ES2285720T3 - Metodo de fabricacion de productos terapeuticos pra la encefalopatia espongiforme transmisible, productos sanguineos y tejidos no infecciosos y metodos para su obtencion. - Google Patents

Abstract

SE HAN IDENTIFICADO CELULAS B COMO PORTADORES CRUCIALES DE INFECCIONES EN LA PROPAGACION DE LA ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME TRANSMISIBLE EN UN ANIMAL INFECTADO. EN UN SEGUNDO PASO, LAS CELULAS B PUEDEN INFECTAR COMPONENTES ADICIONALES DEL SISTEMA INMUNE, POR EJEMPLO, LAS CELULAS T. DE ESTA FORMA, LA INVENCION SUMINISTRA LIGANTES ESPECIFICOS DE LAS CELULAS B Y DE LAS CELULAS T PARA SU USO EN AGENTES DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICOS PARA LA ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME TRANSMISIBLE Y SUMINISTRA PROCEDIMIENTOS PARA LA FABRICACION DE PRODUCTOS SANGUINEOS NO INFECCIOSOS Y PRODUCTOS DERIVADOS DE TEJIDOS. ASI, LA INVENCION SUMINISTRA MEDICAMENTOS QUE COMPRENDEN DEPRESORES DE LAS CELULAS B Y/O DE LAS CELULAS T, PARA EL TRATAMIENTO DE PATOLOGIAS EN LAS QUE LA DEPRESION DE LAS CELULAS B Y/O DE LAS CELULAS T, Y MAS PARTICULARMENTE DE LAS CELULAS B Y/O DE LAS CELULAS T NO INFECCIOSAS, ES TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA.

Description

Método de fabricación de productos terapéuticos para la encefalopatía espongiforme transmisible, productos sanguíneos y tejidos no infecciosos y métodos para su obtención.

La presente invención se refiere al uso de depletores de células B selectivos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de encefalopatía espongiforme transmisible. Asimismo, la invención se refiere a productos de fluidos corporales sin TSE humanos no infectivos y a productos derivados de tejido sin TSE humanos y a métodos adecuados para su fabricación.

Antecedentes

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs) comprenden un grupo de enfermedades degenerativas lentas del SNC, como la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD), nueva variante de CJD (denominada vCJD)^{1,2}, la enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) y el kuru en el hombre y scrapie en ovejas o BSE (enfermedad de las vacas locas) en el ganado.

La incidencia de estas enfermedades exóticas sigue siendo afortunadamente muy baja, probablemente con una incidencia de 1:1.000.000, pero existen similitudes sorprendentes cuando se las compara con el síndrome de Alzheimer. No obstante, se ha registrado actualmente que BSE ha alcanzado proporciones epidémicas en Inglaterra y tiene su origen en el uso de materiales de desechos cárnicos en el forraje del ganado, pudiendo originar ovejas infectadas con scrapie. El ganado vacuno en particular está expuesto al máximo riesgo calibrable. Una incidencia trágicamente similar se ha producido en los seres humanos.

Durante la producción de la hormona de crecimiento humana a partir de las glándulas humanas recogidas de cadáveres, se introdujo el agente patógeno del síndrome de Creutzfeld-Jacob. Actualmente, se han registrado varios casos en pacientes tratados con esta hormona del crecimiento. Los pacientes eran predominantemente niños, aunque la enfermedad ataca normalmente a adultos de más de 50 años de edad.

Estos ejemplos señalan el potencial peligro de estas nuevas enfermedades y las dificultades para diagnosticarlas y tratarses eficazmente.

Las propiedades inusuales del agente patógeno, designado "prión" (Prusiner, S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 216, 136-144 (1982)) incluyen períodos de incubación extremadamente largos, que exceden un año, y la resistencia a altas temperaturas, tratamiento con formaldehído y radiación UV (Gordon, W.S. Vet Rec. 58, 516 (1946); Pattison, I.H. Resistance of the scrapie agent to formalin. J. comp. Pathol. 75, 159-164 (1965); Alper y cols., The exceptionally small size of the scrapie agent. Biochem. Biophys. Res. Commun. 22, 278-284 (1966); Latarjet y cols. Inactivation of the scrapie agent by near monochromatic ultraviolet light. Nature 227, 1341-1343 (1970)). Han surgido especulaciones anteriormente sobre si el agente del scrapie podría estar desprovisto de ácido nucleico (Alper y cols., Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Natura 214, 764-766 (1967); Gibbon, R.A. and Hunter, G.D. Nature of the scrapie agent. Nature 215, 1041-1043 (1967); Pattison, I.H. and Jones, K.M. The possible nature of the transmissible agent of scrapie. Vet. Rec. 80, 2-9 (1967)). Hay considerables pruebas actualmente que apoyan la hipótesis de "sólo proteína" (Prusiner, S.B. and Hsiao K.K. Human prion diseases. Ann. Neurol. 35, 385-395 (1994); Weissmann, C. Molecular biology of prion diseases. Trends Cell Biol. 4, 10-14 (1994)) en la que se propone que el prion está desprovisto de ácido nucleico y es idéntico a PrP^{Se}, una forma modificada de PrP^{C}. PrP^{C} es una proteína huésped normal (Oesch y cols., A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 Proteín. Cell 40, 735-746 (1985); Chesebro y cols. Identification of scrapie prion protein-specific mRNA in scrapie-infected and uninfected brain. Nature 315, 331-333 (1985)) que se encuentra predominantemente en la superficie exterior de las neuronas, pero también en muchos otros tejidos (Manson y cols., The prion protein gene: a role in mouse embryogenesis? Development 115, 117-122 (1992); Bendheim y cols., Nearly ubiquitous tissue distribution of the scrapie agent precursor protein. Neurology 42, 149-156 (1992)). PrP^{Se} se define como una forma resistente a proteasa de PrP^{C} que forma fácilmente agregados tras el tratamiento con detergente (Mc Kinley y cols.,Scrapie prion rod formation in vitro requires both detergent extraction and limited proteolysis: J. Vitrol. 65, 1340-1351 (1991)). Hasta el momento no se han detectado diferencias químicas entre PrP^{Se} y PrP^{C} (Stahl y cols., Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochemistry 32, 1991-2002 (1993)). Prusiner propuso que PrP^{Se} , al ser introducido en una célula normal, causa la conversión de PrP^{C} o su precursor en PrP^{C} (Oesch y cols., Search for a scrapie-specific nucleic acid: a progress report. Ciba Found. Symp. 135-209-223 (1988); Prusiner y cols., Transgenic studies implicate interactions between homologous PrP isoforms in scrapie prion replication. Cell 63, 673-686 (1990); Bolton, D.C. and Bendheim, P.E. A modified host protein model of scrapie. Ciba Found. Symp. 135, 164-181 (1988)). Se cree que la conversión es el resultado de una reorganización conformacional de PrP^{C}. Algunos investigadores siguen adhiriéndose a la hipótesis del virino que sostiene que el agente infeccioso consiste en un genoma de ácido nucleico y el PrP derivado de huésped, que se recluta como una especie de recubrimiento (Dickinson, A.G. and Outram, G.W. Genetic aspects of unconventional virus infections: the basis of the virino hypothesis. Ciba Found. Symp. 135, 63-83 (1988); Hope; J. The nature of the scrapie agent: the evolution of the virino. Ann. N.Y. Acad. Sci. 724, 282-289 (1994)). Finalmente, la posibilidad de que el agente infeccioso sea un virus con propiedades inusuales sigue siendo sostenida por algunos (Diringer y cols., The nature of the scrapie agent; the virus theory. Ann. N.Y. Acad. Sci. 724, 240-258 (1994); Pocchiari, M. Prions and related neurological diseases. Molec. Aspects. Med. 15, 195-192 (1994); Rohwer, R.G. The scrapie agent: "a virus by any other name". Curr. Top. Microbiol. Immunol. 172, 195-232 (1991)). No se ha adelantado aún ninguna prueba creíble de la existencia de un ácido nucleico específico de scrapie, tal como lo demanda la hipótesis del virus y el virino (Oesch y cols. ver anterior; Kellings y cols. Further analysis of nucleic acids in purified scrapie prion preparations by improved return refocusing gel electrophoresis. J. Gen. Virol. 73, 1025-1029 (1992)).

Prusiner y sus colegas fueron los primeros en purificar PrP^{Se} y demostrar la relación física con la infectividad de scrapie (Bolton y cols., Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science 218, 1309-1311 (1982)). Una colaboración entre los grupos de Prusiner, Hood y Weissmann condujo al aislamiento de ADNc PrP y a la prueba patente de que PrP^{C} era una proteína huésped normal y PrP^{Se} era un isoformo de PrP^{C} (Oesch y cols., ver anterior (1985)). Weissmann y sus colaboradores (Basler y cols., Scrapie and cellular PrP isoforms are encoded by the same chromosomal gene. Cell 46, 417-428 (1986)) clonaron el gen Prp (Prn-P) y el grupo de Prusiner demostró la relación entre la susceptibilidad genética a la enfermedad de prión y el gen Prn-p en ratón (Prusiner y cols., ver anterior (1990)) y el hombre (Hsiao y cols., Lingage of a prion protein missense variant to Gerstmann-Straussler syndrome. Nature 338, 342-345 (1989)). Varios grupos han registrado datos que apoyan las diferencias conformacionales entre PrP^{C} y PrP^{Se} (Caughey y cols. Secondary structure analysis of the scrapie-associated protein PrP 27-30 in water by infrared spectroscopy. Biochemistry 30, 7672-7680 (1991); Cohen y cols., Structural clues to prion replication. Science 264, 530-531 (1994); Huang y cols., Proposed three-dimensional structure for the cellular prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7139-7143 (1994); Pan y cols., Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993); Safar y cols., Conformational transitions, dissociation and unfolding of scrapie amyloid (prion) protein. J. Biol. Chem. 268, 20276-20284 (1993)).

Dado que no existe ningún marcador fiable de la infectividad de encefalopatía espongiforme transmisible, la cinética de replicación del agente infeccioso no puede ser estudiada específicamente ya que no se conocen los vehículos físicos de priones. No obstante un conjunto de pruebas cada vez mayor a partir de experimentos anteriores y estudios recientes señala la importancia de dos fases distintas de replicación durante el ciclo vital del prion, el agente infeccioso que causa las ecenfalopatías espongiformes. En la primera fase, se cree que la replicación de infectividad tiene lugar principalmente en órganos linfoides (Eklund y cols., Pathogenesis of scrapie virus infection in the mouse, J. Infect. Dis 117, 15-22 (1967); Clarck, M.C and Konberlin R.H. Pathogenesis of mouse scrapie: distribution of agent in the pulp and stroma of infected spleens. Vet. Microbial. 9, 215-225 (1984); Fraser, H. and Dickinson, A.G. Studies of the lymphoreticular system in the pathogenesis of scrapie: the role of spleen and thymus, J. Comp. Pathol. 88, 563-573 (1978)). Por ejemplo se puede demostrar infectividad en el bazo ya a los 4 días de la infección i.p. o i.c. Esto es así incluso cuando la infección tiene lugar a través de la ruta intracerebral (Kimberlin, R.H. and Walker, C.A. Pahtogenesis of experimental scrapie. Ciba. Found. Symp. 135, 37-62 (1988)), y la replicación del agente infeccioso en el bazo precede a la replicación intracerebral incluso si la infectividad se administra intracerebralmente (Rubenstein y cols., Scrapie-infected spleen: analysis of infectivity, scrapie-associated fibrils, and protease-resistant proteins. J. infect. Dis. 164, 29-35 (1991)). La infectividad también puede acumularse en otros componentes del sistema linforreticular (LRS), v.g., en los nódulos linfáticos y en las placas de Peyer del intestino delgado, en el que se puede demostrar la replicación de infectividad casi inmediatamente después de la administración oral de preparaciones de prion. El rápido establecimiento de un plató de concentración infecciosa en el bazo en un punto en el tiempo relativamente temprano durante el período de latencia sugiere que la disponibilidad de sitios de replicación de prion es de velocidad limitada en el LRS. No se sabe, sin embargo, si este plató se debe a un número limitado de células esplénicas que soportan la replicación de prion, o más bien a la disponibilidad limitada de los sitios de replicación de prion dentro de cada célula. La naturaleza de las células que soportan la replicación de prion dentro del LRS es incierta. Las pruebas indirectas obtenidas en estudios en los que se extirpó el bazo a intervalos variables tras la infección i.p. sugieren que el compartimiento del tejido crítico es de vida prolongada y no consiste principalmente en linfocitos. Por otra parte, la ablación de linfocitos por irradiación total del cuerpo no parece afectar al tiempo de incubación de scrapie en ratones. (Fraser y cols., The scrapie disease process is unaffected by ionising radiation. Prog. Clin. Biol. Res. 317, 653-658 (1989)). En conjunto, estos y otros hallazgos sugieren que las células dendríticas foliculares (FDC) pueden constituir la población principal de células que participan en la replicación de priones del LRS. De hecho, PrP se acumula en las FDC en el bazo de ratones de tipo silvestre y atímicos, y la infección i.p. no parece conducir a scrapie cerebral en ratones SCID (cuyas FDC están, según se cree, dañadas funcionalmente) al tiempo que provoca eficientemente la enfermedad en ratones atímicos que son portadores de un defecto de célula T selectivo (Muramoto y cols. Species barrier prevents an abnormal isoform of prion protein from accumulation in follicular dendritic cells of mice with Creutzfeldt-Jakob disease. J. Virol. 67, 6808-6810 (1993)).

Si bien se cree que las etapas que se han identificado son importantes en la historia natural de la encefalopatía espongiforme transmisible dentro de un organismo infectado, el factor limitativo o entidad física implicado en el desarrollo y propagación de encefalopatía espongiforme transmisible tras una infección periférica, es decir, el vehículo físico del prion, sigue sin conocerse. Aunque un seguimiento preciso de la propagación epidémica de la ecenfalopatía espongiforme transmisible resulta extremadamente difícil debido a los prolongados períodos de incubación implicados (hasta 30 años), parece ser probable que la infección periférica, v.g., por exposición alimentaria, es la ruta más relevante de propagación. Así pues, cualquier tentativa para combatir la encefalopatía espongiforme transmisible deberá concentrarse en dichos factores limitativos o entidades físicas relacionadas con el desarrollo de la enfermedad tras la infección periférica. No obstante, un conocimiento detallado sobre dicho(s) factor(es) limitativos o entidades es un requisito previo esencial para diseñar métodos terapéuticos mejorados dirigidos a interferir en la replicación y propagación de prión dentro de la víctima infectada. Si bien Aguzzi y cols., en The Lancet 350: 1519-1520 (1997) han propuesto un primer método terapéutico que se basa en la administración de prednisolona como inmunosupresor, el tratamiento propuesto es relativamente tosco y deberá considerarse como provisional ya que afecta a muchos tipos de células, aparte de los factores limitativos desconocidos y la entidad física que que pueda estar implicada con mayor probabilidad con la replicación y la propagación de prión.

Por otra parte, los datos sobre la identidad de los vehículos físicos de los priones debería dar cabida al diseño de métodos de ensayo mejorados para determinar la infectividad de materiales potencialmente infectivos como productos de sangre o productos derivados de tejido, así como un mejor seguimiento del progreso epidémico de encefalopatía espongiforme transmisible dentro de poblaciones infectadas. Asimismo, los datos sobre la interacción de vehículos físicos de priones con otras entidades físicas implicadas en la patogénesis permitiría el seguimiento del progreso de la enfermedad dentro de una víctima infectada y/o la verificación de la efectividad de tratamiento terapéutico.

Asimismo, una vez conocida la identidad de los vehículos físicos, se pueden diseñar a demanda métodos adecuados para la separación de dichos vehículos físicos de priones de productos derivados de tejido o fluido corporal destinados a uso médico o aplicación industrial.

Por consiguiente, existe una urgente necesidad de identificar específicamente los factores limitativos y las entidades físicas en el desarrollo de encefalopatía espongiforme tras infección periférica. Existe además la necesidad de proporcionar mejores medicamentos para combatir la encefalopatía espongifome en organismo infectados, es decir seres humanos y animales. Por otra parte, existe la necesidad de proporcionar mejores métodos de ensayo para el diagnóstico y/o seguimiento del progreso o regresión de encefalopatía espongiforme transmisible en organismos infectados o en organismos que están presuntamente infectados. Dichos métodos de ensayo son necesarios también para el análisis seguro de productos derivados del tejido y fluido corporal de dichos organismos. Asimismo, existe la necesidad de proporcionar productos derivados del tejido y el fluido corporal que no sean infectivos con el fin de prevenir la mayor propagación de encefalopatía espongiforme transmisible dentro de las poblaciones humana y animal infectadas. Existe además la necesidad de proporcionar un método para la fabricación de dichos productos derivados del tejido y el fluido corporal no infectivos. También existe la necesidad de proporcionar reactivos adecuados que sean capaces de reconocer la entidad física crucial implicada en la propagación de encefalopatía espongiforme.

La satisfacción de las necesidades expuestas, así como otras necesidades, que se pondrán de manifiesto a continuación, es uno de los objetos de la presente invención.

Compendio de la invención

Con el fin de satisfacer los objetos mencionados, así las necesidades expuestas, en uno de los modos de realización, la presente invención proporciona el uso de depletores de células B selectivos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de encefalopatía espongiforme transmisible en seres humanos o animales infectados.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE humano caracterizado porque ha sido depletado de células B in vitro, habiéndose depletado las células B por medio de un medicamento que comprende un depletor de células B selectivo.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un método para la fabricación de un producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE humano, caracterizado porque dicho método comprende una etapa de separación de células B de dicho producto derivado de tejido o fluido corporal.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un método para la fabricación de un producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE humano, que se caracteriza porque dicho producto derivado de tejido o fluido corporal se aísla de seres humanos no vivos que son solo deficientes en células B.

En otro modo de realización más, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo dirigido contra células B infectivas.

Otros modos de realización de la presente invención se señalan en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención supone una investigación detallada sobre la naturaleza de los factores limitativos y/o entidades físicas en el desarrollo de encefalopatía espongiforme tras la infección periférica. Por lo tanto, la presente invención implica la identificación de vehículos físicos de priones y de los mecanismos implicados en la propagación de infectividad.

Definiciones

Tal como se aplica en la presente solicitud, células B (o linfocitos B) debe entenderse como miembros de un subgrupo de células linfocíticas que son precursores de células de plasma que producen anticuerpos; son capaces de reconocer antígenos libres y antígenos localizados en las células. En lo que se refiere a la presente solicitud, células T (o linfocitos T) se refiere a miembros de un subgrupo de células linfocíticas responsables de la inmunidad celular y la producción de sustancias inmunomoduladoras. Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "linfocitos" designa células que participan en la defensa inmune humoral y mediada por células, y que comprende por consiguiente células B y células T. Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "animales" abarca organismos eucarióticos excluyendo las plantas. La referencia a células T y productos y métodos relacionados se reserva en la presente memoria descriptiva y las figuras tiene un mero fin ilustrativo y comparativo. De manera similar, la referencia a métodos de ensayo con los que se pueda llevar un seguimiento y diagnosticar la propagación de encefalopatía espongiforme transmisible se reserva tiene un mero fin ilustrativo.

Figuras

La figura 1 presenta la histopatología de cerebro de ratones inmuno deficientes y de control tras la inoculación i.p. de priones de scrapie. Se inmuno manchó la formación de hipocampo para determinar la proteína ácida fibrilar glial y se microfotografiaron segmentos idénticos de bucle celular piramidal (200x). Fue visible una gliosis difusa intensa en los cerebros de ratones SCID deficientes en células T, TNF-r1^{0/0}, t11 \muMT, y ratones de control infectados. Algunos ratones rag-2^{0/0} y \muMT presentaron encefalopatía espongiforme, en cambio otros del mismo genotipo no mostraron ninguna patología tras períodos de tiempo similares tras la inoculación i.p., y no se los distinguió de ratones C57BL/6 infectados simuladamente.

La figura 2 se refiere al análisis de mancha de Western de cerebros de ratones inmunodeficientes tras la inoculación i.p. con priones de encefalopatía espongiforme transmisible y con falta de anticuerpos específicos contra PrP en ratones t11\muMT. Las figuras a, b son manchas de Western de material de cerebro sometido a electroforesis nativo (-) o tras la digestión con proteinasa K (PK) (+). Se detectaron cantidades grandes de proteína de prion resistente a PK (PrP^{SC}) en todos los ratones que habían desarrollado encefalopatía espongiforme, así como en un ratón arg^{0/0} (a) dos rag-2^{0/0} y dos \muMT (b). Un ratón deficiente en células B más resultó negativo para PrP^{SC} (no mostrado) y no se detectaron síntomas clínicos de encefalopatía espongiforme en ningún ratón deficiente en células B independientemente de la acumulación de PrP^{SC}. La figura c presenta una mancha de Western preparada con PrP murino recombinante de E. coli (PrP^{R}), un extracto de proteína de cerebro total de un ratón de tipo silvestre (WT) y un extracto de proteína de cerebro total de un ratón Prnp^{0/0} (0/0)^{15}. Se incubaron manchas con suero de un ratón t11\muT en el que se habían inoculado priones i.p. (izquierda), se separaron y se volvieron a sondear con anticuerpo monoclonal 6H4 para determinar PrP recombinante (derecha). La presencia de anticuerpos específicos de PrP, tal como lo indica una banda 20K en la línea PrP^{R} y por un agrupamiento de bandas presente en la línea WT pero ausente en la línea 0/0, es evidente con anticuerpo 6H4 pero no detectable en suero de t11\muMT. Los marcadores de masa molecular relativos (superior e inferior): 105K, 82K, 45K, 37,3K, 28,6K, 19,4K. La Figura d presenta el análisis FACS de inmunorreactividad de suero t11\muMT. Ordenadas: recuento celular; abscisas: logaritmo de intensidad de fluorescencia. Se diluyó suero de un ratón t11\muMT 210 días después de la inoculación i.p. con priones 1:10 y 1:100, se mancharon células EL4 infectadas con VSV manchadas (panel superior, zona sin rellenar) casi tan fuertemente como el anticuerpo monoclonal específico de VSV V124 (zona rellenada). En contraste, la inmunorreacción con suero t11\muMT (1:10) con células T CD3^{+} de ratones C57HL/6, tga20, tg33 (ref. 29) y Prnp^{0/0} (paneles inferiores) no excedieron los antecedentes, como el suero C57BL/6 normal en células EL4 (panel superior, línea de puntos). Se obtuvieron los mismos perfiles cuando se mancharon las sondas con suero de ratones t11 \muMT sin tratar (no se muestran los datos).

La Figura 3a y 3bpresentan una impresión del análisis de flujo en el que se muestran poblaciones de células B y células T enriquecidas.

La Figura 4 muestra la infectividad de esplenocitos en ratones de tipo silvestre y ratones esplénicos.

Las figuras 5a-5c presentan la infectividad en diferentes tipos de células de ratones de tipo silvestre, ratones de células T y ratones esplénicos.

Investigaciones realizadas por los autores de la invención El papel de las células B

Tal como puede deducirse de la técnica anterior, el desarrollo de enfermedad neurológica tras la infección periférica con encefalopatía espongiforme transmisible depende de la expansión anormal de prión dentro de las células del sistema linforreticular^{3,4}. Las personas especializadas en este campo, no obstante, son conscientes de que el sistema inmune comprende varios componentes cuya identidad y función precisa, así como interacción específica con el resto de los componentes, siguen siendo objeto de una exhaustiva investigación científica. Los autores de la invención han investigado por primera vez el papel de los diferentes componentes del sistema inmune utilizando un panel de ratones inmunodeficientes inoculados con priones intraperitionealmente y han encontrado que los defectos que afectan únicamente a células T no tenían ningún efecto aparente, en cambio todas las mutaciones que interrumpían la diferenciación y respuesta de células B prevenían el desarrollo de encefalopagía espongiforme clínica. Dado que una ausencia de células B y de anticuerpos se corresponde con defectos severos en células dendríticas foliculares, una falta de cualquiera de estos tres componentes puede prevenir el desarrollo de encefalopatía espongiforme clínica. La función clave de las células dendríticas foliculares ha sido postulada entre otros por Muramoto, ver anterior. No obstante, los autores de la invención han observado de manera sorprendente que la encefalopatía espongiforme se desarrollaba tras la inoculación periférica en ratones que expresan inmunoglobulinas que eran exclusivamente de la subclase M y sin especificidad detectable para la forma normal del prion PrP^{C}, y en ratones que tenían células B pero no células dendríticas foliculares funcionales. Por lo tanto, los autores de la invención han observado que las células B diferenciadas son cruciales para la neuroinvasión de encefalopatía espongiforme, independientemente de la especificidad de sus receptores.

El efecto de defectos inmunes combinados en la patogénesis de encefaolopatía espongiforme fue estudiado en ratones deficientes en rag-2 (ref.5) y rag-1 (ref.6) que carecen de células B y T, en ratones scid (que padecen inmunodeficiencia combinada severa), y ratones arg^{0/0}, que carecen de rag-2 así como los receptores para interferón-\alpha/\beta^{7} e interferón-\gamma^{8}. Se obtuvieron dichos ratones con arreglo a los métodos conocidos en la especialidad de ingeniería genética. Para los controles, se inocularon también ratones endogámicos de cepas C57BL/6 y 129/Sv que son los antecedentes genéticos de todas las demás cepas de ratón utilizadas. Para investigar el papel de células T, los autores de la invención utilizaron ratones con disrupción dirigida de genes que codifican CD4 (ref. 9), CD8 (ref. 10), \beta2-microglobulina^{11} y perforina^{12}. Se estudió la depleción selectiva de células B en ratones \muMT^{13}, que tenían una disrupción dirigida del exón de transmembrana del gen de cadena u de inmunoglobulina, no producen ninguna inmunoglobulina y sufren de un bloqueo de diferenciación de células B en la transición pre-célula B larga a pequeña, aunque soportan subgrupos de células T completos y funcionales.

Tras la prueba de desafío (challenge) intracerebral (i.c.) con priones, todos los ratones inmunodeficientes desarrollaron síntomas clínicos de encefalopatía espongiforme. Esto fue confirmado por el análisis histopatologico (no mostrado) y por la transmisión de la enfermedad a ratones tga20 indicadores, que sobreexpresan la proteína prion normal (PrP^{C}) y son hipersensibles a encefalopatía espongiforme^{14} (Tabla 1). La transmisión a ratones Prnp^{0/0} ^{15},
que no expresan PrP^{C} y son resistentes a encefalopatía spongiforme^{16} (n=4) no indujo enfermedad al cabo de >210 días, según lo esperado para encefalopatía espongiforme bona fide. En todos los grupos, los períodos de latencia desde la inoculación a la primera manifestación de síntomas clínicos y hasta la enfermedad terminal (tabla 2), así como las valoraciones de infectividad de prión del cerebro (tabla 1) fueron similares a las de los ratones
de control.

Por lo tanto, cuando los priones son suministrados al sistema nervioso central, la patogénesis de la encefalopatía espongiforme y la expansión de prion en el cerebro tiene lugar sin ninguna influencia detectable del estado inmune del huésped.

Cuando se expuso a los ratones a priones a través de la ruta intraperitoneal (i.p.), los ratones homocigotos-nulos para CD4, CD8, \beta2-microglobulina o perforina desarrollaron los síntomas iniciales de la enfermedad y encefalopatía espongiforme terminal con períodos de latencia similares a los de los ratones C57BL/6 y 129/sv (Tabla 2), y alcanzaron valoraciones de prión análogas, tanto en el bazo como en el cerebro (tabla 1). Por lo tanto, los autores de la invención concluyeron que las células T colaboradoras CD4^{-} y citotóxicas CD8^{+} no son limitadoras de la velocidad para encefalopatía espongiforme tras la inoculación periférica de priones, de acuerdo con la observación de que los ratones atímicos desarrollan encefalopatía espongiforme normalmente tras la inoculación i.p.^{3}.

En contraste, no se manifestó la enfermedad tras la inoculación i.p. en ratones \muMT y rag-deficientes (rag-1^{0/0}, rag-2^{0/0} y arg^{0/0}) y no fue detectable la infectividad de prión en sus bazos (tabla 1). En los ratones SCID C57BL/6, la enfermedad se prolongó marginalmente, lo que está en desacuerdo con resultados anteriores^{4,17} y puede deberse a una inmunodeficiencia incompleta de ratones SCID en antecedentes genéticos específicos^{3}, ya que los ratones SCID C.B-17 (cuyo defecto inmune es menos filtrante) no desarrollaron la enfermedad (tabla 2). La diferenciación de células B para competencia inmune presenta redundancia en muchos puntos; esto hace que estas células sean solamente parcialmente sensibles a manipulación genética.

El examen histopatológico de las secciones del cerebro reveló encefalopatía espongiforme generalizada en todos los ratones de tipo silvestre e inmunodeficientes clínicamente diagnosticados como enfermos de encefalopatía espongiforme (figura 1). Por otra parte, y a pesar de los síntomas clínicos, se observó la encefalopatía espongiforme en 1/7 ratones rag-deficientes y 1/6 ratones \muMT (en un muestreo aleatorio) 342 y 436 días después de la inoculación i.p. (figura 1) y se observaron valoraciones de prión significativas en los cerebros de 3/7 ratones rag-deficientes y 1/3 ratones \muMT (tabla 1). El análisis de mancha de Western reveló la acumulación de la forma de la enfermedad de prión, PrP^{SC}, en los cerebros de 2/6 ratones rag-deficientes y 2/6 ratones \muMT inoculados i.p. (Figura 2). El resto de ratones rag-deficientes y \muMT no acumuló PrP^{SC} en un período tan tardío como 504 días tras la inoculación.

En vistas a un absoluto escrutinio, se puede concluir que los últimos hallazgos son compatibles con encefalopatía espongiforme incipiente en una fracción menor de ratones deficientes en células B. Por consiguiente, aunque previene la "neuroinvasión" del agente de encefalopatía espongiforme en la mayoría de los casos, la ausencia de células B desvela un mecanismo más lento, eficiente en <50%, de patogénesis que puede causar encefalopatía espongiforme en situaciones de deficiencia inmune. Deberá enfatizarse que incluso entonces, la deficiencia de células B prolonga el retraso entre la acumulación de PrP^{SC}, el inicio de la histopatología de encefalopatía espongiforme y los síntomas clínicos más allá de la esperanza de vida típica del ratón.

Estos resultados sugieren que las células B pueden "transportar" priones desde los órganos linfoides al tejido nervioso. Alternativamente, la protección aparente de ratones deficientes en células B desde los priones administrados i.p. puede ser resultado de la ausencia de inmunoglobulinas. La formación de complejo de PrP^{SC} y anticuerpos puede favorecer la nucleación (un proceso propuesto para subrayar la formación de infectividad de prión^{20}) o puede opsonizar PrP^{SC} y potenciar el acceso de sitios linfoides de expansión de prión anormal. Asimismo puede sugerir que los animales se hacen más capaces de propagar la infección si el cambio genético es posterior en el desarrollo de células B. Para aclarar esta cuestión, los autores de la invención inocularon a ratones t11\muMT (ratones \muMT que expresan un transgen de IgM reorganizado dirigido contra la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular) y observaron que podían soportar diferenciación de células B normal pero expresaban exclusivamente la cadena pesada de IgM transgénica, tenían un repertorio de anticuerpos fuertemente oblicuo y muy limitado, y carecían de inmunoglobulinas de las subclases D, G, E y A. Dichos ratones fueron obtenidos con arreglo a los métodos conocidos en la especialidad.

Tras la inoculación i.p. con priones, los ratones t11\muMT desarrollaron la enfermedad con una latencia comparable a la de los ratones de tipo silvestre (Tabla 2) y acumularon PrP^{SC} en sus cerebros (Figura 2B). Se mostró por mancha de Western y por análisis de clasificación celular asistida por flujo (FACS) que el suero tanto de ratones t11MT enfermos de encefalopatía espongiforme terminales como sin infectar inoculados i.p. no reaccionaba con PrP^{C} (Figura 2c, d), lo que sugiere que IgGs no son los efectores de la "neuroinvasión" de prión y que no se puede correlacionar una respuesta inmune humoral específica (al menos tal como se valora por FACS y análisis de mancha de Western) con la patogénsis periférica de la encefalopatía espongiforme. No obstante, en favor de un escrutinio absoluto, no se puede excluir la posibilidad de que las IgM por debajo del umbral de detectabilidad, o los efectos indirectos de los anticuerpos, pueden tener relación con la patogénesis de la encefalopatía espongiforme. Esto se corresponde con la dificultad de obtener una transmisión de la enfermedad fiable a partir de componentes de suero solubles de animales enfermos.

Las células B son necesarias para la maduración de células dendríticas foliculares (FDCs) y la formación de centros germinales. La protección de ratones deficientes en células B puede por tanto ser el resultado de la ausencia de FDCs, especialmente a medida que las FDC acumulan PrP^{SC} extensivamente en ratones inoculados i.p.^{3} y en las anginas de pacientes que sufren de la nueva variante CJD^{21}. Así pues, los autores de la invención inocularon a ratones que carecían de receptor-1 de factor de necrosis de tumor (TNF-R^{0/0})^{22}, que no tenían virtualmente centros germinales en órganos linfáticos y muy pocas FDCs^{23}, si es que las tenían, a pesar de la diferenciación de células B y T. Estos ratones desarrollaron encefalopatía espongiforme tras la inoculación tanto i.c. como i.p., al igual que los ratones de control (tabla 2), lo que contradice el papel principal de las FDCs en la patogénesis periférica y corrobora los resultados anteriores de los autores de la invención de que la transferencia adoptiva de células de hígado fetal (que no sustituye eficazmente las FDCs^{24}) puede restaurar valoraciones de prión de bazo superiores tras la inoculación i.p.^{25}.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Para los bioensayos de infectividad, se inyectaron intracerebralmente homogenatos de cerebro y bazo en grupos de cuatro ratones tga20. ND: no determinado.

* Las valoraciones de prión expresadas como log LD_{50} por g de tejido del bazo o el cerebro.

\iota tiempo de incubación en días de ratones tga20 indicadores(media = desviación típica).

TABLA 2 Latencia de scrapie en diferentes ratones inmunodeficientes

2

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Todos los ratones desarrollaron encefalopatía espongiforme tras la inoculación i.c. En contraste, los ratones deficientes en células B permanecieron sanos tras la inoculación i.p. de priones scrapie RML.

* El antecedente genético fue C57BL/6 endémico

\iota Ona perforina^{0/0} y un ratón SCID sufrieron de muerte intercurriente 135 y 141 días tras la inoculación, respectivamente.

\updownarrow Dos ratones SCID C57BL/6 permanecieron sanos y fueron sacrificados 303 y 323 días después de la inoculación.

^{\NAK} El antecedente genético fue C.B.17 endogámico

# 3 /4 ratones SCID C.B-17 permanecieron sanos (>340 d). Se hicieron pruebas de desarrollo en cuatro ratones SCID C.B.187 más con 100 \mul de una dilución 10^{-4} de priones RML y todos permanecieron sanos (>340d).

¶ El antecedente genético fue C57BL/6 x 129Sv.

# El antecedente genético fue 129 Sv endogámico.

Por lo tanto, los autores de la invención han identificado procesos dependientes de células B y células B como factor limitativo del desarrollo de encefalopatía espongiforme transmisible tras la infección periférica. Por consiguiente, la presente invención proporciona un nuevo procedimiento específico y por tanto más preferible para suprimir ese componente del sistema inmune que es responsable de la propagación de prión, en concreto las células B.

\newpage

El papel de las células T

El papel de las células T en la presente memoria descriptiva se registra simplemente para entender mejor el papel de las células B en la presente invención.

Por otra parte, los autores de la invención han estudiado el papel de los procesos dependientes de células B durante la patogénesis. En consecuencia, los autores de la invención han llevado a cabo más experimentos dirigidos a establecer la cantidad y naturaleza de la posible interacción de células B infectivas con el resto de los componentes del sistema inmune, v.g., con células T. Los resultados de la indagación sobre dicha interacción y diseño de medidas terapéuticas adecuadas que influyen en dicha interacción son un aspecto más de influencia de la presente invención.

Tal como se ha señalado anteriormente, se sabe que los ratones desprovistos de genes PrP funcionales (Prn-p^{0/0}) son resistentes a encefalopatía espongiforme transmisible y no propagan priones (Büeler y cols., Cell, 73, 1339-1347, 1993). Por lo tanto, la reintroducción de transgenes PrP en Prn-p^{0/0} debería restaurar encefalopatía espongiforme transmisible. Partiendo de este concepto, los autores de la invención llevaron a cabo estudios en ratones Prn-p^{0/0} transgénicos para genes PrP controlados por promotores específicos de tejido. Dichos ratones pueden ser obtenidos por las personas especializadas en ingeniería genética con arreglo a los métodos conocidos en la especialidad. Específicamente, los autores de la invención emplearon "ratones de célula T" (promotor Ick, Chaffin y cols., EMBO J. 9, 3821-3829) que expresan exclusivamente PrP en células T y "ratones esplénicos" (promotor IRF-1/potenciador Eu; Yamada y cols., Proc. Natl. Acad-Sci. EE.UU. 88, 532-536, 1991) que expresan PrP en esplenocitos y a un nivel bajo en el cerebro. Las pruebas de desafío en ratones esplénicos con priones llevó al desarrollo de encefalopatía espongiforme, ya que los ratones esplénicos sucumbieron en la última etapa debido a la enfermedad cerebral y presentaron propagación de priones en el bazo y el timo así como en el cerebro. Por otra parte, los ratones de células T no presentaron propagación de priones. Por consiguiente, estos resultados se corresponden plenamente con los experimentos anteriores tal como se ha descrito anteriormente y confirman el papel crucial de células B (Tabla 3).

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TABLA 3

3

Tabla 1: Transmisión de priones de ratón a ratones transgénicos con expresión PrP ectópica.

Para seguir investigando el papel de procesos dependientes de células B, en una segunda etapa, se determinó selectivamente la infectividad de los esplenocitos de ratones esplénicos en un bioensayo. Se observó que, a pesar de que la mayor parte de la infectividad se llevó a cabo realmente con células B, las células T también se contaminaron en cierto grado (Tabla 4).

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TABLA 4

4

Tabla 2: Infectividad de esplenocitos totales y fraccionados de "ratones esplénicos" 120 días después de la inoculación i.p. con priones. Se fraccionaron las células por clasificación celular activada magnéticamente (MACS) utilizando anticuerpos anti-B220 de células B y anticuerpos anti-Thy 1.2 para células T.

Esta contaminación recién encontrada demostrada por las células T de los ratones esplénicos parece estar en contradicción con el hecho de que las células T de ratones células T no presentan ninguna contaminación (ver figuras 4 y 5). No obstante, lo que inicialmente parece una contradicción (infectividad de células T en algunos casos, no infectividad de células T en otros casos), en realidad implica y corrobora la existencia de una interacción entre las células B (los vehículos de infectividad) y células T (que como tales, no son capaces de propagar inefectividad). Los ratones esplénicos contienen tanto células T como células B, y tras la infección de las células B, tiene lugar una infección secundaria mediada por células B de las células T de ratones esplénicos. Por el contrario, los ratones de células T no contienen células B, y como consecuencia de esta falta de vehículos de infectividad, las células T de ratones de células T no están sujetas a infección.

Conclusiones

Tal como se ha señalado anteriormente, los autores de la invención no solamente han identificado el vehículo crucial de la infectividad, en concreto las células B, sino que también han proporcionado una poderosa herramienta para el seguimiento de la propagación de encefalopatía espongiforme transmisible dentro del sistema inmune de un ser humano o animal infectado. De hecho, la presente invención permite una distinción entre la incidencia de células B infectadas en solitario y la incidencia además de células T infectadas secundariamente.

En particular, esta conclusión de que la eliminación de linfocitos B por autolisis de células B de antígeno superficial limita o previene la transmisión de la infección de la enfermedad de prión demuestra que la ausencia de dichos componentes celulares previene la transferencia de la infectividad a otras células, como por ejemplo células T, o el desarrollo de la enfermedad. La deducción lógica es que las células B predicen el resultado patológico y la progresión de enfermedad de prión. Estos componentes específicos de la enfermedad del sistema inmune celular pueden graduar efectivamente la enfermedad en desarrollo predecir el estado de la enfermedad en un organismo individual sometido a tratamiento.

Se aíslan linfocitos de la sangre a través de técnicas normales conocidas por preservar las características celulares fenotípicas. Se pueden evaluar las células aisladas de esta manera sin manipulación o fijar a través de métodos adecuados e introducirse después en soluciones líquidas compuestas de constituyentes muy conocidos que contienen socios de unión o anticuerpos característicos para las células que pueden expresar determinantes fenotípicos de "enfermedad de prión" o determinantes de linfocito clásicos distribuidos entre células madre y/o hijas de un linaje de desarrollo determinado de una forma característica de la enfermedad. Estos componentes se pueden seleccionar, pero sin limitarse sólo a ellos, de diferenciación celular, CD, antígenos como CD 19, CD20, etc. y/o socios de unión específicos para determinados fenotipos celulares específicos de enfermedad intracelulares o extracelulares como por ejemplo anticuerpos para proteínas prion normales o anormales. Estos componentes pueden ser específicos de la especie o de la cepa de la enfermedad. Dichos fenotipos o distribución de fenotipos se correlacionan con la infectividad o la transmisión de infectividad. Ha de advertirse que dichos antígenos específicos de enfermedad de prión o CD o determinantes pueden distribuirse diferencialmente de una manera cuantitativa o cualitativa entre linfocitos de diferentes etapas de desarrollo y linajes funcionales. La relación de dichos determinantes fenotípicos en poblaciones celulares es diagnóstico de la presencia de la enfermedad, la presencia de progreso en avance de la enfermedad o el grado de regresión de la enfermedad sometida a tratamiento, dependiendo del estado del organismo en cuestión.

Dado que la observación inusual y nueva de células B proporciona el sitio germinal necesario para la promulgación de la enfermedad, el análisis de determinantes específicos en linfocitos B y T proporcionará una introspección en la progresión de la enfermedad. Debe entenderse que los medios para detectar estas relaciones de células proporcionales entre las diferentes poblaciones fenotípicas podría conseguirse por medio de métodos histopatológicos o métodos citométricos de flujo automáticos utilizando algoritmos de análisis de datos sofisticados para desplegar resultados de una forma fácilmente interpretable.

Otros aspectos de los modos preferibles de la invención

Por otra parte, según la presente invención, la supresión selectiva de células B infectivas puede llevarse a cabo por tratamiento con una cantidad adecuada de anticuerpos para un marcador superficial de células B infectivas. Debe anticiparse que el examen de disposiciones inusuales de células B o células T o sus células madre y productores puede ser importante. Preferiblemente, este anticuerpo reconoce la célula B infectiva y no la célula madre, lo que da cabida a una repoblación posterior de células B a través de la célula madre. Preferiblemente, los procedimientos muy conocidos en la especialidad pueden ayudar a preparar dichos anticuerpos. Por consiguiente, el uso de dichos anticuerpos en un medicamento que comprende dicho anticuerpo constituyen un aspecto más que contempla la presente invención.

Otro objeto más de la presente invención es el uso de depletores de célula B selectivos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de encefalopatía espongiforme transmisible en seres humanos o animales infectados. Un "depletor de células B" tal como se utiliza en la presente solicitud es un reactivo o un equipo de reactivos que, tras su administración ya sea en solitario, en combinación o de manera sucesiva, lleva a la depleción de células B en el organismo que se está tratando. Se puede utilizar cualquier depletor de células B conocido en la especialidad para conseguir el objeto de la presente invención que se ha señalado. Los depletores de células B adecuados comprenden tanto biomoléculas inmunológicamente activas, como v.g., anticuerpos, como compuestos químicos activos como inmunosupresores. Como ejemplo no limitativo, los anticuerpos anti-\muM tal como los describe R.S. Fujinami y cols., en Journal of Virology, 69, 1995, pp. 5152-5155, cuya descripción se incorpora en el presente documento como referencia, son depletores de células B preferibles con arreglo a la presente invención. Otro ejemplo de depletor de células B de acuerdo con la presente invención es el anticuerpo LR1 tal como se describirá más adelante. Otro ejemplo más de depletor de células B con arreglo a la presente invención es el anticuerpo B220 tal como se describirá más adelante. Asimismo, los anticuerpos para linfocitos B malignos, útiles para el tratamiento de linfoma de linfocitos B, frecuentemente son reactivos con células B normales y también se pueden utilizar para los fines de la presente invención. En la bibliografía se pueden encontrar ejemplos de dichos anticuerpos. v.g. Epstein y cols., describen la preparación de dos de dichos anticuerpos, denominados Lym-1 y Lym-2, en Two new Monoclonal Antibodies Lym-1 y Lym-2, Reactive with Human B-Lymphocytes and Derived Tumors, with Immunodiagnostic and Immunotherapeutic Potential, Cancer Research, 47, 830-840 (1987). Dado que es posible que en algunos casos, cuando no en muchos casos, la población de células B no compartan todas ellas marcadores superficiales idénticos, puede ser necesario utilizar más de un anticuerpo para conseguir efectivamente la depleción deseada de células B. La presente invención prevé la utilización de cuantos anticuerpos sean necesarios para conseguir esta meta.

Asimismo, la presente invención prevé el uso de anticuerpos sin modificar "desnudos", así como anticuerpos conjugados con un agente citotóxico, toxina o radionuclido adecuado. Entre los radioisótopos adecuados se incluyen ^{131}I, ^{90}Y, ^{67}Cu. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos yodados son muy conocidos en la especialidad y dichas preparaciones pueden llevarse a cabo fácilmente en radiofarmacias hospitalarias.

El anticuerpo también puede conjugarse a través de los procedimientos descritos en la especialidad con fármacos citotóxicos conocidos como metotrexato, aminopterina, mitoxantrona, vincristina, vinblastina, doxorrubicina y otros, o con toxinas vegetales como abrina o ricina o similares o sus sub-unidades de inactivación de ribosoma, u otros agentes conocidos por sus propiedades citotóxicas.

Por otra parte, la presente invención contempla el uso de anticuerpos alterados genética, enzimática o químicamente que reconocen células B, en virtud de lo cual las regiones constantes han sido alteradas o reemplazadas con dominios que fijan proteínas complemento o provocan la destrucción de la célula diana en virtud de la citoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), activando así el sistema inmune del propio paciente.

Otros ejemplos no limitativos de depletores de célula B contemplados en la presente invención son compuestos químicos como ciamexona (patente EE.UU. 5.055.290) e imexon (patente EE.UU. 5.369.119).

Las composiciones terapéuticas (v.g., los medicamentos) de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral por inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea (intranasofarangialmente), por dermoabsorción, por vía oral, intraocular o intracerebroventricular (i.c.v.). Alternativamente, se pueden administrar las composiciones por vía intramuscular, o intravenosa. Las composiciones para administración parenteral incluyen soluciones acuosas y no acuosas esterilizadas, suspensiones y emulsiones. Entre los ejemplos de disolventes no acuosos se incluyen propilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Se pueden utilizar vehículos o revestimientos oclusivos para aumentar la biodisponibilidad. Las formas de dosis líquidas para administración oral pueden comprender por lo general una solución de liposoma que contiene la forma de dosis líquida. Entre las formas adecuadas para liposomas de suspensión se incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, siropes y elixires que contienen los diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, dichas composiciones pueden incluir además adyuvantes, agentes de humectación, agentes emulsionantes y de suspensión, o agentes edulcorantes, aromatizantes y de perfume.

De acuerdo con la presente invención una "cantidad efectiva" del medicamento es una cantidad suficiente para conseguir el efecto biológico deseado. Generalmente, la dosis necesaria para proporcionar una cantidad efectiva del medicamento variará dependiendo de factores como la edad del ser humano o animal, el estado, el sexo y el grado de la en-
fermedad, cuando existe, así como otras variables, pudiendo ser ajustada por la persona especializada en el campo.

Existe un método de diagnóstico, que no entra sin embargo dentro del marco de la presente invención, que permite la determinación de la presencia o ausencia de células B infectivas en seres humanos y animales o en productos derivados de tejido o fluido corporal aislados de los mismos. Dicho método de ensayo comprende las etapas de extracción de células B de tejidos o fluidos corporales o de productos derivados de ellos y la inoculación de dichas células B en el cerebro de un animal de ensayo, el desarrollo de encefalopatía espongiforme transmisible en dicho animal de ensayo que indique la presencia de dichas células B infectivas.

En lo que se refiere a la etapa de extracción, será evidente para las personas especializadas en este campo, que dicha extracción implica el uso de una entidad física reactiva que reconozca específicamente células B, preferiblemente anticuerpos específicos de células B, como los que se describen más adelante. Así pues, la extracción será preferiblemente análoga a los métodos de separación adoptados para la fabricación de productos derivados de tejido o fluido corporal no infectivos que se detallarán más adelante. En un modo de realización preferible, pero no limitativo de la presente invención, los autores de la invención han utilizado anticuerpos anti-ratón-B220 conjugados con microperlas super-paramagnéticas (Milteny Biotec GmbH, Alemania) para la purificación de células B.

Los animales de ensayo adecuados para llevar a cabo el método son v.g., ratones indicadores tga20 y tal como fueron utilizados por Brandner y cols., en "Normal host prion protein necessary for scrapie-induced neurotoxicity", Nature, 379 (1996). Tal como describe Brandner, la infectividad de un inóculo dado determina el tiempo de incubación transcurrido antes de la aparición de síntomas clínicos manifestados en animales de ensayo (ver tabla 5).

Otro objeto más de la invención consiste en proporcionar un producto de fluido corporal sin TSE humano no infectivo. Así pues, de acuerdo con la invención, un producto de fluido corporal no infectivo es un producto de fluido corporal que está sustancialmente libre de células B. Un producto de fluido corporal preferible de acuerdo con la invención es un producto de sangre.

Un aspecto más de la invención consiste en proporcionar un producto derivado de tejido sin TSE humano no infectivo. Así pues, de acuerdo con la invención, un producto derivado de tejido no infectivo es un producto derivado de tejido que está sustancialmente libre de células B. Un producto derivado de tejido preferible según la invención es un producto derivado del sistema linforreticular. Un producto derivado de tejido más preferible aún según la invención es un producto derivado del bazo.

Un aspecto más de la invención consiste en un método para la fabricación de un producto derivado de fluido corporal sin TSE humano no infectivo. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, los productos de fluido corporal no infectivos se obtienen a través de la depleción específica in vitro solamente de células B de los fluidos corporales o de otros productos de fluido corporal conocidos. Si bien podría utilizarse cualquier método adecuado conocido entre las personas especializadas en la técnica para la depleción específica de células B de fluidos corporales, son preferibles medios de depleción específica de inmunorreactivos específicos de células B, como v.g., anticuerpos específicos de células B. Entre los ejemplos adecuados pero no limitativos de dichos anticuerpos específicos de células B se incluyen los anticuerpos B220 y LR1 disponibles en el comercio o anticuerpos anti-mu M, ver anterior. La expresión "depleción específica por medio de anticuerpos específicos de células B" abarca cualquier método de depleción que comprenda el uso de reactivos de depleción que comprenden anticuerpos específicos de célula B para el reconocimiento de células B en productos de fluido corporal. Los reactivos de depleción que comprenden anticuerpos específicos de célula B son anticuerpos específicos de células B que se conjugan con una fase sólida o que son capaces de interactuar con una fase sólida a través de medios químicos o físicos ya sea por sí mismos o en virtud de una derivatización adecuada de manera que quedan inmovilizados directa o indirectamente sobre dicha fase sólida de manera que dan cabida a la separación desde la mezcla de reacción.

Un aspecto más de la invención consiste en un método de fabricación de dicho producto derivado de tejido sin TSE humano no infectivo. Así pues, de acuerdo con la invención los productos derivados de tejido sin TSE humanos no infectivos se obtienen por depleción específica in vitro solamente de células B desde productos derivados de tejido. Si bien se puede utilizar cualquier método adecuado conocido entre las personas especializadas en este campo para la depleción específica de células B desde productos derivados de tejido, es preferible la depleción específica por medio de inmunorreactivos específicos de células B, como por ejemplo anticuerpos específicos de células B. Entre los ejemplos adecuados pero no limitativos de anticuerpos específicos de células B se incluyen los anticuerpos B220 o LR1 o los anticuerpos anti- mu M disponibles en el comercio. La expresión "depleción específica por medio de anticuerpos específicos de células B" abarca cualquier método de depleción que comprenda el uso de reactivos de depleción que comprenden anticuerpos específicos para células B para el reconocimiento de células B en productos derivados de tejido. Los reactivos depletores que comprenden anticuerpos específicos de células B son anticuerpos específicos de células B que están conjugados con una fase sólida o que son capaces de interactuar con una fase sólida a través de medios químicos o físicos ya sea por sí mismos o en virtud de una derivatización adecuada de manera que puedan quedar inmovilizados directamente o indirectamente en dicha fase sólida para dar cabida a la separación desde la mezcla de reacción.

Según otro aspecto más, de acuerdo con la invención, se aíslan productos de fluido corporal no infectivo sin TSE humano y/o productos derivados de tejido desde aislados de seres humanos que son solo deficientes en células B. Se puede utilizar cualquiera de los métodos conocidos entre las personas especializadas en la técnica para la depleción de células B en organismos. Por ejemplo, se pueden tratar organismos con anticuerpos anti- mu M tal como describe R.S. Fujinami y cols., ver anterior, de manera que se conviertan en fuentes de sangre periférica depletada de células B. Un método más para la depleción de células B en organismos puede ser un "knockout" (eliminación para hacerlos inoperativos) selectivo de genes relacionados con células B. Un ejemplo no limitativo adecuado de organismo obtenido por knocking out de genes relacionados con células B es el ratón mu Mt descrito por Kitamira y cols., "A B-cell deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin muchain gene" Nature 350, 423-42 (1991).

Inmunoensayos: este capítulo tiene por objeto un fin ilustrativo. Los inmunoensayos no entran dentro del marco de la presente invención.

Las células B, que tal como se ha demostrado son capaces de transmitir encefalopatía espongiforme, son importantes para la generación de reactivos inmunológicos, antígenos y anticuerpos específicos que se pueden utilizar en diversos ensayos, muchos de los cuales se describen aquí, para la detección de encefalopatía espongiforme transmisible (TSE). Se pueden utilizar como inmunógenos para producir anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden ser por ejemplo anticuerpos policlonales o monoclonales, anticuerpos humanizados y de cadena única, quiméricos, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión Fab. En la técnica se conocen diversos procedimientos que se pueden utilizar para la producción de dichos anticuerpos y fragmentos.

Por ejemplo, se pueden obtener anticuerpos generados contra una preparación de células B infectivas por inyección directa de 3-células infectivas en un animal. Es preferible un ratón, conejo o cabra. El anticuerpo así obtenido se unirá después con las células B infectivas. Dichos anticuerpos se pueden utilizar luego para aislar las células B infectivas de las muestras de ensayo como por ejemplo tejidos que contienen presuntamente material infeccioso. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede emplear cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivo de línea celular continuo. Entre los ejemplos se incluyen la técnica de hibridoma tal como la describe Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humano, tal como la describe Kozbor y cols., Immun. Today 4:72 (1983) y la técnica de EEV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos, tal como la describe Cole y cols., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. Nueva York NY, pp. 77-96 (1985). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena única para los productos de polipéptido inmunogénicos de la invención. Ver por ejemplo, la patente EE.UU. Nº 4.946.778.

Varios formatos de ensayo pueden utilizar los anticuerpos utilizados en la presente invención, incluyendo inmunoensayos "sandwich" y ensayos de sonda. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, pueden emplearse en varios sistemas de ensayo para determinar la presencia, cuando existe, de células B infectivas en una muestra de ensayo. Por ejemplo, en un primer formato de ensayo, se pone en contacto un anticuerpo policlonal o monoclonal, o fragmento del mismo, o una combinación de estos anticuerpos, que han sido recubiertos sobre una fase sólida, con una muestra de ensayo para formar una primera mezcla. Se incuba esta primera mezcla durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos antígeno/anticuerpo. A continuación, se pone en contacto un reactivo indicador que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento del mismo, o una combinación de estos anticuerpos, a los que se ha unido un compuesto generador de señal, con los complejos antígeno/anticuerpo para formar una segunda mezcla. A continuación, se incuba esta segunda mezcla durante un período de tiempo y en condiciones adecuadas para formar complejos anticuerpo/antígeno/anticuerpo. La presencia de células B infectivas en la muestra de ensayo y capturada sobre la fase sólida, si existe, se determina por detección de la señal calibrable generada por el compuesto generador de señal. La cantidad de antígeno de célula B infectiva en la muestra de ensayo es proporcional a la señal generada.

En un formato de ensayo alternativo, se forma una mezcla poniendo en contacto: (1) un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, que se une específicamente a células B infectivas, o una combinación de dichos anticuerpos unidos a un soporte sólido; (b) la muestra de ensayo; y (3) un reactivo indicador que comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo, que se une específicamente a diferentes antígenos de célula B infectivos (o una combinación de estos anticuerpos) a los que se une un compuesto generador de señal. Se incuba esta mezcla durante un período de tiempo en condiciones suficientes para formar complejos anticuerpo/antígeno/anticuerpo. La presencia, si existe, de antígeno de células B infectivas presentes en la muestra de ensayo y capturadas en la fase sólida se determina por detección de la señal calibrable generada por el compuesto generador de señal. La cantidad de antígeno de célula B infectivo presente en la muestra de ensayo es proporcional a la señal generada.

En otro formato de ensayo, se puede emplear un anticuerpo o una combinación de al menos dos anticuerpos monoclonales utilizados en la invención como sonda competitiva para la detección de anticuerpos para antígeno de células B infectivas. Por ejemplo, se puede lisar suavemente las células B infectivas y recubrir sobre una fase sólida. A continuación, se incuba una muestra de ensayo que contiene presuntamente anticuerpos de antígeno de células B infectivas con un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal y al menos un anticuerpo monoclonal de la invención durante un período y en condiciones suficientes para formar complejos antígeno/anticuerpo de o bien la muestra de ensayo y el reactivo indicador unido a la fase sólida o bien del reactivo indicador unido a la fase sólida. La reducción de unión del anticuerpo monoclonal a la fase sólida puede medirse cuantitativamente.

En otro método de detección más, se puede emplear cada uno de los anticuerpos monoclonales o policlonales utilizados en la presente invención en la detección de antígenos de células B infectivas en secciones de tejido, así como en células, por análisis inmunohistoquímico. Se puede llevar a cabo también el análisis citoquímico en el que se etiquetan estos anticuerpos directamente (por ejemplo con fluoresceína, oro coloidal, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.) o se etiquetan mediante el uso de anticuerpos anti-especie etiquetados secundariamente (con varias etiquetas tal como se ilustra aquí) para rastrear la histopatología de la enfermedad.

Adicionalmente, estos anticuerpos monoclonales se pueden unir a matrices similares a la sefarosa activada por CNBr y utilizarlos para la purificación de afinidad de células B infectivas específicas o antígenos de células B infectivas a partir de cultivos celulares o tejidos biológicos, por ejemplo para purificar proteínas de células B infectivas recombinantes y nativas o para preparar tejido o fluido biológico desprovisto de células B infectivas.

Los anticuerpos monoclonales, con arreglo a la invención también pueden ser utilizados para la generación de anticuerpos quiméricos para uso terapéutico u otras aplicaciones similares.

Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos pueden proporcionarse individualmente para detectar células B infectivas. Las combinaciones de los anticuerpos monoclonales (y fragmentos de los mismos) aquí proporcionados también pueden ser utilizados en combinación como componentes de una mezcla o "cocktail" de al menos un anticuerpo de células B infectivas de la invención, junto con anticuerpos que se unen específicamente a otras regiones de células B infectivas, teniendo cada anticuerpo diferentes especificidades de unión. Según esto, este cocktail puede incluir los anticuerpos monoclonales de la invención que van dirigidos a polipéptidos de células B infectivas y otros anticuerpos monoclonales específicos para otros determinantes antigénicos de células B infectivas.

El anticuerpo policlonal o fragmento del mismo que se puede utilizar en los formatos de ensayo deberá unirse específicamente a un polipéptido de células B infectivas u otros polipéptidos de células B infectivas que se utilicen adicionalmente en el ensayo. El anticuerpo policlonal utilizado preferiblemente es de origen mamífero, como por ejemplo anticuerpo policlonal de ser humano, cabra, conejo u oveja que se une a células B infectivas. Es sobre todo preferible, que el anticuerpo policlonal sea de origen de conejo. Los anticuerpos policlonales utilizados en los ensayos pueden utilizarse o bien en solitario o como un cocktail de anticuerpos policlonales. Dado que los cocktails utilizados en los formatos de ensayo comprenden o bien anticuerpos monoclonales o bien anticuerpos policlonales que tienen diferente especificidad de unión con células B infectivas, son útiles para prevenir o tratar encefalopatía espongiforme transmisible.

Las células B infectivas o antígenos específicos de las mismas pueden ser detectables en ensayos mediante el uso de un antígeno recombinante así como mediante el uso de un péptido sintético o péptido purificado, comprendiendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos de células B infectivas. También entra dentro del marco de la invención la posible utilización de diferentes péptidos sintéticos, recombinantes o purificados que identifican diferentes epítopos de células B infectivas, en combinación en un ensayo para prevenir o tratar encefalopatía espongiforme transmisible. Todos estos péptidos se pueden revestir sobre una fase sólida; o cada uno de los péptidos por separado puede revestirse sobre distintas fases sólidas, como micropartículas, y combinarse después para formar una mezcla de péptidos que se puede utilizar más adelante en los ensayos. Por otra parte, se contempla el posible uso de múltiples péptidos que definen epítopos de diferentes antígenos para la prevención o tratamiento de encefalopatía espongiforme transmisible. A continuación, se deja que los péptidos revestidos sobre fases sólidas o etiquetados con etiquetas detectables compitan con los presentes en una muestra del paciente (si la hay) para una cantidad limitada de anticuerpo. Una reducción de la unión en péptidos sintéticos, recombinantes o purificados al anticuerpo (o anticuerpos) es una indicación de la presencia de antígeno de células B infectivas en la muestra de paciente. La presencia de antígeno de células B infectivas indica la presencia de encefalopatía espongiforme transmisible en el paciente. Se conocen variaciones de formatos de ensayo entre las personas especializadas en la técnica, de los cuales muchos se explicarán aquí a continuación.

En otro formato de ensayo, se puede detectar la presencia de antígeno de célula B infectiva y/o anticuerpo de célula B anti-infectiva en un ensayo simultáneo del siguiente modo. Se pone en contacto una muestra de ensayo simultáneamente con un reactivo de captura de un primer analito, comprendiendo el reactivo de captura un primer miembro de unión específico para un primer analito unido a una fase sólida y un reactivo de captura para un segundo analito unido a una segunda fase sólida para formar de este modo una mezcla. Se incuba esta mezcla durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para formar complejos de reactivo de captura/primer analito y reactivo de captura/segundo analito. A continuación, se ponen en contacto estos complejos así formados con un reactivo indicador que comprende un miembro de un par de unión específica para el primer analito etiquetado con un compuesto de generación de señal y un reactivo indicador que comprende un miembro de un par de unión específica para el segundo analito etiquetado con un compuesto generador de señal para formar una segunda mezcla. Se incuba esta segunda mezcla durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para formar complejos de reactivo de captura/primer analito/reactivo indicador y reactivo de captura/segundo analito/reactivo indicador. La presencia de uno o más analitos se determina detectando una señal generada en conexión con los complejos formados en una o en las dos fases sólidas como indicación de la presencia de uno o más analitos en la muestra de ensayo. En este formato de ensayo, se pueden utilizar los antígenos recombinantes derivados de los sistemas de expresión descritos aquí, así como los anticuerpos monoclonales producidos desde las proteínas derivadas de los sistemas de expresión que se han descrito aquí. Por ejemplo, en este sistema de ensayo, el antígeno de células B infectivas puede ser el primer analito. Dichos sistemas de ensayo se describen con mayor detalle en la publicación EP Nº 0473065.

En otros formatos de ensayo más, se pueden utilizar los polipéptidos aquí descritos para detectar la presencia de anticuerpo contra antígeno de células B infectivas en muestras de ensayo. Por ejemplo, se incuba una muestra de ensayo con una fase sólida a la que se ha unido al menos un polipéptido, como por ejemplo una proteína recombinante o péptido sintético. Se hacen reaccionar durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para formar complejos antígeno/anticuerpo. Tras la incubación, se detecta el complejo antígeno/anticuerpo. Se pueden utilizar reactivos indicadores para facilitar la detección, dependiendo del sistema de ensayo elegido. En otro formato de ensayo, se pone en contacto una muestra de ensayo con una fase sólida a la que se ha unido una proteína recombinante producida tal como se ha descrito, y también se pone en contacto con un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para la proteína, que ha sido etiquetada preferiblemente con un reactivo indicador. Tras la incubación durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para formar complejos anticuerpo/antígeno, se separa la fase sólida de la fase libre y se detecta la etiqueta tanto en la fase sólida o en la fase libre como indicación de la presencia de anticuerpo contra antígeno de células B infectivas. Se describen otros formatos de ensayo en los que se utilizan los antígenos recombinantes aquí descritos. Entre ellos se incluyen el contacto de una muestra de ensayo con una fase sólida a la que se ha unido al menos un antígeno a partir de una primera fuente, la incubación de la fase sólida y la muestra de ensayo durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para formar complejos antígeno/anticuerpo y, a continuación, contacto de la fase sólida con un antígeno etiquetado, derivándose el antígeno de una segunda fuente diferente de la primera fuente. Por ejemplo, se utiliza una proteína recombinante derivada de una primera fuente como E. coli como antígeno de captura sobre una fase sólida, se añade una muestra de ensayo a la fase sólida así preparada y siguiendo las etapas de incubación y lavado normales según se considere o sea necesario, se utiliza una proteína recombinante derivada de una fuente diferente (es decir no E. coli) como parte de un reactivo indicador que se detecta posteriormente. De igual modo, también son posibles las combinaciones de un antígeno recombinante sobre una fase sólida y un péptido sintético en la fase indicador. Se contempla cualquier formato de ensayo en el que se utilice antígeno específico para células B infectivas producidas o derivadas de una primera fuente como antígeno de captura y antígeno específico para células B infectivas a partir de una segunda fuente diferente.

Se describen también otros ensayos que utilizan otras fases sólidas diversas; por ejemplo, se pueden emplear procedimientos de captura iónica para inmovilizar un complejo de reacción inmovilizable con un polímero de carga negativa (descrito en la publicación EP 0326100 y publicación EP Nº 0406473) para llevar a efecto una reacción inmunoquímica en fase solución rápida. Se separa un complejo inmune inmovilizable del resto de la mezcla de reacción por interacciones iónicas entre el complejo poli-anión/inmune de carga negativa y la matriz porosa con carga positiva tratada previamente y se detecta utilizando varios sistemas de generación de señal descritos anteriormente, incluyendo los descritos en medidas de señal quimioluminiscente descritas en la publicación EPO Nº 0.273.115.

Asimismo, se pueden adaptar estos métodos para su uso en sistemas en los que se utiliza tecnología de micropartículas, incluyendo sistemas automáticos y semi-automáticos en los que la fase sólida comprende una micropartícula (magnética o no magnética). Dichos sistemas incluyen los descritos por ejemplo en las solicitudes EPO publicadas Nº EP 0.425.633 y EP 0.424.634, respectivamente.

El uso de microscopía de sonda de exploración (SPM) para inmunoensayos también constituye una tecnología a la que se pueden adaptar fácilmente los anticuerpos monoclonales de la presente invención. En la microscopía de sonda de exploración, en particular en microscopía de fuerza atómica, se adhiere la fase de captura, por ejemplo, al menos uno de los anticuerpos monoclonales utilizados en la invención, a una fase sólida y se utiliza el microscopio de sonda de exploración para detectar complejos antígeno/anticuerpo que pueden estar presentes en la superficie de la fase sólida. El uso de microscoía de tunelación de exploración elimina la necesidad de etiquetas que se deben utilizar normalmente en muchos sistemas de inmunoensayo para detectar complejos antígeno/anticuerpo. El uso de SPM para llevar un seguimiento de las reacciones de unión específicas puede tener lugar de muchas maneras. En uno de los métodos, se une un miembro de un socio de unión específico (sustancia específica de analito que es el anticuerpo monoclonal de la invención) a una superficie adecuada para la exploración. La unión de la sustancia específica de analito puede consistir en la adsorción con la pieza de ensayo que comprende una fase sólida de una superficie plástica o de metal, seguido de métodos conocidos entre las personas especializadas en este campo. O, se puede utilizar la unión covalente de un socio de unión específico (sustancia específica de analito) con una pieza de ensayo comprendiendo dicha pieza una fase sólida de derivado de plástico, metal, silicio o vidrio. Los métodos de unión covalente son conocidos entre las personas especializadas en este campo e incluyen diversos medios de unión irreversible de socios de unión específicos con la pieza de ensayo. Si la pieza de ensayo es silicio o vidrio, se debe activar la superficie antes de la unión del socio de unión específico. Asimismo, se pueden utilizar interacciones de polielectrolito para inmovilizar un socio de unión específica sobre una superficie de una pieza de ensayo utilizando técnicas y técnicas químicas. El método de unión preferible es el medio covalente. Tras la unión de un socio de unión específica, se puede tratar posteriormente la superficie con materiales como suero, proteínas u otros agentes de bloqueo para reducir al mínimo la unión no específica. Se puede explorar también la superficie o bien en el sitio de fabricación o bien el punto de uso para verificar su adecuación para los propósitos de ensayo. El proceso de exploración no se anticipa para alterar las propiedades de unión específica de la pieza de ensayo.

Los reactivos como por ejemplo anticuerpos, proteínas y péptidos utilizados en la presente invención pueden ser utilizados en sistemas de ensayo en fase sólida. Dichos sistemas de ensayo son conocidos entre las personas especializadas en la técnica.

El reactivo empleado para el ensayo se puede proporcionar en forma de un equipo de ensayo con uno o más contenedores como por ejemplo viales o botellas, conteniendo cada uno de los contenedores un reactivo por separado como por ejemplo, una sonda, cebador, anticuerpo monoclonal o cocktail de anticuerpos monoclonales, o un polipéptido (v.g., producido por recombinación, sintético o purificado) de los empleados en el ensayo. Se pueden incluir en dichos equipos de ensayo otros componentes como tampones, controles y similares conocidos entre las personas especializadas en la técnica. Se pueden emplear equipos de ensayo que tienen medios de recogida de muestras de ensayo que comprenden fluidos corporales accesibles, v.g., sangre, líquido encéfalo-raquídeo, orina, saliva y heces. Dichas herramientas útiles para la recogida (materiales de recogida) incluyen bisturí y papel o tela absorbente para recoger y estabilizar sangre; escobillas para recoger y estabilizar saliva; vasos para recoger y estabilizar muestras de orina y heces. Los materiales de recogida, papeles, telas, escobillas, vasos y similares, se pueden tratar opcionalmente para evitar la desnaturalización o adsorción irreversible de la muestra. Los materiales de recogida también pueden tratarse con conservantes, estabilizantes o agentes antimicrobianos, o contenerlos, para ayudar a mantener la integridad de los especimenes. Los equipos de ensayo diseñados para la recogida, estabilización y conservación de especimenes de ensayo obtenidos por cirugía o biopsia con aguja también son útiles. Todos los equipos pueden configurarse en dos componentes que pueden proporcionarse por separado; uno de los componentes para la recogida y el transporte del espécimen y el otro componente para el análisis del espécimen. El componente de recogida, por ejemplo, puede facilitarse al usuario en el mercado abierto, mientras que los componentes para el análisis pueden proporcionarse a terceros, como por ejemplo personal de laboratorio, para la determinación de la presencia, ausencia o cantidad de analito. Por otra parte, los equipos para la recogida, estabilización y conservación de especimenes de ensayo pueden configurarse para que sean utilizados por personal no entrenado y pueden estar disponibles en el mercado abierto para su uso en casa con el transporte posterior al laboratorio para el análisis de la muestra de ensayo.

La presente invención quedará descrita a continuación con los siguientes ejemplos cuyo fin es ilustrativo, sin pretender limitar el marco de la presente invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Generación de ratones t11 \muMt

Se clono el segmento V-gen de la cadena pesada de inmunoglobulina de la cadena pesada de inmunoglobulina de hibridoma de célula B VI41 (ref. 27) que secreta un anticuerpo neutralizante de VSV en un vector de expresión que codifica la \mu-cadena de ratón de alotipo a. Se generaron ratones transgénitos y se cruzaron con ratones \muMT. Los ratones t11 \muMT expresaron exclusivamente la cadena \mu transgénica del alotipo a; no se detectaron IgM endógena del alotipo b ni inmunoglobulinas de otras subclases en su suero (no mostrado).

Ejemplo 2 1. Inoculación de scrapie

Se inocularon ratones con un 1% homogenato de cerebro tratado con calor y sarcosilo preparado de ratones infectados con la cepa de scrapie de Rocky Mountain Laboratory (RML). Se utilizaron treinta microvaloraciones para la inyección intra-craneal (i.c.), mientras que se administraron 100 \mul por ruta intra-peritoneal (i.p.). Se llevó un seguimiento de los ratones cada segundo día, y se diagnosticó scrapie con arreglo a criterios clínicos normales.

2. Análisis de mancha de Western

Se prepararon homogenatos de cerebro al 10% tal como se ha descrito y, cuando se indica, se digirieron con 20 \mug/ml de proteinasa K durante 30 minutos a 37ºC. Se sometieron a electroforesis 80 \mug de proteína total a través de 12% SDS - gel de poliacrilamida, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, se sondearon con anticuerpo monoclonal 6H4 (Prionics Ag, Zurich) o antisuero policlonal IB3 (referencia 26) contra ratón PrP, y se revelaron por quimioluminiscencia potenciada.

3. Detección de Anticuerpos PrP

Se sometieron a electroforesis lisatos de cerebro de ratones de tipo silvestre y Prnp^{0/0}, así como PrP de E. coli recombinante, a través de 12,5% SDS-gel de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. A continuación, se incubaron las membranas con suero de ratones con enfermedad scrapie terminales infectados (diluido 1:100). Se consiguió la visualización por quimioluminiscencia potenciada tal como se ha descrito anteriormente para la mancha de Western.

4. Estudios de inmunohistoquímica

Se fijaron tejidos de cerebro de cada ratón, se inactivaron durante 1 hora con ácido fórmico al 98%, se embebieron en parafina y se sometieron a manchado convencional y a inmuno-manchado para determinar la proteína ácida fibrilar glial con arreglo al procedimiento normal. Se detecto la gliosis (un indicador no específico pero temprano de daño cerebral) mediante la presencia de astrocitos reactivos inmunomanchados grandes. En ratones con enfermedad de scrapie terminales, la vacuolización extendida amplia se observó consistentemente en todo el sistema nervioso central.

5. Bioensayos infectivos

Se prepararon homogenatos de cerebro y de bazo (p/v 10% en sacarosa 0,32 M) de animales infectados tal como se ha descrito y se administraron 30 \mul (diluido 1:10 en solución salina tamponada con fosfato que contenía 1% BSA) i.c. a grupos de al menos 4 ratones tga^{20} para cada muestra. Se determinó el tiempo de incubación hasta el desarrollo de la enfermedad de scrapie terminal y se calculó la valoración de infectividad utilizando la relación y =14,37-0,11 x en la que y es ID50 y x es el tiempo de incubación (en días) para la enfermedad terminal.

6. Preparación de solenocitos

Se recuperaron bazos de ratones de 34 días de vida seguido de la inoculación i.p. con cepas RML de priones. Se prepararon suspensiones de esplenocitos forzando los bazos a través de un tamiz de malla fina hacia 25 ml de tampón de separación magnética de células (MACS). El tampón MACS está compuesto de solución salina tamponada con fostato que contiene 1% de BSA, EDIA 5 mM y 0,1% de azida sódica. Al cabo de un período de incubación de 15 minutos en hielo para permitir que se sedimentaran los aglomerados celulares se separó la suspensión celular para una posterior evaluación.

7. Anticuerpos

Se obtuvieron anticuerpos conjugados con microperlas super-paramagnéticas que reconocen específicamente células B y T (anti-ratón-B220, anti-Thy, 1,2 anti-IgM y anti-CD3) de Milteny Biotech GmbH. Se obtuvieron también todas las columnas de separación magnética (columna A2 & CS) de Milteny Biotech GmbH. Se obtuvo complemento de conejo de Cedarlane, Ontario (complemento de conejo Low-tox-M). Se obtuvieron anticuerpos andicionales (LR1, ratón anti-ratón thy 1,2) de Serotec.

8. Purificación de células B y T por separación de perlas magnéticas

Se centrifugaron 5 ml de una suspensión de esplenocitos a 100 rpm durante 10 minutos y se recuperó el aglomerado celular en = 0,6 ml de tampón MACS. A continuación, se incubaron las células con 75 \mul de B-200 o Lthy 1,2 microperlas super-paramagnéticas conjugadas según las instrucciones del fabricante (Milteny Biotech GmbH) durante 15 minutos a 4ºC. Tras la incubación, se ajustó el volumen total a 2 ml con tampón MACS y se cargó en una columna A2 pre-cargada y lavada (columna de separación magnética). Se eluyeron las células no asociadas con las microperlas magnéticas con 5 ml de tampón MACS. A continuación, se separó la columna del campo magnético y se volvió a nivelar para separar las células extraídas. A continuación, se repitió el proceso de separación y se eluyó la población celular enriquecida en B o T final con 11 ml de tampón MACS después de haber separado la columna de separación del campo magnético.

9. Lisis de complemento

Para mejorar más la pureza de la población de células B y T obtenida por separación magnética, se llevó a cabo la lisis de complemento de la población enriquecida en células T o B. Se aglomeraron las células y se volvieron a suspender en medio citotóxico (CM, medio RPMI-1640 con un contenido de 25 mM de HEPES y 0,3% de BSA) a una concentración de 1-3x10^{7} células/ml. Para la depleción de células B, se utilizó un anticuerpo específico de células B, v.g., LR1. En cambio, para la depleción de células TL, se utilizó un anticuerpo específico de células T, v.g., Thy 1,2. La concentración de anticuerpos efectiva óptima tendría que ser determinada individualmente para las fuentes de anticuerpo específico. Se llevó a cabo la incubación con los anticuerpos a 4ºC durante 60 minutos tras lo cual se volvieron a suspender las células en LCM que contenía 20% de complemento de conejo Low-tox-M y se incubó a 37ºC durante 60 minutos para permitir la lisis celular. Se separaron las células viables a continuación de las células muertas y los restos por centrifugado sobre linfolito-M (Cedarlane, Ontario) u otro medio de separación celular según las instrucciones del fabricante.

10. Preparación de células para análisis de citometría de flujo

Se preparó una suspensión celular de Singel única para análisis de citometría de flujo en tampón FACS que consistió en solución salina tamponada con fosfato con un contenido de 2% de FCS, 20 mM de EDTA y 1% de azida sódica. Se utilizaron muestras de sangre periférica y se enriqueció la población de linfocitos por eliminación por lisis de los glóbulos rojos de sangre heparinizada. El proceso de manchado celular consistió en la incubación de la población de células con concentración saturada de anticuerpos conjugados con fluoresceína (FITC) durante 30 minutos a 4ºC. A continuación, se lavaron las células con tampón FACS para separar el material sin unir y someterlo a análisis de flujo. Cuando se utilizó el método de manchado indirecto, primero se incubaron las poblaciones celulares con el anticuerpo primario durante 30 minutos a 4ºC, se lavó con tampón FACS y se siguió con 30 minutos adicionales de incubación a 4ºC con un anticuerpo conjugado con FITC secundario. Tras la eliminación de los anticuerpos secundarios conjugados con FITC sin unir, las poblaciones celulares estuvieron listas para el análisis de flujo.

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Explicación de los resultados del ejemplo 2 1. Determinación de la infectividad de scrapie

Se demostró la infectividad del material cerebral de ratones infectados con scrapie por infección i.c. de ratones indicadores tga20. Se determinó la infectividad por inyección de muestras de 30 \mul i.c. en ratones tga20 y determinando el período para que se manifestara la enfermedad a través de procedimientos histoquímicos normales. En la tabla 5 se ilustra un resultado típico de dicho análisis. El análisis da el índice de éxito de transmisión de la enfermedad y el período de duración/incubación para la expresión de los síntomas de la enfermedad. Por lo tanto, el ensayo revela la susceptibilidad de la cepa huésped a la enfermedad y, por lo tanto, permite una determinación de los tipos de células críticos necesarios para la transmisión de la enfermedad.

TABLA 5 Determinación de la infectividad de scrapie

5

2. Evaluación de las células diana potenciales para la transmisión de scrapie por metodología genética

Se estudió el efecto de los defectos inmunes en la patogénesis de scrapie en ratones deficientes en células T, células B o con defectos en células T/B combinados. Se ha generado una serie de diversos genotipos de ratón que son adecuados, siendo la selección del tipo utilizado evidente para las personas especializadas en la técnica. Se determina el éxito de la infección por examen de los síntomas de la enfermedad, la patología y el bioensayo de infectividad. En la tabla 1 se ilustra un resultado típico de dicho análisis. Este análisis da el tiempo de incubación desde la infección hasta la presentación de los síntomas, la presencia o ausencia de síntomas y los rasgos patológicos. Asimismo, el bioensayo de infectividad proporciona información en relación con la latencia de los agentes infectivos en el cerebro y tejidos esplénicos del huésped infectado primario. Siguiendo una correlación la expresión de la enfermedad y el genotipo de animales infectados, la tabla 1 ilustra que si se introduce el agente infectivo por la ruta i.c. todos los genotipos expresan la enfermedad independientemente de sus defectos de células B y células T. Alternativamente, al examinar la capacidad infectiva (secundaria) del cerebro y tejidos esplénicos a partir de huéspedes infectados primarios, se puede examinar el linaje celular diana potencial de la transmisión de scrapie. Así pues, la tabla 2 ilustra además que, tras la inoculación i.c., solamente los genotipos con funciones de célula B intacta son capaces de demostrar una infectividad secundaria en los tejidos del bazo.

Al tomar una ruta más periférica de infección primaria, es decir inoculación i.p., la propagación de la enfermedad se puede delinear más. Esto queda además ilustrado en la tabla 1. El análisis demuestra que al seleccionar animales con defectos en linfocitos específicos, se pueden identificar específicamente los tipos de célula linfoide críticos para la transmisión de la enfermedad de scrapie. Estos resultados sugieren que las células B pueden "transportar" priones de órganos linfoides a los tejidos nerviosos. (El modo de transporte no está limitado a transporte asociado a célula directo, sino que también puede consistir en complejos con diversos productos celulares. Los componentes no están limitados pero pueden incluir anticuerpos, PrP^{C}, PrP^{SC} y otros productos celulares similares).

3. Evaluación del papel de células linfoides en la transmisición de enfermedad de prión

Se pueden obtener componentes celulares de los tejidos linfoides periféricos, v.g., bazo, nódulos linfáticos, de animales. Dichos estados se describen en la bibliografía publicada.

Los componentes celulares obtenidos se pueden separar además mediante anticuerpos específicos en marcadores superficiales diferenciales para los diversos tipos de células linfoides que han sido conjugados con microperlas magnéticas. Por supresión adicional de tipos de células no deseables por depleción citotóxica utilizando complemento, se pueden obtener aislados celulares altamente purificados. Se construye el procedimiento para aislar polbaciones de células T y células B altamente enriquecidas. Se suspenden las poblaciones de células aisladas en medio de cultivo. v.g., RPMI-1640 y se pueden suplementar con suero y con aditivos como ácido glutámico, factores del crecimiento, citoquinas y otros moduladores de fisiología celular antes de la evaluación de la capacidad de infectividad. Se pueden caracterizar además dichos linfocitos altamente enriquecidos por evaluación de citometría de flujo de los componentes de superficies de membrana, v.g., CD-4, CD-8 y/o expresión Ig, que son evidentes para las personas especializadas en la técnica. En la figura 3a y 3b se ilustra un análisis de flujo típico de dicha población enriquecida. La pureza celular se demuestra por la expresión de marcadores superficiales específicos de célula T o célula B. Se pueden documentar también otros componentes asociados a linaje no celular a través de medios similares, v.g., expresión de superficie celular de PrP^{C} y PrP^{SC}. Asimismo, las técnicas biológicas moleculares que se han descrito en la bibliografía publicada también pueden emplearse para documentar los componentes intracelulares específicos asociados a no membrana, v.g., ADN, ARN, ARNm cuya presencia es indicativa de la presencia celular.

Dichos componentes linfoides celulares pueden obtenerse de huéspedes infectivos y no infectivos y se caracterizan por su linaje y sus capacidades intracelulares. A continuación, se puede examinar su capacidad infectiva por inoculación a través de la ruta i.c. o i.p. En este ensayo, es posible determinar el linaje celular que es sobre todo responsable de la transmisión de enfermedad de prión. Por otra parte, midiendo los diversos componentes intracelulares y en correlación con el linaje celular, el ensayo es indicativo de las interacciones entre los priones y las células diana tentativas.

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TABLA 6 Infectividad en fracciones celulares de Tg94 y bazo en peso

6

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Análisis FACS presentado en la figura 2D

Se incubaron células de sangre periférica con suero de ratones t11\muMT, se lavó, se incubó con conjugado IgM-FITC anti-ratón seguido de anti-CD3-PE (Pharmingen) y se analizó con un instrumento Becton-Dickinson FASCan tras la lisis de eritrocitos y la fijación. Para el análisis, se sincronizaron las células con células T CD3 positivas. Se mancharon células EL4 infectados con virus de estomatitis vesicular (VSV) con 5 \mug de anticuerpo monoclonal específico de VSV V124 (ref. 27) y con anticuerpo etiquetado con FTC para Ig2a de ratón (Southern Biotechnology) o con suero de ratón t11 \muMT, y con anticuerpo F(ab')2 etiquetado con FITC para IgM de ratón (anti-IgM-FITC, Tago) o con suero de ratones C57BL/6 y anti-IgM-FITC. Se realizó la adquisición y análisis de todos los datos con un programa CellQuest (Becton Dickinson).

Ejemplo 4 Producción de anticuerpos contra linfocitos infectivos A. Producción de antisueros policlonales

Se prepara antisuero contra linfocitos infectivos (células B o células T) inyectando a animales apropiados linfocitos infectivos identificados y aislados tal como se ha descrito en el ejemplo 2.

1. Materiales de partida

Específicamente, se utilizan preparaciones de células B y/o preparaciones de células T purificadas. Se pueden utilizar preparaciones de célula completa de linfocitos infectivos directamente como inmunógeno o alternativamente, se pueden lisar suavemente linfocitos infectivos con un tratamiento con detergente suave por ejemplo con 0,05-0,5% Triton x 100 seguido de fijación en paraformaldehído 0,5 x 2% en PBS 1% durante 5-100 minutos a 4-10ºC.

2. Inmunización animal. Se utilizan conejos neozelandeses blancos hembra con un peso de 2 kg o más para producir antisuero policlonal. Generalmente, se inmuniza a un animal por preparación de linfocitos infectiva. Una semana antes de la primera inmunización, se obtienen de 5 a 10 ml de sangre del animal para que sirva como muestra de suero preinmune (prebleed) no inmune.

Se utilizan los linfocitos infectivos para preparar el inmunógeno primario por emulsión de 0,5 ml de la preparación de linfocito infectiva a una concentración comprendida entre 1 x 10^{5} y 1 x 10^{2} células/ml en PBS (pH 7,2) con 0,5 ml de adyuvante de Freund completo (CFA) (Difco, Detroit, MI). Se inyecta el inmunógeno en varios sitios del animal por rutas de administración subcutánea, intraperitoneal y/o intramuscular. Cuatro semanas después de la inmunización primaria, se administra una inmunización de recuerdo. Se prepara el inmunógeno para la dosis de inmunización de recuerdo emulsionando 0,5 ml de la misma preparación de linfocito infectiva utilizada para el inmunógeno primario, a excepción de que ahora no se utiliza 0,5 ml de adyuvante de Freund incompleto (IFA) (Difco, Detroit, MI). También en este caso, la dosis de recuerdo se administra en varios sitios, pudiéndose utilizar tipos de inyecciones subcutánea, intraperitoneal e intramuscular. Se sangra al animal (5 ml) dos semanas después de la inmunización de recuerdo y se analiza el suero para determinar la inmunorreactividad a la preparación de linfocitos infectiva, tal como se describe a continuación. Se repite el esquema de recuerdo y sangrado a intervalos de 4 semanas hasta obtener una concentración adecuada. La valoración o concentración del antisuero se determina por microvaloración EIA tal como se describe en el ejemplo 17, a continuación. Se considera una valoración de anticuerpo de 1:500 o más una valoración adecuada para su uso y estudio posteriores.

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B. Producción de anticuerpos monoclonales

1. Protocolo de inmunización. Se inmunizan ratones utilizando inmunógenos preparados tal como se ha descrito anteriormente, salvo que la cantidad del inmunógeno para la producción de anticuerpos monoclonales en ratones es la décima parte de la cantidad utilizada para producir antisueros policlonales en conejos. El inmunógeno primario consiste en 0,1 ml de preparación de linfocitos infectiva a una concentración comprendida entre 1 x 10^{5} a 1 x 10^{8} células /ml en PBS (pH 7,2) en 0,1 ml de emulsión CFA; en cambio, el inmunógeno utilizado para las inmunizaciones de recuerdo consiste en 0,1 ml de preparación de linfocitos infectivas como antes, emulsionado con 0,1 ml de IFA. Se preparan hibridomas para la generación de anticuerpos monoclonales y se realiza la detección selectiva a través de técnicas convencionales. Estos métodos utilizados para el desarrollo de anticuerpos monoclonales siguen los procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo los detallados en Kohler y Milstein, Nature 256:494 (1975) y revisados en J.G. R. Hurrel ed. Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press. Inc., Boca Raton, FL (1982). Otro método de desarrollo de anticuerpos monoclonales que se basa en el método de Kohler and Milstein, es el de L.T. Mimms y cols., Virology, 176:004-619 (1990), que se incorpora en el presente documento como
referencia.

El régimen de inmunización (por ratón) consiste en una inmunización primaria con inmunizaciones de recuerdo adicionales. Las inmunizaciones de refuerzo se llevan a cabo aproximadamente a las dos semanas o cuatro semanas de la inmunización primaria. Se inocula un total de 100 \mul de inmunógeno intraperitionealmente y subcutáneamente en cada ratón. Se realiza la detección selectiva en cada ratón por separado para la respuesta inmune por inmunoensayo de enzima de placa de microvaloración (EIA), tal como se describe en el ejemplo 17, aproximadamente cuatro semanas después de la tercera inmunización. Se inocula a los ratones por vía intravenosa, intraesplénica o intraperitoneal con 0,1 ml de la preparación de linfocitos infectivos a una concentración comprendida entre 1 x 10^{5} y 1 x 10^{8} células/ml en PBS (pE 7,2) en 0,1 ml de IFA aproximadamente 15 semanas después de la tercera inmunización.

Tres días después de este recuerdo intravenoso, se funden los esplenocitos por ejemplo con Sp2/0-Ag14 células de mieloma (Milstein Laboratories, Inglaterra) utilizando el método de polietilen glicol (PEG). Se cultivan estas fusiones en medio de Dulbecco modificado con Iscove (IMDM) con un contenido de 10% de suero de becerro fetal (FCS), más 1% de hipoxantina, aminopterina y thymidina (HAT). Se realiza la detección selectiva de los cultivos en masa por placa de microvaloración EIA siguiendo el protocolo del ejemplo 17. Se seleccionan clones reactivos con la preparación de linfocitos infecciosa utilizada como inmunógeno y no-reactiva con la preparación de linfocitos no infecciosa (es decir, linfocitos preparados a partir de animales no infectados no utilizados como inmunógeno) para expansión final. Se expanden los clones así seleccionados, se reparten en partes alículotas y se congelan en IMDM que contiene 10% de FCS y 10% de sulfóxido de dimetilo.

2. Producción de anticuerpos monoclonales que contienen líquido ascítico. Se descongelan las células de hibridoma congeladas preparadas tal como se ha descrito y se colocan en cultivo de expansión. Se inoculan células de hibridoma viables intraperitonealmente en ratones tratados con Pristane. Se separa el líquido ascítico de los ratones, se distribuye, se filtra a través de un filtro de 0,2 \mu y se somete a un análisis de inmunoglobulina case G (IgG) para determinar el volumen de columna de proteína A requerido para la purificación.

3. Purificación de Anticuerpos monoclonales desde líquido ascítico. Brevemente, se mezcla líquido ascítico filtrado y descongelado con un volumen igual de tampón de unión de Sefarosa de Proteína A (1,5 mM de glicina, 3,0 M de NaCl, pH 8,9) y se vuelve a filtrar a través de un filtro de 0,2 \mu. Se determina el volumen de columna de proteína A según la cantidad de IgG presente en el líquido ascítico. A continuación, se dializa el eluato contra PBS (pH 7,2) durante toda la noche a 2-8ºC. Se filtra para esterilizarlo el anticuerpo monoclonal dializado y se dispensa en partes alícuotas. Se confirma la inmunorreactividad del anticuerpo monoclonal purificado determinando su capacidad para unirse específicamente a la preparación de linfocitos infecciosa utilizada como inmunógeno mediante el uso de procedimiento de ensayo de placa de microvaloración EIA del ejemplo 17. Se confirma la especificidad del anticuerpo monoclonal purificado determinando su falta de unión con linfocitos no infecciosos irrelevantes no utilizados como el imunógeno. Se coloca el monoclonal de linfocitos anti-infeccioso purificado así preparado y caracterizado a 2-8ºC durante un breve período de almacenamiento o a -80ºC durante un largo período de almacenamiento.

4. Caracterización posterior de anticuerpo monoclonal. Se puede determinar el isotipo y subtipo del anticuerpo monoclonal producido tal como se ha descrito utilizando equipos disponibles en el comercio (disponible de Amersham Inc., Arlington Heighst, IL). Se puede llevar a cabo también el ensayo de estabilidad en el anticuerpo monoclonal colocando una parte alícuota del anticuerpo monoclonal en almacenamiento continuo a 2-8ºC y analizando las lecturas de la densidad óptica (OD) a lo largo de un período de tiempo determinado.

C. Uso de proteínas recombinantes como inmunógenos. Entra dentro del marco de la presente invención que las proteínas recombinantes obtenidas como se ha descrito se puedan utilizar como inmunógenos en la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales, con los cambios correspondientes en los reactivos y las técnicas conocidas entre las personas especializadas en la técnica.

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Ejemplo 5 Purificación de anticuerpos de suero que se unen específicamente a linfocitos infecciosos

Se purifican por afinidad los sueros inmunes obtenidos como se ha descrito en el ejemplo 14, utilizando proteínas inmovilizadas de la preparación de linfocitos infecciosos utilizada como el inmunógeno, tal como se ha descrito anteriormente. Se obtiene una fracción IgG del antisuero pasando el antisuero bruto diluido sobre una columna de proteína A (proteína A Affi-Gel, Bio-Rad, Hercules, CA). La elución con un tampón (tampón de unión, suministrado por el fabricante) elimina sustancialmente todas las proteínas que no son inmunoglobulinas. La elución con glicina tamponada 0,1M (pH 3) da una preparación de inmunoglobulina que está sustancialmente libre de albúmina y otras proteínas de suero.

Se lleva a cabo la cromatografía de inmunoafinidad para obtener una preparación con una fracción superior de anticuerpo de unión a antígeno específico. Se inmoviliza la preparación de linfocitos infecciosa utilizada para producir el antisuero sobre una resina de cromatografía y se adsorben en la resina los anticuerpos específicos dirigidos contra sus epitopos. Después del lavado con componentes que no se unen, se eluyen los anticuerpos específicos con tampón de glicina 0,1 M, pH 2,3. Se neutralizan inmediatamente las fracciones de anticuerpo con tampón Tris 1,0 M (pH 8,0) para preservar la inmunorreactividad. Se utiliza una resina como Affi-Gel 10 o Affi-Gel 15 (Bio-Rad, Hercules, CA). Si se desea el acoplamiento a través de carboxi, se puede utilizar Affi-Gel 102 (Bio-Rad, Hercules, CA). Se puede utilizar una resina órganomercurial como Affi-Gel 501 (Bio-Rad, Hercules, CA).

Alternativamente, se pueden recoger los bazos y utilizarlos en la producción de hibridomas para producir anticuerpos monoclonales seguido de métodos de rutina conocidos en la especialidad, tal como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 6 Mancha de Western de muestras de tejido

Se prepararon extractos de proteína por homogenización de muestras de tejido en 0,1M de Tris-HCl (pH 7,5), 15% (p/v) de glicerol, EDTA 0,2 mM, 1,4-ditiotreitol 1,0 mM, 10 \mug/ml de leupeptina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1,0 M (Kain y cols., Biotechniques, 17:982 (1992)). Después de la homogenización, se centrifugaron los homogenatos a 4ºC durante 5 minutos para separar el sobrenadante del desperdicio. Para la determinación cuantitativa de la proteína, se añadieron 3-10 \mul de sobrenadante a 1,5 ml de reactivo de ácido bicinconínico (Sigma, St, Louis, MO) y se midió la absorbancia resultante a 562 nm.

Para SDS-PAGE se ajustan muestras a la concentración de proteínas deseada con tampón tricina (Novex, San Diego, CA), se mezclan con un volumen igual de tampón de muestra de Tricina 2X (Novex, San Diego, CA) y se calienta durante 5 minutos a 100ºC en un ciclador térmico. A continuación, se aplican las muestras a un gel de tricina Nove 10-20% Precast para electroforesis. Tras la electroforesis, se transfieren las muestras desde los geles a membranas de nitrocelulosa en tampón de transferencia Novex Tris-glicina. A continuación, se sondean las membranas con anticuerpos de linfocito anti-infectivos específicos utilizando los reactivos y los procedimientos proporcionados en los equipos de detección de quimioluminiscencia Western Lights o Western Lights Plus (Tropix, Bedford, MA). Se visualizan las bandas quimioluminicentes por exposición de las membranas reveladas a Hyperfilm ECL (Amersham, Arlington-Heights, IL).

Se llevan a cabo los experimentos de competencia de manera análoga a la anterior, con la siguiente excepción: los anticuerpos primarios (antisueros policlonales de linfocito anti-infectivos) se preincuban durante 30 minutos a temperatura ambiente con diversas concentraciones de inmunógeno de linfocito no infectivo antes de la exposición a filtro de nitrocelulosa. El revelado de la mancha de Western se lleva a cabo como antes.

Tras la visualización de las bandas sobre la película, también se pueden visualizar las bandas directamente sobre membranas mediante la adición y desarrollo de un sustrato cromogénico como 5-bromo-4-cloro-3-indol fosfato (BCIP). Esta solución cromogénica contiene 0,016% BCIP en una solución que contiene 100 mM NaCl, 5 mM de MgCl_{2} y 100 mM de Tri-HCl (pH 9,5). Se incuba el filtro en la solución a temperatura ambiente hasta que se revelan las bandas a la intensidad deseada. Se lleva a cabo la determinación de la masa molecular en función de la movilidad de los patrones de peso molecular manchados previamente (Novex, San Diego, CA) o los patrones de peso molecular biotinilados (Tropix, Bedfor, MA).

Ejemplo 7 Ensayo de placa de microvaloración EIA

Se determina la inmuno-reactividad de antisuero obtenido preferiblemente de conejos o ratones, tal como se ha descrito en el ejemplo 14 por medio de una placa de microvaloración EIA, del siguiente modo. Se prepara proteína de preparaciones de linfocitos infecciosos y no infecciosos, tal como se ha descrito anteriormente ( ejemplo 2) por homogenización de linfocitos en un tampón apropiado como por ejemplo PBS (7,2) o con un detergente suave como 0,01% de Triton x 100. A continuación, se colocan 100 \mul de la solución de proteínas anterior en cada uno de los pocillos de una placa de microvaloración Immulon 2® (Dynex Technologies, Chantilly, VA). Se incuba la placa durante toda la noche a temperatura ambiente y después se lava cuatro veces con agua desionizada. Se bloquean los pocillos por adición de 125 \mul de un agente de bloqueo de proteínas adecuado como Superblock® (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) a cada pocillo y después descartando inmediatamente la solución. Se lleva a cabo este procedimiento de bloqueo tres veces. Se diluye antisuero obtenido de conejos o ratones inmunizados preparado como se ha descrito anteriormente, en agente de bloqueo de proteína (v.g., una solución Superblock® al 3%) en PBS que contiene 0,05% de Tween-20® (éter de monolaurato polioxietileno) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y 0,05% de azida sódica a diluciones de 1:500, 1:2500, 1:12.500, 1:62.500 y 1:312.500 y se coloca en cada pocillo de la placa de microvaloración revestida. A continuación, se incuban los pocillos durante tres horas a temperatura ambiente. Se lava cada uno de los pocillos cuatro veces con agua desionizada. Se añaden 100 \mul de antisuero IgG anti-ratón de cabra o IgG anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Southern Biotech, Birmingham, AB), diluido 1:2000 en solución Superblock® al 3% en solución salina tamponada con fosfato con un contenido de Tween 20® al 0,05% y azida sódica al 0,05%. Se incuban los pocillos durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, se lava cada uno de los pocillos cuatro veces con agua desionizada. A continuación, se añaden cien microlitros (100 \mul) de sustrato de fosfato de paranitrofenilo (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburb, MD) a cada pocillo. Se incuban los pocillos durante treinta minutos a temperatura ambiente. Se hace la lectura de la absorbancia a 405 nm de cada pocillo. Se identifican las reacciones positivas según el aumento de la absorbancia a 405 nm en el pocillo de ensayo por encima de la abosrbancia dada por un suero no inmune (control negativo). Una reacción positiva es indicativa de la presencia de anticuerpos de linfocitos anti-infectivos detectables.

Además de las valoraciones, también se pueden determinar las afinidades aparentes [K_{d}(app)] para algunos de los antisueros. Los resultados del ensayo de placa de microvaloración EIA se pueden utilizar para derivar las constantes de disociación aparente (K_{d}) en función de un análogo de la ecuación de Michaelis-Menten (V. Van Heyningen, Methods in Enzymology, vol., 121, p. 472 (1986) y que se describen también X. Qiu, y cols., Journal of Immunology, vol., 156, p. 3350, (1996)):

[Ag-Ab] = [Ag-Ab]_{max} x \frac{[Ab]}{[Ab] = K_{d}}

en la que [Ag-Ab] es la concentración de complejo antígeno-anticuerpo, [Ag-Ab]_{max} es la concentración de complejo máxima, [Ab] es la concentración de anticuerpo y K_{d} es la constante de disociación. Durante el ajuste de curva, se sustituye [Ag-Ab] con el valor sustraído anterior de OD_{405nm} a una concentración de Ab dada. Tanto K_{d} como
[OD_{405nm}]_{max}, que corresponde al [Ag-Ab]_{max}, se tratan como parámetros ajustados. Puede utilizarse el programa informático Origin para el ajuste de curva.

Ejemplo 8 Recubrimiento de partículas en fase sólida

A. Recubrimiento de micropartículas con anticuerpos que se unen específicamente a linfocitos infectivos. Se recubren anticuerpos purificados por afinidad que se unen específicamente con linfocitos infectivos (ver ejemplo 15) sobre micropartículas de poliestireno, poliestireno carboxilado, polimetacrilato o partículas similares, con un radio en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 20 \mum. Las micropartículas pueden recubrirse pasiva o activamente. Un método de recubrimiento comprende el recubrimiento EDAC (hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) de microparticulas de látex carboxiladas activas con anticuerpos que se unen específiamente a linfocitos infectivos, del siguiente modo. Brevemente, se mezclan una suspensión de sólidos al 0,375% final de microparticulas de látex carboxiladas lavadas con resina (disponible de Bangs Laboratories, Carmel, IN o Serodyn, Indianapolis, IN) en una solución con un contenido de 50 mM de tampón MES, pH 4,0 y 150 e anticuerpo de linfocitos anti-infectivos purificado por afinidad (ver ejemplo 14) durante 15 minutos en un contenedor apropiado. Se añade agente de acoplamiento EDAE hasta una concentración final de 5,5 \mug/ml a la mezcla y se mezcla durante 2,5 horas a temperatura ambiente.

A continuación, se lavan las microparticulas con 8 volúmenes de tampón de lavado de Tween 20® /fosfato sódico (pH 7,2) por filtración de flujo tangencial utilizando 0,2 \mum de módulo de filtración Microgon. Se almacenan las micropartículas lavadas en un tampón apropiado que contiene normalmente un agente tensioactivo diluido de proteína irrelevante como agente de bloqueo hasta que se necesite.

B. Recubrimiento de perlas de ¼ pulgadas (0,63 cm) Se pueden recubrir también anticuerpos que se unen específicamente a antígeno de linfocito infectivo sobre la superficie de perlas de poliestireno de ¼ pulgadas (0,63 cm) a través de los métodos de rutina conocidos en la especialidad (Snitman y cols., patente EE.UU. 5.273.882), que se incorpora al presente documento como referencia) y se utilizan en ensayos de unión competitiva o sandwich EIA).

Se lavan las perlas de poliestireno primero sometiéndolas a ultrasonido durante aproximadamente 15 segundos en 10 mM de tampón NaHCO_{3} a pH 8,0. A continuación, se lavan las perlas en agua desionizada hasta eliminar todos los finos. A continuación, se sumergen las perlas en una solución de anticuerpo en tampón carbonato 10 mm, pH 8 a 9,5. Se puede diluir la solución de anticuerpo hasta 1 \mug/ml en el caso de anticuerpos monoclonales de alta afinidad o concentrarse hasta aproximadamente 500 \mug/ml para anticuerpos policlonales que no han sido purificados para afinidad. Se recubren las perlas durante al menos 12 horas a temperatura ambiente y después se lavan con agua desionizada. Se pueden secar al aire las perlas y almacenarse en húmedo (en PBS, pH 7,4). Se pueden recubrir también con estabilizantes de proteína (como sacarosa) o agentes de bloqueo de proteína utilizados como agentes e bloqueo de unión no específica (como por ejemplo proteínas irrelevantes, leche desnatada clavel (Carnation), Suyperblock®, o similares).

Ejemplo 9 Ejemplo ilustrativo Inmunnoensayo de enzima de micropartícula (MEIA)

Se detectan antígenos de linfocito infectivos en muestras de ensayo de paciente llevando a cabo una competición de antígeno normal EIA o EIA sandwich de anticuerpo y utilizando una fase sólida como por ejemplo micropartículas (MEIA). Se puede llevar a cabo el ensayo en un analizador automático como Analycer IMx® (Abbot Labboratories, Abbott Park, IL).

A. BIA Sándwich de anticuerpo. Brevemente, se incuban muestras que contienen presuntamente antígeno de linfocito infectivo en presencia de micropartículas revestidas con anticuerpo de linfocito anti-infectivo (preparado tal como se ha descrito en el ejemplo 17) con el fin de formar complejos antígeno/anticuerpo. A continuación, se lavan las micropartículas y se añade un reactivo indicador que comprende un anticuerpo conjugado con un compuesto de generación de señal (es decir, enzimas como fosfatasa algalina o peróxidasa de rábano picante) a los complejos anticuerpo/antígeno o micropartículas y se incuba. Se lavan las micropartículas y se detectan los complejos de anticuerpo/antígeno/anticuerpo unidos añadiendo un sustrato (v.g., fosfato de 4-metil umbeliferilo (MUP) o OPD/peróxido, respectivamente), que reacciona con el compuesto de generación de señal para generar una señal calibrable. Una señal elevada de la muestra de ensayo, en comparación con la señal generada por un control negativo, detecta la presencia de antígeno de linfocito infectivo. La presencia del antígeno de linfocito infectivo en la muestra de ensayo es indicativa de un diagnóstico de encefalopatía espongiforme de transmisión (TSE).

B. Ensayo de unión competitiva. El ensayo de unión competitiva emplea una proteína o proteínas de una preparación de linfocitos infectiva que genera una señal calibrable cuando la proteína etiquetada se pone en contacto con una micropartícula recubierta con anticuerpo de linfocito anti-infectivo. Este ensayo se puede llevar ac abo en un Analizaodr IMx® (disponible por Abbot Laboratories, Abbott Park, IL). Se añaden las proteínas etiquetadas de una preparación de linfocitos infectiva a las micropartículas revestidas con anticuerpo de linfocitos infectivas (preparadas tal como se ha descrito en el ejemplo 17) en presencia de una muestra de ensayo que contiene presuntamente antígeno de linfocito infectivo y se incuba durante un período y en unas condiciones suficientes para formar complejos proteína de linfocito infectiva etiquetada/anticuerpo unido y/o complejos de antígeno de linfocito infectivo de paciente/anticuerpo unido. El antígeno de linfocito infectivo de la muestra de ensayo compite con las proteínas de linfocito infectivas etiquetadas por los sitios de unión en la micropartícula. El antígeno de linfocito infectivo en la muestra de ensayo tiene como resultado una unión más baja de la proteína de linfocito infectiva etiquetada y las micropartículas revestidas con anticuerpo en el ensayo ya que el antígeno de la muestra de ensayo y la proteína de linfocito infectiva compiten por los sitios de unión de anticuerpo. Una señal más baja (en comparación con el control) indica la presencia de antígeno de linfocito infectivo en la muestra de ensayo. La presencia de antígeno de linfocito infectivo sugiere el diagnóstico de TSE.

Las proteínas de linfocito infectivas que se han explicado son útiles como marcadores de TSE. Los ensayos basados en el aspecto de este marcador o marcadores en una muestra de ensayo como sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, y tejidos puede proporcionar una información de diagnóstico no invasiva y de bajo coste para ayudar al médico a realizar un diagnóstico de TSE, para ayudar a seleccionar un protocolo de terapia o para llevar un seguimiento del éxito de una terapia seleccionada. Este marcador o marcadores puede aparecer en fluidos corporales fácilmente accesibles como sangre, orina, CSF, o heces como antígenos derivados de tejido enfermo detectables por métodos inmunológicos. Este marcador puede ser elevado en un estado de enfermedad, alterado en un estado de enfermedad o puede ser una proteína normal que aparece en un compartimiento del cuerpo inapropiado, en un estado o forma alterados indicativos de la enfermedad.

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Referencias citadas en la presente solicitud

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Claims (29)

1. Uso de depletores de células B selectivos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de encefalopatía espongiforme transmisible en seres humanos y animales infectados.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos depletores de células B comprenden biomoléculas inmunológicamente activas.

3. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque dichas biomoléculas inmunológicamente activas comprenden anticuerpos.

4. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos anti-\muM.

5. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos LR1.

6. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos B220.

7. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos depletores de células B comprenden compuestos químicos inmunosupresivamente activos.

8. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque dichos compuestos químicos inmunosupresivamente activos comprenden ciamexona.

9. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque dichos compuestos químicos inmunosupresivamente activos comprenden imexon.

10. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE humano, caracterizado porque dicho producto derivado de tejido o fluido corporal ha sido depletado solamente de células B in vitro por tratamiento con un medicamento que comprende un depletor de células B selectivo.

11. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho depletor de células B comprende biomoléculas inmunológicamente activas.

12. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE según la reivindicación 11, caracterizado porque dichas biomoléculas inmunológicamente activas comprenden anticuerpos.

13. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE según la reivindicación 12, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos anti-\muM.

14. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE según la reivindicación 12, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos LR1.

15. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE según la reivindicación 12, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos B220.

16. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho depletor de células B comprende compuestos químicos inmunosulpresivamente activos.

17. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE según la reivindicación 16, caracterizado porque dichos compuestos químicos inmunosupresivamente activos comprenden ciamexona.

18. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE, según la reivindicación 16, caracterizado porque dichos compuestos químicos inmunosupresivamente activos comprenden imexon.

19. Método para preparar producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE humano, caracterizado porque dicho método comprende una etapa de depleción solamente de células B desde dicho producto derivado de tejido o fluido corporal in vitro, en el que se depletan las células B por medio de un medicamento que comprende un depletor de células B selectivo.

20. Método según la reivindicación 19, caracterizado porque dicho depletor de células B comprende biomoléculas inmunológicamente activas.

21. Método según la reivindicación 20, caracterizado porque dichas biomoléculas inmunológicamente activas comprenden anticuerpos.

22. Método según la reivindicación 21, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos
anti-\muM.

23. Método según la reivindicación 21, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos LR1.

24. Método según la reivindicación 21, caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden anticuerpos B220.

25. Método según la reivindicación 19, caracterizado porque dicho depletor de células B comprenden compuestos químicos inmunosupresivamente activos.

26. Método según la reivindicación 25, caracterizado porque dichos compuestos químicos inmunosupresivamente activos comprenden ciamexona.

27. Método según la reivindicación 25, caracterizado porque dichos compuestos químicos inmunosupresivamente activos comprenden imexon.

28. Método para aislar productos derivados de tejido o fluido corporal sin TSE humanos, caracterizado porque dichos productos derivados de tejido o fluido corporal se aíslan de seres humanos no vivos que son deficientes en células B solamente.

29. Producto derivado de tejido o fluido corporal sin TSE humano, caracterizado porque dicho producto derivado de tejido o fluido corporal se aísla de seres humanos que son deficientes en células B solamente.