JP2005538930A

JP2005538930A - ヒトｆｏｘｃ２タンパク質およびｆｏｘｃ−２相互作用タンパク質の複合体

Info

Publication number: JP2005538930A
Application number: JP2003564087A
Authority: JP
Inventors: イサベル・クリメント−ヨハンソン; スヴェン・エナーベック
Original assignee: LeanGene AB
Current assignee: LeanGene AB
Priority date: 2002-01-29
Filing date: 2003-01-28
Publication date: 2005-12-22
Also published as: US20060052293A1; US7217692B2; EP1468017A1; WO2003064467A1

Abstract

本発明は、ＦＯＸＣ２タンパク質と他のタンパク質、特にｐ６２１、ＮＯＬＰ、ＨＳＣ７１、ＦＴＰ３、ＣＬＨ１およびキナーゼＡアンカータンパク質８４／１４９（ＡＫＡＰ）と命名されたタンパク質とＦＯＸＣ２との複合体に関する。タンパク質複合体は変調されたＦＯＸＣ２活性により処置されうる病状、例えば肥満症、高トリグリセリド血症、食事誘導インスリン耐性および／または２型糖尿病などの処置のために有用な物質を同定する方法にて用いることが可能である。

Description

（技術分野）
本発明は、ＦＯＸＣ２タンパク質と他のタンパク質との複合体、特にＦＯＸＣ２とｐ６２１、ＮＯＬＰ、ＨＳＣ７１、ＦＴＰ３、ＣＬＨ１およびキナーゼＡアンカータンパク質８４／１４（ＡＫＡＰ）と命名されたタンパク質との複合体に関する。前記複合体は、変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置されうる病状、例えば肥満症、高トリグリセリド血症、食事誘導インスリン抵抗性および／または２型糖尿病の処置に有用な物質を同定する方法にて用いられ得る。

（発明の背景）
肥満症、高脂血症およびインスリン抵抗性は、２型糖尿病に共通の前兆である。ヒト・ウイングド・ヘリックス／フォークヘッド転写因子遺伝子であるＦＯＸＣ２は、脂肪細胞代謝の主要な調節因子として同定された（Cederberg, A. et al.（2001）Cell 106：563−573）。脂肪細胞におけるＦＯＸＣ２発現の増大は、徐脂肪およびインスリン感受性表現型を誘導する、遺伝子発現における多面的効果を有する。ＦＯＸＣ２は、脂肪細胞のＰＫＡホロ酵素組成物の変化を介するベータ−アドレナリン−ｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）シグナル伝達経路の感受性を増加させることによって脂肪細胞の代謝に影響する。高脂肪の食事によって誘導されるＦＯＸＣ２レベルの増大は、高トリグリセリド血症および食事誘導インスリン抵抗性を含む肥満症に関する多くの症状を軽減するようようである；つまり２型糖尿病に対する予防となり得る。

ヒトＦＯＸＣ２タンパク質（配列番号：１）の核酸およびアミノ酸配列はＦＫＨＬ１４、ＦＲＥＡＣ−１１、またはＳ１２としても知られ、マウス間充組織フォークヘッド−１（ＭＦＨ−１）タンパク質に相当し、当業者に周知である（N. et al. (1993) FEBS letters 326: 171-176; Miura, N. et al. (1997) Genomics 41: 489-492; WO 98／54216 and WO 01／60853を参照のこと）。

ＦＯＸＣ２がどのようにして遺伝子の発現を調節する働きをするのかという様々なメカニズムが提案されている。１つの可能性としては、ＦＯＸＣ２がノッチデルタ（Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ）シグナル伝達経路の下流にある因子と相互作用するというものである（Kume, T. et al. (2001) Genes & Development 15：2470-2482）。例えば、Grouchoタンパク質はｂＨＬＨ転写因子と共に転写抑制複合体を形成する。Grouchoが２つのＦＯＸタンパク質、ＦＯＸＧ１およびＦＯＸＡ２に結合し得ることを示唆され（Wang, J.-C. et al. (2001) J. Biol. Chem. 275: 18418-18423; Yao, J. et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:1962-1972）、そして同種の相互作用がＦＯＸＣタンパク質で起こりうることが示唆された。しかし、ＦＯＸＣ２タンパク質とGrouchoの相互作用は、未だ示されていない。さらに、ＦＯＸＣ２と所望のタンパク質、例えばｐ６２１、ＮＯＬＰ、熱ショック同族タンパク質７１（ＨＳＣ７１）、ＦＴＰ３、ＣＬＨ１またはＡキナーゼアンカータンパク質８４／１４９（ＡＫＡＰ）との相互作用も未だ記載されていない。

（発明の開示）
本発明は、ＦＯＸＣ２と相互作用するタンパク質の同定に基づく。ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質の同定は、この転写因子シグナル経路の理解に貢献する。さらに、そのような相互作用タンパク質は、それ自身が肥満症および糖尿病の処置に有用な物質の同定に有用となり得る。

よって、本発明の第一の態様は、ＦＯＸＣ２タンパク質のタンパク質複合体、例えば、ヒトＦＯＸＣ２タンパク質およびＦＯＸＣ２相互作用タンパク質を提供し、ここにＦＯＸＣ２相互作用タンパク質は、ｐ６２１（例えば、配列番号：２）、ＮＯＬＰ（例えば、配列番号：３）、熱ショック同族タンパク質７１（ＨＳＣ７１；例えば、配列番号：４）、ＦＴＰ３（例えば、配列番号：５）、ＣＬＨ１（例えば、配列番号：６）およびＡキナーゼアンカータンパク質８４／１４９（ＡＫＡＰ；例えば、配列番号：７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

１つの具体例にて、本発明は第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドからなる実質的に純粋なタンパク質複合体を特色とし、ここに、第一ポリペプチドは配列番号：１のアミノ酸配列を含み、そして第二ポリペプチドは配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含む。

いくつかの具体例にて、第一ポリペプチドは配列番号：１のアミノ酸配列と１つまたはそれ以上の残基にて異なる配列を含む。さらにいくつかの具体例にて、第二ポリペプチドは配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列と１つまたはそれ以上の残基にて異なる配列を含む。好ましくは、その相違が非必須残基における相違または変異、あるいは同類置換である。もう１つの実施例にて、第一または第二ポリペプチドは配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８として示される配列と少なくとも約６０％の相同性を有するアミノ酸配列またはその断片を含む。好ましくは、ポリペプチドは配列番号：１、２、３、４、５、６または７と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を有する。好ましいポリペプチド断片は、配列番号：１、２、３、４、５、６または７として示される配列の長さの少なくとも１０％であり、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上の長さである。好ましい第一ポリペプチドは、配列番号：２、３、４、５、６または７のポリペプチドに結合する能力を有する。いくつかの実施例にて、第一ポリペプチドはＦＯＸＣ２転写活性を有する。好ましい第二ポリペプチドは、配列番号：１のポリペプチドに結合する能力を保有する。

特定のタンパク質複合体またはポリペプチドに関して本明細書にて用いる「実質的に純粋」とは、タンパク質複合体またはポリペプチドが他の生物学的マクロ分子を実質的に含まないことを意味する。例えば、実質的に純粋なタンパク質複合体またはポリペプチドとは、乾燥重量で少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９５％または９９％の純度である。純度は当業者に周知の適した標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。

もう１つの態様において本発明は、治療的または予防的な有効量の、ヒトＦＯＸＣ２タンパク質とＦＯＸＣ２相互作用タンパク質との複合体、および製薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供し、ここに、ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質は配列番号：２、３、４、５、６、７または８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。

本発明の他の具体例は、変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置可能な医学的状態の処置にて用いるための医薬組成物であり、治療的または予防的な有効量の配列番号：２、３、４、５、６、７または８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＦＯＸＣ２相互作用タンパク質、および製薬的に許容可能な担体を含む。

本発明の他の具体例は、ＦＯＸＣ２発現または活性に関して病状の処置または予防に有効な量の本明細書に記載のタンパク質および製薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。

さらに本発明の他の態様は、ＦＯＸＣ２発現または活性を変調する方法であり、ＦＯＸＣ２、例えばヒトＦＯＸＣ２を発現する細胞を、細胞にてＦＯＸＣ２の発現または活性を変調するのに十分な量の本明細書に記載のポリペプチド、例えば実質的に純粋なポリペプチド（例えば、配列番号２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列からなるポリペプチド）またはポリペプチドをコードする核酸と接触させることを包含する方法である。

さらに本発明の態様は、変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状の処置または予防のための方法であり、かかる処置または予防を必要とする患者に、変調されたＦＯＸＣ２活性により処置可能な病状を処置または予防するのに有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、例えば実質的に純粋なポリペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列からなるポリペプチド）および製薬的に許容可能な担体を投与することを含む。

病状とは、増大するＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状であり、例えば肥満症、高トリグリセリド血症、食事誘導インスリン耐性または２型糖尿病などでありうる。あるいはまた、病状とは減少するＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状であり、例えば食欲不振であり得る。

用語「処置する」とは、ほ乳類における疾患の処置を意味し、例えば（ｉ）疾患の予防、すなわち疾患の臨床症状の原因を発展させないこと（予防法）；（ｉｉ）疾患の抑制、すなわち臨床症状の発展を抑止すること；および／または（ｉｉｉ）疾患の緩和、すなわち臨床症状の回復を促すこと、を含む。用語「有効量」とは、処置下の疾患状態の処置に対して有効な投与量を意味する。これは患者、疾患および実行している処置に依存して変わるであろう。

他の態様にて、本発明はＦＯＸＣ２タンパク質複合体の形成を変調(増加または減少)する物質を同定する方法を特徴とし、該方法は：（ｉ）候補物質の存在下で本明細書に記載する第一ポリペプチド（例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド）および第二ポリペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を接触させ；（ｉｉ）候補物質の存在下で第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドの複合体の形成を測定し；そして（ｉｉｉ）候補物質の不存在下での第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドの複合体の形成と候補物質の存在下での第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドの複合体の形成を比較し、そのことにより候補物質がＦＯＸＣ２タンパク質複合体の形成を変調するかどうかを決定すること、を含む。

本発明はまた、ＦＯＸＣ２活性を変調する物質を同定する方法を特徴とし、該方法は：（ｉ）候補物質の存在下で本明細書に記載する第一ポリペプチド（例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド）および第二ポリペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を接触させ；（ｉｉ）候補物質の存在下で第一ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性を測定し；そして（ｉｉｉ）候補物質の存在下での第一ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性と候補物質の不存在下での第一ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性を比較し、そのことにより候補物質がＦＯＸＣ２活性を変調するかどうかを決定すること、を含む。

本発明はまた、ＦＯＸＣ２活性を変調する物質を同定する方法を特徴とし、該方法は：（ｉ）候補物質と本明細書に記載する第一ポリペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を接触させ；（ｉｉ）第一ポリペプチドと結合する候補物質を決定し；（ｉｉｉ）候補物質と本明細書に記載する第二ポリペプチド（例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を接触させ；（ｉｖ）候補物質の存在下で第二ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性を測定し；そして（ｖ）候補物質の存在下での第二ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性と候補物質の不存在下での第二ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性を比較し、そのことにより候補物質がＦＯＸＣ２活性を変調するかどうかを決定すること、を含む。

本方法にて用いた第一ポリペプチドおよび／または第二ポリペプチドは、任意に実質的に純粋なポリペプチドであり得る。本発明の方法は、細胞存在系または無細胞系に用いて行われうる。本発明の方法にて測定されうるＦＯＸＣ２活性の例としては、ＦＯＸＣ２転写活性がある。

本発明はまた、変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状の処置または予防のための方法を提供し、該方法は変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状の処置または予防に有効量の本明細書に記載した方法によって同定される物質、および製薬的に許容可能な担体をそのような処置または予防を必要とする患者に投与することを含む。

病状とは、増加するＦＯＸＣ２活性によって処置されると推定される病状であってよく、例えば肥満症、高トリグリセリド血症、食事誘導インスリン耐性または２型糖尿病であり得る。別の病状とは、減少するＦＯＸＣ２活性によって処置されると推定される病状であってよく、例えば食欲不振であり得る。

さらに別の態様にて、本発明はヒトＦＯＸＣ２タンパク質およびＦＯＸＣ２相互作用タンパク質の複合体、すなわち本発明にて上記に定義した複合体に対して指向される抗体を提供する。そのような抗体は、当業者に周知の方法にて調製されうる。該抗体は、例えばヒトＦＯＸＣ２タンパク質および／またはＦＯＸＣ２相互作用タンパク質の特徴付けおよび／または精製のための方法にて有用であり、そこでは該複合体に対する抗体の特異的結合が利用される。そのような方法としては、例えば免疫沈降法、免疫ブロット法または免疫親和性クロマトグラフィーを含み得る。免疫沈降法は、細胞溶解、特異的抗原と抗体の結合、抗原−抗体複合体の沈降、洗浄および免疫複合体からの抗原の分離、を含む複数の決められた段階からなる（Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 10：Analysis of Proteins, 1991, John Wiley & Sons, Inc.）。免疫ブロット法は、ゲル電気泳動の分離能と免疫化学検出の特異性を組み合わせた方法である。免疫ブロット法は、タンパク質抗原の多数の重要な特徴（すなわち、試料の存在および量、分子量など）を決定するために用いられ得る。それは、少量の抗原の鋭敏な検出を可能にし、かつ抗原間の特定の相互作用を研究するために免疫沈殿と合わせて用いられ得る（抗体、A Laboratory Manual, Chapter 12: Immunoblotting, 1998, Harlow & Lane, CSH）。免疫親和性クロマトグラフィーは、細胞または均一化した組織からの可溶性成分または膜結合タンパク質抗原の精製を可能にする。前記技術は、非特異的に吸着されたタンパク質の溶出の前後に免疫親和性カラムからの単一タンパク質の溶出を伴う（Current Protocols in Protein Science, Chapter 9: Affinity purification, 1996, John Wiley & Sons, Inc.）。

１つの具体例にて、本発明はＦＯＸＣ２相互作用タンパク質の精製のための方法を特徴とし、前記方法は：（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＦＯＸＣ２タンパク質および配列番号：２、３、４、５、６、７または８のアミノ酸配列を含むＦＯＸＣ２相互作用タンパク質を包含するタンパク質複合体を、タンパク質複合体と結合する抗体と接触させ；そして（ｉｉ）タンパク質複合体からＦＯＸＣ２相互作用タンパク質を精製すること、を含む。タンパク質複合体と結合する抗体はまた、タンパク質複合体および／またはＦＯＸＣ２タンパク質の精製に用いられ得る。本明細書に記載する第一および／または第二ポリペプチドは、本発明の抗体を用いる精製方法にて用いられ得る。

本明細書における用語「標準プロトコール」および「標準手法」は、分子生物学的技術に関して用いられる場合は、例えば：Current Protocols in Molecular Biology, editors F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994、またはSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989のような通常の研究室マニュアルにおけるプロトコールおよび手法として理解されている。

他に定義されなければ、本明細書にて用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同様の意味を有する。好適な方法および材料を下記に記載するが、本明細書に記載する方法および材料と相似または等価であるものを本発明の実行または試験に使用することもできる。本明細書にて言及された出版物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、参照によって本明細書の全体に組み込まれる。不一致の場合には、定義を含む本明細書が支配的となる。さらに、材料、方法および実施例は単なる具体例であって、保護の範囲を制限するものではない。

以下の本発明は、添付した実施例に記載され、実施例は本明細書を例証するためのものであり、保護の範囲を制限するものではない。

（実施例）
実施例１：ＳＲＳ酵母ツーハイブリッド系による推定陽性ＦＯＸＣ２相互作用クローンの同定
１．１Ｓｏｓ採用系（ＳＲＳ）の概要
Ｓｏｓ採用系（ＳＲＳ）を、ヒトＦＯＸＣ２ポリペプチドと相互作用するポリペプチドアッセイに用いた。ＳＲＳは、最初にFields & Song (1989) Nature 340, 245-246に記載されたような周知の酵母ツーハイブリッド系の変形である。

CytoTrap（登録商標）SRS (http://www.stratagene.com/vectors/signal_trans/cytotrap; また、 Aronheim, A. et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17:3094-3102;および米国特許番号5,776,689をも参照のこと)にて、タンパク質は細胞質、すなわち核ではない場所にて発現し、転写後修飾を受け得る。細胞質におけるタンパク質−タンパク質相互作用は、Ｒａｓ経路を活性化する場所である細胞膜へのヒトＳｏｓ遺伝子産物（ｈＳｏｓ）の動員によって検出される。サイトトラップ（CytoTrap）系は、ｈＳｏｓの酵母ホモログであるｃｄｃ２５遺伝子における温度感受性変異を含む独特の酵母株ｃｄｃ２５Ｈを用いる。このグアニル核酸交換因子であるタンパク質は、Ｒａｓ経路の活性化に必須であり、つまり細胞の生存および増殖に必須である。ｃｄｃ２５タンパク質における変異は温度感受性であり；細胞は、２５℃では増殖可能であるが３７℃では増殖できない。このｃｄｃ２５変異は、ｈＳｏｓ遺伝子産物によって補完され３７℃での増殖を可能とするが、ｈＳｏｓタンパク質がタンパク質−タンパク質相互作用によって膜に局在することが条件となる。

ｐＭｙｒベクターは、ｃＤＮＡライブラリー構成物として設計される。遺伝子は、タンパク質を細胞膜に標的化し固定化して、遺伝子産物を細胞質内へと押し出すｓｒｃミリスチル化シグナルとの融合タンパク質として、このベクター内で発現する。タンパク質発現は、ＧＡＬ１プロモーターによって制御され、ガラクトースの存在下では誘導されるがグルコースの存在下では抑制される。

ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質（ＦＯＸＣ２）は、ｐＳｏｓベクターからｈＳｏｓタンパク質との融合タンパク質として発現する。ｃＤＮＡライブラリーおよびベイト構成物をｃｄｃ２５Ｈ酵母株へ同時形質転換する時、ガラクトース培地上で３７℃で増殖可能な細胞のみが、タンパク質−タンパク質相互作用によって救助されｈＳｏｓを細胞膜へ動員する。

１．２ｐＳｏｓにおけるヒトＦＯＸＣ２のクローニング
ＣＳＩＸ−１７（配列番号：９）およびＣＳＩＸ−１８（配列番号：１０）プライマーを用いてｐＣＢ６^＋プラスミド（Cederberg, A. et al. (2001) Cell 106: 1-20）からヒト全長ＦＯＸＣ２（アミノ酸１−５０１）を、標準的な手法によってＰＣＲにより増幅した。増幅断片をプライマーに含まれるＢａｍＨ１部位を用いてｐＳｏｓベクター（Stratagene catalog No. 217433）へクローンした。挿入位置は、制限酵素での消化によって分析し、そしてＦＯＸＣ２配列は標準的な手法により核酸配列の確認を行った。

１．３酵母におけるｐＳｏｓ−ＦＯＸＣ２の発現
酵母株ｃｄｃ２５Ｈ（Stratagene catalog No. 217437）を取り扱い説明書（Stratagene; CytoTrap Vector Kit; catalog No. 217438）に従ってｐＳｏｓ−ＦＯＸＣ２で形質転換し、そしてＳＤ／ＰＤＯ−Ｌｅｕ平板にプレートした。タンパク質抽出物をMoilanen A. et al. (1998) Mol. Cell Biol. 18: 5128-5139に記載のように作製し、続いて抗マウスＳｏｓ抗体（BD Transduction Laboratories; catalog No. S15520-050）を用いたＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析した。ウエスタンブロッティング分析は、Ｓｏｓ−ＦＯＸＣ２（ＭＷ178 kDa）およびＳｏｓ（ＭＷ127 kDa）に対応する予期される分子量で移動するタンパク質バンドを示した。さらに、抽出処理中または酵母細胞が増殖している間に起こるタンパク質分解によるものと推定される低分子量のバンドが見られた。

１．４酵母細胞の形質転換
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene catalog No. 975204）を、酵母細胞の形質転換に用いた。そのライブラリーをＬＢ−Ｋａｎ（直径１４ｃｍ）に約２００，０００コロニー／プレートとなるようにプレートし増幅した。ライブラリー価は全５０プレートで０．３×１０^９ｃｆｕ／ｍｌであるから、プレートに対してライブラリー溶液０．６６μｌをインキュベートし用いた。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、その後ピンポイントサイズのコロニーを殺菌剥離グラスを用いて２×４ｍｌのＬＢと共に集菌した。さらにＬＢ−Ｋａｎ培地を終容量１．５ｌまで加えた。細胞溶解液を３７℃で２時間インキュベートした。細胞を１０分間６，０００×ｇにて遠心して集め、プラスミドＤＮＡをキアゲンの取り扱い説明書に従ってプラスミドマキシプレップカラム（Qiagen catalog No. 12162）を用いて調製した。

形質転換を逐次行う、すなわち２工程で行う点で異なるが、ストラトジーン(CytoTrap XR Library Construction Kit; Instruction Manual; catalog No. 200444)により記載されたように行った。まず、酵母をｐＳｏｓ−ＦＯＸＣ２プラスミドで形質転換した。ｐＳｏｓ−ＦＯＸＣ２プラスミドを持つＣｄｃ２５Ｈ酵母細胞をコンピテントの作製に用い、ｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡ８０μｌで形質転換した。グルコースプレート（−Ｌｅｕ，−Ｕｒａ）にて２５℃で７２時間増殖後ガラクトース培地に置換し、３７℃で最大１１日間インキュベートした。形質転換を復帰試験のためにストラトジーンの取り扱い説明書に従ってスクリーンした。

約８×１０^５個の酵母形質転換体をスクリーンし、４，０００個のガラクトース依存候補クローンを得た。非許容温度におけるグルコース培地中およびガラクトース培地中での並行増殖試験後、これらのうち２３０個のクローンのみが、ガラクトース培地にて増殖しさらに分析された。グルコースおよびガラクトース培地両方にて増殖したクローンを復帰変異したものとし、それゆえ捨てた。

実施例２：推定陽性相互作用クローンの分析
２．１推定ＦＯＸＣ２相互作用クローンの配列分析
全酵母ＤＮＡをストラトジーン（CytoTrap XR Library Construction Kit; Instruction Manual; catalog No. 200444）に記載のように調製した。最終ペレットをＨ_２Ｏ２０μｌに溶解しＰＣＲ増幅または大腸菌細胞の形質転換のためのテンプレートとした。４０μｌのＴＯＰ１０７’エレクトロコンピテント細胞（electro competent cell）を、２μｌの前記ＤＮＡで形質転換した（2.5 kV, 25 μF and 200Ω）。直ちにＳＯＣ培地１ｍｌを加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。すべての細胞をクロラムフェニコール３０μ／ｍｌを含むＬＢ平板にプレートした。形質転換体をプラスミドＤＮＡの調製に用いた（QIAGEN）。

プレイ（ｐｒｅｙ）挿入体を増幅するために抽出酵母ＤＮＡをテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応は、所望の酵母ＤＮＡ１μｌ、１×ＰＣＲ緩衝液、５ユニットＴａｑＰｏｌ、それぞれ４０ｐｍｏｌのＮＡ１５プライマー（配列番号：１１）およびＮＡ１１４９（配列番号：１２）、および２００μＭｄＮＴＰ’ｓを混合して調製し、最終容量５０μｌとした。ＰＣＲ反応は以下のように行った。：初め９５℃で５分加熱後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で１．５分からなる３５サイクルを実行し、最後に７２℃で７分間加熱した。得た断片を、精製しシークエンスした。

ＰＣＲレベルにて、またはＥＳＴのない希少核酸データベースに対するＢＬＡＳＴ相同性検索によるプラスミドＤＮＡにて配列分析を行った（EMBL およびGenBank）。

２．２７つのＦＯＸＣ２相互作用タンパク質の同定
予期された偽陽性の中からｈＳｏｓ、ＲａｓおよびＲａｓ−ＧＴＰａｓｅ族の他の群をコードするいくつかのクローンを同定し、本分析に関するｒａｓシグナル経路の読み出しを確認した。残りのクローンは、既に特性化した遺伝子（１３９クローン）および未知遺伝子（１６クローン）に相当していた。どちらの場合もライブラリー増幅の結果、いくつかのコロニーが同じクローンとして何度か発見された。未知クローンを、上述の酵母における検認試験に用いてさらに分析した。これらのクローンは、ＦＯＸＣ２との特異的な相互作用能を有するタンパク質を発現しないことが示され、よって無視した。既知の遺伝子に相当するクローンを、以下のタンパク質区分に分類することが可能である：その分類とは、転写制御、マトリックスタンパク質、転写因子、キナーゼ−サブユニットおよび核タンパク質である。全部で４３クローンが推定「ヒット」として同定され、さらに分析を行った。

ＦＯＸＣ２と非特異的に相互作用するヒット体（例えば、Ｓｏｓ標的タンパク質と相互作用するタンパク質）を除くため、４３の同定したクローンに対し偽陽性試験を行った。この試験は、ヒットタンパク質（ｐＭｙｒＨｉｔ）とそれぞれ（ａ）ｐＳｏｓ−ＦＯＸＣ２；（ｂ）ｐＳｏｓ；または（ｃ）対照としてのＭａｆＢ融合Ｓｏｓとでｃｄｃ２５Ｈ酵母を同時形質転換することによって行った（Stratagene; CytoTrap Vector Kit; catalog No. 217438）。プラスミド（ａ）で形質転換した場合に３７℃でのみガラクトースにて増殖する細胞を、真の陽性相互作用を有するクローンと見なした。本手法によって、７つのタンパク質（表１）が推定ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質と同定された。これら７つのタンパク質について、上述の実験を対照としてＣｏｌｌ（Stratagene; CytoTrap Vector Kit; catalog No. 217438）を用いて繰り返し、同様の結果を得た。

酵母におけるＦＯＸＣ２とＦＯＸＣ２相互作用タンパク質との間の相互作用をさらに特徴付けるために、Ｓｏｓ−ＦＯＸＣ２ハイブリッドタンパク質の相互作用をＭａｆＢタンパク質間のそれと比較した。ＭａｆＢタンパク質は、二量体を形成することが知られている（Kataoka, K. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 7581-7591）。ｐ６２１遺伝子はＦＴＰ３、ＧｒｏｕｃｈｏおよびＣｌａｔｈｒｉｎの次にＦＯＸＣ２との強い相互作用を示した。ＰＫＡアンカータンパク質、ＮＯＬＰおよびＨＳＣ７１は弱い相互作用を示した。

表１は、ＳＲＳによって同定された推定ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質の一覧である。相互作用の強さを同様の状態におけるＭａｆＢタンパク質との相互作用（＋＋＋＋）と比較して決定した。

実施例３：ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質の特徴付け
３．１ｐ６２１
ｐ６２１（配列番号：２；部分配列）は、Ｓｐ１転写因子と相互作用する機能未知のタンパク質である（Gunther, M. et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 210: 131-142）。マウスホモログであるＡＴＦａ−結合因子（ｍＡＭ）が最近クローン化され、特性化された（De Grave, F. et al. (2000) 19: 1807-1819）。それは、転写抑制補因子として機能し、ＮＬＳ（核局在化シグナル）およびＡＴＰａｓｅ活性の両方を含む。

本発明のＳＲＳスクリーンにおいて、酵母におけるＦＯＸＣ２とｐ６２１タンパク質との間の相互作用は、得られた１２クローンにより支持され、これらのクローンは３つの異なる重複配列を含んでいた。同定した断片により、核酸５８０−１３２０からなるｐ６２１部位は、ＦＯＸＣ２−ｐ６２１相互作用に十分である。

３．２ＮＯＬＰ
ＮＯＬＰ（「核小体局在タンパク質」を示す）は、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ueki, N. et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Comm. 252: 97-10）からクローンされた核小体タンパク質である。ＮＯＬＰ遺伝子は、大腸菌ヘリカーゼ相同領域、酸−豊富ドメイン、３つの塩基−豊富推定核局在化シグナル、セリン−豊富領域およびコイルドコイルドメインを伴う５２４個のアミノ酸のポリペプチドをコードしている。ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲは、ＮＯＬＰが胎児脳、成体脳および組織にて３．５ｋｂのｍＲＮＡとして発現されることを明らかにした。欠失研究は、ＮＯＬＰが機能的核および核小体局在化シグナルを含むことを明らかにした。本発明のＳＲＳスクリーンにて、単一のＮＯＬＰクローンが同定され、前記ＮＯＬＰはＮＯＬＰ配列のＤ１４５残基（配列番号：３）で始まる配列から構成されていた。

３．３熱ショック同族タンパク質７１（ＨＳＣ７１）
熱ショック同族タンパク質７１タンパク質（ＨＳＣ７１；配列番号：４）は、最近ヒト脳組織から同定された（GenBank Accession No. BC007276）。ＨＳＣ７１タンパク質はｈｓｐ７０ドメインを含み（Pfam-PF00012; Bateman et al. (2002) Nucleic Acids Research 30:276-280）、このｈｓｐ７０スーパーファミリータンパク質の他のメンバーと同様に、タンパク質の折り畳みおよびタンパク質複合体の集合／脱集合に関与すると推測されうる。このことは、ニジマスから分離されたＨＳＣ７１タンパク質より示唆されている（Zafarullah, M. et al. (1992) Eur. J. Biochem. 204: 893-900）。

本発明のＳＲＳスクリーンにて、９つのＨＳＣ７１クローンを得た。それらを、４つの異なる重複クローンに分類することができた（Ｋ_６７からＨＳＣ７１タンパク質のストップコドンまで）。

３．４ＦＴＰ３
ＦＴＰ３（配列番号：５）は、不均一核内リボヌクレオタンパク質−Ｈ’（ｈｎＲＮＰ−Ｈ’）であり、遍在的に発現する。前記ＦＴＰ３は、３つのＲＮＡ結合モチーフを含み、その機能としてプレｍＲＮＡプロセシングおよび輸送を含むことができる。ｈｎＲＮＰｓは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより生産される転写物である不均一核内ＲＮＡと結合することが知られている（Honor B. et al. (1995) J. Biol. Chem.270: 28780-28789）。本発明のＳＲＳスクリーンにて、単一のＦＴＰ３クローンが同定され、ＦＴＰ３のＣ末端部位に相当していた（D₃₄₈−A₄₄₉）。

３．５ＣＬＨ１
ＣＬＨ１（配列番号：６）は、ヒトクラスリン重鎖タンパク質である。クラスリン重鎖は、被覆小窩および小胞の細胞質表面の主な構造タンパク質であり、レセプター誘導エンドサイトーシス、分泌および膜結合物の細胞内輸送に働く。前記ＣＬＨ１は、被覆小窩および小胞の細胞質相に局在し、ほとんどのヒト成人組織に発現し、ヒト１７番染色体に位置する（Dodge, GR. et al. (1991) Genomics 1:174-178）。
本発明のＳＲＳスクリーンにて、１３の同じクローンを同定し、それらはＣＬＨ１配列のＮ_８５３アミノ酸残基とＮ末端にてアライメントした。

３．６ＡＫＡＰ１４９（キナーゼアンカータンパク質１４９）
個々のタンパク質キナーゼ（ＰＫＡｓ）イソ型の効果は、その細胞内局在によって決定され、独特のＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰｓ）と特異的に結合する。ＡＫＡＰ１４９（配列番号：７；Trendelenburg, G. et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 225: 313-319）は、Ｓ−ＡＫＡＰ８４（Linらによる既報の J. Biol. Chem. 270: 27804-27811(1995); GenBank Accession No. U34074）の推定スプライシング異型であり、ＲＮＡ結合モチーフ（ＫＨドメイン）の重要な新規特性を有する。Trendelenburgらは、試験したすべての上皮組織にてＡＫＡＰ１４９が４．２ｋｂの転写産物として発現され、前立腺および小腸にてＲＮＡの強力なシグナルが検出されたことを明らかにしている。さらに、３．２ｋｂの転写産物が睾丸のみに発現していた。Trendelenburgらは、ＡＫＡＰ１４９がｃＡＭＰ依存性シグナル伝達経路およびＲＮＡを特異的な細胞区分に配向することに関与すると推測した。
本発明のＳＲＳスクリーンにて、２つのクローンが同定され、双方ともＡＫＡＰ１４９の全ＣＤＳアミノ酸配列を含んでいた。

３．７ＡＥＳ１−２／Ｇｒｏｕｃｈｏ
ＡＥＳ１−２／Ｇｒｏｕｃｈｏ（配列番号：８）は、ショウジョウバエの「分割Ｇｒｏｕｃｈｏのエンハンサー」タンパク質（Miyasaka, H. et al. (1993) Eur. J. Biochem. 216: 343-352）のＮ末端部位と約５０％の相同性を示すヒトタンパク質である。前記ＡＥＳ１−２／Ｇｒｏｕｃｈｏは、ＷＤ４０反復を含む負の制御タンパク質として働く可能性がある。それは核に局在しており、主に筋肉、心臓および胎盤で発現する。本発明のＳＲＳスクリーンにて、２つのクローンが同定された。

３．８まとめ
要約すると、７つのＦＯＸＣ２相互作用タンパク質を分離した。これらのタンパク質のうち２つ（ｐ６２１およびＡＥＳ１−２／ｇｒｏｕｃｈｏ）は転写に関与し、ＦＯＸＣ２転写活性の抑制に作用することができる。さらに、細胞内およびマトリックス局在化、およびタンパク質の折り畳み活性に関与する３つの細胞質タンパク質（ＡＫＡＰ、クラスリンおよびＨＳＣ７１）が同定された。最後に、２つの核局在化タンパク質が同定され；１つは、ＲＮＡプロセシングに関与し（ＦＴＰ３）、もう１つは、機能未知であった（ＮＯＬＰ）。

実施例４：ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質の発現分布
実施例３に記載のＦＯＸＣ２相互作用タンパク質に関する組織転写発現評価を決定するため、脂肪組織、肝臓および筋肉由来のヒト転写物を含むアフィメトリクス・チップのコンピューター分析を行なった。

ｐｏｌｙＡおよびｍＲＮＡをDynabeads mRNA Direct^TM kit（Dynal A.S., Norway）を用いて健全な患者のヒト組織から抽出した。白色脂肪、肝臓および筋肉組織を生検した。ｍＲＮＡｓをＴ７標識したオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写し、そして二本鎖ｃＤＮＡを調製した。その後、これらのｃＤＮＡを増幅し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびビオチン化ヌクレオチドと共にインビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて標識した。ＩＶＴ後に得たｃＲＮＡの集団を精製し、加熱して断片化し、約３５〜２００塩基サイズのＲＮＡ断片区分を調製した。５つのGeneChip（登録商標）プローブアレイ（アフィメトリクス; カタログ番号：900303、900305、900307、900309および900311）のHuman GenomeＵ９５ＳＥＴを、推奨緩衝液を用いて４５℃にて一晩変性したｃＲＮＡ試料とハイブリダイズした。その後、前記アレイを洗浄し、アフィメトリクスフライディクスステーションを用いてＲ−フィコエリトリン・ストレプタビジンで染色した。カートリッジをHewlett-Packard 共焦点スキャナーを用いてスキャンし、映像をGeneChip 4.1 ソフトウェア（アフィメトリクス）で分析した。プローブ配列に存在する遺伝子の同定を、商業的に利用可能なタンパク質配列データバンクであるＢＬＡＳＴを用いた検索にて行った（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410）。

その結果、ＮＯＬＰおよびクラスリンを除くすべての同定されたＦＯＸＣ２相互作用タンパク質が、脂肪および肝臓組織に存在すること明らかとなった。筋肉では、ＮＯＬＰを除くすべての同定されたＦＯＸＣ２相互作用タンパク質が存在していた。ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質はエネルギー代謝に関与する組織にて発現し、よって糖尿病および肥満症に関する病状に関与すると推定されると結論づけることができる。

実施例５：共免疫沈降法
全細胞抽出物からのタンパク質の共免疫沈降は、所望のタンパク質間の物理的相互作用に関する試験手段として有用である（Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 20: Analysis of protein interactions, 2000, John Wiley & Sons, Inc. 2000）。例えば、ＦＯＸＣ２および同定されたＦＯＸＣ２相互作用タンパク質それぞれは、^３５Ｓメチオニンの存在下にてTNT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate システム (Promega, 2800 Woods Hollow Road, Madison-WI53711, USA) を用いた研究にてＴ７プロモーターの制御下においてインビトロで転写／翻訳され得る。ＦＯＸＣ２−ヒット複合体は、ＦＯＸＣに対する抗体またはタグ融合タンパク質（例えば、Clontech のc-myc モノクローナルまたは AH-ポリクローナル）として発現させたタンパク質に存在するエピトープタグを用いて免疫沈降することができる。複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離することができる。これらのタンパク質がＦＯＸＣ２と相互作用する場合、Ｘ線フィルムまたは蛍光映像スクリーンへのゲルの露光により、ＦＯＸＣ２−ヒット複合体に対する予期されたサイズのバンドの存在を識別することができる。

実施例６：抗−ＦＯＸＣ２抗体の調製
抗体は、タンパク質−タンパク質相互作用の分析にて重要な手段である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 11: Immunology, John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと）。ヒトＦＯＸＣ２タンパク質、または特異的かつ抗原性のＦＯＸＣ２配列の合成断片は、ウサギのような動物への免疫に用いうる。ポリクローナル抗体は、以下の標準的な取り扱い説明書（抗体、A laboratory Manual, Chapter 5: Immunizations, 1988, Harlow & Lane, CHS）に従って使用可能であり、抗原としてペプチドを用いた場合の全血清からアフィニティー精製されうる。抗体は、ＦＯＸＣ２／ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質複合体の共免疫沈降に有用であり、分離した複合体のウエスタンブロット分析に有用である。

【配列表】

Claims

第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドを包む実質的に純粋なタンパク質複合体であって、第一ポリペプチドが配列番号：１のアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチドが配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含むものであるタンパク質複合体。
第二ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質複合体。
第二ポリペプチドが配列番号：３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質複合体。
第二ポリペプチドが配列番号：４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質複合体。
第二ポリペプチドが配列番号：５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質複合体。
第二ポリペプチドが配列番号：６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質複合体。
第二ポリペプチドが配列番号：７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質複合体。
ＦＯＸＣ２発現または活性に関する病状の処置または予防に有効な量の請求項１のタンパク質複合体および製薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
ＦＯＸＣ２発現または活性を変調する方法であり、細胞にてＦＯＸＣ２の発現または活性を変調するために十分な量の配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸と、ＦＯＸＣ２を発現する細胞とを接触させることを包含する方法。
変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状の処置または予防のための方法であり、変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状の処置または予防に有効な量の配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび製薬的に許容可能な担体を、そのような処置または予防を必要とする患者に対して投与することを包含する方法。
病状がＦＯＸＣ２活性の増大によって処置され得る、請求項１０に記載の方法。
病状が肥満症、高トリグリセリド血症、食事誘導インスリン抵抗性または２型糖尿病である、請求項１１に記載の方法。
病状がＦＯＸＣ２活性の減少によって処置され得る、請求項１０に記載の方法。
病状が食欲不振である請求項１３に記載の方法。
ＦＯＸＣ２タンパク質複合体の形成を変調する物質を同定する方法であって、
（ｉ）候補物質の存在下にて配列番号：１のアミノ酸配列を含む第一ポリペプチドと配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含む第二ポリペプチドとを接触させ；
（ｉｉ）候補物質の存在下における第一ポリペプチドと第二ポリペプチド間の複合体の形成を測定し；そして、
（ｉｉｉ）候補物質の存在下における第一ポリペプチドと第二ポリペプチド間の複合体の形成と、候補物質の不存在下における第一ポリペプチドと第二ポリペプチドの複合体の形成とを比較し、
そのことにより候補物質がＦＯＸＣ２タンパク質複合体の形成を変調するかどうかを決定することを含む方法。
ＦＯＸＣ２活性を変調する物質を同定する方法であって、
（ｉ）候補物質の存在下にて配列番号：１のアミノ酸配列を含む第一ポリペプチドと配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含む第二ポリペプチドとを接触させ；
（ｉｉ）候補物質の存在下における第一ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性を測定し；そして、
（ｉｉｉ）候補物質の存在下における第一ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性と候補物質の不存在下における第一ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性を比較し、
そのことにより候補物質がＦＯＸＣ２活性を変調するかどうかを決定することを含む方法。
ＦＯＸＣ２活性を変調する物質を同定する方法であって、
（ｉ）配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含む第一ポリペプチドと候補物質とを接触させ、
（ｉｉ）第一ポリペプチドと結合する候補物質を決定し、
（ｉｉｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む第二ポリペプチドと候補物質を接触させ、
（ｉｖ）候補物質の存在下における第二ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性を測定し；そして、
（ｖ）候補物質の存在下における第二ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性と候補物質の不存在下における第二ポリペプチドのＦＯＸＣ２活性を比較し、
そのことにより候補物質がＦＯＸＣ２活性を変調するかどうかを決定することを含む方法。
変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状の処置または予防のための方法であって、変調されたＦＯＸＣ２活性によって処置可能な病状の処置または予防に有効な量の請求項１５の方法によって同定された物質および製薬的に許容可能な担体を、そのような処置または予防の必要な患者に投与することを包含する方法。
病状がＦＯＸＣ２活性の増大によって処置され得る、請求項１８に記載の方法。
病状が肥満症、高トリグリセリド血症、食事誘導インスリン抵抗性または２型糖尿病である、請求項１９に記載の方法。
病状がＦＯＸＣ２活性の減少によって処置され得る、請求項１８に記載の方法。
病状が食欲不振である請求項２１に記載の方法。
ＦＯＸＣ２相互作用タンパク質を精製するための方法であって、
（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＦＯＸＣ２タンパク質および配列番号：２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含むＦＯＸＣ２相互作用タンパク質を包含するタンパク質複合体と、前記タンパク質複合体に結合する抗体とを接触させ；そして、
（ｉｉ）前記タンパク質複合体からＦＯＸＣ２相互作用タンパク質を精製することを含む方法。