EA009555B1

EA009555B1 - Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью, и фармацевтическая композиция

Info

Publication number: EA009555B1
Application number: EA200501720A
Authority: EA
Inventors: Сергей Иванович Черныш; Герман Петрович БЕККЕР
Original assignee: Сергей Иванович Черныш
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2008-02-28
Also published as: EA200501720A1

Abstract

Изобретение относится к получению новых пептидов, обладающих иммуномоделирующей, антипролиферативной, противоопухолевой и антивирусной активностью, и фармацевтической композиции. Предложены пептиды до 30 аминокислотных остатков, характеризуемые общей структурной формулой: XTrp Gly Gln X, где X, выбран из группы His-Gly-Val-Ser-Gly-, His-Gly-Gly-Gly-, His-Val-Gly-Gly-, His-Gly-Gly-Gly-Gly-, Gln-Gly-Gly-Gly-Gly- и His-Gly-Gly-Gly- или отсутствует, a Xвыбран из группы -His-Gly-Thr-His-Gly, -Gly-Gly-Thr-His-Gly, -Pro-His-Val-Gly-Gly, -Pro-His-Gly-Gly-Gly, -Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly, -Gly-Gly-Gly-Thr-His-Ser или отсутствует.

Description

Предлагаемое изобретение относится к пептидам и белкам противоопухолевого и антивирусного действия, а также к лекарственным средствам на их основе.

Предшествующий уровень техники

Известны противоопухолевые пептиды из группы блеомицина (1). Блеомицины оказывают прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки, однако возможности их применения в клинике ограничены выраженными побочными эффектами, прежде всего со стороны легких и почек.

Известно применение рекомбинантных белков из группы интерферонов в качестве активаторов противоопухолевого иммунитета и ингибиторов пролиферации опухолевых клеток. Интерфероны применяются для лечения множественной миеломы (2), болезни Ходжкина (3), миелоидной лейкемии (4). Однако высокая стоимость интерферонов делает их малодоступными для широкого клинического применения. Другим ограничением служат побочные эффекты, связанные с возможной пирогенностью, иммуногенностью и другими нежелательными свойствами рекомбинантного интерферона.

Известны предложения по использованию пептидных индукторов апоптоза в качестве потенциальных противопухолевых препаратов (5). Однако клинические перспективы этого направления остаются неизученными. В настоящее время на стадии разработки и клинических испытаний в качестве противопухолевых средств находится ряд белковых препаратов цитокиновой природы (6).

Наибольшую известность получило использование интерлейкина-2, однако высокая токсичность и стоимость рекомбинантного интерлейкина-2 ограничивают его применение в широкой онкологической практике.

Известно применение белков гемоцианинов и арилфоринов в качестве активаторов иммунного ответа и противоопухолевых агентов (7).

Несмотря на наличие перечисленных выше и других разработок, описанных в литературе, терапия онкологических заболеваний во многих случаях остается малоэффективной и практически всегда высокотоксичной и дорогостоящей. Поэтому поиски новых подходов к терапии опухолей остаются одной из наиболее острых проблем современной медицины.

Известны иммуномодулирующие пептиды - аллофероны (8). Основной областью применения аллоферонов является лечение вирусных инфекций. В то же время имеются сведения о противоопухолевых свойствах аллоферонов, основанных на активации механизмов противоопухолевого иммунитета - интерферонов и естественных киллеров (9). Аллофероны являются наиболее близкими аналогами предлагаемого изобретения по химической структуре и механизму действия.

Сущность изобретения

Экспериментальные исследования противоопухолевой активности аллоферона показали, что заявляемый пептид подавляет рост сингенного опухолевого трансплантата у мышей и на этом основании может быть отнесен к перспективным противоопухолевым препаратам. Эффект аллоферона реализуется на уровне системного ответа организма на трансплантированную опухоль. В то же время на клеточном уровне влияние аллоферона на пролиферацию опухоли оказывается более сложным. В частности, эксперименты ίη νίΐτο показали, что аллоферон, в зависимости от концентрации в культуральной среде, может как ингибировать (в области высоких концентраций), так и стимулировать (в области низких концетраций) пролиферацию опухолевых клеток. Наличие ростстимулирующей активности ограничивает возможности использования аллоферона для терапии опухолей, где подавление пролиферации малигнизированных клеток является основной целью лечения.

Задачей настоящего изобретения является разработка препаратов, которые, сохраняя иммуномодулирующий механизм действия аллоферона, в то же время обладали бы сниженной ростстимулирующей активностью и повышенной антипролиферативной и цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток.

С этой целью разработано новое семейство пептидов, отличающихся от аллоферонов и других биологически активных соединений структурой, механизмом действия и достигаемым терапевтическим эффектом.

Предлагаемая группа соединений относится к линейным пептидам, строение которых описывается следующей структурной формулой:

Х1 Тгр О1у Οίη Х2 (1), где Х1 отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты, Х2 отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты. При разработке настоящего изобретения в качестве базовой структуры был использован пептид, представленный в табл. 1 под названием аллостатин 1 (8ЕО Ш N0 1).

Аллостатин 1 был синтезирован методом твердофазного синтеза и использован для изучения биологической и терапевтической активности предлагаемых пептидов. Исследования, результаты которых суммированы в приведенных ниже примерах, показали, что данный пептид обладает противоопухолевой активностью, основанной на прямом подавлении пролиферации опухолевых клеток и усилении определенных звеньев противоопухолевого иммунитета.

Компьютерный анализ баз данных по структуре и свойствам белков и пептидов установил, что данное соединение относится к новому неизвестному ранее семейству биологически активных пептидов.

- 1 009555

Оригинальная структура предлагаемых пептидов обеспечивает достижение нового технического уровня возможности эффективного подавления опухолевого роста и лечения на этой основе онкологических заболеваний.

Анализ гомологии аминокислотных сиквенсов аллостатина 1 и известных белков и пептидов, выполненный при помощи программы В1аз1 кеагсй по материалам базы данных 8\νί55ρΐΌΐ. выявил ряд структурных аналогов предлагаемых пептидов. Эти данные суммированы в табл. 1.

Выявленные сиквенсы с высоким уровнем гомологии по отношению к аллостатину 1 принадлежат к однородной с точки зрения структуры. функций и происхождения группе соединений - прионовым белкам (РгР). Прионовые белки (прионы) продуцируются клетками различной тканевой принадлежности многих видов животных. в том числе человека и других млекопитающих. Функции прионов в норме остаются малоизученными. В то же время известно. что при определенных условиях прионы могут претерпевать конформационные изменения. в результате которых возникает патологическая изоформа §сгар1е. ответственная за развитие некоторых нейродегенеративных заболеваний. Зрелый прионовый белок обычно содержит более 200 аминокислотных остатков. Патологические свойства прионов связаны с фрагментами. гомологичными фрагменту 114-134 РгР I быка. в особенности амилоидному гидрофобному участку АОААААОА этого фрагмента (10). Аллостатин 1 гомологичен повторяющимся участкам 64-75. 72-83. 80-91. 87-98. 96-108 и структурно совершенно отличен от участка 114-134 РгР I. Тесное структурное сходство этих участков и предлагаемых пептидов (например. в участке 96-108 РгР I быка совпадают с аллостатином 11 аминокислот из 13 или 84%) предполагает и сходство биологической активности. Поэтому с высокой степенью вероятности можно предположить. что фрагменты прионов млекопитающих. гомологичные предлагаемым противоопухолевым пептидам. также обладают сходной противоопухолевой активностью. Механизм вероятного противоопухолевого действия этих фрагментов неизвестен. однако есть данные. согласно которым прионы имеют отношение к регуляции активности Т-лимфоцитов (11). Т-лимфоциты. в свою очередь. играют ключевую роль в реакциях противоопухолевого иммунитета.

Структурно-функциональное сходство с фрагментами прионов млекопитающих позволяет выделить потенциально вариабельные участки сиквенса предлагаемых пептидов. в которых замена состава и порядка следования аминокислот не окажет существенного влияния на функциональные свойства молекулы в целом. С учетом распределения вариабельных и консервативных участков аминокислотных последовательностей. приведенных в табл. 1. общая структурная формула (1) включает две вариабельные зоны Х₁ и Х₂. разделенные консервативной последовательностью из аминокислот триптофана. глицина и глютамина (Тгр-О1у-О1п). Вариабельный участок Χι может отсутствовать или содержать до 5 и более аминокислот. Вариабельный участок Х2 может отсутствовать или содержать до 7 и более аминокислот. При этом предлагаемые пептиды могут входить в состав более крупных аминокислотных последовательностей в качестве функционально важной части других полипептидов и белков. например прионовых белков с длиной цепи до 250-300 аминокислот.

Соединения предлагаемой структуры. представленные аллостатином 1. синтезированы с использованием твердофазного метода синтеза и охарактеризованы методами производных. В частности. аллостатины могут быть включены в состав более крупных белков полипептидов без изменения их фармакологической активности или с целью придания им новых свойств. Понятно также. что фармацевтически приемлемые производные аллостатина могут быть получены путем химической модификации боковых радикалов или концевых участков аминокислот. входящих в состав аллостатина. Помимо химического синтеза предлагаемые пептиды можно получать методами генной инженерии или извлекать их из природных источников. С целью генно-инженерного получения предлагаемых пептидов могут быть синтезированы нуклеотидные последовательности. кодирующие аминокислотный сиквенс аллостатинов. эти нуклеотидные последовательности могут быть при помощи подходящего вектора внедрены в геном клетки-хозяина. а трансформированные таким образом клетки использованы для синтеза предлагаемых пептидов. Понятно также. что указанные нуклеотидные последовательности и векторы. а также трансформированные ими клетки могут быть введены в организм человека для синтеза предлагаемых пептидов непосредственно в организме.

Другими структурными аналогами предлагаемых пептидов являются аллофероны. общая структурная формула которых дана в патенте РФ № 2172322 (12). Результаты сравнительного анализа структурных формул аллоферонов и предлагаемых пептидов. аллостатинов. приведены в табл. 2 и 3. В табл. 2 сопоставлена структура аллоферона 1 (8ЕО ГО N0 12) и аллостатина 1 (8ЕО ГО N0 1). двух характерных представителей сравниваемых семейств пептидов. Из сравнения видно. что эти пептиды различаются аминокислотами в позициях 6 и 11. представленных у аллоферона 1 гистидином и валином. а у аллостатина 1 триптофаном и треонином соответственно. Позиции 6 и 11 составляют неизменную часть и характерный признак всех аллоферонов согласно патенту Росии №2172322. Замена аминокислот в этих позициях на триптофан и треонин приводит к желаемому изменению биологической активности и терапевтического эффекта. как показано в приведенных ниже примерах.

Сопоставление общих структурных формул (табл. 3) показывает. что состав консервативных участков и расположение вариабельных участков в составе молекулы аллостатинов и аллоферонов качественно различаются. На этом основании они могут быть отнесены к двум разным семействам пептидов. Ис- 2 009555 следования биологических и токсикологических характеристик аллостатина 1 показывают, что пептиды данной группы не являются токсичными для отдельных клеток и целого организма экспериментальных животных. Так, в примере 2 приведены результаты экспериментов с клетками линии Р388, согласно которым концентрация аллостатина 1, в 10 000 раз превышающая минимальную терапевтически эффективную концентрацию, не оказывает на клетки цитотоксического действия. Исследования, результаты которых приведены в примерах 4-6, не выявили признаков токсического действия аллостатина в дозах, которые обеспечивают выраженных терапевтический эффект. Таким образом, аллостатины следует отнести к нетоксичным соединениям (группа А классификации лекарственных средств).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Синтез аллостатина 1.

Пептид, состоящий из 13 аминокислот, соответствующих структуре аллостатина 1, был синтезирован методом твердофазного синтеза на автоматическом многоканальном синтезаторе МиШкуЩесй СшЬН №1йеи с использованием Ршос-(Ы-[9-флуоренил]метоксикарбонил)замещенных аминокислот. Очистка синтезированного пептида производилась методом обратнофазной ВЭЖХ на хроматографе δΐιίιηαζιι ЬС8 с колонкой Сйтошакй С18, 10 мм. Чистоту полученного пептида контролировали также методом ВЭЖХ (фиг. 1). Корректность синтеза подтверждена масс-спектрометрически методом ΜΑΤΌΙ-ΤΟΡ на приборе Ршшдаи Τ8Ο 7000 (фиг. 2). Экспериментально установленная масса пептида соответствует расчетной, различия находятся в пределах ошибки измерения.

Пример 2. Влияние аллостатина на пролиферацию опухолевых клеток ίη νίίτο.

Целью экспериментов, изложенных в настоящем разделе, является сравнительный анализ влияния аллостатина и аллоферона на пролиферацию опухолевых клеток. Сравнивали эффект аллостатина 1 и аллоферона 1 в концентрациях 0.001, 0.01, 0.1, 1 и 10 мкг/мл на пролиферативную активность в массовой культуре опухолевых клеток линии Р388Д1. В лунки 24-луночных планшетов высевали по 5000 клеток, суспендированных в 2 мл среды ΚΡΜΙ 164. В опытах использовали среду, содержащую 5% фетальной сыворотки теленка производства фирмы «Биолот». Препараты вносили в лунки в 0.2 мл той же среды сразу после посева клеток, в контроле вносили эквивалентное количество среды без препаратов. Количество клеток в 1 мл инкубационной среды определяли с помощью камеры Горяева На основе 3-х независимых определений рассчитывали среднее количество клеток в 1 мл инкубационной среды через 21, 44, 90 и 114 ч после начала опыта.

На фиг. 3 представлена характерная картина влияния аллостатина и аллоферона на динамику роста популяции опухолевых клеток. В качестве критерия оценки антипролиферативной активности препаратов здесь выбрана величина кратности роста популяции за 90 ч наблюдения, определяемая как соотношение количества клеток на лунку в начале и конце периода инкубации. За этот период в контроле количество клеток возросло примерно в 30 раз. В присутствии препаратов количество клеток и, соответственно, скорость пролиферации снижались дозозависимым образом. При этом аллостатин в диапазоне концентраций 0.001-1 мкг/мл в 3-7 раз превосходил аллоферон по антипролиферативной активности. Аллостатин в концентрации 10 мкг/мл практически полностью прекратил рост популяции опухолевых клеток в наблюдаемый период.

Таким образом, данный пример демонстрирует наличие у аллостатина антипролиферативной активности и его преимущество в этом отношении по сравнению с аллофероном.

Пример 3. Взаимодействие аллостатина и противоопухолевых цитостатиков ίη νίίτο.

В этом примере приведены материалы, демонстрирующие взаимодействие аллостатина и классического цитостатика, циклофосфамида, в отношении подавления клоногенной активности опухолевых клеток. Показатель клоногенной активности позволяет определить, какая доля опухолевых клеток из общего пула способна давать жизнеспособные клоны и таким образом участвовать в росте и распространении опухоли. Основная цель хемотерапии состоит в уничтожении именно этих активно пролиферирующих клеток.

Методика постановки эксперимента состояла в следующем. Клетки лимфоидной неоплазмы мыши линии Р388Д1 культивировали в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей глутамин, гентамицин и 10% эмбриональной сыворотки теленка «Нщй с1опе». При постановке опыта в ячейки 24-луночных культуральных планшетов вносили по 100 клеток Р388Д1 в 1 мл среды указанного состава. Сразу после этого в лунки вносили по 0,1 мл среды без проверяемых препаратов (контрольные лунки) или с препаратами. Каждый вариант опыта был поставлен в трех независимых повторностях. Количество клонов подсчитывали через 7 дней после начала культивирования.

Как видно из табл. 4, в условиях данного эксперимента около 15% опухолевых клеток образовали жизнеспособные клоны. Ни циклофосфамид, ни аллостатин, взятые в отдельности, не оказали заметного влияния на процесс клонирования. В то же время их сочетание существенно снизило клоногенную активность опухолевых клеток, пропорционально дозе аллостатина.

Настоящий пример показывает, что аллостатин имеет перспективы использования в комбинированной хемотерапии опухолей в сочетании с цитостатиками типа циклофосфамида.

Пример 4. Противоопухолевое действие аллостатина на модели перевивных опухолей у мышей.

Лабораторным мышам линии ΌΒΑ-1 подкожно прививали по 3000 опухолевых клеток сингенной

- 3 009555 линии Р388Д1. На следующий день животные были разделены на 4 экспериментальные группы. В первой группе они получали только аллостатин подкожно в дозе 25 мкг на 4, 11 и 18 сутки после трансплантации опухолевых клеток; во второй группе - комбинацию цитостатиков циклофосфамида (0.56 мг), доксорубицина (0.036 мг) и винкристина (1.05 мкг) в день трансплатации, через 7, 14 и 21 сутки; в третьей группе, аллостатин и комбинацию цитостатиков по той же схеме. В четвертой группе (контроль) животным в те же сроки вводили растворитель (0.9% ЫаС1). В контрольной группе пальпируемые опухоли в месте трансплантации клеток начали появляться через 20 дней, через 25 дней все мыши имели типичные подкожно расположенные опухоли размером от 5 до 26 мм в диаметре (фиг. 4). В группах, получавших отдельно аллостатин или цитостатики, опухоли появлялись с задержкой, у небольшой части животных опухоли не сформировались на протяжении всего срока наблюдения. В то же время сочетание аллостатина и цитостатиков обеспечило резкое и во многих случаях необратимое противоопухолевое действие. В этой группе только у 40% мышей сформировались опухоли в течение периода наблюдения (Р< 0.001 по отношению к контролю и Р< 0.05 по отношению к группе, получавшей только цитостатики).

Данный пример, как и пример 3, свидетельствует, что аллостатин оказывает выраженное противоопухолевое действие при применении в сочетании со средствами стандартной хемотерапии, широко используемыми при лечении лейкозов и других онкологических заболеваний.

Пример 5. Иммуномодулирующая (интерфероногенная) активность аллостатина.

Аллофероны относятся к иммуномодуляторам, механизм действия которых связан с индукцией синтеза интерферонов лейкоцитами крови (9). Одна из целей настоящего изобретения состояла в сохранении иммуномодулирующего действия в спектре биологической активности аллостатинов. Настоящий пример иллюстрирует иммуномодулирующую активность аллостатина 1 на модели индукции синтеза интерферона лейкоцитами человека ίη νίίΓο.

Образцы донорской крови смешивали с водным раствором испытуемого препарата и культуральной средой в отношении 1:1:8. Конечная концентрация препаратов в инкубационной смеси составляла 0 (контроль), 0.01, 0.1, 1 или 10 мкг/мл в различных вариантах опыта. Эту смесь инкубировали в течение 24 ч при 37°С в СО₂ термостате. Затем клетки крови были осаждены центрифугированием. После этого сериальные разведения полученного супернатанта были помещены в лунки 96-луночного планшета, содержащие монослой тест-культуры клеток Ь-41, и проинкубированы 24 ч в тех же условиях. Затем монослой клеток был инфицирован вирусом везикулярного стоматита в дозе, равной 100 ЦПД5₀ (доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя), и проинкубирован 18 ч при 37°С. Затем клетки были окрашены 0.1% раствором красителя кристальный фиолетовый. Доля разрушенного вирусом монослоя была определена путем измерения оптической плотности экстрагированного красителя при длине волны 590 нм. Полученные значения сравнивались с эффектом референс-препарата интерферона-альфа, и полученный титр интерферона расчитывался в единицах (МЕ) антивирусной активности интерферона-альфа. На фиг. 5 суммированы результаты исследования образцов крови 6 доноров, взятые в двух аналитических повторностях (всего 12 определений для каждой точки). Приведенные результаты свидетельствуют о том, что интерфероногенная активность аллостатина и аллоферона существенно не различается. Следовательно, аллостатин, приобретая специфические свойства, полезные для его применения в качестве противоопухолевого препарата, в то же время сохраняет присущую аллоферону иммуномодулирующую активность. На этом основании аллостатин может быть использован в онкологии и других областях, где это может быть полезно, в качестве препарата двойного действия: прямого (цитотоксический и антипролиферативный эффект, потенцирование эффекта цитостатиков) и опосредованного (иммуномодулирующего).

Пример 6. Антивирусная активность аллостатина.

В исследованиях противовирусного действия аллостатина в качестве модели использовали летальную гриппозную инфекцию у беспородных белых мышей обоего пола массой 14-16 г. В работе использовали вирус гриппа А/А1еЫ/2/68 (Η3Ν2), адаптированный к белым мышам. Аллостатин и аллоферон растворяли в дистиллированной воде и вводили животным по 0,25 мл подкожно из расчета 25 мкг на мышь (1,5 мг/кг веса). В качестве плацебо в контрольной группе вводили дистиллированную воду. Для определения противовирусной активности препаратов использовали профилактическую схему введения однократное введение препаратов за 24 ч до заражения. Вирус вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 3 и 30 ΕΌ₅₀. В каждую группу наблюдения брали по 10 мышей. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. Фиксировали смертность животных в контрольных и опытных группах.

Результаты эксперимента представлены в табл. 5. Оба препарата обеспечивали одинаково эффективную защиту от летальной гриппозной инфекции у мышей. Таким образом, аллостатин сохраняет антивирусную активность, характерную для аллоферона. На этом основании можно предполагать, что аллостатин может быть использован в качестве антивирусного средства, как и аллоферон. При этом наиболее целесообразно его применение вместо аллоферона в случае пограничных состояний, объединяющих вирусную и онкологическую патологию, например при опухолях вирусной этиологии или для лечения вирусных заболеваний у онкологических больных.

- 4 009555

Лучший вариант осуществления изобретения

Заявленный противоопухолевый и антивирусный пептид, обладающий иммуномоделурующей активностью, представлен как лучший вариант в примере 1, поскольку он наиболее полно раскрывает терапевтическую эффективность опробованного в лабораторных условиях основы для получения таких препаратов из числа данного класса пептидов, который представляет собой пептид, состоящий из 13 аминокислот, соответствующих структуре аллостатина 1. Пептид был синтезирован методом твердофазного синтеза на автоматическом многоканальном синтезаторе Ми1йбуп1есй СшЬН \УШсп с использованием Ршос-(Х-[9-флуоренил]метоксикарбонил)замещенных аминокислот. Очистка синтезированного пептида производилась методом обратнофазной ВЭЖХ на хроматографе δΐιίιηαζιι ЬС8 с колонкой Сйгошакй С18, 10 мм. Чистоту полученного пептида контролировали также методом ВЭЖХ (фиг. 1). Корректность синтеза подтверждена масс-спектрометрически методом ΜΆΒΌΙ-ΤΘΡ на приборе Ршшдап Т5>0 7000 (фиг. 2). Экспериментально установленная масса пептида соответствует расчетной, различия находятся в пределах ошибки измерения.

Промышленная применимость

Промышленная применимость заявленного изобретения подтверждается результатами лабораторных исследований и расчетов, которые отражены в примерах 1-6 и приведенных ниже табл. 4 и 5. Эти материалы показывают, что применение аллостатина позволяет подавлять пролиферацию опухолевых клеток и их элиминацию системой иммунологического надзора организма, что является основной целью терапии и профилактики онкологических заболеваний. Сходным образом приведенные материалы свидетельствуют о применимости изобретения для терапии вирусных инфекций путем стимуляции механизмов антивирусного иммунитета. Описанный в материалах заявки метод синтеза заявленных пептидов доступен масштабированию в промышленных условиях.

Таблица 1. Гомология сиквенса предлагаемого пептида и прионовых белков млекопитающих

8Е<2 ПЭ ΝΟ

Ηί

οι

Уа

8е

01

Тг

О1

01

ΗΪ

О1

ть

Ηί

О1

1 Аллостатин 1

3

У

1

Г

У

Р

У

η

5

У

г

5

У

8Е<2 Ю ΝΟ

Ηί

οι

О1

Тг

О1

Рг

Ηί

О1

2 РгР 1 Тгаз1 ί 80-91

$

У

Р

У

η

О

8

У

8Е<2 ПЭ ΝΟ

Ηί

οι

О1

Тг

О1

тн

Ηί

О1

3 РгР1 Тгаа( ΐ96-108

$

У

Р

У

η

У

г

5

У

- 5 009555

8ЕО ГО N0 4 РгР2 Тга$1 £64-75

Ηί 8

οι У

О1 У

Тг Р

01 У

01 п

Рг 0

Ηί 5

Уа 1

О1 У

σι У

8ЕО ГО ΝΟ 5 РгР2 Тгазг £72-83

Ηί 5

Уа 1

οι У

О1 У

Тг Р

О1 У

О1 п

Рг 0

Ηί 8

οι У

О1 У

8ЕС} ГО N0 6 РгР2 Тгав1 £88-100

Ηί $

ΟΙ У

οι У

01 У

О1 У

Тг Р

01 У

61 п

01 У

О1 У

ть г

Ηί 8

О1 У

8Е<? ГО ΝΟ Ρτίο Βονίη £96-108

Ηί 8

οι У

О1 У

Тг Р

01 У

ΟΙ п

01 У

О1 У

ТЬ г

Ηί 8

О1 У

8Е0 ГО ΝΟ 8 Рпо όονίη £64-75

Ηί 8

οι У

О1 У

Тг Р

О1 У

О1 п

Рг 0

Ηΐ 5

01 У

О1 У

8Εζ> ГО N0 9 РгР Нитап £52-66

61 η

οι У

01 У

О1 У

Тг Р

О1 У

61 п

Рг 0

Ηί 8

О1 У

01 У

Тг Р

О1 У

8Е0ГО N010 РгР Нитап £69-83

Ηί 5

οι У

Тг Р

01 У

61 п

Рг 0

Ηί 8

О1 У

Тг Р

ΟΙ У

8Е0ГО ΝΟ11 РгР Нитап £85-97

Ηί 8

οι У

01 У

Тг Р

01 У

61 п

οι У

О1 У

01 У

ть г

Ηί 8

8е г

Консенсуссиквенс

Тг Р

О1 У

61 п

Таблица 2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей аллоферона 1 и аллостатина 1

Позиции

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

к

12

13

8Е<Э ГО ΝΟ 1

Ηί

<31

Уа

8ег

О!

Тг

О1

Ηί

οι

ть

Ηί

οι

Аллостатин 1

3

У

1

У

Е

У

п

3

У

г

8

У

8Е<2 ГО ΝΟ 2

Ηί

<31

Уа

8ег

О1

ш

О1

Ηί

01

Уа

Ηί

οι

Аллоферон 1

8

У

1

У

5

У

п

8

У

1

8

У

Таблица 3. Сравнительный анализ общих структурных формул аллоферонов и аллостатинов

- 6 009555

Таблица 4. Комбинированное действие циклофосфамида и аллостатина на способность опухолевых клеток линии Р388Д1 к образованию дочерних клонов

Препарат	Концентрация	Кол-во клонов в отдельных лунках	Среднее кол-во клонов
1	2	3
Контроль	-	16	16	12	14,7 ± 1,3
Циклофосфамид	1,5 мкг/мл	12	19	14	15,0 ±2,1
Аллостатин	0,1 мкг/мл	21	20	14	18,3 ±2,2
1 мкг/мл	14	19	19	17,3 ± 1,7
10 мкг/мл	16	15	21	17,3 ± 1,9
Циклофосфамид + Аллостатин	1550 нг/мл + 0,1 мкг/мл	8	8	9	8,7 ± 0,3
1550 нг/мл + 1 мкг/мл	6	6	10	7,3 ± 1,3
1550 нг/мл + 10 мкг/мл	3	4	4 1	3,7 ± 0,3

Таблица 5. Противовирусная активность препаратов аллостатин и аллоферон в отношении вируса гриппа А/АюЫ/2/68 (Η3Ν2) на модели летальной гриппозной инфекции у белых мышей

Препарат	Доза вируса, Ь°50	Смертность животных (пало/заражено, шт.).	Процент гибели, %	Смертность по сумме двух доз вируса, %
Контроль	30	10/10	100	90
3	8/10	80
Аллоферон	30	6/10	60	50**
3	4/10	40
Аллостатин	30	7/10	70	50**
3	3/10	30

** Вероятность отличия от контроля Р< 0,01

Перечень последовательностей <110> Черныш Сергей Иванович; СЬегпузЬ 8ег&еу КэпоуюЬ <120> Противоопухолевые и антивирусные пептиды <160> 12 <210> 1 <211> 13 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аллостатин 1 <400 1

ΗΪ5 О1у Уа1 Зег О1у Тгр О1у 01η Ηίβ <31у ТЬг Ηίδ О1у

5 10 <210>2 <211> 264 <212> РКТ <213> Тга§е1арЬи5 51герысегоз <220 <223> Гга^теШ АА 80-91 оГТга81рпопрго1еш 1 ргесигзог (РгР1 Тгаз1) <308> δννΪ85ρΓ0ΐ Р40242 <309> 1995-02-31 <400> 2

Ηίδ 01у 01у 01у Тгр 01у 01п Рго Ηίδ О1у 01у 01у

5 10 <210> 3 <211> 264 <212> РКТ <213> Тга§е1арЬив в1герв1сегоз <220>

<223> Гга§теп( АА 96-108 оГТгаз! ρήοη ρτοΐείη 1 ргесигвог (РгР1 ТгаМ) <308> 8\νΐδδρΓ0( Р40242 <309> 1995-02-31

- 7 009555 <400> 3

О1у О1у О1у О1у Тгр О1у 61п О1у О1у ТЬг ΗΪ5 О1у

5 10 <210>4 <211> 256 <212> РКТ <213> Тга§е1арЬи8 51герз1сего8 <220>

<223> Ггадтегб АА 64-75 οί Тгаз1 рпоп ρτοίεΐη 2 ргесигзог (РгР2 ТгазЦ <308> δννΐκϊρΓΟί Р40243 <309> 1995-02-31 <400> 4

О1у О1у О1у Тгр О1у 61п Рго ΗΪ8 Уа101у О1у <210> 5 <211> 256 <212>РКТ <213> Тга£е1арЬиз 81гер81сегоз <220>

<223> ГгадтегН АА 72-83 оГТгаз! рпоп ρτοίεΐη 2 ргесигзог (РгР2 Тгаз1) <308> 8ννί88ρΓθΙ Р40243 <309> 1995-02-31 <400> 5

Уа1 С1у С1у Тгр С1у О1п Рго ΗΪ5 О1у 61у О1у <210>6 <211> 256 <212> РКТ <213> Тга§е1ар1ш8 зХгерзтсегоз <220>

<223> ГгадтепС АА 88-100 оГТгазС рпоп ρτοίεΐη 2 ргесигаог (РгР2 Тгаз1) <ЗО8> 8ννΪ88ρΓθΐ Р40243 <309> 1995-02-31 <400>6

- 8 009555

О1у О1у С1у С1у Тгр С1у С1п О1у О1у ТЬг ΗΪ8 О1у <210> 7 <211> 264 <212>РКТ <213> Воз (аигиз <220>

<223> Сгадтеп! АА 96 - 108 οί Βονΐηβ рпоп ргоТет I ргесигзог (Рпо Βονίη) <308> 81лчззрго1 Р10279 <309> 1989-03-10 <400> 7

С1у О1у С1у О1у Тгр С1у С1п С1у С1у ТЪг Ηίβ С1у <210>8 <211> 264 <212>РКТ <213> Воз 1аип18 <220>

<223> ГгадшепГ АА 64-75 οίΒονίηβ рпоп рго1е!п 1 ргесигзог (Ρτίο Βονϊη) <308> 8ч>'155рго1 Р10279 <309> 1989-03-10 <400>8

О1у С1у С1у Тгр С1у С1п Рго Ηίβ О1у О1у О1у <210>9 <211> 253 <212>РКТ <213> Ното зар1епз <220>

<223> Ггадтеп! АА 52-66 οί Нитап рпоп рго(ет ргесигзог (РгР Нитап) <308> ЗчоззргоГ Р04156 <309> 1986-11-03 <400> 9

О1п О1у О1у О1у О1у Тгр О1у О1п Рго ΗΪ5 С1у С1у О1у Тгр С1у

- 9 009555 <210 10 <211> 253 <212>РКТ <213> Ното 8ар1еп8 <220>

<223> Гга^теп! АА 69-83 оГЬитап рпоп ρτοίείη ргесигзог (РгР Нитап) <308> ЗМззрго! Р04156 <309> 1986-11-03 <400 10

Ηίβ О1у О1у О1у Тгр 01у 01η Рго Н18 О1у О1у 01у Тгр 01у <210> 11 <211> 253 <212> РКТ <213> Ното зарюпз <220>

<223> Гга§теп1 АА 85-97 оГ китап рпоп ρτοίείη ргесигзог (РгР Нитап) <308> З'Мззрго! Р04156 <309> 1986-11-03 <400> 11

ΗΪ3 О1у О1у О1у Тгр О1у О1п О1у О1у О1у 1Ъг Ηίβ 8ег <210 12 <211> 13 <212>РКТ <213> СаШрЬога У1с1па <220>

<223> Аллоферон 1 <310> 1Ш 2172322 С1 <311> 1999-12-27 <312> 2001-08-20 <400> 12

Ηίβ О1у Уа1 Зег О1у ΗΪ3 О1у 01η Ηίβ О1у Уа] Ηίβ О1у

5 10

Список используемой литературы

1. Н.И. Переводчикова. Клиническая химиотерапия опухолевых заболеваний. М.: Медицина, 1976,

с. 100-103.

2. Ζββ е! а1., 1. СНп. Опсо1., 1998, 16, 8, р. 2834-2839.

3. Аубез е! а1. Ьеик. Ьутркота, 1998, 30,5-6, р. 651-656.

4. ОПЬей, Сапсег, 1998, 83,6, р.1205-13.

5. Ки!1ебде, СЫп апб ЗскераПх Сиггеп! Оршюп ίη Скетка1 В1о1о§у, 2002, 6, р. 479-485.

6. 8К Nа^и1а, К СоГГтап. ебз. Νον су!октез аз ро!еп!1а1 бгидз, Виккаизег Уег1ад, Вазе1, 2000, 141 рр.

7. Патент США №5231081.

8. Патент России №2172322.

9. Скегпузк е! а1., Ргосеебтдз оГ №10опа1 Асабету оГ 8с1епсе, 2002, 99, р. 12628-12632.

10. Коипе, 1.1. Скет. Вю1. 1п!егас!., 2001, 138, 1-26; Тау1ог, 8.С., Огееп, Κ.Ν., §тйк, Ι.Ρ. & Реегз, С. Ат. 1. РЬу8ю1. Се11 Ркузю1., 2001, 281, 1850-1857.

11. МаЬЬо!!, Ν.Α., Вго^п, К.Ь., Мапзоп, 1. & Вгисе, М.Е. 1ттипо1о§у, 1997, 92, р. 161-165.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

12. Патент РФ №2172322.

1. Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью, содержащий до 30 аминокислотных остатков, характеризуемый общей структурной формулой

Х1 Тгр О1у О1п Х2 , или его фармацевтически приемлемые соли, или эфиры, или амиды, где

Х₁ выбран из группы Н1з-О1у-Уа1-8ег-О1у-, Н18-О1у-О1у-О1у-, Н18-Уа1-О1у-О1у-, Н18-О1у-О1у-О1у-О1у-, О1п-О1у-О1у-О1у-О1у- и Н18-О1у-О1у-О1у- или отсутствует, а Х₂ выбран из группы -Н18-О1у-Тйг-Н18-О1у, -О1у-О1у-ТЬг-Н18-О1у, -Рго-Н18-Уа1-О1у-О1у, -Рго-Н18-О1у-О1у-О1у, -Рго-Н18-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у, -О1уО1у-О1у-1Ъг-Н1з-8ег или отсутствует.
2. Пептид по п.1, содержащий до 20, предпочтительно 5-15 аминокислотных остатков.
3. Пептид по п.1, выбранный из группы, содержащей Н18-О1у-Уа1-§ег-О1у-Тгр-О1у-О1п-Н18-О1у-ТЪгН1₈-О1у, Н1₈-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у-О1п-Рго-Н18-О1у-О1у-О1у, Н1₈-О1у-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у-О1п-О1у-О1уТЬг-Н18-О1у, Н18-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у-О1п-Рго-Н18-Уа1-О1у-О1у, Н18-Уа1-О1у-О1у-Тгр-О1у-О1п-Рго-Н18-О1уО1у-О1у, О1п-О1у-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у-О1п-Рго-Н1₈-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у, Н1₈-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у-О1пРго-Н1₈-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у, Н1₈-О1у-О1у-О1у-Тгр-О1у-О1п-О1у-О1у-О1у-Тйг-Н1₈-8ег.
4. Пептид по п.1, обладающий антипролиферативной активностью.
5. Пептид по п.1, обладающий противоопухолевой активностью.
6. Пептид по п.1, обладающий антивирусной активностью.
7. Фармацевтическая композиция, обладающая иммуномодулирующей активностью, содержащая пептиды по любому из пп.1-6, его фармацевтически приемлемые соли, или эфиры, или амиды, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.