JP2012136536A - アテローム血栓症およびプラーク破壊を予防するためのアネキシンv - Google Patents
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Abstract
【課題】アテローム性動脈硬化プラークの破壊に繋がる因子の治療法の提供。
【解決手段】ヒトにおけるプラーク破壊を予防するための医薬組成物の製造における、アネキシンVに結合する抗体を阻害する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクションまたは、アネキシンVの内皮に対する結合を促進する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクションの使用。頚動脈プラークに対するアネキシンVの結合を増加させるために、アネキシンV、N−末端フラグメントまたは免疫グロブリンを使用することによる、アテローム血栓症を予防する方法。
【選択図】なし
【解決手段】ヒトにおけるプラーク破壊を予防するための医薬組成物の製造における、アネキシンVに結合する抗体を阻害する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクションまたは、アネキシンVの内皮に対する結合を促進する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクションの使用。頚動脈プラークに対するアネキシンVの結合を増加させるために、アネキシンV、N−末端フラグメントまたは免疫グロブリンを使用することによる、アテローム血栓症を予防する方法。
【選択図】なし
Description
本発明はアテローム性動脈硬化症およびアテローム血栓症の分野に関係する。本発明は取分けアテローム血栓症およびプラーク破壊を予防または阻害するための新規メカニズムに関する。
アテローム性動脈硬化症とアテローム血栓症との間には相互関係がある。アテローム性動脈硬化症は炎症性疾患の多くの特徴を有する;例えば、病巣における、多量の炎症性細胞および前炎症性サイトカインの産生などである1,2。
心臓血管系疾患による死に至る危険の増大、取分け全身性紅斑性狼瘡(SLE)の患者における死亡リスクは重要な臨床上の課題である。SLE患者の心臓血管系疾患は異常脂肪血症などの伝統的なリスクファクター、および低密度リポタンパク質の酸化(oxLDL)、腫瘍壊死因子(TNF)システムにおける上昇した活性(異常脂肪血症と密接に関連)、CRPにより判定される全身性炎症、ホモシステインおよび抗リン脂質抗体(aPL)などの非伝統的リスクファクターの両方と関連する3−7。抗リン脂質は、SLE患者に共通して、再発性妊娠喪失および再発性血栓症を特徴とする抗リン脂質抗体症候群(ASP)の原因となり得る8,9。抗リン脂質の異なる形状は、一般住民における心臓血管系疾患にも関係がある10,11。
アネキシンはカルシウムと負に荷電したリン脂質に結合する性質を有し、その両方の性質が血液凝固に必要である。最近、アネキシンVが抗リン脂質抗体症候群に関係するとされた;その理由は、ある種の抗リン脂質抗体が胎盤のアネキシンV抗血栓遮蔽を崩壊させ、胎盤ミクロ血栓症と再発性流産にかかりやすくするからである12−14。
アネキシンVが活性化した血小板と傷害を受けた細胞に結合することが、多分、血栓中での選択的タンパク質保持を説明している。このことは静脈性および動脈性血栓症の実験動物モデルにおいて示されており15、標識アネキシンは、ノイズの少ない安全性の高いヒトの血管血栓を医療用に画像化するためのものとして提案されている16。
血液凝固系障害におけるアネキシンVの治療使用と関連する重要な問題は、動物実験で5〜15分と見積もられている、循環系でのその短い半減期である15,17;アネキシンVはヒトの循環系において半減期が短い。
「修飾アネキシンタンパク質および血栓症の予防方法」とするEP1379266には、出血を増大させることなく血栓症を予防するために使用するポリエチレングリコール−修飾アネキシンタンパク質が請求されている。アネキシンVの半減期は、血栓形成に必要なプロトロンビナーゼ複合体の結合を防止する方法において、PEG複合体を使用することにより改善されている。
本発明において、我々は、アネキシンVがアテローム性動脈硬化症のプラークを安定化し得ることを示した。アネキシンVまたはアネキシンVのN−末端フラグメントを本発明に従って(好ましくは、注射により)投与すると、それは最初の経路上の内皮プラークに結合する。循環系におけるアネキシンVの短い半減期は、従って、EP1379266の場合と同様に、問題ではない。アネキシンVまたはアネキシンVのN−末端フラグメントを添加剤と共に、または添加剤なしに含有してなる注射用組成物は、従って、瞬間的な結合を経て頚動脈プラークを安定化することにより、アテローム血栓症を予防する。
免疫グロブリンGまたはIgGは、成人において900mg/dlないし2400mg/dlの範囲の正常濃度で形成されるタンパク質である。これは血清または血漿に見出される総タンパク質の約20%である。IgGの半減期は23日である。このものはバクテリア、ウイルス、寄生虫、ある種のカビに対する免疫として寄与し、組織において抗体活性を提供する。IgGは炎症反応の引き金を引く補体を活性化することができ、それ自体が対象である。IgGは動物の種々のウイルスなどに対し、接種またはナチュラル・バーンヤードとの接触を介して予防を提供する。接触が起こると、メモリーが展開し、身体は特異的な感染と闘うために必要な抗体を産生することが可能となる。ヒトの場合、IgGは胎盤を通して新生児に移行する。もしIgGが存在しないかまたは低レベルであるなら、哺乳動物は動物が接触することとなる感染因子に対して予防力の乏しいものとなる。
静脈内用免疫グロブリン製剤(例えば、IGIV(バクスター(Baxter)その他)は、市販品として入手可能なIgGの高度精製製剤であり、抗体生産がまったくないか、または非常に低いレベルである患者の処置に使用する。免疫グロブリン製剤は以下のメーカーから入手可能である:バクスター(米国)例、ガンマガード(Gammagard;登録商標)、イシベン(Isiven)(アンチモ・ナポリ、イタリア)、オムリックス(Omrix)(テル−ハショマー(Tel-Hashomer)、イスラエル)、マイルス(生物製品部門、ウエスト・ヘブン、コネチカット)、スクラボ(Sclavo)(ルッカ(Lucca)、イタリア)、サンド(ノバルティス、バーゼル、スイス、例、サンドグロブリン(Sandoglobulin;登録商標)、バイオテスト・ディアグノスティック・コーポレイション(デビル、ニュージャージー)。免疫グロブリン製剤の例は、ガンマガードS/D(登録商標、ガンマーIV(登録商標)、ガンマー−PIV(登録商標)、ガムイミューンN(Gammimune N;登録商標)、イベエガム(Iveegam;登録商標)、パングロブリン(Panglobulin;登録商標)、ポリガムS/D(Polygam S/D;登録商標)、サンドグロブリン(Sandoglobulin;登録商標)、ベノグロブリン(Venoglobulin;登録商標)。免疫グロブリン製剤は一般にある種のIgMならびにIgGを含有する。微量のIgMがガンマガード(Gammagard;登録商標)中に存在する。ペンタグロビン(Pentaglobin)(バイオテスト)はIgMに富む製剤であり、SARSの処置に使用されている。
かかるIvIg製剤は多くのドナーに由来するプール血漿からのもので、しばしば自己免疫症状にも使用されるが、その場合の認められている作用様式は抗イディオタイプ抗体の存在、例えば、病原である他の抗体と反応し、それを中和する抗体の存在である。
US6613328には、ホン・ウイルブランド(von
Willebrand)因子特異的抗体による血栓症疾患の処置法が記載されている。ヒト化抗体は特異的に製造される。しかし、IGIVなどの容易に入手し得る免疫グロブリンまたはこれら免疫グロブリンのサブフラクションがアテローム血栓症またはプラーク破壊の予防に使用し得るという情報はない。さらに、本発明にて提供されるアネキシンVと内皮との結合の低下の動機となりえるIgGが、抗体と本来のアネキシンVとの結合を阻害し得るという文献情報もない。
Willebrand)因子特異的抗体による血栓症疾患の処置法が記載されている。ヒト化抗体は特異的に製造される。しかし、IGIVなどの容易に入手し得る免疫グロブリンまたはこれら免疫グロブリンのサブフラクションがアテローム血栓症またはプラーク破壊の予防に使用し得るという情報はない。さらに、本発明にて提供されるアネキシンVと内皮との結合の低下の動機となりえるIgGが、抗体と本来のアネキシンVとの結合を阻害し得るという文献情報もない。
本発明はアテローム血栓症およびプラーク破壊を予防し、アテローム性動脈硬化合併症を処置する新規な方法であって、アネキシンVがプラークに結合するのを阻害するIgを阻害することにより前記結合を回復する化合物を投与する方法を提供する。この処置は、一定用量のアネキシンVまたはN−末端フラグメントを、好ましくはIV注射により投与するか、またはアネキシンVが抗体に結合するのを阻害することによりアネキシンVがプラークに結合するのを促進するように作用する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのサブフラクションをIV投与することにより実施する。免疫グロブリン(IGIV;バクスター)または他の市販入手可能な製剤(その例示は上記)ならびにアフィニティ精製したサブフラクション(感染症および重篤な自己免疫症状の処置または予防用として技術上既知である)を使用することができる。免疫グロブリンのアフィニティ精製サブフラクションが好ましい。
本発明方法において、活性成分(アネキシンV、アネキシンVのN−末端フラグメントまたは免疫グロブリンサブフラクション)は、有効量の活性成分を含む医薬組成物としてアテローム血栓症の危険状態にある被験対象に投与する。該医薬組成物は静脈内投与するか、またはリスクグループに属する患者の処置として別ルートで投与する。適するリスクグループとは、全身性紅斑性狼瘡(SLE)患者である。別のリスクグループは、抗リン脂質関連抗体のレベルを上昇させ得る上部呼吸気道の、または他の感染症(肺炎球菌感染を包含する)を有するか、または有していた(または、その危険状態にある)患者である。この処置は適切な時間間隔で繰り返すことができる。
アテローム血栓症とプラーク破壊のリスクは、抗体がアネキシンV−プラーク結合を阻害する結果として、内皮に結合するアネキシンVが低下するときに、著しく上昇する。プラーク−アネキシン結合を低下させる他の抗体(例えば、アネキシンV−結合抗体)を阻害するアネキシンV(またはフラグメント)の投与、または免疫グロブリン、好ましくは免疫グロブリンのサブフラクション(すなわち、上記のプール免疫グロブリン製剤のサブフラクション)を投与することによるアネキシンV結合の回復は、アテローム血栓症と特に心臓血管系疾患の主要原因であるプラーク破壊に対する新提案治療法を提供する。
本発明の第1の局面では、アテローム血栓症および/またはプラーク破壊を予防するための医薬組成物の製造における、アネキシンVタンパク質またはアネキシンVのN−末端フラグメントの塩の形状としての使用が提供される。
アネキシンVという用語は当業者周知であり、例えば、上記に引用した文献、例えば、EP1379266で使用されている。当業者には明らかなように、アネキシンVのN−末端フラグメントはアネキシンVのフラグメントとして当業者が認識し得るために十分な大きさである(例えば、他のアネキシンのフラグメントよりもむしろ大きい。
該医薬組成物は有効量のアネキシンVタンパク質またはアネキシンVのN−末端フラグメントを、担体および添加物と組合わせて含有していてもよい。適切な担体および添加物は当業者に周知のものであり、EP1379266に例示されたものが使用し得る。その塩は医薬的に許容し得る酸付加塩でよく、その場合の対イオンは、例えば、塩素、酢酸塩などである。
該医薬組成物中のアネキシンVの有効量は、アネキシンV−内皮結合の診断的状況分析により決定される。従って、用量は患者のアネキシンV−内皮結合の状態を評価することにより決定し得る。従って、アネキシンV−内皮結合は、アネキシンVと内皮との結合に対する患者血清の影響を、例えば、アネキシンVと培養した内皮細胞との結合に対する患者血漿の影響を評価する、実施例にて使用された技法と同様の技法(「内皮細胞結合の培養;アネキシンVの結合」および「結果」の部参照)を用いて評価することにより評価し得る。患者からの剖検プラーク材料の免疫組織化学的染色(実施例の「ヒトアテローム性動脈硬化症プラークの免疫組織化学的染色」の部に記載)を使用することができる。
標識アネキシンを用いる画像化技法(文献16(WO95/34315)の考察参照)も使用し得る。当業者が理解するように、患者のアネキシンV結合が非常に低いと判明したなら、患者のアネキシンV結合が正常人で見出されるものに近いことが分かっている場合よりも、より高用量のアネキシンV(またはそのフラグメント)が必要とされ得る。
本発明のさらなる局面では、アテローム血栓症および/またはプラーク破壊の危険状態にある被験対象を処置する方法であって、有効量のアネキシンVまたはアネキシンVのN−末端フラグメントの塩の形状で含有してなる医薬組成物を当該被験対象に投与することを特徴とする方法が提供される。
該危険状態にある被験対象とは全身性紅斑性狼瘡(SLE)患者である。SLE患者はさらに上記に考察したリスクファクターを有している;例えば、異常脂肪血症、低密度リポタンパク質の酸化(oxLDL)上昇、腫瘍壊死因子(TNF)システムにおける上昇した活性(異常脂肪血症と密接に関連)、CRPにより判定される全身性炎症、ホモシステインおよび抗リン脂質抗体(aPL)などである。SLE患者はさらに再発性血栓症または度々繰り返されるアテローム血栓症を示すか、または心臓血管系疾患の1回以上の徴候;例えば、血栓塞栓症の非出血性または脈管炎性の発作、心筋梗塞、狭心症または間欠性跛行などを切り抜けて生き残っている。危険状態にある被験対象は、肺炎球菌感染症に罹患しているか、罹患していたか、またはそのリスクのある患者であり得る;または不安定狭心症、他の形状の重篤な狭心症、または一過性の虚血性発作(TIA)などの切迫性心臓血管系疾患の徴候ありとする症候または臨床評価に基づき同定される、攻撃され易いプラークを有する患者であり得る。アネキシンV−内皮結合の評価は、上記考察のように、リスクを評価する際に使用し得る。
本発明のさらなる局面では、アネキシンVに結合する抗体を阻害する能力を有する免疫グロブリンの精製サブフラクション(すなわち、上記で考察したプール免疫グロブリン製剤の精製サブフラクション)が提供される。かかるサブフラクションは上記の技法、例えば、アフィニティ精製を用いて調製することができる。該精製サブフラクションは、抗IgG抗体サブフラクション、例えば、IgGに結合する親和性により、特にIgG定常ドメインに選択されるサブフラクションであり得る。
本発明のさらなる局面では、アネキシンVの内皮(または内皮細胞、例えば、培養中)に対する結合を促進する能力を有する免疫グロブリンの精製サブフラクション(すなわち、上記で考察したプール免疫グロブリン製剤の精製サブフラクション)が提供される。かかるサブフラクションは、上に示した技法、例えば、アフィニティ精製により調製し得る。該サブフラクションは抗Ig抗体サブフラクション、例えば、IgG、取分けIgG定常ドメインにアフィニティ結合させることにより選択されるサブフラクションである。かかるサブフラクションは抗−aPAF、抗−aLPC、抗−aPSまたは抗−a−肺炎球菌ワクチンを含み得るものであり、これらはaPAF、aLPC、aPSまたは肺炎球菌ワクチンに対する抗体のレベルを低下させることが可能であり、その欠乏はアネキシンV結合を増加させることが判明した(実施例参照)。アネキシンVが内皮に結合するのを促進するサブフラクションの能力は、上記のように、また実施例に示したように、アネキシンV−内皮結合分析評価法を用いて評価することができる。例えば、適切なサブフラクションは、アネキシンVと内皮細胞との結合に対して、SLE症例からの血漿(高抗リン脂質抗体(aPL)タイター血清)の阻害作用を低下させるものであり得る。該サブフラクションは、ホスホリルコリン複合体、例えば、実施例にて考察したPC−BSAまたはPC−KLHなどに対する結合に基づくアフィニティ精製により調製し得る。かかるサブフラクションは出発原料の免疫グロブリン標品に比べて、抗ホスホリルコリン(aPC)抗体、例えば、aPC IgGおよび/またはaPC IgMなどのレベルを上昇させ得る。実施例に記すように、我々はaPC−BSAとaPC−KLHとアネキシンV結合のレベル間に統計的な相関関係を見出した。aPC IgGおよび/またはIgMがある種のIgGに結合することが可能で(例えば、Halpern et al (1991) J Clin Invest 88(2), 476-482 参照)、またIgGを産生するB2細胞をも中和し得るB細胞サブタイプのB1細胞により産生される可能性がもっとも高いことが考えられる。
本発明のさらなる局面においては、例えば、アテローム血栓症および/またはプラーク破壊を予防するための医薬として使用する本発明の精製サブフラクションが提供される。
本発明のさらなる局面においては、アテローム血栓症および/またはプラーク破壊を予防するための医薬の製造における本発明の前記局面による精製サブフラクションの使用または市販入手可能な免疫グロブリン製剤(すなわち、上記に考察したプール免疫グロブリン製剤)の使用が提供される。
本発明のさらなる局面においては、アテローム血栓症および/またはプラーク破壊の危険状態にある被験対象を処置する方法であって、有効量の免疫グロブリン(すなわち、上記に考察したプール免疫グロブリン製剤)または免疫グロブリンの精製サブフラクション(上記の例)を含有してなる医薬組成物を当該被験対象に投与することを特徴とする方法が提供される。
処置すべき被験対象(または処置用医薬)の選択は、上記に考察した。被験対象は、例えば、全身性紅斑性狼瘡(SLE)患者であるか、または肺炎球菌感染症に罹患しているか、罹患していたか、またはその危険のある患者であるか、または攻撃され易いプラークおよび/または不安定狭心症を有する患者であり得る。
本発明につき、以下の非制限的図面および実施例を参照することにより、ここでより詳細に説明する。
本明細書に引用した文献は、参照により本明細書の一部とする。
検討グループ
検討したグループは、心臓血管系疾患を1回以上発症し、生き延びてきたSLEの女性26名からなり、血栓塞栓症の非出血性または脈管炎発作(n=15)(コンピューター断層または磁気共鳴画像化により確認);心筋梗塞(n=7)(心電図検査およびクレアチン・キナーゼ上昇により確認);狭心症(n=9)(運動ストレス検査により確認)または間欠性跛行(n=4)(血管造影図により確認される末梢アテローム性動脈硬化症)と定義されたグループ;SLEであるが、心臓血管系疾患の臨床的徴候のない年齢の釣り合う女性26名;および健常集団に基づく年齢の釣り合う女性26名からなる。
検討したグループは、心臓血管系疾患を1回以上発症し、生き延びてきたSLEの女性26名からなり、血栓塞栓症の非出血性または脈管炎発作(n=15)(コンピューター断層または磁気共鳴画像化により確認);心筋梗塞(n=7)(心電図検査およびクレアチン・キナーゼ上昇により確認);狭心症(n=9)(運動ストレス検査により確認)または間欠性跛行(n=4)(血管造影図により確認される末梢アテローム性動脈硬化症)と定義されたグループ;SLEであるが、心臓血管系疾患の臨床的徴候のない年齢の釣り合う女性26名;および健常集団に基づく年齢の釣り合う女性26名からなる。
すべての患者は1982年に改正されたSLE16に対するアメリカリウマチ学会の基準を満足するものであった。この研究はカロリンスカ病院の倫理委員会により承認された。参加者はすべて研究に参加する前にインフォームドコンセントを承諾した。
頚動脈超音波
左右の頚動脈について、二重機能スキャナー(アクソン・セコイア(Acuson Sequoia)、マウンテン・ビュー、カリフォルニア、米国)により試験し、アテローム性動脈硬化症の程度は内部媒質厚(IMT)により判定した。
左右の頚動脈について、二重機能スキャナー(アクソン・セコイア(Acuson Sequoia)、マウンテン・ビュー、カリフォルニア、米国)により試験し、アテローム性動脈硬化症の程度は内部媒質厚(IMT)により判定した。
アネキシンV結合内皮細胞の培養物
凍結保存プールヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の2継代のものをカスケード・バイオロジックス・インク(Cascade Biologics, Inc.)(ポートランド、オレゴン、米国)から購入し、培養物は2%ウシ胎児血清およびサプリメントを含有するEGM(商標)フェノール・レッド不含培地(クロネチックス(Clonetics)、サンディエゴ、カリフォルニア、米国)に維持した。細胞は75cm2フラスコ(TPP、AG,トラサジンゲン(Transadingen)、スイス)中に、湿潤5%CO2下、37℃の条件でインキュベートした。実験はすべて3〜4継代で実施した。HUVECはフローサイトメトリー分析用12穴プレート(ヌンク・インク(NUNC, Inc.)、ネイパービル、イリノイ、米国)に、2×104細胞/mlの密度で;MTT分析評価用96穴プレート(TPP)に、1×104細胞/ウエル/100μlの密度で;DNA断片化ELISA用24穴プレート(ヌンク)に、8×103細胞/mlの密度で;播種した。細胞は、12〜24時間付着させて、無血清培地(SFM)で注意深く洗浄した後、処理に先立ち、少なくとも12時間SFMに静止状態とした。検討グループから採取したヘパリン保存血漿をSFM中10%の濃度で単層に加えた。
凍結保存プールヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の2継代のものをカスケード・バイオロジックス・インク(Cascade Biologics, Inc.)(ポートランド、オレゴン、米国)から購入し、培養物は2%ウシ胎児血清およびサプリメントを含有するEGM(商標)フェノール・レッド不含培地(クロネチックス(Clonetics)、サンディエゴ、カリフォルニア、米国)に維持した。細胞は75cm2フラスコ(TPP、AG,トラサジンゲン(Transadingen)、スイス)中に、湿潤5%CO2下、37℃の条件でインキュベートした。実験はすべて3〜4継代で実施した。HUVECはフローサイトメトリー分析用12穴プレート(ヌンク・インク(NUNC, Inc.)、ネイパービル、イリノイ、米国)に、2×104細胞/mlの密度で;MTT分析評価用96穴プレート(TPP)に、1×104細胞/ウエル/100μlの密度で;DNA断片化ELISA用24穴プレート(ヌンク)に、8×103細胞/mlの密度で;播種した。細胞は、12〜24時間付着させて、無血清培地(SFM)で注意深く洗浄した後、処理に先立ち、少なくとも12時間SFMに静止状態とした。検討グループから採取したヘパリン保存血漿をSFM中10%の濃度で単層に加えた。
細胞は細胞解離溶液(CDS;シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ、米国)により非酵素的に収穫した。HUVBCは注意深く上清と共にプールして、剥がれて浮遊するECの選択的損失を排除し、1200rpmで7分間遠心分離した。100μlのアネキシンV−結合バッファー(モレキュラー・プローブ・インク、ユージン、オレゴン、米国)サンプルの再懸濁液を5mg/mlのアネキシンV−FITC(モレキュラー・プローブ)で染色し、氷上、15分間インキュベートした。取得直前に、1mg/mlのヨウ化プロピジウム(PI;R&Dシステムズ・ヨーロッパ(株)、アビンドン、英国)を加えた。分析はセルクエスト(CellQuestTM)ソフトウエアを備えたFACSスキャン・フロー・サイトメーター(BDバイオサイエンス、サン・ホセ、カリフォルニア、米国)で実施した。取得に際し、直線FCSおよびSSCスケール上、230未満の事象を除くためにゲートを設置した。各サンプルにつき、10000事象を集めた。
ヒトアテローム性動脈硬化プラークの免疫組織化学的染色
以前に特性化したヒトプラークについて、免疫染色を実施した。プラークは一過性虚血発作後の頚動脈血管内膜切除術を受けた患者12名から集めた。標品はすべて進行性アテローム性動脈硬化病巣を含んでいた。対照として、肉眼的に健康な腸間膜動脈を無関係の腸管切除後に得た。凍結切片を2%パラホルムアルデヒド/PBS(シグマ・ケミカルス)中で、4℃で20分間固定し、−70℃で保存した。内在するペルオキシダーゼを遮断した後、切片をマウス・タイプIgG2aのモノクローナル抗アネキシンV抗体(アレキシス(Alexis)バイオケミカル・コープ、ソーセン、スイス)、抗CD68(ダコ・サイトメーション(Dako Cytomation)、グロストラップ、デンマーク)または抗CD31(モノサン(Monosan)、ウーデン、オランダ)と一夜インキュベートした。無関係のマウスIgG2a(セロテック(株)、オックスフォード、英国)は負の対照として使用した。抗体はすべて1%BSA−0.02%NaN3/PBSで希釈した。洗浄後、1%正常ウマ血清/PBSを使用した。二次抗体−ビオチン化ウマ抗マウス免疫グロブリン(ベクター・ラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア、米国)を加えた。ABCペルオキシダーゼ・エリート(商標)キットを使用した(ベクター・ラボラトリーズ)。染色はジアミノベンジジン(ベクター・ラボラトリーズ)で発色し、対比染色はヘマトキシリンで実施した。断片はすべてライカDMRXA顕微鏡(ライカ、ウエッツラー、ドイツ)で分析した。
以前に特性化したヒトプラークについて、免疫染色を実施した。プラークは一過性虚血発作後の頚動脈血管内膜切除術を受けた患者12名から集めた。標品はすべて進行性アテローム性動脈硬化病巣を含んでいた。対照として、肉眼的に健康な腸間膜動脈を無関係の腸管切除後に得た。凍結切片を2%パラホルムアルデヒド/PBS(シグマ・ケミカルス)中で、4℃で20分間固定し、−70℃で保存した。内在するペルオキシダーゼを遮断した後、切片をマウス・タイプIgG2aのモノクローナル抗アネキシンV抗体(アレキシス(Alexis)バイオケミカル・コープ、ソーセン、スイス)、抗CD68(ダコ・サイトメーション(Dako Cytomation)、グロストラップ、デンマーク)または抗CD31(モノサン(Monosan)、ウーデン、オランダ)と一夜インキュベートした。無関係のマウスIgG2a(セロテック(株)、オックスフォード、英国)は負の対照として使用した。抗体はすべて1%BSA−0.02%NaN3/PBSで希釈した。洗浄後、1%正常ウマ血清/PBSを使用した。二次抗体−ビオチン化ウマ抗マウス免疫グロブリン(ベクター・ラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア、米国)を加えた。ABCペルオキシダーゼ・エリート(商標)キットを使用した(ベクター・ラボラトリーズ)。染色はジアミノベンジジン(ベクター・ラボラトリーズ)で発色し、対比染色はヘマトキシリンで実施した。断片はすべてライカDMRXA顕微鏡(ライカ、ウエッツラー、ドイツ)で分析した。
aPCの調製
全IgMまたはIgGフラクションはハイトラップIgMまたはIgGカラム(アマシャム・バイオサイエンス)を用いて、市販入手可能なプールヒト免疫グロブリン(ガンマガード(登録商標))から50mg/mlで分離した。ホスホリルコリン(PC)に対する抗体はキーホールリンペット(limpet)ヘモシアニン(KLH)タンパク質(1または5mg/ml)またはウシ血清アルブミン(BSA)(1mg/ml)に接合したPCにカップル結合したNHS−セファロースカラム上、IgMまたはIgGフラクションを負荷した後に溶出し、次いで、BSAのみのカラムに付した。PC−BSA(ホスホリルコリン−ウシ血清アルブミン)およびPC−KLHはバイオサーチ・テクノロジーズ・インク(カリフォルニア、米国)より購入した。溶出フラクションはPD−10カラムでバッファー交換し、ミリポア・セントリコーン(登録商標)装置にて濃縮した。操作は製造業者による説明書に従って実施した。調製したIgMaPCの濃度は、一般に50μg/mlであり、IgGaPCの濃度は一般に30μg/mlであった。
全IgMまたはIgGフラクションはハイトラップIgMまたはIgGカラム(アマシャム・バイオサイエンス)を用いて、市販入手可能なプールヒト免疫グロブリン(ガンマガード(登録商標))から50mg/mlで分離した。ホスホリルコリン(PC)に対する抗体はキーホールリンペット(limpet)ヘモシアニン(KLH)タンパク質(1または5mg/ml)またはウシ血清アルブミン(BSA)(1mg/ml)に接合したPCにカップル結合したNHS−セファロースカラム上、IgMまたはIgGフラクションを負荷した後に溶出し、次いで、BSAのみのカラムに付した。PC−BSA(ホスホリルコリン−ウシ血清アルブミン)およびPC−KLHはバイオサーチ・テクノロジーズ・インク(カリフォルニア、米国)より購入した。溶出フラクションはPD−10カラムでバッファー交換し、ミリポア・セントリコーン(登録商標)装置にて濃縮した。操作は製造業者による説明書に従って実施した。調製したIgMaPCの濃度は、一般に50μg/mlであり、IgGaPCの濃度は一般に30μg/mlであった。
内皮細胞に対するアネキシンVの結合
アネキシンVの結合を阻害する高い能力を有するヘパリン保存血漿を、SFM中、10%の濃度でHUVEC単層に加えた。24時間後に、細胞を細胞解離溶液(CDS;シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ、米国)により収穫し、注意深く上清をプールし、剥がれて浮遊する細胞の選択的損失を排除し、1200rpmで7分間遠心分離した。100μlのアネキシンV−結合バッファー(モレキュラー・プローブ・インク、ユージン、オレゴン、米国)サンプル中の再懸濁液を5mg/mlのアネキシンV−FITC(モレキュラー・プローブ)2μlで染色し、氷上、15分間インキュベートした。取得直前に、1mg/mlのヨウ化プロピジウム(PI;生体色素;R&Dシステムズ・ヨーロッパ(株)、アビンドン、英国)を加えた。分析は前記同様に実施した。
アネキシンVの結合を阻害する高い能力を有するヘパリン保存血漿を、SFM中、10%の濃度でHUVEC単層に加えた。24時間後に、細胞を細胞解離溶液(CDS;シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ、米国)により収穫し、注意深く上清をプールし、剥がれて浮遊する細胞の選択的損失を排除し、1200rpmで7分間遠心分離した。100μlのアネキシンV−結合バッファー(モレキュラー・プローブ・インク、ユージン、オレゴン、米国)サンプル中の再懸濁液を5mg/mlのアネキシンV−FITC(モレキュラー・プローブ)2μlで染色し、氷上、15分間インキュベートした。取得直前に、1mg/mlのヨウ化プロピジウム(PI;生体色素;R&Dシステムズ・ヨーロッパ(株)、アビンドン、英国)を加えた。分析は前記同様に実施した。
結果
アネキシンVの結合に対する免疫グロブリンIgG欠乏の影響
免疫グロブリンIgGサブクラスの欠乏は、アネキシンV結合の蛍光強度増大を2.7〜2.6倍にまで至らしめた(完全血清平均FI:267.95± vs 709.91±;中間値FI:222.67± vs 567.42±)。IgGフラクションを再構築して欠乏血清とすると、蛍光強度が低下し、一方、IgG溶出液で培養すると、アネキシンV結合の蛍光強度が完全血清の蛍光強度に匹敵するものとなった。
アネキシンVの結合に対する免疫グロブリンIgG欠乏の影響
免疫グロブリンIgGサブクラスの欠乏は、アネキシンV結合の蛍光強度増大を2.7〜2.6倍にまで至らしめた(完全血清平均FI:267.95± vs 709.91±;中間値FI:222.67± vs 567.42±)。IgGフラクションを再構築して欠乏血清とすると、蛍光強度が低下し、一方、IgG溶出液で培養すると、アネキシンV結合の蛍光強度が完全血清の蛍光強度に匹敵するものとなった。
アネキシンVの結合はSLE症例からの血漿を使用して、24時間後に対照と比較した場合、有意に低下していた(SLE症例 vs 集団対照:p=0.002;SLE症例 vs SLE対照:p=0.02)。アネキシンVの結合を阻害する高い能力をもつ血清から全IgGを枯渇させると、この結合が完全に回復する。SLE症例の中には、アネキシンV結合とアテローム性動脈硬化症の程度の間に、顕著な正の関連性が存在した(R=0.73;p<0.001)。免疫染色は試験した11/12のプラークにアネキシンVの存在することを明らかにした。
プロテインGアフィニティ・カラムクロマトグラフィー
ECに結合するアネキシンVを阻害する高い能力を有するプール血清は、0.45μmで濾過し、等容量の内皮基礎培地で希釈した。ハイトラップ・プロテインG
HP、アマシャム・バイオサイエンス(ウプサラ、スウェーデン)から得た25mgヒトIgG/ml結合能力をもつゲルの1mlカラムを、製造業者の説明書に従い使用した。IgGフラクションは0.1M−グリシンHCl(pH2.7)でカラムを溶出することにより得た。中和のために、1M−トリス−HCl(pH9.0)を使用した。完全血清、流出液および溶出液を使用し、分離した日に、SFM中、1:10の希釈でHUVECとインキュベーションした。
ECに結合するアネキシンVを阻害する高い能力を有するプール血清は、0.45μmで濾過し、等容量の内皮基礎培地で希釈した。ハイトラップ・プロテインG
HP、アマシャム・バイオサイエンス(ウプサラ、スウェーデン)から得た25mgヒトIgG/ml結合能力をもつゲルの1mlカラムを、製造業者の説明書に従い使用した。IgGフラクションは0.1M−グリシンHCl(pH2.7)でカラムを溶出することにより得た。中和のために、1M−トリス−HCl(pH9.0)を使用した。完全血清、流出液および溶出液を使用し、分離した日に、SFM中、1:10の希釈でHUVECとインキュベーションした。
内皮細胞に結合するアネキシンVの測定
アネキシンV結合に陽性のHUVECの頻度は、ニ変量ドットプロット上のアネキシンV+/PI細胞のパーセントとして、またはヒストグラムに基づくアネキシンV+細胞のパーセントとして決定した。結合を低下させることが分かっており、IVIGでプレインキュベートした血清の存在下において、HUVECに対するアネキシンV結合を決定した。IVIGとのプレインキュベーションはアネキシンの結合を回復させ得るが、このことはIVIGに存在する抗体が結合を中和し得ることを物語っている(図1)。
アネキシンV結合に陽性のHUVECの頻度は、ニ変量ドットプロット上のアネキシンV+/PI細胞のパーセントとして、またはヒストグラムに基づくアネキシンV+細胞のパーセントとして決定した。結合を低下させることが分かっており、IVIGでプレインキュベートした血清の存在下において、HUVECに対するアネキシンV結合を決定した。IVIGとのプレインキュベーションはアネキシンの結合を回復させ得るが、このことはIVIGに存在する抗体が結合を中和し得ることを物語っている(図1)。
aPC−BSAおよびaPC−KLHは共に、CVDの病歴をもつSLE患者において、ECに結合するアネキシンVと有意に関連していた(それぞれ、r=0.45;p=0.02およびr=0.03)。aPC−BSAおよびaPC−KLHレベルは、標準的技法、例えば、以下の試薬を用いて評価した。ポリソープ(Polysorp)F96マイクロタイター免疫プレートはヌンク(ロスキライド、デンマーク)から購入した;PC−BSA(ホスホリルコリン−ウシ血清アルブミン)はバイオサーチ・テクノロジー・インク(米国)から購入した。ウシ血清アルブミン(BSA)、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIgG(r−鎖特異的)、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIgM(u−鎖特異的)、PNPP(アルカリ性ホスファターゼ基質)はシグマ(セントルイス、ミズーリ、米国)から得た。例えば、PC−BSAに対するIgGおよびIgM抗体は酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により決定した。17名の抗リン脂質症候群患者からのプール血清は内部基準として使用し、各プレート上で試験した。抗体結合は10μg/mlの抗原濃度で頭打ちとなった。そこで、F96マイクロタイター・ポリソープ・プレートはPBS中で、PC−BSA(10μg/ml)50μl/ウエルで被覆した。被覆プレートは4℃で一夜インキュベートした。PBSで5回洗浄した後、プレートは室温で2時間、2%BSA−PBSにより遮断し、上記同様に洗浄した。血清サンプルは0.2%BSA−PBS中に希釈し(1:30)、50μl/ウエルで加えた。
結合低下を誘発する高い能力を有する血清の肺炎球菌ワクチン(国立血清研究所、デンマーク)、PAF、ホスファチジルセリンまたはリソホスファチジルコリンによるプレインキュベーションは、抗原に対する血清の結合を低下させる作用を有していた;また、アネキシンVの結合も保存された(図:2、3、5)。対照的に、PCは有意な作用を有しなかった。このことは、肺炎球菌ワクチン、PAF、ホスファチジルセリン、リソホスファチジルコリンに結合する抗体が、内皮細胞に対するアネキシンVの結合低下に関与している可能性のあることを示唆している。
結論として、アネキシンVはアテローム性動脈硬化病巣の多くの部位、取分け、プラーク破壊の傾向のある部位に存在する。アネキシンV結合が最適ではなく、代わりにアネキシン−プラーク結合に干渉する抗体の影響により結果として低下する場合、アテローム血栓症とプラーク破壊のリスクが大きく上昇する。従って、アネキシンV結合を回復させることは、アテローム血栓症および取分け心臓血管系疾患の主原因であるプラーク破壊に対する可能性のある斬新な治療法である。本発明は2つの方法を提供する。1つはアネキシンVまたは該タンパク質の塩の最適用量の使用に基づくものであり、該タンパク質は好ましくは静脈内注射により投与すべきである;他方は容易に入手可能な免疫グロブリン、または免疫グロブリンのアフィニティ精製サブフラクションの使用に基づくものであり、これらもまた注射により投与し得る。
投与に際してのアネキシンV(または免疫グロブリン)の有効量は、現状のアネキシンV−プラーク結合に対しての診断状態分析から決定し得る。結合は上記の分析方法により決定した。活性成分を含有してなる医薬組成物での処置は、好ましくは危険状態にある被験対象に投与することである。危険状態にある被験対象は頻繁にアテローム血栓症を繰り返すSLE患者である。危険状態にある別の被験対象は、肺炎球菌感染症に罹患しているか、または罹患していたか、またはその危険状態にある患者である。
参考文献
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Claims (4)
- ヒトにおけるプラーク破壊を予防するための医薬組成物の製造における、アネキシンVに結合する抗体を阻害する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクションまたは、アネキシンVの内皮に対する結合を促進する能力を有するプール免疫グロブリンの精製サブフラクションの使用。
- ヒトにおけるプラーク破壊を予防するための医薬の製造における、市販入手可能なプール免疫グロブリン製剤の使用。
- ヒトが全身性紅斑性狼瘡(SLE)患者である請求項1または請求項2の使用。
- 傷つきやすいプラークを有する患者のプラーク破壊を予防するための請求項1乃至請求項3のいずれか一つに記載の使用。
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