JP2023516196A - 動脈及び静脈血栓症を治療するための相乗作用標的化組成物 - Google Patents

Abstract

その融合タンパク質を含むアピラーゼとアネキシンとの組み合わせは、望ましくない出血を誘発しない相乗性抗血栓薬である。

Description

本発明は、出血が最小限であるべきである、心臓発作、脳卒中、及び外科手術の合併症などの望ましくない血栓症を特徴とする状態の治療の分野におけるものである。具体的には、本発明は、血栓症を予防又は治療するために、アピラーゼと共に、プロトロンビナーゼ複合体と競合して、活性化血小板の表面上のホスファチジルセリンに結合する因子を投与することを目的とする。

本発明の方法によって治療される関連する状態は、動脈血栓症及び静脈血栓症の両方である。

動脈血栓症の場合は、冠動脈バイパス手術（ＣＡＢＧ）を受ける患者の術中血液凝固を防ぐために、高濃度の非分画ヘパリンが通常用いられる。プロタミン拮抗を使用するにもかかわらず、ヘパリン治療は術後出血を増加させ、患者の約３０％がＣＡＢＧ後に輸血を必要とする。その他の抗血栓療法も、術後出血のリスクを著しく増加させる。クロピドグレル（商標名：Ｐｌａｖｉｘ）、プラスグレル（商標名：Ｅｆｆｉｅｎｔ）、チカグレロル（商標名：Ｂｒｉｌｉｎｔａ）、及びイブプロフェンは、一般的には冠動脈手術前の数日間は中断される。ワルファリン（商標名：Ｃｏｕｍａｄｉｎ）、アピキサバン（商標名：Ｅｌｉｑｕｉｓ）、リバーロキサバン（商標名：Ｘａｒｅｌｔｏ）、エドキサバン（商標名：Ｓａｖａｙｓａ）、又はダビガトラン（商標名：Ｐｒａｄａｘａ）を服用する患者は、手術前にその服用を中止すべきである。このため、術中又は術後出血を引き起こすことのない抗血栓治療が非常に必要とされている。

以前にはステント血管形成術として知られる、経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）中の現行の補助抗血栓療法も、大量出血を増加させる。冠動脈疾患は、心電図上のＳＴ上昇型急性心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）の存在によって診断され得る。血小板は、血栓性合併症において中心的な役割を果たす（非特許文献１）。この状態に対する治療は、正常な冠動脈血流を回復すること、及び機能的心筋のサルベージを最大化することを目的とする。

現行の米国及び欧州ガイドラインは、二重抗血小板薬及び抗凝血薬を含む補助療法と共にプライマリＰＣＩを推奨している。しかしながら、現在利用可能な抗血小板活性を有する薬剤は、ＳＴＥＭＩ患者の約４０％～５０％で作用の発現が遅れ（非特許文献２）、また、全ての組み合わせが、出血を増加させる作用機序を有する。最近の臨床試験では、患者のうち１１％～１２％が大量出血を経験している（非特許文献３）。加えて、現行の抗血栓薬（すなわち、抗血小板薬と抗凝血薬との組み合わせ）のいずれも、虚血後の冠動脈血流の回復に伴う心筋梗塞として定義される再灌流障害を防御しない。再灌流障害は、心筋梗塞の最終サイズの最大５０％を占め、関連する心機能障害を生じされる。これは、最適な冠動脈再灌流にもかかわらず、ＡＭＩ後の死亡率が１０％近くになり、心不全の発生率がほぼ２５％である理由を説明することができる（非特許文献１、非特許文献４、非特許文献５）。

したがって、出血を増加させることなく再灌流を促進し、同時に再灌流障害を減弱させ、心筋のサルベージ及び左心室機能の回復を改善して、それにより心不全の発生率を低下させる、ＰＣＩの補助剤としての即効性治療薬に対する、長年の切実な満たされていない医学的ニーズが存在する。

左心室補助装置（ＬＶＡＤ）は、末期心不全に達した患者に用いられるポンプである。ＬＶＡＤはバッテリー駆動の機械式ポンプであり、外科的に埋め込まれて、左心室（心臓の主要なポンプ室）が身体の残部に血液を圧送するのを補助する。ＬＶＡＤを、心臓が利用可能になるまで使用してもよく、又は、患者は、患者を延命してその生活を改善することのできる、ＬＶＡＤを用いた長期治療を受けてもよい。生存、機能的能力、及び生活の質が著しく改善されたにもかかわらず、ポンプ血栓症、脳卒中、及び出血はよく見られる合併症である。現行の抗血栓薬の全てが出血のリスクを増加させるため、血栓症の予防と出血の増加とのバランスを取る最適な抗血栓療法の実現は、現在も続く課題である。

外科手術を受ける、慢性抗血栓療法を投与中の患者に対しては、現行の臨床的勧告は、これらの薬剤が過剰出血のリスクを増大させるため、外科手術前の抗血栓療法を中断することを提言している。例えば、ＣＡＢＧが必要な患者における外科手術時間前後のアスピリンの中止、外科手術の４～６時間前の患者における非分画ヘパリンの中止、外科手術の２４時間前の患者における低分子量ヘパリンの最終投与。しかしながら、これらの抗血栓治療の中断も、高致死率となり得る肺塞栓などの術中血栓症のリスクを増加させる。現在、術中管理のために安全に用いることのできる抗血栓治療は存在しない。

同様の不利益が、治療が大量出血事象の増加によって悩まされ、静脈壁肥厚又は線維症に対して最小限の防御しか提供しないという点において、静脈血栓塞栓症に対する抗凝血薬治療に関しても見られる。深部静脈血栓症（ＤＶＴ）及び肺塞栓（ＰＥ）を含む静脈血栓塞栓症は、全世界における罹患及び死亡の主要源である。

現行のＤＶＴの予防及び治療は、非経口抗凝血薬、例えばヘパリンの投与であり、これはその後ワルファリンなどの経口抗凝血薬に移行する（非特許文献１、非特許文献６）。その他の薬剤も用いられており、例えば、リバーロキサバンが短期治療及び長期治療の両方に認可されている（非特許文献７、非特許文献３）が、どれも出血をもたらす作用機序を有するため、投与可能な用量は制限されている。加えて、現行の治療は、静脈壁肥厚及び線維症に続いて発生する、障害のある静脈弁によって生じた血液逆流、溢流閉塞（ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、及び組織低酸素を特徴とする血栓後症候群（ＰＴＳ）を有効に防御しない（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。

ＤＶＴの影響は、老齢人口の増加と共に増大している。２００５年、米国上院は、３月を「深部静脈血栓症啓蒙月間」に指定した。明らかに、ＤＶＴの健康及び経済的負担は大きく、ＤＶＴ患者は、増加する出血リスクによって制限されず、同時にＰＴＳを減弱させることのできる有効な抗血栓薬から大きな利益を得るであろう。

下記で説明するように、本発明の組成物及び方法は、この満たされていない医学的ニーズに対する解決も提供する。

血栓症に伴う状態を治療するためのアピラーゼ、具体的には可溶性ＣＤ３９Ｌ３及びその修飾物の使用は、特許文献１、特許文献２、及び特許文献３で開示されている。出血状態に対する療法としてのアピラーゼの使用は特許文献４で開示されており、可溶性ＣＤ３９Ｌ３をベースとするアピラーゼの改良形態は特許文献５に開示されている。加えて、線維増殖性障害、肺高血圧症、及び心不全に対するアピラーゼ療法が、現在係属中の特許文献６で開示されている。

プロトロンビナーゼ複合体の結合と競合して、活性化血小板の表面上のホスファチジルセリンと結合することが知られているタンパク質であるアネキシンＶは、アネキシンＶに反応する抗体が、例えば、全身性エリテマトーデスを患う患者における動脈及び／又は静脈血栓症に影響を与えるという申し立てを考慮すると、血栓症の予防及び治療に関連すると考えられる（非特許文献１１）。実際には、アネキシンＶの現在の主な用法はアポトーシスのための標識としてのものであるが、アネキシンＶはプロトロンビンの活性化を阻害し、通常の静脈及び動脈血流条件下で血栓の形成を予防できることが理解される。アネキシンＶに反応する抗体は、１型糖尿病を患う患者において血栓性合併症をもたらすことが示されている。（非特許文献１２）。

現在では、アネキシンＶ、又は活性化血小板の表面上のホスファチジルセリンと結合するその他のアネキシン、及びアピラーゼは、それ自体として組み合わせで投与されると、或いは単一の融合タンパク質として投与されると、相乗的な抗血栓効果を発揮し、望ましくない出血を増進しないことが判明している。

したがって、この組み合わせは、動脈血栓症及び静脈血栓症の両方の治療に現在伴われる問題に対する解決となる。融合タンパク質としてのアピラーゼと結合したアネキシンＶの特定の実施形態も、組換え産生に関する好ましい性質を示すことが判明している。

本明細書で引用される全ての文書は、参照によりその全体が組み込まれる。

米国特許第７，２４７，３００号明細書 米国特許第７，３９０，４８５号明細書 米国特許第８，０２１，８６６号明細書 米国特許第８，５３５，６２２号明細書 米国特許第８，７７１，６８３号明細書 米国特許出願第１４／６６６，１２１明細書

Ｈｅｉｔ，ＪＡ，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ（２００５）３：１６１１－１６１７ Ｒｉｔｅａｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ（２０１０）１８２：７７４－７８３ Ｕｆｅｒ，Ｍ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ（２０１０）１０３：５７２－５８５ Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓ，ＡＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍａｎａｇ Ｃａｒｅ Ｐｈａｒｍ（２００７）１３：４７５－４８６ Ｍａｒｃｕｓ，ＡＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ（２００５）３１：２３４－２４６ Ｋｙｒｌｅ，ＰＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（２００５）３６５：１１６３－１１７４ Ｐｅｒｚｂｏｒｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１１）１０：６１－７５ Ｐｏｐｕｒｉ，ＲＫ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ（２０１１）３１：４７９－４８４ Ｓａａｒｉｎｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ（２０００）４１：４４１－４４６ Ｄｅａｔｒｉｃｋ，ＫＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ ２０１１ ５３：１３９－１４６ Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖ（２００５）４：５５－６０ Ｂａｋａｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ（２０１４）９９：９３２－９３７

一態様では、本発明は、アピラーゼ、及び活性化血小板の表面のホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するアネキシンを含む組成物であって、上記のアピラーゼ及びアネキシンは、合わせて、出血を増加させることなく血栓症を阻害するのに有効な量で投与される、組成物に関する。

アネキシンとアピラーゼとの組み合わせは、アピラーゼとアネキシンとが共有結合した単一分子の形態で投与されることもできる。

このような共有結合した組み合わせの産生の容易さに関して、アピラーゼ及びアネキシンがリンカーペプチドを介して共有結合して融合タンパク質を形成し、特にここでリンカーペプチドが血漿及び／又は細胞培養上清中で加水分解に耐性があることが有利である。

本発明は、アピラーゼとアネキシンとの共有結合形態の組換え産生であって、こうした組換え産生に関連する材料を含む、組換え産生、及び本発明の組成物を用いて血栓症を経験しているか又は血栓症のリスクがある対象を治療するための方法も目的とする。

図１Ａ及びＢは、２０μＭのＡＤＰで活性化されたヒト血小板豊富血漿（ＰＲＰ）を含むエクスビボ反応混合物中の血小板凝集に対する、そのままで用いられたアピラーゼＡＰＴ１０２、及びその融合タンパク質であるＡＰＴ４０２の効果を示す。ＡＰＴ１０２対ＡＰＴ４０２によるＡＤＰ誘導性ヒト血小板凝集の同等の阻害能力が示されている。Ｘ軸はアッセイ時間であり（６分の時間長）、Ｙ軸は光透過率である。（Ａ）ＡＰＴ１０２は、５ｍＭ ＡＤＰによって誘導される血小板凝集を用量依存的に阻害する。（Ｂ）ＡＰＴ４０２は、５ｍＭ ＡＤＰによって誘導される血小板凝集を用量依存的に阻害する。矢印は、ＡＤＰ及びアピラーゼの添加を示す。 図２は、ＰＢＭＣ中のＡＰＴ４０２対アネキシンのＸ因子活性化に対する阻害活性を示す。ＡＰＴ４０２対アネキシンＶによるＬＰＳ誘導性凝血促進活性の同等の阻害能力が示されている。ＦＶＩＩ、ＦＸ、及び発色性基質Ｓ２７６５の存在下で測定した組織因子の発現及びＦＸの活性化を誘導するために、末梢血単核細胞を、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｍｌ）でインキュベートした。 図３は、トロンビン生成の減弱に対するアネキシンＶ及びＡＰＴ１０２の相乗効果を示す。２０ｍＭ ＡＤＰで活性化したヒト血小板豊富血漿中で生成されたナノモルのトロンビンのトロンボグラムが示される。ＡＰＴ４０２又はＡＰＴ１０２及びアネキシンＶでの処置は、同等の阻害効果を示す。これらの結果は、ＡＰＴ１０２又はアネキシンＶのみで得られたものよりも優れている。 図４は、０．４ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．ボーラス注射の場合の、ウサギ（ｎ＝２）におけるＡＰＴ４０２のＰＫ分析を示す。 図５は、ウサギにおける、０．２ｍｇ／ｋｇのボーラス注射、及びそれに続く１２０分間の連続ＩＶ注入を用いるＡＰＴ４０２のＰＫ分析（ＥＬＩＳＡ）を示す。 図６は、０．２ｍｇ／ｋｇボーラスのＡＰＴ４０２、及びそれに続く１２０分間の２４μｇ／ｋｇ／分を用いた、ウサギの血小板豊富血漿中のＡＤＰ誘導性（５０ｕＭ）血小板凝集の阻害を示す。凝集は６０分及び１１０分で効果的に阻害され、１８０分でベースラインレベルに戻った。 図７は、ウサギにおける、０．２ｍｇ／ｋｇボーラスのＡＰＴ４０２、及びそれに続く１２０分間にわたる２４μｇ／ｋｇ／分の注入を用いたトロンビン生成の減弱を示す。トロンビン生成は６０分及び１１０分で効果的に減弱されたが、１８０分でベースラインレベルに戻った。 図８Ａ～Ｃは、ＡＰＴ４０２が、好ましくは損傷した動脈の血栓部位に局在することを示す。Ａ．ＡＰＴ４０２を蛍光色素（ＬＳ２８８）にコンジュゲートした；Ｂ．０．２ｍｇ／ｋｇのボーラス、及びそれに続く１２０分間の１２ｍｇ／ｋｇ／分のＡＰＴ４０２で処置したウサギの損傷した動脈における蛍光強度。各バーは３つの読み取り値の平均値を表す。Ｃ．ＡＰＴ４０２は、好ましくは血栓に結合する。 図９は、ウサギにおける電気損傷モデル（ＥＩＭ）における対照及び様々な処置群の閉塞率を示す。１２又は２４μｇ／ｋｇ／分のＡＰＴ４０２による処置は、閉塞を完全に予防した。 図１０は、ウサギにおけるＥＩＭにおける対照及び様々な処置群の動脈血栓重量（ｍｇ）を示す。２４μｇ／ｋｇ／分のＡＰＴ４０２による処置は、単体でも組み合わせでも、任意の他の処置よりも効果的であった。 図１１は、ＡＰＴ４０２が、閉塞を完全に予防する用量で出血時間（ＢＴ）を長期化させず（ＢＴ測定限度：５分間）、一方でクロピドグレル、ＬＭＷＨ、ビバリルジン、及びチカグレロル（単体又はビバリルジンとの組み合わせ）は、出血時間を長期化させたことを示す。 図１２は、有効用量のＡＰＴ４０２が、ウサギにおけるプロトロンビン時間に影響を及ぼさず、一方でビバリルジンは、単体でもチカグレロルとの組み合わせでもプロトロンビン時間を増加させたことを示す。 図１３は、有効用量のＡＰＴ４０２がウサギにおける部分トロンボプラスチン時間に影響を及ぼさず、一方でＬＭＷＨ、ビバリルジン、チカグレロル（単体又はビバリルジンとの組み合わせ）は部分トロンボプラスチン時間を増加させたことを示す。 図１４は、ＡＰＴ４０２が平均動脈圧に影響を及ぼさないことを示す（水銀柱ミリメートル；ｍｍＨｇ）。 図１５は、ＡＰＴ４０２が心拍数に影響を及ぼさないことを示す（毎分脈拍；ＢＰＭ）。 図１６Ａ～Ｄは、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）に対するＥＩＭの後遺症に対するＡＰＴ４０２の効果を示す。 図１７は、ＥＩＭにより低減したＤＶＴにおけるコラーゲン沈着に対するＡＰＴ４０２の効果を示す。

本発明は、動脈血栓症及び静脈血栓症の両方の予防又は治療に予想外の相乗効果を有する、抗血小板及び抗凝血薬タンパク質であるアピラーゼ及びアネキシンの組み合わせ作用を利用する。この組み合わせは、市販の抗血栓薬に伴う問題を解決し、また具体的には、これらの市販の抗血栓薬と比較して、出血増進の回避に関してより好ましいプロファイルを有する。加えて、本発明は、アピラーゼ及びアネキシンが追加のアミノ酸配列によって結合する比類のない融合タンパク質を含む。融合タンパク質として産生される場合、本発明は、組換え産生された時のその発現レベルの点、並びに組換え培養物中及び血漿中の両方でのタンパク質分解に対するその耐性の点において、その有利な形態を含む。これらの特徴は、アネキシン構成要素とアピラーゼ構成要素との間に提供されたリンカーに依存しているものと思われる。

構成要素
一般的に、血小板の活性化及び凝集を阻害する任意のアピラーゼを用いることができる。こうしたアピラーゼに関する考察は、米国特許第７，３９０，４８５号明細書で見出され得る。ＣＤ３９Ｌ３の可溶性形態の特定の変異体は特に有用である。

アピラーゼの特に有用な形態は、ＣＤ３９Ｌ３の可溶性形態であり、その配列は米国特許第７，３９０，４８５号明細書に開示されている。完全長ＣＤ３９Ｌ３及びその推定アミノ酸配列は、その中のそれぞれ配列番号５５及び配列番号５６である。可溶性形態は、本特許に、並びにその中の配列番号５９としてのコーディングヌクレオチドの配列及び配列番号６０としての推定アミノ酸配列の配列にも開示されている。

’４８５特許は、可溶性ＣＤ３９及び可溶性ＣＤ３９Ｌ３の両方の部位特異的変異誘発も説明している。本発明で特に有用なのは、６７位及び６９位のアミノ酸が変異した、可溶性ＣＤ３９Ｌ３の変異形態である。可溶性ＣＤ３９Ｌ３のこれらの変異体のうち２つは、Ｒ６７Ａ Ｔ６９Ｒ及びＲ６７Ｇ Ｔ６９Ｒである。可溶性ＣＤ３９Ｌ３のＲ６７Ｇ Ｔ６９Ｒは、特に好ましい二重変異体である。この配列の「改良」形態は、米国特許第８，７７１，６８３号明細書に開示されており、関連するヌクレオチド及びアミノ酸配列は、本明細書でそれぞれ配列番号１及び２として複製される。この実施形態は、ＡＰＴ１０２と指定される。

本発明で有用なアネキシン構成要素は、活性化血小板上のホスファチジルセリンに結合するアネキシンＶである。アネキシンは、類似した構造を有するが、様々な生理学的活性を有する、タンパク質の大ファミリーのメンバーである。アネキシンＶの上記の性質を示す任意のアネキシンを本発明で用いることができる。これらのアネキシンをコードする天然の又は最適化されたヌクレオチド配列を含むこれらのアネキシンの構造は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、選択されたアネキシンは、処置の対象と同じ種からなることになる。

本発明の構成要素の産生
一般的には、組換え技術を用いて本発明で有用な構成要素を産生することが都合よい。これは、アピラーゼ及びアネキシンが共有結合されている実施形態の場合に特に当てはまる。こうしたタンパク質の組換え技術は、現時点では当該技術分野で周知されており、組換え産生は、培養物及び多細胞生物のインサイチュ位置における、動物、植物、及び微生物細胞を含む様々な細胞及び環境で実施することができる。したがって、本発明は、これらの構成要素を産生するための組換え材料、例えば好適な制御配列、ベクター、これらを有する宿主細胞を含む発現系などを含む。

本発明の組成物のインビボ投与
本発明の組成物は、ヒト及びその他の哺乳動物を含む温血動物、並びに家禽（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｖｉａｎ）種に投与され得る。これらとしては、例えばコンパニオンアニマル又は家畜が挙げられ得る。ヒトの病気を治療する場合、有資格医師が、確立されたプロトコルを使用して、本発明の組成物が、用量、スケジュール、及び投与経路の点でどのように利用されるべきかを判断する。その他の種においては、獣医が類似の役割をすると想定される。こうした適用では、用量増加が用いられてもよい。

好ましくは、本発明の医薬組成物は非経口で、すなわち、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内に投与される。より好ましくは、医薬組成物は、ボーラス又は注入注射（ｉｎｆｕｓｉｏｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって静脈内又は腹腔内投与される。

本発明の医薬組成物は、標準の技法に従って調製され、安定性を改善するための糖タンパク質、例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含む、水、緩衝用水、生理食塩水、グリシン、デキストロース、等浸透圧スクロース溶液などを含んでもよい。これらの組成物は、従来の公知の滅菌技法によって滅菌してよい。得られた水溶液は、使用のために包装するか又は無菌条件下で濾過して凍結乾燥し、凍結乾燥した調製物は投与前に滅菌水溶液と混合してよい。この組成物は、生理学的条件と近づけるために必要な薬学的に許容できる補助物質、例えばｐＨ調整剤、及び緩衝剤、等張化剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを含有してよい。

薬学的配合物中の本発明の構成要素の濃度は、約０．０５重量％未満からはじまり、通常は約２～５重量％又は少なくとも約２～５重量％から１０～３０重量％程度まで広範に変化し得、選択された特定の投与方法に従い、主に液量、粘度などに基づいて選択される。例えば、処置に伴う流体負荷を低下させるために、濃度を増加させてもよい。

好ましくは、本発明の医薬組成物は静脈内投与される。送達ビヒクル配合物の投与量は、薬物と脂質との比率、並びに患者の年齢、体重、及び状態に基づく投与担当医師の意見に応じて変化する。１つの好ましいプロトコルは、ボーラスＩＶ投与、及びそれに続く長時間ＩＶ注入を含む。

医薬組成物に加えて、獣医学的用途の好適な配合物を、対象に適した方法で調製及び投与することができる。好ましい獣医学的対象としては、哺乳動物種、例えば非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及び家禽類が挙げられる。対象としては、実験動物、例えば、特にラット、ウサギ、マウス、及びモルモットも挙げられ得る。

適応症
本発明の組成物は、出血多量を引き起こすことなく血栓症を治療又は予防すべき対象で有用である。これとしては、限定するものでないが、外科手術、例えば、ＣＡＢＧを含む胸部手術、及び高い血栓リスクを伴う大手術、又は留置したカテーテル若しくは装置の配置上の凝固に対する予防として抗血栓治療が施される外科手術若しくは医学研究（例えば、電気生理学的研究、ペースメーカー植え込み、経皮心臓弁の設置又は修理）が挙げられる。本発明の組成物で治療すべき対象としては、ＰＣＩ又は血栓溶解を用いた血管再生／再灌流治療を受ける、ＳＴＥＭＩを含む心筋梗塞を患う対象、及び、ＰＣＩを用いた冠動脈血管再生を受ける、安定又は不安定な冠動脈疾患を患う対象も挙げられる。好適な対象は、ステント留置術を伴うか又は伴わない、末梢血管移植又は腔内バルーン血管形成による血管再生術を受ける、末梢血管疾患を患う対象、並びに、対象が経口抗血栓治療を持続することができない場合の絶食中及び外科処置中のブリッジング戦略／術中管理としての長期的な抗血栓療法を受けている対象、例えば心房細動を患い、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）の治療／予防下にあり、従って血栓合併症の高いリスクがある対象である。

本組成物は、整形外科手術及び骨折治療、並びに動けない対象、急性又は慢性疾患（癌を含む）及び血栓症の高いリスクを有する対象に関連する予防的治療を含む、深部静脈血栓症及び肺塞栓を含むＶＴＥの予防又は治療としても有用である。加えて、本発明の組成物は、潜在的な再灌流治療の前、その最中、又はその後を含む（が、再灌流治療が用いられなかった場合も含む）、のみならず、慢性血栓塞栓性肺疾患／高血圧症（ＣＴＥＰＨ）を患う対象における治療又は肺血管形成処置中を含む、ヘパリン誘導性血小板減少症（ＨＩＴ）を患う対象、及び標準治療に加えて追加の抗血栓治療を必要とする、急性の虚血性脳卒中を患う対象を治療するために用いられる。

脳卒中は、急性虚血性脳卒中、血栓溶解又は血栓摘出による再灌流に関連する大及び／又は小血管閉塞虚血性脳卒中、塞栓性脳卒中に関連する組織破壊の予防、並びに改善された神経機能及び転帰のため、並びに脳卒中の高いリスクを伴う急性の一過性脳虚血発作を患う患者における再発性脳卒中の予防のためを含むが、これらに限定されなくてもよい、脳虚血又は頭蓋内出血に起因する神経機能の喪失として定義される。

キット
本発明の組成物で用いられるアピラーゼ及びアネキシンは、個々の組成物中で、又は同じ組成物中で個別に配合してもよく、或いは共有結合される。個別の組成物は、同時又は順次に個別に対象に投与され得る。個別の容器中で、アピラーゼを含む第１の容器に第１の組成物、及び、第２の容器に、好適なアネキシンを含む第２の組成物を含むキットを、続いてキットへとパッケージ化してよい。

キットはまた、少なくとも投与される各組成物の量の比率の説明を含む、対象への組成物の投与方法に関する指示を含む。一実施形態では、等モル量が投与される。しかしながら、アピラーゼとアネキシンとのモル比は、これらの構成要素の選択に応じて変わり、アピラーゼ：アネキシンの場合は１０：１～１：１０で変化し得る。或いは、又は加えて、キットは、他方の容器の含有量と組み合わせた一方の容器の含有量が正しい比率を表すように、各容器内の組成物の量が予め測定されるように、構築される。或いは、又は加えて、容器は、目に見えるスケールに基づいて適切な量を分配できるように、スケールでマーキングされてもよい。容器は、それ自体が投与に使用可能であってよく、例えば、キットは、個別のシリンジ中に適量の各組成物を含有してもよい。予め配合された正しい比率の治療薬を含む配合物もこのようにパッケージ化されてよく、その結果、配合物がキット内に予めパッケージ化されているシリンジから直接投与され得る。

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、及びその他の科学用語又は科学専門用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語が、本明細書では明確さのため、及び／又は即時参考のために定義されるが、本明細書におけるこうした定義の包含は、必ずしも当該技術分野で一般的に理解されるものとの根本的な相違を表すものと解釈されるべきではない。本明細書で記載又は参照される技法及び手順のうちの多くが、当業者により十分理解され、従来の手法を用いて一般に利用されている。特に断りのない限り、必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順が、製造者が定義するプロトコル及び／又はパラメータに従って一般的に実施される。本明細書に参照される全ての特許、出願、公開出願、及びその他の刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。本項で記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願、及びその他の刊行物に記載される定義と相反するか、さもなければ矛盾する場合、本項で記載される定義が参照により本明細書に組み込まれる定義よりも優先される。

本明細書で使用する時、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味する。

以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。更に、データから集められた発症機序に関する下記の科学的論考も、本明細書に記載される本発明を限定することを意味しない。

略語：ＢＴ：出血時間；ａＰＴＴ：活性化部分トロンボプラスチン時間；ＴＣＴ：トロンビン凝固時間；ＡＣＴ：活性化凝固時間；ＰＴ：プロトロンビン時間；ＬＭＷＨ：低分子量ヘパリン；ＦＸ：Ｘ因子；ＤＶＴ：深部静脈血栓症；ＥＩＭ：電気損傷モデル；ＩＶＣ：下大静脈。

実施例１
アピラーゼ－アネキシン融合作成物及びリンカーの設計
これらの実施例で用いられるアピラーゼ薬は、可溶性ＣＤ３９Ｌ３ Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒをコードする作成物から作製された可溶性アピラーゼ薬であり、本明細書ではＡＰＴ１０２（配列番号２）と指定される、米国特許第８，７７１，６８３号明細書に記載される均質化Ｎ末端を備える。

発現レベルを最適化させ、分解を防ぐために、アネキシンＶをコードする核酸を、様々な長さのリンカーでアピラーゼ薬のＣ末端に融合させ、様々な反復に、本明細書の配列番号３及び４に示すマウスＩｇＧκ配列をコードする配列を提供し、発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇ２ｃに挿入した。

ＨＥＫ２９３細胞を、リンカー配列の変形を用いてアピラーゼアネキシンＶ融合タンパク質の発現を提供する線状化発現プラスミドを用いて安定に形質転換させた。

形質転換体は、無血清懸濁培養に適合させ、継続的により大きなフラスコへと分割させた。典型的な懸濁培養に、０．５×１０^６細胞／ｍＬで植菌し、５～６日のうちに、ＨＥＫ２９３細胞は、典型的には３．５×１０^６細胞／ｍＬを超えて成長した。細胞を３～４日毎に分裂させ、馴化培地中の融合タンパク質を回収した。２０ＡＡリンカーを用いたアピラーゼアネキシンＶ融合の産生を、３Ｌスピナーにスケールアップした。

ＩＭＡＣ、Ｑ、及びＳＰカラムを用いてタンパク質を均質になるまで精製した。設計された様々なリンカーのアミノ酸配列を以下に示す。
＞ｍ０（当初設計：プロテアーゼによって切断された）

＞ｍ１（プロテアーゼによって切断された）

＞ｍ２（切断は検出されなかった）

＞ｍ３（切断は検出されなかった）

当初設計のリンカー、ｍ０の場合、培地中に存在するプロテアーゼ活性によって精製タンパク質の約５０％がリンカー領域中で分解した。更なる研究は、低いｐＨ（例えば５．０）は、７．４のｐＨと比較して分解を加速させたことを示す。プロテアーゼ耐性融合タンパク質は、ｍ１に示すようにＧからＴへの置換を導入することによって設計し、これは、クエン酸ナトリウムによって浄化上清のｐＨが５に低下すると依然としてプロテアーゼ分解を起こしやすかった。この変異を、ｍ２及びｍ３に示すようにアラニン又はグルタミンによるセリンの置換と組み合わせると、分解は最小化した。

発現レベルの比較に基づき、２０個のアミノ酸リンカーが最も有利であったことも示された。

発現レベルを、５、１０、１５、及び２０個のアミノ酸残基長の可撓性リンカー、又は９アミノ酸残基の剛性リンカーと比較した。

上記で説明された馴化培地の浄化上清由来のタンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上で分離した。分析は、融合タンパク質の発現は、２０ＡＡのリンカーの長さと正相関して、最高の発現をもたらしたことを示す。剛性リンカー作成物も、２０ＡＡ可撓性リンカーを有するバリアントよりも低い発現をもたらした。この２０ＡＡリンカーのアミノ酸及びヌクレオチド配列を、配列番号３に示す。

実施例２～１０で用いられた最終作成物は、配列番号７のヌクレオチド配列を有し、ここでシグナル配列はウシαラクトアルブミンシグナルペプチドをコードした。アピラーゼ－リンカー－アネキシンＶのコードされた融合は、ＡＰＴ４０２と指定される。

実施例２
ＣＨＯ細胞からのＡＰＴ４０２の発現及び精製
融合タンパク質ＡＰＴ４０２を産生するための作成物中のアピラーゼ薬は、ＡＰＴ１０２である。実施例１で説明した２０ＡＡリンカーを有するアピラーゼアネキシンＶ融合を、配列番号７に示す作成物由来のウシαラクトアルブミンシグナルペプチドのシグナル配列を用いてＣＨＯ細胞中で産生した。記載したように、アピラーゼ－リンカー－アネキシンタンパク質は、ＡＰＴ４０２として指定した。産生細胞株は、ＣＨＯ親細胞株にＣａｔａｌｅｎｔ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）から作製したレトロベクター及び発現レトロベクタープラスミドで４回形質導入することによって作製した。形質導入細胞のプールした集団を、ＣＨＯ－Ｓ－ＡＰＴ４０２－Ｒ ４×プールと名付けた。プールした集団細胞株の試料を凍結保存した。

１０Ｌを産生する場合、指数増殖段階の間、ＰＦＣＨＯ ＬＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中の１０ＬのＢｒａｕｎバイオリアクターのスケールアップのために、細胞株ＣＨＯ－Ｓ－ＡＰＴ４０２－Ｒ ４×プールを３～４日ごとに継代した。２つの１０Ｌバイオリアクター中に、ＰＦＣＨＯ ＬＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）培地中約３００，０００～４００，０００細胞／ｍＬの細胞密度で細胞を播種した。この研究に用いたフェドバッチサプリメントは、ＨｙＣｌｏｎｅ ＰＳ３０７（１２％（ｗ／ｖ）溶液）、ＡＧＴ ＣＤ ＣＨＯ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％グルコース溶液、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン（１５ｇ／Ｌ）／Ｌ－セリン（１０ｇ／Ｌ）の５０×溶液、Ｌ－チロシン（４ｇ／Ｌ）／Ｌ－シスチン（２ｇ／Ｌ）の５０×溶液であった。

ＡＮＸクロマトグラフィー。１０Ｌ容器からの１０ＬＢＲＸ－３３８０－４×プール－００１の収穫は、培養１２日目に行われた。カラムを、平衡化のために１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。Ｔｒｉｔｏｎで処理した培地を、等体積（６．６０Ｌ）のＷＦＩで希釈して、ＡＮＸ投入物を調製した。投入物（１３．２Ｌ）をカラムに適用した。続いて、カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄して、３Ｌのこの洗浄液を回収した。ＡＰＴ４０２分画を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２７０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で溶出して、回収した（２．３７Ｌ）。

ＳＰセファロースクロマトグラフィー。カラムを１ＭのＮａＯＨで１時間殺菌し、続いてカラムをＷＦＩで洗浄した。カラムを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４中で平衡化した。投入物（添加され２０分間攪拌されたＡＮＸ溶離液＋９．４Ｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４＋３４．５ｇのＣａＣｌ_２；１１．７５Ｌ）をカラムに適用し、貫流し、洗浄し、回収した（約１２Ｌ）。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、ベースラインを再確立した。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４で溶出し、透明な無色溶液として溶出ピークを回収した（１．０Ｌ）。

ヘパリンＨｙｐｅｒ Ｄクロマトグラフィー。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。続いてカラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中で平衡化した。投入物（緩衝液交換ＳＰプール、０．８８Ｌ）をカラムに適用し、貫流し、洗浄し、回収した（１．４０Ｌ）。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４でカラムから残留タンパク質を除去し、これも回収した（約１００ｍＬ）。クロマトグラムを下記に示す。ヘパリン貫流容積（１．４０Ｌ）を、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘポンプ及びＰｅｌｌｉｃｏｎ Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ １０Ｋ膜を用いて、不連続モードで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４へと緩衝液交換した。ＳＰプールを約７倍に濃縮して２００ｍＬにし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で約１０倍に希釈して２．０Ｌにし、再度濃縮して２００ｍＬにし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で約１０倍の２．０Ｌに再度希釈した。３回目の濃縮で約１００ｍＬにした後、フィルタを２００ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４でフラッシュし、これをリテンテートに添加した。濃縮物の最終体積は３００ｍＬであり、約４．９Ｌの透過水を回収した（初期濃縮体積の約２４．５倍）。１０ｋＤの再生セルロース膜を用いるＡｍｉｃｏｎ攪拌セル装置を用いて、リテンテート水溶液を更に濃縮した。

タンパク質を均質になるまで精製した。最終回収収率は、全体で約５４％であった。バイオバーデンは０ＣＦＵであり、配合バルク中のエンドトキシンを、１．０＜Ｘ＜２．０ＥＵ／ｍＬ又は０．６＜Ｘ＜１．２ＥＵ／ｍｇでアッセイした。

実施例３
ＡＰＴ４０２は、ＡＰＴ１０２と同等のエクスビボ抗血小板活性、及びアネキシンＶと同等のエクスビボＸ因子活性化阻害を示した
ＡＰＴ４０２は、ＡＰＴ１０２及びアネキシンＶの両方の酵素的及び生物学的活性を維持するように設計された。マラカイトグリーンアッセイを用いて、本発明者らは、ＡＴＰ及びＡＤＰに関するＡＰＴ４０２の酵素動力学的パラメータが、ＡＰＴ１０２のそれと同等であることを発見した。同様に、ＡＰＴ４０２は、ＡＰＴ１０２と同等の効力でＡＤＰ誘導性のヒト血小板凝集を阻害した（図１）。正常なヒトドナー及び麻酔ウサギから標準法によって精製した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて、ＦＸ活性化に対する阻害活性をアッセイした。ウサギ及びヒトＰＢＭＣにおけるＡＰＴ４０２及びアネキシンＶの両方で、ＬＰＳ誘導性ＦＸ活性化における類似の用量依存的低下が存在した（図２）。予期された通り、ＡＰＴ１０２はＰＢＭＣの凝固促進活性に対する影響を有さなかった。

実施例４
ＡＰＴ４０２は、ＡＰＴ１０２及びアネキシンＶ単体と比較して、活性化ヒト血漿豊富血小板からのトロンビン生成の相乗的阻害を示した
クエン酸ヒト血小板豊富血漿（ＰＲＰ）中のトロンビン生成を、Ｈｅｍｋｅｒらにより開発された方法に従い、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅシステム（Ｓｙｎａｐｓｅ）を用いた較正自動トロンボグラフィー（ＣＡＴ）によって定量化した。９６ウェルプレートのウェル中で、ＰＲＰのアリコートを、薬剤を用いて室温で１５分間、続いて３７℃で５分間インキュベートした。０．５ｐＭの組織因子及びＣａＣｌ_２を添加して１６．７ｍＭにすることによってトロンビン生成を開始し、マイクロタイタープレート蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で監視した。Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェアを用いて、トロンボグラム（生成されたｎＭ単位のトロンビン対時間）を生成し、重要なトロンビン生成パラメータも生成した：トロンビン生成開始遅延時間（分）、ピークトロンビン濃度（ｎＭ）、ピークトロンビン時間（分）、及び内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ；トロンボグラム曲線下の統合領域）。

２０μＭのＡＤＰ活性化ヒト血小板からのトロンビン生成に対する等モル濃度でのＡＰＴ１０２、アネキシンＶ、ＡＰＴ１０２＋アネキシンＶ、及びＡＰＴ４０２の効果を、ＣＡＴアッセイを用いて比較した（図３）。アネキシンＶは、ピークトロンビン時間を有意に増加させたが、ピークトロンビン濃度をいくらか低減させた。ＡＰＴ１０２は、両方のパラメータに対していくらかの阻害効果を有した。しかしながら、ＡＰＴ１０２＋アネキシンＶは、トロンビン生成を相乗的に阻害し、これは、ピークトロンビン時間を４倍と有意に増加させ、同時にピークトロンビンを３倍と有意に低減させた。これらの特徴はＡＰＴ４０２によって模倣された。

実施例５
ＡＰＴ４０２は、健康なウサギにおける単一のボーラス投与後に、急速な作用開始を示した
ＡＰＴ４０２は、２匹のウサギにおいて単一ボーラス（０．４０ｍｇ／ｋｇ）としてＩＶ注射された。薬物動態モデリングは、ＡＤＰアーゼ活性の二相性指数曲線に対する最良適合を示した（図４）。最大活性は、投与後３０分に血漿中で検出された。ＡＰＴ４０２の分布相及び排出半減期（ｔ_1/2）は、それぞれ３０分及び６時間であり、これは、アネキシンＶの５分の分布相半減期及び２０分の排出半減期（１８倍）と比較して有意に延長されている。ＡＰＴ４０２の投与は、ＩＶ投与の１０分後までに２０μＭ ＡＤＰ誘導性エクスビボ血小板凝集の９５％を阻害し、投与からそれぞれ１及び６時間後に９０％及び８０％を阻害する作用の急速な開始を示した。これらのデータは、半減期が比較的短いため、ＡＰＴ４０２は、安定した血栓症の減弱を保証するためにはボーラス、及び続いてＩＶ注入として投与されるべきであることを示唆する。

実施例６
ＡＰＴ４０２の連続的ＩＶ注入は、健康なウサギにおける急速な作用の開始及び消失をもたらした
予備データは、ＡＰＴ４０２が短い分布相半減期を有したことを示す。続いて、ウサギにＡＰＴ４０２を単一ボーラスとしてＩＶ注射し（０．２ｍｇ／ｋｇ）、続いてＩＶ注入を１２及び２４μｇ／ｋｇ／分で１２０分間行った。ＥＬＩＳＡデータは、投与から３０分後までにＡＰＴ４０２が血漿中で検出可能であったことを示す。ＡＰＴ４０２の濃度、ＡＤＰ誘導性血小板凝集及びトロンビン生成の阻害は、注入の間、最大１２０分間維持し、その後、ＡＰＴ４０２注入の中止から６０分後に有意に低減した（図５、６、７）。出血時間、ＡＣＴ、ＰＴ、ａＰＴＴ、又は血小板数に関してＡＰＴ４０２で治療した動物と対照動物との間に差はなかった。データは、ＡＰＴ４０２による最適治療は、局所及び全身血栓症の両方の減弱を保証するための３０分間の前治療で達成されることを示す。

実施例７
ＡＰＴ４０２は、ウサギにおける損傷動脈の血栓部位に選択的に局在化する
メタノール中の近赤外（ＮＩＲ）蛍光染料（ＬＳ２８８，Ｅｘ／Ｅｍ７７３／７９３）を、ＡＰＴ４０２の官能性アミンとコンジュゲートした（約１：１）。精製されたバイオコンジュゲートは、１つの蛍光バンドを示した（図８Ａ）。蛍光分子トモグラフィー（ＦＭＴ）による血栓のインビボ画像化のために、特注のファイバーベース携帯式ビデオレートシステムを記載されるとおりに使用した（ＣＩＴＥ）。ＡＰＴ４０２（ＮＩＲ標識及び非標識ＡＰＴ４０２）のボーラス及びそれに続く１２μｇ／ｋｇ／分のＩＶ注入（損傷頸動脈の開通性を２時間維持した）から３０分後に、陽極電流を頸動脈針電極に印加して血栓症を開始した。３匹のウサギの平均蛍光値及び信頼区間を図８Ｂに示す。損傷部位は、経血管針電極周囲に形成された血栓のために、ベースライン後に約６～７倍の蛍光の増加を伴った。重要なことに、ＡＰＴ４０２は血栓と結合することが発見された（図８Ｃ）。対照的に、非損傷の対照頸動脈におけるシグナルの増加はなかった（データは示さず）。したがって、ＡＰＴ４０２は、動脈損傷及び血栓症の部位に特異的に標的化される。ＮＩＲ標識化ＡＰＴ４０２の組織分布は、標識の大部分が肝臓及び脾臓によって取り込まれたことを示す。

実施例８
ＡＰＴ４０２は、出血リスクの増加なしに、単体でも組み合わせでも、他の抗血小板又は抗凝血薬よりもウサギにおける動脈血栓症の減弱により効果的であった
ウサギを、電気損傷の３０分前に治療を開始した以下の１１の群に無作為化した。

電気損傷は、２時間以内に生理食塩水で治療されたウサギの６０％で閉塞を生成した。平均血栓症重量は７．８ｍｇであった。１２又は２４μｇ／ｋｇ／分のＡＰＴ４０２、チカグレロル（単体又はアンジオマックスとの組み合わせ）による治療は閉塞を完全に防いだ（図９）。血栓症重量は、ＡＰＴ４０２によって用量依存的に減少した（図１０）。際立ったことに、２４μｇ／ｋｇ／分のＡＰＴ４０２による治療は、チカグレロルとビバリルジンとの組み合わせを含む全ての他の治療よりも最も低い血栓重量をもたらした。一方で、ＡＰＴ４０２は、出血時間（図１１）、プロトロンビン時間（図１２）、部分トロンボプラスチン時間（図１３）、血圧（図１４）、又は心拍数（図１５）に影響を及ぼさなかった。

実施例９
ＡＰＴ４０２は、静脈血栓症、すなわち深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の急性マウス電気損傷モデル（ＥＩＭ）において、出血を増加させることも凝血能低下を誘発することもなしに静脈血栓症を減弱させた
静脈血栓症の電気損傷モデルは、急性試験のために用いた（Ｄｉａｚ ＪＡ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１０４：３６６－３７５，２０１０。

マウスを以下の４つの群に無作為化した（ｎ＝１０／群）。

ＥＩＭは、全てのマウスにおいて一貫してＩＶＣ血栓症を生成し、平均血栓重量は２２．５ｍｇであった。血栓重量、ＢＴ、ＡＰＴＴ、及びＴＣＴを、ＤＶＴ誘導から４８時間後に測定した。

ＬＭＷＨによる治療は、血栓重量を対照と比較して５７％減少させ、出血時間で３倍、ａＰＴＴで２．５倍、及びＴＣＴで２倍の有意な長期化を伴った（図１６）。

ＡＰＴ４０２は、血栓重量を、用量依存的に、それぞれ低用量及び高用量で４４％及び６５％減少させた。重要なことに、ＡＰＴ４０２は、ＢＴ、ａＰＴＴ、又はＴＣＴの検出可能な長期化をもたらさなかった（図１６）。同様に、２日間、毎日の１．０ｍｇ／ｋｇのｉｐボーラスでのＡＰＴ４０２も、出血時間を増加させることなしに血栓重量を５３％低減させた。

これらのデータは、用量を限定させる出血がないためにＡＰＴ４０２が安全であり、且つエノキサパリンよりもＤＶＴ治療に効果的となることを示唆する。

実施例１０
ＡＰＴ４０２は、出血を増加させることなしに、ＤＶＴの慢性マウス電気分解損傷（ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｉｎｊｕｒｙ）モデル（ＥＩＭ）における線維症を低減させた
慢性線維化試験では、マウスを以下の群に無作為化及び盲検化した（ｎ＝５～１２／群）。

ＤＶＴ誘導から１４日後に、マッソン３色染色法でコラーゲン沈着を染色した。ＥＩＭは、全てのマウスで一貫してＩＶＣ線維症を誘導し、健康なマウスと比較して平均コラーゲン沈着を約６倍増加させた（図１７）。

ＡＰＴ４０２及びＡＰＴ１０２による治療は、コラーゲン沈着を、それぞれ３３％及び１１％と有意に低減させた。プラセボ群において１件の死亡があったが、ＡＰＴ４０２及びＡＰＴ１０２群においては、死亡、又は出血増加、若しくは重篤な副作用は観察されなかった。

これらのデータは、ＡＰＴ４０２が安全であり、血栓後症候群に対する効果的な治療法となり得ることを示唆する。

配列表
可溶性ＣＤ３９Ｌ３ Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ（ＡＰＴ１０２）
配列番号１－ヌクレオチド
配列番号２－アミノ酸

最適化コドン及びマウスＩｇκシグナルペプチド配列を有するＡＰＴ４０２
配列番号３－ヌクレオチド
配列番号４－アミノ酸

２０ＡＡリンカー
配列番号５－ヌクレオチド
配列番号６－アミノ酸

最適化コドン及びウシαラクトアルブミンシグナルペプチドを有するＡＰＴ４０２
配列番号７－ヌクレオチド
配列番号８－アミノ酸

最適化コドンを有するＡＰＴ４０２
配列番号９－ヌクレオチド
配列番号１０－アミノ酸

Claims (27)

1. アピラーゼ、及び活性化血小板の表面のホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するアネキシンを含む組成物であって、前記アピラーゼ及びアネキシンは、合わせて、出血を増加させることなく血栓症を阻害するのに有効な量で存在する、組成物。
2. 前記アピラーゼ及びアネキシンは等モル量で存在する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記アピラーゼ及びアネキシンは共有結合している、請求項２に記載の組成物。
4. 前記アピラーゼは、可溶性ＣＤ３９Ｌ３、又は強化されたＡＤＰアーゼ活性を有するその修飾形態である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記アピラーゼが修飾形態の可溶性ＣＤ３９Ｌ３であり、前記修飾がアミノ酸６７及び６９位における置換からなる、請求項４に記載の組成物。
6. 前記置換がＲ６７Ｇ及びＴ６９Ｒである、請求項４に記載の組成物。
7. 前記アピラーゼがＡＰＴ１０２（配列番号２）である、請求項６に記載の組成物。
8. 前記アネキシンがアネキシンＩＶ又はＶである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記アピラーゼ及びアネキシンが、リンカーペプチドを介して共有結合して融合タンパク質を形成する、請求項３～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記リンカーペプチドが３～３０個のアミノ酸を含有する、請求項９に記載の組成物。
11. 前記リンカーペプチドが１５～２５個のアミノ酸を含有する、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記リンカーペプチドが、血漿及び／又は細胞培養上清中で加水分解に耐性がある、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記リンカーペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記融合タンパク質がＡＰＴ４０２（配列番号１０）である、請求項１３に記載の組成物。
15. 請求項３～１４のいずれか一項で定義される融合タンパク質をコードする核酸。
16. 発現のための制御配列を更に含む、請求項１５に記載の核酸。
17. 請求項１６に記載の核酸を含有する組換え宿主細胞又はベクター。
18. リンカーペプチドを介して共有結合したアピラーゼ及びアネキシンを含む融合タンパク質を産生するための方法であって、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することと、前記培養物から前記融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
19. 請求項１８に記載の方法によって産生された、リンカーペプチドを介して共有結合したアピラーゼ及びアネキシンを含む融合タンパク質。
20. 血栓症を経験している対象、又は過剰出血のリスクがある外科手術を受けている対象を治療するための方法であって、前記対象に有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１９に記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
21. 前記対象に有効量のＡＰＴ４０２（配列番号１０）を投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
22. 前記投与が静脈内（ＩＶ）である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記方法がボーラス注射であり、その後ＩＶ注入が続く、請求項２２に記載の方法。
24. 血栓症を経験している対象、又は過剰出血のリスクがある外科手術を受けている対象を治療するための方法であって、前記対象に、有効量のアピラーゼと活性化血小板の表面のホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するアネキシンとの組み合わせを、合わせて出血を増加させることなく血栓症を阻害するのに有効な前記アピラーゼ及びアネキシンの量で投与することを含む、方法。
25. 前記アピラーゼがＡＰＴ１０２（配列番号２）であり、前記アネキシンがアネキシンＶである、請求項２４に記載の方法。
26. 前記投与が同時である、請求項２４に記載の方法。
27. 前記投与が順次である、請求項２４に記載の方法。

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