KR20120044279A - 무-프리온 나노입자 조성물 및 방법 - Google Patents

무-프리온 나노입자 조성물 및 방법 Download PDF

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네일 피. 데자이
빅토르 페이코브
패트릭 순-쉬옹
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아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨
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Abstract

알부민 및 실질적으로 수불용성인 약물을 포함하는 나노입자를 포함하는 무-프리온 조성물이 개시된다. 무-프리온 조성물의 제조 방법, 및 나노입자 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법 또한 제공된다. 조성물의 사용 방법은 물론, 상기 방법을 수행하는 데에 유용한 키트 역시 제공된다.

Description

무-프리온 나노입자 조성물 및 방법{PRION-FREE NANOPARTICLE COMPOSITIONS AND METHODS}
[관련 출원]
본 출원은 그 각각의 내용이 전체적으로 본원에 개재되는 2009년 4월 15일자 U.S. 특허 가출원 제61/169,665호, 및 2009년 8월 28일자 U.S. 특허 가출원 제61/238,052호에 대하여 우선권의 특혜를 주장하는 바이다.
[기술 분야]
본 발명은 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약물을 포함하는 나노입자를 포함하는 무-프리온 조성물, 그의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
전염성 해면상 뇌병증 (TSE)으로도 알려져 있는 프리온 질병은 치명적인 전염성의 신경변성 질병 군이다. TSE의 구체적인 예에는 양 및 염소에 영향을 주는 스크래피, 소 해면상 뇌병증 (BSE), 전염성 밍크 뇌병증, 고양이 해면상 뇌병증 및 만성 소모성 질병 (CWD)가 포함된다. 인간에서, TSE 질병은 쿠루, 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군 (GSS), 치명성 불면증 및 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD)으로 나타날 수 있다. vCJD는 영국에서의 BSE 유행의 결과로써 인간에서 출현하였는데, BSE 또는 "광우병"에 감염된 소에서 유래하는 식품의 소비에 의해 야기되는 것일 가능성이 크다 (문헌 [Will et al. (1996) Lancet 347:921-925]). 경구로 감염된 질병의 잠복기가 인간에서 20년을 초과할 수 있기 때문에, vCJD의 진정한 발생률은 오랜 시간 동안 밝혀지지 않을 수 있다.
소 유래의 감염된 생성물의 섭취 이외에도, 혈액 수혈 및 장기 이식이 인간들 간 vCJD 전염의 또 다른 측면을 나타낸다 (문헌 [Brown et al. (1998) Transfusion 38:810-816]; [Diringer et al. (1984) Archives of Virology 82:105-109]; [Manuelidis et al. (1978) Nature 271:778-779]). TSE-감염 개체로부터의 혈액 수혈 또는 기타 혈액 생성물을 통하여 vCJD가 전염될 수 있다는 커다란 우려가 1990년대 중반 이후 고조되고 있다. 그러한 개체들은 vCJD의 오랜 전임상기 및 잠복기 동안 무증상일 수 있으며, 그와 같은 공여자로부터 수득되는 혈액은 공여자 유래의 혈액 또는 혈액 생성물을 수용하는 사람에게 질병을 전염시킬 수 있다.
지금까지 영국에서 인간의 혈액 수혈 획득 vCJD의 사례가 4회 이상 보고된 바 있다. 22명 공여자로부터 전혈을 수용한 64명의 사람들 중, 4명의 사람이 vCJD의 발병으로 진행하였다. 첫 번째 발생에서, 수용자는 무증상으로 유지되는 공여자로부터 적혈구를 수용하고 7년 후에 병에 걸렸으며, 공여 3년 후까지만 vCJD의 징후를 나타내었다 (문헌 [Llewely et al. (2004) Lancet 363:417-421]). 두 번째 발생에서는, 공여자가 공여 2년 후에 vCJD로 사망하였으며, 수용자는 공여 5년 후에 (vCJD가 아닌) 동맥류로 사망하였다 (문헌 [Peden et al. (2004) Lancet 364:527-529]). 수용자의 부검시, 림프절 및 비장에는 PrPsc가 존재하였으나, 뇌에는 존재하지 않았다. 세 번째 발생에서는, 공여 20개월 후에 vCJD가 발병된 공여자로부터의 수혈 7년 반 후에 수용자가 vCJD로 사망하였다 (문헌 [Wroe et al. (2006) Lancet 368:2061-2067]). 네 번째 발생은 세 번째 사례와 동일한 공여자로부터의 수혈 8년 반 후에 수용자에서 발생하였다 (문헌 [Health Protection Agency-Health Protection Report, (2007) Vol 1, No 3, 26]. 하기에서 입수가능: http://www.hpa.org.uk/hpr/archives/2007/news2007/news0307.htm).
모든 프리온 질병의 공통적인 특징은 정상적인 세포 프리온 단백질 (PrPc)의 비정상 동형(isoform) (PrPsc)으로의 전환이다. PrPc와 PrPsc 사이의 차이는 PrPc는 주로 알파-나선형 구조를 가지고 PrPsc는 주로 종종 결집하여 응집체를 형성하는 베타 시트를 가진다는, 순수하게 형태적인 것으로 여겨지고 있다. PrPsc는 정상적인 단백질 분자를 동일한 비정상 동형 (이후 이것은 다시 더 많은 PrPc를 PrPsc로 전환시킴)으로 전환되도록 유도하는 주형으로 작용한다 (문헌 [Prusiner et al. (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:13363-13383]). 이와 같은 자가촉매촉진 과정은 신경독성인 PrPsc 응집체의 기하급수적인 형성으로 이어진다 (문헌 [Aguzzi et al. (2007) Nat Rev Mol . Cell Biol . 8:552-561]). 프리온 단백질 리간드 및 그의 용도에 대해서는 WO04/050851호, WO06/010915호, WO04/090102호, 및 WO06/044459호에 기술되어 있다.
질병 잠복기의 초기 단계 동안 혈액 중 프리온 감염성의 조기 발현이 이루어질 수도 있다는 것이 연구로 밝혀졌다 (문헌 [Brown et al. (2006) Blood infectivity in the transmissible spongiform encephalopathies . Chapter 4 In: Turner ML, ed. 95-118]). 질병 증상의 발병까지가 오랜 시간일 수 있기 때문에, 무증상 감염 개체는 여전히 건강하고 활력있는 혈액 공여자로 간주될 수 있다. 또한, 일부 개체는 질병의 발병 없이 영구적으로 또는 일시적으로 감염될 수도 있다. 따라서, 불가능한 것은 아니지만, 혈액 유래 생성물을 위한 혈액 공급원에 프리온이 없다고 보장하는 것은 어렵다.
알부민-기재의 나노입자 조성물은 실질적으로 수불용성인 약물을 전달하기 위한 약물 전달 시스템으로 개발되었다. 예를 들면, U.S. 특허 제5,916,596호; 6,506,405호; 6,749,868호, 및 6,537,579호, 및 또한 U.S. 특허 공개 제2005/0004002호 및 2007/0082838호를 참조하라. 상기 알부민-기재 나노입자 기술은 실질적으로 수불용성인 약물을 질병 부위로 수송 및 전달하는 단백질 알부민의 독특한 자연적 특성을 이용한다. 이러한 나노입자는 신체 자체의 수송 과정에 용이하게 도입되며, 알부민에 대한 종양의 인력을 이용하여 표적 부위에 대한 활성 약물의 더 고농도로의 전달을 가능케 할 수 있다. 또한, 알부민-기재 나노입자 기술은 투여 과정에서 용매와 같은 독성 화학물질에 대한 필요성을 방지함으로써, 용매-관련 부작용의 제거를 통하여 잠재적으로 안전성을 향상시키는 것에 의해, 약물의 용해도를 향상시키는 능력을 제공한다.
본원에서 언급되는 모든 문헌, 특허, 특허 출원 및 공개 특허 출원의 개시내용은 그 전체가 본원에 의거 참조로 개재된다.
[발명의 개요]
일 측면에서, 본 발명은 무-프리온 나노입자 조성물 (예컨대 제약 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물은 무균성이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 무균 여과성이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 약 100 fg/ml 미만의 프리온 단백질을 가진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 10 IU-ic/ml 미만의 프리온 감염성을 가진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 1 LD50/ml 미만의 프리온 감염성을 가진다.
일부 실시양태에서, 조성물은 단백질 오형성 주기적 증폭(protein misfolding cyclic amplification) (PMCA) 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 IPCR 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 10 IU-ic/ml 미만의 프리온 감염성을 가지며, PMCA 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 10 IU-ic/ml 미만의 프리온 감염성을 가지며, IPRC 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다.
본원에서 기술되는 조성물에는 일반적으로 PrPsc가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물에는 PrPc 역시 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 PrPsc와 PrPc의 몰비는 약 1:1 이하, 예컨대 대략 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 또는 1:100000 중 어느 것 이하이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 조성물은 프리온-제거 과정 동안 도입되는 일정량 (예컨대 미량)의 물질들을 함유한다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 프리온 단백질에 결합할 수 있는 일정량 (예컨대 미량)의 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 일정량 (예컨대 미량)의 지지 재료 (예컨대 수지를 포함한, 본원에서 기술되는 지지 재료)를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 일정량의 PRDT 수지 (예컨대 미량의 PRDT 수지)를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 일정량의 DVR 수지 (예컨대 미량의 DVR 수지)를 포함한다.
일부 실시양태에서는, 조성물 중 알부민 안정화제의 농도가 알부민이 프리온-제거 과정에 의해 정화되지 않은 조성물의 그것 미만이다. 이러한 알부민 안정화제에는 예를 들면 N-아세틸 트립토파네이트 및 나트륨 카프릴레이트가 포함된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 알부민이 프리온-제거 과정에 의해 정화되지 않은 조성물과 생물학적으로 등가이다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 조성물 중 알부민은 프리온-제거 과정을 포함하는 방법에 의해 수득되고, 상기 프리온 제거 과정은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프리온 제거 과정은 상기 알부민 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 조성물 중 알부민은 하기를 포함하는 방법에 의해 수득된다: a) 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시킴으로써, 리간드와 프리온 단백질 사이의 복합체의 형성을 야기하는 것, 및 b) 최초 조성물로부터 복합체를 제거하는 것.
일부 실시양태에서, 상기 최초 알부민 조성물은 혈액 유래 생성물이다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 체액 (예컨대 혈액)으로부터 제조된 알부민 조성물이다. 일부 실시양태에서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민이다.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 펩티드 (예컨대 표 1에 제공되어 있는 임의의 펩티드)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 프리온 단백질을 인식하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 화합물 (예컨대 트리아진-기재 화합물)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노 기, 예컨대 아미노 수지상의 아미노 기를 포함한다.
상기 리간드는 예컨대 칼럼, 비드, 매트릭스, 필터 및 멤브레인을 포함한 지지 재료에 결합될 수 있다.
또 다른 측면에서는, 무-프리온 나노입자 조성물의 제조 방법이 제공된다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 함유하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 포함하고, 상기 알부민은 최초 알부민 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 함유하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 포함하고, 상기 알부민은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 함유하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 포함하고, 상기 알부민은 하기를 포함하는 방법에 의해 수득된다: a) 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, 및 b) 최초 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다: a) 최초 알부민 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것; b) 프리온-제거 알부민을 포함하는 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다: a) 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시킴으로써, 리간드와 프리온 단백질 사이의 복합체의 형성을 야기하는 것; b) 알부민 최초 조성물로부터 복합체를 제거하는 것; 및 c) 프리온-제거 알부민을 포함하는 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되는 바, 하기를 포함한다: a) 알부민 용액을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것; b) 알부민 용액으로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것; 및 c) 상기 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것. 일부 실시양태에서, 상기 혼합물은 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는다.
프리온은 나노입자의 형성 동안에 제거될 수 있다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: b) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 c) 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는다.
프리온 단백질은 나노입자 조성물의 형성 후에 제거될 수도 있다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 혼합물은 리간드와 접촉되기 전에 고전단 조건에 적용되는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것, 및 b) 상기 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: c) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 혼합물에는 계면활성제가 실질적으로 없다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는, 프리온 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 조성물로부터의 프리온 단백질을 제거하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 상기 나노입자 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, b) 나노입자 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 비정상 프리온 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 알부민 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 제거 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 알부민을 포함하는 상기 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, b) 상기 알부민 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것 (상기 알부민 조성물은 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물을 제조하는 데에 사용됨).
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 조성물 중 프리온 단백질의 존재 또는 부재를 측정하는 것, b) 상기 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, 및 c) 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것.
또한 제공되는 것은 프리온 제거 과정 동안 제조되는 조성물이다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하며, 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 추가로 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자, 및 프리온 단백질에 결합할 수 있으며 본원에서 기술되는 1종 이상의 지지 재료와 같은 지지 재료에 결합된 리간드를 포함하는 혼합물이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 적재된 칼럼이 제공되며, 상기 칼럼은 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다.
또한 제공되는 것은 본원에서 기술되는 방법에 의해 제조되는 조성물이다. 또한 제공되는 것은 본원에서 기술되는 무-프리온 조성물의 사용 방법이다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 투여 방법이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질병 (예컨대 암)의 치료 방법이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 투여 방법이 제공되며, 조성물 중 상기 알부민은 프리온-제거 과정을 포함하는 방법에 의해 수득되고, 상기 프리온-제거 과정은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프리온 제거 과정은 상기 알부민 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질병 (예컨대 암)의 치료 방법이 제공되며, 조성물 중 상기 알부민은 프리온-제거 과정을 포함하는 방법에 의해 수득되고, 상기 프리온-제거 과정은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다.
또한 제공되는 것은 본원에서 기술되는 무-프리온 나노입자 조성물, 및 본원에서 기술되는 방법에 유용한 키트를 포함하는 키트 및 투약 형태 (예컨대 바이알, 예를 들면 밀봉 바이알)이다. 추가로 제공되는 것은 본원에서 기술되는 1종 이상의 방법을 수행하기 위한 시스템 (장치 포함)이다.
본 발명의 이상 및 기타 측면 및 장점들은 이하의 상세한 설명 및 첨부된 청구항에서 분명해질 것이다. 본원에서 기술되는 다양한 실시양태의 특성들 중 1종, 수종, 또는 모두가 합쳐져 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
도 1은 20 % 또는 25 % 알부민 중 0.01 % 및 0.005 % 스크래피 햄스터 뇌 균질물을 사용하여 시도된 DVR 수지의 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE 겔을 제공한다. AMN31은 양성 대조 수지였다. 관찰된 신호는 결합된 분획이었다. "-PK" 및 "+PK"는 프로테이나제 K 분해의 부재 또는 존재를 나타낸다.
도 2는 20 % 또는 25 % 알부민 중 0.01 % 및 0.005 % 스크래피 햄스터 뇌 균질물을 사용하여 시도된 YVHEA 및 SYA 수지의 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE 겔을 제공한다. AMN31은 양성 대조 수지였다. 관찰된 신호는 결합된 분획이었다. "-PK" 및 "+PK"는 프로테이나제 K 분해의 부재 또는 존재를 나타낸다.
도 3은 20 % 또는 25 % 알부민 중 0.01 % 및 0.005 % 스크래피 햄스터 뇌 균질물을 사용하여 시도된 D4 수지의 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE 겔을 제공한다. AMN31은 양성 대조 수지였다. 관찰된 신호는 결합된 분획이었다. "-PK" 및 "+PK"는 프로테이나제 K 분해의 부재 또는 존재를 나타낸다.
도 4는 20 % 알부민에 있어서의 프리온 감소 수지 칼럼 (PRDT (파토젠 리무벌 앤드 디아그노스틱 테크놀로지스 사) 칼럼)에 의한 TSE 제거를 위한 공정 흐름 개략도를 도시한다.
도 5는 20 % 알부민에 있어서의 PRDT 칼럼에 의한 TSE 제거 연구에서의, 첨가 전개로부터의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 6은 원심분리에 의한 20 % 알부민 용액의 웨스턴 블롯 방해 시험을 나타낸다 (10-배 농축이 있거나 없음).
도 7은 25 % 알부민에 있어서의 프리온 감소 수지 칼럼 (PRDT 칼럼)에 의한 TSE 제거를 위한 공정 흐름 개략도를 도시한다.
도 8은 25 % 알부민에 있어서의 PRDT 칼럼에 의한 TSE 제거 연구에서의, 첨가 전개로부터의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 9는 원심분리에 의한 25 % 알부민 용액의 웨스턴 블롯 방해 시험을 나타낸다 (10-배 농축이 있거나 없음).
본 발명은 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 무-프리온 조성물 (예컨대 제약 조성물), 및 무-프리온 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물 (예컨대 제약 조성물)을 제공하며, 여기서 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다.
또 다른 측면에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 무-프리온 조성물 (예컨대 제약 조성물)의 제조 방법이 제공된다. 제조 방법 과정 동안 제조되는 조성물 역시 제공된다.
또 다른 측면에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 무-프리온 조성물 (예컨대 제약 조성물)의 사용 방법이 제공된다.
역시 제공되는 것은 본원에서 기술되는 무-프리온 나노입자 조성물, 및 본원에서 기술되는 방법에 유용한 키트 및 시스템 (장치 포함)을 포함하는 키트 및 투약 형태 (예컨대 바이알, 예를 들면 밀봉 바이알)이다.
"무-프리온"은 본원에서 본 발명의 조성물을 기술하기 위하여 편리하게 일반적으로 사용되며, 본원에서 기술되는 모든 실시양태를 포괄하여 의미한다.
본원에서, 값 또는 파라미터의 "약"에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체와 관련된 실시양태를 포함 (및 기술)한다. 예를 들면, "약 X"를 언급하는 기술은 "X"의 기술을 포함한다.
본원에서 기술되는 본 발명의 측면 및 실시양태에는 측면 및 실시양태들을 "구성하는 것" 및/또는 "필수적으로 그것으로 구성되는 것"이 포함되는 것으로 양해된다.
무- 프리온 나노입자 조성물
본 발명은 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물 (예컨대 제약 조성물)을 제공하며, 여기서 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 무균성이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 무균 여과성이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서는, 프리온 단백질이 약 100 fg/ml 또는 더 고도의 검출 감도를 가지는 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없는데, 다시 말하자면, 약 100 fg/ml 또는 더 고도의 검출 감도 (예를 들면 약 50 fg/ml, 약 10 fg/ml, 약 1 fg/ml, 약 0.1 fg/ml의 검출 감도)를 가지는 방법을 사용하는 분석에서, 시험 결과는 음성이다. 조성물 중 프리온 함량은 조성물로부터 직접 측정될 수 있다. 다르게는, 측정 전에 조성물이 처리될 수 있는데, 예를 들면 조성물 중 프리온 단백질의 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여 농축 또는 강화될 수 있다.
조성물에 프리온 단백질이 실질적으로 없는지 여부를 측정하는 한가지 방식은 생체내 감염성 분석이다. 예를 들면, 마우스, 밍크, 햄스터, 또는 염소 모델에서의 시험 조성물의 접종에 의해 생체내 감염성이 증명될 수 있다. 감염성은 치사 투여량 (LD50), 즉 주어진 경로 (예컨대 뇌내 경로)에 의해 투여되었을 때 노출된 동물의 50 %에서 질병을 유발하는 투여량으로 측정될 수 있다. 다르게는, 감염성은 감염 단위(infectious unit), 즉 주어진 경로에 의해 하나의 실험 동물로부터 또 다른 것으로 질병을 전파할 수 있는 최소 감염 투여량으로 측정될 수 있다. 일반적으로, 100 IU-ic/ml (뇌내 경로로 측정된 감염 단위)는 프리온 단백질 약 10 LD50/ml 및 1 pg/ml에 해당한다.
조성물 중 프리온 단백질을 측정하기 위한 또 다른 방법은 PCR의 기하급수적 증폭 능력이 ELISA 체제에서의 항체에 의한 단백질의 검출과 연계되며, 초저 농도의 프리온 단백질을 검출하기 위한 변형 실시간 IPCR법으로 적용되는 기술인 면역-폴리머라제 연쇄 반응 (IPCR)이다. 문헌 [Barletta et al., J. Virology Method, 127 (2005):154-104]을 참조하라. IPCR을 사용하게 되면, 재조합 햄스터 PrPc가 1 fg/ml에서 일관되게 검출되며, 10-8 (대략 10-100 감염 단위)으로 희석된 프로테이나제 K (PK)-분해 스크래피 감염 햄스터 뇌 균질물이 반-정량적 투여량 응답으로 검출된다.
일부 실시양태에서, 조성물 중 프리온 단백질은 단백질 오형성 주기적 증폭 (PMCA)에 의해 측정된다. 상기 방법은 혈액 중 PrPsc를 측정하는 데에 사용되어 왔다. 조성물 중 프리온 단백질을 측정하는 데에 적합한 다른 방법에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 시간-분해 해리-강화 형광 기술을 사용한 정량 샌드위치 ELISA; 이중-색상 형광 공초점 스캐닝; 입체형태 의존성 면역분석 (CDI). 웨스턴 블롯팅, 비드 블롯, 겔-이동성 이동 분석, 형광 제자리 혼성화 분석 (FISH), 방사성 또는 생체발광 마커의 추적, 핵 자기 공명, 전자 상자성 공명, 흐름-정지 분광법, 칼럼 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 또는 기타 방법들이 조성물 중 프리온 단백질을 검출하도록 개발될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 프리온 단백질을 검출하기 위한 분석법들 중 1종 (예컨대 상기한 분석법들 중 어느 하나)을 기준으로, 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서는, 조성물을 분석하는 데에 2종 이상의 분석법이 사용되며, 상이한 해당 분석법들 사이의 상관관계가 조성물에 프리온 단백질이 없는지 여부를 측정하는 데에 사용된다.
따라서, 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 100 fg/ml 미만의 프리온 감염성을 가진다. 일부 실시양태에서는, 조성물이 약 10 IU-ic/ml 미만의 프리온 감염성을 가진다. 일부 실시양태에서는, 조성물이 약 1 LD50/ml 미만의 프리온 감염성을 가진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 단백질 오형성 주기적 증폭 (PMCA) 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 IPCR 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 10 IU-ic/ml 미만의 프리온 감염성을 가지며, PMCA 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 10 IU-ic/ml 미만의 프리온 감염성을 가지며, IPRC 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서는, http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/513603en.pdf에서 입수가능하며 그 내용이 본원에 전체적으로 개재되는 문헌 [Guideline for the Investigation of Manufacturing Processes for Plasma-Derived Medicinal Products with Regard to vCJD Risk (CPMP5136/03)]에 제공되어 있는 표준을 기준으로, 조성물에 프리온 단백질이 없다.
본원에서 기술되는 조성물에는 일반적으로 PrPsc가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물에는 PrPc 역시 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 PrPsc와 PrPc의 몰비는 약 1:1 이하, 예컨대 대략 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 또는 1:100000 중 어느 것 이하이다.
일부 실시양태에서, 조성물에는 인간, 소, 양, 및 설치류 (예컨대 햄스터, 마우스, 및 밍크) 유래의 프리온 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물에는 H-유형 프리온 단백질, L-유형 프리온 단백질 또는 이들 모두가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물에는 세포-결합 프리온 단백질, 유리 프리온 단백질 또는 이들 모두가 실질적으로 없다.
본원에서 사용되는 "PrPc"라는 용어는 포유동물의 신체 내에서 자연적으로 발현되는 선천적인 프리온 단백질 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "PrPsc"라는 용어는 감염성인 것으로 여겨지는, 입체형태가 변경된 형태의 PrPc 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "알부민"은 자연 발생 알부민을 지칭하는 것으로써, 재조합에 의해 제조된 알부민은 포괄하지 않는다. 자연 발생 알부민은 재조합 알부민에 비해 유리한데, 그것이 생체내에서 알부민 수용체에 대한 자연적인 리간드이기 때문이다. 본원에서 기술되는 방법에 사용되는 알부민은 일반적으로 알부민의 해독-후 수식을 보유함으로써, 감소된 면역원성의 위험성을 가지고 있다. 일부 실시양태에서, 알부민은 혈액-유래 조성물로부터 수득된다. 본원에서 사용되는 "혈액 유래 조성물"에는 전혈, 적혈구 농축액, 혈장, 혈청, 혈소판 풍부 및 혈소판 결핍 분획, 혈소판 농축액, 백혈구, 혈액 혈장 침전물, 혈액 혈장 분별 침전물 및 상청액, 혈장 분별 중간물, 혈액으로부터 유래하는 기타 다양한 물질들 등이 포함된다. 일부 실시양태에서, 알부민은 인간 유래의 것이다. 일부 실시양태에서, 알부민은 소, 양, 및 설치류 (예컨대 마우스, 햄스터, 및 밍크)와 같은 동물 유래의 것이다. 일부 실시양태에서, 알부민은 그 중 일부 이상이 프리온에 감염된 개체들 (예컨대 인간)의 군집으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 알부민은 그 중 일부 이상이 프리온에 감염된 것으로 의심되는 개체들 (예컨대 인간)의 군집으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 알부민은 개체들의 대형 배치-크기의 풀(pool)로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 조성물은 프리온-제거 과정 동안 도입되는 미량의 물질들을 함유한다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 프리온 단백질에 결합할 수 있는 미량의 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 미량의 지지 재료 (예컨대 수지를 포함한, 본원에서 기술되는 지지 재료 유래의 재료)를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없고, 상기 조성물은 프리온 단백질에 결합할 수 있는 미량의 리간드, 및 미량의 지지 재료 (예컨대 수지를 포함한, 본원에서 기술되는 지지 재료 유래의 재료)를 포함한다.
"미량"은 예컨대 생체이용률 및/또는 생물학적등가성(bioequivalency) 면에서 조성물의 특성에 영향을 주지 않는 검출가능한 양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 프리온-제거 과정에 의해 알부민이 정화되지 않은 조성물과 생물학적으로 등가이다. 생물학적등가성은 예를 들면 Cmax 및 AUC 모두에 있어서 90 %의 신뢰 구간으로 0.80 내지 1.25 사이이거나, 또는 90 % 신뢰 구간으로 0.80 내지 1.25 사이의 AUC 및 90 %의 신뢰 구간으로 0.70 내지 1.43 사이의 Cmax일 때, 확정될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 조성물 중 알부민 안정화제의 농도가 알부민이 프리온-제거 과정에 의해 정화되지 않은 조성물의 그것 미만이다. 이러한 알부민 안정화제에는 예를 들면 N-아세틸 트립토파네이트 및 나트륨 카프릴레이트가 포함된다.
본원에서 기술되는 조성물에는 일반적으로 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 및 알부민을 포함하는 나노입자가 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 나노입자 조성물은 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 및 알부민을 포함하는 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 조성물 중 나노입자는 예를 들면 대략 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 또는 60 nm 중 어느 것 이하를 포함하여, 약 1000 nm 이하의 평균 직경을 가진다. 일부 실시양태에서는, 모든 조성물 나노입자의 약 50 % 이상 (예컨대 대략 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것 이상)이 예를 들면 대략 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 또는 60 nm 중 어느 것 이하를 포함하여, 약 1000 nm 이하의 직경을 가진다. 일부 실시양태에서는, 모든 조성물 나노입자의 약 50 % 이상 (예컨대 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것 이상)이 예를 들면 약 30 내지 약 180 nm 중 어느 것, 및 약 40 내지 약 150, 약 50 내지 약 120, 및 약 60 내지 약 100 nm 중 어느 것을 포함하여, 약 20 내지 약 200 nm 범위에 속한다.
일부 실시양태에서, 조성물 나노입자 부분의 알부민 중 약 5 % 이상 (예컨대 대략 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 또는 90 % 중 어느 것 이상 포함)은 가교결합된다 (예컨대 하나 이상의 디술피드 결합을 통하여 가교결합됨).
일부 실시양태에서, 나노입자는 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민)에 의해 코팅된 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 파클리탁셀(paclitaxel))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 나노입자 형태 및 비-나노입자 형태 모두로 포함하며, 조성물 중 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 대략 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것 이상이 나노입자 형태이다. 일부 실시양태에서는, 나노입자 중 실질적으로 수불용성인 약리 활성제가 중량 기준으로 나노입자의 대략 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것을 초과하여 구성한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 비-중합체성 매트릭스를 가진다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 중합체성 재료 (예컨대 중합체성 매트릭스)가 실질적으로 없는 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 코어(core)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물에는 계면활성제 또는 유기 용매 (예컨대 크레모포어(Cremophor)®, 트윈(Tween) 80, 또는 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 투여에 사용되는 임의의 기타 유기 용매)가 실질적으로 없다 (예컨대 없다). 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 대략 20 %, 15 %, 10 %, 7.5 %, 5 %, 2.5 %, 1 % 또는 그 미만 중 어느 것보다 적게 유기 용매를 함유한다.
알부민-함유 조성물로부터의 프리온의 제거는 프리온에 대한 걱정 없이 더 많은 양의 알부민을 투여하는 것을 가능케 한다. 따라서, 본 발명에서는 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하며, 알부민 대 실질적으로 수불용성인 제약 작용제의 중량비가 약 20:1 이상, 예컨대 대략 약 30:1 이상, 약 40:1 이상, 또는 약 50:1 이상 중 어느 것인 조성물 (예컨대 제약 조성물)도 고려된다. 대표적인 비에는 예를 들면 약 20:1 내지 약 40:1, 약 40:1 내지 약 60:1, 약 60:1 내지 약 80:1, 또는 약 90:1 내지 약 100:1이 포함된다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물 중 알부민과 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비는 약 18:1 이하, 예컨대 약 15:1 이하, 예를 들면 약 10:1 이하이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 알부민과 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비는 약 1:1 내지 약 18:1, 약 2:1 내지 약 15:1, 약 3:1 내지 약 13:1, 약 4:1 내지 약 12:1, 약 5:1 내지 약 10:1 중 어느 것의 범위에 속한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 나노입자 부분 중 알부민과 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비는 대략 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15 이하 중 어느 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 입자 조성물은 상기 특성들 중 1종 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 아브락산(Abraxane)™이다. 다른 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 도세탁셀(docetaxel) 및 오르타탁셀(ortataxel))를 포함하는 나노입자 조성물 역시 상기 특성들 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 조성물 중 알부민은 프리온-제거 과정을 포함하는 방법에 의해 수득되고, 상기 프리온 제거 과정은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프리온-제거 과정은 상기 알부민 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 조성물 중 알부민은 하기를 포함하는 방법에 의해 수득된다: a) 알부민을 포함하는 최초 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시킴으로써, 리간드와 프리온 단백질 사이의 복합체의 형성을 야기하는 것, 및 b) 최초 조성물로부터 복합체를 제거하는 것.
알부민 및 실질적으로 수불용성인 약물을 포함하는 나노입자를 하기에 더욱 상세하게 추가 기술한다. 조성물 (예컨대 최초 알부민 조성물, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자 조성물, 또는 나노입자를 제조하는 과정 동안 형성되는 중간 조성물)로부터 프리온을 제거하는 방법을 하기에 더욱 상세하게 추가 기술한다. 본 발명은 본원에서 기술되는 모든 방법에 의해 제조되는 조성물들을 포괄한다.
본원에서 기술되는 조성물은 일반적으로 프리온-제거 과정에 의해 알부민이 정화되지 않은 조성물에 비해 감소된 프리온 단백질 농도를 가진다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 조성물은 프리온-제거 과정에 의해 알부민이 정화되지 않은 조성물에 비해 대략 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % 또는 그 미만 중 어느 것보다 적게 프리온 단백질을 가진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 프리온-제거 과정에 의해 알부민이 정화되지 않은 조성물에 비해 약 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 또는 8 log 중 어느 것 만큼 더 적은 프리온 단백질을 가진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 프리온-제거 과정에 의해 알부민이 정화되지 않은 조성물에 비해 약 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 또는 8 log 중 어느 것 만큼 더 적은 감염성을 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 프리온-제거 과정에 의해 알부민이 정화되지 않은 조성물과 생물학적으로 등가이다.
본 출원이 알부민에 초점을 맞추고 있기는 하지만, 비제한적으로 면역글로불린 (IgA 및 IgG 포함), 지질단백질, 아포지질단백질 B, 알파-산 당단백질, 베타-2-마크로글로불린, 티로글로불린, 트랜스페린, 피브로넥틴, 제VII 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자 등을 포함하여 혈액 또는 혈장에서 정상적으로 발견되는 다른 단백질들 역시 고려된다는 것이 이해되어야 한다. 본원에서 제공되는 알부민에 대한 모든 관련 기술은 그들이 나노입자의 형성에 이용되는 정도까지 이러한 다른 단백질들에 동등하게 적용가능하다.
무- 프리온 나노입자 조성물의 제조 방법
또 다른 측면에서는, 무-프리온 나노입자 조성물의 제조 방법이 제공된다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 함유하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 포함하고, 상기 알부민은 최초 알부민 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 함유하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 포함하고, 상기 알부민은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 함유하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 포함하고, 상기 알부민은 하기를 포함하는 방법에 의해 수득된다: a) 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, 및 b) 최초 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다: a) 최초 알부민 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것; b) 프리온-제거 알부민을 포함하는 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다: a) 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시킴으로써, 리간드와 프리온 단백질 사이의 복합체의 형성을 야기하는 것; b) 알부민 최초 조성물로부터 복합체를 제거하는 것; c) 프리온-제거 알부민을 포함하는 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되는 바, 하기를 포함한다: a) 알부민 용액을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것; b) 알부민 용액으로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것; c) 상기 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것. 일부 실시양태에서, 상기 혼합물은 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는다.
프리온은 나노입자의 형성 동안에 제거될 수 있다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: b) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 c) 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혼합물로부터 유기 용매를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 알부민 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것, 및 b) 상기 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: c) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혼합물로부터 유기 용매를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는다.
일부 실시양태에서는, 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 혼합물은 리간드와 접촉되기 전에 고전단 조건에 적용되는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것, 및 b) 상기 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: c) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: d) 혼합물로부터 수성 상을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 혼합물에는 계면활성제가 실질적으로 없다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것, b) 상기 유기 용매를 제거하는 것, 및 c) 유기 용매가 제거된 상기 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: d) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: d) 혼합물로부터 수성 상을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 혼합물에는 계면활성제가 실질적으로 없다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것, b) 상기 유기 용매를 제거하는 것, c) 알부민을 혼합물에 첨가하는 것, 및 d) 상기 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: e) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: f) 혼합물로부터 수성 상을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 혼합물에는 계면활성제가 실질적으로 없다.
본원에서 기술되는 방법은 일반적으로 유기 용매 중에 분산된 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 고전단 조건은 예를 들면 약 6000 내지 약 25,000 psi, 약 9000 내지 약 18,000 psi, 약 10,000 내지 약 25,000 psi, 약 15,000 내지 약 25,000 psi를 포함하여, 예컨대 약 3000 내지 약 30,000 psi 범위의 압력에서의 고압 균질화이다. 일부 실시양태에서, 유기 용매는 실질적으로 수비혼화성인 유기 용매 (예컨대 클로로포름 또는 염화 메틸렌)와 수용성 유기 용매 (예컨대 에탄올 및 t-부탄올을 포함한 수용성 알콜)의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수비혼화성인 유기 용매와 수용성 유기 용매의 비 (v/v) (예컨대 클로로포름/에탄올 또는 클로로포름/부탄올의 비)는 대략 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 또는 9:1 중 어느 것, 또는 대략 3:7, 5:7, 4:6. 6:4, 5:5, 6:5, 8:5, 9:5, 9.5:5, 5:3, 7:3, 6:4, 또는 9.5:0.5 중 어느 것의 비이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 혼합물로부터 유기 상을 제거하는 것 (예컨대 감압하에서의 증발에 의한 제거)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혼합물로부터 수성 상을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기한 방법에 의해 형성되는 나노입자를 무균 여과하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서는, 프리온 단백질을 함유하는 것으로 의심되며, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다: a) 상기 나노입자 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, b) 나노입자 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서는, 비정상 프리온 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 알부민 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 알부민을 포함하는 상기 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, b) 상기 알부민 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것 (상기 알부민 조성물은 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물을 제조하는 데에 사용됨).
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 조성물 중 프리온 단백질의 존재 또는 부재를 측정하는 것, b) 상기 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, 및 c) 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 방법들의 하나 이상 단계는 배치 방식으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 방법들의 하나 이상 단계는 연속 방식으로 수행된다.
나노입자 형성 전의 프리온 제거
프리온 단백질은 알부민-함유 나노입자 조성물이 제조되기 전에 최초 알부민 조성물로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, 및 상기 알부민 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 포함한다. 이와 같은 과정은 동일하거나 상이한 리간드를 사용하여 1회 이상 반복될 수 있다. 프리온 제거 과정 동안 2종 이상의 리간드가 동시에 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 혈액 유래 조성물이다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 전혈, 적혈구 농축액, 혈장, 혈청, 혈소판 풍부 및 혈소판 결핍 분획, 혈소판 농축액, 백혈구, 혈액 혈장 침전물, 혈액 혈장 분별 침전물 및 상청액, 또는 혈장 분별 중간물이다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 인간으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 소, 양, 및 설치류 (예컨대 마우스, 햄스터, 및 밍크)와 같은 동물 유래의 것이다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 그 중 일부 이상이 프리온에 감염되어 있는 개체들 (예컨대 인간)의 군집으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 그 중 일부 이상이 프리온에 감염된 것으로 의심되는 개체들 (예컨대 인간)의 군집으로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 상기 최초 알부민 조성물은 이온 교환, 친화성, 겔 투과, 및/또는 소수성 크로마토그래피 및/또는 시차 침전을 포함하여, 업계 공통의 다양한 방법들 중 어느 것에 의해 체액 (예컨대 혈액)으로부터 제조되는 알부민 조성물이다. 일부 실시양태에서, 최초 조성물은 혈액 (예컨대 인간 혈액)으로부터 정제된 알부민 조성물이다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 혈청 (예컨대 인간 헐청)으로부터 정제된 알부민 조성물이다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물은 약 100 IU-ic/ml, 90 IU-ic/ml, 50 IU-ic/ml, 또는 10 IU-ic/ml의 프리온 감염성을 가진다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물 중 알부민의 농도는 예를 들면 약 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 또는 30 %를 포함하여, 약 1 % (w/v)이다.
프리온-제거 과정 동안, 리간드가 최초 알부민 조성물과 접촉되어, 최초 알부민 조성물 중 프리온 단백질에 결합된다. 결합에 적합한 조건은, 리간드의 특성 및 프리온 단백질에 대한 그의 결합 특이성을 바탕으로, 프리온 단백질에 대한 리간드의 결합을 촉진하도록 결정 및 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합은 예를 들면 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃를 포함하여, 약 0 ℃ 내지 약 39 ℃의 온도에서 수행된다. 결합은 예를 들면 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 8, 약 6.8 내지 약 7.5, 약 6.9 내지 약 7.4, 또는 약 7을 포함하여, 약 4 내지 약 10의 pH에서 수행될 수 있다. 임의로, 리간드에 대한 비-특이적 결합을 감소시키기 위하여, 차단제(blocking agent)가 사용될 수 있다.
접촉 단계 후, 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질은 나머지 조성물로부터 제거된다. 본원에서 사용될 때의 "제거"라는 용어는 알부민-함유 조성물로부터의 리간드 및 그에 결합된 단백질의 분리를 지칭한다. 상기 분리는 리간드 및 분리를 용이하게 하기 위하여 사용되는 지지 재료 (존재할 경우)의 특성에 따라 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 리간드 및 그에 결합된 단백질은 비제한적으로 박층, 칼럼 및 배치 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피; 고체 지지체 및 멤브레인 분리; 반응기 분리; 자기 분리, 면역분리; 콜로이드 분리; 침강; 침전; 또는 원심분리에 의해 분리 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는 비드 또는 멤브레인과 같은 지지 재료에 결합될 수 있는데, 그것은 다시 최초 알부민 조성물과 접촉된다. 리간드-고정 지지체는 프리온-리간드 복합체의 형성을 야기하기에 충분한 조건하에서 최초 알부민 조성물과 접촉된다. 다음에, 고체 상이 조성물로부터 분리됨으로써, 리간드에 결합된 프리온 단백질이 샘플로부터 제거된다. 예를 들어 대표적인 일 실시양태에서는, 크로마토그래피 칼럼과 같은 칼럼에 리간드가 고정된 다음, 중력, 또는 고압 액체 크로마토그래피 칼럼에서와 같은 압력하에서의 힘 중 어느 것으로 인하여 샘플 (예컨대 최초 알부민 조성물)이 칼럼으로 통과된다. 샘플 중 프리온 단백질은 칼럼에 고정된 리간드에 결합될 것이므로, 통과하는 샘플이 수집될 수 있다. 이와 같은 과정은 원하는 결과를 달성하기 위하여 동일하거나 상이한 리간드들을 사용하여 수회 반복될 수 있다.
칼럼에서의 샘플 (예컨대 최초 알부민 조성물)의 유량은 리간드와 샘플 중 프리온 단백질의 결합이 최대화되도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합은 예를 들면 대략 분 당 0.1 ml, 분 당 0.25 ml, 분 당 0.5 ml, 분 당 1.0 ml, 분 당 1.5 ml, 분 당 1.7 ml, 분 당 1.8 ml, 분 당 1.9 ml, 분 당 2.0 ml, 분 당 2.1 ml, 분 당 2.3 ml, 분 당 2.5 ml, 분 당 2.7 ml, 분 당 3.0 ml, 분 당 3.5 ml, 분 당 4.0 ml, 분 당 4.5 ml, 또는 분 당 5.0 ml를 포함하여, 분 당 약 0.1 ml 내지 분당 약 5.0 ml, 분 당 약 0.1 ml 내지 분당 약 2.5 ml, 분 당 약 0.1 ml 내지 분당 약 0.25 ml, 분 당 약 0.25 ml 내지 분당 약 0.5 ml, 분 당 약 0.5 ml 내지 분당 약 1.0 ml, 분 당 약 1.0 ml 내지 분당 약 1.5 ml, 분 당 약 1.5 ml 내지 분당 약 2.0 ml, 분 당 약 2.0 ml 내지 분당 약 2.5 ml, 분 당 약 2.5 ml 내지 분당 약 3.0 ml, 분 당 약 3.0 ml 내지 분당 약 3.5 ml, 분 당 약 3.5 ml 내지 분당 약 4.0 ml, 분 당 약 4.0 ml 내지 분당 약 4.5 ml, 또는 분 당 약 4.5 ml 내지 분당 약 5.0 ml의 유량으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유량은 분 당 약 10 ml 이상, 예컨대 대략 분 당 20 ml, 분 당 30 ml, 분 당 40 ml, 분 당 50 ml 중 어느 것 이상이다.
결합 과정 동안의 총 유통 부피 또는 총 유통 시간 역시 리간드와 샘플 (예컨대 최초 알부민 조성물) 중 프리온 단백질의 결합이 최대화되도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 유통 부피는 예를 들면 칼럼 부피의 약 2배 내지 약 10배, 칼럼 부피의 약 10배 내지 약 20배, 칼럼 부피의 약 20배 내지 약 30배, 칼럼 부피의 약 30배 내지 약 40배, 칼럼 부피의 약 40배 내지 약 50배, 칼럼 부피의 약 50배 내지 약 1000배, 칼럼 부피의 약 50배 내지 약 500배, 칼럼 부피의 약 100배 내지 약 600배, 또는 칼럼 부피의 약 200배 내지 약 800배를 포함하여, 칼럼 부피의 약 1배 내지 약 1000배이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 부피는 칼럼 부피의 약 100배이다. 다른 실시양태에서, 총 유통 부피는 칼럼 부피의 약 500배이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 시간은 예를 들면 약 2시간 내지 약 25시간, 약 3시간 내지 약 20시간, 또는 약 3시간 내지 약 17시간을 포함하여, 약 1시간 내지 약 30시간이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 시간은 대략 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 또는 20시간 중 어느 것이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 시간은 약 24시간을 초과하는 것이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 시간은 예를 들면 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0.5시간 중 어느 것을 포함하여, 약 8시간 미만이다.
다르게는, 프리온-리간드 복합체의 형성을 야기하기에 충분한 조건하에서 리간드가 먼저 최초 알부민 조성물과 접촉될 수 있다. 다음에 이어서, 프리온-리간드 복합체가 친화성-기반의 크로마토그래피와 같은 칼럼을 사용하여 제거된다. 분리를 용이하게 하기 위하여, 리간드가 결합 상대물에 결합됨으로써, 예컨대 결합 상대물을 인식하는 분자를 함유하는 친화성 칼럼을 사용하는 것에 의해, 결합 상대물을 통하여 리간드/프리온 복합체가 제거될 수도 있다.
배치 또는 칼럼 크로마토그래피 이외에도, 프리온 단백질 결합을 위한 리간드 사용의 다양한 다른 구성, 변형 및 변종들도 예상된다. 그와 같은 변종 및 변형에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 배치 공정, 연속 공정, 이동 상 크로마토크래피 공정; 저압, 중간압 또는 고압 공정; 또는 소규모, 중간규모 또는 대규모 공정. 일부 실시양태에서, 리간드는 멤브레인, 부직 메시에 함침된 섬유 비드, 또는 필터 하우징에 내포된 코팅 섬유 상에 존재한다.
일부 실시양태에서, 상기 제거 단계는 유의성 있는 산출 손실, 및/또는 알부민의 특성 및/또는 안정성에 있어서의 변화를 초래하지 않는다. 일부 실시양태에서는, 그의 원래의 생물학적 상태에서의 알부민의 회수율이 예를 들면 80 %, 또는 90 % 이상을 포함하여, 적어도 50 %를 초과하는 수준까지 실질적으로 유지된다. 일부 실시양태에서, 프리온 제거 과정으로부터의 알부민의 회수율은 약 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것을 초과한다. 일부 실시양태에서, 최초 알부민 조성물 중 알부민의 농도는 비-특이적 결합 및 상기 과정 동안의 알부민의 손실을 최소화하기 위하여 프리온 제거 단계 이전에 조정 또는 조절된다. 예를 들면, 알부민의 농도는 예컨대 약 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 또는 30 %의 알부민을 포함하여, 약 1 % 내지 약 50 %, 약 5 % 내지 약 25 %, 약 5 % 내지 약 30 %, 약 5 % 내지 약 40 %, 약 5 % 내지 약 10 %, 약 10 % 내지 약 15 %, 약 15 % 내지 약 20 %, 약 20 % 내지 약 25 %, 약 25 % 내지 약 30 % 등의 범위일 수 있다.
생성되는 알부민 조성물은 프리온 제거 과정의 정화율을 측정하기 위하여 분석될 수 있다. 결합된 프리온 단백질을 가지는 리간드 역시 정화율을 측정하기 위하여 (바로 또는 용리 후에) 분석될 수 있다.
프리온 단백질의 제거는 프리온 단백질의 감소 또는 감염성의 감소를 기준으로 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 예를 들면 약 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 또는 100 % 이상을 포함하여, 약 50 % 이상의 프리온 단백질이 최초 알부민 조성물로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 제거-후 알부민 조성물의 감염성은 최초 알부민 조성물의 그것에 비해 약 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 80×, 100×, 200×, 500×, 1000×, 104×, 105×, 106×, 107×, 108×, 109× 이상 더 작다.
일부 실시양태에서는, 프리온 제거 과정의 정화율을 측정하는 데에 일련의 감염성이 사용된다. 일련 희석의 샘플을 제조하고, 예컨대 분석 동물에서의 감염 활성에 대하여 희석액들을 조사한다. 동물의 절반이 감염되는 희석이 감염가이다. 예를 들어, 5배 희석이 요구되는 경우, 샘플은 5 log의 감염성을 가지는 것으로 정의될 수 있다. 최초 알부민 조성물의 log 감염성과 제거-후 알부민 조성물의 그것을 비교함으로써, 프리온 제거 과정의 정화율을 측정할 수 있다. 소정 구현에에서, 상기 프리온 제거 방법은 감염성의 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 log 중 어느 것의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 프리온-제거 과정의 정화율은 감염성 물질을 사용하는 첨가(spiking) 실험을 기준으로 프리온-제거 방법에 대하여 본원에서 기술되는 하기의 단계들에 의해 측정된다. 적합한 첨가제에는 뇌 균질물, 마이크로좀, 카베올레-유사 도메인, 정제된 PrPsc, 및 프리온 피브릴이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 가용화된 세정제 (예컨대 가용화된 사르코실)이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 첨가 비(spiking ratio)는 예를 들면 약 0.001 %, 0.005 %, 0.075 %, 0.01 %, 0.1 %, 0.5 %, 0.75 %, 1 %, 2 %, 3 %, 또는 5 %를 포함하여, 약 0.001 % 내지 약 5 %, 약 0.001 % 내지 약 0.25 %, 약 0.001 % 내지 약 0.1 %, 약 0.001 % 내지 약 0.005 %, 약 0.005 % 내지 약 0.075 %, 약 0.075 % 내지 약 0.01 %, 약 0.01 % 내지 약 0.1 %, 약 0.1 % 내지 약 0.5 %, 약 0.5 % 내지 약 0.75 %, 약 0.75 % 내지 약 1 %, 약 1 % 내지 약 2 %, 약 2 % 내지 약 3 %, 또는 약 3 % 내지 약 5 %의 범위이다.
일부 실시양태에서는, 감소 계수(reduction factor) (RF)를 사용하여 프리온 제거 과정의 정화율이 측정된다. 상기 RF는 하기 수학식을 사용하여 계산될 수 있다:
RF = (V1×T1)/(V2×T2) 또는
Log10[RF] = [Log10(V1) + Log10(T1)] - [Log10(V2) + Log10(T2)]
여기서, V1 및 T1은 각각 최초 알부민 조성물의 부피 및 역가이며, V2 및 T2는 제거-후 알부민 조성물의 부피 및 역가이다. 감소 계수는 최종 계산 후 소수점 이하 1자리로 반올림될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 감소 계수 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 또는 8.0 log10 이상의 프리온 단백질 감염성이 최초 알부민 조성물로부터 제거된다. 예를 들면, 20 % 알부민 조성물에 첨가된 0.5 % 사르코실 가용화 분획에서, 2.5 log10 이상의 감소 계수로 프리온 단백질이 제거될 수 있다. 또 다른 예로서, 25 % 알부민 조성물에 첨가된 0.5 % 사르코실 가용화 분획에서, 2.0 log10 이상의 감소 계수로 프리온 단백질이 제거될 수도 있다.
표준 웨스턴 블롯 분석에 의해 프리온의 제거가 평가될 수 있다. 예를 들어, 결합-후의 리간드는 먼저 모든 PrPc를 분해하나 PrPsc는 분해하지 않는 프로테이나제 K로 처리될 수 있다. 다음에, SDS 겔 상에서 소화물을 전개시켜, 니트로셀룰로스 또는 PVDF 멤브레인 시트에 교차블롯팅한다(transblotted). 다음에, 분리된 PrPsc 밴드를 3F4 또는 6H4를 사용하여 가시화한다. 3F4는 인간, 햄스터, 및 고양이 유래의 아미노산 잔기 109-112 PrP와 반응한다. 대표적인 일 구현에에서는, 0.6 ㎍/ml의 농도로 최소 1시간 동안 배양을 수행하고, 그 후 과량의 항체를 세척 제거한 후, 토끼 항-마우스 양고추냉이 퍼옥시다제 접합체 (1:1000 희석)를 사용하여 최소 1시간 동안 멤브레인을 배양하였다. TTBS를 사용한 광범위한 세척 후, 강화된 화학발광을 사용하여 멤브레인을 현상하였다. 일부 실시양태에서는, 문헌 [Guideline for the Investigation of Manufacturing Processes for Plasma-Derived Medicinal Products with Regard to vCJD Risk (CPMP5136/03)]에 따라 프리온 단백질의 제거가 평가된다.
프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드 및 지지 재료
본원에서 사용되는 "리간드"는 프리온 단백질 또는 펩티드가 결합하는 분자를 지칭한다. "프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드"는 적합한 조건하에서 프리온 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 리간드는 인간 프리온 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서는, 리간드가 햄스터 프리온 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 마우스 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서는, 리간드가 다수 종들 유래의 프리온 단백질에 결합한다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 리간드는 인간 프리온 단백질, 햄스터 프리온 단백질, 및 마우스 프리온 단백질에 결합한다.
일부 실시양태에서, 리간드는 고도의 결합 친화도로 프리온 단백질 (예컨대 인간 프리온 단백질, 햄스터 프리온 단백질, 및/또는 마우스 프리온 단백질)에 결합한다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 리간드는 대략 107, 108, 109, 1010, 또는 1011 중 어느 것을 초과하는 결합 K 연관(binding K association)을 가진다.
수많은 리간드들이 프리온 단백질에 결합하며 그에 따라 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다. 예를 들면, WO04/090102호, WO04/050851호, WO06/010915호, 및 WO06/044459호를 참조하라. 여기에는 예를 들면 프리온 단백질을 특이적으로 인식하는 펩티드, 화합물, 및 항체들이 포함된다. 리간드는 조성물 내의 모든 형태의 프리온 단백질을 제거하도록 사용될 수 있거나, 또는 단일 형태의 프리온 단백질을 검출 또는 제거하도록 선택적으로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프리온을 제거하기 위한 리간드는 펩티드, 예컨대 PCT 출원 공개 제WO04/05051호에 기술되어 있는 펩티드이다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 리간드가 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 1-232 중 어느 것의 아미노산을 가지는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 서열 48, 102, 105, 108, 109, 110, 111, 143, 148, 193, 194, 195, 202, 203, 204, 또는 210 중 어느 것의 아미노산 서열을 가지는 펩티드와 같은 트리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 서열 152, 153, 180, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 188, 189, 또는 190 중 어느 것의 아미노산 서열을 가지는 6량체와 같이, 6개의 아미노산을 가지는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 서열 150 또는 151의 아미노산 서열을 가진다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 리간드는 DVR, SYA, AMN31, D4, 또는 YVHEA의 아미노산 서열을 가지는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 DVR, SYA, AMN31, D4, 또는 YVHEA의 것과 유사하거나 그것을 초과하는 친화도로 프리온 단백질에 결합하는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 DVR이다. 다른 실시양태에서, 리간드는 AMN31이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 리간드는 수지의 (예컨대 수지에 결합된) 형태로 제공된다.
일부 실시양태에서는, 리간드가 프리온 단백질을 인식하는 항체이다. 프리온 단백질을 인식하는 항체에 대해서는 업계에 알려져 있다. 여기에는 단일클론 항체 3F4, 6H4, 또는 16A18이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 ICSM-4 및 ICSM-10과 같은 당형(glycoform)의 특이적인 항체이다. 본원에서 기술되는 방법에 유용한 적합한 항체에는 다클론 및 단일클론 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, 및 Fv 단편이 포함된다.
일부 실시양태에서, 리간드는 프리온 단백질의 특정 서열에 결합한다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 리간드 (예컨대 펩티드 리간드 또는 항체 리간드)는 표 2에 열거되어 있는 프리온 단백질 서열 133-146 중 어느 것에 결합한다.
Figure pct00005
일부 실시양태에서, 리간드는 화합물이다. 프리온 단백질에 결합할 수 있는 화합물은 예를 들면 본원에 그 전체가 개재되는 PCT 출원 공개 제WO06/010915호에서 찾아볼 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 치환된 트리아진이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 하기 화학식 (I)을 가지는 화합물이다:
<화학식 I>
Figure pct00006
(여기서, 프리온 단백질의 친화성 결합을 위해서는, R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 시클로알킬, 임의 치환된 아릴 또는 임의 치환된 헤테로아릴 기이고; R3은 수소 또는 아릴 기 치환체이거나, 또는 R3은 임의로 스페이서(spacer)를 통하여 결합되는 고체 지지체이며; Z는 산소 원자, 황 원자 또는 NR4를 나타내고; Y는 산소 원자, 황 원자 또는 NR5를 나타내며; 여기서 동일하거나 상이할 수 있는 R4 및 R5는 수소, 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 페닐, 임의 치환된 벤질 또는 임의 치환된 β-페닐에틸을 나타내고; X1 및 X2 중 하나는 질소 원자를 나타내며, X1 및 X2 중 다른 하나는 질소 원자 또는 CR6를 나타내고, 여기서 R6는 수소 또는 아릴 기 치환체를 나타냄).
일부 실시양태에서, 리간드는 하기 화학식 (II)의 화합물이다:
<화학식 II>
Figure pct00007
(여기서, 프리온 단백질의 친화성 결합을 위해서는, R1은 -(CH2)m-Q1 기를 나타내며, 여기서 m은 0 내지 7이고, Q1은 -CR11R12R13 또는 -NR11R12를 나타내며, 여기서 R11, R12 및 R13은 독립적으로 수소, 알킬, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 나타내거나, 또는 R11, R12 및 R13 중 2개가 그들이 결합되어 있는 탄소 또는 질소 원자와 함께 임의 치환된 시클로알킬 또는 임의 치환된 헤테로시클로알킬 기를 형성하고; R2는 -(CH2)n-Q2 기를 나타내며, 여기서 n은 0 내지 7이고, Q2는 -CR21R22R23 또는 -NR21R22를 나타내며, 여기서 R21, R22 및 R23은 독립적으로 수소, 알킬, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 나타내거나, 또는 R11, R12 및 R13 중 2개가 그들이 결합되어 있는 탄소 또는 질소 원자와 함께 임의 치환된 시클로알킬 또는 임의 치환된 헤테로시클로알킬 기를 형성하고; R3은 수소 또는 아릴 기 치환체이거나, 또는 R3은 임의로 스페이서를 통하여 결합되는 고체 지지체이며; Z는 산소 원자, 황 원자 또는 NR4를 나타내고; Y는 산소 원자, 황 원자 또는 NR5를 나타내며; 여기서 동일하거나 상이할 수 있는 R4 및 R5는 수소, 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 페닐, 임의 치환된 벤질 또는 임의 치환된 β-페닐에틸을 나타내고; X1 및 X2 중 하나는 질소 원자를 나타내며, X1 및 X2 중 다른 하나는 질소 원자 또는 CR6를 나타내고, 여기서 R6는 수소 또는 아릴 기 치환체를 나타냄).
일부 실시양태에서, a) X1 및 X2는 모두 질소이며; b) Z 및 Y 모두는 NR4를 나타내고, 특히 여기서 R4는 수소이며; c) m은 0 내지 4, 더욱 바람직하게는 0 내지 3, 가장 바람직하게는 1 내지 3이고; d) Q1은 -NR11R12이며, R11 및 R12는 바람직하게는 그들이 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로시클로알킬 기를 형성하고; e) n은 0 내지 4, 더욱 바람직하게는 0 내지 2이며, 가장 바람직하게는 0이고; f) R21 및 R22는 그들이 결합되어 있는 탄소 원자 또는 질소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬 기를 형성한다.
일부 실시양태에서, Q2는 특히 6개 이상의 원자를 포함하는 고리 시스템을 가지는 소수성의 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬 기를 나타낸다.
일부 실시양태에서, Q1은 헤테로시클로알킬 기, 특히 피페리딜, 특히 1-피페리딜, 또는 피페라지닐, 특히 1-피페라지닐을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 리간드는 하기 화학식 (III)의 화합물이다:
<화학식 III>
Figure pct00008
(여기서, 프리온 단백질의 친화성 결합을 위해서는, R1은 1개 이상의 카르복실 기에 의해 치환되고 1개 이상의 추가적인 알킬 기 치환체에 의해 임의 치환된 -(CH2)p-CH3 알킬렌 사슬을 나타내며, 여기서 p는 0 내지 6이고; R2는 -(CH2)q-Ar 기를 나타내며, 여기서 q는 0 내지 7이고, Ar은 임의 치환된 아릴 기를 나타내며; R3은 수소 또는 아릴 기 치환체이거나, 또는 R3은 임의로 스페이서를 통하여 결합되는 고체 지지체이고; Z는 산소 원자, 황 원자 또는 NR4를 나타내며; Y는 산소 원자, 황 원자 또는 NR5를 나타내고; 여기서 동일하거나 상이할 수 있는 R4 및 R5는 수소, 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 페닐, 임의 치환된 벤질 또는 임의 치환된 β-페닐에틸을 나타내며; X1 및 X2 중 하나는 질소 원자를 나타내고, X1 및 X2 중 다른 하나는 질소 원자 또는 CR6를 나타내며, 여기서 R6는 수소 또는 아릴 기 치환체를 나타냄).
일부 실시양태에서, a) X1 및 X2는 모두 질소이며; b) Z 및 Y 모두는 NR4를 나타내고, 특히 여기서 R4는 수소이며; c) p는 0 내지 4, 더욱 바람직하게는 0 내지 3이고; d) R1은 1 또는 2개의 카르복실 기에 의해 치환되며, 상기 카르복실 기들 중 1개 이상은 -(CH2)p-CH3 알킬렌 사슬의 말단 탄소 원자에 의해 보유되고, e) q는 0 내지 4, 더욱 바람직하게는 0 내지 3이며, 가장 바람직하게는 1 또는 2이고; f) Ar은 페닐, 페녹시, 톨릴, 클로로벤질, 메톡시벤질, 플루오로벤질, 피리딜 및 인돌릴로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상의 치환체에 의해 임의 치환된 1고리형 카르보시클릭 또는 헤테로고리형 방향족 기이다.
일부 실시양태에서, R1은 카르복시메틸, 4-카르복시부틸 또는 1-(1,3-디카르복시)프로필이다.
일부 실시양태에서, Ar은 페닐, 4-히드록시페닐 또는 피리딜, 특히 2-피리딜이다.
일부 실시양태에서, R3은 수소 또는 아릴 기 치환체이거나, 또는 R3은 임의로 스페이서를 통하여 결합되는 고체 지지체이며; X1 및 X2는 모두 N이고; Y 및 Z 모두는 NH를 나타내며; m은 2를 나타내고; Q1은 피페리딜 또는 피페라지닐을 나타내며; n은 0 또는 2를 나타내고; Q2는 1-피페리딜 또는 아다만틸을 나타낸다.
일부 실시양태에서, R3은 수소 또는 아릴 기 치환체이거나, 또는 R3은 임의로 스페이서를 통하여 결합되는 고체 지지체이며; X1 및 X2는 모두 N이고; Y 및 Z 모두는 NH를 나타내며; R1은 카르복시메틸, 4-카르복시부틸 및 1-(1,3-디카르복시)프로필을 나타내고; q는 2를 나타내며; Ar은 페닐, 2-피리딜 또는 4-히드록시페닐을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 리간드는 무기 화합물 또는 성분, 예컨대 비제한적으로 알루미늄 (예컨대 산화 알루미늄) 또는 실리카 (예컨대 용융 실리카(fused silica))이다. 일부 실시양태에서, 상기 무기 화합물은 Al2O3 또는 SiO2이다.
일부 실시양태에서, 리간드는 1종 이상의 관능기를 포함한다. 본원에서 "관능기"라는 용어는 분자 또는 물질에 특징적인 화학적, 물리적, 또는 물리화학적 거동을 부여하는 화학 기, 하위기, 또는 하위구조를 나타내기 위하여 사용된다. 본원에서 기술되는 관능기에는 친수성인 것, 예컨대 양성, 음성, 또는 비하전 또는 중성의 것, 또는 소수성인 것이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 친양쪽성 또는 다관능성 관능기 역시 고려되며, 본 발명의 영역에 포함된다. 관능기에는 유기 및 무기 관능기가 포함된다. 바람직한 관능기는 아민, 페닐 또는 술파이트 기를 포함한다. 바람직한 아민 기는 1차, 2차, 3차, 또는 4차 암모늄 이온 예컨대 디메틸아미노에틸 (DMAE) 또는 트리메틸아미노에틸 (TMAE)이다.
다른 대표적인 관능기에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: -CH2-CHOH-CH2NH2; -C6H5; -(CH2)3-CH3; -CH2-CH2-NH(C2H5)2; -SO2-CH2-CF3'-CH2-CH2-H(CH3)2; -CH2-CH2-(CH3)3; -SO32-. 추가로 유용한 관능기에는 술포닐 기 및 트레실 기가 포함된다. 관능기는 고유하게 리간드에 존재할 수 있거나, 또는 화학적 변형에 의해 리간드에 부가될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, 리간드는 아미노 기를 포함한다. 여기에는 예를 들면 아미노 수지, 예컨대 토요펄(Toyopearl)™ 아미노-650M, 토요펄™ 아미노-AMN31, TSK-GEL™-아미노 750C, 또는 그의 관능기 등가물이 포함된다. 일부 실시양태에서, 리간드는 페닐 기를 포함한다. 여기에는 예를 들면 TSK-GEL™ 페닐-5PW 또는 그의 관능기 등가물이 포함된다.
일부 실시양태에서, 리간드는 선택적으로, 그리고 특이적으로 프리온 단백질에 결합하는 중합체 물질, 예컨대 크로마토그래피 수지 (예를 들면 아미노 수지)이다. 크로마토그래피수지의 예는 PRDT 프리온 감소 수지 (UK CB4 0WA, 캠브리지 밀턴 로드, 211 캠브리지 사이언스 파크 소재 프로메틱 바이오사이언시즈(ProMetic Biosciences) Ltd 사)이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합체 물질은 상기한 관능기와 같은 1종 이상의 관능기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 메타크릴레이트 골격을 가지는 중합체 물질, 예컨대 비제한적으로 시중에서 구입가능한 TSK, 토요펄, 또한 팩토겔(FACTOGEL) 수지 (PA 몽고메리빌 소재 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) 사)이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다른 리간드에는 예를 들면 아밀로이드 플라크와 상호작용하는 리간드, 예컨대 콩고(Congo):E;Led (문헌 [Ingrosso, L., et al., Congo Red: Prolongs the Incubation Period in Scrapie-infected Hamsters. Virology 69:506-508 (1995)]); 1,4-요오도, 4-데옥시 독소루비신 (문헌 [Tagliavini, F., et al., Effectiveness of Anthracycline Against Experimental Prion Diseases in Syrian Hamsters. Science 276:1119-1122 (1997)]); 암포테리신 13, 포르피린 및 프탈로시아닌 (문헌 [Priola, S.A., et al., Porphyrin and Phthalocyanine Antiscrapie Compounds, Science 287:1503-1506 (2000)]); 금속 (문헌 [Stocker et al., Biochemistry, 37, 7185-7193 (1998)]); PrP와 상호작용하여 복합체를 형성하는 펩티드 (프루시너(Prusiner) 등의 U.S. 특허 5,750,361호, 및 문헌 [Solo, C. et al., Reversion of Prion Protein Conformational Changes in Synthetic p-sheet Breaker Peptides, Lances, 355:192-197 (2000)] 참조); 헤파린 및 기타 폴리술페이트화 폴리음이온 (문헌 [Caughey, B., et al., Binding of the Protease-sensitive Form of Prion Protein PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and Congo Red, J. Virology 68:2135-2141(1994)]); 항체 (문헌 [Kascsak, R.J., et al., Immunodiagnosis of Prion Disease, Immunological Invest. 26:259-268 (1997)]); 및 기타 단백질들, 예를 들면 플라스미노겐 (문헌 [Fischer, M.B. et al., Binding of Disease-associated Prion Protein to: Plasminogen., Nature 408:479-483 (2000)])이 포함된다.
리간드는 임의의 지지 재료에 결합될 수 있다. 본원에서 사용되는 "지지 재료"는 나머지 조성물로부터의 리간드 및 그에 결합된 단백질의 물리적 또는 화학적 분리 수단을 제공할 수 있는 임의의 화합물 또는 재료를 지칭한다. 상기 지지 재료는 미립자 또는 비-미립자, 가용성 또는 불용성, 다공성 또는 비-다공성일 수 있다.
지지 재료의 예에는 자연 발생 중합체, 예를 들면 다당류 예컨대 아가로스, 알기네이트, 카라기난, 키틴, 셀룰로스, 덱스트란 또는 전분; 합성 중합체 예컨대 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리아크롤레인, 폴리비닐 알콜, 폴리메틸아크릴레이트, 퍼플루오로탄소; 무기 화합물 예컨대 실리카, 유리, 규조토, 알루미나, 산화 철 또는 기타 금속 산화물, 또는 2종 이상 자연 발생 중합체, 합성 중합체 또는 무기 화합물의 임의의 조합으로 구성되는 공중합체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 역시 시도되는 것은 액체 분배에 사용하기 위한 친화성-리간드 매트릭스 접합체를 제공하는 중합체 예컨대 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜 또는 가수분해된 전분을 포함하는 가용성 지지 재료이다.
일부 실시양태에서, 지지 재료는 고체 지지체 예컨대 칼럼, 비드, 멤브레인, 카트리지, 필터, 침지막대, 미세적정 플레이트, 시험관, 고체 분말, 캐스트 또는 압출 성형 모듈, 메시, 자기 입자 복합체, 또는 임의의 기타 고체 재료이다. 상기 고체 재료는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 레이온, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리비닐리덴 디플루오리드 (PVDF), 실리콘, 폴리포름알데히드, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스 등과 같은 물질에 의해 코팅될 수 있다. 다르게는, 겔을 형성하는 물질, 예를 들면 단백질 (예컨대 젤라틴), 지질다당류, 실리케이트, 아가로스 및 폴리아크릴아미드가 사용된다. 중합체 예컨대 덱스트란, 폴리알킬렌 글리콜 또는 계면활성제, 예컨대 인지질, 장쇄 (12-24개의 탄소 원자) 알킬 암모늄염 등 역시 사용될 수 있다. 리간드는 상기 지지 재료에 결합되거나 분산된다.
일부 실시양태에서, 지지 재료는 활성 아가로스, 실리카, 셀룰로스, 유리, 메타크릴레이트, 히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 스티렌디비닐벤젠, 하이퍼(Hyper) D 또는 퍼플루오로탄소이다. 일부 실시양태에서는, 지지 재료가 토요펄 (USA PA I 18936, 몽고메리빌, 156 키스톤 드라이브 소재 토소 바이오사이언스 LLC 사로부터 구입가능)이라는 상표명으로 판매되는 유형의 메타크릴레이트 재료이다. WO 97/10887호는 친화성 리간드-매트릭스 접합체를 형성하기 위하여, 지지 매트릭스에 친화성 리간드를 결합시키는 방법, 예컨대 활성화법의 사용, 및 예컨대 축합 반응에 의해 스페이서를 통하여 매트릭스에 친화성 리간드를 결합시키는 방법에 대해 기술하고 있다.
일부 실시양태에서, 리간드 및/또는 지지 재료는 재사용가능하다. 일부 실시양태에서, 리간드 및/또는 지지 재료는 1회용으로만 사용된다.
리간드의 프리온 결합 용량은 리간드에서의 감염가를 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들면, 일련 희석의 참조 모액을 제조하고, 표준 웨스턴 블롯 분석으로 시험한다. 참조 모액으로부터 관찰되는 역가를 생물검정에서 관찰된 상응 역가와 비교한다. 다음에, 웨스턴 블롯 역가는 하기의 수학식을 사용하여 감염가로 전환될 수 있다: 역가[생물검정] = 역가[ 웨스턴블롯 ] + (선형 회귀 분석의 절편) / (선형 회귀 분석의 기울기). 일단 ml 당 감염가가 계산되고 나면, 칼럼에 결합된 총 프리온 단백질이 측정될 수 있다. 리간드의 프리온 결합 용량은 리간드에 결합된 것으로 직접 관찰된 프리온 단백질의 양을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 리간드의 프리온 결합 용량은 리간드 ml 당 약 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.5, 또는 10.0 log10 ID50 이상이다. 일부 실시양태에서는, 리간드의 프리온 결합 용량이 리간드 ml 당 약 102, 103, 104, 105, 106, 107, 또는 108 ID50 이상이다.
나노입자의 제조 방법
알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 함유하는 조성물의 제조 방법에 대해서는 업계에 알려져 있다. 예를 들면, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 및 알부민을 함유하는 나노입자는 고전단력의 조건 (예컨대 초음파처리, 고압 균질화 등)하에서 제조될 수 있다. 이러한 방법들에 대해서는 예를 들면 각각 그 전체가 의거 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제5,916,596호; 6,506,405호; 6,749,868호, 및 6,537,579호, 및 또한 U.S. 특허 공개 제2005/0004002호 및 2007/0082838호, 그리고 PCT 공개 WO99/00113호에 개시되어 있다.
대표적인 일 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 파클리탁셀)는 유기 용매에 용해된다. 적합한 유기 용매에는 예를 들면 케톤, 에스테르, 에테르, 염소화 용매, 및 업계에 알려져 있는 기타 용매가 포함된다. 예를 들면, 유기 용매는 염화 메틸렌일 수 있다. 소정 구현에에서, 유기 용매는 수비혼화성 용매 (예컨대 클로로포름)와 수혼화성 용매 (예컨대 수혼화성 알콜 용매)의 혼합물, 예컨대 클로로포름/메탄올, 클로로포름/에탄올, 클로로포름/프로판올, 또는 클로로포름/t-부탄올 (예를 들면 대략 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 또는 9:1 중 어느 것의 비 (v/v)를 가지거나, 또는 대략 3:7, 5:7, 4:6, 5:5, 6:5, 8:5, 9:5, 9.5:5, 5:3, 7:3, 6:4, 또는 9.5:0.5 중 어느 것의 비 (v/v)를 가짐)일 수 있다. 상기 용액은 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민)에 첨가된다. 상기 혼합물은 고압 균질화 (예컨대 표준 균질화 장치 사용)에 적용된다. 상기 에멀션은 약 2 내지 약 100 주기, 예컨대 약 5 내지 약 50 주기 또는 약 8 내지 약 20 주기 사이 (예컨대 대략 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20 주기 중 어느 것) 동안 고압 균질화기를 통하여 순환될 수 있다. 다음에, 비제한적으로 회전 증발기, 박막 증발기, 강하 막 증발기, 막 세척 증발기, 분무 건조기 등을 포함하여, 해당 목적으로 공지되어 있는 적합한 장비를 이용한 증발에 의해, 유기 용매가 제거될 수 있다. 용매는 예를 들면 감압에서 (예컨대 대략 5 mm Hg, 10 mm Hg, 15 mm Hg, 20 mm Hg, 25 mm Hg, 30 mm Hg, 40 mm Hg, 50 mm Hg, 100 mm Hg, 200 mm Hg, 또는 300 mm Hg 중 어느 것에서) 제거될 수 있다. 감압하에서 용매를 제거하는 데에 사용되는 시간의 양은 배합물의 부피를 기준으로 조정될 수 있다. 예를 들어 300 mL 규모로 제조된 배합물의 경우, 용매는 약 1 내지 약 300 mm Hg (예컨대 대략 5-100 mm Hg, 10-50 mm Hg, 20-40 mm Hg, 또는 25 mm Hg 중 어느 것)에서 약 5 내지 약 60분 (예컨대 대략 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 또는 30분 중 어느 것)을 포함하여, 약 1 내지 약 120분 동안 제거될 수 있다.
필요시에, 알부민 대 약물 (예컨대 파클리탁셀) 비를 조정하거나 분산액 중 탁산 (예컨대 파클리탁셀)의 농도를 조정하기 위하여, 알부민 용액 (예컨대 프리온-제거된 알부민 용액)이 분산액에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 알부민 용액 (예컨대 25 % w/v)이 첨가됨으로써, 알부민 대 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 파클리탁셀) 비가 대략 18:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7.5:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 또는 1:18 중 어느 것으로 조정될 수 있다. 예를 들면, 알부민 용액 (예컨대 25 % w/v) 또는 또 다른 용액이 첨가됨으로써, 분산액 중 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 파클리탁셀)의 농도가 대략 0.5 mg/ml, 1.3 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 또는 50 mg/ml 중 어느 것으로 조정된다. 상기 분산액은 1종 이상의 필터, 예컨대 1.2 ㎛, 0.8 ㎛, 0.45 ㎛, 및 0.22 ㎛ 필터; 이들 2종 이상의 조합, 또는 업계에 알려져 있는 임의의 다른 필터와의 조합을 통하여 개별적으로 또는 연속적으로 여과될 수 있다.
필요시에, 제2의 요법 (예컨대 암을 치료하는 데에 유용한 1종 이상의 화합물), 항미생물제 (예컨대 시트레이트 또는 에데테이트), 당 (예컨대 수크로스), 및/또는 안정화제가 조성물에 포함될 수도 있다. 이와 같은 첨가제는 조성물의 제조 동안에 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 파클리탁셀) 및/또는 알부민과 혼합될 수 있거나, 또는 나노입자 조성물이 제조된 후에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 제제가 동결건조 전에 나노입자 조성물과 혼합된다. 일부 실시양태에서, 제제는 동결건조된 조성물에 첨가된다. 제제의 첨가가 조성물의 pH를 변화시키는 일부 실시양태에서는, 조성물의 pH가 일반적으로 (필수적인 것은 아님) 원하는 pH로 조정된다. 대표적인 조성물의 pH 값에는 예를 들면 약 5 내지 약 8.5의 범위가 포함된다. 일부 실시양태에서, 조성물의 pH는 예컨대 약 6.5, 7, 또는 8 중 어느 것 이상 (예컨대 약 8)을 포함하여, 약 6 이상으로 조정된다.
하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 프리온-제거 과정은 제조 과정과 동시에 수행될 수 있다. 예를 들면, 프리온-제거 과정은 알부민과 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 혼합물이 형성된 후, 혼합물이 고전단 조건에 적용되기 전에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프리온 제거 과정은 혼합물이 고전단 조건에 적용된 후, 유기 용매의 제거 전에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 프리온-제거 과정이 유기 용매의 제거 후에 수행된다. 일부 실시양태에서는, 프리온-제거 과정 전에, 증발-후 현탁액에 추가 알부민이 첨가된다. 일부 실시양태에서는, 프리온-제거 과정이 멸균 조건하에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 프리온-제거 과정은 동시에 조성물을 멸균 여과하기도 하는 카트리지를 사용하여 수행된다.
나노입자 조성물 또는 중간 조성물로부터의 프리온의 제거 방법
일 측면에서, 본 발명은 상기한 방법에 의해 형성되는 나노입자 조성물과 같은 나노입자 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서는, 나노입자 제조 과정 동안 생성되는 중간 조성물 (이하, "중간 조성물"로 지칭됨)로부터의 프리온 단백질의 제거 방법이 제공된다.
일반적으로, 상기 방법은 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, 및 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 나노입자 조성물로부터 제거하는 것을 포함한다. 이와 같은 과정은 동일하거나 상이한 리간드를 사용하여 1회 이상 반복될 수 있다. 프리온 제거 과정 동안, 2종 이상의 리간드가 동시에 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물 또는 중간 조성물은 약 100 IU-ic/ml, 90 IU-ic/ml, 50 IU-ic/ml, 또는 10 IU-ic/ml의 프리온 감염성을 가진다.
프리온-제거 과정 동안, 리간드는 나노입자 조성물 또는 중간 조성물과 접촉됨으로써, 나노입자 조성물 또는 중간 조성물 중 프리온 단백질에 결합된다. 결합에 적합한 조건은, 리간드의 특성 및 프리온 단백질에 대한 그의 결합 특이성을 바탕으로, 프리온 단백질에 대한 리간드의 결합을 촉진하도록 결정 및 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합은 예를 들면 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃를 포함하여, 약 0 ℃ 내지 약 39 ℃의 온도에서 수행된다. 결합은 예를 들면 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 8, 약 6.8 내지 약 7.5, 약 6.9 내지 약 7.4, 또는 약 7을 포함하여, 약 4 내지 약 10의 pH에서 수행될 수 있다. 임의로, 리간드에 대한 비-특이적 결합을 감소시키기 위하여, 차단제가 사용될 수 있다.
접촉 단계 후, 리간드 및 그에 결합된 단백질은 나머지 조성물로부터 제거된다. 상기 제거는 리간드 및 분리를 용이하게 하기 위하여 사용되는 지지 재료 (존재할 경우)의 특성에 따라 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 리간드 및 그에 결합된 단백질은 비제한적으로 박층, 칼럼 및 배치 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피; 고체 지지체 및 멤브레인 분리; 반응기 분리; 자기 분리, 면역분리; 및 콜로이드 분리에 의해 분리 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는 비드 또는 멤브레인과 같은 지지 재료에 고정될 수 있으며, 그것은 다시 나노입자 조성물 또는 중간 조성물과 접촉된다. 리간드-고정 지지체는 프리온-리간드 복합체의 형성을 야기하기에 충분한 조건하에서 나노입자 조성물 또는 중간 조성물과 접촉된다. 다음에, 고체 상이 조성물로부터 분리됨으로써, 리간드에 결합된 프리온 단백질이 샘플로부터 제거된다. 예를 들어 대표적인 일 실시양태에서는, 크로마토그래피 칼럼과 같은 칼럼에 리간드가 고정된 다음, 중력, 또는 고압 액체 크로마토그래피 칼럼에서와 같은 압력하에서의 힘 중 어느 것으로 인하여 샘플 (예컨대 나노입자 조성물)이 칼럼으로 통과된다. 샘플 중 프리온 단백질은 칼럼에 고정된 리간드에 결합될 것이므로, 통과하는 샘플이 수집될 수 있다. 이와 같은 과정은 원하는 결과를 달성하기 위하여 수회 반복될 수 있다.
칼럼에서의 샘플 (예컨대 나노입자 조성물 또는 중간 조성물)의 유량은 리간드와 샘플 중 프리온 단백질의 결합이 최대화되도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합은 예를 들면 대략 분 당 0.1 ml, 분 당 0.25 ml, 분 당 0.5 ml, 분 당 1.0 ml, 분 당 1.5 ml, 분 당 1.7 ml, 분 당 1.8 ml, 분 당 1.9 ml, 분 당 2.0 ml, 분 당 2.1 ml, 분 당 2.3 ml, 분 당 2.5 ml, 분 당 2.7 ml, 분 당 3.0 ml, 분 당 3.5 ml, 분 당 4.0 ml, 분 당 4.5 ml, 또는 분 당 5.0 ml를 포함하여, 분 당 약 0.1 ml 내지 분당 약 5.0 ml, 분 당 약 0.1 ml 내지 분당 약 2.5 ml, 분 당 약 0.1 ml 내지 분당 약 0.25 ml, 분 당 약 0.25 ml 내지 분당 약 0.5 ml, 분 당 약 0.5 ml 내지 분당 약 1.0 ml, 분 당 약 1.0 ml 내지 분당 약 1.5 ml, 분 당 약 1.5 ml 내지 분당 약 2.0 ml, 분 당 약 2.0 ml 내지 분당 약 2.5 ml, 분 당 약 2.5 ml 내지 분당 약 3.0 ml, 분 당 약 3.0 ml 내지 분당 약 3.5 ml, 분 당 약 3.5 ml 내지 분당 약 4.0 ml, 분 당 약 4.0 ml 내지 분당 약 4.5 ml, 또는 분 당 약 4.5 ml 내지 분당 약 5.0 ml의 유량으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 유량은 분 당 약 10 ml 이상, 예컨대 대략 분 당 20 ml, 분 당 30 ml, 분 당 40 ml, 분 당 50 ml 중 어느 것 이상이다.
결합 과정 동안의 총 유통 부피 또는 총 유통 시간 역시 리간드와 샘플 (예컨대 나노입자 조성물 또는 중간 조성물) 중 프리온 단백질의 결합이 최대화되도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 유통 부피는 예를 들면 칼럼 부피의 약 50배 내지 약 500배, 칼럼 부피의 약 100배 내지 약 600배, 또는 칼럼 부피의 약 200배 내지 약 800배를 포함하여, 칼럼 부피의 약 50배 내지 약 1000배이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 부피는 칼럼 부피의 약 100배이다. 다른 실시양태에서, 총 유통 부피는 칼럼 부피의 약 500배이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 시간은 예를 들면 약 2시간 내지 약 25시간, 약 3시간 내지 약 20시간, 또는 약 3시간 내지 약 17시간을 포함하여, 약 1시간 내지 약 30시간이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 시간은 대략 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 또는 20시간 중 어느 것이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 시간은 약 24시간을 초과하는 것이다. 일부 실시양태에서, 총 유통 시간은 예를 들면 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0.5시간 중 어느 것을 포함하여, 약 8시간 미만이다.
다르게는, 프리온-리간드 복합체의 형성을 야기하기에 충분한 조건하에서 리간드가 먼저 나노입자 조성물 또는 중간 조성물과 접촉될 수 있다. 다음에 이어서, 프리온-리간드 복합체가 친화성-기반의 크로마토그래피와 같은 칼럼을 사용하여 제거된다. 분리를 용이하게 하기 위하여, 리간드가 결합 상대물에 결합됨으로써, 결합 상대물을 인식하는 분자를 함유하는 친화성 칼럼을 사용하는 것에 의해, 리간드/프리온 복합체가 제거될 수도 있다.
배치 또는 칼럼 크로마토그래피 이외에, 프리온 단백질 결합을 위한 리간드 사용의 다양한 구성, 변형 및 변종들도 예상된다. 그와 같은 변종 및 변형에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 배치 공정, 연속 공정, 이동 상 크로마토크래피 공정; 저압, 중간압 또는 고압 공정; 또는 소규모, 중간규모 또는 대규모 공정. 일부 실시양태에서, 리간드는 멤브레인, 부직 메시에 함침된 섬유 비드, 또는 필터 하우징에 내포된 코팅 섬유 상에 존재한다.
일부 실시양태에서, 상기 제거 단계는 유의성 있는 산출 손실, 및/또는 알부민의 특성 및/또는 안정성에 있어서의 변화를 초래하지 않는다. 실용적인 목적상, 그의 원래의 생물학적 상태에서의 알부민의 회수율은 예를 들면 80 %, 또는 90 % 이상을 포함하여, 적어도 50 %를 초과하는 수준까지 실질적으로 유지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 프리온 과정으로부터의 알부민의 회수율은 약 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것을 초과한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물 중 알부민의 농도는 비-특이적 결합 및 상기 과정 동안의 알부민의 손실을 최소화하기 위하여 프리온 제거 단계 이전에 조정 또는 조절된다. 예를 들면, 알부민의 농도는 예컨대 약 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 또는 30 %의 알부민을 포함하여, 약 1 % 내지 약 50 %, 약 5 % 내지 약 25 %, 약 5 % 내지 약 30 %, 약 5 % 내지 약 40 %, 약 5 % 내지 약 10 %, 약 10 % 내지 약 15 %, 약 15 % 내지 약 20 %, 약 20 % 내지 약 25 %, 약 25 % 내지 약 30 % 등의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제거 단계는 유의성 있는 산출 손실, 및/또는 조성물 중 나노입자의 특성 및/또는 안정성에 있어서의 변화를 초래하지 않는다.
일부 실시양태에서, 제거 단계는 유의성 있는 산출 손실, 및/또는 조성물 중 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 특성 또는 적재량에 있어서의 변화를 초래하지 않는다.
일부 실시양태에서, 제거 단계는 유의성 있는 조성물 중 알부민 대 실질적으로 수불용성인 약리 작용제의 비에 있어서의 변화를 초래하지 않는다.
프리온-제거 조성물은 프리온 제거 과정의 정화율을 측정하기 위하여 분석될 수 있다. 결합된 프리온 단백질을 가지는 리간드 역시 정화율을 측정하기 위하여 (바로 또는 용리 후에) 분석될 수 있다.
프리온 단백질의 제거는 프리온 단백질 농도의 감소 및/또는 감염성의 감소를 기준으로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 예를 들면 약 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 또는 100 % 이상을 포함하여, 약 50 % 이상의 프리온 단백질이 나노입자 조성물로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 제거-후 알부민 조성물의 감염성은 나노입자 조성물의 그것에 비해 약 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 80×, 100×, 200×, 500×, 1000×, 104×, 105×, 106× 이상 더 작다.
일부 실시양태에서는, 프리온 제거 과정의 정화율을 측정하는 데에 일련의 감염성이 사용된다. 일련 희석의 샘플을 제조하고, 예컨대 분석 동물에서의 감염 활성에 대하여 희석액들을 조사한다. 동물의 절반이 감염되는 희석이 감염가이다. 예를 들어, 5배 희석이 요구되는 경우, 샘플은 5 log의 감염성을 가지는 것으로 정의될 수 있다. 나노입자 조성물의 log 감염성과 제거-후 나노입자 조성물의 그것을 비교함으로써, 프리온 제거 과정의 정화율을 측정할 수 있다. 소정 구현에에서, 상기 프리온 제거 방법은 감염성의 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 log 중 어느 것의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 프리온-제거 과정의 정화율은 감염성 물질을 사용하는 첨가 실험을 기준으로 프리온-제거 방법에 대하여 본원에서 기술되는 하기의 단계들에 의해 측정된다. 적합한 첨가제에는 뇌 균질물, 마이크로좀, 카베올레-유사 도메인, 정제된 PrPsc, 및 프리온 피브릴이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 가용화된 세정제 (예컨대 가용화된 사르코실)이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 첨가 비는 예를 들면 약 0.001 %, 0.005 %, 0.075 %, 0.01 %, 0.1 %, 0.5 %, 0.75 %, 1 %, 2 %, 3 %, 또는 5 %를 포함하여, 약 0.001 % 내지 약 5 %, 약 0.001 % 내지 약 0.25 %, 약 0.001 % 내지 약 0.1 %, 약 0.001 % 내지 약 0.005 %, 약 0.005 % 내지 약 0.075 %, 약 0.075 % 내지 약 0.01 %, 약 0.01 % 내지 약 0.1 %, 약 0.1 % 내지 약 0.5 %, 약 0.5 % 내지 약 0.75 %, 약 0.75 % 내지 약 1 %, 약 1 % 내지 약 2 %, 약 2 % 내지 약 3 %, 또는 약 3 % 내지 약 5 %의 범위이다.
일부 실시양태에서는, 감소 계수 (RF)를 사용하여 프리온 제거 과정의 정화율이 측정된다. 상기 RF는 하기 수학식을 사용하여 계산될 수 있다:
RF = (V1×T1)/(V2×T2) 또는
Log10[RF] = [Log10(V1) + Log10(T1)] - [Log10(V2) + Log10(T2)]
여기서, V1 및 T1은 각각 최초 알부민 조성물의 부피 및 역가이며, V2 및 T2는 제거-후 알부민 조성물의 부피 및 역가이다. 감소 계수는 최종 계산 후 소수점 이하 1자리로 반올림될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 감소 계수 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 또는 8.0 log10 이상의 프리온 단백질 감염성이 최초 알부민 조성물로부터 제거된다. 예를 들면, 20 % 알부민 조성물에 첨가된 0.5 % 사르코실 가용화 분획에서, 2.5 log10 이상의 감소 계수로 프리온 단백질이 제거될 수 있다. 또 다른 예로서, 25 % 알부민 조성물에 첨가된 0.5 % 사르코실 가용화 분획에서, 2.0 log10 이상의 감소 계수로 프리온 단백질이 제거될 수도 있다.
표준 웨스턴 블롯 분석에 의해 프리온의 제거가 평가될 수 있다. 예를 들어, 결합-후의 리간드는 먼저 모든 PrPc를 분해하나 PrPsc는 분해하지 않는 프로테이나제 K로 처리될 수 있다. 다음에, SDS 겔 상에서 소화물을 전개시켜, 니트로셀룰로스 또는 PVDF 멤브레인 시트에 교차블롯팅한다. 다음에, 분리된 PrPsc 밴드를 3F4 또는 6H4를 사용하여 가시화한다. 3F4는 인간, 햄스터, 및 고양이 유래의 잔기 109-112 PrP와 반응한다. 대표적인 일 구현에에서는, 0.6 ㎍/ml의 농도로 최소 1시간 동안 배양을 수행하고, 그 후 과량의 항체를 세척 제거한 후, 토끼 항-마우스 양고추냉이 퍼옥시다제 접합체 (1:1000 희석)를 사용하여 최소 1시간 동안 멤브레인을 배양하였다. TTBS를 사용한 광범위한 세척 후, 강화된 화학발광을 사용하여 멤브레인을 현상하였다. 일부 실시양태에서는, 문헌 [Guideline for the Investigation of Manufacturing Processes for Plasma-Derived Medicinal Products with Regard to vCJD Risk (CPMP5136/03)]에 따라 프리온 단백질의 제거가 평가된다.
또한 본원에서 시도되는 것은 프리온 제거 과정 동안 제조되는 조성물이다. 예컨대 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하며, 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 추가로 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자, 및 프리온 단백질에 결합할 수 있으며 본원에서 기술되는 1종 이상의 지지 재료와 같은 지지 재료에 결합된 리간드를 포함하는 혼합물이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 적재된 칼럼이 제공되며, 상기 칼럼은 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자, 및 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 수지를 포함하는 조성물이 제공된다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자, 및 DVR 수지를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자, 및 PRDT 수지를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서는, 알부민 수용액과 유기 용매 중에 분산된 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 혼합물을 포함하며, 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 추가로 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 수용액과 유기 용매 중에 분산된 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 혼합물, 및 프리온 단백질에 결합할 수 있으며 본원에서 기술되는 1종 이상의 지지 재료와 같은 지지 재료에 결합된 리간드를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 알부민 수용액과 유기 용매 중에 분산된 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 혼합물을 포함하는 조성물이 적재된 칼럼이 제공되며, 상기 칼럼은 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다.
역시 제공되는 것은 본원에서 기술되는 방법에 의해 제조되는 조성물이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 프리온-제거 과정에 적용되지 않은 조성물과 생물학적으로 등가이다.
나노입자 조성물
본원에서 기술되는 나노입자 조성물은 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 파클리탁셀) (여러 실시양태에서, 필수적으로 이들로 구성됨)를 포함하는 나노입자를 포함한다. 수용성이 저조한 약물 (예컨대 탁산)의 나노입자에 대해서는 예를 들면 그 각각의 내용이 전체적으로 본원에 개재되는 U.S. 특허 제5,916,596호; 6,506,405호; 6,749,868호, 및 6,537,579호 및 또한 U.S. 특허 공개 제2005/0004002호 및 2007/0082838, 그리고 PCT 특허 출원 WO08/137148호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 약 1000 나노미터 (nm) 이하, 예컨대 대략 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 및 100 nm 중 어느 것 이하의 평균 또는 중간 직경을 가지는 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 평균 또는 중간 직경은 약 200 nm 이하이다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 평균 또는 중간 직경은 약 150 nm 이하이다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 평균 또는 중간 직경은 약 100 nm 이하이다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 평균 또는 중간 직경은 약 20 내지 약 400 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 평균 또는 중간 직경은 약 40 내지 약 200 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 멸균-여과성이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 조성물 중 나노입자는 예를 들면 대략 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 또는 60 nm 중 어느 것 이하를 포함하여, 약 200 nm 이하의 평균 직경을 가진다. 일부 실시양태에서는, 모든 조성물 나노입자의 약 50 % 이상 (예컨대 대략 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것 이상)이 예를 들면 대략 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 또는 60 nm 중 어느 것 이하를 포함하여, 약 200 nm 이하의 직경을 가진다. 일부 실시양태에서는, 모든 조성물 나노입자의 약 50 % 이상 (예컨대 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것 이상)이 예를 들면 약 30 내지 약 180 nm 중 어느 것, 및 약 40 내지 약 150, 약 50 내지 약 120, 및 약 60 내지 약 100 nm 중 어느 것을 포함하여, 약 20 내지 약 200 nm 범위에 속한다.
일부 실시양태에서, 조성물 나노입자 부분의 알부민 중 약 5 % 이상 (예컨대 대략 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 또는 90 % 중 어느 것 이상 포함)은 가교결합된다 (예컨대 하나 이상의 디술피드 결합을 통하여 가교결합됨).
일부 실시양태에서, 나노입자는 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민)에 의해 코팅된 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 파클리탁셀)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 비-나노입자 형태로 포함하며, 조성물 중 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 대략 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것 이상이 나노입자 형태이다. 일부 실시양태에서는, 나노입자 중 실질적으로 수불용성인 약리 활성제가 중량 기준으로 나노입자의 대략 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것을 초과하여 구성한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 비-중합체성 매트릭스를 가진다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 중합체성 재료 (예컨대 중합체성 매트릭스)가 실질적으로 없는 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 코어를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 알부민을 조성물 중 나노입자 부분 및 비-나노입자 부분 모두에 포함하며, 조성물 중 알부민의 대략 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 99 % 중 어느 것 이상이 조성물의 비-나노입자 부분에 존재한다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물에는 계면활성제 (예컨대 크레모포어®, 트윈 80, 또는 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 투여에 사용되는 기타 유기 용매)가 실질적으로 없다 (예컨대 없다). 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 대략 20 %, 15 %, 10 %, 7.5 %, 5 %, 2.5 %, 1 % 또는 그 미만 중 어느 것보다 적게 유기 용매를 함유한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물 중 알부민과 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비는 약 18:1 이하, 예컨대 약 15:1 이하, 예를 들면 약 10:1 이하이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 알부민과 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비는 약 1:1 내지 약 18:1, 약 2:1 내지 약 15:1, 약 3:1 내지 약 13:1, 약 4:1 내지 약 12:1, 약 5:1 내지 약 10:1 중 어느 것의 범위에 속한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 나노입자 부분 중 알부민과 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비는 대략 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:15 이하 중 어느 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민)과 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비는 하기 중 어느 것이다: 약 1:1 내지 약 18:1, 약 1:1 내지 약 15:1, 약 1:1 내지 약 12:1, 약 1:1 내지 약 10:1, 약 1:1 내지 약 9:1, 약 1:1 내지 약 8:1, 약 1:1 내지 약 7:1, 약 1:1 내지 약 6:1, 약 1:1 내지 약 5:1, 약 1:1 내지 약 4:1, 약 1:1 내지 약 3:1, 약 1:1 내지 약 2:1, 또는 약 1:1.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 상기 특성들 중 1종 이상을 포함한다.
본원에서 기술되는 나노입자는 건조 배합물 (예컨대 동결건조된 조성물)로서, 또는 생체적합성 매체 중에 현탁되어 존재할 수 있다. 적합한 생체적합성 매체에는 물, 버퍼링된 수성 매체, 식염수, 버퍼링된 식염수, 임의로 버퍼링된 아미노산 용액, 임의로 버퍼링된 단백질 용액, 임의로 버퍼링된 당 용액, 임의로 버퍼링된 비타민 용액, 임의로 버퍼링된 합성 중합체 용액, 지질-함유 에멀션 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 인간 혈청 알부민 (HSA)은 Mr65K의 고도로 가용성인 구상 단백질로써, 585개의 아미노산으로 구성된다. HSA는 혈장에서 가장 풍부한 단백질로써, 인간 혈장 콜로이드 삼투압의 70-80 %를 차지한다. HSA의 아미노산 서열은 총 17개의 디술피드 가교, 1개의 자유 티올 (Cys 34), 및 1개의 트립토판 (Trp 214)을 함유한다. HSA 용액의 정맥내 사용이 신생아 고빌리루빈혈증의 치료에서 교환 수혈과 함께 저혈량성 쇼크를 예방 및 치료하는 것으로 나타난 바 있다. 소 혈청 알부민과 같은 다른 알부민도 시도된다. 그와 같은 비-인간 알부민의 사용은 예를 들면 수의과 (애완동물 및 농업용 맥락 포함)와 같은 비-인간 포유동물에서의 이러한 조성물의 사용 맥락에서 적절할 수 있다.
인간 혈청 알부민 (HSA)은 다수의 소수성 결합 부위 (지방산용의 총 8개, HSA의 내생 리간드)를 가지며, 다양한 류의 실질적으로 수불용성인 약리 활성제, 특히 중성 및 음성으로 하전된 소수성 화합물에 결합한다. HSA의 하위도메인 IIA 및 IIIA에서 2개의 고도 친화성 결합 부위가 제기되어 있는데, 이들은 극성 리간드 특징을 위한 결합점으로 기능하는 표면 부근의 하전된 라이신 및 아르기닌 잔기를 가지는 고도로 연장된 소수성 포켓이다.
조성물 중 알부민은 일반적으로 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 위한 담체로서 기능하는데, 다시 말하자면 조성물 중 알부민은 알부민을 포함하지 않는 조성물에 비해 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 수성 매체 중에서 더 용이하게 현탁가능하도록 해주거나, 현탁액이 유지되는 것을 돕는다. 이는 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 가용화하기 위한 독성 용매 (또는 계면활성제)의 사용을 방지할 수 있으며, 그에 따라 개체 (예컨대 인간)에의 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 투여의 1종 이상 부작용을 감소시킬 수 있다. 따라서 일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 조성물에는 크레모포어 (크레모포어 EL® (바스프(BASF) 사) 포함)와 같은 계면활성제가 실질적으로 없다 (예컨대 없다). 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물에는 계면활성제가 실질적으로 없다 (예컨대 없다). 나노입자 조성물이 개체에 투여되었을 때, 조성물 중 크레모포어 또는 계면활성제의 양이 개체에서 1종 이상의 부작용(들)을 야기하기에 충분하지 않은 경우, 조성물에는 "크레모포어가 실질적으로 없거나" 또는 "계면활성제가 실질적으로 없다".
본원에서 기술되는 조성물 중 알부민의 양은 조성물 중 다른 성분들에 따라 달라지게 된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 수성 현택액 중에서, 예를 들면 안정한 콜로이드 현탁액 (예컨대 안정한 나노입자 현탁액) 형태로, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 안정화하기에 충분한 양으로 알부민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알부민은 수성 매체 중에서의 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 침강 속도를 감소시키는 양이다. 입자-함유 조성물의 경우, 알부민의 양은 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 나노입자의 크기 및 밀도에 따라서도 달라진다.
실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 그것이 대략 0.1, 0.2, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48, 60, 또는 72시간 중 어느 것 이상 동안과 같이 오랜 시간 기간 동안 수성 매체 중에서 (예컨대 눈에 보이는 침전 또는 침강 없이) 현탁되어 유지되는 경우에, 수성 현탁액 중에서 "안정화"된다. 현탁액은 일반적으로 (반드시 그런 것은 아니나) 개체 (예컨대 인간)에의 투여에 적합하다. 현탁액의 적합성은 일반적으로 (반드시 그런 것은 아니나) 저장 온도 (예컨대 실온 (예컨대 20-25 ℃) 또는 냉장 조건 (예컨대 4 ℃))에서 평가된다. 예를 들어, 현탁액의 제조 약 15분 후에 나안으로, 또는 광학 현미경하에서 1000배로 보았을 때 그것이 눈에 보이는 엉김 또는 입자 응집을 나타내지 않는 경우, 현탁액은 저장 온도에서 안정하다. 적합성은 약 40 ℃를 초과하는 온도에서와 같은 촉진된 시험 조건하에서 평가될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 알부민은 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 소정 농도에서 수성 현탁액 중에 안정화시키기에 충분한 양으로 존재한다. 예를 들어, 조성물 중 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 농도는 예컨대 약 0.1 내지 약 50 mg/ml, 약 0.1 내지 약 20 mg/ml, 약 1 내지 약 10 mg/ml, 약 2 mg/ml 내지 약 8 mg/ml, 약 4 내지 약 6 mg/ml, 약 5 mg/ml 중 어느 것을 포함하여, 약 0.1 내지 약 100 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 농도는 대략 1.3 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 및 50 mg/ml 중 어느 것 이상이다. 일부 실시양태에서, 알부민은 계면활성제 (예컨대 크레모포어)의 사용을 방지하는 양으로 존재하며, 그에 따라 조성물에는 계면활성제 (예컨대 크레모포어)가 없거나, 실질적으로 없다.
일부 실시양태에서, 액체 형태의 조성물은 약 0.1 % 내지 약 50 % (w/v) (예컨대 약 0.5 % (w/v), 약 5 % (w/v), 약 10 % (w/v), 약 15 % (w/v), 약 20 % (w/v), 약 25 % (w/v), 약 30 % (w/v), 약 40 % (w/v), 또는 약 50 % (w/v))의 알부민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 액체 형태의 조성물은 약 0.5 % 내지 약 5 % (w/v)의 알부민을 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물 중 알부민의 중량비, 예컨대 알부민 대 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비는 충분한 양의 실질적으로 수불용성인 약리 활성제가 세포에 결합하도록 하거나, 세포에 의해 수송되도록 하는 것이다. 알부민 대 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비가 여러 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 조합에 따라 최적화되어야 할 것이기는 하나, 일반적으로 알부민의 중량비, 예컨대 알부민 대 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 중량비 (w/w)는 약 0.01:1 내지 약 100:1, 약 0.02:1 내지 약 50:1, 약 0.05:1 내지 약 20:1, 약 0.1:1 내지 약 20:1, 약 1:1 내지 약 18:1, 약 2:1 내지 약 15:1, 약 3:1 내지 약 12:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 9:1이다. 일부 실시양태에서, 알부민 대 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 중량비는 대략 18:1 이하, 15:1 이하, 14:1 이하, 13:1 이하, 12:1 이하, 11:1 이하, 10:1 이하, 9:1 이하, 8:1 이하, 7:1 이하, 6:1 이하, 5:1 이하, 4:1 이하, 및 3:1 이하 중 어느 것이다.
일부 실시양태에서, 알부민은 조성물이 유의성 있는 부작용 없이 개체 (예컨대 인간)에게 투여되는 것을 가능케 한다. 일부 실시양태에서, 알부민은 인간에 대한 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 투여의 1종 이상 부작용을 감소시키는 데에 효과적인 양이다. "실질적으로 수불용성인 약리 활성제 투여의 1종 이상 부작용을 감소시키는 것"이라는 용어는 실질적으로 수불용성인 약리 활성제에 의해 야기되는 1종 이상의 바람직하지 않은 효과는 물론, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 전달하는 데에 사용되는 전달 운반체 (예컨대 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 주입에 적합하게 해주는 용매)에 의해 야기되는 부작용의 감소, 경감, 제거 또는 방지를 지칭한다. 그와 같은 부작용에는 예를 들면 골수억제, 신경독성, 과민, 염증, 정맥 자극, 정맥염, 통증, 피부 자극, 말초 신경병증, 호중구감소성 열, 아나필락시성 반응, 정맥 혈전증, 일혈, 및 이들의 조합이 포함된다. 그러나, 이러한 부작용들은 단순히 대표적인 것으로써, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제와 관련된 다른 부작용 또는 부작용들의 조합도 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 아브락산® (또는 Nab-파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 아브락산® (또는 Nab-파클리탁셀)이다. 아브락산®은 인간 알부민 USP에 의해 안정화된 파클리탁셀의 제제로써, 직접 주입가능한 생리학적 용액에 분산될 수 있다. 0.9 % 염화 나트륨 주사액, 또는 5 % 덱스트로스 주사액과 같은 적합한 수성 매체에 분산될 경우, 아브락산™은 파클리탁셀의 안정한 콜로이드 현탁액을 형성한다. 콜로이드 현탁액 중 나노입자의 평균 입자 크기는 약 130 나노미터이다. HSA가 물에 자유롭게 용해가능하기 때문에, 아브락산™은 예를 들면 약 2 mg/ml 내지 약 8 mg/ml, 약 5 mg/ml를 포함하여, 묽은 것 (0.1 mg/ml의 파클리탁셀)으로부터 농축된 것 (20 mg/ml의 파클리탁셀)까지 범위의 광범위한 농도로 재구성될 수 있다.
실질적으로 수불용성인 약리 활성제
본원에서 기술되는 조성물은 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함한다. 예를 들어, 약 20-25 ℃에서의 수용성이 저조한 제제의 물에서의 용해도는 예컨대 대략 5, 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05, 0.02, 또는 0.01 mg/ml 중 어느 것 미만을 포함하여, 약 10 mg/ml 미만일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 고체이다. 일부 실시양태에서는, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제가 액체이다. 본원에서 기술되는 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 예를 들면 제약 작용제, 진단 제제, 또는 영양가를 가지는 제제일 수 있다.
적합한 제약 작용제에는 항암제 또는 항신생물제, 항미세관제, 면역억제제, 마취제, 호르몬, 심혈관 장애에 사용하기 위한 제제, 항부정맥제, 항생제, 항진균제, 항고혈압제, 항천식제, 항-염증제, 항관절염제, 혈관작용제, 진통제/해열제, 항우울제, 항당뇨제, 항진균제, 항염증제, 항불안제, 면역억제제, 항편두통제, 진정제, 항협심증제, 항정신병제, 항조증제, 항관절염제, 항통풍제, 항응고제, 혈전용해제, 항섬유소용해제, 혈액순환개선제, 항혈소판제, 항경련제, 항파킨슨제, 항히스타민/항가려움제, 칼슘 조절에 유용한 제제, 항바이러스제, 항미생물제, 항감염제, 기관지확장제, 호르몬, 저혈당제, 저지질혈증제, 항궤양제/항역류제, 항구토제/진토제, 및 지용성 비타민 (예컨대 비타민 A, D, E, K 등)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 하기 중 어느 것이다: 티로신 키나제 억제제, 시리즈/트레오닌 키나제 억제제, 헤지호그 억제제, 토포이소머라제 억제제, 미세관 조립의 억제제, AKT 키나제 경로의 억제제, 프로테아좀 억제제, 항대사제, 및 백금-기제.
일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 항신생물제이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 화학요법제이다.
적합한 실질적으로 수불용성인 약리 활성제에는 탁산 (예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀, 오르타탁셀 및 기타 탁산들), 에포틸론(epothilone), 캄프토테신(camptothecin), 콜히친(colchicine), 젤라다나마이신(geladanamycin), 아미오다론(amiodarone), 갑상샘 호르몬, 암포테리신(amphotericin), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 프로포폴(propofol), 멜라토닌(melatonin), 시클로스포린(cyclosporine), 라파마이신(rapamycin) (시롤리무스(sirolimus)) 및 유도체, 타크롤리무스(tacrolimus), 미코페놀산(mycophenolic acid), 이포스파미드(ifosfamide), 비노렐빈(vinorelbine), 반코마이신(vancomycin), 젬시타빈(gemcitabine), SU5416, 티오테파(thiotepa), 블레오마이신(bleomycin), 진단용 방사성조영제, 및 이들의 유도체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명 조성물에 유용한 기타 실질적으로 수불용성인 약리 활성제에 대해서는 예를 들면 U.S. 특허 제5,916,596호, 6,096,331호, 6,749,868호, 및 6,537,539호에 기술되어 있다. 실질적으로 수불용성인 약리 활성제의 추가적인 예로는 수용성이 저조한 것으로써 문헌 ["Therapeutic Category and Biological Activity Index" of The Merck Index (12th Edition, 1996)]에 열거되어 있는 화합물들이 포함된다.
일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 파클리탁셀, 도세탁셀, CY196, 오르타탁셀 또는 기타 탁산 또는 탁산 유사체, 17-알릴 아미노 젤다나마이신 (17-AAG), 18-유도화 젤다나마이신, 캄프토테신, 프로포폴, 아미오다론, 시클로스포린, 에포틸론, 라디시콜, 콤브레타스타틴, 라파마이신, 암포테리신, 리오티로닌, 에포틸론, 콜히친, 티오콜히친 및 그의 이량체, 갑상샘 호르몬, 혈관작용 장 펩티드, 코르티코스테로이드, 멜라토닌, 타크롤리무스, 미코페놀산, 에포틸론, 라디시콜, 콤브레타스타틴, 및 이들의 유사체 또는 유도체 중 어느 것이다 (일부 실시양태에서는, 이들로 구성되는 군에서 선택됨). 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 파클리탁셀, 도세탁셀, CY196, 오르타탁셀 또는 기타 탁산, 젤다나마이신, 17-알릴 아미노 젤다나마이신, 티오콜히친 및 그의 이량체, 라파마이신, 시클로스포린, 에포틸론, 라디시콜, 및 콤브레타스타틴 중 어느 것이다 (일부 실시양태에서는, 이들로 구성되는 군에서 선택됨). 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 라파마이신이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 17-AAG이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 티오콜히친 이량체 (예컨대 IDN5404)이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 도세탁셀이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 CY196이다.
일부 실시양태에서, 실질적으로 수불용성인 약리 활성제는 탁산 또는 그의 유도체로써, 여기에는 파클리탁셀, 도세탁셀 및 IDN5109 (오르타탁셀), 또는 이들의 유도체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 조성물은 비-결정질 및/또는 비정질의 탁산 (예컨대 파클리탁셀 또는 그의 유도체)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 무수 탁산 (예컨대 무수 도세탁셀 또는 그의 유도체)을 사용하여 제조된다. 무수 도세탁셀은 도세탁셀 3수화물 또는 반-수화물과 같은 수화 도세탁셀을 사용하여 제조될 수 있는 것에 비해 더 안정한 제제를 산출하는 것으로 밝혀졌다.
나노입자 조성물 중 기타 성분
본원에서 기술되는 나노입자는 다른 제제, 부형제, 또는 안정화제들을 포함하는 조성물 중에 존재할 수 있다. 예를 들면, 나노입자의 음성 제타 전위를 증가시킴으로써 안정성을 증가시키기 위하여, 소정의 음성으로 하전된 성분이 첨가될 수 있다. 그와 같이 음성으로 하전된 성분에는 글리코콜산, 콜산, 케노데옥시콜산, 타우로콜산, 글리코케노데옥시콜산, 타우로케노데옥시콜산, 리토콜산, 우르소데옥시콜산, 데히드로콜산 및 그밖의 것으로 구성되는 담즙산의 담즙염; 하기의 포스파티딜콜린들을 포함하는 레시틴 (난황) 기재 인지질을 포함한 인지질들: 팔미토일올레오일포스파티딜콜린, 팔미토일리놀레오일포스파티딜콜린, 스테아로일리놀레오일포스파티딜콜린, 스테아로일올레오일포스파티딜콜린, 스테아로일아라키도일포스파티딜콜린, 및 디팔미토일포스파티딜콜린이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 기타 인지질에는 L-a-디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 수소화 대두 포스파티딜콜린 (HSPC), 및 기타 관련 화합물들이 포함된다. 음성으로 하전된 계면활성제 또는 에멀션화제, 예컨대 나트륨 콜레스테릴 술페이트 등 역시 첨가제로서 적합하다.
일부 실시양태에서, 조성물은 인간에의 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 수의과 맥락에서 애완동물 및 가축과 같은 포유동물에의 투여에 적합하다. 매우 다양한 나노입자 조성물의 적합한 제제가 존재한다 (예컨대 U.S. 특허 제5,916,596호 및 6,096,331호 참조). 하기의 제제 및 방법들은 단순히 대표적인 것으로써, 어떠한 방식으로도 제한하는 것은 아니다. 경구 투여에 적합한 제제는 (a) 물, 식염수, 또는 오렌지 쥬스와 같은 희석제에 용해된 유효량의 화합물과 같은 액체 용액, (b) 각각 사전결정량의 활성 성분을 고체 또는 과립으로서 함유하는 캡슐, 사셰 또는 정제, (c) 적절한 액체 중의 현탁액, 및 (d) 적합한 에멀션으로 구성될 수 있다. 정제 형태는 락토스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 미세결정질 셀룰로스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화 규소, 크로스카르멜로스 나트륨, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 및 기타 부형제, 착색제, 희석제, 버퍼링제, 보습제, 보존제, 향미제, 및 약리학적 상용성인 부형제 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 향미제, 보통 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트는 물론, 불활성 기제, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 중에 활성 성분을 포함하는 방향제, 또는 활성 성분 이외에도 업계에 알려져 있는 바와 같은 부형제들을 함유하는 수크로스 및 아카시아, 에멀션, 겔 등에 활성 성분을 포함할 수 있다.
적합한 담체, 부형제, 및 희석제의 예에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 식염수 용액, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸- 및 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 및 무기 오일이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제제는 추가로 윤활제, 침윤제, 에멀션화제 및 현탁제, 보존제, 감미제 또는 향미제를 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제에는 항산화제, 버퍼, 정균제, 및 제제를 예정된 수용자의 혈액과 상용성이 되도록 하여 주는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성의 등장 멸균 주입 용액, 그리고 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성의 멸균 현탁액이 포함된다. 제제는 단위-투여량 또는 다수-투여량 밀봉 용기, 예컨대 앰풀 및 바이알에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균된 액체 부형제, 예컨대 주입용 물의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조된 (동결건조된) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주입 용액 및 현탁액은 전기한 종류의 멸균된 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 주입가능 제제가 바람직하다.
일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들면 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 및 약 6.5 내지 약 7.0 중 어느 것의 pH 범위를 포함하여, 약 4.5 내지 약 9.0의 pH 범위를 가지도록 제제화된다. 일부 실시양태에서, 조성물의 pH는 예를 들면 대략 6.5, 7, 또는 8 중 어느 것 (예컨대 약 8) 이상을 포함하여, 약 6 이상으로 제제화된다. 조성물은 또한 글리세롤과 같은 적합한 장성 개질제의 첨가에 의해 혈액과 등장이 되도록 제조될 수 있다.
무- 프리온 나노입자 조성물의 사용 방법
본원에서 기술되는 무-프리온 조성물의 사용 방법 역시 제공된다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 투여 방법이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물 유효량을 투여하는 것을 포함하는 질병 (예컨대 암)의 치료 방법이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 투여 방법이 제공되며, 조성물 중 상기 알부민은 프리온-제거 과정을 포함하는 방법에 의해 수득되고, 상기 프리온-제거 과정은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프리온 제거 과정은 상기 알부민 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 질병 (예컨대 암)의 치료 방법이 제공되며, 조성물 중 상기 알부민은 프리온-제거 과정을 포함하는 방법에 의해 수득되고, 상기 프리온-제거 과정은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 개체는 vCJD를 보유한다. 일부 실시양태에서, 개체는 이미 프리온 단백질에 감염되어 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 vCJD를 보유하거나 프리온 단백질에 감염된 것으로 의심된다. 일부 실시양태에서, 개체는 프리온 단백질의 무증상 보유자이다. 일부 실시양태에서, 개체는 1회 이상 혈액 수혈을 받은 바 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 60세 이상의 연령, 예컨대 약 65, 70, 또는 75세 이상의 연령이다. 일부 실시양태에서, 개체는 면역이 손상되어 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 암 환자이다.
본원에서 사용되는 "유효량"이라는 용어는 1종 이상의 해당 증상을 개선, 완화, 경감, 및/또는 지연시키는 것과 같이, 특정 장애, 이상 또는 질병을 치료하기에 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 암 또는 기타 원치 않는 세포 증식과 관련하여, 유효량은 종양의 축소 및/또는 종양의 성장 속도 감소 (예컨대 종양 성장을 억제하는 것)를 야기하기에 충분한 양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유효량은 발병을 지연하기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 발병 및/또는 재발을 예방하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에서 기술되는 조성물 (예컨대 탁산, 라파마이신, 및 17-AAG와 같은 항신생물제를 포함하는 조성물)에 의해 치료될 암에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 기술되는 조성물에 의해 치료될 수 있는 암의 예에는 편평 세포암, 폐암 (소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐의 샘암종, 및 편평 NSCLC를 포함한 폐의 편평 암종 포함), 복막의 암, 간세포암, 위장암 또는 위암 (위장관암 포함), 췌장암 (예컨대 진행성 췌장암), 아교모세포종, 경부암, 난소암, 간암 (예컨대 간세포 암종), 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 흑색종, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장 또는 콩팥암, 간암, 전립샘암 (예컨대 진행성 전립샘암), 외음암, 갑상샘암, 간 암종, 두부 및 경부 암, 결장직장암, 직장암, 연-조직 암종, 카포시 암종, B-세포 림프종 (저 등급/소포 비-홋킨스 림프종 (NHL), 소형 림프구 (SL) NHL, 중간 등급/소포 NHL, 중간 등급 확산 NHL, 고등급 면역모세포 NHL, 고등급 림프모세포 NHL, 고등급 소형 비-절단 세포 NHL, 거대 종양(bulky disease) NHL, 외투 세포 림프종, AIDS-관련 림프종, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 급성 림프구 백혈병 (ALL), 골수종, 헤어리 세포 백혈병, 만성 골수모세포 백혈병, 및 이식-후 림프증식성 장애 (PTLD)는 물론, 모반증, 부종 (예컨대 뇌종양과 관련된 것), 및 메이그 증후군과 관련된 비정상적인 혈관 증식이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서는, 전이성 암 (즉, 1차 종양으로부터 전이된 암)의 치료방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 세포 증식 및/또는 세포 이동의 감소 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 과다형성의 치료 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서는, 진행 단계(들)에서의 암의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 예컨대 진행성 유방암, 단계 IV 유방암, 국소 진행성 유방암, 및 전이성 유방암을 포함한 유방암 (HER2 양성 또는 HER2 음성일 수 있음)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 암은 예컨대 비-소형 세포 폐암 (NSCLC, 예컨대 진행성 NSCLC), 소형 세포 폐암 (SCLC, 예컨대 진행성 SCLC), 및 폐에서의 진행성 고형 악성 종양을 포함한 폐암이다. 일부 실시양태에서는, 암이 난소암, 두부 및 경부 암, 악성 위암, 흑색종 (전이성 흑색종 포함), 결장직장암, 췌장암, 및 고형 종양 (예컨대 진행성 고형 종양)이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소형 세포 폐암, 비-홋킨스 림프종 (NHL), 신장 세포암, 전립샘암, 간암, 췌장암, 연-조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두부 및 경부 암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교종, 아교모세포종, 신경모세포종, 및 다발 골수종 중 어느 것이다 (일부 실시양태에서는, 이들로 구성되는 군에서 선택됨). 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다.
이러한 조성물을 수용하는 데에 적합한 개체는 수용성이 저조한 제약 작용제는 물론, 치료 및/또는 예방될 질병/이상/장애의 특성에 따라 달라진다. 따라서, 개체라는 용어에는 척추동물, 포유동물, 및 인간 중 어느 것이 포함된다. 일부 실시양태에서, 개체는 비제한적으로 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 또는 영장류를 포함한 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 개체는 인간이다.
개체 (예컨대 인간)에 투여되는 본 발명 조성물의 투여량은 구체적인 조성물, 투여 방법, 및 치료되는 구체적인 질병에 따라 달라지게 된다. 투여량은 특정 질병에 대한 치료 또는 예방 반응과 같은 바람직한 반응을 이끌어내기에 충분해야 한다. 예를 들면, 조성물 중 파클리탁셀의 투약량은 3주 일정으로 주어지는 경우 100-400 mg/m2, 또는 매주 일정으로 주어지는 경우 50-250 mg/m2의 범위일 수 있다. 또한, 규칙적인 처방계획 (예컨대 매일 또는 주 당 수회)으로 주어지는 경우, 투약량은 약 5-75 mg/m2의 범위일 수 있다.
본원에서 기술되는 조성물은 예컨대 정맥내, 동맥내, 폐내, 문내, 간내, 경구, 흡입, 소포내, 근육내, 기관내, 피하, 안내, 건초내, 점막경유, 및 경피를 포함한 다양한 경로들을 통하여 개체 (예컨대 인간)에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명 조성물은 기도의 이상을 치료하기 위하여 흡입에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 폐 섬유증, 폐쇄성 기관지염, 폐암, 기관지폐포 암종 등과 같은 호흡 이상들을 치료하는 데에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물의 투여는 프리온-제거 필터와 연계하여 수행된다.
본원에서 또한 제공되는 것은 나노입자 조성물의 투여와 관련된 부작용의 감소 방법이다. 예를 들면, 본 발명은 비제한적으로 골수억제, 신경독성, 과민, 염증, 정맥 자극, 정맥염, 통증, 피부 자극, 말초 신경병증, 호중구감소성 열, 아나필락시성 반응, 혈액학적 독성, 및 뇌 또는 신경학적 독성, 및 이들의 조합을 포함하여, 수용성이 저조한 제약 작용제의 투여와 관련된 여러 부작용의 감소 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 예컨대 중증 피부 발진, 두드러기, 홍조, 호흡곤란, 빈맥 등을 포함하여, 수용성이 저조한 제약 작용제의 투여와 관련된 과민 반응의 감소 방법이 제공된다.
키트 및 시스템
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 무-프리온 나노입자 조성물을 포함하는 1종 이상의 용기를 포함하며, 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 방법들 중 어느 것에 따라 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 상기 키트는 적합한 개체 또는 치료의 선택에 관한 설명서를 추가로 포함할 수도 있다. 본 발명의 키트에서 제공되는 지침은 통상적으로는 라벨 또는 포장 삽입물 (예컨대 키트에 포함되어 있는 종이 시트) 상에 기재된 지침이지만, 기계-해독가능 지침 (예컨대 자기 또는 광학 저장 디스크에 담긴 지침) 역시 허용가능하다.
본 발명의 키트는 적합한 포장 내에 존재한다. 적합한 포장에는 바이알, 병, 자아(jar), 유연성 포장 (예컨대 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 키트는 임의로 버퍼 및 통역 정보와 같은 추가적인 구성요소를 제공할 수 있다.
나노입자 조성물의 사용과 관련한 지침은 일반적으로 예정된 치료를 위한 투약량, 투여 일정, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 투여량, 대량 포장 (예컨대 다수-투여량 포장) 또는 하위단위 투여량일 수 있다. 예를 들면, 1주, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 7개월, 8개월, 9개월 이상 중 어느 것과 같은 오랜 기간 동안 효과적인 개체의 치료를 제공하기 위하여, 충분한 투약량의 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 실질적으로 수불용성인 약리 활성제)를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 키트는 또한 다수 단위 투여량의 실질적으로 수불용성인 약리 활성제 및 제약 조성물 및 사용 지침을 포함하여, 약국, 예컨대 병원 약국 및 조제 약국에서 저장 및 사용하기에 충분한 양으로 포장될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하기 위한 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 지지 재료를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 나노입자 조성물로부터 프리온을 제거하는 데에 리간드를 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다.
또한 제공되는 것은 본원에서 기술되는 방법을 수행하기 위한 시스템이다. 예를 들어 일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 무-프리온 나노입자 조성물의 제조 시스템이 제공되며, 상기 시스템은 1) 나노입자 조성물을 제조하기 위한 장치; 및 2) 나노입자 조성물을 제조하는 데에 사용되는 알부민으로부터 프리온 단백질을 제거하기 위한 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물을 제조하는 데에 사용되는 상기 알부민으로부터 프리온 단백질을 제거하기 위한 장치는 나노입자 조성물을 제조하기 위한 장치에 통합된다. 일부 실시양태에서는, 나노입자 조성물을 제조하기 위한 장치가 나노입자 조성물을 제조하는 데에 사용되는 알부민으로부터 프리온 단백질을 제거하기 위한 장치로부터 분리된다.
일부 실시양태에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 무-프리온 나노입자 조성물의 제조 시스템이 제공되며, 상기 시스템은 1) 나노입자 조성물을 제조하기 위한 장치; 및 2) (예컨대 나노입자의 제조 동안 생성되는 중간 조성물로부터, 또는 생성된 나노입자 조성물로부터) 프리온 단백질을 제거하기 위한 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프리온 단백질을 제거하기 위한 장치는 나노입자 조성물을 제조하기 위한 장치에 통합된다. 일부 실시양태에서는, 나노입자 조성물을 제조하기 위한 장치가 프리온 단백질을 제거하기 위한 장치로부터 분리된다.
업계 숙련자라면, 본 발명의 영역 및 기술사상 내에서 수종의 실시양태가 가능하다는 것을 알고 있을 것이다.
문헌, 특허 출원, 및 특허들을 포함하여, 본원에서 인용되는 모든 참고문헌들은 각 참고문헌이 참조로 개재되는 것으로 개별적으로 그리고 구체적으로 표시되고 그 전체가 본원에 제시되어 있는 것과 동일한 정도까지 의거 참조로 개재된다.
지금부터, 본 발명자들이 알고 있는 본 발명을 수행하기 위한 최상의 양식을 포함하여, 본 발명의 바람직한 실시양태를 기술한다. 바람직한 실시양태에서의 구현에 대해서는 전기한 상세한 설명을 읽게 되면 업계 일반의 숙련자에게 분명해질 수 있을 것이다. 본 발명자들은 숙련 기술자가 해당 실시양태를 적절하게 사용할 것으로 기대하는 바, 본 발명자들은 본 발명이 본원에서 구체적으로 기술된 것과 다르게 실행될 것을 예상한다. 따라서, 적용 법령에 의해 허용되는 바와 같이, 본 발명은 거기에 첨부된 청구항에서 언급되는 주제의 모든 변형 및 등가물들을 포함한다. 또한, 본원에서 다르게 표시되거나 아니면 문맥상 명백하게 부정되지 않는 한, 모든 가능한 해당 실시양태에서 상기한 요소들의 어떠한 조합도 본 발명에 의해 포괄된다.
본 출원의 대표적인 실시양태
일 측면에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물에는 프리온 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 100 fg/ml 미만의 프리온 감염성을 가진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상기한 조성물들 중 어느 것이며, 약 10 IU-ic/ml 미만의 프리온 감염성을 가진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상기한 조성물들 중 어느 것이며, 단백질 오형성 주기적 증폭 (PMCA) 분석 또는 IPCR 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상기한 조성물들 중 어느 것이며, 프리온 단백질에 결합할 수 있는 미량의 리간드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상기한 조성물들 중 어느 것이며, 미량의 지지 재료를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 조성물 중 알부민은 프리온 제거 과정을 포함하는 방법에 의해 수득되고, 상기 프리온 제거 과정은 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프리온 제거 과정은 상기 알부민 및 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 트리아진-기재 화합물이다.
또 다른 측면에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다: a) 최초 알부민 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것; b) 프리온-제거 알부민을 포함하는 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것. 일부 실시양태에서, 단계 a)는 하기를 포함한다: 1) 최초 알부민 용액을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 단계 a)는 하기를 추가로 포함한다: 2) 알부민 용액으로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 방법은 상기한 방법들 중 어느 것이며, 상기 혼합물로부터 유기 용매를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기 용매의 상기 제거는 증발에 의한다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기한 방법들 중 어느 것이며, 상기 리간드는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기한 방법들 중 어느 것이며, 상기 리간드는 트리아진-기재 화합물이다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기한 방법들 중 어느 것이며, 최초 알부민 조성물은 혈액 유래 생성물이다.
또 다른 측면에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 하기를 포함한다; a) 상기 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것, 및 b) 상기 혼합물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 단계 b)는 하기를 포함한다: 1) 상기 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것. 일부 실시양태에서, 단계 b)는 하기를 추가로 포함한다: 2) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 트리아진-기재 화합물이다.
또한 제공되는 것은 청구항 제11-23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 조성물이다. 또한 제공되는 것은 상기한 조성물들 중 어느 것의, 암과 같은 질병의 치료를 위한 용도이다.
또 다른 측면에서는, 프리온 단백질을 함유하는 것으로 의심되며, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: a) 상기 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, b) 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것. 일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 트리아진-기재 화합물이다. 또한 제공되는 것은 방법 후 수득되는 조성물이다.
또 다른 측면에서는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하며, 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 추가로 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 트리아진-기재 화합물이다.
비제한적으로 본 발명을 예시하기 위하여, 하기의 실시예들을 제공한다. 본원에서 기술되는 실시예는 예시만을 목적으로 한다는 것, 및 업계 숙련자라면, 그에 비추어 다양한 변형 및 변경들이 제기될 것인 바, 본 출원의 기술사상 및 범위 내로 포괄되어야 한다는 것이 양해된다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 알부민 제제로부터의 프리온 단백질 제거를 위한 친화성 흡착제의 개발
본 연구에서는, 2종의 상이한 농도 (0.01 % 또는 0.005 %)로 스크래피 햄스터 뇌 균질물이 첨가된 시중에서 구입가능한 2종의 상이한 알부민 제제 (20 % w/v 또는 25 % w/v 알부민 함유)를 사용하여 4종의 수지 패널을 시험함으로써, 4종의 프리온 결합 리간드 수지 패널을 스크리닝하였다. 상기 4종의 수지 패널은 이미 PRDT (파토젠 리무벌 앤드 디아그노스틱 테크놀로지스(Pathogen Removal and Diagnostic Technologies) Inc 사; 프로메틱 바이오사시언시즈(ProMetic Biosciences) Ltd. 사, UK 캠브리지 소재)에 의해 25 % 알부민 존재하에서 우수한 프리온 결합제인 것으로 확인되어 있다. 최적 수지의 선택은 알부민 나노입자 제조에서의 프리온-감소 단계의 도입을 최적화할 수 있다.
방법론
소르벤트 아이덴티피케이션(Sorbent Identification) (PIKSI™, 프로메틱 바이오사이언시즈 Ltd 사) 키트용 6종 단백질 분리 키트에 4종 PRDT 수지 및 대조 수지 (토요펄 아미노 AMN31) 각각의 12개 칼럼 (약 0.5 mL)을 구비시켰다. 프리온 단백질에 대한 각 수지의 결합 능력을 평가하기 위하여, 3개-칼럼 일련 체제로 0.01 % 또는 0.005 % 스크래피 햄스터 뇌 균질물 (SBH)이 첨가된 20 % 및 25 % 알부민을 함유하는 용액을 사용하여, 각 수지를 시험하였다. 수지 성능의 비교는 웨스턴 블롯 및 농도측정에 의해 측정하였을 때의 프리온 단백질 결합을 기준으로 하였다. 총 단백질 결합 프로파일은 SDS-PAGE 겔에 의해 측정하였다. 결합된 단백질은 프리온 단백질 결합 및 총 단백질 결합 검출 양자를 위하여 수지로부터 탈거하였다. 알부민 결합은 280 nm 에서의 흡광도를 측정하는 나노드롭(NanoDrop)® ND-1000 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE 겔에서 관찰된 신호는 각각 프리온 단백질 및 총 단백질의 결합 분획에 해당하였다.
본 발명에서 사용된 시중의 알부민 제제는 알부민 (인간) U.S.P. 휴먼 알부민 그리폴스(Human Albumin Grifols)® 20 %, Lot No. IBAB8MJ001, 및 알부민 (인간), USP, 25 % 용액 박스터(Baxter), Lot No. LA06D04AA이었다.
결과
웨스턴 블롯 및 SDS - PAGE
수득된 결과는 4종의 수지 모두가 20 % 또는 25 % 인간 알부민 용액에 첨가된 PrPsc에 결합하였음을 나타내었다. 웨스턴 블롯 (도 1-3)에서의 PrPsc 신호 강도는 프리온 결합이 DVR, 이어서 YVHEA, SYA, 및 D4 수지 순서로 가장 강하였음을 암시하였다. 대조 수지 AMN31은 예상대로 강한 신호를 가졌다. DVR 수지를 사용하여 수득된 신호의 수준은 고농도의 알부민이 프리온 결합을 방해하지 않았음을 암시하였다.
제2 및 제3 칼럼에서는, DVR을 사용하여 (도 1) 다양한 조건에서 시험하였을 경우, 더 긴 노출 시간으로 시험하였을 때에도 검출가능한 신호가 관찰되지 않았는데, 이는 모든 검출 가능한 PrPsc가 제1 DVR 칼럼에 의해 포획되었음을 나타낸다.
다른 수지의 경우, 제1 칼럼에서 신호 강도가 약하여, 일련의 제2 칼럼에서 프리온 단백질이 검출됨으로써 (도 2 및 3), 프리온 단백질 결합에 대한 알부민의 방해가 가능하였음을 암시하였다. 제3 칼럼에서는, 3종의 리간드 모두가 프리온 신호를 나타내지 않음으로써, 수지가 SBH 첨가된 알부민 용액으로부터 프리온을 선택적으로 제거할 수 있다는 것을 표시하였다. 햄스터 뇌에서의 PrPsc의 농도는 0.01 % SBH 중 약 5 ng/ml의 PrPsc와 등가인 약 50 ㎍/g로써, 250 mg/ml의 알부민 용액에 첨가되었을 때, 50,000,000-배 과량의 알부민을 생성시켰다.
쿠마시(Coomassie)-염색 SDS-PAGE 겔 (도 1 내지 3)에서 관찰된 총 단백질 패턴은 DVR이 나머지 프리온-결합 수지들에 비해 훨씬 더 낮은 총 단백질 결합 수준을 가진다는 것을 보여주는데, 총 단백질 겔에서의 대부분의 관찰된 밴드가 뇌 균질물 첨가로부터 유래하였다는 사실에도 불구하고, 이는 장점으로 생각된다. 예상했던 바와 같이, DVR 겔에서의 눈에 보이는 1개의 단백질 밴드는 분명하게 알부민과 유사한 분자량 (66.5 KDa)을 가졌다.
농도측정
프리온 제거는 수지에 결합된 PrPsc의 농도측정 신호 대 SBH가 첨가된 알부민 용액에 존재하는 신호의 비를 계산하는 것에 의해 간접적으로 평가되기도 하였다. 프리온에 결합하는 DVR 수지의 능력은 제1 칼럼에서 대략 모든 가용한 PrPsc를 흡착하는 양성 대조 수지에 필적하였다. 프리온 결합의 척도로서 감염 투여량을 사용할 경우, 0.5 mL의 DVR 칼럼은 10 mL의 SBH-첨가 알부민 용액에서 프리온을 제거할 수 있었는데, 0.1 % SBH가 약 106 ID50/mL를 함유한다는 것을 고려하면, 이는 약 106 ID50과 등가이다. 웨스턴 블롯에서 관찰된 것과 마찬가지로, DVR은 프리온 결합에 있어서 YVHEA, D4, 및 SYA에 비해 최상의 성능을 가졌다. 3종의 수지 모두가 SBH-첨가 알부민 용액에 존재하는 임의의 검출가능한 프리온 단백질에 추가로 결합하기 위하여, 각 일련 중 제2 칼럼을 필요로 하였다.
알부민 결합
단백질 정량을 위하여 나노드롭® ND-1000 분광광도계를 사용하여 280 nm 흡광도로 알부민 농도를 측정하였다. SBH-첨가 알부민 용액을 4종의 수지 (DVR, YVHEA, SYA, 및 D4) 및 대조 수지 (AMN31) 각각으로 통과시킨 후, 각 유통을 알부민 농도에 대하여 측정하였다. 수지 칼럼으로 유통시키기 전에, 0.01 % 또는 0.005 % SBH 첨가물의 부재 또는 존재하에 20 % 및 25 %인 시중 알부민 용액의 단백질 농도를 측정하였다. 수득된 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure pct00009
시중 알부민 용액의 농도는 특히 20 % w/v 알부민 용액을 함유하는 제제에서 시중에 라벨화되어 있는 값보다 더 높게 측정되었다. 그러나, 본 연구는 비교용 값을 다룬 것이므로, 그것을 고려하지는 않았다. 단백질 농도를 측정함에 있어서, 3개 값의 평균을 수득하였으며, 첨가물의 양은 용액에 존재하는 알부민의 양에 비해 무시할 만한 것으로 간주하였다. SBH-첨가된 알부민 용액을 표 4 및 5에 나타낸 바와 같은 수지로 유통시킨 후, 알부민의 농도를 수득하였다.
Figure pct00010
Figure pct00011
시험된 수지 중 어느 것도 유의성 있는 알부민 손실을 나타내지 않았다. 사실상, 대부분의 조건에서 손실이 검출되지 않았다. 관측된 값은 약 ±5 %의 변이를 나타내었다. 상기 데이터는 알부민 손실이 시험된 조건 범위 내에서는 이와 같은 규모에서 거의 수지들 중 하나를 선택하는 인자가 아님을 암시한다.
결론
수득된 결과를 기준으로 볼 때, 시중의 알부민 용액으로부터 프리온을 제거함에 있어서, DVR이 4종의 시험된 수지들 중 최상의 수지이다. 상기 수지는 0.5-mL 칼럼에서 약 106 ID50을 제거할 수 있다. 이와 같은 값은 다른 연구에서의 이전의 시도에서 수득된 것과 유사하다. 20 또는 25 % 알부민/수지를 사용한 시도에서 시험된 20의 시험 비에서는, 거의 알부민 손실이 검출되지 않았다. 알부민 결합은 공정 조건에서는 더 낮아져야 하는데, 해당 비가 증가할 가능성이 있기 때문이다.
실시예 2: 파클리탁셀 및 인간 알부민 용액을 함유하는 제제화된 현탁액의 프리온 -제거 가능성 연구
파클리탁셀 (예컨대 아브락산™)을 함유하는 제제화된 현탁액, 및 다양한 백분율의 알부민 (% w/v)을 함유하는 인간 알부민 용액을 사용하여, 나노입자 조성물에서의 프리온-제거 기술의 적용에 대해 평가하였다.
실험 조건
연구 시스템
아브락산™용으로 제제화된 현탁액 및 당-파클리탁셀 제제를 평가하였다. 아브락산™용 제제화 현탁액 (FS)은 대략 7 mg/mL의 파클리탁셀 및 56 mg/mL의 인간 알부민을 함유하는, 제품으로부터 수득된 증발-후 현탁액 (PE) 및 인간 알부민 용액 (25 %, 박스터 사, 일리노이 디어필드 소재)을 사용하여 제제화하였다. 당-파클리탁셀 제제용 제제화 현탁액 (FS)는 대략 7 mg/ml의 파클리탁셀, 56 mg/ml의 인간 알부민; 32 mg/ml의 수크로스, 8.4 NaCl mg/ml, 및 0.07 mg/ml의 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)을 함유하는, 제품으로부터 수득된 증발-후 현탁액 (PE), 인간 알부민 용액 (25 %, 박스터 사), 수크로스, 염화 나트륨 및 에데테이트 디나트륨 2수화물을 사용하여 제제화하였다.
25 %, 20 %, 및 5 %의 인간 알부민 용액 역시 평가하였다. 25 % 또는 250 mg/ml의 인간 알부민 용액은 박스터 사로부터 입수하고; 20 % 또는 200 mg/ml의 인간 알부민 용액 (예컨대 그리폴스(Grifols)®)은 그리폴스 바이올로지칼스(Grifols Biologicals), Inc. 사 (캘리포니아 로스앤젤레스 소재)로부터 입수하였다. 5 % 인간 알부민 용액은 주입용 멸균수를 사용하여 25 % 인간 알부민 (박스터 사)을 희석함으로써 제조하였다.
프리온 -제거 칼럼
본 연구에서 사용된 프리온 제거 칼럼 (1-ml)은 프로메틱 바이오사이언시즈, Ltd 사 (UK 캠브리지 소재)에 의해 공급되는, 토요펄 아미노 650CU 수지 (샘플 AMN31)를 함유하는 시중에서 구입가능한 PIKSI® (흡착제 확인용 단백질 분리 키트) 키트 칼럼이었다.
유통 조건
제제 현탁액에 대한 연구에 있어서, 총 유통 부피는 약 500 mL이었는데, 이는 칼럼 부피 (1-ml)의 500배였다. 유량은 약 0.5 ml/분이었다. 총 유통 시간은 16시간을 초과하였다. 매 2시간마다 샘플을 채취하였다. 칼럼의 막힘은 관찰되지 않았다.
알부민 용액에 대한 연구에 있어서, 총 유통 부피는 100 mL 이상이었는데, 이는 칼럼 부피 (1-ml)의 100배였다. 유량은 약 0.5 ml/분이었다. 총 유통 시간은 3시간을 초과하였다. 매 시간마다 샘플을 채취하였다. 칼럼의 막힘은 관찰되지 않았다.
결과 및 논의
제제화된 현탁액에서의 프리온-제거 가능성 연구의 결과를 표 6 및 표 7에 요약하였다. 아브락산™용 제제화 현탁액에 대한 물리 화학적 시험 결과는 입자 크기, pH, 파클리탁셀 분석 및 분순물, 인간 알부민 분석, 및 인간 알부민 조성물 면에서 칼럼 전 및 후 현탁액 사이에 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다. 마찬가지로, 당-파클리탁셀 제제용 제제화 현탁액에 대한 물리 화학적 시험 결과도 입자 크기, pH, 파클리탁셀 분석 및 분순물, 인간 알부민 분석, 인간 알부민 조성물, 수크로스, 및 EDTA 면에서 칼럼 전 및 후 현탁액 사이에 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다.
Figure pct00012
Figure pct00013
알부민 용액에서의 프리온-제거 가능성 연구로부터의 결과를 표 8에 요약하였다. 인간 알부민 분석 및 인간 알부민 조성물 면에서 칼럼 전 및 후 용액 사이에 유의성 있는 차이는 없었다.
Figure pct00014
본 연구는 프리온-제거 칼럼 처리가 아브락산™ 및 당-파클리탁셀 제제 모두를 위한 인간 알부민 용액 및 제제화된 현탁액의 물리 화학적 특성에 대하여 부정적인 효과를 가지지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 3: 20 % 알부민에 있어서의 프리온 감소 수지에 의한 TSE 제거
본 연구에서는, 20 % (w/v) 알부민 (그리폴스®)에서의 프리온 감소 수지 (PRDT 칼럼; 프로메틱 바이오사이언시즈, Ltd 사)에 의한 잠재적인 TSE 제거를 평가하였다. TSE 제거 공정 단계를 위한 개시 물질에 모델 TSE 제제를 첨가하였다. 바이러스슈어(VirusSure) 실험실 (바이러슈어 포르슝 운트 엔트비클룽(Virusure Forschung und Entwicklung) GmbH 사, 오스트리아 비엔나 소재)에서 공정 단계를 수행하였다. 공정 단계의 수행 동안, 다양한 분획들을 수집하고, PrPsc의 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석을 사용한 TSE 제제의 농도 측정을 기준으로, 공정의 TSE 제거 용량을 계산하였다.
본 연구는 하기의 지침을 참고하여 따랐다: 1) 문헌 [CPMP/BWP/268/95 (revised in 1996), Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution, and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses]; 2) 문헌 [CPMP/BWP/5136/03 Guideline on the Investigation of Manufacturing Processes for Plasma-Derived Medicinal Products with Regards to vCJD Risk]; 3) 문헌 [OECD Principles of Good Laboratory Practice as outlined in ENV/MC/CHEM(98)17, revised in 1997]; 4) 문헌 [21 CFR part 58, Good Laboratory Practice, US FDA; 5) EU directive 2004/9/EG, Inspection und Uberprufung der Guten Laborpraxis (GLP)]; 6) 문헌 [EU Directive 2004/10/EG, Anwendung der Grundsatze der guten Laborpraxis und zur Kontrolle ihrer Anwendung bei Versunchen mit chemischen Stoffen]; 7) 문헌 [Austrian BGBI. II, 211. Verordnung, Chemikalien-GLP-Inspektionsverordnung, Jahrgang 2000]; 및 8) 문헌 [Austrian BGBI. II, 450. Verordnung, gute Laborpraxis 2006, Jahrgang 2006].
재료 및 방법
20 % 알부민 (그리폴스®)에 있어서의 프리온 감소 수지 (PRDT 칼럼)에 의한 TSE 제거의 조사를 위한 본 연구 과정 동안, 하기의 시험 품목, 시약, 및 재료들을 사용하였다.
첨가 전개 및 방해 시험에는 그리폴스® 알부민 (인간) (USP 20% 용액 (Lot: IBAB7GX001/TA09/0122))을 사용하였다.
공정 전개(process run)에는 9 % 식염수 중에 충전된 5 ml의 프리온 제거 수지를 함유하는 1회용 셉패스트(SepFast)™ 칼럼 (프로메틱 바이오사이언시즈 Ltd. 사)을 사용하였다.
다양한 버퍼들을 제조하였다. 여기에는 하기가 포함된다:
1) 프리온 감소 수지를 위한 평형 버퍼로서 0.9 % NaCl (9 g/l)을 제조하였으며;
2) 크로마토그래피 후 수지의 재-현탁액으로서 트리스 버퍼링된 식염수 (TBS)를 제조하였고;
3) 프리온 감소 수지 재생 버퍼로서 2 M NaCl (116.88 g/l)을 제조하였으며;
4) 첨가된 연구 샘플의 pH 조정 및 감염 물질의 공정 중간물 불활성화를 위하여, NaOH (0.1 M, 0.5 M, 및 1.0 M) 버퍼를 제조하였고;
5) 첨가된 연구 샘플 및 공정 중간물의 pH 조정을 위하여, HCl (0.1 M 및 1.0 M) 버퍼를 제조하였음.
263 스크래피
본 연구에는, 스트레인 263K 햄스터 순화 스크래피 (0.5 % 사르코실 처리)를 사용하였다. 햄스터 순화 스크래피의 상기 263K 스트레인은 햄스터 뇌에서의 높은 역가라는 장점을 제공한다. 10 % 뇌 균질물에서의 통상적인 역가는 ml 당 108-1010 ID50 단위의 범위이다. 이와 같은 요소에 의해 배출되는 PrPsc 단백질은 프로테이나제 K 분해에 대하여 상대적으로 내성이기 때문에, 비-질병 관련 형태의 단백질 PrPc와의 구별 가능성을 허용한다. 햄스터 순화 스크래피의 시드 263K 스트레인은 Dr. 로버트 로워 (볼티모어 리서치앤드 에듀케이션 파운에이션, USA MD 21201, 볼티모어, 10 노스 그린 스트리트, 메일 스탑 151-A 소재)의 실험실에 의해 10 % 균질물로서 공급되었다. 본 실험을 위하여, 0.5 % 사르코실-처리된 분획을 선택하였다. 상기 분획은 0.5 % 사르코실을 사용한 처리 후, 더 큰 응집물을 제거하여 상청액에 세정제 가용화된 단편만을 남기기 위한 시차 원심분리에 의해 조 뇌 균질물 (이로부터 마이크로좀/세포질 263K 분획이 이미 제거되어 있음)로부터 제조되었다. 상기 0.5 % 사르코실-처리 분획은 세정제 가용화 오염물 (즉, 용매 세정제 함유 공정에서 발견되는 것과 같은 것)을 흉내내어 제조되는데, 이와 같은 유형의 분획은 인간 혈장 및 재조합 생성물에 있어서의 프리온 정화 연구에서 광범위하게 사용되고 있다.
PrPsc 의 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석
다양한 샘플에서의 TSE 농도 (PrPsc)의 준-정량적 측정을 위하여, PrPsc 검출용 웨스턴 블롯 분석을 사용하였다. 웨스턴 블롯 분석의 동적 범위는 보통 신호가 상실되기까지 4-5 log10 희석 범위이며, 따라서 상기 분석은 햄스터 생물검정에 비해서는 덜 민감하다. 그러나, 웨스턴 블롯 분석은 생물제약적 제조 공정에 의한 프리온 제거를 평가함에 있어서는 유용한 도구이다.
웨스턴 블롯 분석에서는, 먼저 샘플을 프로테이나제 K를 사용한 분해에 적용함으로써, 정상적인 형태의 단백질인 PrPc를 제거하였다 (모든 공정 샘플은 83 pg/ml 농도의 프로테이나제 K를 사용하여 분해하였음). 단백질분해 반응의 블로킹 후, 샘플을 SDS-버퍼와 혼합하고 비등시킴으로써, PrPsc를 그의 응집된 형태로부터 변성시켰다. 다음에, 0.5 log10 희석의 샘플을 제조하여, 분자량 마커와 함께 SDS-PAGE 겔 상에 적재하였다. 전기영동에 이어, PVDF 멤브레인 상에서 겔을 웨스턴 블롯팅한 후, 이어서 블로킹하고, 항체 3F4에 의한 결합된 PrPsc 단백질의 검출을 가능케 하는 항체를 사용하여 프로빙(probing)하였다. 스크래피의 263K 스트레인은 25-33 KDa 영역에서 특징적인 밴딩 패턴을 나타내는데, 이는 샘플 중 PrPsc 단백질의 존재를 확인하는 것을 돕는다. 샘플 적정의 종말점은 웨스턴 블롯 상에서 신호가 관찰되지 않는 첫 번째 희석으로 정의되었다.
감소 계수의 계산
감소 계수 (RF)는 하기와 같이 계산된다:
RF = (V1×T1)/(V2×T2)
여기서, V1 및 T1은 각각 개시 물질의 부피 및 역가이며, V2 및 T2는 각각 생성물 분획의 부피 및 역가이다.
대수적인 용어로, 상기 수학식은 하기와 같이 표현될 수 있다:
Log10[RF] = [Log10(V1) + Log10(T1)] - [Log10(V2) + Log10(T2)]
감소 계수는 최종 계산 후에만 소수점 이하 1자리로 반올림된다.
방해 시험
개시 물질을 희석하지 않은 채로 시험한 후, 이어서 TBSA 중에 1.0 log10으로 예비-희석하였다. 첨가에 사용된 스크래피 모액 종말점의 대략 2 log10 이내 역가와 등가인 최종 농도로 263K를 사용하여 첨가한 후, 비희석 및 예비-희석 개시 물질 샘플을 실온에서 60분 동안 15.558×g로 원심분리하였다. 원심분리에 이어서, 상청액을 조심스럽게 경사분리하고, 원래 원심분리되었던 샘플 부피의 1/10로 TBSA를 사용하여 (1.0 log10 예비-희석 샘플의 경우 유효 농도에 해당하지 않으며, 비희석 샘플의 경우 10-배 농도와 등가임) 펠렛을 재현탁하였다. 다음에, 표준 프로토콜에 따라 프로테아제 K 분해 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 재생 및 칼럼 샘플을 웨스턴 블롯팅에 의한 분석 전에 (즉, 원심분리 없이) 각각 0.5 log10으로 희석하거나 희석하지 않은 채로 시험하였다.
pH 의 조정
분취 및 ≤-60 ℃에서의 저장 전에, 샘플을 pH 6-8이 되도록 점검하였다 (어떠한 샘플에서도 pH 조정은 필요하지 않았음).
장비
본 연구의 수행에는, 하기의 주 장비 항목들을 사용하였다. 멸균 등급 II 바이오해자드(Biohazard) 안전 캐비넷, 산요 & 앤젤안토니(Sanyo & Angelantoni) ≤-60 ℃ 냉동고, 앤젤안토니 2-8 ℃ 냉장고 및 ≤-15 ℃ 냉동고, 사르토리우스(Sartorius) 또는 케른(Kern) (분석용) 저울 및 프린터, 한나(Hanna) 전자 온도계, 메틀러 톨레도(Mettler Toledo) pH 측정기, 그랜트(Grant) 또는 셀렉타(Selecta) 수조, 오레곤 라보래토리(Oregon Laboratory) 타이머, 헤티치(Hettich) 마이크로퓨지, 바이오래드 크리테리온(BioRad Criterion) 전기영동 셀, 바이오래드 크리테리온 블러터(Blotter), 악타(AKTA) 크로마토그래피 시스템, 윌텍 전원, 아그파 필름 현상기, 및 PRDT 수지가 충전된 바이오툴로믹스(Biotoolomics) 칼럼.
공정 흐름
수집된 샘플에 따른 공정 흐름 체계를 도 4에 도시하였다. 각 샘플의 부피는 결과 부문의 표 9에서 찾아볼 수 있다.
공정 흐름의 준비시, 층류 (LF) 안전성 캐비넷을 세척하여 10 내지 15분 이상 동안 가동함으로써, 평형화하였다. 수조는 30±2 ℃로 평형화하였으며, 개시 물질은 29.5 ℃의 온도에 도달할 때까지 평형화하였다. 0.5 % 사르코실 가용화 첨가물을 동일 수조에서 해동하고, 그것이 해동되자마자 사용시까지 얼음상에 놓아두었다. PRDT 칼럼은 밤새 주변 온도 (23.0±5.0 ℃)로 평형화하였다.
칼럼 유입구 관재 (상부)는 악타로부터의 유출구에 연결되었다. 칼럼 유출구 (저부)로부터의 관재는 적절한 수집 용기 (비커 또는 50 ml 1회용 원심분리 튜브)로 공급되었다. 모든 관재는 이미 기포가 시스템에 도입되지 않도록 WFI (주입용수)로 채워져 있다.
칼럼은 먼저 5 칼럼 부피 (CV)의 WFI로, 그리고 다음에 10 CV의 평형화 버퍼로 평형화하였다. 목표 유량 처리량은 분 당 2.0±0.1 ml이었다.
샘플 제조 및 프리온 감소 수지 크로마토그래피
50.7 ml의 평형화된 개시 물질에 0.51 ml의 0.5 % 사르코실 가용화 263K 균질물을 첨가하였다. 다음에, pH를 점검하였는데, 6.9-7.4의 목표 범위 이내인 것으로 밝혀졌다. 이어서, 0.5 ml의 분취량을 제거하여 (샘플 SSM) 분취하고, ≤-60 ℃에서 저장하였다.
다음에, 첨가된 샘플을 분 당 1.8±0.1 ml의 유량으로 상기 평형화된 PRDT 칼럼에 적용하고, 하기의 분획과 같이 유통 수집하였다:
Figure pct00015
E1의 수집은 일단 흡광도가 전체 규모 편차의 80 %에 도달하고 나면 개시하였다. 각 전개에 대하여, 유통 분획을 수집하였다 (칭량에 의해, 수집되는 각 용리물 샘플의 부피를 측정하였음). 첨부된 알부민 용액의 적재 후, 10.0 ml의 평형 버퍼를 사용하여 칼럼을 세척하였다. 일단 흡광도가 전체 규모 편차의 80 % 미만으로 강하하면, E5 샘플의 수집을 중단하였다. 평형화 버퍼 세척 후, >20.0 ml의 2 M NaCl을 사용하여 칼럼을 재생하고 (샘플 REG), 이후 제거된 수지를 재생한 후, 5 ml의 TBS에 재현탁하였다 (샘플 COL).
결과
첨가 전개로부터의 샘플
하기의 표 9에 첨가 전개로부터 수집된 샘플을 각 샘플의 부피와 함께 열거하였다. 샘플 크기가 중량 기준으로 측정되는 경우라면, 1.0 g/ml의 밀도를 가정하여 각 샘플에 대한 부피의 계산을 가능케 하였다. 모든 샘플은 분취하여 -60 ℃로 분석시까지 저장하였다. 첨가 전개로부터의 크로마토그래피 프로파일의 스캐닝 사본을 도 5에 나타내었다.
Figure pct00016
방해 결과
방해를 극복하기 위하여, 재생 및 수지 샘플을 제외한 모든 샘플을 0.1 % BSA를 함유하는 TBS를 사용하여 1.0 log10으로 희석한 후, 이어서 원심분리 및 1/10 농축하였다. 10× 농도에서 방해에 대하여 시험된 비희석 샘플이 강한 방해를 나타내었다. 재생 샘플의 경우, NaCl의 농도를 감소시키기 위하여 시험 전에 0.5 log10 희석액을 제조하였다. 수지 샘플의 경우에는, 수지가 TBS 버퍼에 재현탁되었으므로, 해당 샘플을 예비-희석 없이 시험하였다.
원심분리 및 원래 부피의 1/10th에의 재현탁에 의한 1.0 Log10 예비희석을 사용하여, 알부민에 의한 방해를 극복하는 데에 필요한 샘플의 희석액을 제조하였다. 도 6을 참조하라.
프리온 적정 데이터 및 감소 계수의 계산
공정 전개에 있어서의 프리온 감소 계수의 계산을 표 10에 나타내었다. 방해를 극복하기 위하여 사용된 샘플의 희석 역시 표 10에 나타내었다.
Figure pct00017
PRDT 칼럼을 통과한 첫 번째 2.0 ml를 나타내는 E1 샘플에 대하여, 첨가된 개시 물질에 대비한 2.5 log10의 감소 계수가 계산되었다. 샘플 E2 내지 E5에서는, 유통 분획으로의 PrPsc의 유출이 관찰되었다 (샘플 E5의 경우, 감소 계수 1.5 log10). 재생 샘플에서는 PrPsc가 검출되지 않았는데, PRDT 수지에 결합된 PrPsc 등가물에 대해서는 하기 PRDT 수지의 프리온 결합 용량 계산 부문에 더욱 상세하게 논의되어 있다.
프리온 감소 수지의 프리온 결합 용량 계산
감염성 프리온 단백질에 대한 프리온 감소 수지 (PRDT 수지)의 결합 용량을 평가하기 위하여, 웨스턴 블롯 시험에서 관찰된 역가를 감염가와 연관시켰다. 웨스턴 블롯 분석은 역가가 알려져 있는 263K 모액을 사용하였다. 일련 희석의 참조 모액을 제조하고, 웨스턴 블롯 분석으로 시험하였다. 수득된 역가 대 햄스터 생물검정에서 관찰된 각 역가를 플로팅한 후, 선형 회귀 분석을 수행하여 두 시험 시스템 사이의 관계를 평가하였다. 회귀 선에 대한 기울기 및 절편은 각각 1.0667 및 -4.5867인 것으로 계산되었다. 회귀 파라미터를 사용하여 웨스턴 블롯 역가를 감염가로 전환하였는데, 하기의 수학식을 사용하였다:
역가[생물검정] = (역가[ 웨스턴블롯 ] + 4.5867)/(1.0667)
일단 ml 당 감염가가 계산되고 나면, 칼럼에 결합된 총 프리온이 측정될 수 있다. 프리온 감소 수지의 계산된 프리온 단백질 결합 용량을 하기 표 11에 나타내었다. 용량은 프리온 감소 수지에 결합된 것으로 직접 관찰된 PrPsc의 양을 사용하여 측정하였다 (샘플 Reg 및 Col).
Figure pct00018
2 M 염 세척 후 PRDT 수지에 대한 PrPsc의 총 결합은 7.4 log10 ID50/ml이었다. 웨스턴 블롯에 의해서는 염 세척 분획에서 PrPsc가 검출되지 않았다. 유의성 있는 PrPsc 제거 (≥ 2.5 log10) 역시 관찰되었다.
방해 시험을 수행할 때, 개시 물질은 희석되지 않은 채로 원심분리 및 10-배 농축을 사용하여 시험하였다. 이는 샘플을 농축하고, 그에 따라 더 높은 감소 계수를 달성하는 것에 대한 가능성의 평가를 가능케 하기 위하여 수행되었다.
실시예 4: 25 % 알부민에 있어서의 프리온 감소 수지에 의한 TSE 제거
본 연구에서는, 25 % 알부민 (박스터 사, 일리노이 디어필드 소재)에서의 프리온 감소 수지 (PRDT 칼럼)에 의한 잠재적인 TSE 제거를 평가하였다. 사용된 재료 및 방법은 첨가 전개 및 방해 시험을 위한 개시 물질로서 박스터 사의 알부민 (인간) USP 25 % 용액 (Lot: LA07D051AB/TA09/0123)이 사용되었다는 것 이외에는, 실시예 3에서 기술된 것과 동일하였다.
공정 흐름
바이러슈어 설비에서 소규모 공정을 설정하여 수행하였다. 수집된 샘플에 따른 공정 흐름 체계를 도 7에 도시하였다. 각 샘플의 부피는 결과 부문의 표 12에서 찾아볼 수 있다. 악타와 칼럼을 연결하는 것, 칼럼 평형화를 포함하여 공정 흐름의 준비시 사용된 파라미터 및 절차들은 실시예 3에 기술되어 있는 것과 동일하였다.
샘플 제조 및 프리온 감소 수지 크로마토그래피
50.1 ml의 평형화된 개시 물질에 0.51 ml의 0.5 % 사르코실 가용화 263K 균질물을 첨가하였다. 다음에, pH를 점검하였는데, 0.1 M HCl 또는 0.5 M NaOH를 사용하여 6.9-7.4의 목표 범위 이내가 된 것으로 밝혀졌다. 첨가된 개시 물질의 pH (6.85)는 6.9-7.4의 목표 범위를 벗어나 있었다 (편차 부문 참조). 65 μL의 0.1 M NaOH 및 50 μl의 1 M NaOH의 첨가 후에도 pH 값이 변함없이 유지되었기 때문에, 개시 물질을 상기 pH에서 적재하는 것으로 결정을 내렸다. 이어서, 0.5 ml의 분취량을 제거하여 (샘플 SSM) 분취하고, ≤-60 ℃에서 저장하였다.
다음에, 첨가된 샘플을 분 당 1.8±0.1 ml의 유량으로 상기 평형화된 PRDT 칼럼에 적용하고, 하기의 분획과 같이 유통 수집하였다:
Figure pct00019
E1의 수집은 일단 흡광도가 전체 규모 편차의 80 %에 도달하고 나면 개시하였다. 각 전개에 대하여, 유통 분획을 수집하였다 (칭량에 의해, 수집되는 각 용리물 샘플의 부피를 측정하였음). 첨부된 알부민 용액의 적재 후, 10.0 ml의 평형 버퍼를 사용하여 칼럼을 세척하였다. 일단 흡광도가 전체 규모 편차의 80 % 미만으로 강하하면, E5 샘플의 수집을 중단하였다. 평형화 버퍼 세척 후, >20.0 ml의 2 M NaCl을 사용하여 칼럼을 재생하고 (샘플 REG), 이후 제거된 수지를 재생한 후, 5 ml의 TBS에 재현탁하였다 (샘플 COL).
결과
첨가 전개로부터의 샘플
하기의 표 12에 첨가 전개로부터 수집된 샘플을 각 샘플의 부피와 함께 열거하였다. 샘플 크기가 중량 기준으로 측정되는 경우라면, 1.0 g/ml의 밀도를 가정하여 각 샘플에 대한 부피의 계산을 가능케 하였다. 모든 샘플은 분취하여 ≤-60 ℃로 분석시까지 저장하였다. 첨가 전개로부터의 크로마토그래피 프로파일의 스캐닝 사본을 도 8에 나타내었다.
Figure pct00020
알부민에 의한 방해를 극복하기 위하여, 재생 및 수지 샘플을 제외한 모든 샘플을 0.1 % BSA를 함유하는 TBS를 사용하여 1.0 log10으로 희석한 후, 이어서 원심분리 및 1/10 농축하였다. 10-배 농도에서 방해에 대하여 시험된 비희석 샘플이 강한 방해를 나타내었다. 재생 샘플의 경우, NaCl의 농도를 감소시키기 위하여 시험 전에 0.5 log10 희석액을 제조하였다. 수지 샘플의 경우에는, 수지가 TBS 버퍼에 재현탁되었으므로, 해당 샘플을 예비-희석 없이 시험하였다.
원심분리 및 원래 부피의 1/10th에의 재현탁에 의한 1.0 Log10 예비희석을 사용하여, 방해를 극복하는 데에 필요한 샘플의 희석액을 제조하였다. 도 9를 참조하라.
프리온 적정 데이터 및 감소 계수의 계산
공정 전개에 있어서의 프리온 감소 계수의 계산을 표 13에 나타내었다. 방해를 극복하기 위하여 사용된 샘플의 희석 역시 표 13에 나타내었다.
Figure pct00021
PRDT 칼럼을 통과한 첫 번째 2.0 ml를 나타내는 E1 샘플에 대하여, 첨가된 개시 물질에 대비한 ≥2.5 log10의 감소 계수가 계산되었다. 샘플 E2 내지 E5에서는, 유통 분획으로의 PrPsc의 유출이 관찰되었다 (샘플 E5의 경우, 감소 계수 1.5 log10). 재생 샘플에서는 PrPsc가 검출되지 않았는데, PRDT 수지에 결합된 PrPsc 등가물에 대해서는 하기 PRDT 수지의 프리온 결합 용량 계산 부문에 더욱 상세하게 논의되어 있다.
프리온 감소 수지의 프리온 결합 용량 계산
감염성 프리온 단백질에 대한 프리온 감소 수지 (PRDT 수지)의 결합 용량을 평가하기 위하여, 웨스턴 블롯 시험에서 관찰된 역가를 감염가와 연관시켰다. 웨스턴 블롯 분석은 역가가 알려져 있는 263K 모액을 사용하였다. 일련 희석의 참조 모액을 제조하고, 웨스턴 블롯 분석으로 시험하였다. 수득된 역가 대 햄스터 생물검정에서 관찰된 각 역가를 플로팅한 후, 선형 회귀 분석을 수행하여 두 시험 시스템 사이의 관계를 평가하였다. 회귀 선에 대한 기울기 및 절편은 각각 1.0667 및 -4.5867인 것으로 계산되었다. 회귀 파라미터를 사용하여 웨스턴 블롯 역가를 감염가로 전환하였는데, 하기의 수학식을 사용하였다:
역가[생물검정] = (역가[ 웨스턴블롯 ] + 4.5867)/(1.0667)
일단 ml 당 감염가가 계산되고 나면, 칼럼에 결합된 총 프리온이 측정되었다. PRDT 수지의 계산된 프리온 단백질 결합 용량을 하기 표 14에 나타내었다. 용량은 PRDT 수지에 결합된 것으로 직접 관찰된 PrPsc의 양을 사용하여 측정하였다 (샘플 Reg 및 Col).
Figure pct00022
2 M 염 세척 후 PRDT 매트릭스에 대한 PrPsc의 총 결합은 7.4 log10 ID50/ml이었다. 웨스턴 블롯에 의해서는 염 세척 분획에서 PrPsc가 검출되지 않았다. 유의성 있는 PrPsc 제거 (≥ 2.0 log10) 역시 관찰되었다.
첨가된 개시 물질의 pH는 6.85이었다. 65 μl의 0.1 M NaOH 및 50 μl의 1 M NaOH 첨가 후에도, pH 값은 변함없이 유지되었다. 이러한 효과는 25 % 알부민의 상당한 버퍼링 용량에 기인한 것일 수 있다.
방해 시험을 수행할 때, 개시 물질은 희석되지 않은 채로 원심분리 및 10-배 농축을 사용하여 시험하였다. 이는 연구 계획에서 기술된 방해 시험 이외의 것으로써, 샘플을 농축하고, 그에 따라 더 높은 감소 계수를 달성하는 것에 대한 가능성의 평가를 가능케 하기 위하여 수행되었다.
실시예 5: 프리온 제거 처리된 인간 알부민에서의 제조중 분석 및 안정성 분석
본 실험에서는, 인간 알부민의 농도 및 조성에 대한 프리온-제거 칼럼의 효과를 평가하였다. 2회의 별도 실험에서, 프리오클리어(PRIOCLEAR)™ B 칼럼 (50 ml) (프로메틱 바이오사이언시즈 사)을 사용하여 1리터의 알부민을 처리하였다. 다음에, 비처리 샘플, 전개 개시시에 수집된 샘플, 및 전개 종료시에 수집된 샘플을 농도 및 조성 분석에 적용하였다. 결과를 표 15 및 16에 나타내었다.
Figure pct00023
Figure pct00024
프리온 제거 공정 전 및 후에, 알부민에 대한 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다.
추가로, 프리온-제거를 위하여 처리된 인간 알부민, 및 프리온-제거를 위하여 처리된 인간 알부민을 사용하여 제조된 아브락산® 현탁액의 제조중 안정성을 평가하였다. 결과를 표 17 및 18에 나타내었다.
Figure pct00025
Figure pct00026
추가로, 프리온-제거 처리된 인간 알부민 (프리온 제거 처리된 인간 알부민을 사용한 파일럿 플랜트 배치)을 사용하여 제조된 최종 아브락산® 생성물과 프리온-제거 처리되지 않은 인간 알부민을 사용하여 제조된 최종 아브락산® 생성물에서의 인간 알부민의 촉진 안정성(accelerated stability)을 비교하였다 (아브락산 존재 로트(lot), 아브락산 입증 로트, 아브락산 파일럿 플랜트 배치). 결과를 표 19에 나타내었다.
Figure pct00027
안정성 데이터의 비교는 55 ℃에서의 2주 동안의 저장이 40 ℃에서의 3개월 동안의 저장과 등가임을 보여준다. 제조 공정 동안 및 제조중 시험 동안, 프리온 제거 처리된 인간 알부민을 사용하여 제조된 파일럿 플랜트 배치와 비처리 인간 알부민을 사용하여 제조된 파일럿 플랜트 배치 사이에 유의성 있는 차이는 발견되지 않았다. 프리온 제거 처리된 인간 알부민을 사용하여 제조된 최종 생성물의 특성과 비처리 인간 알부민을 사용하여 제조된 최종 생성물의 특성 사이에 유의성 있는 차이는 존재하지 않았다.
실시예 6: 아브락산 ® 제조중 현탁액에 대한 프리온 -제거 칼럼의 효과 평가
본 실험은 아브락산® 제조중 현탁액, 즉 동결건조 전의 아브락산® 현탁액으로부터의 프리온 제거의 효과를 평가한다. 본 실험에서는, 프로메틱 바이오사이언시즈 사의 토요펄 아미노 650CU 수지를 함유하는 시중에서 구입가능한 PIKSI 키트 칼럼 (1 cc)을 사용하였다.
2회의 별도 실험에서, 인간 알부민을 함유하는 0.5 L의 아브락산® 제조중 현탁액을 칼럼으로 통과 처리하였다. 분석 결과를 표 20에 요약하였다.
Figure pct00028
샘플 1: 아브락산 제조중 현탁액, 비처리
샘플 2: 아브락산 제조중 현탁액, 프리온-제거 칼럼 후, 전개 개시시에 수집된 샘플
샘플 3: 아브락산 제조중 현탁액, 프리온-제거 칼럼 후, 전개 종료시에 수집된 샘플 (0.5 L).
표 20에 나타낸 바와 같이, 프리온 제거 처리된 아브락산® 제조중 현탁액의 물리 화학적 시험은 입자 크기, pH, 파클리탁셀 분석 및 불순물, 인간 알부민 (HA) 분석, 및 HA 조성 면에서, 비처리 및 처리 현탁액 사이에 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> ABRAXIS BIOSCIENCE LLC. Neil P. DESAI Viktor PEYKOV Patrick SOON-SHIONG <120> PRION FREE NANOPARTICLE COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING THEREOF <130> 638772010740 <140> PCT/US2010/031197 <141> 2010-04-15 <150> US 61/169,665 <151> 2009-04-15 <150> US 61/238,052 <151> 2009-08-28 <160> 246 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Lys Ile His Lys Phe Leu Ala 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gly Thr His Asp Phe Gln Ala 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Lys Phe Gly Ser Thr His Ala 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Phe Val Asn Glu Ile Glu Ala 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Gly Leu His Phe Lys Ser Ala 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct 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<210> 222 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 222 Trp His Ile Leu Glu Glu Ala 1 5 <210> 223 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 223 Asn Pro His Glu Asn Phe Ala 1 5 <210> 224 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 224 His Glu Asp Asn Gly Gly Ala 1 5 <210> 225 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 225 Ser Asp Ser Glu Gly Pro Ala 1 5 <210> 226 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 226 Glu Phe Gln Glu Phe Thr Ala 1 5 <210> 227 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 227 Gln Glu Gly Asp Glu Ile Ala 1 5 <210> 228 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 228 Asp Ile Tyr Ala Glu Thr Ala 1 5 <210> 229 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 229 Asp Arg Val Arg Glu Thr Ala 1 5 <210> 230 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 230 Phe Glu Glu Pro Gln Trp Ala 1 5 <210> 231 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 231 Phe Glu Gly Glu Glu Phe Ala 1 5 <210> 232 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Thr or Leu <400> 232 Xaa Phe Asn Ile His Ala 1 5 <210> 233 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Gly, Pro, or Asn <400> 233 Arg Tyr Pro Xaa Gln 1 5 <210> 234 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1, 2, 6 <223> Xaa = Gly, Pro, or Asn <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Arg or Gln <400> 234 Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa 1 5 <210> 235 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 235 Arg Tyr Pro Gly Gln 1 5 <210> 236 <211> 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Gly Ser Asn Trp Gly Gln 1 5 10 <210> 244 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 244 Pro His Asn Pro Gly Tyr 1 5 <210> 245 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 245 Pro His Asn Pro Ser Tyr 1 5 <210> 246 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 246 Pro His Asn Pro Gly Tyr 1 5

Claims (32)

  1. 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하며, 프리온 단백질이 실질적으로 없는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 약 100 fg/ml 미만의 프리온 감염성을 가지는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 10 IU-ic/ml 미만의 프리온 감염성을 가지는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 오형성 주기적 증폭 (PMCA) 분석 또는 IPCR 분석을 기준으로 프리온 단백질의 존재를 나타내지 않는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프리온 단백질에 결합할 수 있는 미량의 리간드를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 미량의 지지 재료를 추가로 포함하는 조성물.
  7. 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하며, 조성물 중 알부민이 최초 알부민 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함하는 프리온-제거 과정을 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 프리온 제거 과정이 상기 알부민 및 조성물로부터 상기 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 리간드가 펩티드인 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 리간드가 트리아진-기재 화합물인 조성물.
  11. a) 최초 알부민 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것; b) 프리온-제거 알부민을 포함하는 용액, 및 유기 용매 중에 분산된 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것을 포함하는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단계 a)가 1) 최초 알부민 용액을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 a)가 2) 알부민 용액으로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물로부터 상기 유기 용매를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 유기 용매의 상기 제거가 증발에 의한 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 펩티드인 방법.
  17. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 트리아진-기재 화합물인 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 최초 알부민 조성물이 혈액 유래 생성물인 방법.
  19. a) 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 유기 상, 및 알부민 용액을 포함하는 혼합물을 고전단 조건에 적용하는 것, 및 b) 상기 혼합물로부터 프리온 단백질을 제거하는 것을 포함하는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계 b)가 1) 혼합물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 단계 b)가 2) 상기 혼합물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 리간드가 펩티드인 방법.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 리간드가 트리아진-기재 화합물인 방법.
  24. 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 조성물.
  25. a) 조성물을 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드와 접촉시키는 것, b) 조성물로부터 리간드 및 그에 결합된 단백질을 제거하는 것
    을 포함하는, 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하는, 프리온 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 리간드가 펩티드인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 리간드가 트리아진-기재 화합물인 방법.
  28. 알부민 및 실질적으로 수불용성인 약리 활성제를 포함하는 나노입자를 포함하며, 프리온 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 추가로 포함하는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 리간드가 펩티드인 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 리간드가 트리아진-기재 화합물인 조성물.
  31. 질병의 치료를 위한 제1항 내지 제10항 및 제24항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  32. 제31항에 있어서, 질병이 암인 용도.
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