ES2324334T3 - Productos terapeuticos para las celulas t para la encefalopatia espongiforme transmisible y metodo para la fabricacion de productos derivados de tejidos y fluidos corporales no infecciosos. - Google Patents

Abstract

El uso de reductores de células B y células T para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la encefalopatía espongiforme transmisible en humanos o animales infectados, en donde los reductores de células B y células T son administrados simultáneamente, secuencialmente o por separado.

Description

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Productos terapéuticos para las células T para la encefalopatía espongiforme transmisible y método para la fabricación de productos derivados de tejidos y fluidos corporales no infecciosos.

La presente invención se refiere a productos terapéuticos para la encefalopatía espongiforme transmisible. Además, la invención tiene que ver con un método para la fabricación de productos derivados de tejidos o fluidos corporales sin encefalopatías espongiformes transmisibles humanas.

Técnica Anterior

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) abarcan un grupo de enfermedades degenerativas lentas del SNC tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), la nueva variante de la ECJ (llamada nvECJ)^{1.2}, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) y el kuru en el hombre y el scrapie en ovejas o la EEB (enfermedad de las vacas locas) en el ganado vacuno.

La aparición de estas enfermedades exóticas es afortunadamente muy baja todavía, ocurriendo probablemente en 1:1.000.000, pero existen similitudes interesantes cuando se comparan con el síndrome de Alzheimer. Sin embargo, se informa ahora de la EEB por haber alcanzado proporciones epidémicas en Inglaterra, y está causada por el empleo de materias recicladas en la alimentación del ganado vacuno, y se puede originar con ovejas infectadas con scrapie. En particular, el ganado vacuno lechero está en el máximo riesgo medible. Con humanos, ha ocurrido una incidencia trágicamente similar.

Durante la producción de la hormona humana del crecimiento a partir de glándulas humanas recolectadas de cadáveres, fue introducido el agente patogénico del Síndrome de Creutzfeldt-Jakob. Ahora se ha informado de varios casos en pacientes tratados con esta hormona del crecimiento. Los pacientes eran predominantemente niños, mientras que la enfermedad ataca normalmente a adultos por encima de 50 años de edad.

Estos ejemplos indican el peligro potencial de estas nuevas enfermedades y las dificultades para diagnosticar y tratarlas eficazmente.

Las inusuales propiedades del agente patogénico, denominado como "prión" [Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 216, 136-144, (1982)], incluyen los extremadamente largos periodos de incubación, que exceden de un año, y la resistencia a las altas temperaturas, al tratamiento con formaldehido y a la irradiación UV [Gordon, W. S. Vet. Rec. 58, 516 (1946); Pattison, I. H. Resistance of the scrapie agent to formalin. J Comp Pathol 75, 159-164 (1965); Alper y col., The exceptionally small size of the scrapie agent. Biochem. Biophys. Res. Commun. 22, 278-284 (1966); Latarjet y col., Inactivation of the scrapie agent by near monochromatic ultraviolet light. Nature 227, 1.341-1.343 (1970)]. Tempranamente surgieron especulaciones sobre que el agente del scrapie pudiese estar desprovisto de ácido nucleico [Alper y col., Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Nature 214, 764-766 (1967); Gibbon, R. A. and Hunter, G. D., Nature of the scrapie agent. Nature 215, 1.041-1.043 (1967); Pattison, I. H. and Jones, K. M., The possible nature of the transmissible agent of scrapie. Vet. Rec. 80, 2-9 (1967)]. La considerable evidencia sostiene ahora la hipótesis de "sólo proteína" [Prusiner, S. B. and Hsiao, K. K., Human prion diseases. Ann. Neurol. 35, 385-395 (1994); Weissmann, C., Molecular biology of prion diseases. Trends Cell Biol. 4, 10-14 (1994)] que propone que el prión está desprovisto de ácido nucleico e idéntico a PrP^{SC}, una forma modificada de PrP^{C}. La PrP^{C} es una proteína normal del huésped [Oesch y col., A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 Protein. Cell 40, 735-746 (1985); Chesebro y col., Identification of scrapie prion protein-specific mRNA in scrapie-infected and uninfected brain. Nature 315, 331-333 (1985)] encontrada predominantemente en la superficie externa de las neuronas, pero también en muchos otros tejidos (Manson y col., The prion protein gene: a role in mouse embryogenesis? Development 115, 117-122 (1992); Bendheim y col., Nearly ubiquitous tissue distribution of the scrapie agent precursor protein. Neurology 42, 149-156 (1992)]. La PrP^{SC} es definida como una forma de PrP^{C} resistente a la proteasa, la cual forma fácilmente agregados después de un tratamiento con detergente (Mc Kinley y col., Scrapie prion rod formation in vitro requieres both detergent extraction and limited proteolysis. J. Virol. 65, 1.340-1.351 (1991)]. Hasta aquí no se han detectado diferencias químicas entre la PrP^{Se} y la PrP^{C} [Stahl y col., Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochemistry 32, 1991-2002 (1993)]. Prusiner propuso que la PrP^{Se}, cuando se introduce en una célula normal, origina la transformación de la PrP^{C} o su precursora en PrP^{C} [Oesch y col., Search for a scrapie-specific nucleic acid: a progress report. Ciba. Found. Symp. 135, 209-223 (1988); Prusiner y col., Transgenetic studies implicate interactions between homologous PrP isoforms in scrapie prion replication. Cell 63, 673-686 (1990); Bolton, D. C. and Bendheim, P. E., A modified host protein model of scrapie. Ciba. Found. Symp. 135, 164-181 (1988)]. Se cree que la transformación resulta de una reordenación conformacional de la PrP^{C}. Algunos investigadores se adhieren todavía a la hipótesis del virino, la cual mantiene que el agente infeccioso consta de un genoma de ácido nucleico y del PrP derivado del huésped, el cual es reclutado como alguna clase de cubierta (Dickinson, A. G. and Outram, G. W., Genetic aspects of unconventional virus infections: the basis of the virino hypothesis. Ciba. Found. Symp. 135, 63-83 (1988); Hope, J., The nature of the scrapie agent: the evolution of the virino. Ann. N. Y. Acad. Sci. 724, 282-289 (1994)]. Finalmente, la posibilidad de que el agente infeccioso sea un virus con propiedades inusuales es todavía apoyada por algunos (Diringer y col., The nature of the scrapie: the virus theory. Ann. N. Y. Acad. Sci. 724, 246-258 (1994); Pocchiari, M., Prions and related neurological diseases. Molec. Aspects. Med. 15, 195-291 (1994); Rohwer, R. G., The scrapie agent: "a virus by any other name". Curr. Top-Microbiol. Immunol. 172, 195-232 (1991)]. Aun no está disponible una evidencia creíble de la existencia de un ácido nucleico específico para el scrapie, como se demanda por la hipótesis del virus y del virino [Oesch y col., ver arriba; Kellings y col., Further analysis of nucleic acids in purified scrapie prion preparations by improved return refocusing gel electrophoresis. J. Gen. Virol. 73, 1.025-1.029 (1992)].

Prusiner y sus compañeros fueron los primeros en purificar PrP^{Se} y demostrar la unión física para la infectividad del scrapie [Bolton y col., Identification of a protein that purifies with el scrapie prion. Science 218, 1.309-1.311 (1982)]. Una colaboración entre los grupos de Prusiner, Hood y Weissmann condujo al asilamiento de ADNc de PrP, y a la realización de que la PrP^{C} era una proteína normal del huésped y que la PrP^{Se} era una isoforma de la PrP^{C} [Oesch y col., ver arriba (1985)]. Weissmann y sus colaboradores [Basler y col., Scrapie and cellular PrP isoforms are encoded by the same chromosomal gene. Cell 46, 417-428 (1986)] clonaron el gen de la PrP (PrnP), y el grupo de Prusiner demostró la unión entre la susceptibilidad genética hacia la enfermedad priónica y el gen PrnP en ratón [Prusiner y col., ver arriba (1990)] y hombre [Hsiao y col., Linkage of a prion protein missense variant to Gerstmann-Straussler syndrome. Nature 338, 342-345 (1989)]. Varios grupos informaron de los datos físicos que apoyan las diferencias conformacionales entre la PrP^{C} y la PrP^{Se} [Caughey y col., Secondary structure analysis of the scrapie-associated protein PrP 27-30 in water by infrared spectroscopy. Biochemistry 30, 7.672-7.680 (1991); Cohen y col., Structural clues to prion replication. Science 264, 530-531 (1994); Huang y col., Proposed three-dimensional structure for the cellular prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7.139-7.143 (1994); Pan y col., Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993); Safar y col., Conformational transitions, dissociation, and unfolding of scrapie amyloid (prion) protein. J. Biol. Chem. 268, 20.276-20.284 (1993)].

Puesto que no hay marcador fidedigno de la infectividad de la encefalopatía espongiforme transmisible, no se puede estudiar específicamente la cinética de la replicación del agente infeccioso ya que no se conocen los trasmisores físicos de los priones. Sin embargo, una creciente colección de datos a partir los primeros experimentos y de recientes estudios indica la importancia de dos fases de replicación distintas durante el ciclo de vida del prión, el agente infeccioso que causa las encefalopatías espongiformes. En la primera fase, se piensa que la replicación de la infectividad tiene lugar principalmente en los órganos linfoides [Eklund y col., Pathogenesis of scrapie virus infection in the mouse. J. Infect. Dis. 117, 15-22 (1967); Clarke, M. C. and Komberlin, R. H., Pathogenesis of mouse scrapie: distribution of agent in the pulp and stroma of infected spleens. Vet. Microbiol. 9, 215-225 (1984); Fraser, H. and Dickinson, A. G., Studies of the lymphoreticular system in the pathogenesis of scrapie: the role of spleen and thymus. J Comp Pathol 88, 563-573 (1978)]. Por ejemplo, se puede demostrar la infectividad en el bazo tan tempranamente como 4 días después de la infección i.p. o i.c. Esto es verdadero incluso si la infección tiene lugar vía la ruta intracerebral [Kimberlin, R. H. and Walker, C. A., Pathogenesis of experimental scrapie. Ciba. Found. Symp. 135, 37-62 (1988)], y la replicación del agente infeccioso en el bazo precede a la replicación intracerebral incluso si la infectividad es administrada intracerebralmente [Rubenstein y col., Scrapie-infected spleen: analysis of infectivity, scrapie-associated fibrils, and protease-resistant proteins. J. Infect. Dis. 164, 29-35 (1991)]. La infectividad también se puede acumular en otros componentes del sistema linforreticular (SLR), por ejemplo, en los nódulos linfáticos y en las placas de Peyer del intestino delgado, donde la replicación de la infectividad puede ser demostrada casi inmediatamente después de la administración oral de preparaciones de priones. El rápido establecimiento de una meseta del título infeccioso en el bazo, en un punto temporal relativamente temprano durante el tiempo de latencia, sugiere que la disponibilidad de los sitios de replicación del prión es limitante en el SLR. Sin embargo, no se sabe si esta meseta es debida a un número limitado de células del bazo que soportan la replicación del prión, o más bien a la disponibilidad limitada de los sitios de replicación del prión dentro de cada célula. La naturaleza de las células que soportan la replicación del prión dentro del SLR es incierta. La evidencia indirecta obtenida por estudios en los que se extrajo el bazo a intervalos variables después de la infección i.p., sugiere que el compartimento tisular es longevo y no se compone principalmente de linfocitos. Además, la ablación de los linfocitos mediante la irradiación total del cuerpo no parece afectar al tiempo de incubación del scrapie de ratón [Fraser y col., The scrapie disease process is unaffected by ionising radiation. Prog. Clin. Biol. Res. 317, 653-658 (1989)]. Tomados conjuntamente, estos y otros descubrimientos sugieren que las células dendríticas foliculares (CDF) pueden ser la población principal de células involucradas en la replicación de priones del SLR. En efecto, la PrP se acumula en las CDFs del bazo de ratones salvajes y desnudos, y la infección i.p. no conduce al scrapie cerebral en ratones SCID (cuyas CDFs se cree que no están funcionalmente deterioradas) mientras que provoca eficazmente la enfermedad en ratones desnudos que porten un defecto selectivo en las células T [Muramoto y col., Species barrier prevents an abnormal isoform of prion protein from accumulating in folicular dendritic cells of mice with Creutzfeldt-Jakob disease. J. Virol. 67, 6.808-6.810 (1993)].

Aunque se cree que las etapas delineadas anteriores son importantes en la historia natural de la encefalopatía espongiforme transmisible dentro de un organismo infectado, todavía no se conoce el factor limitante o entidad física implicada en el desarrollo y propagación de la encefalopatía espongiforme transmisible después de la infección periférica, es decir, el trasmisor físico del prión. Incluso aunque la precisa monitorización de la propagación epidémica de la encefalopatía espongiforme transmisible sea sumamente difícil de ejecutar por los largos tiempos de incubación implicados (hasta 30 años), parece ser verosímil que la infección periférica, por ejemplo mediante exposición alimentaria, sea la vía de propagación más relevante. Cualquier intento para combatir la encefalopatía espongiforme transmisible debería enfocarse, de este modo, en tales factores limitantes o entidades físicas implicadas en el desarrollo de la enfermedad después de la infección periférica. Sin embargo, el conocimiento detallado acerca de tales factores limitantes o entidades es un prerrequisito esencial para el diseño de enfoques terapéuticos mejorados para pretender interferir la replicación y propagación del prión dentro de una víctima infectada. Si bien un primer enfoque terapéutico basado en la administración de prednisolona como inmunosupresor ha sido recientemente propuesto por Aguzzi y col. en The Lancet 350: 1.519-1.520 (1997), el tratamiento propuesto es relativamente tosco y debería ser considerado como provisional puesto que afecta a muchos tipos de células además de los factores limitantes y entidad física que probablemente estén directamente involucrados en la propagación y replicación del prión.

Más aun, una vez que se conozca la identidad de los trasmisores físicos, se pueden hacer a medida, por adelantado, métodos apropiados para la separación de dichos trasmisores físicos de priones a partir de productos derivados de tejidos o fluidos corporales pretendidos para su uso médico o aplicación industrial.

Por consiguiente, existe la necesidad urgente de la identificación específica de los factores limitantes y entidades físicas en el desarrollo de la encefalopatía espongiforme después de la infección periférica. Existe la necesidad adicional de proporcionar medicamentos perfeccionados para combatir la encefalopatía espongiforme en organismos infectados, esto es, humanos y animales.

Aun más, existe la necesidad de proporcionar un método para la fabricación de un producto derivado de fluidos o tejidos corporales sin EET humana.

La satisfacción de las necesidades anteriores, así como de necesidades adicionales que llegarán a ser evidentes de ahora en adelante, es un objeto de la presente invención.

Sumario de la invención

Para satisfacer los objetos anteriores y satisfacer las necesidades anteriores, en una forma de realización la presente invención proporciona el empleo de reductores de células B y células T para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la encefalopatía espongiforme transmisible en humanos o animales infectados, en donde los reductores de células B y los reductores de células T son administrados simultáneamente, secuencialmente o por separado.

En una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un método para la fabricación de un producto derivado de fluidos o tejidos corporales sin EET humana, caracterizado porque dicho método comprende la etapa de separar in vitro las células B y las células T de dicho producto derivado de fluidos o tejidos corporales.

Las formas de realización adicionales de la presente invención están ordenadas en las reivindicaciones dependientes.

Descripción detallada de la invención

La presente invención implica investigaciones detalladas acerca de la naturaleza de los factores limitantes y/o entidades físicas en el desarrollo de la encefalopatía espongiforme después de la infección periférica. De este modo, la presente invención implica la identificación de los trasmisores físicos de priones y de los mecanismos implicados en la propagación de la infectividad.

Definiciones

Como se menciona en la presente solicitud, las células B (o linfocitos B) son entendidas como miembros de un subconjunto de células linfocíticas que son precursoras de células plasmáticas que producen anticuerpos; son capaces de reconocer antígenos libres y antígenos localizados en células.

Como se menciona en la presente solicitud, las células T son entendidas como miembros de un subconjunto de células linfocíticas responsables de la inmunidad celular y de la producción de sustancias inmunomoduladoras.

Como se menciona en la presente solicitud, el término "linfocitos" designa células que participan en la defensa inmune humoral y mediada por células, y que, de acuerdo con esto, comprende células B y células T.

Como se menciona en la presente solicitud, el término "animales" abarca todos los organismos eucariotas excluyendo las plantas.

Figuras

La Figura 1 muestra la histopatología del cerebro de ratones inmunodeficientes y de control después de la inoculación i.p. de priones de scrapie. La formación hipocampal fue inmunoteñida para proteína ácida fibrilar glial, y se microfotografiaron (200x) segmentos idénticos de la banda de células piramidales. En cerebros de ratones SCID, TNF-r1^{0/0}, t11 \muMT, deficientes en células T, y de control infectados fue visible una intensa gliosis difusa. Algunos ratones rag-2^{0/0} y \muMT mostraron encefalopatía espongiforme, pero otros del mismo genotipo no mostraron después de la inoculación i.p. ninguna patología después de periodos de tiempo similares, y eran indistinguibles de ratones C57BL/6 no infectados.

La Figura 2 tiene que ver con el análisis Western blot de cerebros de ratones inmunodeficientes después de la inoculación i.p. con priones de encefalopatías espongiformes transmisibles, y carecen de anticuerpos específicos contra PrP en ratones t11\muMT. Las Figs. a y b son Western blots de materia cerebral electroforetizada nativamente (-) o después de digestión con proteinasa K (PK)(+). Se detectaron grandes cantidades de proteína prión (PrP^{SC}) resistente a la PK en todos los ratones que habían desarrollado encefalopatía espongiforme, así como en un ratón agr^{0/0} (a) dos rag-2^{0/0} y dos \muMT (b). Un ratón deficiente además en células B resultó negativo para PrP^{SC} (no mostrado), y no se detectaron síntomas clínicos de encefalopatía espongiforme en ningún ratón deficiente en células B con independencia de la acumulación de PrP^{SC}. La Fig. c muestra un Western blot preparado con PrP murina recombinante de E. coli (PrP^{R}), extracto de proteína cerebral total de un ratón salvaje (WT), y extracto de proteína cerebral total de un ratón Prnp^{0/0} (0/0)^{15}. Los blots fueron incubados con suero de un ratón t11\muMT inoculado i.p. con priones (izquierda), depurado e investigado con anticuerpo monoclonal 6H4 para PrP recombinante (derecha). La presencia de anticuerpos específicos para PrP, como se indica por una banda de 20K en la vereda PrP^{R}, y por una aglomeración de bandas presente en la vereda WT pero ausente de la vereda 0/0, son indicios con anticuerpo 6H4 pero indetectable en suero t11\muMT. Marcadores de peso molecular relativo (de arriba a abajo): 105 K, 82 K, 45 K, 37'3 K, 28'6 K, 19'4 K. La Fig. d muestra el análisis FACS de inmunorreactividad de suero t11\muMT. Ordenada: recuentos de células; abscisa: logaritmo de la intensidad de la fluorescencia. El suero de un ratón t11\muMT, 210 días después de la inoculación i.p. con priones, fue diluido 1:10 y 1:100, tiño células EL4 infectadas con VSV (panel superior, área sin rellenar) casi tan fuertemente como el anticuerpo monoclonal VI24 específico para VSV (área rellena). Por contraste, la inmunorreacción de suero t11\muMT (1:10) con células T CD3+ de ratones C57BL/6, tga20, tg33 (ref. 29) y Prnp^{0/0} (paneles inferiores) no sobrepasaron el fondo, como el suero C57BL/6 normal en células EL4 (panel superior, línea de puntos). Se obtuvieron los mismos perfiles cuando se tiñeron sondas con suero de ratones t11\muMT sin tratar (datos no mostrados).

Las Figuras 3a y 3b exhiben una impresión del análisis de flujo que muestra poblaciones de células B y células T enriquecidas.

La Figura 4 muestra la infectividad de esplenocitos en ratones salvajes y ratones Spleen.

Las Figuras 5a-5c muestran la infectividad en diferentes tipos celulares de ratones salvajes, ratones células T y ratones Spleen.

Investigaciones realizadas por los inventores El papel de las células B

Como es evidente a partir de la técnica anterior, el desarrollo de la enfermedad neurológica, después de la infección periférica con encefalopatía espongiforme transmisible, depende de la expansión anormal de los priones dentro de las células del sistema linforreticular^{3.4}. Sin embargo, el hombre especializado es consciente de que el sistema inmune consta de varios componentes cuya identidad y función precisa e interacción específica con los componentes restantes son todavía el objeto de una extensa investigación científica. Los inventores han investigado desde el primer momento los papeles de los diferentes componentes del sistema inmune, utilizando un panel de ratones inmunodeficientes inoculados intraperitonealmente con priones, y encontraron que los defectos que llevan a cabo únicamente las células T no tenían efecto aparente, pero que todas las mutaciones que interrumpieron la diferenciación y la respuesta de las células B impidieron el desarrollo de la encefalopatía espongiforme clínica. Ya que una ausencia de células B y de anticuerpos tiene correlación con defectos severos en las células dendríticas foliculares, una carencia de cualquiera de estos tres componentes puede evitar el desarrollo de la encefalopatía espongiforme clínica. La función clave de las células dendríticas foliculares ha sido postulada, entre otros, por Muramoto, ver arriba. Sin embargo, los inventores descubrieron, sorprendentemente, que la encefalopatía espongiforme se desarrolló, después de la inoculación periférica, en ratones expresando inmunoglobulinas que eran exclusivamente de la subclase M y sin especificidad detectable para la forma normal de la PrP^{C} prión, y en ratones que tenían células B pero no células dendríticas foliculares funcionales. De este modo, los inventores han averiguado que las células B diferenciadas son cruciales para la neuroinvasión por la encefalopatía espongiforme, indiferente a la especificidad de sus receptores.

El efecto de los defectos inmunológicos combinados sobre la patogénesis de la encefalopatía espongiforme fue estudiado en ratones deficientes en rag-2 (ref. 5) y rag-1 (ref. 6), los cuales carecen de células B y T, en ratones SCID (inmunodeficiencia combinada severa), y en ratones agr^{0/0}, los cuales carecen de rag-2 así como de los receptores para interferón-\alpha/\beta^{7} e interferón-\gamma^{8}. Tales ratones fueron obtenidos conforme a métodos bien conocidos en la técnica de la ingeniería genética. Para los controles, también se inocularon ratones endogámicos de las cepas C57BL/6 y 129/Sv, las cuales son los antecedentes genéticos de todas las otras cepas de ratón utilizadas. Para investigar el papel de las células T, los inventores utilizaron ratones con una interrupción dirigida de los genes que codifican CD4 (ref. 9), CD8 (ref. 10), \beta_{2}-microglobulina^{11} o perforina^{12}. Se estudió el agotamiento selectivo de células B en ratones \muMT^{13}, los cuales tienen una interrupción dirigida del exón transmembrana del gen de la cadena u de las inmunoglobulinas, no producen ninguna inmunoglobulina y padecen de un bloqueo de la diferenciación de las células B en la transición de precélulas B grandes a pequeñas, todavía portan subconjuntos de células T completas y funcionales.

Después del desafío intracerebral (i.c.) con priones, todos los ratones inmunodeficientes desarrollaron síntomas clínicos de encefalopatía espongiforme. Esto fue confirmado mediante análisis histopatológico (no mostrado) y por la transmisión de la enfermedad a ratones tga20 indicadores, los cuales sobreexpresan la proteína prión normal (PrP^{C}) y son hipersensibles a la encefalopatía espongiforme^{14} (Tabla 1). La transmisión a ratones Prnp^{0/0} ^{15}, los cuales no expresan PrP^{C} y son resistentes a la encefalopatía espongiforme^{16} (n=4), no indujeron la enfermedad después de >210 días, como se esperaba para la genuina encefalopatía espongiforme. En todos los grupos, los tiempos de latencia desde la inoculación hasta la primera aparición de los síntomas clínicos y hasta la enfermedad terminal (Tabla 2), así como los títulos de infectividad (Tabla 1), fueron similares a los de los ratones de control.

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De este modo, donde los priones se liberaron al sistema nervioso central, la patogénesis de la encefalopatía espongiforme y la expansión de los priones en el cerebro procedieron sin ninguna influencia detectable del estado inmune del huésped.

Cuando los ratones fueron expuestos a priones a través de la vía intraperitoneal (i.p.), los ratones homocigotos nulos para CD4, CD8, \beta_{2}-microglobulina o perforina desarrollaron los síntomas iniciales de la enfermedad y encefalopatía espongiforme terminal con periodos de latencia similares a los de los ratones C57BL/6 y 129/Sv (Tabla 2), y alcanzaron títulos priónicos análogos tanto en el bazo como en el cerebro (Tabla 1). De este modo, los inventores concluyeron que las células T citotóxicas CD8+ y ayudadoras CD4+ no son limitantes para la encefalopatía espongiforme después de la inoculación periférica de priones, de acuerdo con la observación de que los ratones desnudos desarrollan encefalopatía espongiforme normalmente después de la inoculación i.p.^{3}.

Por contraste, no apareció la enfermedad después de inoculación i.p. en ratones \muMT y en deficientes en rag (rag-1^{0/0}, rag-2^{0/0} y agr^{0/0}), y no fue detectable la infectividad de priones en sus bazos (Tabla 1). En ratones C57BL/6 SCID, la enfermedad fue prolongada ligeramente, lo cual no está de acuerdo con los primeros resultados^{4.17} y puede ser debido a la incompleta inmunodeficiencia de los ratones SCID en antecedentes genéticos específicos^{18.19}, debido a que los ratones C.B-17 SCID (cuyo defecto inmunológico es menos permeable) no desarrollaron la enfermedad ((Tabla 2). La diferenciación de las células B para la inmunocompetencia muestra redundancia en muchos puntos; eso hace a tales células solo parcialmente sensibles a la manipulación genética.

El examen histopatológico de secciones cerebrales reveló encefalopatía espongiforme generalizada en todos los ratones salvajes e inmunodeficientes, clínicamente diagnosticados como enfermos de encefalopatía espongiforme (Fig. 1). Además, y a pesar de la carencia de síntomas clínicos, se observó la encefalopatía espongiforme en 1/7 ratones deficientes en rag y 1/6 \muMT (en un muestreo al azar) 342 y 436 días después de la inoculación i.p. (Fig. 1), y se encontraron títulos priónicos significativos en los cerebros de 3/7 ratones deficientes en rag y 1/3 ratones \muMT (Tabla 1). El análisis Western blot reveló la acumulación de la forma de prión PrP^{SC} de la enfermedad en los cerebros de 2/6 ratones deficientes en rag y 2/6 \muMT inoculados i.p. (Fig. 2). Los restantes ratones deficientes en rag y \muMT no acumularon PrP^{SC} tan tarde como 504 días después de la inoculación.

En atención al escrutinio absoluto, se puede concluir que los últimos descubrimientos son compatibles con una incipiente encefalopatía espongiforme en una fracción menor de ratones deficientes en células B. Por lo tanto, aunque en la mayoría de los casos se evite la "neuroinvasión" del agente de la encefalopatía espongiforme, la ausencia de células B deja al descubierto un mecanismo de patogénesis más lento, <50% eficiente, que puede causar encefalopatía espongiforme en situaciones de inmunodeficiencia. Se debería enfatizar que, incluso entonces, la deficiencia de células B prolonga la demora entre la acumulación de PrP^{SC}, el comienzo de la histopatología de la encefalopatía espongiforme y los síntomas clínicos más allá de la esperanza de vida típica de los ratones.

Estos resultados sugieren que las células B pueden "transportar" priones desde los órganos linfoides hasta el tejido nervioso. Alternativamente, la evidente protección de los ratones deficientes en células B de los priones administrados i.p. puede resultar de la ausencia de inmunoglobulinas. La acomplejación de la PrP^{SC} con anticuerpos puede favorecer la nucleación (un proceso propuesto para servir de base a la formación de infectividad de priones^{20}) o puede opsonizar la PrP^{SC} e intensificar el acceso a los sitios linfoides de expansión anormal del prión. También puede sugerir que los animales llegan a ser más capaces de propagar la infección si el cambio genético es más tardío en el desarrollo de las células B. Para aclarar esta cuestión, los inventores inocularon ratones t11\muMT (ratones t11\muMT expresando un transgen de IgM reordenado dirigido contra la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular) y se encontró que podían soportar la diferenciación normal de las células B, pero expresaban exclusivamente la cadena pesada transgénica de IgM, tenían un repertorio de anticuerpos groseramente sesgado y muy limitado, y carecían de inmunoglobulinas de las subclases D, G, E y A. Tales ratones fueron obtenidos conforme a métodos bien conocidos en la técnica.

Después de la inoculación i.p. con priones, los ratones t11\muMT desarrollaron la enfermedad con una latencia comparable a la de ratones salvajes (Tabla 2), y acumularon PrP^{SC} en sus cerebros (Fig. 2b). El suero de ratones t11\muMT inoculados i.p., tanto los no infectados como los enfermos terminalmente de encefalopatía espongiforme, demostró, mediante análisis western blotting y por separación de células activada por fluorescencia (FACS), que no reaccionaba cruzadamente con la PrP^{C} (Fig. 2c, d), sugiriendo que las IgGs no son los efectores de la "neuroinvasión" por priones, y que no se puede correlacionar una respuesta inmune humoral específica (al menos como se evalúa mediante FACS y análisis western blot) con la patogénesis periférica de la encefalopatía espongiforme. Sin embargo, en atención al escrutinio absoluto, no se puede excluir la posibilidad de que las IgMs por debajo del umbral de detectabilidad, o los efectos indirectos de los anticuerpos, puedan estar implicados en la patogénesis de la encefalopatía espongiforme. Esto se corresponde con la dificultad para obtener una transmisión fidedigna de la enfermedad a partir de componentes del suero solubles de animales enfermados.

Las células B son necesarias para la maduración de las células dendríticas foliculares (CDFs) y la formación de centros germinales. La protección de los ratones deficientes en células B puede resultar, por lo tanto, de la ausencia de CDFs, especialmente a medida que las CDFs acumulen PrP^{SC} extensamente en ratones inoculados i.p.^{3} y en las amígdalas de pacientes que padecen la nueva variante CJD^{21}. De este modo, los inventores inocularon ratones careciendo del receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNF-R1^{0/0})^{22}, los cuales no tienen prácticamente centros germinales en los órganos linfáticos y muy pocas CDFs^{23}, si las hubiera, a pesar de la diferenciación de las células B y T funcionales. Estos ratones desarrollaron encefalopatía espongiforme después de la inoculación tanto i.c. como i.p., como lo hicieron los ratones de control (Tabla 2), refutando de este modo un papel principal para las CDFs en la patogénesis periférica y apoyando los resultados previos de los inventores de que la transferencia adoptiva de células de hígado fetal (que no reemplazan eficazmente a las CDFs^{24}) pueda restaurar los altos títulos de priones después de la inoculación i.p.^{25}.

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TABLA 1 Síntomas del scrapie, histopatología del scrapie y títulos de infectividad en ratones inmunodeficientes

1

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TABLA 2 Latencia del scrapie en diferentes ratones inmunodeficientes

2

De este modo, los inventores han identificado células B y procesos dependientes de células B como factor limitante en el desarrollo de la encefalopatía espongiforme transmisible después de la infección periférica. Por consiguiente, la presente invención proporciona un nuevo, específico y, por lo tanto, procedimiento más preferible para suprimir ese componente del sistema inmune que es responsable de la propagación de priones, a saber, las células B.

El papel de las células T

Aun más, los inventores han estudiado el papel de los procesos dependientes de células B durante la patogénesis. Por consiguiente, los inventores han llevado a cabo experimentos adicionales teniendo la mirada puesta en establecer la cantidad y naturaleza de la posible interacción de células B infectivas con los restantes componentes del sistema inmune, por ejemplo con las células T. Los resultados de la indagación acerca de tal interacción y el diseño de medidas terapéuticas apropiadas que influyan en tal interacción, son un aspecto adicional que afecta a la presente invención.

Como se indicó antes, se sabe que los ratones desprovistos de genes PrP funcionales (Prn-p^{0/0}) son resistentes a la encefalopatía espongiforme transmisible y no propagan priones (Büeler y col., Cell 73, 1.339-1.347, 1993). De este modo, la reintroducción de transgenes PrP dentro de Prn-p^{0/0} debería restablecer la encefalopatía espongiforme transmisible. Partiendo de este concepto, los inventores condujeron estudios en ratones Prn-p^{0/0} transgénicos para genes PrP controlados mediante promotores tejido-específicos. Tales ratones pueden ser obtenidos por el hombre especializado en ingeniería genética según métodos bien conocidos en la técnica. Específicamente, los inventores utilizaron "ratones células T" (promotor Ick; Chaffin y col., EMBO J. 9, 3.821-3.829) que expresan PrP exclusivamente en células T, y "ratones bazo" (promotor IRF-1/activador Eu; Yamada y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 532-536, 1991) que expresan PrP en esplenocitos y a bajo nivel en el cerebro. El desafío de ratones bazo con priones condujo al desarrollo de encefalopatía espongiforme porque los ratones bazo sucumbieron en la última etapa debido a la enfermedad cerebral, y presentaron propagación de priones en el bazo y timo así como en el cerebro. Por otra parte, los ratones células T no mostraron propagación de priones. Por consiguiente, estos resultados son completamente coherentes con los experimentos de priones como se describió antes, y confirman el papel crucial de las células B (Tabla 3).

TABLA 3

3

Para investigar además el papel de los procesos dependientes de las células B, en una segunda etapa se determinó selectivamente la infectividad de los esplenocitos de ratones bazo en un bioensayo. Se encontró que, aunque la mayor parte de la infectividad fue verdaderamente llevada a cabo por las células B, las células T también contaminaron hasta cierto punto (Tabla 4).

TABLA 4

4

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Esta contaminación recién encontrada mostrada por las células T de los ratones bazo parece estar en contradicción con el hecho de que las células T de los ratones células T no muestren ninguna contaminación (ver Figuras 4 y 5). Sin embargo, lo que inicialmente parece ser una contradicción (infectividad de las células T en algunos casos, no infectividad de las células T en otros casos), en realidad presupone y apoya la existencia de una interacción entre las células B (los trasmisores de la infectividad) y las células T (que, tal cual, no son capaces de propagar la infectividad). Los ratones bazo contienen ambas células T y células B, y en la infección de las células B, tiene lugar una infección secundaria, mediada por células B, de las células T de los ratones bazo. Por el contrario, los ratones células T no contienen células B, y como consecuencia de esta carencia de trasmisores de la infectividad, las células T de los ratones células T no son propensos a la infección. De este modo, la provisión de reductores de células T para el tratamiento de la encefalopatía espongiforme transmisible es un aspecto adicional de la invención.

Conclusiones

Como se indicó antes, se ha identificado el trasmisor crucial de la infectividad, es decir las células B.

En particular, el descubrimiento anterior de que los linfocitos B, mediante la autolisis de células B por antígenos de superficie limita o previene la transmisión de la infección de la enfermedad priónica, demuestra que la ausencia de tales componentes celulares evita la transferencia de infectividad a otras células, tales como las células T, o el desarrollo de la enfermedad.

Aspectos adicionales y formas de realización preferidas de la invención

Un objeto adicional de la presente invención es el empleo de reductores de células B y células T para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la encefalopatía espongiforme transmisible en humanos o animales infectados, en donde los reductores de células B y los reductores de células T son administrados simultáneamente, secuencialmente o por separado. Un "reductor de células B", como se menciona en la presente solicitud, es un reactivo o un juego de reactivos que, en la administración sola, conjunta o secuencialmente, conduce a la reducción de células B en el organismo a tratar. Cualquier reductor de células B conocido en la técnica puede ser utilizado para lograr el anterior objeto establecido de la presente invención. Los reductores de células B apropiados comprenden cualquier biomolécula inmunológicamente activa como por ejemplo anticuerpos, así como compuestos químicos inmunosupresivamente activo. Como ejemplo no limitante, los anticuerpos anti-\muM descritos por R. S. Fujinami y col. en Journal of Virology, 69, 1995, págs. 5.152-5.155, la revelación del cual está por este medio incorporado por referencia, son reductores de células B preferidos conforme a la presente invención. Un ejemplo adicional de un reductor de células B conforme a la presente invención es el anticuerpo LR1, como se describe adicionalmente a continuación. Un ejemplo adicional de reductor de células B conforme a la presente invención es el anticuerpo B220, como se describe adicionalmente a continuación. También los anticuerpos para linfocitos B malignos, útiles para el tratamiento del linfoma de linfocitos B, son a menudo interreactivos con células B normales, y también pueden ser útiles por lo que toca a la presente invención. En la bibliografía existen ejemplos de tales anticuerpos. Por ejemplo, Epstein y col. describen la preparación de dos de tales anticuerpos, denominados Lym-1 y Lym-2, en Two new Monoclonal Antibodies Lym-1 and Lym-2, Reactive with Human B-Lymphocytes and Derived Tumors, with Immunodiagnostic and Immunotherapeutic Potential, Cancer Research, 47, 830-840 (1987). Puesto que es posible que en algún caso, si no en muchos casos, la población de células B puede no compartir todos los marcadores superficiales idénticos, puede ser necesario utilizar más de un anticuerpo para conseguir eficazmente la reducción deseada de células B. La presente invención imagina la utilización de tantos anticuerpos como sea necesario, para consumar este objetivo.

Además, la presente invención prevé el empleo de anticuerpos no modificados ("desnudos"), así como de anticuerpos conjugados con un agente citotóxico, toxina o radionucleido apropiado. Los radioisótopos apropiados incluyen ^{131}I, ^{90}Y, ^{67}Cu. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos yodados son bien conocidos en la técnica, y tales preparaciones se pueden realizar fácilmente en radiofarmacias de hospitales.

El anticuerpos también puede ser conjugado, mediante procedimientos descritos en la técnica, con fármacos citotóxicos conocidos tales como el metotrexato, la aminopterina, la mitoxantrona, la vincristina, la vinblastina, la doxorrubicina y otros, o con toxinas vegetales tales como la abrina, la ricina u otras, o sus subunidades inactivadoras de ribosomas, o cualquier otro agente conocido por tener propiedades citotóxicas.

Además, la presente invención contempla el empleo de anticuerpos genéticamente, enzimáticamente o químicamente alterados que reconocen las células B, por lo que las regiones constantes han sido alteradas o reemplazadas con dominios que fijan proteínas del complemento o provocan la destrucción de células diana en virtud de la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (CCDA), activando así el propio sistema inmune del paciente.

Ejemplos adicionales no limitantes de reductores de células B contemplados por la presente invención son compuestos químicos como la ciamexona (Patente US 5.055.290) y el imexón (Patente US 5.369.119), las revelaciones de las cuales están, por este medio, incorporadas por referencia.

Un "reductor de células T", como se menciona en la presente invención, es un reactivo o un juego de reactivos que, en la administración sola, conjunta o secuencialmente, conduce al agotamiento de las células T en el organismo a tratar. Se puede utilizar cualquier reductor de células T conocido en la técnica para conseguir el anterior objeto establecido de la presente invención. Los reductores de células T apropiados comprenden biomoléculas inmunológicamente activas como por ejemplo anticuerpos, así como compuestos químicos inmunosupresivamente activos. Un ejemplo no limitante de un anticuerpo apropiado que actúa como reductor de células T es el anticuerpo Thy 1.2, como se describe más adelante. Un ejemplo no limitante adicional de un péptido cíclico reductor de células T es la ciclosporina A.

Las composiciones terapéuticas (esto es, los medicamentos) de la presente invención pueden ser administradas parenteralmente por inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea (intranasofaríngealmente), dermoabsorción, oralmente, intraocularmente o intracerebroventricularmente (i.c.v.). Las composiciones pueden alternativamente ser administradas intramuscularmente o intravenosamente. Las composiciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones o emulsiones estériles acuosas o no acuosas, Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Se pueden utilizar soportes o vendajes oclusivos para incrementar la biodisponibilidad. Las formas de dosificación líquida para administración oral pueden constar, generalmente, de una solución de liposomas conteniendo la forma de dosificación líquida. Las formas apropiadas para suspender liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes y elixires conteniendo diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tales como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, tales composiciones pueden incluir también adyuvantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, o agentes edulcorantes, saborizantes o perfumantes.

Según la presente invención, una "cantidad eficaz" de medicamento es la que sea suficiente para lograr el efecto biológico deseado. Generalmente, la dosificación necesaria para proporcionar una cantidad eficaz de medicamento variará dependiendo de factores tales como la edad, estado, sexo del humano o animal, y alcance de la enfermedad, si la hubiese, y otras variables que se puedan ajustar por uno de habilidad normal en la técnica.

Un aspecto adicional de la invención es un método de fabricación de un producto de fluidos corporales sin EET humana. De este modo, conforme a la invención, se obtienen in vitro productos de fluidos corporales no infectivos separando específicamente células B y células T de fluidos corporales o de conocidos productos de fluidos corporales. Aunque para la separación específica de células B de fluidos corporales se podría utilizar cualquier método apropiado conocido por el hombre especializado en la técnica, se prefiere la separación específica por medio de inmunorreactantes específicos para células B como, por ejemplo, anticuerpos específicos para células B. Ejemplos apropiados pero no limitantes de tales anticuerpos específicos para células B son los anticuerpos B220 o LR1 disponibles comercialmente, o los anticuerpos anti-\muM, ver arriba. El término "separación específica por medio de anticuerpos específicos para células B" abarca cualquier método de separación que comprenda el uso de reactivos para separación, constando de anticuerpos específicos para células B, para la identificación de células B en productos de fluidos corporales. Los reactivos para separación constando de anticuerpos específicos para células B son anticuerpos específicos para células B que están conjugados a una fase sólida o que son capaces de interaccionar ellos mismos con una fase sólida, vía medios químicos o físicos, o en virtud de una derivatización apropiada de manera que se inmovilicen directa o indirectamente sobre dicha fase sólida, para permitir la separación de la mezcla de reacción.

Aunque se pudiese utilizar cualquier método apropiado conocido por el hombre especializado en la técnica para la separación específica de células T a partir de fluidos corporales, se prefiere la separación específica por medio de inmunorreactantes específicos para células T como, por ejemplo, anticuerpos específicos para células T. Un ejemplo apropiado pero no limitante de tal anticuerpo específico para células T es el Thy 1.2. El término "separación específica por medio de anticuerpos específicos para células T" abarca cualquier método de separación que comprenda el uso de reactivos para separación, constando de anticuerpos específicos para células T, para la identificación de células T en productos de fluidos corporales. Los reactivos para separación constando de anticuerpos específicos para células T son anticuerpos específicos para células T que están conjugados a una fase sólida o que son capaces de interaccionar ellos mismos con una fase sólida, vía medios químicos o físicos, o en virtud de una derivatización apropiada de manera que se inmovilicen directa o indirectamente sobre dicha fase sólida, para permitir la separación de la mezcla de reacción.

Un aspecto adicional de la invención es un método de fabricación de un producto derivado de tejidos sin EET humana. De este modo, conforme a la invención, se obtienen productos derivados de tejidos no infectivos separando específicamente células B y células T de productos derivados de tejidos in vitro. Aunque para la separación específica de células B productos derivados de tejidos se podría utilizar cualquier método apropiado conocido por el hombre especializado en la técnica, se prefiere la separación específica por medio de inmunorreactantes específicos para células B como, por ejemplo, anticuerpos específicos para células B. Ejemplos apropiados pero no limitantes de tales anticuerpos específicos para células B son los anticuerpos B220 o LR1 disponibles comercialmente, o los anticuerpos anti-\muM. El término "separación específica por medio de anticuerpos específicos para células B" abarca cualquier método de separación que comprenda el uso de reactivos para separación, constando de anticuerpos específicos para células B, para la identificación de células B en productos derivados de tejidos. Los reactivos para separación constando de anticuerpos específicos para células B son anticuerpos específicos para células B que están conjugados a una fase sólida o que son capaces de interaccionar ellos mismos con una fase sólida, vía medios químicos o físicos, o en virtud de la derivatización apropiada de manera que se inmovilicen directa o indirectamente sobre dicha fase sólida, para permitir la separación de la mezcla de reacción.

Aunque para la separación específica de células T a partir de productos derivados de tejidos se pudiese utilizar cualquier método apropiado conocido por el hombre especializado en la técnica, se prefiere la separación específica por medio de inmunorreactantes específicos para células T como, por ejemplo, anticuerpos específicos para células T. Un ejemplo apropiado pero no limitante de tal anticuerpo específico para células T es el Thy 1.2. El término "separación específica por medio de anticuerpos específicos para células T" abarca cualquier método de separación que comprenda el uso de reactivos para separación, constando de anticuerpos específicos para células T, para la identificación de células T en productos derivados de tejidos. Los reactivos para separación constando de anticuerpos específicos para células T son anticuerpos específicos para células T que están conjugados a una fase sólida o que son capaces de interaccionar ellos mismos con una fase sólida, vía medios químicos o físicos, o en virtud de una derivatización apropiada de manera que se inmovilicen directa o indirectamente sobre dicha fase sólida, para permitir la separación de la mezcla de reacción.

La presente invención será descrita ahora a modo de ejemplos, los cuales se quiere que ilustren el campo de aplicación de la presente invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Generación de ratones t11 \muMT

El segmento del gen V de la cadena pesada de inmunoglobulina de la cadena pesada del hibridoma VI41 de células B (ref. 27), que secreta un anticuerpo neutralizador del VSV, fue clonado dentro de un vector de expresión codificando la cadena \mu del alotipo a de ratón. Se generaron ratones transgénicos y se cruzaron, con uno de sus padres, para ratones \muMT. Los ratones t11 \muMT expresaron exclusivamente la cadena \mu transgénica del alotipo a; en su suero no se detectaron IgM endógeno del alotipo b e inmunoglobulinas de otras subclases (no mostrado).

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Ejemplo 2

(Comparativo)

1. Inoculación de scrapie

Se inocularon ratones con un homogenado al 1% de cerebro, tratado con calor y Sarcosyl, preparado a partir de ratones infectados con la cepa de scrapie del laboratorio Rocky Mountain (RML). Se utilizaron treinta microlitros para inyección intracraneal (i.c.), mientras que se administraron 100 \mul por vía intraperitoneal (i.p.). Los ratones fueron monitorizados cada segundo día, y se diagnosticó el scrapie conforme a criterios clínicos estándar.

2. Análisis Western blot

Se prepararon homogenados de cerebro al diez porciento como se describió^{16} y, donde se indicó, se digirieron con 20 \mug/ml de proteinasa K durante 30 minutos a 37ºC. Después, se sometieron a electroforesis ochenta \mug de proteína total a través de gel de SDS-poliacrilamida al 12%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, se ensayaron con anticuerpo monoclonal 6H4 (Prionics Ag, Zurich) o antisuero policlonal IB3 (referencia 26) contra PrP de ratón, y se desarrolló por quimioluminiscencia intensificada.

3. Detección de anticuerpos PrP

Los lisados de cerebro de ratones salvajes y Prnp^{0/0}, así como PrP de E. coli recombinante, fueron sometidos a electroforesis a través de un gel de SDS-poliacrilamida al 12'5% y transferidos a membranas de nitrocelulosa. Después, las membranas fueron incubadas con suero (diluido 1:100) de ratones infectados, enfermos terminales de scrapie. La visualización se logró por quimioluminiscencia intensificada, como se describió anteriormente para el Western-blot.

4. Estudios inmunohistoquímicos

Se fijaron tejidos cerebrales de cada ratón, se inactivaron durante 1 hora con ácido fórmico del 98%, se incrustaron en parafina y se sometieron a tinción convencional y a inmunotinción para proteína ácida fibrilar glial conforme a un procedimiento estándar. Se detectó gliosis (un indicador no específico pero temprano de daño cerebral) por la presencia de grandes astrocitos reactivos inmunoteñidos. En ratones enfermos terminales de scrapie, se vio consistentemente una extendida vacuolación a través de todo el sistema nervioso central.

5. Bioensayos de infectividad

Se prepararon homogenados de cerebro y bazo (p/v, 10% en sacarosa 0'32M) a partir de animales infectados como se describió, y se administró i.c. 30 \mul (diluidos 1:10 en salino tamponado con fosfato conteniendo 1% de BSA) a grupos de al menos 4 ratones tga^{20} para cada muestra. Se determinó el tiempo de incubación hasta el desarrollo de la enfermedad terminal por scrapie, y se calcularon los títulos de infectividad utilizando la relación y = 14'37 - 0'11x, donde y es la ID_{50} y x es el tiempo de incubación (en días) para enfermedad terminal.

6. Preparación de solenocitos

Se recogieron bazos de ratones a los 34 días después de la inoculación i.p. con la cepa RML de priones. Se prepararon suspensiones de esplenocitos, forzando los bazos a través de un tamiz de malla fina, en 25 ml de tampón para separación de células activada magnéticamente (MACS). El tampón MACS está compuesto de salino tamponado con fosfato conteniendo 1% de BSA, EDTA 5 mM y 0'1% de azida sódica. Después de una incubación de 15 minutos en hielo para permitir que los agregados celulares se asentasen, se sacaron para su evaluación posterior.

7. Anticuerpos

De Milteny Biotech GmbH se obtuvieron anticuerpos conjugados a microcuentas superparamagnéticas que reconocían específicamente células B y T (anti-B220 de ratón, anti-Thy 1.2, anti-IgM y anti-CD3). Todas las columnas de separación magnética (Columna A2 y CS) fueron también obtenidas de Milteny Biotech GmbH. Se obtuvo complemento de conejo de Cedariane, Ontario (Low-tox-M rabbit complement). De Serotec se obtuvieron anticuerpos adicionales (LR1, ratón anti-Thy 1.2 de ratón).

8. Purificación de células B y T por separación con cuentas magnéticas

Se centrifugó cinco ml de suspensión de esplenocitos a 100 rpm durante 10 minutos, y se recuperó el gránulo celular en \approx 0'6 ml de tampón MACS. Después, las células fueron incubadas con 75 \mul de microcuentas superparamagnéticas conjugadas con B-200 o Lthy 1.2, según las instrucciones del fabricante (Milteny Biotech GmbH), durante 15 minutos a 4ºC. A continuación de la incubación, se ajustó el volumen total a 2 ml con tampón MACS, y se cargó sobre una columna A2 prerrellenada y lavada (columna de separación magnética). Las células no asociadas con las microcuentas magnéticas fueron eluidas con 5 ml de tampón MACS. Luego, se extrajo la columna del campo magnético y se lavó a contracorriente para sacar las células extraídas. Luego, se repite el proceso de separación y la población final enriquecida de células B o T es eluída con 11 ml de tampón MACS después de que la columna haya sido extraída del campo magnético.

9. Lisis por complemento

Para mejorar más aun la pureza de la población de células B y T obtenida por separación magnética, se realizó una lisis por complemento de la población enriquecida de células B y T. Las células fueron granuladas y resuspendidas en medio para citotoxicidad (CM, medios RPMI-1640 conteniendo HEPES 25 mM y 0'3% de BSA) hasta una concentración de 1-3x10^{7} células/ml. Para la reducción de las células B, se utilizó un anticuerpo específico para células B, por ejemplo LR1. Mientras, para la reducción de las células T se utilizó un anticuerpo específico para células T, por ejemplo Thy 1.2. Para las fuentes de anticuerpos específicos, se necesitaría determinar individualmente la concentración efectiva óptima de anticuerpo. La incubación con los anticuerpos se realiza a 4ºC durante 60 minutos, después de lo cual las células fueron resuspendidas en LCM conteniendo 20% de complemento de conejo Low-tox-M, e incubadas a 37ºC durante 60 minutos para permitir la lisis celular. Luego, se separaron las células viables de las células muertas y del detritus por centrifugación sobre Limpholyte-M (Cedarlane, Ontario) u otro medio de separación celular según las instrucciones del fabricante.

10. Preparación celular para análisis por citometría de flujo

Para el análisis de citometría de flujo se preparó una suspensión celular única en tampón FACS constando de salino tamponado con fosfato conteniendo 2% de FCS, EDTA 20 mM y 1% de azida sódica. Cuando se utilizaron muestras sanguíneas periféricas, la población de linfocitos fue enriquecida por extracción por lisis de los glóbulos rojos de sangre heparinizada. El proceso de tinción celular consiste en incubar la población de células con una concentración saturadora de anticuerpos conjugados con fluoresceína (FITC), durante 30 minutos a 4ºC. Después, las células fueron lavadas con tampón FACS para eliminar la materia no unida y someter a análisis de flujo. Cuando se utilizó el método de tinción indirecta, las poblaciones de células fueron primero incubadas con el anticuerpo primario durante 30 minutos a 4ºC, lavadas con tampón FACS y a continuación 30 minutos adicionales de incubación a 4ºC con un anticuerpo secundario conjugado con FITC. Después de la eliminación de los anticuerpos secundarios conjugados con FITC no unidos, las poblaciones de células fueron leídas entonces por análisis de flujo.

Discusión de los Resultados del Ejemplo 2 1. Determinación de la infectividad por scrapie

La infectividad de materia cerebral de ratones infectados con scrapie se demostró mediante infección i.c. de ratones tga20 indicadores. La infectividad fue determinada inyectando i.c. muestras de 30 \mul en ratones tga20 y determinando el tiempo hasta la manifestación de la enfermedad mediante un procedimiento histoquímico estándar. La Tabla 5 ilustra un resultado típico de tal análisis. Este análisis da el índice de éxito de transmisión de la enfermedad y el tiempo de duración/incubación para la expresión de los síntomas de la enfermedad. Por lo tanto, el ensayo revela la susceptibilidad de la cepa huésped a la enfermedad y, de este modo, permite la determinación de los tipos celulares críticos necesarios para la transmisión de la enfermedad.

TABLA 5 Determinación de la infectividad por scrapie

5

2. Evaluación de las células diana potenciales para la transmisión del scrapie por metodología genética

Se estudió el efecto de los defectos inmunes en la patogénesis del scrapie en ratones deficientes en células T, células B o con defectos en células B/T combinados. Se han generado algunos genotipos diferentes de ratones que sean apropiados, y para una persona especializada en la técnica será evidente la selección del tipo a utilizar. El éxito de la infección se determina por examen de los síntomas de la enfermedad, la patología y por el bioensayo de infectividad. La Tabla 1 ilustra un típico resultado de tal análisis. Este análisis da el tiempo de incubación desde la infección hasta la presentación de los síntomas, la presencia o ausencia de síntomas y características patológicas. Además, el bioensayo de infectividad proporciona información relativa a la latencia de los agentes infectivos en los tejidos cerebrales y esplénicos del huésped infectado primario. Correlacionando la expresión de la enfermedad y el genotipo de los animales infectados, la Tabla 1 ilustra que, si el agente infectivo es introducido por la vía i.c., todos los genotipos expresan la enfermedad en cuanto a los defectos de sus células B o células T. Alternativamente, examinando la capacidad infectiva (secundaria) de los tejidos cerebrales y esplénicos de los huéspedes infectados primarios, se puede examinar el linaje de las células diana potenciales de la transmisión del scrapie. De este modo, la Tabla 2 ilustra además que, después de la inoculación i.c., solamente aquellos genotipos con funciones intactas de las células B son capaces de demostrar la infectividad secundaria en los tejidos esplénicos.

Tomando una vía más periférica de infección primaria, esto es, la inoculación i.p., se puede delinear adicionalmente la propagación de la enfermedad. Esto está adicionalmente ilustrado en la Tabla 1. El análisis demuestra que, seleccionando animales con defectos linfocitarios específicos, se pueden identificar específicamente los tipos celulares linfoides críticos para la transmisión de la enfermedad del scrapie. Estos resultados sugieren que las células B pueden "transportar" priones desde los órganos linfoides hasta los tejidos nerviosos (el modo de transporte no se limita al transporte directo asociado a las células, sino también pueden ser complejos con diversos productos celulares. Los componentes no están limitados, pero pueden incluir anticuerpos, PrP^{C}, PrP^{SC} y otros productos celulares
similares).

3. Evaluación del papel de las células linfoides en la transmisión de las enfermedades priónicas

Los componentes celulares de tejidos linfoides periféricos, por ejemplo el bazo y los nódulos linfáticos, pueden ser obtenidos fácilmente de animales. Tales condiciones están descritas por la bibliografía pública.

Los componentes celulares obtenidos pueden ser adicionalmente separados por anticuerpos específicos para marcadores superficiales diferenciales para los diversos tipos celulares linfoides que han sido conjugados a microcuentas magnéticas. Por agotamiento adicional de los tipos celulares no deseados, se pueden obtener aislados celulares del complemento, sumamente purificados, utilizando agotamiento citotóxico. El procedimiento está construido para aislar poblaciones sumamente enriquecidas de células T y células B. Las poblaciones celulares aisladas son suspendidas en medio de cultivo, por ejemplo RPMI-1640, y pueden ser complementadas con suero y con aditivos como ácido glutámico, factores de crecimiento, citoquinas u otros moduladores de la fisiología celular, antes de la evaluación de la capacidad de infectividad. Tales linfocitos sumamente enriquecidos pueden ser caracterizados más aun mediante evaluación por citometría de flujo de los componentes de la superficie de la membrana, por ejemplo CD-4, CD-8, y/o la expresión Ig, y es obvio para una persona especializada en la técnica. Las Figuras 3a y 3b ilustran un típico análisis de flujo de tal población enriquecida. La pureza celular se demuestra por la expresión de los marcadores superficiales de específicos para células T o células B. También se pueden documentar otros componentes asociados de linaje no celular por medios similares, por ejemplo, la expresión superficial celular de PrP^{C} y PrP^{SC}. Además, también se pueden emplear técnicas de bilogía molecular, como se describen por la bibliografía pública, para documentar componentes intracelulares específicos no asociados a la membrana, por ejemplo ADN, ARN, ARNm, cuya presencia es indicativa de su presencia celular.

Tales componentes linfoides celulares pueden ser obtenidos a partir de huéspedes infectivos y no infectivos, y caracterizados por su linaje y capacidades intracelulares. Con posterioridad, se puede examinar su capacidad infectiva por inoculación vía la ruta i.c. o i.p. Mediante este ensayo, es posible determinar el linaje celular más responsable de la transmisión de enfermedades priónicas. Además, por medición de diversos componentes intracelulares y correlación con el linaje celular, el ensayo es indicativo de las interacciones entre los priones y las células diana provisionales.

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TABLA 6 Infectividad en fracciones celulares de Tg94 y bazo salvaje

6

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Análisis FACS mostrado en la Fig. 2D

Se incubaron células sanguíneas periféricas con suero de ratones t11 \muMT, se lavaron, incubaron con conjugado de anti-IgM de ratón-FITC, seguido por anti-CD3-PE (Pharmingen), y se analizó con un instrumento FACScan de Becton-Dickinson después de la lisis y fijación de los eritrocitos. Para el análisis, las células fueron seleccionadas en células T positivas para CD3. Las células EL4 infectadas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) fueron teñidas con 5 \mug de anticuerpo monoclonal VI24 específico para VSV (ref. 27) y con anticuerpo, marcado con FITC, para IgG2a de ratón (Southern Biotechnology), o con suero de ratones t11 \muMT, y con anticuerpo F(ab')_{2}, marcado con FITC, para IgM de ratón (anti-IgM-FITC, Tago), o con suero de ratones C57BL/6 y anti-IgM-FITC. Toda la captación de datos y análisis fueron realizados con el software CellQuest (Becton-Dickinson).

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Ejemplo 4

(Comparativo)

Producción de Anticuerpos contra Linfocitos Infectivos A. Producción de Antisueros Policlonales

Se prepara antisuero contra linfocitos infectivos (células B o células T) inyectando animales apropiados con linfocitos infectivos identificados y aislados como se describió en el Ejemplo 2.

1. Materias de Partida

Específicamente, se utilizan preparaciones de células B y/o preparaciones de células T purificadas. Las preparaciones de células enteras de linfocitos infectivos se pueden utilizar directamente como inmunógeno o, alternativamente, los linfocitos infectivos se pueden lisar suavemente con un tratamiento suave con detergente, por ejemplo con 0'05-0'5% de Triton X-100, seguido por fijación en paraformaldehído al 0'5-2% en PBS al 1%, durante 5-100 minutos a 4-10ºC.

2. Inmunización de Animales

Se utilizan conejos New Zealand hembra blancos, pesando 2 kg o más, para producir antisuero policlonal. Generalmente, un animal es inmunizado por una preparación de linfocitos infectivos. Una semana antes de la primera inmunización, se obtiene 5 a 10 ml de sangre del animal para que sirvan como muestra presangrada no inmune.

Se utilizan linfocitos infectivos para preparar el inmunógeno primario, emulsionando 0'5 ml de la preparación de linfocitos infectivos a una concentración entre 1x10^{5} y 1x10^{8} células/ml en PBS (pH 7'2) con 0'5 ml de adyuvante completo de Freund (ACF) (Difco, Detroit, MI). Se inyecta el inmunógeno en varios sitios del animal, vía las rutas de administración subcutánea, intraperitoneal y/o intramuscular. Cuatro semanas después de la inmunización primaria, se administra una revacunación. El inmunógeno utilizado para la dosis de revacunación se prepara emulsionando 0'5 ml de la misma preparación de linfocitos infectivos utilizada para el inmunógeno primario, excepto que ahora se utiliza 0'5 ml de adyuvante incompleto de Freund (AIF) (Difco, Detroit, MI). Nuevamente, se administra la dosis de revacunación en vario sitios, y se pueden utilizar tipos de inyecciones subcutánea, intraperitoneal e intramuscular. Dos semanas después de la revacunación, se sangra el animal (5 ml) y se ensaya el suero por su inmunorreactividad a la preparación de linfocitos infectivos como se describe a continuación. Se repite la revacunación y el programa de sangrados a intervalos de 4 semanas hasta que se obtenga un título adecuado. El título o concentración del antisuero se determina por microtitulación EIA como se describe en el Ejemplo 7, abajo. Un título de anticuerpos de 1:500 o mayor se considera un título adecuado para su posterior empleo y estudio.

B. Producción de Anticuerpo Monoclonal 1. Protocolo de Inmunización

Los ratones son inmunizados utilizando inmunógenos preparados como se describió anteriormente, excepto que la cantidad de inmunógeno para la producción de anticuerpos monoclonales en ratones es la décima parte de la cantidad utilizada para producir antisueros policlonales en conejos. El inmunógeno primario consta de 0'1 ml de preparación de linfocitos infectivos en una concentración entre 1x10^{5} y 1x10^{8} células/ml en PBS (pH 7'2) en 0'1 ml de emulsión de ACF; mientras que el inmunógeno utilizado para revacunaciones consta de 0'1 ml de la preparación de linfocitos infectivos de antes, emulsionada con 0'1 ml de AIF. Los hibridomas para la generación de anticuerpos monoclonales se preparan y escrutan utilizando técnicas estándar. Los métodos utilizados para el desarrollo de anticuerpos monoclonales siguen procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos detalladamente en Kohler and Milstein, Nature 256: 494 (1975) y evaluados en J. G. R. Hurrel, ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL (1982). Otro método de desarrollo de anticuerpos monoclonales, que se basa en el método de Kohler y Milstein, es el de L. T. Mimms y col., Virology 176: 604-619 (1990), el cual está incorporado aquí como referencia.

El régimen de inmunización (por ratón) consta de una inmunización primaria con revacunaciones adicionales. Las revacunaciones son realizadas a aproximadamente dos semanas y cuatro semanas postinmunización primaria. Se inocula intraperitoneal y subcutáneamente un total de 100 \mul de inmunógeno en cada ratón. Los ratones por separado son escrutados por su respuesta inmune mediante inmunoensayo enzimático en placas de microtitulación (EIA), como se describe en el Ejemplo 7, aproximadamente cuatro semanas después de la tercera inmunización. Los ratones son inoculados intravenosamente, intraesplénicamente o intraperitonealmente con 0'1 ml de la preparación de linfocitos infectivos a una concentración entre 1x10^{5} y 1x10^{8} células/ml en PBS (pH 7'2) en 0'1 ml de AIF, aproximadamente quince semanas después de la tercera inmunización.

Tres días después de esta revacunación intravenosa, los esplenocitos se fusionan con, por ejemplo, células de mieloma Sp2/0-Ag14 (Milstein Laboratories, Inglaterra) utilizando el método del polietilenglicol (PEG). Las fusiones se cultivan en Medio Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) conteniendo 10% de suero de ternero fetal (FCS), más 1% de hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Los cultivos a granel son escrutados mediante EIA en placas de microtitulación siguiendo el protocolo del Ejemplo 7. Los clones reactivos con la preparación de linfocitos infecciosos utilizada como inmunógeno, y no reactivos con la preparación de linfocitos infecciosos (esto es, linfocitos preparados a partir de animales no infectados no utilizados como inmunógeno), se seleccionan para la expansión final. Los clones así seleccionados son expandidos, repartidos en partes iguales y congelados en IMDM conteniendo 10% de FCS y 10% de dimetilsulfóxido.

2. Producción de Líquido Ascítico conteniendo Anticuerpos Monoclonales

Células hibridomas congeladas, preparadas como se describió anteriormente, son descongeladas y colocadas en un cultivo de expansión. Las células hibridomas viables son inoculadas intraperitonealmente en ratones tratados con pristano. Se saca líquido ascítico de los ratones, se combina, se filtra a través de un filtro de 0'2 \mu y se somete a un análisis de inmunoglobulinas de clase G (IgG) para determinar el volumen de la columna de la proteína A necesario para la purificación.

3. Purificación de Anticuerpos Monoclonales a partir de Líquido Ascítico

Brevemente, el líquido ascítico descongelado y filtrado es mezclado con un volumen igual de tampón de unión proteína A-Sepharosa (glicina 1'5M, ClNa 3'0M, pH 8'9) y vuelto a filtrar a través de un filtro de 0'2 \mu. El volumen de la columna de proteína A se determina por la cantidad de IgG presente en el líquido ascítico. Después, el eluato es dializado frente a PBS (pH 7'2) durante toda la noche a 2-8ºC. El anticuerpo monoclonal dializado es filtrado estérilmente y dispensado en alícuotas. Se confirma la inmunorreactividad del anticuerpo monoclonal purificado, determinando su capacidad para unirse específicamente a la preparación de linfocitos infecciosos utilizada como inmunógeno, mediante el empleo del procedimiento de ensayo EIA en placas de microtitulación del Ejemplo 7. La especificidad del anticuerpo monoclonal purificado se confirma determinando su carencia de unión a linfocitos no infecciosos irrelevantes no utilizados como inmunógeno. El monoclonal anti-linfocito infeccioso purificado así preparado y caracterizado es puesto a 2-8ºC durante un almacenamiento a corto plazo o a -80ºC durante un almacenamiento a largo plazo.

4. Caracterización Adicional del Anticuerpo Monoclonal

Se pueden determinar el isotipo y subtipo del anticuerpo monoclonal producido como se describió antes, utilizando equipos disponibles comercialmente (disponibles por Amersham Inc., Arlington Heights, IL). También se pueden realizar pruebas de estabilidad en el anticuerpo monoclonal, poniendo una alícuota del anticuerpo monoclonal en almacenamiento continuo a 2-8ºC y ensayando lecturas de densidad óptica (DO) durante todo el transcurso de un periodo de tiempo dado.

C. Empleo de Proteínas Recombinantes como Inmunógenos

Está dentro del ámbito de aplicación de la presente invención el que las proteínas recombinantes, fabricadas como se describe aquí, puedan ser utilizadas como inmunógenos en la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales, con los correspondientes cambios en reactivos y técnicas conocidos por aquellos especializados en la técnica.

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Ejemplo 5

(Comparativo)

Purificación de Anticuerpos Séricos que se Unen Específicamente a Linfocitos Infecciosos

Los sueros inmunes, obtenidos como se describió anteriormente en el Ejemplo 4, son purificados por afinidad utilizando proteínas inmovilizadas de la preparación de linfocitos infecciosos utilizada como inmunógeno como se describió antes. Se obtiene una fracción IgG del antisuero pasando el antisuero bruto diluido sobre una columna de proteína A (proteína A Affi-Gel, Bio-Rad, Hercules, CA). La elución con un tampón (Tampón de Unión, suministrado por el fabricante) elimina sustancialmente todas las proteínas que no sean inmunoglobulinas. La elución con glicina tamponada 0'1M (pH 3) da una preparación de inmunoglobulinas que está sustancialmente libre de albúmina y otras proteínas séricas.

Se realiza una cromatografía de inmunoafinidad para obtener una preparación con una fracción superior de anticuerpos específicos de unión al antígeno. La preparación de linfocitos infecciosos utilizada para producir el antisuero es inmovilizada en una resina de cromatografía, y los anticuerpos específicos dirigidos contra sus epítopos son absorbidos por la resina. Después de quitar mediante lavado los componentes no unidos, los anticuerpos específicos son eluídos con tampón de glicina 0'1M, pH 2'3. Las fracciones de anticuerpo son inmediatamente neutralizadas con tampón Tris 1'0M (pH 8'0) para conservar su inmunorreactividad. Se utiliza una resina tal como la Affi-Gel 10 ó la Affi-Gel 5 (Bio-Rad, Hercules, CA). Si se desea el acoplamiento mediante un carboxi, se puede utilizar la Affi-Gel 102 (Bio-Rad, Hercules, CA).

\hbox{Se puede
utilizar una resina organomercurial tal  como la
Affi-Gel 501 (Bio-Rad, Hercules,
CA).}

Alternativamente, se pueden recolectar los bazos y utilizarlos en la producción de hibridomas para producir anticuerpos monoclonales siguiendo métodos rutinarios conocidos en la técnica, como se describió anteriormente.

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Ejemplo 6

(Comparativo)

Western blotting de Muestras de Tejidos

Se preparan extractos de proteínas homogeneizando muestras de tejidos en Tris 0'1M-ClH (pH 7'5), 15% (p/v) de glicerol, EDTA 0'2 mM, 1,4-ditiotreitol 1'0 mM, 10 \mug/ml de leupeptina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1'0 mM [Kain y col., Biotechniques, 17: 982 (1994)]. Después de la homogeneización, se centrifugan los homogenados a 4ºC durante 5 minutos, para separar el sobrenadante del detritus. Para la cuantificación de proteínas, se añaden 3-10 \mul de sobrenadante a 1'5 ml de reactivo ácido bicinconínico (Sigma, St. Louis, MO), y se mide la absorbancia resultante a 562 nm.

Para SDS-PAGE, se ajustaron muestras a la concentración deseada de proteína con tampón de Tricina (Novex, San Diego, CA), se mezclaron con un volumen igual de tampón de 2xTricina para muestras (Novex, San Diego, CA), y se calentaron durante 5 minutos a 100ºC en un termociclador. Después, las muestras son aplicadas a un Gel Precast de Tricina al 10-20% de Novex para electroforesis. A continuación de la electroforesis, las muestras se transfieren desde los geles a membranas de nitrocelulosa en tampón de Transferencia Tris-Glicina de Novex. Luego, las membranas son investigadas con anticuerpos específicos anti-linfocito infectivo utilizando los reactivos y procedimientos proporcionados en los equipos de detección por quimioluminiscencia Western Lights o Western Lights Plus (Tropix, Bedford, MA). Las bandas quimioluminiscentes son visualizadas exponiendo las membranas desarrolladas a Hyperfilm ECL (Amersham Arlington Heights, IL).

Los experimentos de competición se llevan a cabo de una manera análoga como antes, con la excepción siguiente: los anticuerpos primarios (antisueros policlonales anti-linfocito infectivo) son preincubados durante 30 minutos a temperatura ambiente, con concentraciones diversas de inmunógeno para linfocitos no infectivos, antes de la exposición al filtro de nitrocelulosa. El desarrollo del Western se ejecuta como antes.

Después de la visualización de las bandas sobre la película, las bandas también se pueden visualizar directamente sobre las membranas mediante la adición y desarrollo de un sustrato cromogénico tal como 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP). Esta solución cromogénica contiene BCIP al 16% en una solución conteniendo ClNa 100 mM, Cl_{2}Mg 5 mM y Tris-ClH 100 mM (pH 9'5). El filtro se incuba en la solución a temperatura ambiente, hasta que las bandas se desarrollen hasta la intensidad deseada. La determinación de la masa molecular se hace basada en la movilidad de los estándares de peso molecular preteñidos (Novex, San Diego, CA) o estándares de peso molecular biotinilados (Tropix, Bedford, MA).

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Ejemplo 7

(Comparativo)

Ensayo EIA en Placas de Microtitulación

La inmunorreactividad del antisuero obtenido preferentemente a partir de conejos o ratones, como se describió en el Ejemplo 4, es determinada por medio de un EIA en placas de microtitulación como sigue. La proteína de preparaciones de linfocitos infecciosos o no infecciosos, como se describió antes (Ejemplo 2), es preparada mediante homogeneización de linfocitos en un tampón apropiado, por ejemplo PBS (7'2), o con un detergente suave tal como Triton X-100 al 0'01%. A continuación, en cada pocillo de una placa de microtitulación Immunolon 2® (Dynex Technologies, Chantilly, VA) se pone 100 \mul de la solución de proteína anterior. La placa es incubada durante toda la noche a temperatura ambiente, y después se lava cuatro veces con agua desionizada. Los pocillos son bloqueados añadiendo 125 \mul de un agente bloqueador de proteínas apropiado, tal como Superblock® (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), en salino tamponado con fosfato (PBS, pH 7'4), e inmediatamente después se descarta la solución. Este procedimiento bloqueador se lleva a cabo tres veces. El antisuero obtenido de conejos o ratones inmunizados, preparado como se describió anteriormente, se diluye en un agente bloqueador de proteínas (por ejemplo, una solución de Superblock® al 3%) en PBS conteniendo 0'05% de Tween-20® (monolaurato de polioxietilen sorbitan) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y 0'05% de azida sódica, a diluciones de 1:500, 1:2.500, 1:12.500, 1:62.500 y 1:312.500, y se pusieron en cada pocillo de la placa de microtitulación recubierta. Luego, los pocillos son incubados durante tres horas a temperatura ambiente. Se lava cada pocillo cuatro veces con agua desionizada. A cada pocillo se añade cien \mul de antisuero de cabra anti-IgG de conejo o de cabra anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Southern Biotech, Hirmingham, AB), diluidos 1:2.000 en solución de Superblock® al 3% en salino tamponado con fosfato conteniendo 0'05% de Tween 20® y 0'05% de azida sódica. Los pocillos se incuban durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, cada pocillo es lavado cuatro veces con agua desionizada. Después, a cada pocillo se añade cien microlitros (100 \mul) de sustrato de paranitrofenil fosfato (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Los pocillos son incubados durante treinta minutos a temperatura ambiente. Se mide la absorbancia a 405 nm para cada pocillo. Las reacciones positivas son identificadas por un aumento en la absorbancia a 405 nm, en el pocillo de ensayo, por encima de la absorbancia dada por un suero no inmune (control negativo). Una reacción positiva es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-linfocito infectivo detectables.

Además de los títulos, también se pueden determinar las afinidades aparentes [K_{d}(ap)] para algunos de los antisueros. Los resultados del ensayo EIA en placa de microtitulación se pueden utilizar para obtener las constantes de disociación aparente (K_{d}) basadas en una análoga de la ecuación de Michaelis-Menten [V. Van Heyningen, Methods in Enzymology, Vol. 121, pág. 472 (1986) y descrita posteriormente en X. Qiu y col., Journal of Immunology, Vol. 156, pág. 3.350 (1996)]:

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7

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donde [Ag-Ab] es la concentración de complejo antígeno-anticuerpo, [Ag-Ab]_{max} es la máxima concentración de complejo, [Ab] es la concentración de anticuerpo, y K_{d} es la constante de disociación. Durante el ajuste de las curvas, la [Ag-Ab] se reemplaza con el valor, restado del fondo, de la DO_{450\ nm} a la concentración dada de Ab. La K_{d} y la [DO_{450\ nm}]_{max} que corresponde a la [Ag-Ab]_{max} son tratadas como parámetros de ajuste. Se puede utilizar el programa de software Origin para el ajuste de las curvas.

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Ejemplo 8

(Comparativo)

Recubrimiento de Partículas en Fase Sólida A. Recubrimiento de Micropartículas con Anticuerpos que se Unen específicamente a Linfocitos Infectivos

Anticuerpos purificados por afinidad, los cuales se unen específicamente a linfocitos infectivos (ver Ejemplo 5), son recubiertos sobre micropartículas de poliestireno, poliestireno carboxilado, polimetilacrilato o partículas similares teniendo un radio en el intervalo de aproximadamente 0'1 a 20 \mum. Las micropartículas pueden ser recubiertas pasiva o activamente. Un método de recubrimiento comprende el recubrir micropartículas de látex carboxilado, activadas con EDAC [clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), con anticuerpos que se unan específicamente a linfocitos infectivos, como sigue. Brevemente, una suspensión final al 0'375% en sólidos de micropartículas de látex carboxilado lavadas con resina (disponibles por Bangs Laboratories, Carmel, IN o Serodyn, Indianápolis, IN) es mezclada en una solución conteniendo tampón MES 50 mM, pH 4'0, y 150 mg/ml de anticuerpo purificado por afinidad anti-linfocito infectivo (ver Ejemplo 5), durante 15 minutos en un recipiente apropiado. A la mezcla se añade agente de acoplamiento EDAC hasta una concentración de 5'5 \mug/ml, y se mezcla durante 2'5 horas a temperatura ambiente.

Después, las micropartículas se lavan con 8 volúmenes de un tampón de lavado Tween 20®/fosfato sódico (pH 7'2) mediante filtración de flujo tangencial utilizando un módulo de filtración Microgon de 0'2 \mum. Las micropartículas lavadas son almacenadas en un tampón apropiado que contiene, habitualmente, un surfactante diluido y una proteína irrelevante como agente bloqueador, hasta que se necesite.

B. Recubrimiento de Cuentas de 1/4 de Pulgada

Los anticuerpos que se unen específicamente a antígeno de linfocitos infectivos también pueden ser recubiertos sobre la superficie de cuentas de poliestireno de 1/4 de pulgada, mediante métodos rutinarios conocidos en la técnica (Snitman y col., Patente US 5.273.882, incorporada aquí por referencia), y utilizadas en ensayos de unión competitivo o EIA tipo sándwich.

En primer lugar, las cuentas de poliestireno son limpiadas ultrasonicándolas durante aproximadamente 15 segundos en tampón CO_{3}HNa 10 mM a pH 8'0. Después, se lavan las cuentas en agua desionizada hasta que sean eliminados todos los finos. Luego, las cuentas son sumergidas en una solución de anticuerpo en tampón carbonato 10 mM, pH 8 a 9'5. La solución de anticuerpo puede ser tan diluida como 1 \mug/ml en el caso de anticuerpos monoclonales de alta afinidad, o tan concentrada como unos 500 \mug/ml para anticuerpos policlonales que no hayan sido purificados por afinidad. Las cuentas se recubren durante al menos 12 horas a temperatura ambiente, y después se lavan con agua desionizada. Las cuentas se pueden secar al aire o almacenadas húmedas (en PBS, pH 7'4). También se pueden sobrerrecubrir con estabilizantes proteicos (tales como sacarosa) o agentes bloqueadores de proteínas utilizados como bloqueadores de unión no específica (tales como las proteínas irrelevantes, leche desnatada Carnation, Superblock® u otras).

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Ejemplo 9

(Comparativo)

Inmunoensayo enzimático de Micropartículas (MEIA)

Los antígenos de linfocitos infectivos son detectados en muestras de ensayo de pacientes realizando un EIA de competición de antígeno estándar o EIA tipo sándwich de anticuerpo, y utilizando una fase sólida tal como micropartículas (MEIA). El ensayo se puede realizar en un analizador automatizado tal como el analizador IMx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).

A. EIA tipo Sándwich de Anticuerpo

Brevemente, las muestras sospechosas de contener antígeno de linfocitos infectivos son incubadas en presencia de micropartículas recubiertas con anticuerpo anti-linfocito infectivo (preparadas como se describió en el Ejemplo 8), para formar complejos antígeno/anticuerpo. Después se lavan las micropartículas, y a los complejos antígeno/anticuerpo o a las micropartículas se añade un reactivo indicador comprendiendo un anticuerpo conjugado a un compuesto generador de señales (esto es, enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante), y se incuba. Se lavan las micropartículas y se detectan los complejos anticuerpo/antígeno/anticuerpo unido añadiendo un sustrato [por ejemplo, 4-metilumbeliferilfosfato (MUP), u OPD/peróxido, respetivamente], que reacciona con el compuesto generador de señales para generar una señal medible. Una señal elevada en la muestra de ensayo, comparada con la señal generada por un control negativo, detecta la presencia de antígeno de linfocitos infectivos. La presencia de antígeno de linfocitos infectivos en la muestra de ensayo es indicativa de un diagnóstico de encefalopatía espongiforme transmisible
(EET).

B. Ensayo de Unión Competitiva

El ensayo de unión competitiva emplea una proteína o proteínas de una preparación de linfocitos infectivos que genera una señal medible cuando la proteína marcada es puesta en contacto con una micropartícula recubierta con anticuerpo anti-linfocito infectivo. Este ensayo se puede realizar en el analizador IMx® (disponible por Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Las proteínas marcadas de una preparación de linfocitos infectivos son añadidas a las micropartículas recubiertas con anticuerpo para linfocito infectivo (preparadas como se describió en el Ejemplo 8), en presencia de una muestra de ensayo sospechosa de contener antígeno de linfocitos infectivos, e incubadas durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos de proteína de linfocitos infectivos marcada/anticuerpo unido y/o complejos de antígeno de linfocitos infectivos del paciente/anticuerpo unido. El antígeno de linfocitos infectivos en la muestra de ensayo compite con las proteínas de linfocitos infectivos marcadas por los sitios de unión en la micropartícula. El antígeno de linfocitos infectivos en la muestra de ensayo produce una unión reducida de la proteína de linfocitos infectivos marcada y las micropartículas recubiertas con anticuerpo en el ensayo, puesto que el antígeno en la muestra de ensayo y la proteína de linfocitos infectivos compiten por los sitios de unión del anticuerpo. Una señal disminuida (comparada con un control) indica la presencia de antígeno de linfocitos infectivos en la muestra de ensayo. La presencia de antígeno de linfocitos infectivos sugiere el diagnóstico de
EET.

Las proteínas de linfocitos infectivos discutidas anteriormente son útiles como marcadores de EET. Los ensayos basados en la aparición de este marcador o marcadores en una muestra de ensayo tal como sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal y tejidos puede proporcionar una información diagnóstica no invasiva, de bajo coste, para ayudar al médico a hacer un diagnóstico de EET, ayudar a seleccionar un protocolo de terapia, o a monitorizar el éxito de la terapia elegida. Este marcador o marcadores pueden aparecer en fluidos corporales fácilmente accesibles tales como sangre, orina, FCE o heces, como antígenos derivados del tejido enfermo que son detectables por métodos inmunológicos. Este marcador puede estar elevado en un estado de enfermedad, alterado en un estado de enfermedad, o ser una proteína normal que aparece en un compartimento corporal inapropiado, en un estado alterado o forma indicativa de enfermedad.

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Referencias citadas en la presente solicitud

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17. Fraser, H. y col. Replication of scrapie in spleens of scid mice follows reconstitution with wild-type mouse bone marrow. J. Gen. Virol. 77, 1.935-1.940 (1996).

18. Nonoyama, S., Smith, F. O., Bernstein, I. D. & Ochs, H. D. Strain-dependent leakiness of mice with severe combined immune deficiency. J. Immunol. 150, 3.817-3.824 (1993).

19. Bosma, M. J. & Carroll, A. M. The SCID mouse mutant: definition, characterization, and potential uses. Annu. Rev. Immunol. 9, 323-350 (1991).

20. Eigen, M. Prionics or the kinetics basis of prion diseases. Biophys. Chem. 63, A1-18 (1996).

21. Hill, A. F., Zeidler, M., Ironside, J & Collinge, J. Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 349, 99 (1997).

22. Rothe, J. y col. Mice lacking the tumour-necrosis factor receptor 1 are resistant to TNF-mediated toxicity but highly susceptible to infection by Listeria monocytogenes. Nature 364, 798-802 (1993).

23. Le Hir, M. y col. Differentiation of follicular dendritic cells and full antibody responses require tumor necrosis factor receptor-1 signaling. J. Exp. Med. 183, 2.367-2.372 (1996).

24. Humphrey, J. H., Grennan, D. & Sundaram, V. The origin of follicular dendritic cells in the mouse and the mechanism of trapping of immune complexes on them. Eur. J. Immunol. 14, 859-864 (1984).

25. Blättler, T. y col. Transfer of scrapie infectivity from spleen to brain depends on interposed PrP-expressing tissue. Nature 389, 69-73 (1997).

26. Farquhar, C. F., Somerville, R. A. & Ritchie, L. A. Post-mortem immunodiagnosis of scrapie and bovine spongiform encephalopathy. J. Virol. Meth. 24, 215-221 (1989).

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Las referencias listadas arriba, así como referencias adicionales (artículos o Patentes) citadas en la especificación anterior, están por este medio incluidas, mediante referencia, en la revelación de la presente solicitud.

Claims (26)

1. El uso de reductores de células B y células T para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la encefalopatía espongiforme transmisible en humanos o animales infectados, en donde los reductores de células B y células T son administrados simultáneamente, secuencialmente o por separado.

2. El uso conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque dicho reductor de células T consta de un anticuerpo.

3. El uso conforme a la reivindicación 2, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un anticuerpo Thy 1.2.

4. El uso conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque dicho reductor de células T consta de un compuesto químico inmunosupresivamente activo.

5. El uso conforme a la reivindicación 4, caracterizado porque dicho compuesto químico inmunosupresivamente activo es ciclosporina A.

6. El uso conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque dicho reductor de células B consta de un anticuerpo.

7. El uso conforme a la reivindicación 6, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un anticuerpo anti-\muM.

8. El uso conforme a la reivindicación 6, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un anticuerpo LR1.

9. El uso conforme a la reivindicación 6, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un anticuerpo
B220.

10. El uso conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque dicho reductor de células B consta de un compuesto químico inmunosupresivamente activo.

11. El uso conforme a la reivindicación 10, caracterizado porque dicho compuesto químico inmunosupresivamente activo comprende ciamexona.

12. El uso conforme a la reivindicación 10, caracterizado porque dicho compuesto químico inmunosupresivamente activo comprende imexón.

13. Un método para la fabricación de un producto derivado de fluidos o tejidos corporales sin EET humana, caracterizado porque dicho método comprende la etapa de separar únicamente las células B y las células T de dicho producto derivado de fluidos o tejidos corporales sin EET humana in vitro.

14. Un método según la reivindicación 13, caracterizado porque las células T son separadas por medio de un reductor de células T.

15. Un método según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho reductor de células T consta de un anticuerpo.

16. Un método según la reivindicación 15, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un anticuerpo Thy 1.2.

17. Un método según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho reductor de células T consta de un compuesto químico inmunosupresivamente activo.

18. Un método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicho compuesto químico inmunosupresivamente activo es ciclosporina A.

19. Un método según la reivindicación 13, caracterizado porque las células B son separadas por medio de un reductor de células B.

20. Un método según la reivindicación 19, caracterizado porque dicho reductor de células B consta de un anticuerpo.

21. Un método según la reivindicación 20, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un anticuerpo anti-\muM.

22. Un método según la reivindicación 20, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un anticuerpo LR1.

23. Un método según la reivindicación 20, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un anticuerpo B220.

24. Un método según la reivindicación 19, caracterizado porque dicho reductor de células B consta de un compuesto químico inmunosupresivamente activo.

25. Un método según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho compuesto químico inmunosupresivamente activo comprende ciamexona.

26. Un método según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho compuesto químico inmunosupresivamente activo comprende imexón.