TW202146042A - 用於治療動脈和靜脈血栓形成的協同且靶向的組成物 - Google Patents

Abstract

腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白的組合，包括其融合蛋白，係不會引起不希望的出血的協同抗血栓形成劑。

Description

用於治療動脈和靜脈血栓形成的協同且靶向的組成物

本發明屬於治療以不希望的血栓形成為特徵的病症的領域，該病症係例如心臟病發作、中風和應使出血最小化的手術併發症。特別地，本發明關於與凝血酶原酶複合物和腺苷三磷酸雙磷酸酶競爭地與活化的血小板表面上的磷脂醯絲胺酸結合的因子之投與，以預防或治療血栓形成。

藉由本發明之方法治療的相關病症係動脈血栓形成和靜脈血栓形成。

在動脈血栓形成的情況下，常規地使用高濃度的未分級肝素來預防冠狀動脈搭橋手術（CABG）患者的圍手術期凝血。儘管使用了魚精蛋白拮抗，肝素治療仍會增加術後出血，並且大約30%的患者在CABG後需要輸血。其他抗血栓形成療法也顯著增加了術後出血的風險。一般在冠狀動脈手術前幾天停用氯吡格雷（商品名：Plavix）、普拉格雷（商品名：Effient）、替卡格雷（商品名：Brillinta）和伊布洛芬。服用華法林（商品名：Coumadin）、阿哌沙班（商品名：Eliquis）、利伐沙班（商品名：Xarelto）、依度沙班（商品名：Savaysa）或達比加群（商品名：Pradaxa）的患者應在手術前停止服用。因此，迫切需要一種不引起圍手術期或術後出血的抗血栓形成治療。

當前的經皮冠狀動脈介入治療（PCI）期間的輔助抗血栓形成療法（以前稱為帶支架血管成形術）也增加了大出血。可以藉由心電圖上是否存在急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）來診斷冠狀動脈疾病。血小板在血栓形成併發症中起中心作用（Heit, JA,J Thromb Haemost [血栓形成和止血雜誌] (2005) 3: 1611-1617）。針對這種情況的治療旨在恢復正常的冠狀動脈血流並最大程度地挽救功能性心肌。

目前，美國和歐洲的指南建議將原發性PCI與輔助療法結合，輔助療法包括雙重抗血小板劑和抗凝劑。然而，在約40%-50%的STEMI患者中，目前可用的具有抗血小板活性的藥劑在作用開始方面被延遲（Riteau, N., 等人,Am J Respir Crit Care Med [美國呼吸與重症醫學雜誌] (2010) 182: 774-783）並且所有組合均具有增加出血的作用機制。在最近的一項臨床試驗中，11%-12%的患者遭受了大出血（Ufer, M.,Thromb Haemost [血栓形成和止血] (2010) 103: 572-585）。另外，當前的抗血栓形成劑（抗血小板劑和抗凝劑的組合）均不能防止再灌注損傷，再灌注損傷被定義為與缺血後冠狀動脈血流恢復相關的心肌梗死。再灌注損傷占心肌梗死最終大小的多達50%，並引起相關的心臟功能障礙。這可以解釋為什麼儘管進行了最佳的冠狀動脈再灌注，但AMI後的死亡率仍然接近10%，並且心臟衰竭的發生率接近25%（Heit, JA,J Thromb Haemost [血栓形成和止血雜誌] (2005) 3: 1611-1617; Spyropoulos, AC, 等人,J Manag Care Pharm [管理護理藥學雜誌] (2007) 13: 475-486; Marcus, AJ, 等人,Semin Thromb Hemost [血栓形成和止血研討會] (2005) 31: 234-246）。

因此，長期以來人們一直沒有滿足醫學上對速效治療劑作為PCI輔助劑的需求，這將有助於再灌注而不增加出血，並減輕再灌注損傷，這將改善心肌挽救和左心室功能的恢復，從而降低心臟衰竭的發生率。

左心室輔助設備（LVAD）係一種泵，其用於已達到晚期心臟衰竭的患者。LVAD係電池驅動的機械泵，並藉由外科手術植入，然後幫助左心室（心臟的主泵腔）將血液泵送到身體的其他部位。可以使用LVAD，直到心臟可用或患者可以使用LVAD接受長期治療，這可以延長並改善患者的生活。儘管存活、功能能力和生活品質有了顯著改善，但常見的併發症係泵血栓形成、中風和出血。由於目前所有的抗血栓形成藥物都增加出血風險，因此實現最佳的抗血栓形成療法（其平衡血栓形成預防與增加的出血）一直係一項持續的挑戰。

對於經歷手術治療的慢性抗血栓形成療法患者，當前的臨床推薦建議在手術前停止抗血栓形成療法，因為該等藥物會增加過度出血的風險。例如，對於需要CABG的患者，在手術前後停止使用阿司匹林；患者術前4-6h停止使用未分級肝素，患者術前24h使用低分子量肝素的最後劑量。但是，中斷該等抗血栓形成治療也增加了圍手術期血栓形成的風險，例如肺栓塞，這可能是致命的。當前，尚無可安全用於圍手術期管理的抗血栓治療。

對於靜脈血栓栓塞的抗凝治療，發現了類似的缺點，因為該治療受到大出血事件增加的困擾，並且對靜脈壁增厚或纖維化的保護作用最小。靜脈血栓栓塞包括深靜脈血栓形成（DVT）並且肺栓塞（PE）係全世界發病率和死亡率的主要來源。

DVT的當前預防和治療係投與腸胃外抗凝劑，例如肝素，隨後過渡為口服活性抗凝劑，例如華法林（Heit, JA,J Thromb Haemost [血栓形成和止血雜誌] (2005) 3: 1611-1617; Kyrle, PA, 等人,Lancet [柳葉刀] (2005) 365: 1163-1174）。也已經使用了其他藥劑，例如，利伐沙班已被批准用於短期和長期治療（Perzborn, E., 等人,Nature Rev. Drug Discovery [自然綜述藥物發現] (2011) 10: 61-75；Ufer, M.,Thromb Haemost [血栓形成和止血] (2010) 103: 572-585），但是都具有產生出血的作用機制，從而限制了可投與的劑量。此外，目前的治療不能有效預防血栓形成後綜合症（PTS），其特徵係靜脈瓣膜受損、溢流阻塞和組織缺氧（係繼發於靜脈壁增厚和纖維化）所致的血液逆流（Popuri, RK, 等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol [動脈硬化性血栓形成和血管生物學] (2011) 31: 479-484; Saarinen, J., 等人,J Cardiovasc Surg [心血管手術雜誌] (2000) 41: 441-446; Deatrick, KB, 等人,J Vasc Surg [血管手術雜誌] 2011 53: 139-146）。

隨著人口老齡化的增加，DVT的影響正在增加。2005年，美國參議院將三月指定為「深靜脈血栓形成意識月」。顯然，DVT的健康和經濟負擔係深遠的，DVT患者將大大受益於有效的抗血栓形成劑，其不受出血風險增加的限制並且還能夠減輕PTS。

如下所述，本發明之組成物和方法也提供了針對這種未滿足的醫療需求的解決方案。

在US 7,247,300、US 7,390,485和US 8,021,866中揭露了使用腺苷三磷酸雙磷酸酶，特別是可溶性CD39L3及其修飾物來治療與血栓形成有關的病症。在US 8,535,622中揭露了使用腺苷三磷酸雙磷酸酶作為治療出血病症的療法，在US 8,771,683中揭露了基於可溶性CD39L3的腺苷三磷酸雙磷酸酶的增強形式。另外，在US 14/666,121（其正在審理中）中揭露了用於纖維增生性障礙、肺動脈高壓和心臟衰竭的腺苷三磷酸雙磷酸酶療法。

考慮到例如在患有全身性紅斑狼瘡的患者中顯示與膜聯蛋白V反應的抗體會影響動脈血栓形成和/或靜脈血栓形成，因此已知與凝血酶原酶複合物膜聯蛋白V的結合競爭而與活化血小板表面上的磷脂醯絲胺酸結合的蛋白質被認為與血栓形成的預防和治療有關（Esposito, G., 等人,Autoimmunity Rev [自體免疫綜述] (2005) 4: 55-60）。確實，儘管目前膜聯蛋白V的主要用途係作為細胞凋亡的標記，但是可以理解，膜聯蛋白V抑制凝血酶原活化並能夠在正常的靜脈和動脈血流條件下防止血栓形成。與膜聯蛋白V反應的抗體已顯示導致1型糖尿病患者的血栓併發症。（Bakar, F., 等人,J Clin Endocrinol Metab [臨床內分泌與代謝雜誌] (2014) 99: 932-937）。

現已發現，當按照原樣組合投與時或作為單一融合蛋白投與時，膜聯蛋白V或其他與活化血小板表面的磷脂醯絲胺酸結合的膜聯蛋白和腺苷三磷酸雙磷酸酶具有協同抗血栓形成作用並且不增加不希望的出血。

因此，這種組合代表了目前與動脈血栓形成和靜脈血栓形成治療相關的問題的解決方案。還發現膜聯蛋白V偶聯至腺苷三磷酸雙磷酸酶作為融合蛋白的某些實施方式在重組生產方面顯示出有利的特性。

本文所引用的所有文檔藉由引用以其全文結合。

一方面，本發明關於一種組成物，其包含腺苷三磷酸雙磷酸酶和結合活化血小板表面上的磷脂醯絲胺酸（PS）的膜聯蛋白；所述腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白的投與量可一起有效地抑制血栓形成而不增加出血。

膜聯蛋白和腺苷三磷酸雙磷酸酶的組合也可以以其中腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白共價偶聯的單個分子的形式投與。

關於易於產生這種共價偶聯的組合，有利的是，腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白藉由連接子（linker）肽共價偶聯以形成融合蛋白，特別是其中連接子肽對血漿和/或細胞培養上清液中的水解具有抗性。

本發明還關於腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白的共價偶聯形式的重組生產（包括與這種重組生產有關的材料），並關於使用本發明之組成物治療經歷血栓形成或有血栓形成危險的受試者之方法。

本發明利用了抗血小板和抗凝血蛋白，腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白的出乎意料的協同組合作用來預防或治療動脈和靜脈血栓形成。該組合解決了與市售抗血栓形成劑有關的問題，並且與該等市售抗血栓形成劑相比，特別是在避免增加出血方面具有更有利的特性。另外，本發明包括獨特的融合蛋白，其中腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白藉由另外的胺基酸序列連接。當以融合蛋白產生時，就重組產生時的表現水平而言以及就在重組培養物中和血漿中對蛋白水解的抗性而言，本發明包括其有利形式。該等特徵的出現取決於膜聯蛋白組分和腺苷三磷酸雙磷酸酶組分之間提供的連接子。 組分

通常，可以使用任何抑制血小板活化和凝集的腺苷三磷酸雙磷酸酶。可以在US 7,390,485中找到對此腺苷三磷酸雙磷酸酶的討論。可溶性形式的CD39L3的某些突變體特別有用。

腺苷三磷酸雙磷酸酶的一種特別有用的形式係CD39L3的可溶形式，其序列在US 7,390,485中揭露。其中全長CD39L3及其推導的胺基酸序列分別為SEQ ID NO: 55和SEQ ID NO: 56。該專利中也揭露了可溶形式，並且其中編碼核苷酸的序列為SEQ ID NO: 59，推導的胺基酸序列為SEQ ID NO: 60。

‘485專利還描述了可溶性CD39和可溶性CD39L3的定點誘變。在本發明中特別有用的是可溶性CD39L3的突變形式，其中位置67和69的胺基酸係突變的。可溶性CD39L3的該等突變體中的兩個係R67A T69R和R67G T69R。可溶性CD39L3 R67G T69R係特別較佳的雙重突變體。在US 8,771,683中揭露了該序列的「增強」形式，並且相關的核苷酸和胺基酸序列在本文中分別以SEQ ID NO: 1和2再現。該實施方式被命名為APT102。

用於本發明之膜聯蛋白組分係膜聯蛋白V，其結合活化的血小板上的磷脂醯絲胺酸。膜聯蛋白係具有相似結構但具有各種生理活性的蛋白大家族的成員。表現出膜聯蛋白V的上述特性的任何膜聯蛋白都可以用於本發明。該等膜聯蛋白的結構，包括編碼它們的天然或優化的核苷酸序列，係本領域已知的。在一些實施方式中，所選擇的膜聯蛋白將與治療對象屬於相同物種。 本發明組分之產生

通常，使用重組技術來產生可用於本發明之組分係方便的。對於腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白共價連接的實施方式而言尤其如此。目前，此類蛋白質的重組技術係本領域眾所周知的，並且重組產生可以在多種細胞和環境中進行，包括培養中的動物、植物和微生物細胞，以及在多細胞生物中原位定位進行。因此，本發明包括用於產生該等組分的重組材料，例如具有合適控制序列的表現系統、載體、帶有該等組分的宿主細胞等。 體內投與本發明之組成物

本發明之組成物可以投與於溫血動物，包括人和其他哺乳動物以及家禽物種。例如，該等動物可包括伴侶動物或農場動物。對於人疾病的治療，合格的醫師將確定使用既定方案在劑量、時間表和投與途徑方面應如何使用本發明之組成物。其他物種的獸醫也承擔類似的角色。這樣的應用也可以利用劑量遞增。

較佳的是，本發明之藥物組成物藉由腸胃外，即動脈內、靜脈內、腹膜內、皮下或肌內投與。更較佳的是，該藥物組成物藉由推注或輸注而靜脈內或腹膜內投與。

本發明之藥物組成物根據標準技術製備，並且可以包含水、緩衝水、鹽水、甘胺酸、右旋糖、等滲蔗糖溶液等，包括用於增強穩定性的糖蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。該等組成物可以藉由常規的、熟知的滅菌技術來滅菌。所得的水溶液可以包裝使用或在無菌條件下過濾並凍乾，將凍乾的製劑在投與前與無菌水溶液組合。該組成物可包含近似生理條件所需的藥學上可接受的輔助物質，例如pH調節劑和緩衝劑、張力調節劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。

藥物配製物中本發明組分的濃度可以在寬範圍內變化，例如按重量計從小於約0.05%，通常是或至少約2%-5%至高達10%-30%，並且將根據所選擇的特定投與方式，主要藉由流體體積、黏度等來選擇。例如，可以增加濃度以降低與治療相關的流體負荷。

較佳的是，本發明之藥物組成物靜脈內投與。遞送媒介物配製物的劑量取決於藥物與脂質的比例以及主治醫生根據患者的年齡、體重和狀況的意見。一種較佳的方案包括推注IV投與，然後是延長的IV輸注。

除藥物組成物外，可以以適合受試者的方式製備和投與獸用的合適配製物。較佳的獸醫受試者包括哺乳動物物種，例如非人靈長類動物、狗、貓、牛、馬、綿羊和馴養家禽。受試者還可以包括實驗動物，例如，特別是大鼠、兔、小鼠和豚鼠。 適應症

本發明之組成物可用於受試者，其中治療或預防血栓形成而不引起過多出血。該等包括但不限於手術，例如包括CABG的胸外科手術和具有高血栓形成風險的大手術，或手術或醫學檢查，其中進行抗血栓形成治療係為了防止在留置導管上凝結或為了放置器械（例如，電生理檢查、起搏器植入、經皮心臟瓣膜放置或修復）。用本發明之組成物治療的受試者還包括患有心肌梗死（包括STEMI）的受試者（其經受PCI或溶栓治療的血運重建/再灌注治療）以及患有穩定或不穩定冠狀動脈疾病的受試者（其經受PCI的冠狀動脈血運重建）。合適的受試者係那些藉由外周血管移植或帶/不帶支架的腔內球囊血管成形術而進行血管重建的周圍血管疾病的受試者，以及接受慢性抗血栓療法的受試者，包括以下那些受試者，該受試者患有心房纖顫且正在接受靜脈血栓栓塞（VTE）治療/預防（因此有血栓併發症的高風險），當受試者無法維持口服抗血栓形成治療時，在禁食和手術過程中作為過渡策略/圍手術期管理。

組成物還可用作預防或治療VTE（包括深靜脈血栓形成和肺栓塞），包括與整形手術有關的預防性治療和骨折的治療，以及固定的受試者，患有急性或慢性疾病（包括癌症）和血栓形成高風險的受試者。另外，本發明之組成物用於治療患有肝素誘導的血小板減少症（HIT）的受試者和患有急性缺血性中風的受試者，該等受試者需要在標準護理基礎上增加另外的抗血栓形成治療，包括在潛在的再灌注治療之前、期間或之後（也在未使用再灌注治療時）以及慢性血栓栓塞性肺疾病/高血壓（CTEPH）受試者的治療或肺血管成形術過程中。

中風定義為由於腦缺血或顱內出血引起的神經功能喪失，包括但不限於預防組織破壞和改善的與急性缺血性中風有關的神經功能和預後；與由於溶栓或血栓切除術的再灌注有關的大和/或小血管阻塞性缺血性中風；栓塞性中風；以及具有中風高風險的急性腦短暫性缺血發作的患者中的復發性中風的預防。 套組

本發明組成物中所用的腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白可以分開配製在單獨的組成物中或配製在相同的組成物中或共價結合。分開的組成物可以同時或順序地分開投與給受試者。然後可以將套組（kit）包裝成為套組，該套組在分開的容器中包括在第一容器中的包含腺苷三磷酸雙磷酸酶的第一組成物，以及在第二容器中的包含合適的膜聯蛋白的第二組成物。

套組還將包括關於將組成物投與於受試者的方式之說明，至少包括對要投與的每種組成物的量的比例的描述。在一個實施方式中，投與等莫耳量。但是，腺苷三磷酸雙磷酸酶與膜聯蛋白的莫耳比將取決於該等組分的選擇，並且腺苷三磷酸雙磷酸酶 : 膜聯蛋白可以在10 : 1到1 : 10之間變化。可替代地或另外地，套組被構造成使得每個容器中的組成物的量被預先測量，使得一個容器的內容物與另一個容器的內容物組合代表正確的比例。可替代地或另外地，容器可以用測量刻度進行標記，以允許根據可見的刻度分配適當的量。容器本身可用於投與；例如，套組可以在分開的注射器中包含適當量的每種組成物。包含預先配製正確比例的治療劑的配製物也可以這種方式包裝，使得可以從預先包裝在套組中的注射器中直接投與配製物。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語、符號和其他科學術語或用辭具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。在一些情況下，為了清楚和/或便於參考，本文定義了具有通常理解的含義的術語，並且本文中對此類定義的包含不必解釋為表示與本領域通常理解的實質性區別。熟悉該項技術者使用常規方法很好地理解並通常採用本文描述或參考的許多技術和程序。適當地，除非另有說明，否則通常根據製造商定義的方案和/或參數進行涉及使用市售套組和試劑的程序。本文引用的所有專利、申請、公開的申請和其他出版物均藉由引用全文併入。如果本節中提出的定義與藉由引用併入本文的專利、申請、公開的申請和其他出版物中提出的定義相反或在其他方面不一致，則本節中提出的定義優先於藉由引用併入本文的定義。

如本文所用，「一個」或「一種」係指「至少一個」或「一個或多個」。

下列實例用於說明而不是限制本發明。而且，下面關於從數據中收集的潛在機制的科學討論也不意味著係本文描述的發明的限制。 縮寫：BT：出血時間；aPTT：活化的部分促凝血酶原激酶時間；TCT：凝血酶凝血時間；ACT：活化的凝血時間；PT：凝血酶原時間；LMWH：低分子量肝素；FX：因子X；DVT：深靜脈血栓形成；EIM：電損傷模型IVC：下腔靜脈。 實例1 腺苷三磷酸雙磷酸酶膜聯蛋白融合構建體和連接子設計

該等實例中使用的腺苷三磷酸雙磷酸酶劑係由編碼U.S. 8,771,683中所述之具有均勻N末端的可溶性CD39L3 R67G T69R: 的構建體製成的可溶性腺苷三磷酸雙磷酸酶劑，在本文中以APT102（SEQ ID NO: 2）命名。

編碼核酸的膜聯蛋白V藉由各種長度的連接子與腺苷三磷酸雙磷酸酶劑的C末端融合，以優化表現水平並防止降解，並為各種迭代提供了如SEQ ID NO: 3和4所示的編碼小鼠IgG κ序列的序列，並插入到表現質體pSecTag2c中。

用線性化表現質體穩定地轉化HEK 293細胞，該質體提供了腺苷三磷酸雙磷酸酶膜聯蛋白V融合蛋白的表現，其中在連接子序列中具有變化。

使轉化體適應於無血清懸浮培養，並連續分離成更大的燒瓶。以0.5 x 10⁶ 個細胞/mL接種典型的懸浮培養物，在5至6天之內，HEK 293細胞通常生長超過3.5 x 10⁶ 個細胞/mL。每3-4天分離細胞，並收集條件培養基中的融合蛋白。將具有20 AA連接子的腺苷三磷酸雙磷酸酶膜聯蛋白V融合蛋白的生產規模擴大至3L旋轉器。

使用IMAC、Q和SP柱將蛋白質純化至均質。設計的各種連接子的胺基酸序列如下所示。＞ m0 （原始設計：被蛋白酶切割）

切割 |Anx V ＞ m1 ( 被蛋白酶切割 )

＞ m2 ( 未檢測到切割 )

＞m3 ( 未檢測到切割 )

對於原始設計的連接子，m0，由於培養基中存在的蛋白酶活性，約50%的純化蛋白在連接子區域中降解。進一步的研究表明，與pH值為7.4相比，低pH值（例如5.0）加速了降解。如m1所示，藉由引入G至T取代來設計抗蛋白酶的融合蛋白，當用檸檬酸鈉將澄清的上清液的pH值降至5時，m1仍易於受蛋白酶降解。如m2和m3所示，當將此突變與絲胺酸替換為丙胺酸或麩醯胺酸時，降解最小化。

根據表現水平的比較，還顯示出20個胺基酸的連接子係最有利的。

將表現水平與長度為5、10、15和20個胺基酸殘基的柔性連接子或9個胺基酸殘基的剛性連接子進行比較。

在SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳上從上述條件培養基的澄清上清液分離蛋白質。分析顯示融合蛋白表現與具有20AA的連接子的長度正相關，導致最高的表現。剛性連接子構建體也導致比具有20AA柔性連接子的變體更低的表現。具有該20AA連接子的胺基酸和核苷酸序列示於SEQ ID NO: 3。

實例2-10中使用的最終構建體具有核苷酸序列SEQ ID NO: 7，其中訊息序列編碼牛α乳清蛋白訊息肽。腺苷三磷酸雙磷酸酶-連接子-膜聯蛋白V的編碼融合體稱為APT402。 實例2 從CHO細胞中表現和純化APT402

用於產生融合蛋白APT402的構建體中的腺苷三磷酸雙磷酸酶劑係APT102。在CHO細胞中產生具有實例1中所述之20 AA連接子的腺苷三磷酸雙磷酸酶膜聯蛋白V融合體，其中牛α-乳清蛋白訊息肽的訊息序列來自SEQ ID NO: 7所示的構建體。如上所述，將腺苷三磷酸雙磷酸酶-連接子-膜聯蛋白蛋白命名為APT402。藉由用由康泰倫特公司（Catalent）（麥迪森，美國）製成的逆轉錄載體和表現逆轉錄載體質體進行CHO親本細胞系的四輪轉導來製備生產細胞系。池化的轉導細胞群體稱為CHO-S-APT402-R 4X池。將池化的群體細胞系的樣本冷凍保存。

對於10L生產，在指數生長期每3-4天傳代細胞系CHO-S-APT402-R 4X池，以擴大規模用於PFCHO LS（HyClone公司）中10 L Braun生物反應器。在PFCHO LS（HyClone公司）培養基中以約300,000-400,000個細胞/ml的細胞密度將細胞接種到兩個10 L生物反應器中。用於該研究的補料分批補充劑係HyClone PS307（12%（w/v）溶液）、AGT CD CHO 5X完全飼料培養基（英傑公司（Invitrogen））、20%葡萄糖溶液、200 mM L-麩醯胺酸、50X L-天冬醯胺溶液（15 g/L）/L-絲胺酸（10 g/L）、50X L-酪胺酸（4 g/L）/L-胱胺酸（2 g/L）溶液。

ANX層析。在培養的第12天從10 L容器中收穫10LBRX-3380-4X池-001。用10 mM Tris-Cl，pH 7.4洗滌柱以進行平衡。經Triton處理的培養基用等體積（6.60 L）的WFI稀釋以製備ANX負載。將負載（13.2 L）施加到柱上。然後用10 mM Tris，100 mM NaCl，pH 7.4洗滌柱，並收集3 L該洗滌液。用10 mM Tris，270 mM NaCl，pH 7.4洗脫APT402級分，並收集（2.37 L）。

SP Sepharose層析。將柱用1 M NaOH消毒一小時以上，然後用WFI洗滌柱。將柱在10 mM Tris，50 mM NaCl，20 mM CaCl₂ ，pH 7.4中平衡。將負載（添加ANX洗脫液 + 9.4 L的10 mM Tris，pH 7.4 + 34.5 g CaCl₂ 並攪拌20分鐘，11.75 L）施加到柱上，並收集流出物加洗滌液（約12 L）。用10 mM Tris，50 mM NaCl，pH 7.4洗滌柱，並重新建立基線。用10 mM Tris，300 mM NaCl，pH 7.4洗脫柱，並收集洗脫峰（1.0 L），呈透明無色溶液。

肝素Hyper D層析。用10 mM Tris，1 M NaCl，pH 7.4洗滌柱。然後將柱在10 mM Tris，pH 7.4中平衡。將負載（緩衝液交換的SP池，0.88 L）施加到柱上，並收集流出物加洗滌液（1.40 L）。用10 mM Tris，1 M NaCl，pH 7.4去除柱上的殘留蛋白質，並且也將其收集（約100 mL）。層析圖如下所示。使用Masterflex泵和Pellicon聚碸10K膜以不連續模式將肝素流出物體積（1.40 L）緩衝液交換到10 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4中。將SP池濃縮約7x至200 mL；用10 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4稀釋約10x至2.0 L；再次濃縮至200 mL；並再用10 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4稀釋約10x至2.0 L。在第三次濃縮至約100 mL之後，將過濾器用200 mL的10 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4沖洗，然後將其添加到滲餘物中。濃縮物的最終體積為300 mL，並且收集到約4.9 L的滲透液（為原始濃縮物體積的約24.5x）。使用Amicon攪拌池裝置，使用10 kD再生纖維素膜進一步濃縮滲餘物溶液。

蛋白質被純化至均質。最終回收率總體為約54%。生物負載為0 CFU，配製的批量中的內毒素測定為1.0 ＜ X ＜ 2.0 EU/mL或0.6 ＜ X ＜ 1.2 EU/mg。 實例3 APT402表現出與APT102相當的離體抗血小板活性和與膜聯蛋白V相當的離體因子X活化抑制

設計APT402來維持APT102和膜聯蛋白V的酶和生物學活性。使用孔雀石綠測定，我們發現APT402針對ATP和ADP的酶動力學參數與APT102的那些相當。同樣，APT402抑制ADP誘導的人血小板凝集，其效力與APT102相當（圖1）。藉由標準方法，使用從正常人供體和麻醉兔中純化的外周血單核細胞（PBMC），測定對FX活化的抑制活性。在兔和人PBMC中，對於APT402和膜聯蛋白V而言的LPS誘導的FX活化呈類似的劑量依賴性降低（圖2）。如預期的那樣，APT102對PBMC促凝活性沒有影響。 實例4 與單獨的APT102和膜聯蛋白V相比，APT402對活化的富含血小板的人血漿的凝血酶產生表現出協同抑制

根據Hemker等人開發之方法，使用Thrombinoscope系統（Synapse公司）藉由校準的自動血栓描記法（CAT）對檸檬酸化的富含人血小板的血漿（PRP）中的凝血酶產生進行定量。將PRP等分試樣與藥劑在室溫下孵育15分鐘，然後在96孔板的孔中於37°C孵育5分鐘。藉由添加0.5 pM組織因子和CaCl₂ 至16.7 mM來啟動凝血酶產生，並在微量滴定板螢光計（Fluoroskan Ascent，賽默電子公司（Thermo Electron Corp.），萬塔（Vantaa），芬蘭）中進行監測。使用凝血酶鏡軟體生成凝血酶圖（產生的凝血酶nM相比於時間）以及關鍵凝血酶產生參數：至凝血酶產生開始的滯後時間（分鐘）、凝血酶峰值濃度（nM）、至凝血酶峰值的時間（分鐘）和內源性凝血酶電位（ETP；血栓圖曲線下的積分面積）。

使用CAT測定法比較了等莫耳濃度的APT102、膜聯蛋白V、APT102 + 膜聯蛋白V和APT402對來自20 uM ADP活化人血小板的凝血酶產生的影響（圖3）。膜聯蛋白V顯著增加了達到凝血酶峰值的時間，同時適度降低了凝血酶峰值濃度。APT102對這兩個參數均具有適度的抑制作用。但是，APT102加膜聯蛋白V協同抑制了凝血酶產生，這顯著使達到凝血酶峰值的時間增加了4倍，而凝血酶峰值顯著減少了3倍。APT402模擬了該等特徵。 實例5 APT402在健康兔中單次推注給藥後顯示出快速起效

APT402以單次推注（0.40 mg/kg）IV注射到兩隻兔中。藥物動力學模型顯示對ADP酶活性的雙相指數曲線的最佳擬合（圖4）。投與後30分鐘在血漿中檢測到最大活性。APT402的分佈階段和消除半衰期（t_½ ）分別為30分鐘和6小時，這與膜聯蛋白V的分佈半衰期5分鐘和消除半衰期20分鐘（18倍）相比顯著延長。APT402的投與在IV給藥後10分鐘顯示出快速起效的作用，抑制95%的20 µM ADP誘導的離體血小板凝集，並且在給藥後1小時和6小時分別抑制90%和80%。該等數據表明，在半衰期相對較短的情況下，應以推注投與APT402，然後IV輸注以確保血栓形成的持續減弱。 實例6 連續IV輸注APT402可在健康兔中提供快速起效和作用抵消

初步數據表明，APT402具有短半衰期。然後在兔中將APT402作為單次推注（0.2 mg/kg）IV注射，然後以12和24 µg/kg/min IV輸注120分鐘。ELISA數據顯示，投與後30分鐘血漿中可檢測到APT402。APT402濃度、對ADP誘導的血小板凝集的抑制和凝血酶產生在輸注期間維持長達120分鐘，然後在中斷APT402輸注後60分鐘顯著降低（圖5、6、7）。在出血時間，ACT、PT、aPTT或血小板計數方面，經APT402處理的動物與對照動物之間沒有差異。數據表明，使用APT402進行30分鐘預處理可實現最佳治療，以確保減弱局部和全身血栓形成。 實例7 APT402在兔中優先定位在受傷動脈的血栓形成部位

將甲醇中的近紅外（NIR）螢光染料（LS288，Ex/Em 773/793）與APT402的官能胺（約1 : 1）軛合。純化的生物軛合物顯示一個螢光帶（圖8A）。對於藉由螢光分子層析成像（FMT）進行的血栓體內成像，如所述（CITE）使用了定製的基於纖維的可擕式視頻評定系統。在推注APT402（NIR標記的和未標記的APT402）後30分鐘，將陽極電流施加到頸動脈針狀電極上以開始血栓形成，然後以12 µg/kg/min IV輸注（這保持受傷的頸動脈通暢）2小時。三隻兔的平均螢光值和置信區間顯示在圖8B中。損傷部位與基線後由於經管腔針狀電極周圍形成血栓而導致的螢光增加約6-7倍有關。重要的是，發現APT402與血栓結合（圖8C）。相反，在未損傷的對照頸動脈中沒有增加的信號（數據未顯示）。因此，APT402專門針對動脈損傷和血栓形成的部位。NIR標記的APT402的組織分佈表明大部分標記被肝臟和脾臟攝取。 實例8 APT402在兔中在減弱動脈血栓形成方面比單獨或組合使用其他抗血小板或抗凝劑更有效，且不會增加出血風險

將兔隨機分為以下十一組，在電損傷前30分鐘開始治療。

第1組（n = 10）：	對照鹽水IV輸注2小時；
第2組（n = 6）：	氯吡格雷4 mg/kg口服和IV鹽水輸注；
第3組（n = 6）：	低分子量肝素（LMWH）0.7 mg/kg IV推注，然後1 mg/kg/h IV輸注；
第4組（n = 7）：	比伐盧定5 mg/kg IV推注，然後5 mg/kg/h IV輸注；
第5組：（n = 6）：	APT102 0.3 mg/kg IV推注（n = 2）或1.0 mg/kg IV推注（n = 4）；
第6組（n = 6）：	在電損傷前30分鐘開始APT402 0.2 mg/kg IV推注，然後4 µg/kg/min IV輸注2小時；
第7組（n = 6）：	在損傷時開始APT402 0.2 mg/kg IV推注，然後12 µg/kg/min iv輸注2小時。
第8組（n = 6）：	在損傷時開始APT402 0.2 mg/kg IV推注，然後24 µg/kg/min iv輸注2小時。
第9組（n = 6）：	替卡格雷10 mg/kg以羥丙基甲基纖維素（HPMC）口服，以及IV鹽水輸注。
第10組（n = 6）：	替卡格雷10 mg/kg以HPMC口服，以及比伐盧定5 mg/kg IV推注然後5 mg/kg/h IV輸注。
第11組（n = 6）：	HPMC口服和IV鹽水輸注。

用鹽水處理的兔中有60%在2小時內有電損傷產生的阻塞。平均血栓形成重量為7.8 mg。用APT402（12或24 ug/kg/min），替卡格雷，單獨或與比伐盧定組合治療完全預防阻塞（圖9）。APT402可劑量依賴性地降低血栓形成重量（圖10）。令人驚訝的是，以24 ug/kg/min的APT402進行治療導致比其他任何治療（包括替卡格雷加比伐盧定的組合）最低的血栓重量。同時，APT402不影響出血時間（圖11）、凝血酶原時間（圖12）、部分促凝血酶原激酶時間（圖13）、血壓（圖14）或心率（圖15）。 實例9 在靜脈血栓形成即深靜脈血栓形成（DVT）的急性鼠電損傷模型（EIM）中，APT402減弱靜脈血栓形成，而不會增加出血或誘導低凝狀態

靜脈血栓形成的電損傷模型用於急性研究（Diaz JA等人Thromb Haemost . [血栓形成和止血] 104: 366-375, 2010。

將小鼠隨機分為以下四組（n = 10個/組）。

1) 對照：第1天和第2天鹽水ip；

2) LMWH：第1天和第2天6 mg/kg/天sc；

3) APT402低劑量（LD）：ip推注0.2 mg/kg，然後sc輸注0.03 mg/kg/h 48小時；以及

4) APT402高劑量（HD）：ip推注0.2 mg/kg，然後sc輸注0.09 mg/kg/h 48小時。

EIM在所有小鼠中均持續產生IVC血栓形成，其中平均血栓重量為22.5 mg。DVT誘導後48小時測量血栓重量、BT、APTT和TCT。

與對照相比，LMWH的治療使血栓重量減少了57%，並且與以下相關：出血時間顯著延長了3倍，aPTT延長了2.5倍，並且TCT延長了2倍（圖16）。

在低劑量和高劑量時，APT402劑量依賴性地使血栓重量分別減少44%和65%。重要的是，APT402不會引起BT、aPTT或TCT的可檢測的延長（圖16）。類似地，每天1.0 mg/kg ip推注APT402持續2天也使血栓重量減少了53%，並且沒有增加出血時間。

該等數據表明，APT402係安全的，並且由於缺乏劑量限制性出血而比依諾肝素更有效地用於DVT治療。 實例10 APT402在DVT的慢性鼠電解損傷模型（EIM）中減少了纖維化並且沒有增加出血

在一項慢性纖維化研究中，將小鼠隨機且盲地分至以下組（n = 5-12/組）。

對照：

健康（n = 5）；

安慰劑（n = 12）：每天鹽水ip，持續14天；

APT402：每天1.0 mg/kg ip推注持續14天；以及

APT102：每天1.0 mg/kg ip推注持續14天。

DVT誘導後14天，膠原蛋白沉積物被Masson三色染色。與健康小鼠相比，EIM持續在所有小鼠中誘導IVC纖維化並且使平均膠原沉積增加了約6倍（圖17）。

用APT402和APT102治療分別使膠原蛋白沉積顯著減少了33%和11%。安慰劑組有1例死亡，而APT402和APT102組沒有觀察到死亡或出血增加或總體副作用。

該等數據表明APT402係安全的，並且可能是血栓形成後綜合症的有效治療。序列表 可溶性CD39L3 R67G T69R (APT102) SEQ ID NO: 1 - 核苷酸 SEQ ID NO: 2 - 胺基酸 gaggtcctccctccaggactgaagtatggtattgtgctggatgccgggtcttcaggg acc E  V  L  P  P  G  L  K  Y  G  I  V  L  D  A  G  S  SG Tcgc gtctacgtgtatcaatggccagcagaaaaagagaataataccggagtggtcagtcaaR V  Y  V  Y  Q  W  P  A  E  K  E  N  N  T  G  V  V  S  Q accttcaaatgtagtgtgaaaggctctggaatctccagctatggaaataacccccaagat T  F  K  C  S  V  K  G  S  G  I  S  S  Y  G  N  N  P  Q  D gtccccagagcctttgaggagtgtatgcaaaaagtcaaggggcaggttccatcccacctc V  P  R  A  F  E  E  C  M  Q  K  V  K  G  Q  V  P  S  H  L cacggatccacccccattcacctgggagccacggctgggatgcgcttgctgaggttgcaa H  G  S  T  P  I  H  L  G  A  T  A  G  M  R  L  L  R  L  Q aatgaaacagcagctaatgaagtccttgaaagcatccaaagctacttcaagtcccagccc N  E  T  A  A  N  E  V  L  E  S  I  Q  S  Y  F  K  S  Q  P tttgactttaggggtgctcaaatcatttctgggcaagaagaaggggtatatggatggatt F  D  F  R  G  A  Q  I  I  S  G  Q  E  E  G  V  Y  G  W  I 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W  V  P  G  S  T  G |小鼠Ig κ前導序列 -＞ gacgcgcccgaggtgctgcccccaggcctgaagtacgggatcgtcctggacgccggaagc D  A  P  E  V  L  P  P  G  L  K  Y  G  I  V  L  D  A  G  S |可溶性CD39L3 R69G T69R -＞ tccggtacccgggtctatgtgtaccagtggcccgccgaaaaggagaacaatacaggcgtg S  G  T  R  V  Y  V  Y  Q  W  P  A  E  K  E  N  N  T  G  V gtgtcacaaaccttcaagtgttcagtcaaaggtagtggaatttcttcatatgggaacaat V  S  Q  T  F  K  C  S  V  K  G  S  G  I  S  S  Y  G  N  N ccccaggatgtgcctagggcatttgaggaatgtatgcagaaagtcaagggccaggtccca P  Q  D  V  P  R  A  F  E  E  C  M  Q  K  V  K  G  Q  V  P tctcatctgcatggttcaactcccatccatctgggtgccactgcaggaatgaggctgctg S  H  L  H  G  S  T  P  I  H  L  G  A  T  A  G  M  R  L  L cggctgcagaatgaaaccgcagccaacgaggtcctggaatccattcaaagttacttcaag R  L  Q  N  E  T  A  A  N  E  V  L  E  S  I  Q  S  Y  F  K tcccaaccttttgacttccgaggcgctcaaattatcagtggtcaggaagagggagtctat S  Q  P  F  D  F  R  G  A  Q  I  I  S  G  Q  E  E  G  V  Y ggctggatcaccgcaaactacctgatgggtaattttctggagaagaacctgtggcatatg G  W  I  T  A  N  Y  L  M  G  N  F  L  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無

[圖1A和1B]顯示了按照原樣使用的腺苷三磷酸雙磷酸酶APT102及其融合蛋白APT402對離體反應混合物中血小板凝集的影響，該反應混合物包含用20 µM ADP活化的富含人血小板的血漿（PRP）。顯示了APT102相比於APT402對ADP誘導的人血小板凝集的抑制效力相當。X軸係測定時間（6分鐘的持續時間），Y軸係光透射。(A) APT102劑量依賴性地抑制5 mM ADP誘導的血小板凝集。(B) APT402劑量依賴性地抑制5 mM ADP誘導的血小板凝集。箭頭指示添加ADP和腺苷三磷酸雙磷酸酶。

[圖2]顯示了PBMC中APT402相比於膜聯蛋白對因子X活化的抑制活性。顯示了APT402相比於膜聯蛋白V對LPS誘導的促凝血活性的抑制效力相當。將外周血單核細胞與LPS（1 mg/ml）孵育，以誘導在FVII、FX和生色底物S2765存在下測量的組織因子表現和FX活化。

[圖3]顯示了膜聯蛋白V和APT102對減弱凝血酶產生的協同作用。顯示的是用20 mM ADP活化的富含人血小板的血漿中產生的納莫耳凝血酶的血栓圖（thrombograms）。APT402或APT102加膜聯蛋白V的治療顯示出相當的抑制作用。該等結果優於單獨使用APT102或膜聯蛋白V獲得的結果。

[圖4]顯示了兔（n = 2）靜脈內推注0.4 mg/kg APT402的PK分析。

[圖5]顯示了在兔中以0.2 mg/kg推注然後連續IV輸注120分鐘的APT402的PK分析（ELISA）。

[圖6]顯示了以0.2 mg/kg推注APT402隨後以24 μg/kg/min持續120分鐘抑制富含兔血小板的血漿中ADP誘導的（50 uM）血小板凝集。在60和110分鐘時，凝集被有效抑制，並在180分鐘時恢復到基線水平。

[圖7]顯示在兔中以0.2 mg/kg推注隨後以24 μg/kg/min輸注120分鐘的APT402減弱凝血酶產生。凝血酶的產生在60和110分鐘時有效減弱，但在180分鐘時恢復到基線水平。

[圖8A-8C]顯示APT402較佳的是定位在受傷動脈的血栓形成部位。A. APT402與螢光染料（LS288）軛合；B. 以0.2 mg/kg推注隨後以12 mg/kg/min持續120分鐘的APT402處理的兔的受傷動脈中的螢光強度。每個柱代表3個讀數的平均值。C. APT402較佳的是結合血栓。

[圖9]顯示了兔的電損傷模型（EIM）中的對照組和各種治療組的阻塞率。以12或24 ug/kg/min的APT402進行治療可完全防止阻塞。

[圖10]顯示了兔的EIM中的對照組和各種治療組的動脈血栓重量（mg）。以24 ug/kg/min的APT402治療比單獨或組合使用的任何其他治療更有效。

[圖11]顯示，APT402在完全防止阻塞的劑量下未延長出血時間（BT）（BT測量上限：5分鐘），而單獨或與比伐盧定（bivalirudin）組合的氯吡格雷（clopidogrel）、LMWH、比伐盧定和替卡格雷（ticagrelor）則延長了出血時間。

[圖12]顯示了有效劑量的APT402在兔中不影響凝血酶原時間，而比伐盧定單獨或與替卡格雷組合則增加凝血酶原時間。

[圖13]顯示了有效劑量的APT402在兔中不影響部分促凝血酶原激酶時間，而LMWH、比伐盧定、替卡格雷單獨或與比伐盧定組合則增加部分促凝血酶原激酶時間。

[圖14]顯示了APT402不影響平均動脈壓（毫米汞柱；mmHg）。

[圖15]顯示了APT402不影響心率（每分鐘心跳；BPM）。

[圖16A-16D]顯示了APT402對EIM後遺症對深靜脈血栓形成（DVT）之影響。

[圖17]顯示了APT402對EIM降低的DVT中膠原沉積的作用。

無

Claims (27)

1. 一種組成物，該組成物包含腺苷三磷酸雙磷酸酶和結合活化的血小板表面上的磷脂醯絲胺酸（PS）的膜聯蛋白，該腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白以一起有效抑制血栓形成而不增加出血的量存在。
2. 如請求項1所述之組成物，其中該腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白以等莫耳量存在。
3. 如請求項2所述之組成物，其中該腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白共價偶聯。
4. 如請求項1-3中任一項所述之組成物，其中該腺苷三磷酸雙磷酸酶係可溶性CD39L3或其具有增強的ADP酶活性的經修飾形式。
5. 如請求項4所述之組成物，其中該腺苷三磷酸雙磷酸酶係經修飾形式的可溶性CD39L3，其中所述修飾由胺基酸位置67和69處的取代組成。
6. 如請求項4所述之組成物，其中所述取代係R67G和T69R。
7. 如請求項6所述之組成物，其中該腺苷三磷酸雙磷酸酶係APT102（SEQ ID NO: 2）。
8. 如請求項1-7中任一項所述之組成物，其中該膜聯蛋白係膜聯蛋白IV或V。
9. 如請求項3-8中任一項所述之組成物，其中該腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白藉由連接子肽共價偶聯以形成融合蛋白。
10. 如請求項9所述之組成物，其中該連接子肽含有3-30個胺基酸。
11. 如請求項10所述之組成物，其中該連接子肽含有15-25個胺基酸。
12. 如請求項9-11中任一項所述之組成物，其中該連接子肽對血漿和/或細胞培養上清液中的水解具有抗性。
13. 如請求項12所述之組成物，其中該連接子肽具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列。
14. 如請求項13所述之組成物，其中該融合蛋白係APT 402（SEQ ID NO: 10）。
15. 一種核酸，該核酸編碼如請求項3-14中任一項所定義的融合蛋白。
16. 如請求項15所述之核酸，該核酸進一步包含用於表現的控制序列。
17. 一種重組宿主細胞或載體，該重組宿主細胞或載體含有如請求項16所述之核酸。
18. 一種產生包含藉由連接子肽共價偶聯的腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白的融合蛋白之方法，該方法包括培養如請求項15所述之宿主細胞並從培養物中回收該融合蛋白。
19. 一種融合蛋白，該融合蛋白藉由如請求項18所述之方法產生，包含藉由連接子肽共價偶聯的腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白。
20. 一種治療經歷血栓形成的受試者或經受有過度出血風險的手術的受試者之方法，該方法包括向所述受試者投與有效量的如請求項1-14中任一項所述之組成物或如請求項19所述之融合蛋白。
21. 如請求項18所述之方法，該方法包括向所述受試者投與有效量的APT 402（SEQ ID NO: 10）。
22. 如請求項21所述之方法，其中所述投與係靜脈內（IV）投與。
23. 如請求項22所述之方法，其中所述方法係推注然後IV輸注。
24. 一種治療經歷血栓形成的受試者或經受有過度出血風險的手術的受試者之方法，該方法包括向所述受試者投與有效量的腺苷三磷酸雙磷酸酶和結合活化的血小板表面上的磷脂醯絲胺酸（PS）的膜聯蛋白的組合，所述腺苷三磷酸雙磷酸酶和膜聯蛋白的量一起有效抑制血栓形成而不增加出血。
25. 如請求項24所述之方法，其中該腺苷三磷酸雙磷酸酶係APT 102（SEQ ID NO: 2）並且該膜聯蛋白係膜聯蛋白V。
26. 如請求項24所述之方法，其中該投與係同時的。
27. 如請求項24所述之方法，其中該投與係順序的。

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