出力を約０．３ワットに設定した。励起波長を４８８ｎｍのピークに、そして発光波長を５４０ｎｍに設定した。カメラの絞りを２に設定した。すべての実験を室温（２０〜２２℃）で行なった。
プレート配置−参照信号：各プレートにおいて特定のウェルを標準に割り当て、最小および最大の特異的蛍光信号を測定して化合物の阻害効果を正規化した。参照標準を端部および内部のウェルを含むプレート位置に分配した。
【００４７】
最大信号（Ｎ−チャンネル＋非特異的）：１２個のウェルをニトレンジピン（１μＭ）溶液中でインキュベートし、８０ｍＭのＫ^＋を加えてＮ−チャンネル＋非特異的が関与する最大Ｃａ^２＋増加（後者は非−Ｌ−，非−Ｎ−チャンネルが関与する蛍光増加）を測定した。蛍光単位でのＫ^＋が誘発するピーク増加に関するこれらのウェルの変動係数は典型的に１２％未満であった。
最小信号（非特異的）：６個のウェルをニトレンジピン（１μＭ）＋ｗ−コノトキシンＭＶＩＩＡ中でインキュベートし、８０ｍＭのＫ^＋を加えてすべてのＮ−チャンネルが薬理学的に閉鎖されたバックグラウンドＣａ^２＋を測定した。非特異的信号成分のピークは典型的に最大信号のピーク振幅の１５％未満であった。
Ｎ−チャンネル参照小分子：ＦＬＩＰＲおよびパッチクランプ電気生理学においてＮ−チャンネル阻害活性に関して幅広く特性決定された化合物を三重反復試験の各プレートに１μＭ（ＩＣ_５０付近）で含ませて基準点とした。
試験化合物：５種の試験化合物の効力を各プレートで評価した。それぞれの化合物を半対数単位にわたり、典型的には１０μＭの最大濃度に到達する５種の増加する濃度で試験した。それぞれの濃度について三重のウェルで反復試験した。
【００４８】
プロトコルの構成：ＦＬＩＰＲプロトコルを３種の溶液添加／試料採取工程（下記参照）として構成した。コノトキシン（１μＭの最終濃度）を適当なウェルに加えた後、プレートをＦＬＩＰＲ計測器に配置した。ウェルが最初に含有する溶液の全容量は１００μｌであり、すべての３種の溶液を添加した後の含有量は２４０μｌである。任意の（ピペットによる）活性混合はどの工程でも行なわなかった。
ニトレンジピン添加工程：全期間は２８秒。１Ｈｚで２秒間蛍光信号の試料を採取し、その後２０μＬのニトレンジピン標準溶液を１０μＬ／秒で添加し、０．５Ｈｚで２４秒間試料採取した。
試験化合物添加工程：全期間は６４秒。０．５Ｈｚで４秒間試料採取し、４０μＬの試験溶液を２０μＬ／秒で添加し、その後０．２Ｈｚで６０秒間試料採取した。
化合物のインキュベーション、細胞の脱分極およびカルシウムの読み出し工程：全期間は１０２４秒。０．０１６７Ｈｚで８４０秒間試料採取し、その後８０μＬの高Ｋ^＋（脱分極）溶液を添加し、１Ｈｚで１８０秒間試料採取した。この最後の１８０秒の試料採取期間は活性Ｎ−チャンネルを通した流入による細胞内カルシウムのピーク増加が起こる時期であることを示した。
【００４９】
Ｇ． データ分析
ＦＬＩＰＲソフトウエア：転送前に、データをＦＬＩＰＲソフトウエアモジュールで２つの効果について正規化した。
ベースラインの補正： 試料番号５７（ＫＣｌの添加直前）で“ゼロ化”することによりベースラインを補正した。この正規化は関連する誘発した蛍光増加の開始直前にすべての痕跡が共通点を有するように各ウェルからの蛍光痕跡のｙ軸オフセットを補正するのに役立った。
空間的均一性の補正因子：最初の試料から蛍光単位のプレート全体の平均を計算し、次に各ウェルからのデータに最初の試料の値をこの平均値に調整するスカラを掛ける手順によりデータを正規化した。このようにして、細胞密度または色素ローディングの違いにより生じた各ウェルの蛍光の絶対的なベースラインの違いについて正規化した。
外部ソフトウエア：データをＦＬＩＰＲからＥｘｃｅｌに“^＊．ｓｑｕ”拡張子ファイルとして転送した。転送後、操作をＥｘｃｅｌで行なって各ウェルのカリウム添加後の蛍光増加の（ゼロ化したベースラインに対する）最大ピーク振幅を計算した。次に、試験化合物を加えたウェルの測定値を上記のように最大（１００％）および非特異的（０％）信号成分を与える参照ウェルの平均振幅の百分率として正規化した。得られた試験化合物による阻害率はＮ−型チャンネルのカルシウム流の阻害を反映すると考えた。
【００５０】
ＩＩ． Ｌ−チャンネルＦＬＩＰＲアッセイ
下記の方法によりヒト由来の神経芽細胞腫細胞株、ＳＫ−Ｎ−ＳＨにおいて天然形態で発現するＬ−型カルシウムチャンネルを通過するカルシウム流を阻害する試験化合物の有効性および効力の信頼できるＦＬＩＰＲに基く読み出し法が得られた。化合物が所定の濃度でＬ−チャンネルを阻害する程度は試験ウェルの８０ｍＭのＫ^＋刺激に対するピークカルシウム増加の振幅を化合物を含まないウェルのピーク増加と比較することにより定量した。本アッセイは５点濃度−反応曲線を作成し、それにより参照Ｌ−チャンネル阻害剤のニトレンジピン（３０ｎＭ）、ニフェジピンおよびベラパミルに関する ＩＣ_５０値を定量することにより有効であると確認した。これらの値はＬ−チャンネルを通過するＣａ^２＋流を阻害するこれらの薬剤に関する既知の文献値と適合した。
【００５１】
Ａ． 細胞培養：
ヒト神経芽細胞腫細胞由来の不死化細胞株、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ 製品番号ＨＴＢ−１１）をすべての実験で使用した。細胞をイーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）ｗ／アール塩を０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；カタログ番号ＳＬＭ−０３４−Ｂ，スペシャリティ・メディア）と一緒に含有するＴ７５フラスコ中で増殖させた。継代培養前に細胞を（目視顕微鏡検査により）１００％の培養密度まで増殖させた。細胞を最初に３ｍＬのＰＢＳで洗浄し、そのＰＢＳを０．２５％トリプシンを含有するＰＢＳと交換することにより１：３の比で継代培養し、細胞を表面から分離した。１ｍＬの得られた懸濁液を１０ｍＬの新鮮な培地を含有する新しいフラスコに加えた。次に、細胞をインキュベート（３７℃、５％ＣＯ_２）し、培地を継代培養の約３日後に交換した。
【００５２】
Ｂ． 実験用細胞の調製：
実験に使用した細胞は培養密度が１００％の成長段階である。それぞれのフラスコは３個の９６ウェルプレートに供給するのに十分な細胞を含んだ。継代培養プロトコルで説明したように０．２５％トリプシンを加えることにより細胞をフラスコから分離した。分離後直ちに７ｍＬの新鮮な培地をフラスコに加え、溶液を穏やかに摩砕した。次に、さらに２０ｍＬの培地を加え、１００μＬのこの最終細胞懸濁液を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加えた。実験に使用する前に、プレートを５％ＣＯ_２中、３７℃でインキュベートして細胞の培養密度を１００％に到達させた（１〜２日）。
【００５３】
Ｃ． 実験手順：
溶液の組成、ハードウエアの設定、プレートの配置、ＦＬＩＰＲプロトコルの構成、並びに分析の設定および手順は上記のＮ−チャンネルアッセイで説明したものと同じであるが、プレートの配置と参照信号は次のように異なる。
最大信号（Ｌ−チャンネル＋非特異的）：最初の溶液添加工程で１２個のウェルに２０μＬの緩衝液だけ（ニトレンジピンを含まない）を加えてＬ−チャンネル＋非特異的が関与する最大のＫ^＋−誘発Ｃａ^２＋増加（後者は非−Ｌ−チャンネルが関与する蛍光増加）を測定した。蛍光単位でのＫ^＋が誘発するピーク増加に関するこれらのウェルの変動係数は典型的に１２％未満であった。
最小信号（非特異的）：６個のウェルをニトレンジピン（１μＭ）中でインキュベートし、８０ｍＭのＫ ^＋を加えてすべてのＬ−チャンネルが薬理学的に閉鎖されたバックグラウンドＣａ^２＋を測定した。非特異的信号成分のピークは典型的に最大信号のピーク振幅の１５％未満であった。
Ｌ−チャンネル参照小分子：ニトレンジピンを各プレートにおいて三重のウェルに３０ｎＭ（ＩＣ_５０付近）で含ませて参照表示値とした。
【００５４】
ＩＩＩ． Ｎ−チャンネルパッチ固定電気生理学
慣用の全細胞記録技術を使用して試験化合物のＮ−型カルシウムチャンネルを通過するＣａ^２＋電流を阻害する能力を直接測定した。Ｎ−型の電流を神経細胞的に分化したＩＭＲ−３２ 細胞、および生後間もないラットの上頚部神経節から分離したばかりの天然の神経細胞の両方を使用して記録した。毎日、両方のタイプの細胞の電流を脱分極工程中に全内向き電流の９０％以上が最大上の濃度（３ｍＭ）のｗ−コノトキシンＭＶＩＩＡにより阻害されたことを示すＮ−電流として確認した。さらに、ｗ−コノトキシンＭＶＩＩＡの効力は定期的に定量したところ約３ｎＭ（ＩＣ_５０）であり、文献で報告された値と一致した。両方のタイプの細胞で試験した一部の化合物についての結果に有意な違いはなく、そのためデータは特に断りがなければ１組のデータとみなす。
【００５５】
Ａ． ＩＭＲ−３２細胞の培養および分化：
分化細胞を９６ウェルプレートではなく３５ｍｍのプレキシガラス培養皿で平板培養することを除けば上記のＦＬＩＰＲ Ｎ−チャンネルアッセイで説明した手順と同様にしてＩＭＲ３２細胞を培養し、神経細胞的に分化させた。
【００５６】
Ｂ． ラット上頚部神経節（ＳＣＧ）神経細胞の分離：
７−１０日齢の子供のラットを高いＣＯ_２雰囲気の部屋で安楽死させた。直ちに、ＳＣＧを外科的に単離し、摘出し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に入れた。ＳＣＧの鞘を取り除き、切開し、２０Ｕ／ｍＬのパパインを含有するＨＢＳＳ溶液（３７℃）に１５分間入れた。次に、パパイン溶液を１６ｍｇ／ｍＬのジスパーゼおよび４００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼを含有するＨＢＳＳ（３７℃）と４０分間交換し、その間１５分毎に組織を穏やかに摩砕した。細胞を遠心分離して回収し、同じ日に使用するため４℃のＬ−１５培地で保存した。記録するために、１滴の細胞を含有する溶液をポリ−Ｌ−リシンで被覆された３５ｍｍのプレキシガラス培養皿に入れ、細胞を数分間接着させた。
【００５７】
Ｃ． 電気生理学的方法：
溶液：記録溶液はＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＷｏｎｇのＪ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ４３９：６７１−６８９（１９９１年）に記載の溶液を適合させた。溶液を実験の１ヶ月前はアリコートとして保存した（細胞内−２０℃、細胞外４℃）。ピペット（細胞内）溶液は１３０ｍＭのＴＲＩＳ；１０ｍＭのＣｓＢＡＰＴＡ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；５ｍＭのＭｇ^２＋ＡＴＰを含有し、ｐＨはメタンスルホン酸で７．３に調整され、浸透圧は〜３１５ミリオスモルである。細胞外溶液は１２０ｍＭのＴＲＩＳ；５ｍＭのＣｓＣｌ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１ｍＭのＭｇ^２＋Ｃｌ；５ｍＭのＢａ^２＋Ｃｌ；２５ｍＭのグルコース；１５ｍＭの塩化テトラエチルアンモニウム；２００ｍＭのテトロドトキシン（実験時に加えた）を含有し、ｐＨはメタンスルホン酸で７．４に調整され、浸透圧は〜３２０ミリオスモルである。
【００５８】
全細胞の記録および分析：ＨａｍｉｌｌらのＰｆｌｕｅｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． ３９１：８５−１００（１９８１年）に記載のようなパッチ固定法の全細胞電圧固定配置を使用して膜電位依存性カルシウム電流を分離した。細胞を含有する培養皿を倒立顕微鏡の試料台上のチェンバーに入れた。 すべての実験を室温（２０−２２℃）で行なった。パッチピペットをブラウン−フレーミングＰ−８６プラー（ＤＣ抵抗：３−６ＭΩ；スッター・インスツルメンツ社，ノバート，ＣＡ）において薄壁ガラス（外径１．５ｍｍ，内径１．１２ ｍｍ；ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ，ニューヘブン，ＣＮ）から製造した。アキソパッチ１Ｂ増幅器（アキソン・インスツルメンツ，フォスターシティ，ＣＡ）を使用して電流信号を獲得し、これをＴＬ−１（サイエンティフィク・ソルーションズ，ソロン，ＯＨ）またはデジデータ１２００（アキソン・インスツルメンツ）インターフェースによりパーソナルコンピューターに接続させた。神経細胞を閉鎖する直前に浴中に浸漬させたピペットでバランスをとって電流信号をゼロにした。
【００５９】
閉鎖抵抗は１〜１０ＧΩ以上の範囲であった。直列抵抗は通常１０ＭΩ以下であり、電気的に補償しなかった。デジタル化データの収集および電圧ステップ法のプロトコルをｐＣｌａｍｐ６．０ソフトウエア（アキソン・インスツルメンツ）により行なった。データをデジタル化する前にデジタルサンプリングの半分以下の速度で低域通過フィルターを通した。化合物の阻害効力を評価（定常濃度−反応分析）するためのＮ−型電流を記録するために、＋１０ｍＶまでの２００ミリ秒の電圧ステップを１５秒間隔で−９０ｍＶの保持電位から供給した。記録した電流からｐＣｌａｍｐソフトウエアのＰ−４またはＰ−６サブパルスプロトコルによりオンラインで漏れ電流を引いた。化合物の開放チャンネル阻害を評価するために、＋１０ｍＶまでの１０ミリ秒の電圧ステップをオンラインで漏れ電流を引くことなく様々な頻度で−９０ｍＶの保持電位から供給した。これらの電圧プロトコルは何れも５〜１０分の記録の間ずっと一定の内向き電流振幅を与えた。ｐＣｌａｍｐソフトウエアのクランプフィットモジュールを使用してピーク電流振幅を分析した。オリジン５．０ソフトウエア（マイクロカル社，ノーサンプトン， ＭＡ）を使用して濃度−反応データをヒルの標準式に繰り返し適合させ、電流の痕跡について図形表示し、データを分析した。
【００６０】
薬剤／化合物の調製およびデリバリー：試験化合物をＤＭＳＯ中の１０ｍＭストック溶液として調製し、適当な量のこれらのストック溶液を細胞外緩衝液に溶解して所望の濃度とした。薬剤／化合物を含有する溶液を記録した神経細胞から〜１００ｍｍ離れた所に位置する６個の直線的に配置されたガラス内張り管（外径２００ｍｍ，ヒューレット・パッカード，ウィルミントン， ＤＥ）の何れかから焦点に適用した。それぞれの溶液を電子制御されたソレノイドバルブ装置（ＢＭＥシステム，ボルチモア，ＭＤ）により所望の管から放出した。この装置は記録する特性を混乱させることなく細胞外相で薬剤溶液の迅速な（＜１００ミリ秒）平衡を達成した。
本発明の化合物は一般にＮ−型カルシウムチャンネルに対してＩＣ_５０（μＭ）で表される結合親和性を有し、それはＦＬＩＰＲアッセイにより測定して約１０μＭ以下である。例えば、実施例４、６６、７４および７５の化合物はそれぞれ３．５７、２．３７、３．５６および１０．５４μＭのＩＣ_５０を有する。
【００６１】
ＩＶ． ホルマリン試験
ホルマリン試験は経口投与されたＮ−型カルシウムチャンネル拮抗薬のラットでのホルマリンが誘発する侵害防御行動における阻害効果を評価する。ホルマリン試験は十分に確立した疼痛試験（ＤｕｂｕｉｓｓｏｎおよびＤｅｎｎｉｓら，１９７７年；Ｗｈｅｅｌｅｒ−Ａｃｅｔｏら，１９９０年；Ｃｏｄｅｒｒｅら，１９９３年）である。この試験は２つの異なる時期のホルマリンが誘発する行動からなる。０〜５分で起こる第１期の反応は足に注入された有害化学物質（ホルマリン）に対する急性侵害受容により引き起こされる。この後、注入後５〜１５分の静止期が続く。１５分後に起こり、６０分まで続く第２期の反応は背角の中枢神経細胞の感作により引き起こされる。中枢神経の感作は有害な求心性入力を増加し、より強い痛みが連続して脳内に伝わる。第２期の反応の阻害は薬物作用の中心機構を示す。
【００６２】
ホルマリン試験の手順は次の通りである：雄のラットをプレキシガラス室に入れ、それらの基本の活動を知るために３０〜４５分間観察する。多数グループの動物を賦形剤または様々な投与量の試験化合物で前処置する。動物に当該薬剤を腹腔内投与の場合は４０分間、または経口投与の場合は９０分間投与してから後足にホルマリンを注入する（背部の皮下注射；０．０５ｍＬの滅菌５％ホルマリン）。第１期（０〜５分）および第２期（２０〜３５分）で足を引っ込めたり、なめたりする回数を数え、記録する。足を引っ込めたり、なめたりする反応を食塩水の対照グループの平均回数と比べた阻害率として計算する。薬剤の効力を５０％の最大阻害効果を引き起こす用量（“ＩＤ_５０”）として表す。スチューデントのｔ−検定を使用して統計分析して薬剤効果の有意性を決定する。化合物はそれらの足を引っ込める反応を阻害する能力に基づいて活性とみなす。
【００６３】
Ｖ． 慢性収縮性損傷試験
慢性収縮性損傷（“ＣＣＩ”）試験または神経因性疼痛モデルは外傷および圧迫から直接的に、または感染症からガン、代謝状態、毒素、栄養不足、免疫機能障害および筋骨格の変化までの幅広い疾患から間接的に起こる神経損傷を伴なう神経因性疼痛を評価する。ＣＣＩモデル（ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅ，１９８８年）において、片側性末梢神経障害をラットで部分神経結紮により引き起こす。
スプレーグ・ドーリーラット（２５０〜３５０ｇ）をナトリウムペントバルビタールで麻酔し、大腿二頭筋の鈍的剥離により総挫骨神経を大腿の中央部で露出させる。挫骨の三分岐に近い神経部分（約７ｍｍ）を露出させ、クロミックガット縫合糸で４回結紮する。縫合糸を約１ｍｍの間隔で結んで結紮する。切開部を層状に閉じ、動物を回復させる。 足を引っ込める試験（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら， １９８８年）を使用して温熱性痛覚過敏を測定する。部分神経結紮による神経圧迫は普通の足または擬似手術した足と比べて足を引っ込める潜伏時間をより短くする。動物を高架ガラス床に慣れさせる。放射熱源を皮膚の損傷を予防するために２０秒中断しながらガラス床を通して後足の底の中央部（挫骨神経領域）にあてる。両足の引っ込め反射の潜伏時間を記録する。試験化合物に対する反応を経口投与後の異なる時間に評価して薬物作用の開始および持続時間を決定する。用量反応試験を多数グループのＣＣＩラットに賦形剤または試験化合物を５日間経口投与して行なう。最初の用量を投与する前に足を引っ込める潜伏時間を毎日測定する。データ分析を多重平均比較（Ｄｕｎｎｅｔｔ’の検定）により行ない、薬剤の効力を最大効果の５０％を引き起こす用量（“ＥＣ_５０”）として表す。
【００６４】
化学的方法：
方法Ａ：
本明細書で開示した典型的な化合物の特定の中間体（表１を参照）を実施例５８のキノリン中間体、２−（４−シクロヘキシルフェニル）−４，６−キノリンジアミンの製造を説明している本法と同様にして製造した。
【００６５】
３−（４−シクロヘキシルフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル
水素化ナトリウム２１．７ｇ（０．５４３モル）の６０％油分散液を添加ロート、窒素流入口、磁気攪拌器、加熱マントル、熱電対および冷却器を備えた２Ｌの三つ口丸底フラスコに入れた。これに１リットルの乾燥ヘキサンを加えた。次に、得られた懸濁液を１５分間攪拌し、攪拌を止め、固体を沈降させた。次に、ヘキサンおよび溶解した油状物を含有する透明な上澄みをカニューレで取り出した。炭酸ジエチル（１Ｌ）を固体に加え、懸濁液を１２０℃まで加熱した。この懸濁液に２５０ｍＬの炭酸ジエチルに溶解した１００ｇ（０．４９４モル）の４′−シクロヘキシルアセトフェノンの溶液を４０分にわたって注意しながら滴加した。添加が進むにつれて反応が開始し、水素が発生し、色が淡褐色に変化した。アセトフェノン誘導体の添加が終了した後、混合物をさらに１時間加熱した。反応混合物を冷却し、２Ｌの分液ロートに注いだ。炭酸ジエチル層を回収し、１０％酢酸溶液で２回洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。次に、炭酸ジエチル溶液をろ過し、回転蒸発器で濃縮し、高真空下、７０℃で１８時間吸排気した。２４時間冷却すると、無色の固体が結晶化した。得られた表題化合物をさらに精製することなく使用した。収量１３３ｇ（９８％）。^１Ｈ ＮＭＲはｂ−ケトエステル生成物が実質的に溶液中ではケト−エノール互変異性体混合物として存在し、固体中ではケト形態が優勢であることを示した。
【００６６】
３−（４−アセチルアミノフェニルアミノ）−３−（４−シクロヘキシルフェニル）−アクリル酸ブチルエステル
５０．２５ｇ（０．１８３モル）の３−（４−シクロヘキシルフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル、２５ｇ（０．１６７モル）の４′−アミノアセトアニリド、１．５５ｇ（０．００８モル）の４′−アミノアセトアニリド塩酸塩および５００ｍＬの乾燥ｎ−ブタノールを冷却器、磁気攪拌器および窒素流入口と共にソックスレー抽出器装置を備えた１リットルの単口丸底フラスコに入れた。ソックスレーシンブル（３３×１１８ｍｍ）に高活性４Ａシーブ（１．７〜２．４ｍｍのビーズ）を入れた。使用直前にシーブを高真空下で加熱（４００℃、３０分間）して活性化した。次に、混合物をブタノールとの共沸混合物として水が除去されるように還流して平衡反応を促進し、そしてシーブにより水をブタノールから除去した後、反応ポットに戻した。反応を４８時間続けた。投入するシーブを最初の２４時間後に取り替えた。エタノールの除去を伴なうブチルエステルへのエステル交換はエナミン生成と同時に起こる。４８時間後、反応ポットを冷却し、−４０℃の冷凍庫に入れ、結晶を２４時間生成させた。結晶を真空ろ過により集め、固体を冷エタノールで洗浄した。次に、生成物を真空オーブンで乾燥して７３．８ｇ（９８％）の所望のエナミンを得た。
【００６７】
Ｎ−［２−（４−シクロヘキシルフェニル）−４−ヒドロキシ−キノリン−６−イル］−アセトアミド
１．２ＬのダウサームＡを冷却器、磁気攪拌器、熱電対、可変電圧コントローラーを有する加熱マントル、および窒素流入口を備えた２Ｌの三つ口丸底フラスコに入れた。溶媒を２５０℃まで加熱し、４８ｇ（０．１１モル）の３−（４−アセチルアミノフェニルアミノ）−３−（４−シクロヘキシルフェニル）−アクリル酸ブチルエステルを注意しながら少しずつ加えた。分量を加えるにつれて、気体が発生し、泡立ちが生じた。生成物の結晶が生成し、容器の側壁に付着し始めた。すべての物質を加えた後、混合物の加熱を１時間続けた。次に、混合物を室温まで冷却し、ヘキサンを加えた。固体生成物を真空ろ過により集め、ヘキサンで洗浄した。真空オーブンで乾燥した後、３５．７ｇ（９０％）の生成物を回収した。
【００６８】
Ｎ−［２−（４−シクロヘキシルフェニル）−４−メトキシ−キノリン−６−イル］−アセトアミド
３５．７ｇ（０．０９９モル）のＮ−［２−（４−シクロヘキシルフェニル）−４−ヒドロキシ−キノリン−６−イル］−アセトアミドを２５０ｍＬのトルエンと一緒に冷却器、磁気攪拌器および窒素流入口を備えた５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに入れた。物質を攪拌により懸濁し、２０．６ｍＬ（０．２１モル）の硫酸ジメチルを加えた。次に、懸濁液をシリコーン油加熱浴で１８時間穏やかに加熱還流した。この後、反応混合物を冷却し、ヘキサンを加えた。固体を真空ろ過により集め、ヘキサンで洗浄した。乾燥後、固体を２Ｌの三角フラスコ中で１Ｌの５％水酸化ナトリウム溶液と一緒に懸濁した。懸濁液を激しく攪拌し、３０分間７０℃まで加熱した。これにより塩形態の物質を遊離塩基に変換し、不純物を除去した。冷却後、固体を真空ろ過により集め、水で洗浄した。生成物を真空オーブンで乾燥して３５．８ｇ（９６％）の物質を得、それは約３０％の副生成物を含有し、Ｎ−メチル化物質が主要な不純物を構成していた。物質をさらに精製することなく使用した。
【００６９】
Ｎ−［４−アミノ−２−（４−シクロヘキシルフェニル）−キノリン−６−イル］−アセトアミド
Ｎ−［２−（４−シクロヘキシルフェニル）−４−メトキシ−キノリン−６−イル］−アセトアミド（３５ｇ）を２５０ｇの酢酸アンモニウムと一緒に機械攪拌器、冷却器、窒素流入口および気体流出口を備えた５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに入れた。次に、攪拌した固体懸濁液を１１５℃まで加熱した。アンモニアが発生し、物質が溶け、やがて生成した酢酸中に溶解した。温度を１時間にわたってゆっくりと１４０℃まで上昇させた。確実に冷却器および気体流出口が冷却した表面上で過剰の酢酸アンモニウムの昇華から集まる酢酸アンモニウム固体の除去を維持するように注意した。４時間加熱した後、反応混合物を冷却し、１Ｌの水に注いだ。次に、氷冷しながら濃ＮａＯＨ溶液をゆっくりと加えることによりｐＨを９．５に調整した。次に、酢酸エチルを加え、混合物をろ過した。固体不純物（その幾らかは上記工程からのＮ−メチル化副生成物である）を除去し、ろ液を２Ｌの分液ロートに注いだ。酢酸エチル層を回収し、５％ ＮａＯＨ溶液で２回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。ろ過後、溶媒を蒸発させて２２ｇ（６０％）の固体を得、それは主に所望の生成物からなり、約２０％はＮ６−脱アセチル化物質、２−（４−シクロヘキシルフェニル）−４，６−キノリンジアミンであった。物質をさらに精製することなく使用した。
【００７０】
２−（４−シクロヘキシルフェニル）−４，６−キノリンジアミン
Ｎ−［４−アミノ−２−（４−シクロヘキシルフェニル）−キノリン−６−イル］−アセトアミド（２２ｇ）を１Ｌのフラスコに入れ、それに５００ｍＬの６Ｎ ＨＣｌを加え、混合物を攪拌しながら１８時間９５℃まで加熱した。この後、溶液を氷中で冷却し、注意しながら濃ＮａＯＨ溶液で中和し、ｐＨ ９．５に調整した。溶液を２Ｌの分液ロートに注ぎ、酢酸エチルで抽出した。次に、有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、ろ過し、濃縮して１７ｇの所望の生成物を得た。メタノール、塩化メチレンおよびヘキサンを使用して繰り返し結晶させて９．０ｇ（４１％）の純粋な表題化合物を得た。
【００７１】
方法Ｂ：
本明細書で開示した典型的な化合物の特定の中間体（表１を参照）を実施例９９のキノリン中間体、２−（３−フルオロフェニル）−４，６−キノリンジアミンの製造を説明している本法と同様にして製造した。
【００７２】
３−（３−フルオロフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル
本化合物は生成物を真空蒸留（沸点１１４〜１１７℃／０．８〜０．９ｍｍＨｇ）により精製することを除けば３−（４−シクロヘキシルフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステルの製造（方法Ａ）と同様にしてｍ−フルオロアセトフェノンから９１％の収率で製造した。
【００７３】
３−（４−ニトロフェニルアミノ）−３−（３−フルオロフェニル）−アクリル酸ブチルエステル
６３．０ｇ（０．４５６モル）の４−ニトロアニリン、４．０ｇ（０．０２３モル）の４−ニトロ−アニリン塩酸塩および１０６．３ｇ（０．５０６モル）の３−（３−フルオロフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステルを乾燥した２Ｌの丸底フラスコに入れた。混合物に１．３Ｌのｎ−ブタノールを加え、フラスコにソックスレー抽出器（カップ容量０．３Ｌ）、冷却器および窒素流入口を取り付けた。乾燥した活性４Åシーブ（２００ｇ）を抽出器のカップに入れ、反応混合物を窒素下、１１８℃の還流温度まで加熱し、この温度に９０時間維持した。反応混合物を熱いうちに少量の固体からデカントし、４８時間−１５℃まで冷却した。結晶性固体を真空ろ過により集めた。結晶を０．２Ｌの冷エタノールおよび０．２Ｌのへキサン（２回）で洗浄し、５０℃で一晩真空乾燥して３５．８ｇ（収率２０．８％）の表題化合物を得た。
【００７４】
前記反応混合物からの母液を濃縮し、１．０Ｌのトルエンで希釈し、トルエンを真空下で除去した；この工程を２回繰り返した。次に、溶液を１．０Ｌのｎ−ブタノールで希釈し、１．７５ｇ（１０．０ミリモル）の４−ニトロ−アニリン塩酸塩を加えた；フラスコに前記のようなソックスレー抽出器を取り付け、カップに新しい２００ｇのシーブを入れた。混合物を窒素下に置き、９０時間還流温度にした。次に、混合物を冷却し、真空下で最終容量の０．６Ｌまで濃縮した。溶液に３−（４−ニトロフェニルアミノ）−３−（３−フルオロフェニル）−アクリル酸ブチルエステルの種結晶を加え、−１５℃で４８時間放置した。結晶を前記のようにして集め、乾燥した後６４．３ｇを得た。分析の結果、この物質は４−ニトロ−アニリンを含んでいたため、それをフラッシュクロマトグラフィーに付した。生成物を０．５Ｌの塩化メチレン／へキサン（１：１）に溶解し、塩化メチレン／へキサン（１：１）で湿式充填した３．０Ｌのシリカのカラムに付した。カラムを４．０Ｌの塩化メチレン／ヘキサン（１：１）；９．０Ｌの塩化メチレン／ヘキサン（２：１）；および２．０Ｌの塩化メチレンで溶離した。０．５Ｌのフラクションを集め、所望の生成物を含有するものを合一して４１．７ｇ（２４．３％）の明黄色の固体を得た。総合収率は４５．１％であった。
【００７５】
２−（３−フルオロフェニル）−６−ニトロ−キノリン−４−オール
０．７５ＬのダウサームＡを機械攪拌器、熱電対プローブを持つクライゼンアダプター、および窒素流入口を有する還流冷却器を備えた３Ｌの三つ口フラスコに入れ、２５０℃まで加熱した。これに０．２５時間にわたって７７．０ｇ（０．２１５モル）の３−（４−ニトロフェニルアミノ）−３−（３−フルオロフェニル）−アクリル酸ブチルエステルを注意しながら少しずつ加えた。混合物を２５０℃に１．５時間維持し、次に２時間にわたって９０℃まで冷却した。混合物を１．０Ｌのへキサンで処理し、一晩攪拌しながら室温まで冷却した。淡褐色の固体を吸引ろ過により集め、それぞれ０．１５Ｌのへキサンで３回洗浄した。固体を一晩５０℃で真空乾燥して５８．６３ｇ（９６．０％）の表題化合物を得た。
【００７６】
６−ニトロ−４−クロロ−２−（３−フルオロフェニル）−キノリン
５．２ｇ（１６．３ミリモル）の６−ニトロ−２−（３−フルオロフェニル）−キノリン−４−オールを冷却器、磁気攪拌器および窒素流入口を備えた５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに入れた。これに１５．２ｍＬ（２５．０ｇ、１６３ミリモル、１０当量）のオキシ塩化リンを攪拌しながら加えた。次に、混合物を１１０℃まで４時間加熱した。この後、反応混合物を室温まで冷却し、すべてのＰＯＣｌ_３が消費されるまで水を注意して滴加した。物質を水から結晶させ、その固体をろ過により集めた。次に、固体を水で洗浄し、２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、水で摩砕した。ろ過により集め、水で洗浄し、真空オーブンで乾燥した後、４．６ｇ（８４％）の表題化合物を得た。
【００７７】
６−ニトロ−４−アジド−２−（３−フルオロフェニル）−キノリン
３．２ｇ（９．５０ミリモル）の６−ニトロ−４−クロロ−２−（３−フルオロフェニル）−キノリンを冷却器、磁気攪拌器、シリコーン油加熱浴、窒素流入口および気体流出口を備えた２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに入れた。これに７５ｍＬのＮ−メチルピロリジノン、次に６．０ｇ（９５ミリモル、１０当量）のアジ化ナトリウムを加えた。混合物を攪拌し、６０℃まで１８時間加温した。この後、混合物を冷却し、５００ｍＬの水および２５０ｍＬの酢酸エチルを含有する１Ｌの分液ロートに注いだ。ｐＨを９．０に調整し、層を分離した。水層を１００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出し、有機層を合一し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、ろ過し、濃縮して生成物を得、それをさらに精製することなく次の工程に使用した。
【００７８】
２−（３−フルオロフェニル）−４，６−キノリンジアミン
６−ニトロ−４−アジド−２−（３−フルオロフェニル）−キノリンを冷却器、磁気攪拌器、窒素流入口、気体流出口およびシリコーン油加熱浴を備えた５００ｍＬの三つ口フラスコに入れ、２５０ｍＬの酢酸エチルおよび５０ｍＬのエタノール中で懸濁した。混合物を攪拌し、加熱還流し、２０ｇ（８９ミリモル、６当量）の塩化第一スズ二水和物を４０分にわたって注意しながら少しずつ加え、混合物をさらに２時間加熱した。この後、混合物を冷却し、５００ｍＬの水に注いだ。注意してｐＨを９．０に調整し、溶液をろ過した。固体を１００ｍＬの酢酸エチルで洗浄し、ろ液を合一し、水層を２００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合一し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。生成物を溶離剤として酢酸エチル中の１０％メタノールを用いるシリカゲルカラム上のクロマトグラフィーにより処理し、塩化メチレンおよびヘキサンから再結晶して３．６ｇ（８８％）の表題化合物を得た。
【００７９】
方法Ｃ：
本明細書で開示した典型的な化合物２１の製造に使用される中間体３−（メチル−プロポキシ）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル（表１を参照）を次の方法により製造した。
【００８０】
３−（メチル−プロポキシ）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル
鉱油中の１６０．０ｇ（６０％、４．０モル）の水素化ナトリウム分散液を機械攪拌器、温度計、添加ロートおよび窒素流入口を備えた１２Ｌの丸底フラスコに入れた。フラスコを氷浴で冷却し、温度を２０℃以下に維持しながら３．５Ｌの乾燥ＴＨＦを攪拌しながら加えた。攪拌した水素化ナトリウムの懸濁液に０．３ＬのＴＨＦに溶解した３７６．４ｇ（４．０モル）のイソ−ブタノールを加えた。温度を１０℃以下に維持するような速度で添加を約２時間行なった。次に、混合物を室温まで加温し、１時間攪拌した。再び冷却した溶液に０．３ＬのＴＨＦに溶解した４１８ｇ（２．０モル）のエチル４−ブロモアセトアセテート（Ａ．ＳｖｅｎｄｓｅｎおよびＰ．Ｍ．ＢｏｌｌのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ２９， ４２５１−４２５８（１９７３年））を１時間にわたって加えた。温度を１０℃以下に維持するように添加速度を制御した。氷浴を取り外し、褐色のスラリーを室温で一晩攪拌した。反応混合物を２．２Ｌの１．０Ｎ塩酸に注いで急冷し、相を分離した。水相を０．５Ｌのジエチルエーテルで抽出し、合一した有機相を１．０Ｌの飽和ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。ろ過し、溶媒を除去した後、８３０ｇの赤褐色の油状物を得た。生成物を０．４Ｌのへキサンに溶解し、ヘキサンで湿式充填した８．０Ｌのシリカのカラムに付した。カラムを４．０Ｌのへキサン、８．０Ｌのへキサン／ジエチルエーテル（３：１）および１２．０Ｌのへキサン／ジエチルエーテル（２：１）で溶離した。第２フラクション（４５９．３ｇ）をヘキサンで湿式充填した４．０Ｌのシリカのカラムに再び付した。カラムを３．０Ｌのへキサン／ジエチルエーテル（９５：５）；２．０Ｌのへキサン／ジエチルエーテル（９：１）；２．０Ｌのへキサン／ジエチルエーテル（４：１）および１２．０Ｌのへキサン／ジエチルエーテル（３：１）で溶離した。主要なフラクションをクーゲルロア装置を使用して４０〜４５℃／１．０トル以下のオーブン温度でバルブ・ツー・バルブ蒸留した。所望の生成物を１４５．９ｇ（３３％）の油状物として得た。
【００８１】
方法Ｄ：
本明細書で開示した典型的な化合物１２４の製造に使用される中間体Ｎ−［２−（３−フルオロフェニル）−６−アミノ−４−キノリニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（表１を参照）を次の方法により製造した。
【００８２】
３−（３−フルオロフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル：
２１．７ｇ（０．５４３モル）の水素化ナトリウムの６０％油分散液を乾燥ヘキサン（１Ｌ）と一緒に添加ロート、窒素流入口、磁気攪拌器、加熱マントル、熱電対および冷却器を備えた２Ｌの三つ口丸底フラスコに入れた。得られた懸濁液を１５分間攪拌し、攪拌を止め、固体を沈降させた。次に、ヘキサンおよび溶解した油状物を含有する透明な上澄みをカニューレで取り出した。炭酸ジエチル（１Ｌ）を加え、懸濁液を１２０℃まで加熱した。この懸濁液に２５０ｍＬの炭酸ジエチルに溶解した１００ｇ（０．４９４モル）のｍ−フルオロアセトフェノンの溶液を４０分にわたって注意しながら滴加した。添加が進むにつれて反応が開始し、水素が発生し、色が淡褐色に変化した。アセトフェノン誘導体の添加が終了した後、反応混合物をさらに１時間加熱した。反応混合物を冷却し、２Ｌの分液ロートに注いだ。炭酸ジエチル層を１０％酢酸溶液で２回洗浄し、真空蒸留（沸点１１４〜１１７℃／０．８〜０．９ｍｍＨｇ）により収率９１％で精製した。
【００８３】
３−（４−ニトロフェニルアミノ）−３−（３−フルオロフェニル）−アクリル酸ブチルエステル：
１０６．３ｇ（０．５０６モル）の３−（３−フルオロフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル、６３．０ｇ（０．４５６モル）の４−ニトロ−アニリンおよび４．０ｇ（０．０２３モル）の４−ニトロ−アニリン塩酸塩を乾燥した２Ｌの丸底フラスコに入れた。混合物に１．３Ｌのｎ−ブタノールを加え、フラスコにソックスレー抽出器（カップ容量０．３Ｌ）、冷却器および窒素流入口を取り付けた。乾燥した活性４Åシーブ（２００ｇ）を抽出器のカップに入れ、反応混合物を窒素下、１１８℃で加熱還流し、この温度に９０時間維持した。反応混合物を熱いうちに少量の固体からデカントし、４８時間−１５℃まで冷却した。結晶性固体を真空ろ過により集めた。結晶を０．２Ｌの冷エタノールおよび０．２Ｌのへキサン（２回）で洗浄し、５０℃で一晩真空乾燥して３５．８ｇ（収率２０．８％）の表題化合物を得た。
【００８４】
前記反応混合物からの母液を濃縮し、１．０Ｌのトルエンで希釈し、トルエンを真空下で除去した；この工程を２回繰り返した。次に、溶液を１．０Ｌのｎ−ブタノールで希釈し、さらに１．７５ｇ（１０．０ミリモル）の４−ニトロ−アニリン塩酸塩を加えた；フラスコに前記のようなソックスレー抽出器を取り付け、カップに新しい２００ｇのシーブを入れた。混合物を窒素下に置き、９０時間還流温度にした。反応混合物を冷却し、真空下で最終容量の０．６Ｌまで濃縮した。次に、溶液に３−（４−ニトロ−フェニルアミノ）−３−（３−フルオロ−フェニル）−アクリル酸ブチルエステルの種結晶を加え、−１５℃で４８時間放置した。結晶を前記のようにして集め、乾燥した後６４．３ｇを得た。分析の結果、この物質は４−ニトロ−アニリンで汚染されていたため、それをフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を０．５Ｌの塩化メチレン／ヘキサン（１：１）に溶解し、塩化メチレン／ヘキサン（１：１）で湿式充填した３．０Ｌのシリカのカラムに付した。カラムを４．０Ｌの塩化メチレン／へキサン（１：１）；９．０Ｌの塩化メチレン／ヘキサン（２：１）；および２．０Ｌの塩化メチレンで溶離した。０．５Ｌのフラクションを集め、所望の生成物を含有するものを合一して４１．７ｇ（２４．３％）の明黄色の固体を得た。総合収率は４５．１％であった。
【００８５】
２−（３−フルオロ−フェニル）−６−ニトロ−キノリン−４−オール：
０．７５ＬのダウサームＡを機械攪拌器、熱電対プローブを持つクライゼンアダプター、および窒素流入口を有する還流冷却器を備えた３Ｌの三つ口フラスコに入れ、２５０℃まで加熱した。これに０．２５時間にわたって７７．０ｇ（０．２１５モル）の３−（４−ニトロフェニルアミノ）−３−（３−フルオロフェニル）アクリル酸ブチルエステルを注意しながら少しずつ加えた。混合物を２５０℃に１．５時間維持し、次に２時間にわたって９０℃まで冷却した。混合物を１．０Ｌのへキサンで処理し、一晩攪拌しながら室温まで冷却した。淡褐色の固体を吸引ろ過により集め、それぞれ０．１５Ｌのへキサンで３回洗浄した。固体を一晩５０℃で真空乾燥して５８．６３ｇ（９６．０％）の表題化合物を得た。
【００８６】
６−ニトロ−４−クロロ−２−（３−フルオロ−フェニル）−キノリン：
５．２ｇ（１６．３ミリモル）の６−ニトロ−２−（３−フルオロ−フェニル）−キノリン−４−オールを冷却器、磁気攪拌器および窒素流入口を備えた５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに入れた。これに１５．２ｍＬ（２５．０ｇ、１６３ミリモル、１０当量）のオキシ塩化リンを攪拌しながら加えた。混合物を１１０℃まで４時間加熱した。この後、反応混合物を室温まで冷却し、すべてのＰＯＣｌ_３が消費されるまで水を注意して滴加した。生成物を水から結晶させ、その固体をろ過により集めた。固体を水で洗浄し、２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、水で摩砕した。ろ過により集め、水で洗浄し、真空オーブンで乾燥した後、４．６ｇ（８４％）の生成物を得た。
【００８７】
Ｎ−［６−ニトロ−２−（３−フルオロフェニル）−４−キノリニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン：
２０ｇ（５９．４ミリモル）の６−ニトロ−４−クロロ−２−（３−フルオロ−フェニル）−キノリンを磁気攪拌器、窒素流入口、気体流出口、冷却器および加熱浴を備えた５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに入れた。物質を１５０ｍＬのＮ−メチルピロリジノンに溶解し、攪拌し、２５０ｍＬの４０％ジメチルアミン水溶液を加えた。次に、混合物を６０℃まで４８時間加温した。この後、反応混合物を冷却し、４Ｌの三角フラスコ中で３Ｌの水に注ぎ、固体が生成するまで混合物を攪拌した。固体を真空ろ過により集め、真空オーブンで乾燥した。生成物を−２０℃の冷凍庫でエタノールから再結晶して１９．６ｇ（収率９５％）の所望の生成物を得た。
【００８８】
Ｎ−［２−（３−フルオロフェニル）−６−アミノ−４−キノリニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン
炭酸カルシウム支持体上の５％パラジウムからなる１５０ｍｇの触媒と一緒にＮ−［６−ニトロ−２−（３−フルオロフェニル）−４−キノリニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンを５００ｍＬのパール振騰びんに入れた。これに１５０ｍＬのエタノールを加え、次に５０ｐｓｉの水素雰囲気に付した。混合物を１８時間振騰し、水素雰囲気を窒素に換えた。触媒をろ過により除去し、溶液を濃縮した。残留物を酢酸エチルに取り、５％水酸化ナトリウム溶液で洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。抽出物を塩化メチレンおよびヘキサンから再結晶して２．８ｇ（７７％）の表題化合物を得た。
Ｎ−［２−（３−フルオロフェニル）−６−アミノ−４−キノリニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンはまた、方法Ｂのように塩化第一スズを使用して６−ニトロ基を還元することにより製造した。
【００８９】
方法Ｅ：
本明細書で開示した典型的な化合物の合成に使用される中間体を次の手順と同様にして製造した。
ヒドロキシ−ピリミジン
還流冷却器、窒素流入口、およびストッパーを有する２個の添加ロートを備えたオーブン乾燥した三つ口丸底フラスコに乾燥窒素流下でオーブン活性化した５Åモレキュラーシーブを加えた。室温のフラスコに３．０３ｇ（０．１２６モル）の水素化ナトリウム（９５％）、次に４０ｍＬの乾燥ＤＭＦを加えた。攪拌を開始して固体の懸濁液を得た。４０ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した１１．９ｇ（０．１２５モル）のグアニジン塩酸塩の溶液を０．２５時間にわたって添加ロートで滴加し、攪拌を室温で０．５時間続けた。２６．２８ｇ（０．１２５モル）の３−（４−フルオロフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステルを７５ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解し、滴加ロートで反応フラスコに０．２５時間にわたって加えた。次に、混合物を一晩加熱還流した。混合物を熱ろ過し、濃縮して均質な混合物を得た。１００ｍＬの水を加え、生成した固体をろ過し、乾燥した。固体をメタノールから再結晶して４−ヒドロキシ−６−（４−フルオロフェニル）ピリミジン−２−アミン（収率５１％）を得た。ヒドロキシ−ピリミジン化合物を方法Ｇの工程に使用した。
【００９０】
方法Ｆ：
クロロ−ピリミジン
乾燥した２４ｇ（０．１１７モル）の４−ヒドロキシ−６−（４−フルオロフェニル）ピリミジン−２−アミンを直接２５０ｍＬの丸底フラスコに計り込んだ。乾燥窒素流下、２４．１ｇ（０．１１７モル）の五塩化リン、次に１００ｍＬのオキシ塩化リンを加えた。混合物を一晩還流し、その後液相を蒸発により除去し、氷塊を反応フラスコに加えた。次に、飽和炭酸ナトリウムを加えて攪拌混合物を塩基性にすると固体沈殿物が生成した。固体の４−クロロ−６−（４−フルオロフェニル）ピリミジン−２−アミンをろ過し、乾燥した、１４．４ｇ（５５％）。クロロ−ピリミジン化合物を方法Ｈの工程に使用した。
【００９１】
方法Ｇ：
本明細書で開示した典型的な化合物（表１を参照）をトリフレート中間体からの実施例１１１の化合物Ｎ６−［２−アミノ−６−（４−ブチルフェニル）ピリミジン−４−イル］−２−（４−フルオロフェニル）−キノリン−４，６−ジアミンの製造を説明している次の方法と同様にして製造した。
窒素で満たした反応バイアルに０．１２１ｇ（０．５ミリモル）の４−ヒドロキシ−６−（４−ブチルフェニル）ピリミジン−２−アミンおよび０．１７８ｇ（０．５ミリモル）のＮ−フェニルトリフルオロメタンスルホンアミドを入れた。０．５ｍＬの乾燥Ｎ−メチル−２−ピロリジノンに溶解した０．５０ｇ（０．５ミリモル）のトリエチルアミンを混合物に加え、その混合物を６０℃で２時間加熱した。０．１２６ｇ（０．５ミリモル）の２−（４−フルオロフェニル）キノリン−４，６−ジアミンを１．０ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリジノンに溶解し、反応バイアルに加え、次に４モル当量のＨＣｌ （４．０Ｍ、ジオキサン中）を加えた。混合物を８０℃で１０時間加熱すると固体が生成した。室温まで冷却した後、バイアルのすべての内容物を１０ｍＬのメタノールで希釈し、ろ過した。得られた固体のＮ６−［２−アミノ−６−（４−ブチルフェニル）ピリミジン−４−イル］−２−（４−フルオロフェニル）キノリン−４，６−ジアミンを５０ｍＬのメタノールで洗浄して３０ｍｇの黄色の固体（収率１３％）を得た。
【００９２】
方法Ｈ：
本明細書で開示した典型的な化合物（表１を参照）を実施例５の化合物Ｎ６−［２−アミノ−６−（４−フルオロフェニル）−ピリミジン−４−イル］−２−フェニル−キノリン−４，６−ジアミンの製造を説明している次の方法と同様にして製造した。
０．５ｇ（２．１２ミリモル）の２−フェニル−キノリン−４，６−ジアミンおよび０．８３ｇ（４．２５ミリモル）の４−クロロ−６−（４−フルオロフェニル）ピリミジン−２−アミンを直接反応フラスコに計り込み、次に１０ｍＬの乾燥Ｎ−メチル−２−ピロリジノンおよび２滴の濃塩酸をフラスコに加えた。混合物を窒素雰囲気下、１００℃で一晩加熱した。混合物を室温まで冷却し、水酸化ナトリウム水溶液で希釈すると暗褐色の固体が沈殿した。固体を集め、真空下で乾燥して０．３６５ｇのＮ６−［２−アミノ−６−（４−フルオロフェニル）ピリミジン−４−イル］−２−フェニルキノリン−４，６−ジアミン（収率９２％）を得た。
【００９３】
【実施例】
典型的な化合物１〜１２５を包括的に表１に記載し、各化合物の名称、分子式およびＭＳ結果を示す。キノリン前駆体を適当な方法Ａ、Ｂ、ＣまたはＤにより製造し、上記方法Ｇによりヒドロキシピリミジンと、または上記方法Ｈによりクロロピリミジンと反応させた。
【００９４】
【表１】

【００９５】
【表２】

【００９６】
【表３】

【００９７】
【表４】

【００９８】
【表５】

【００９９】
【表６】

【０１００】
【表７】

【０１０１】
【表８】

【０１０２】
【表９】

Claims (5)

1. 構造式Ｉ
   

   

   ［式中、Ｒ^１はＮＥ^１Ｅ^２ であり、ここでＥ^１は水素およびメチルから選択され、そしてＥ^２は水素、Ｃ_１−４アルキルおよびフェニルＣ_１−４アルキルから選択され；
   Ｒ^２はＥ^３およびＥ^４から選択され、ここでＥ^３はＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−４アルコキシおよびＣ_１−６アルコキシＣ_１−４アルキルから選択され、そして
   Ｅ^４はハロゲン、Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−４アルコキシ、ペルフルオロＣ_１−２アルキルおよびＣ_５−７シクロアルキルから選択される基で置換されたフェニルであり；
   Ｒ^３はＥ^５およびＥ^６から選択され、ここでＥ^５はＮＨ_２、ペルフルオロＣ_１−２アルキル、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシＣ_１−４アルキル、フェニルＣ_１−２アルコキシおよびフェノキシＣ_１−２アルキルから選択され、そして
   Ｅ^６は１または２個の位置が独立してハロゲン、シアノ、ペルフルオロＣ_１−２アルキル、Ｃ_１−４アルコキシ、フェニルＣ_１−２アルコキシ、フェノキシＣ_１−２アルキル、Ｃ_１−６アルコキシＣ_１−４アルキルから選択される基で置換されたフェニルである］の化合物。
2. Ｒ^１はＮＥ^１Ｅ^２ であり、ここでＥ^１は水素であり、そしてＥ^２は水素、メチルおよびベンジルから選択され；
   Ｒ^２はＥ^３およびＥ^４ から選択され、ここでＥ^３はメチル、ペンチル、プロポキシメチルから選択され、そして
   Ｅ^４はフルオロ、クロロ、メチル、メトキシ、トリフルオロメチルおよびシクロヘキシルから選択される基で置換されたフェニルであり；
   Ｒ^３はＥ^５およびＥ^６から選択され、ここでＥ^５はメチル、ペンチル、トリフルオロメチル、プロポキシメチル、ベンジルオキシおよびフェニルオキシメチルから選択され、そして
   Ｅ^６は１または２個の位置が独立してクロロ、フルオロ、ブチル、トリフルオロメチル、メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ、フェノキシメチル、プロポキシメチルおよびシアノから選択される基で置換されたフェニルである請求項１記載の化合物。
3. 疼痛の患者に疼痛を軽減するのに有効な量の請求項１記載の化合物を投与することからなる疼痛の治療法。
4. 治療的に有効な量の請求項１記載の化合物を医薬上許容しうる賦形剤または希釈剤と一緒に含有する医薬組成物。
5. ａ） ３−置換−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステルを水素化ナトリウムおよび活性５Åモレキュラーシーブの存在下、Ｎ−ジメチルホルムアミド中でグアニジン塩酸塩と反応させることにより構造式ＩＩ
   

   

   のヒドロキシ−ピリミジン前駆体を製造し
   ｂ）オキシ塩化リンおよび五塩化リンと一緒に還流して構造式ＩＩのヒドロキシ−ピリミジン化合物を塩素化して構造式ＩＩＩの化合物を生成することによりクロロ−ピリミジン前駆体を製造し
   

   

   ｃ）構造式ＩＩのヒドロキシ−ピリミジン化合物をＮ−フェニルトリフルオロメタンスルホンアミド、トリエチルアミンおよび乾燥Ｎ−メチル−２−ピロリジノンと一緒に加熱して反応させて構造式ＩＶの化合物を生成することによりトリフレート−ピリミジン前駆体を製造し
   

   

   ｄ）次の工程に従ってキノリン前駆体を製造し
   ｄ１）下記のようにして構造式Ｖの新規な３−置換−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル（β−ケトエステル）を製造し
   

   

   （式中、Ｒ^２は前記で定義された通りである）
   ｄ２）下記のようにして構造式Ｖのβ−ケトエステルを構造式ＶＩのエナミンに変換し
   

   

   （式中、Ｒ^６は−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_３またはＮＯ_２から選択される基である）
   ｄ３）下記のようにして構造式ＶＩのエナミンを環化して構造式ＶＩＩの化合物を生成し
   

   

   そして、
   ｄ４）Ｒ^６が−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_３である場合、下記スキームの工程に従って構造式ＶＩＩの化合物を構造式Ｉの化合物に変換し
   

   

   または
   Ｒ^６が−ＮＯ_２である場合、下記のようにして構造式ＶＩＩの化合物を構造式Ｉの化合物に変換し
   

   

   または別法として、
   Ｒ^６が−ＮＯ_２である場合、下記のようにして構造式ＶＩＩの化合物を構造式Ｉの化合物に変換し
   

   

   ｅ）下記スキームに従って構造式ＶＩＩＩのキノリン前駆体を構造式ＩＩＩのクロロ−ピリミジン前駆体と反応させて構造式Ｉの化合物を生成し
   

   

   または
   ｆ）下記スキームに従って構造式ＶＩＩＩのキノリン前駆体を構造式ＩＶのトリフレート−ピリミジン前駆体と反応させて構造式Ｉの化合物を生成し
   

   

   工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）において、必要に応じて何れかの官能基を保護基で保護し、その後
   ｇ）上記保護基を除去し；
   ｈ）本明細書で開示した方法Ａ〜Ｌに記載の手順に従って構造式Ｉの化合物を他の構造式Ｉの化合物に変換し；そして
   ｉ）構造式Ｉの化合物を必要な程度まで精製し、必要に応じて製薬上許容しうる塩を生成する
   ことからなる請求項１記載の化合物の製造法。