CN1798976B - 口蹄疫的诊断方法及诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种诊断口蹄疫病毒感染的方法，包括下列步骤：将预定量的试样施加于试纸条的加样区；将一种包括既定标记试剂的检测试剂偶联于试样中的所研究的分析物，从而形成复合物；将该复合物展开到芯吸膜上；以及观测在芯吸膜的预定区域上具有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区的外观改变，以确定是否存在口蹄疫病毒感染。本发明还提供了一种用于诊断口蹄疫病毒感染的试剂盒，该试剂盒包含：试纸条1，其包括设置于芯吸膜9的预定区域上的一含有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区13，以及一用于确定试剂盒的正常操作的对照区14；和一防止试纸条1被各种污染物污染的壳体20，其包括至少一试样施加口2和一标记窗4，用于观测试纸条上的反应区13和对照区14中的反应结果。

Description

口蹄疫的诊断方法及诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及用于诊断受试者口蹄疫病毒(FMDV)感染的方法和试剂盒，更具体地说，通过观测含有选自由FMDV得到的，或者可经由免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相(其可与作为目标物的动物试样进行免疫反应)的反应区的外观变化而快速检测受试者的FMDV感染的方法和试剂盒。
背景技术
口蹄疫(FMD)是牲畜的破坏性疾病，并且被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties)列举为A级病。所有偶蹄类动物物种(牛、猪、绵羊和山羊)均易感，并且该疾病的传染性极强。由于FMD所导致的财政损失可能是巨大的。直接损失是低龄动物死亡、牛奶损失、肉类损失和产出效率下降。与根治或控制有关的成本高，另外，还有由于施加了贸易限制而导致了间接损失。
病原体是口蹄疫病毒(FMDV)，小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病毒属(Aphthovirus)(Bittle等人，1982和Fross等人，1984)。FMDV基因组由大约8,000个核苷酸碱基的单一RNA正链组成。RNA在感染细胞内首先翻译为单一多肽，随后通过病毒编码的蛋白酶裂解，产生四种壳体蛋白(VP1-VP4)和非结构多肽(2C，3A，3ABC和3D)。图3示出了结构和非结构蛋白的编码区。
FMD病毒是抗原异质性的。7种不同血清型已经被识别，即O、A、C、ASIA1，SAT1，SAT2和SAT3(SAT＝南部非洲地区)。FMDV的每一种血清型的抗原不同于其它6种血清型。血清型A病毒的变异性最大，具有30个以上亚型。此外，各血清型可以再分为抗原不同的多个亚型。FMD病毒的血清型是最初通过动物的交叉免疫实验来鉴定的。从被一种血清型感染中恢复过来的动物可抵抗相同血清型的侵袭，但对任何其它血清型仍然是易感的。FMDV的不同血清型具有不同的地理分布。在亚洲，A、O和Asia血清型是最常见的。在欧洲和南美，发现了A、O和C血清型。在非洲，A、O和SAT血清型是占主要的。非洲、亚洲和南美的一些国家是地方性流行区。
FMD的初步诊断通常包括感染动物的典型临床体征的识别。在所有种属中，FMD的临床体征基本相似，但严重程度可以变化很大。主要体征是发热，随后口蹄形成水疱，导致流涎和跛行。通过测定疑似动物中的FMDV-特异性抗原或抗体的存在来进行血清学诊断，通常是通过ELISA和病毒中和试验来进行。
在动物感染FMDV之后，结构蛋白(SPs)和非结构蛋白(NSPs)的特异性抗体开始出现，滴定度增高，并保持很久。因此，特异性FMD病毒抗体在血清中的存在表明，采集样品的动物已经接触了FMD病毒或抗原。
FMD病毒的血清抗体的检测具有几种用处。抗体检测显示了动物的先前感染，此时还没有出现水疱物质。用临床体征诊断FMD可能是困难的，尤其对于绵羊和山羊，它们的临床体征常常是温和的(Barnett，P.V.等人，1999和Callens，M.，K.等人，1998)。此外，几种其它水疱性病毒感染，包括由猪水疱病(SVD)病毒、水疱性口腔炎病毒等引起的那些病毒感染，不能通过临床表现将之与FMDV感染区分开来。FMDV可以在反刍动物建立稳定(persistent)或携带(carrier)阶段，它们不显示FMD的征象。此类携带者动物可以成为该疾病的新爆发的来源。因为这些问题，需要一种快速血清学方法来鉴别感染动物和/或无症状病毒携带动物，并且将它们与接种疫苗的动物分开。该抗体检测方法还能够用于流行病学调查，测定接种的效力。
疫苗接种和感染诱发了结构壳体蛋白的抗体。因此，如果在诊断分析中单独使用壳体蛋白，这将根据结构蛋白的抗体的检测来检测接种疫苗和感染的动物。为此，结构蛋白的抗体试验只能在无疫苗地区，比如美国和英国使用，而不能在建立了疫苗接种的地区使用。但即使在动物接种疫苗的地区，FMD也常常发生。在这种地区，需要可以区分感染与接种疫苗的诊断试验。几个研究报道过，使用FMDV的非结构蛋白，比如2C和3ABC，可以根据检测该病毒的一种或多种非结构蛋白的抗体将已经感染了FMDV的动物与已接种疫苗的动物区分开来(Rodriguez A等人，Mackey Dk等人，Sorensen KJ等人)。
检测FMDV的另一种方法是PCR(聚合酶链式反应)。为了检测FMDV的特异性RNA序列，已经有人开发了RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)分析(Munez等人)。该技术能够提供特异性和高灵敏度，所以当该保存不好的样品中的病毒数量不足以引起组织培养物感染时，它仍可以检测该样品中的FMD病毒RNA。但该方法需要PCR设备和电，这使得它在现场分析中不实用，并且如果PCR反应的抑制物质存在于一些样品中，那么含有病毒或病毒基因组的一些样品将不会获得PCR阳性结果。
发明内容
因此，鉴于以上问题做出了本发明，本发明的目的是提供一种诊断目标动物被口蹄疫病毒感染的方法，该方法使得可以通过采用由动物获得的生物学样品简单而快速地鉴别动物是否感染了病毒。
本发明的另一个目的是提供一种用于实现上述方法的诊断试剂盒。
根据本发明，以上和其它发明目的可以通过提供一种诊断口蹄疫病毒感染的方法来实现，该方法包括下列步骤：
(1)将预定量的试样施加于试纸条的加样区；(2)将一种包括既定标记试剂的检测试剂偶联于试样中的所研究的分析物，从而形成复合物；(3)将该复合物展开到芯吸膜(wicking membrane)上；以及(4)观测在芯吸膜的预定区域上具有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区的外观改变，以确定是否存在口蹄疫病毒感染。
根据本发明的诊断方法包括一夹心试验或竞争试验。
作为一种为了实现如上所述的诊断方法的诊断试剂盒，本发明提供了一种用于诊断口蹄疫病毒感染的试剂盒，其包含：
一试纸条1，其包括一含有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区13，以及一用于确定试剂盒的正常操作的对照区14，其设置在芯吸膜9的预定区域上；以及
一防止试纸条1被各种污染物污染的壳体20，其包括至少一试样施加口2和一标记窗4，用于观测试纸条1上的反应区13和对照区14中的反应结果。
试样优选是从身体分泌出来的体液，包括血液、血清、血浆、尿、眼泪、唾液、乳等。
此外，所要分析的试样中含有的分析物可以包括含有特异性结合成份的任何物质，其可以是天然形成的或人工赋予的，例如包括抗原呈递物质、抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、半抗原和它们的结合物。
另外，固定相(或捕集试剂)是一种特异性结合于分析物的未标记特异性结合成份、指示试剂、辅助特异性结合成份或者类似物，然后捕集该分析物，并且被直接或间接固定于试纸条1的芯吸膜9上。
检测试剂可以扩散或非扩散方式结合于一个垫上，并且包括一种标记试剂，该辅助特异性结合成份和/或一种信号产生系统的组分。该信号产生系统至少包括一种催化剂和溶液。该溶液可以通过催化成员来催化，诱发一种反应，并且由膜表面或内部产生一种可识别的信号。该催化剂可以是酶或非酶。溶液可以进行由该催化剂催化的反应。这种反应产生了大量的信号产生化合物，所述化合物可以被直接或间接检测到。可被这些组分检测到的信号包括光谱、可见信号，电化学信号和其它可电学检测的信号。
具体实施方式
现在，参考附图来详细说明本发明。
图1a-b分别是作为用于本发明的优选实施方式的示例诊断试剂盒的不同的立体图。
该诊断试剂盒包括试纸条1和外壳20。该外壳是将试样由试样施加口2和显色剂施加口3加到滤垫(或染色垫：它是指含有检测试剂的垫)上所必需的。该试剂盒还包括一具有外罩5的主体7，该外罩5包括用于显示试验结果的标记窗4，以及用于适当放置和固定试纸条1的试纸条安装元件6。
外罩5和主体7经由固紧元件8互连。它们是固定试纸条1以及防止与反应区接触或防止其污染所必需的，并且优选由不与在试验中采用的任何其它试剂发生反应的非反应性材料，比如塑料等制成。
如在根据本发明的第一个方面的图1a的构造中所示，如果试样通过施加口2加到滤垫11(还用作染色垫)上，需要单独的显色剂施加口3。显色剂施加口3被设置成具有杯样形状的曲率，以便接收预定量的显色剂。此外，它的下部优选与储藏垫(reservoir pad)10紧密接触，以便防止显色剂流出到试验设备的其它区域。
与图1a的构造不同，如果试样施加口2’刚好位于构成试纸条的储藏垫10’的上部，以便即时将试样加到储藏垫10’上(在这种情况下，储藏垫还具有如在以下实施例中的滤垫的功能，从而，不需要独立的显色剂施加口)，如在根据本发明的第二个方面的图1b的构造中所示，施加口2’被设置成具有杯样形状的曲率，以便接收预定量的试样。此外，它的下部优选与储藏垫紧密接触，以便防止试样流出到试验设备的其它区域。在该情况下，垫11’是一含有检测试剂的染色垫，或者一第二滤垫，或者可以省略。
标记窗4被设计用于从外部观测在构成试纸条1的芯吸膜9上的反应区13和对照区14中发生的改变，并且设置于外罩5上，以便在反应区13和对照区14上即时定位。
此外，外罩5上可以设置既定识别符号，例如，试验日期的符号“日期”，受试者的符号“ID 0000”，对照区的符号“C”，反应区的符号“T”(试验)，样品施加口的符号“S”，显色剂的符号“D”等，这样就可以容易区分试验日期、受试者、试样施加口、显色剂施加口、显示试验结果的标记窗等。这些符号可以是任何字母、数字、图标或类似物，或者是不同于上述那些的它们的任何结合物。
现在，作为优选的实施方式，参考图1a-b和图2来描述构成根据本发明的诊断设备的试纸条的结构。
图1a显示了根据本发明的第一个方面的一个实施方式。本发明试纸条1包括了一芯吸膜9、一储藏垫10、一滤垫11(还用作染色垫)、一吸收垫12，以及在该芯吸膜9上设有的一反应区13和一对照区14。在试纸条1的背面附着用于将试纸条1固定于主壳体7的固定元件6的基底元件15。基底元件15优选由塑料或玻璃板制成。
图1b示出了根据本发明的第二个方面的另一个实施方式。除了一储藏垫10’和一滤垫11’(它还可以用作染色垫)以外，本发明试纸条1’具有与图1a所示的试纸条相同的构造。其各自构造的详细说明是以图1a所示的本发明的第一个方面为基础，而仅仅提到了二者之间的差别。
滤垫11与用于色谱法的芯吸膜9的背面接触，形成用于流体流入到芯吸膜9中的连接通路。滤垫11的背面与储藏垫10接触，形成用于流体在其中流动的一个连接通路。吸收垫12附着于芯吸膜9的上部。在芯吸膜9的预定区域上隔开了一反应区13和一用于确定该试剂盒是否正常操作的对照区14，该反应区13含有至少一个以上的固定相，其特异性结合于一待测分析物、一标记试剂、一辅助特异性结合成份及类似物。
储藏垫10吸收试样，或其它试验所必需的溶液，例如显色剂及类似物，还包括一用于将分析物转移到滤垫或芯吸膜上的毛细管膜。储藏垫10需要具有足以接收试样或显色剂的空间和体积。适于制备储藏垫的材料优选是低分子量蛋白结合物质，包括具有0.45-60μm的孔径的纤维素、聚酯、聚氨酯、玻璃纤维等。
滤垫11过滤出试样中不必要的成分，并且可能含有检测试剂(在该情况下，该滤垫还可以用作染色垫)。如果在滤垫中含有检测试剂，其优点是省略了将检测试剂与试验用试样预混的步骤。作为适于该滤垫11的材料，可以为聚酯、聚氨酯、聚乙酸酯、纤维素、玻璃纤维、具有0.45-0.60μm的孔径的尼龙等。如果适当的话，该储藏垫10和滤垫11可以由相同的材料制成，在这种情况下，检测试剂可以被包含在一个长滤垫11的底部内。
该检测试剂设有一标记试剂、辅助特异性结合成份、和/或一信号产生系统的组成成分，这使得其可以通过肉眼或外部其它仪器来鉴定有意义的分析物的存在。标记检测试剂是本领域技术人员所公知的。此类标记的实例包括催化剂、酶(例如，磷酸酶、过氧化物酶等，更具体地，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶或类似物，其与酶的底物结合使用)，酶的底物(例如，氮蓝四唑、3，5’，5，5’-四硝基联苯胺(tetranitrobenzidine)、4-甲氧基-1-萘酚、4-氯-1-萘酚、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、酶的化学发光底物，例如，二氯乙烷(dioxethane)，以及它们的衍生物和类似物)，荧光化合物(例如，荧光素、藻胆蛋白、若丹明、它们的衍生物和类似物)，化学发光化合物，放射元素，及类似物。除了这些以外，还可以提到如在第5,728,587号美国专利中所公开的金属溶胶、染料溶胶、颗粒胶乳、颜色指示剂、脂质体中含有的颜料、碳溶胶和非金属溶胶比如硒。此外，该专利的第8-10栏公开了大量的免疫化学标记，作为可用于本发明的诊断方法的标记。
上述标记试剂可以与一种既定辅助特异性结合成份形成缀合物(conjugate)，该既定辅助特异性结合成份具有易结合于所研究的分析物的性能。该辅助特异性结合成份无需特别限制的，包括抗原、抗体、半抗原或类似物，例如蛋白G、蛋白A、蛋白G/A，在分析物是抗体的情况下被认为是充分结合于抗体的材料，以及各种被认为是充分结合于其它抗体IgG和IgM的抗体。这些材料目前可作为重组体从Sigma等公司购得。
从以上可以看出，该检测试剂不是必需包括在滤垫11中。该检测试剂可以设置于显示检测结果的芯吸膜上的反应区13和试样施加口之间的任何位置。该检测试剂可以干燥或冻干状态施加于滤垫11或芯吸膜9的任何上部或内部。然后，如果需要，为了增强试验的灵敏度，反应性等，可以添加多种辅助试剂，比如缓冲剂、洗涤剂、抗凝固储备溶液，或类似物。
另外，试纸条1可以进一步包含一用于确定试剂盒是否正常操作的既定对照试剂。与检测试剂类似，该既定对照试剂还可以设置在滤垫11或芯吸膜9上的反应区13和试样施加口之间的任何位置。该对照试剂可以选自标记蛋白、抗原、抗体及类似物，该物质特异性结合于一固定相(例如，蛋白质、抗原、抗体或类似物)而在芯吸膜9上形成一对照区(或对照带)。这些固定相和对照试剂是本领域的技术人员所公知的。作为可以在对照试剂中包含的标记试剂，可以应用在检测试剂中所述的那些试剂。辅助特异性结合成分不是特别限制的，包括选自抗生物素蛋白、生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、抗FITC小鼠抗体、小鼠免疫球蛋白或抗小鼠免疫球蛋白抗体中的一种物质。
芯吸膜9应该具有充分的空间，并且能够吸收已通过滤垫11的大部分的试样。作为适合于这种芯吸膜的材料的例子，可以是选自尼龙、聚酯、纤维素、聚砜、聚偏二氟乙烯、醋酸纤维素、聚氨酯、玻璃纤维、硝基纤维素或类似物中的至少一种以上材料。
如果使用显色剂，适于显色剂的材料的实例可以包括磷酸盐缓冲剂、盐水、Tris-HCl、水等。需要显色剂的位置为试样施加口2刚好位于滤垫11的上部，以便加样。因此，如在根据图1b的第二个方面的实施方式中那样，如果试样施加口2’位于储藏垫10’上，以便在其上加上预定量的试样，那么显色剂就不是特别需要的。
如果标记检测试剂的复合物含有待测的分析物，该复合物与位于芯吸膜9的反应区13上的固定相相结合，然后导致外部可识别的变化。可以用作这种固定相的材料可以包括选自抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上，该抗原、抗体或半抗原构成了口蹄疫病毒，或者可以通过免疫反应由此获得。
可以用作抗原的材料包括非结构和/或结构蛋白。结构蛋白包括灭活FMDV分解材料或其成分、VP1-VP4多肽。非结构蛋白可以包括选自前导肽(Lb)、2B、2C、3A、3D、3AB和3ABC中的至少一种以上的多肽。图3示出了包括结构和非结构蛋白的聚蛋白前体的图谱。
具有相同名称的结构蛋白还可以在组成氨基酸上显示一些差别，这取决于FMDV的血清学分类。优选地，本发明中采用的结构蛋白不是特别限制的，只要它们可以特异地与用所有血清型形成的抗体产生反应。这些结构蛋白的实例包括、但不限于用SEQ ID NO：118表示的VP1。
然而，即使在上述结构蛋白单独用作构建诊断试剂盒的固定相的时候，也存在这样的情况，那就是，对于未接种疫苗的牛可以精确地诊断该牛是否感染了口蹄疫病毒，但难以区分感染病毒的牛与接种疫苗的牛。除了结构蛋白以外，在疫苗生产中采用的抗原的实例包括非结构蛋白3D。因此，即使当非结构蛋白3D用作固定相时，也存在如上所述的相同限制。非结构蛋白3D的例子在SEQ ID NO：121中示出。
非结构蛋白(除了3D以外)是没有在传统疫苗生产中使用的蛋白，这些蛋白的抗体仅仅可以在病毒感染的动物中观测到。因此，当该蛋白作为固定相应用时，可以做出对感染动物的准确诊断。当然，这种非结构蛋白也在其组成氨基酸上具有一些差别，这取决于FMDV的各血清型。可用的非结构蛋白不是特别限制的，优选为只要它们可以与用所有血清型生产的抗体发生特异反应。这些结构蛋白的实例包括用SEQ IDNO：119表示的2C和用SEQ ID NO：120表示的3ABC。
图4示出了非结构蛋白作为单一固定相应用的实例。T表示其中非结构蛋白(2C或3ABC)被固定的反应区，该反应区迄今为止从未在疫苗生产中采用。C表示对照区。具有变色T和C的试剂盒(图4a)表示感染动物，而仅具有变色C的试剂盒(图4b)表示疫苗接种之前的阴性动物或接种疫苗的动物。如果C在任何情况下都没有变色，这意味着所研究的试剂盒没有正常起作用，这样获得的结果是不可靠的。
如果仅使用如上所述的非结构蛋白作为固定相，那么在任何情况下，都难以区分疫苗接种前的阴性动物和接种疫苗的动物。因此，本发明的最优选的实施方式提供了一种诊断方法和试剂盒，这使得可以区分FMDV感染的动物与接种疫苗的动物。为此，优选提供一第一反应区和一第二反应区，在第一反应区中，作为固定相，可用于迄今已知的疫苗生产中的抗原被固定在芯吸膜的特定位置上，以及在第二反应区中，作为固定相，已知以前从未曾用于疫苗生产的非结构蛋白在芯吸膜的不同于第一反应区的特定位置被间隔和固定。因此，通过由在这些第一和第二反应区和一标记复合物之间的结合反应所产生的外观变化，可以诊断动物是否接种疫苗、病毒感染或者为疫苗接种前的阴性。
结合于对照试剂的固定相在与反应区相隔的不同位置形成了对照区。作为这种固定相，可以采用其它市购诊断试剂盒所用的各种试剂和固定相。其中的细节如在以下实施例中所述。
现在，将参考优选实施方式来描述一种采用具有如以上所述的构造的试剂盒来诊断FMDV感染的方法。在外罩上形成的试样施加口2加上试样比如动物血清(或血浆、全血)。构成试纸条的滤垫10位于施加口2的下端。滤垫10还含有蛋白G-金缀合物作为检测试剂。蛋白G-金缀合物可以与存在于试样中的所有抗体形成复合物。将预定量的显色剂加在显色剂施加口3，其中构成试纸条的储藏垫10位于其下端。显色剂的施加导致了在标记缀合物和在试样中的抗体之间的复合物的形成。然后，该复合物沿芯吸膜9(优选为硝基纤维素膜)的纵轴进行层析。预先将FMDV重组抗原(其构建参考以下实施例详细描述)加样并固定于芯吸膜9的反应区13上，这样，如果该复合物含有该重组抗原的特异性抗体，其将进行反应，然后以红线的形式显示了变色。
如果重组抗原包括结构和非结构蛋白，在此举例描述一种诊断动物是否疫苗接种、病毒感染或为接种疫苗之前的阴性的方法。
图5示出了该实施例。T1表示了一条线，其上已固定有迄今已经在疫苗生产中引入的抗原(结构蛋白或非结构蛋白3D)。T2表示一条线，其上已固定有以前未曾在疫苗生产中使用的非结构蛋白(2C或3ABC)。C表示一对照线。首先，其中T1、T2和C全部变色的试剂盒(图5a)表示病毒感染动物。其次，其中只有T1和C变色的试剂盒(图5b)表示疫苗接种动物。最后，试剂盒(图5c)是指疫苗接种前的阴性动物，因为只有C变色。如果C在任何情况下都不变色，这意味着该试剂盒没有正常操作，这样获得的结果是不可靠的。
如上所述，可用于本发明的诊断设备可以由如在第5,728,587号美国专利所公开的各种构造和变型所制成，并且在该单独设备中试纸条构造(即，垫的排列)的特定公开没有构成本发明的实质。因此，垫的排列不限于上述那些，还可以考虑其它排列方式，比如储藏垫/第一滤垫/第二滤垫/芯吸膜/吸收垫。在该情况下，第一滤垫或第二滤垫用于从血液中过滤和分离单独的血细胞，或者过滤和除去样品试验所不需要的外来物质。
虽然通过以构成口蹄疫病毒的结构和非结构蛋白作为在反应区中含有的固定相为例便于解释本发明，但本发明的范围和精神应该被认为是包括了在提交本发明时已作为疫苗生成的抗原或者在不久的未来作为抗原的任何材料，以及某些能够体内诱导抗体(包括半抗原)的材料，或者通过免疫反应由FMDV获得的各种抗体。
附图简述
图1a示出了根据本发明的第一个方面的一种诊断受试动物的口蹄疫病毒感染的设备(快速试剂盒)的立体图。
图1b示出了根据本发明的第二个方面的一种诊断受试动物的口蹄疫病毒感染的设备(快速试剂盒)的立体图。
图2示出了构成根据本发明的诊断设备的试纸条的构造；
图3示出了由口蹄疫病毒表达的聚蛋白的结构；
图4示出了单线试验(one-line test)试剂盒的示例性试验结果；
图5示出了双线试验试剂盒的示例性试验结果；
图6示出了质粒pBM-VP1Tw97F的图谱；
图7示出了质粒pBM-2CTw97F的图谱；
图8示出了质粒pBM-3ABCTw97F的图谱；和
图9示出了质粒pBM-3DTw97F的图谱。
实施例
现在，参考以下实施例来更详细地说明本发明。这些实施例仅用来说明本发明，但不应被认为是对本发明的范围和精神的限制。
材料
在ResGen公司(亨茨维尔，阿拉巴马州)合成用于基因构建和测序的寡核苷酸。除非另有指示，否则DNA测序也在ResGen进行。
对于聚合酶链式反应(PCR)，从纽英伦生物技术有限公司(NewEngland Biolabs，Inc.)(贝弗利，马萨诸塞州)购买Vent DNA聚合酶和缓冲剂，从安发玛西亚公司(Amersham-Pharmacia)(皮斯卡塔韦，新泽西)购买dNTPs的混合物，除非另有规定，根据生产商的说明来使用。PCR扩增是在珀金--埃尔默公司(Perkin-Elmer Corporation)(福斯特城，加利福尼亚州)的GeneAmp 2400热循环仪上进行的。使用生产商所推荐的Qiagen PCR离心柱(Qiagen公司，沙斯沃斯，加利福尼亚州)纯化该PCR产物。除非另有规定，从纽英伦生物技术有限公司购买限制性酶，以及用琼脂糖(Sigma-Aldrich)凝胶分离DNA片段，用限制性酶处理，然后用于克隆。
切取所需片段，如由生产商所推荐的那样用QIAEX II凝胶提取试剂盒提取DNA。将DNA再悬浮(resuspend)于水或TE(1mM乙二胺四乙酸(EDTA；pH8.0；Sigma-Aldrich)，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl；pH 8.0；Sigma-Aldrich)。如由生产商所推荐，采用DNA连接酶(宝灵曼公司(Boehringer Mannheim Corporation)，印第安纳波利斯，印第安州)进行连接。连接反应在16℃下孵育过夜。使用大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue感受态细胞进行细菌转化。除非另有规定，将转化物和细菌再划线(bacterial restreaks)平板接种在补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox)板上。所有细菌孵育(板和液体培养物)在37℃下进行一夜(16小时)。
通过用限制性酶消化微量制备的DNA和/或通过PCR克隆来完成转化体的筛选，以鉴定所需克隆。除非另有规定，微量制备DNA是根据分子克隆：实验室手册来制备。来自转化板的含有所需克隆的菌落进行繁殖，或者在-70℃下在甘油中储存。
抗原生产
实施例1
重组FMDV VP1抗原的制备
A、FMDV VP1表达载体的构建
(i)合成VP1基因的构建
由NCBI GenBank数据库获取口蹄疫病毒台湾型O 97序列的VP1蛋白，以及在ResGen公司(亨茨维尔，阿拉巴马州)合成用于合成基因的寡核苷酸。在合成寡核苷酸过程中，改变天然FMDV密码子，使之符合大肠杆菌密码子偏倚，以便提高该重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平。例如，参见M.Gouy和C.Gautier，《核酸研究》(Nucleic AcidsResearch)10：7055(1982)；H.Grosjean和W.Fiers，《基因》(Gene)18：199(1982)；J.Watson等人(eds.)，《基因分子生物学》(MolecularBiology of the Gene)，4th Ed.，Benjamin Kumming Publishing Co.，第440页(1987)。使用回归PCR方法来将寡核苷酸组装到全长VP1基因中。基因构建策略涉及系列具有互补末端的重叠寡核苷酸的合成。当退火时，这些末端用作延伸互补链的引物。这些片段然后通过过量外部引物来扩增。
寡核苷酸被设计成含有一个用于克隆到表达载体pGEX-4T-1的BamHI限制位点。
反向寡核苷酸含有一翻译终止密码子(TAA)和EcoRI限制位点。当采用外部引物TW97-1(SEQ ID NO：1)和TW97-16(SEQ ID NO：16)时，合成整个VP1(213个氨基酸)基因(SEQ ID NO：118)。
以下详细描述了回归PCR的这些步骤。
PCR反应(100μl体积)如下设置：
Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲液，以及25μM的各种dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，50pmol的各寡核苷酸TW97-1(SEQ IDNO：1)和TW 97-16(SEQ ID NO：1)，以及0.25pmol各种寡核苷酸TW97-2(SEQ ID NO：2)到TW97-15(SEQ ID NO：15)。
该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时15秒、58℃时15秒和72℃时60秒的30个循环扩增，随后在72℃下孵育5分钟。PCR获得的产物用Qiagen PCR离心柱纯化。
(ii)PCR产物的克隆
如上所述扩增的PCR产物用限制性内切酶Bam HI+Eco RI消化，连接于已经用Bam HI+Eco RI消化并凝胶分离的载体pGEX-4T-1。该连接产物用来转化XL-1 Blue感受态细胞。将转化后的细胞平板接种于补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。由菌落的过夜培养物制备微量制备DNA，并用Bam HI+Eco RI消化，以筛选所需克隆。具有正确插入的克隆被命名为pBM-VP1Tw97F(图6)。
pBM-VP1Tw97F克隆用寡核苷酸引物pGEX 5(SEQ ID NO：116)和pGEX3(SEQ ID NO：117)测序。
B.具有VP1质粒的大肠杆菌(E.coli)菌株的生长和诱导
在补充了100μg/ml氨苄青霉素的500ml无菌LB中制备各大肠杆菌克隆的过夜种子培养物，并投入37℃的振荡回转培养箱(shakingorbital incubator)中。
将50ml的来自种子培养物的接种体转移到含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的0.5L无菌LB的烧瓶内。在37℃下孵育培养物，直到培养物达到中-对数期生长为止，然后用1mM ITPG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃下诱导3小时。在诱导期之后，通过离心来使细胞成粒，按照标准工序收获。粒化细胞在-70℃下储存，直到进一步处理为止。
C.VP1抗原的制备
将由实施例B获得的冷冻细胞再悬浮于具有1mM PMSF的PBS中。
通过超声破碎(必能信(Branson))来碎解细胞。通过离心将包含体与可溶性蛋白分离。将粒化包含体在(1)PBS；和(2)水中顺次洗涤。用简短的超声处理将洗涤的包含体再悬浮于PBS和5M脲的溶液中。再次，将离心造粒的包含体完全溶解在7M胍-HCl中。溶解的重组抗原通过离心来澄清，再通过0.2μm滤器。
将胍-HCl溶解的融合蛋白在水中稀释以变性，通过离心来沉淀该变性蛋白。将该颗粒用水洗涤，并再悬浮于水中。添加2M NaOH溶液，以完全溶解变性蛋白，然后中和蛋白溶液的pH。
实施例2
重组FMDV 2C抗原的制备
A.FMDV 2C表达载体的构建
从NCBI GenBank数据库(GI：5921457，O菌株Chu-Pei)获取FMDV2C蛋白的基因组序列，在ResGen(亨茨维尔，阿拉巴马州)合成用于整个2C基因的合成和测序的寡核苷酸。编码DNA序列长达954个核苷酸，其编码318个氨基酸(SEQ ID NO：119)。
(i)合成全长2C基因的构建
为了获得FMD病毒的2C基因，在Resgen合成24个寡核苷酸引物，各自具有互补末端。
我们采用回归PCR方法来将寡核苷酸组装成完整2C基因。基因构建策略涉及合成一系列具有互补末端的重叠寡核苷酸。当退火时，这些末端用作延伸互补链的引物。这些片段然后通过过量外部引物来扩增。因为所要合成的2C基因较大，将寡核苷酸分为三组，进行各自的回归PCR。所产生的DNA被称为A、B和C片段。B和C片段用PCR连接，然后将B-C片段与A片段连接，形成完整2C基因。寡核苷酸之一被设计成含有用于克隆到表达载体pGEX-4T-1的BamHI限制位点。
该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、53℃时30秒和73℃时100秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。反应混合物的等份试样通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析。
(ii)PCR产物的克隆
用限制性内切酶Bam HI+Hind III消化如上所述扩增的PCR产物，将之连接于预先用Bam HI+Hind III消化的载体pGEX-4T-1。该连接产物用来转化大肠杆菌XL-1 Blue感受态细胞。将经转化后的细胞平板接种于补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。采用QIAprep质粒DNA微量制备试剂盒从转化菌落的过夜培养物制备微量制备DNA，并用BamHI+Hind III消化，以筛选所需克隆。具有正确插入的克隆被命名为pGEX-2CTw97F(图7)。
pGEX-2CTw97F克隆用寡核苷酸引物pGEX 5(SEQ ID NO：116)、pGEX3(SEQ ID NO：117)、2C-25(SEQ ID NO：41)和2C-26(SEQ ID NO：42)测序。
B.带有2C质粒的大肠杆菌菌株的生长和诱导
在补充了100μg/ml氨苄青霉素的500ml无菌LB中制备pGEX-2CTw97F的过夜种子培养物，并投入37℃的振荡回转培养箱中。将50ml的来自种子培养物的接种体转移到含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的0.5L无菌LB的烧瓶内。培养物在37℃下孵育，直到培养物达到中-对数期生长为止，然后用1mM ITPG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃下诱导3小时。在诱导期之后，通过离心来使细胞成粒，按照标准工序收获。粒化细胞在-70℃下储存，直到进一步处理为止。
C.FMDV 2C抗原的制备
将由实施例2B获得的冷冻细胞再悬浮于具有1mM PMSF和TritonX-100洗涤剂的PBS中，然后通过超声破碎(Branson)来碎解。通过离心将包含体与可溶性蛋白分离。通过3-4轮的洗去污染物和将细胞溶解产物颗粒溶解在尿素或胍-HCl中来获得富含2C的蛋白部分。重组2C通过尺寸排阻色谱法(FPLC，Sephacryl S 200HR)在变性条件下(5NGuHCl，PBS(pH 7.4))纯化，含有2C的洗脱部分通过SDS-PAGE鉴定，用20mM磷酸盐缓冲剂(pH9.0)渗析。在添加叠氮化钠至0.05％之后冰冻储存蛋白溶液。为了保存更久(超过1个月)，将蛋白溶液取等份试样，在-70℃下冰冻。
实施例3
重组FMDV 3ABC抗原的制备
A.FMDV 3ABC表达载体的构建
从NCBI GenBank数据库(GI：5921457，O菌株Chu-Pei)获取FMDV3ABC蛋白的基因组序列，在ResGen(亨茨维尔，阿拉巴马州)合成用于整个3ABC基因的合成和测序的寡核苷酸。编码DNA序列长达1281个核苷酸，其编码427个氨基酸(SEQ ID NO：120)。
(i)合成全长3ABC基因的构建
为了获得FMD病毒的3ABC基因，在Resgen合成33个寡核苷酸引物，各自具有互补末端。
我们采用回归PCR方法来将寡核苷酸组装成完全3ABC基因。基因构建策略涉及合成具有系列互补末端的重叠寡核苷酸。当退火时，这些末端用作延伸互补链的引物。这些片段然后通过过量外部引物来扩增。
因为所要合成的3ABC基因较大，将寡核苷酸分为四组，进行各自的回归PCR。所产生的DNA被称为A、B、C和D片段。通过PCR，将A和B片段连接，将C和D片段连接。然后将A-B片段与C-D片段连接，形成完整3ABC基因。
寡核苷酸之一被设计成含有用于克隆到表达载体pGEX-4T-1的Bam HI限制位点。该反义寡核苷酸含有一翻译终止密码子(TAA)和EcoRI限制位点。当采用N-和C-末端引物，3ABC-1(SEQ ID NO：43)和3ABC-33(SEQ ID NO：75)，合成了全长3ABC(427个氨基酸)基因。
PCR反应(100μl体积)如下设置：
Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25μM的各dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO4和100pmol的各寡核苷酸。模板是上述A-B片段和C-D片段的混合物。
反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、60℃时30秒和73℃时120秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。PCR获得的产物在琼脂糖凝胶上跑胶，切取DNA带，使用Quigen凝胶提取试剂盒将之从凝胶上洗脱。
(ii)PCR产物的克隆
用限制性内切酶Bam HI+Hind III消化如上所述扩增的PCR产物，将之连接于预先用Bam HI+Hind III消化的载体pGEX-4T-1。该连接产物用来转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞。将经转化的细胞平板接种于补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。采用QIAprep质粒DNA微量制备试剂盒从转化的菌落的过夜培养物制备微量制备DNA，并用BamHI+Hind III消化，以筛选所需克隆。具有正确插入的克隆被命名为pBM-3ABCTw97F(图8)。
pBM-3ABCTw97F克隆用寡核苷酸引物pGEX 5(SEQ ID NO：116)、pGEX3(SEQ ID NO：117)、3ABC-36(SEQ ID NO：78)和3ABC-37(SEQ IDNO：79)测序。
B.具有E3ABC质粒的大肠杆菌菌株的生长和诱导
在补充了100μg/ml氨苄青霉素的500ml无菌LB中制备pGEX-3ABCTw97F的过夜种子培养物，并投入到37℃的振荡回转培养箱中。将50ml的来自种子培养物的接种体转移到含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的0.5L无菌LB的烧瓶内。培养物在37℃下孵育，直到培养物达到中-对数期生长为止，然后用1mM ITPG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃下诱导3小时。在诱导期之后，通过离心来使细胞成粒，按照标准工序收获。粒化细胞在-70℃下储存，直到进一步处理为止。
C.FMDV 3ABC抗原的制备
将由实施例3B获得的冷冻细胞再悬浮于具有1mM PMSF和TritonX-100洗涤剂的PBS中，然后通过超声破碎(Branson)来碎解。通过离心将包含体与可溶性蛋白分离。通过3-4轮洗去污染物和将细胞溶解产物颗粒溶解在尿素中来获得富含3ABC的蛋白部分。重组3ABC通过离子交换色谱法(FPLC，Q-Sepharose FF)在变性条件下(8M尿素，10mM DTT，20mM磷酸钾，pH 7.0)纯化，用NaCl梯度洗脱。洗脱部分用20mM磷酸盐缓冲剂(pH9.0)渗析。在用布拉德福(Bradford)方法测定蛋白浓度和添加叠氮化钠至0.05％之后，冰冻储存蛋白溶液。为了保存更久(超过1个月)，将该蛋白溶液取等份试样，在-70℃下冰冻。
实施例4
重组FMDV 3D抗原的制备
A.FMDV 3D表达载体的构建
(i)合成全长3D基因的构建
为了获得FMD病毒的3D基因，在Resgen合成36个各自具有互补末端的寡核苷酸，。我们采用回归PCR方法来将寡核苷酸组装成完整3D基因(SEQ ID NO：121)。基因构建策略涉及合成系列具有互补末端的重叠寡核苷酸。当退火时，这些末端用作延伸互补链的引物。这些片段然后通过过量外部引物来扩增。
因为所要合成的3D基因较大，将寡核苷酸分为三组，进行回归PCR。所产生的DNA被称为A、B和C片段。用PCR将B和C片段连接，然后将B-C片段与A片段连接，形成完整3D基因。
寡核苷酸被设计成含有一用于克隆到表达载体pGEX-4T-1的BamHI限制位点。
反义寡核苷酸含有翻译终止密码子(TAA)和EcoRI限制位点。当采用N-和C-末端引物，3d-1A(SEQ ID NO：80)和3d-36A(SEQ IDNO：115)，合成了全长3D(470个氨基酸)基因。
以下详细描述了这些步骤：
1.3DA片段PCR
PCR反应(100μl体积)如下设置：
Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25μM的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO4、100pmol的各寡核苷酸3d-1A(SEQ ID NO：80)和3d-14(SEQ ID NO：93)。模板是0.83pmol的各寡核苷酸3d-1A到3d-14的混合物。
该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒，53℃时30秒和73℃时100秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析反应混合物的等份试样。
2.3DB片段PCR
PCR反应(100μl体积)如下设置：
Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25uM的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO4，100pmol的各寡核苷酸3d-13(SEQ ID NO：92)和3d-24(SEQ ID NO：103)。模板是0.83pmol的各寡核苷酸3d-13到3d-24的混合物。
该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒，55℃时30秒和72℃时90秒的35个循环扩增，随后在72℃下孵育5分钟。通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析反应混合物的等份试样。
3.3DC片段PCR
PCR反应(100μl体积)如下设置：
Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25uM的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO4，100pmol的各寡核苷酸3d-25(SEQ ID NO：104)和3d-36A(SEQ ID NO：115)。模板是0.83pmol的各寡核苷酸3d-25到3d-36A的混合物。
该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、53℃时30秒和73℃时100秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析反应混合物的等份试样。
4.3DB-C片段PCR
PCR反应(100μl体积)如下设置：
Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25uM的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO4，100pmol的各寡核苷酸3d-13(SEQ ID NO：92)和3d-36A(SEQ ID NO：115)。模板是上述B和C片段的混合物。
该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、55℃时30秒和73℃时90秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析反应混合物的等份试样。
5.全长3D(ABC)片段PCR
PCR反应(100μl体积)如下设置：
Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25uM的各dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO4，100pmol的各寡核苷酸3d-1A(SEQ ID NO：80)和3d-36A(SEQ ID NO：115)。模板是上述A、B和C片段的混合物。
该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、60℃时30秒和73℃时120秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。PCR获得的产物在琼脂糖凝胶上跑胶，由该凝胶切取DNA带，使用Quigen凝胶提取试剂盒洗脱DNA。
(ii)PCR产物的克隆
用限制性内切酶Bam HI+Eco RI消化如上所述扩增的PCR产物，将之连接于已经用Bam HI+Eco RI消化的载体pGEX-4T-1，进行凝胶分离。该连接产物用来转化XL-1 Blue感受态细胞。将经转化的细胞平板接种于补加了100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。由菌落的过夜培养物制备微量制备DNA，并用Bam HI+Eco RI消化，以筛选所需克隆。具有正确插入的克隆被命名为pGEX-3Df(图9)。
B.具有pGEX-3Df的大肠杆菌菌株的生长和诱导
为了表达重组GST-3D蛋白，将pGEX-3Df质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，将该转化体涂布在补加了100ug/ml氨苄青霉素的LB-琼脂板上。
在补加了100μg/ml氨苄青霉素的500ml无菌LB中制备pGEX-3Df克隆的过夜种子培养物，并投入到37℃的振荡回转培养箱中。将50ml的来自种子培养物的接种体转移到含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的0.5L无菌LB的烧瓶内。培养物在37℃下孵育，直到培养物达到中-对数期生长为止，然后用1mM ITPG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃下诱导3小时。在诱导期之后，通过离心来使细胞成粒，按照以下标准工序收获。在-70℃下储存该粒化细胞，直到进一步处理为止。
C.GST-3D蛋白的制备
将由实施例获得的冷冻细胞再悬浮于含有1mM PMSF的PBS中。
细胞通过超声破碎(Branson，S-125型)来溶解。通过离心细胞溶解产物(10,000rpm，30分钟)制备可溶性粗溶解产物，再用0.45um针头式过滤器(赛多利斯(Sartorius))过滤。
进行谷胱甘肽亲和层析，以纯化rGST-3D蛋白。将可溶性细胞溶解产物加载到用PBS平衡的谷胱甘肽sepharose4B(法玛西亚)柱子中。在用三个床体积的PBS洗涤柱子之后，用10mM还原型谷胱甘肽洗脱GST-3D，50mM Tris-HCl，pH8.0缓冲溶液洗脱。在8％SDS-PAGE上分析该洗脱部分。含有融合蛋白的部分在PBS中过夜渗析。
试剂盒分析
实施例5
FMDV抗体检测试剂盒配方
A.抗原印膜(antigen printed membrane)的制备
由储备溶液将重组2C和3ABC调节和混合至0.5mg/ml，用0.22μm过滤单元Millex-GV(密理博(Millipore))过滤。在过滤后，使用在PBS中的抗生物素蛋白溶液(pH 7.4)作为内对照。采用Bio-Dot设备(Bio-Dot)将抗原混合物和对照溶液施加于硝基纤维素膜上。在低湿度房间中过夜干燥后，该膜用在PBS中的3％BSA封闭20分钟，然后用风扇干燥至少2小时。处理过的膜板必须在具有干燥剂的封闭容器或低湿度房间中储存。
B.蛋白G-金缀合物的制备
从西格玛公司购买用以消除与血清白蛋白的非特异结合的工程重组蛋白G，并且使之达到1mg/ml的浓度。在搅拌的同时将蛋白G滴加到金溶液中，使之达到10μg/ml的最终浓度，将该溶液保持搅拌15分钟。然后，将15％BSA溶液加入到所用金颗粒悬浮液中。在搅拌另外15分钟后，离心偶联的金溶液，丢弃上清液，以便除去未结合的蛋白G。向偶联的金溶液添加2％BSA，在声波浴(必能信#2200型或同等物)中进行超声处理，以便将该颗粒物再悬浮。将该悬浮液再次离心，最终颗粒物悬浮在2％BSA中，在冰箱中储存。
C.生物素-BSA-金共轭物的制备：对照指示剂
从Pierce公司购买的生物素化BSA用于金偶联。共轭工序基本上与以上用于蛋白G所述程序相同。用强烈搅拌将每毫升含有10μg的生物素化BSA的金颗粒悬浮液加入到金溶液中。在偶联反应结束时，添加每毫升含有15％BSA溶液的金颗粒悬浮液。在搅拌另外15分钟后，离心该生物素-BSA偶联金共轭物悬浮液，丢弃上清液，以除去未结合的生物素-BSA。向偶联金溶液的颗粒物添加2％BSA(10mM磷酸钠，pH7.5)，再次离心悬浮液，洗涤。将颗粒物悬浮于2％BSA中，在冰箱中储存。
D.滤垫的制备(还用作染色垫)
采用染料稀释缓冲液(1％酪蛋白，100mM磷酸钠，pH7.0)稀释蛋白G偶联的金溶液。添加生物素-BSA偶联的金溶液，用于产生结合于膜上的抗生物素蛋白的对照线。将稀释的金溶液涂布到垫条(Lydallpad strip)(微玻璃纸)上，在冷冻干燥机中干燥。将该利得尔垫储存在低湿度房间中备用。
E.储藏垫的制备
将纤维素滤纸预先浸泡在预处理缓冲液(100mM磷酸钠，pH7.0)中，在吸干过量液体之后用风扇干燥。将所制备的储藏垫储存在低湿度房间中。
F.设备组件(device assembly)
当将保护片从顶部的带子上剥离之后，沿板的长轴贴附吸收垫。当将保护片从板的底部的带子上剥离之后，沿板的长轴，在试验膜区域下面贴附滤垫。染色垫应该重叠在试验膜的底部。然后，将储藏垫贴附于该板，以覆盖滤垫的底部。将整修过的膜板切割成宽度适于安装到壳体的长条。
结果
采用共计1540份鉴定的牛、猪、山羊和绵羊血清。试验血清由接种疫苗前的阴性动物、未感染和接种疫苗的动物以及感染动物组成。对于各试验牛，采用3ABC ELISA(意大利和美国农业部，美国)作为参照试验。总之，相对灵敏度、特异性和总精确率分别是98.6％(69/70)、98.6％(1449/1470)和98.6％(1518/1540)。
本发明试验/参照试验
BioSignTM FMDV
Figure S03826670919950404D000241
工业应用性
根据本发明，基于由动物获得的试样，可以快速、准确地诊断动物是否感染了口蹄疫病毒(FMDV)。此外，如果适当，仅用少量试样还可以区分FMV接种疫苗的动物和感染动物。因此，这使得可以容易和快速测定FMV易感动物是否感染了FMV，不管是否进行了FMV疫苗接种。
虽然为了说明的目的公开了本发明的优选实施方式，本领域的那些技术人员会清楚，在不偏离如在所附权利要求书中公开的本发明的范围和主旨的情况下，各种改变、增加和替代是可能的。因此，本发明的实施方式仅仅用FMDV抗原来说明，但本发明的范围和主旨当然还可以适用于检测FMDV抗体、PRRSV(猪呼吸和生殖症状病毒)抗原和抗体、FeLV(猫白血病毒)、FIV(猫免疫缺陷病毒)抗体、狂犬病的诊断标记物、CSF(传统猪瘟)抗原和抗体、犬布鲁氏菌(Brucellosis canis)抗原和抗体、Johnes抗体、BVDV(牛病毒型腹泻病毒)抗原和抗体。
此外，本发明适用于生物体中的多种疾病标记物，比如试样中的癌诊断标记物、激素、酶、药物和各种抗原。
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Claims (15)

1.一种用于诊断口蹄疫病毒感染的试剂盒，其包含：
一试纸条，其包括设置于芯吸膜的预定区域上的一含有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区，以及一用于确定试剂盒的正常操作的对照区；以及
一接收该试纸条的壳体，其包括至少一试样施加口和一标记窗，该标记窗用于观测试纸条上的反应区和对照区中的反应结果，
其中，该固定相含有至少一种以上的选自FMDV衍生的非结构蛋白和/或结构蛋白中的蛋白，
其中，该固定相是结构蛋白VP1-VP4多肽或一种灭活FMDV病毒分解材料，和
其中，该固定相含有选自非结构蛋白前导肽(Lb)、2B、2C、3D、3A、3AB和3ABC中的至少一种以上的多肽。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，该反应区包括一第一反应区，其含有选自能够用于生产疫苗的结构蛋白和3D蛋白中的至少一种；以及一第二反应区，其含有选自除了3D以外的非结构蛋白中的至少一种。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其中，该检测试剂设置在该试纸条上的任何部位。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，该检测试剂包括选自能够结合于标记蛋白G、蛋白A、蛋白G/A、或物种特异性IgG和IgM的抗体中的至少一种以上的材料。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其中，该试纸条的构造为，其中一储藏垫、一用于过滤试样的与储藏垫的一端接触的滤垫、一用于通过毛细管作用移动过滤后样品的与滤垫的一端接触的芯吸膜，以及一与该芯吸膜的一端接触的吸收垫，都按序在基底元件上连接。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其中，该检测试剂设置在该试纸条的任何位置。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其中，该基底元件由塑料或玻璃材料制成。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其中，该检测试剂含有一预定标记，使得所要研究的分析物能够通过肉眼或其它仪器从外部确定。
9.如权利要求5所述的试剂盒，其中，该检测试剂含有选自催化剂、酶、酶的底物、荧光化合物、化学发光化合物、放射性元素、金属溶胶、非金属溶胶、染料溶胶、颜色指示剂、脂质体中含有的颜色物质、胶乳颗粒和免疫化学标记中的至少一种标记。
10.如权利要求1所述的试剂盒，其中，该试样中的分析物是抗原、抗体或半抗原和它们的任何结合物。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其中，该抗体是单克隆或多克隆抗体。
12.如权利要求5所述的试剂盒，其中，该试纸条进一步包括在储藏垫和滤垫之间的另一滤垫。
13.如权利要求1所述的试剂盒，其中，该用于芯吸膜的材料是选自尼龙、聚酯、纤维素、聚砜、聚偏氟乙烯、乙酸纤维素、聚氨酯、玻璃纤维和硝基纤维素中的至少一种以上的材料。
14.如权利要求1所述的试剂盒，其中，该构成对照区的固定相是选自抗生物素蛋白、生物素、FITC、抗FITC抗体、鼠免疫球蛋白和抗鼠免疫球蛋白抗体中的一种。
15.如权利要求1所述的试剂盒，其中，该对照试剂选自特异地结合于构成芯吸膜上的对照区的该固定相的标记蛋白、抗原和抗体。
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