KR20120112621A

KR20120112621A - Ｊｃ 바이러스 항체에 대한 검정법

Info

Publication number: KR20120112621A
Application number: KR1020127019171A
Authority: KR
Inventors: 레오니드 고렐릭; 케네쓰 제이. 시몬; 미나 서브라만얌; 미아 마리 루쉐
Original assignee: 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드
Priority date: 2010-01-11
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2012-10-11
Also published as: EP2524060A1; CY1119972T1; SG181653A1; LT3339865T; MX341991B; SI2524060T1; EP2524060B1; WO2011085369A1; FI3339865T5; CN102906278A; HRP20180356T1; HUE036183T2; AU2011203815B2; RS56977B1; PL3339865T3; EP4152004A1; EP3339865B1; JP2013516633A; CY1126069T1; US9316641B2

Abstract

본 개시내용은 JC 바이러스 항체의 존재에 대하여 샘플을 분석하기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 대상체로부터 생물학적 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 혈액, 소변 또는 뇌척수액)을 수득하는 단계; 해당 샘플을 고도로 정제된 바이러스-유사 입자(HPVLP)와 해당 샘플 중의 JCV 항체의 HPVLP에 대한 결합에 적절한 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및 HPVLP에 대한 해당 샘플 중의 JCV 항체 결합 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일 실시형태에서, 대상체 샘플에서 항-JCV 항체 수준을 결정하는 것은 대상체에서 PML 위험을 확인하는 방법을 제공한다.

Description

ＪＣ 바이러스 항체에 대한 검정법{ASSAY FOR JC VIRUS ANTIBODIES}

관련 출원

본 출원은 미국 가출원 제61/294,048호(출원일: 2010년 1월 11일) 및 미국 가출원 제61/316,193호(출원일: 2010년 3월 22일)의 이익을 주장하며, 이들 둘 모두는 본 명세서에 그들 전문이 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 샘플을 JC 바이러스 항체의 존재에 대하여 분석하기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다.

진행성다병소성백질뇌증(Progressive Multifocal Leukoencephalopathy, PML)은 지속적 면역 억제 또는 면역 조절의 조건 하에서만 인간에서 병원성인 것으로 여겨지는 폴리오마 바이러스인 JC 바이러스(JCV)에 대한 노출과 관련된 중추신경계(CNS)의 기회 감염이다. JCV의 존재가 PML의 발병에 필요하지만, PML 위험은 잘 파악되어있지 않은 방식으로, 바이러스가 병원성이 되게 유발하는 다중의 바이러스 및 숙주-관련 인자의 수렴과 관련이 있는 것으로 여겨진다(문헌[Major, "Progressive Multifocal Leukoencephalopathy in Patients on Immunomodulatory Therapies" Annu. Rev. Med. 61:35-47 (2010) [2009년 8월 31일, 전자 논문 상태]). 인간 집단에서 JCV 감염의 유병률을 기록한 공개된 연구는 다양하다. 이러한 정보는 JCV에 대한 항체의 검출 및 바이러스 DNA에 대한 PCR 분석을 비롯한 다양한 유형의 연구를 기초로 한다. 상기 집단에서의 JCV의 유병률에도 불구하고, JCV로의 감염은 심지어 면역억제가 입증되어 있는 개체에서도 드물게 PML을 야기한다.

JCV DNA 검출에 대한 공개된 보고에서는 JCV에 대한 노출을 평가하기 위한 방법이 민감하지 않으며, 제한된 용도인 것으로 제시되었는데, 이는 JCV DNA가 JCV-감염된 PML 환자의 혈장, 혈청 또는 말초 혈액 단핵 세포에서 드물게, 그리고 일관성 없이 검출되기 때문이다. 항-JCV 항체의 검출이 JCV 감염의 보다 민감한 마커(marker)인 것으로 보이나; 보고된 결과는 다양하다. 1973년도에, 파제트와 워커는 혈구응집 저해(HI) 검정법을 사용하여 65-84%의 JCV 혈청학적 유병률(seroprevalence)을 보고하는 연구를 공개하였다(Padgett and Walker, "Prevalence of antibodies in human sera agains JC virus, an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy" J. Infect. Dis. 127:467-70, 1973). 이후의 HI 검정법 또는 ELISA를 사용한 JCV 혈청학적 유병률의 보고에서는 33 내지 91%로 변하였다. 이들 연구 중의 가변적인 혈청학적 유병률은 아마도, 연구의 크기 및 인구통계학의 현저한 차이와, 아마도, 가장 중요한 것은 검정법의 차이 때문일 것 같다.

따라서, 예를 들어, 개체가 JCV에 노출된 적이 있는지를 평가하기 위하여 사용될 수 있는 JCV 항체의 존재를 결정하기 위한 신뢰성 있으면서 민감한 검정법을 이행하는 것이 요구된다.

본 발명은 생물학적 유체, 예컨대 혈청 또는 혈장에서 JCV 항체의 존재를 검출하기 위한 분석학적으로 입증되고 민감한 검정법의 개발에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 대상체로부터 생물학적 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 혈액, 소변 또는 뇌척수액(CSF))을 수득하는 단계; 해당 샘플 중의 JCV 항체와 HPVLP의 결합에 적절한 조건 하에서 해당 샘플을 고도로 정제된 바이러스-유사 입자(HPVLP)와 접촉시키는 단계; HPVLP에 대한 해당 샘플 중의 JCV 항체 결합 수준을 검출하는 단계; 및 검출된 수준을 기준(reference)과 상호관련시키는 단계로서, 기준이 3% 이하의 위음성률(false negative rate)과, 다른 폴리오마 바이러스, 예컨대 BK 바이러스(BKV)에 대한 항체와 같은 샘플의 다른 구성성분에 대하여 최소의 교차 반응성을 나타내도록 선택되게 하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 대조군 샘플 또는 샘플의 세트로부터 유도된 기준은 대상체로부터의 샘플과 함께 처리한다. 몇몇 실시형태에서, 기준은 검정법의 위음성률이 1% 이하로 되도록 선택된다.

일 실시형태에서, 정제된 HPVLP의 제제에서 적어도 약 10%의 HPVLP는 HPVLP당 5개 초과의 VP1 폴리펩티드를 함유한다. 다른 실시형태에서, 정제된 HPVLP의 제제에서 적어도 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 HPVLP는 HPVLP당 5개 초과의 VP1 폴리펩티드를 함유한다.

검정법은 HPVLP가 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 또는 슬라이드와 같은 고체 지지체상에 고정되도록 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, HPVLP는 본질적으로 VP1 바이러스 단백질로 이루어진다. HPVLP는 추가로 다른 바이러스 단백질, 예컨대 VP2 또는 VP3 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. HPVLP에서 바이러스 단백질(들)은 재조합으로 유도될 수 있거나(예를 들어, MAD1 스트레인 VP1) 또는 자연 발생 바이러스 단백질일 수 있다(예를 들어, 자연 발생 공급원으로부터 유도). 상기 방법은 예를 들어, 면역조절 약물로 치료 중인 대상체, 면역조절 약물로의 치료를 개시하는 것을 고려 중인 대상체, 또는 진행성다병소성백질뇌증(PML)이 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.

몇몇 태양에서, 대상체로부터의 일부의 생물학적 샘플을 용액 중의 HPVLP와 접촉시켜(샘플을 고체 지지체에 부착된 HPVLP와 함께 인큐베이션시키기 이전), 2차 샘플을 제공하는 단계; 2차 샘플을 1차 검정법을 위해 사용된 동일한 조건 하에서 HPVLP와 접촉시키는 단계; 2차 샘플에서 HPVLP에 대한 JCV 항체 결합 수준을 검출하는 단계; 2차 샘플에서 검출된 JCV 항체 수준을 용해성 HPVLP와 사전인큐베이션하지 않은 샘플 중의 JCV 항체 수준과 비교하는 단계로서, 사전인큐베이션시키지 않은 샘플에 비한, 2차 검정법 샘플 중의 검출 수준의 감소는 샘플이 JCV 항체에 대하여 양성임을 나타내며, 검출 수준의 특정 백분율 미만의 변화는 샘플에 JCV-특이적 항체가 존재하지 않음을 나타내는 것인 단계를 포함하는 2차 확인 검정법 방법을 추가로 포함하는 검정법은 2-단계 검정법이다.

본 명세서에 기재된 검정법은 면역조절제로 치료받은 적이 전혀 없는 대상체; 또는 이전에 면역조절제를 받은 적이 있으나, 더 이상 면역조절제로 치료받지 않는 대상체; 또는 현재 면역조절제로 치료받고 있는 대상체에서 JCV 항체의 존재에 대하여 검정법하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 특징적인 검정법에서 HPVLP에 대한 JCV 항체 결합의 검출은 대상체가 PML에 대한 증가된 위험 상태에 있음을 나타낼 수 있다. 또한, JCV 항체의 검출은 특정 치료제, 예컨대 특정 면역조절제의 투여 시에, 대상체가 불리한 징후, 예컨대 PML의 발병에 대한 증가된 위험 상태에 있어, 이에 따라 대상체가 이들 약제로의 치료에 대한 후보가 아님을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터의 샘플에서 JCV 항체의 검출은 대상체가 항-VLA-4 치료제, 예컨대 나탈리주마브로의 치료에 대한 후보가 아님을 나타낼 수 있다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플 중의 JCV 항체의 검출은 대상체가 면역조절제, 예컨대 나탈리주마브로의 치료에 대한 후보임을 나타낼 수 있으나, 대상체는 검출가능한 JVC 항체를 갖지 않는 대상체보다 치료 동안에 증강된 모니터링을 겪을 것이다. 예를 들어, 증강된 모니터링은 불리한 징후, 예컨대 PML의 발병을 나타낼 수 있는 징후에 대한 관찰을 포함할 수 있다.

본 발명의 특징적인 검정법에서 HPVLP에 대한 JCV 항체 결합의 검출의 실패는 대상체가 면역조절제, 예컨대 나탈리주마브로의 치료를 받기 위한 후보임을 나타낼 수 있으며, 일 실시형태에서, 대상체에는 추가로 면역조절제를 투여한다. JCV 항체를 갖지 않는 것으로 결정된 대상체는 적어도 매년(예를 들어, 적어도 3개월마다, 6개월마다, 9개월마다 또는 12개월마다) 재시험하여, 대상체에 JCV 항체가 발생하였는지를 결정할 수 있으며, 이는 대상체가 JCV로 감염되었음을 나타낼 수 있다. 이전에 생물학적 샘플에서 검출가능한 JCV 항체를 갖지 않았으며, 이후에 생물학적 샘플에서 JCV 항체가 발생한 대상체는 면역조절제로 치료를 받는 것을 중단시킬 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 이전에 JCV 항체를 갖는 것으로 확인된 대상체는 이어서 이후의 날짜에 시험하고, JCV 항체를 갖지 않는 것으로 결정할 수 있다. 이들 대상체는 면역조절제, 예컨대 나탈리주마브로의 치료를 받기 위한 후보인 것으로 결정할 수 있다. 일 실시형태에서, 이전에 JCV 항체의 존재에 대하여 시험 결과가 양성이고, 그 후의 JCV 항체에 대한 시험 결과가 음성인 대상체에는 면역조절제를 투여하고, PML의 발병을 나타낼 수 있는 징후를 모니터링하는 것과 같이, JCV 항체에 대한 시험 결과가 양성이 아닌 대상체와 비교하여, 증강된 모니터링을 수행할 수 있다.

본 발명의 특징적인 검정법은 면역학적 질환 또는 장애, 예컨대 다발성 경화증(MS) 또는 크론병(CD)을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 검정법은 예를 들어, 검정법이 제어된 시험 환경에서, 예컨대 임상 시험에서, MS 및 CD 환자 내의 JCV 항체를 검출하는데 효과적임을 보여줌으로써, MS 및 CD 환자에서의 이용을 입증하였다.

다른 태양에서, 본 발명은 HPVLP, 및 샘플, 예컨대 생물학적 샘플 중의 JCV 항체 수준을 확인하기 위한 검정법을 수행하기 위한 적어도 하나의 시약을 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다.

다른 태양에서, 본 발명은 VP1 펜타머보다 크기가 더 큰, 예를 들어, 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 72개의 펜타머를 함유하거나, 약 25개 VP1 분자, 약 50개 VP1 분자, 약 100개 VP1 분자, 약 150개 VP1 분자, 약 200개 VP1 분자, 약 300개 VP1 분자, 약 350개 VP1 분자 또는 약 360개 VP1 분자를 함유하는 VP1-함유 입자로 본질적으로 이루어진 HPVLP 입자를 포함하는 용액에 관한 것이다.

본 발명의 특징적인 다른 태양은 HPVLP의 용액을 제조하는 방법이며, 이 방법은 VP1 펜타머의 크기이거나, 이보다 작은 VP1-함유 입자를 용액으로부터 제거하는 것을 포함한다. 한 방법에서, VP1 폴리펩티드를 세포에서, 예를 들어, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서 발현시킨다. 세포를 용해시킨 다음, 세포를 뉴클레아제(nuclease), 예컨대 벤조나제로 처리한다. 세포 데브리스(debris)를 침전에 의해, 예컨대 염(예를 들어, 황산암모늄) 침전에 의해 제거한 다음, VP1-함유 상층액을 농축시키고, 정용여과(diafiltration)를 사용하여, 예를 들어, 멤브레인(membrane), 예컨대 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF) 멤브레인을 통한 1 또는 2회의 통과에 의하여 추가로 정제한다. 그 다음, VP1-함유 입자, 예컨대 HPVLP를 함유하는 용액을 이온-교환 단계를 통해 추가로 정제하고, HPVLP의 용리를 예를 들어, 완충액을 사용하여 수행한다. VP1 순도를 예를 들어, 전기영동(예컨대, SDS-PAGE) 또는 질량 분석법으로 평가할 수 있다. HPVLP의 존재는 현미경, 예컨대 전자 현미경으로 확인할 수 있다. HPVLP의 형태의 전체 단백질의 백분율을 침강 속도 분석 초원심분리에 의해 결정할 수 있다.

일 태양에서, 본 발명은 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 해당 샘플 중의 JC 바이러스(JCV) 항체와 HPVLP의 결합에 적절한 조건 하에서 해당 생물학적 샘플을 HPVLP와 접촉시키는 단계; HPVLP에 대한 해당 샘플 중의 JCV 항체 결합 수준을 검출하는 단계; 및 검출된 수준을 기준 세트와 상호관련시키는 단계에 의한 것과 같은 PML이 발병할 위험 상태에 있는 대상체를 확인하는 방법을 특징으로 하며, 여기서, 대상체는 JCV 항체 결합이 검출된다면 증가된 PML의 위험 상태에 있다. 기준 세트는 약 5%, 약 3%, 약 1% 또는 그 미만의 위음성률을 나타내도록 선택된다.

다른 태양에서, 본 발명은 대상체로부터의 샘플, 예컨대 혈장, 혈액 또는 혈청 샘플 중의 항-JCV 항체 수준을 결정하는 단계; 및 샘플 중의 항-JCV 항체 수준에 따라 위험 수준을 대상체에 지정하는 단계에 의하여, 대상체에서 PML 위험을 확인하는 방법을 특징으로 한다. 대상체는 면역조절 치료법, 예컨대 항-VLA4 치료, 예를 들어, 나탈리주마브를 받을 수 있거나, 면역 조절 치료법을 받기 위한 후보일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 면역학적 질환 또는 장애, 예컨대 다발성 경화증 또는 크론병으로 진단받은 적이 있다. 일 실시형태에서, 항-JCV 항체 수준은 1-단계 검정법을 사용하여 결정하며, 다른 실시형태에서, 항-JCV 항체 수준은 2-단계 검정법을 사용하여 결정한다. 1-단계 검정법 또는 2-단계 검정법 중 어느 하나는 ELISA 검정법을 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, 대상체에서 PML 위험을 확인하는 방법은 초기 샘플 이후의 날짜로부터의 샘플에서 대상체 내의 항-JCV 항체 수준을 결정하는 단계; 이후의 날짜로부터의 샘플 중의 항-JCV 항체 수준을 초기 샘플로부터의 샘플 중의 수준과 비교하는 단계; 및 대상체가 초기 샘플의 시기에 비해 이후의 날짜에서 PML의 증가된 위험 상태에 있는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

일 태양에서, 본 발명은 대상체에서 PML 위험을 모니터링하는 방법을 특징으로 하며, 해당 방법은 제1 날짜로부터의 샘플을 사용하여 대상체에서 항-JCV 항체 수준을 결정하는 단계; 제1 날짜의 대상체에서의 항-JCV 항체 수준을 기초로, PML의 위험을 지정하는 단계(예를 들어, 고 또는 중간 또는 저 위험); 제2 날짜로부터의 샘플을 사용하여 대상체에서 항-JCV 항체 수준을 결정하는 단계; 제2 날짜의 대상체에서의 항-JCV 항체 수준을 기초로, PML의 위험을 지정하는 단계(예를 들어, 고 또는 중간 또는 저 위험)를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "HPVLP"는 주로 VP1 단백질로 이루어진 고도로 정제된 VLP("바이러스-유사 입자")이다. 본 발명의 특징적인 "HPVLP"는 주로, 주요 캡시드 단백질 "VP1"로 이루어지고, 이는 폴리오마바이러스, JC 바이러스(JCV)로부터의 자연 발생 VP1 또는 재조합 VP1일 수 있다. HPVLP는 예를 들어, VP1의 1개 초과의 펜타머 서브유닛, 적어도 10개의 펜타머 서브유닛, 적어도 20개의 펜타머 서브유닛, 적어도 30개의 펜타머 서브유닛, 적어도 50개의 펜타머 서브유닛, 적어도 72개의 펜타머 서브유닛 또는 그 이상으로 이루어질 수 있다. HPVLP는 미결정 구성으로 VP1 폴리펩티드를 함유할 수 있으며(예를 들어, 폴리펩티드는 펜타머로 구성되거나 이로 구성되지 않을 수 있다), 이 경우에, HPVLP는 5개 초과의 VP1 폴리펩티드, 적어도 50개의 VP1 폴리펩티드, 적어도 150개의 VP1 폴리펩티드, 적어도 360개의 VP1 폴리펩티드 또는 그 이상으로 이루어질 수 있다. HPVLP는 캡소미어(capsomere)를 포함하며, 캡소미어는 약 10 내지 24개 펜타머를 함유한다. 본 발명의 특징적인 HPVLP는 자연-발생, 무손상(intact) JC 바이러스에 대한 항체에 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, HPVLP는 JC 바이러스의 마이너(minor) 캡시드 단백질인 제2 및 임의로 제3의 폴리펩티드의 유형, 예를 들어, 적어도 하나의 VP2 또는 VP3 폴리펩티드를 포함한다. VP2 또는 VP3은 재조합 또는 자연-발생 또는 자연-유래 폴리펩티드일 수 있다.

이러한 "고도로 정제된" 입자는 1개 초과의 VP1 펜타머, 예를 들어, 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 72개 VP1 펜타머 또는 100개 미만의 VP1 펜타머를 함유한다. 이러한 고도로 정제된 입자는 예를 들어, 이중 여과를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, VLP의 고도로 정제된 제제는 예를 들어, 수크로스 쿠션을 통한 원심분리에 의하여 적어도 2회 입자를 정제함으로써 수득된다. 일반적으로, HPVLP 제제는 규정된 대조군 샘플을 사용한 ELISA 검정법에서의 그의 활성에 의해 확인될 수 있다. 몇몇 경우에, 이러한 대조군 샘플은 음성 대조군이고/이거나 낮은 수준의 JCV 항체를 함유하는 대조군 샘플이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용하는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명을 실시하는 데에는 본 명세서에서 기술한 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질은 하기에 기술한 것이다. 본 명세서에서 언급한 모든 공개 문헌, 특허출원, 특허 및 기타 다른 참조문헌은 그의 전문이 본 명세서에서 참고로 인용된다. 의견이 대립되는 경우에는, 정의를 포함한 본 명세서가 조정할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 설명을 위해 예시한 것이며, 이를 한정하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 하나 이상의 실시태양에 대한 상세한 설명은 첨부된 도면 및 하기 설명에 기술하였다. 본 발명의 기타 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 및 특허청구범위를 통해 자명해질 것이다.

도 1은 대상체의 소변에서 JCV DNA에 대해 양성인 대상체(소변양성(Uropositive)) 및 대상체의 소변에서 JCV DNA에 대하여 음성인 대상체(소변음성(Uronegative))로부터의 샘플 중의 HPVLP ELISA의 결과를 도시한 그래프이다. 박스형은 중심에 중선(median line)을 갖는 사분위(IQR) 범위를 나타내며; 대괄호는 1.5 × IQR 내의 관찰을 나타낸다. "+" 기호는 1.5 × IQR을 벗어나는 관찰(아웃라이어(outlier))을 나타낸다. ^*만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험.
도 2는 qPCR (n=204)로 측정시의 소변 JCV DNA 수준에 대한, ELISA에 의해 측정시의 항-JCV 항체 수준을 도시한 그래프이다. 열린 원은 매치되는 STRATA 시점에 수집한 소변 및 혈청 샘플을 나타낸다. 닫힌 원은 상이한 시점에 수집한 샘플을 나타낸다. 정량 수준 미만(< 500 카피/mL)의 DNA 시험 결과를 갖는 17개의 샘플에 대하여, 상기 수준을 검출 한계로 설정하였다.
도 3은 BKV로 면역화된 한 마리의 토끼로부터의 BKV-JCV 교차-반응성 데이터를 도시한 그래프이다. BKV-면역화된 토끼로부터의 항혈청(antisera)은 높은 친화성(EC50 = 1:100,000)으로 BKV VLP에 결합하며, JCV VLP와 교차 반응한다(EC50 = 1:5,000).
도 4A 및 4B는 스크리닝 및 확인 ELISA에서 소변음성(n=311)(도 4A) 및 소변양성(n=204)(도 4B) 환자로부터의 혈청 샘플의 항-JCV 검정법 반응성을 도시한 것이다. 스크리닝 ELISA에서 샘플의 혈청학적 반응성의 분포를 나타내었으며, 하한점(nOD₄₅₀ = 0.10) 및 상한점(nOD₄₅₀ = 0.25)을 강조표시하였다(좌측 패널). 추보의 확인 ELISA(우측 패널)에서, 40% 억제 컷 포인트(cut point)을 강조표시하고(세로선), 음영을 넣은 영역은 항-JCV 특이적 항체를 갖는 것으로 확인되지 않은 샘플을 나타낸다(nOD₄₅₀ ≤ 0.25 및 억제 백분율 ≤ 40%).
도 5A 및 도 5B는 모든 환자(n=515)(도 5A) 및 소변양성 환자(n=204)(도 5B)에 대한 각 10% 억제 범위 내의 관찰의 빈도를 도시하는 막대 그래프이다. 분포는 2개의 명확하게 정해진 피크로 이루어지며, 가장 최적으로는 40% 억제에서 분리된다. 40% 억제 수준은 대략 소변양성 샘플의 반응 분포의 5번째로 낮은 백분위수에 상응한다.
도 6A 및 6B는 11개의 예비-PML 샘플에 대한, 확인 ELISA로부터의 억제 백분율 값(도 5B)에 대한 스크리닝 ELISA로부터의 nOD₄₅₀ 값의 플롯(plot)이다. 수평선은 0.10 및 0.25의 nOD₄₅₀ 값을 나타내며, 수직선은 40%의 억제 백분율을 나타낸다.

위음성을 최소화하고 교차-반응성 항체의 검출을 최소화하는 JCV 항체에 대해 민감한 검정법은 JCV에 노출된 개체의 확인에 유용하다. 이러한 시험의 투입은 현재 JCV 감염을 갖고 있거나, 바이러스에 대한 항체를 발생시키기에 충분한 과거의 JCV에 대한 노출이 있었던 개체의 확인에 유용할 수 있다. 또한, 이러한 검정법은 임상의의 PML 임상적 경계 및 위험 계층화를 보조하기 위한 도구를 제공할 수 있다. 예를 들어, 이러한 시험은 대상체에 JCV에 노출된 적이 있는지를 정확하게 평가함으로써, PML이 발생할 환자의 위험의 평가의 일부로서, 전문의 및 환자에 대해 유용할 수 있다. 몇몇 경우에, 분석은 환자로부터의 생물학적 샘플 중의 JCV 항체 수준을 결정하는 것을 포함할 수 있다.

JCV 항체를 위한, 예를 들어, 입증된 컷 포인트의 확립을 위한 유용한 검정법의 개발에는 소정의 어려움이 있다. 출원인들은 JCV DNA에 대하여 소변양성 또는 소변음성인 환자로부터의 소변 및 혈장 샘플의 검정법으로부터 유래한 데이터를 사용하여 이러한 문제를 해결하였다. 다른 문제는 특이성과 재현성이 있는 검정법을 개발하는 것이다. 본 출원인들은 항체 검정법에서 고도로 정제된 바이러스 단백질-함유 입자를 사용함으로써, 이 문제를 해결하였다. 또한, 본 출원인들은 일차 검정법에서 모호한 결과를 갖는 샘플을 분석하기 위한 2차 검정법의 사용이 검정법의 유용성을 개선시켜, 이러한 샘플의 유용한 결과를 제공하는 것을 발견하였다.

따라서, 고도로 정제된 VP1-함유 바이러스-유사 입자(VLP)를 사용하는 분석으로 입증된 검정법을 개발하여, 체액, 예컨대 혈청, 혈장, 소변, CSF 또는 항체를 함유하는 다른 체액 중의 JCV 항체의 존재를 검출하였다. 새로운 검정법을 입증하기 위한 실험에서, 임상 연구에 참여한 MS 환자의 집단에서 JCV 항체의 대략 54%의 유병률을 확인하였다. 본 명세서에 기재된 검정법의 주요 특징은 고도로 정제된 바이러스-유사 입자(HPVLP)의 사용에 있다.

본 명세서에 기재된 검정법의 하나의 이점은 이것이 JCV에 대한 항체의 검출을 위해 상당히 낮은 위음성률, 예를 들어, 약 10%, 약 8%, 약 6%, 약 4%, 약 3%, 약 1% 또는 그 미만의 위음성률을 갖는다는 것이다. 일반적으로, 검정법은 JCV에 대한 항체의 검출을 위해 오직 3% 이하의 위음성률을 갖는다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 새로운 검정법을 사용하여 JCV에 대한 혈청전환(seroconversion)을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 검정법을 사용하여 처음에는 JCV 항체에 대해 음성이었던 대상체의 시험 코호트 (cohort)에서, 약 2% 이하의 연간 혈청전환율을 발견하였다. 이는 검정법이 시간에 따른 개체의 JCV 노출 상태를 모니터링하는데 유용할 수 있음을 나타낸다.

상기 검정법을 면역조절제, 예를 들어, 항-VLA-4 치료법(예를 들어, 나탈리주마브), 항-CD20 치료법(예를 들어, 리툭시마브), 항-CD11a 치료법(예를 들어, 에팔리주마브) 또는 마이코페놀레이트 모페틸로의 치료를 고려 중인 대상체; 현재 면역조절제를 사용하여 치료 중인 대상체; 또는 면역조절제로의 치료를 중단한 대상체를 비롯한 임의의 인간 대상체에서 JCV 항체의 검출을 위해 사용할 수 있다. 상기 검정법은 PML에 걸리기 쉬울 수 있는 다른 개체, 예컨대 다발성 골수종 또는 림프종과 같은 림프증식성 장애를 갖는 개체; 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로 감염되거나, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 골수계열 혈액종양 또는 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 예를 들어, 크론병(CD) 또는 궤양성 대장염, 다발성 경화증(MS) 또는 관절염, 예컨대 류마티스성 관절염(RA)을 갖는 개체에 유용할 수 있다. 또한, 상기 검정법은 면역억제 또는 면역조절 치료법을 받는 대상체, 예를 들어, 이식 환자에게 유용할 수 있다. 예시적인 면역억제 또는 면역조절 치료법은 나탈리주마브, 리툭시마브, 에팔리주마브 및 마이코페놀레이트 모페틸을 포함한다. 상기 검정법은 그 내용이 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Piccinni et al. "Stronger association of drug-induced progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) with biological immunomodulating agents" Eur. J Clin. Pharmacol. 66:199-206, 2010]에 기재된 장애를 갖거나, 약물로 치료 중인 대상체에서 JCV 항체의 검출에 유용할 수 있다.

VP1

JCV 항체를 위한 검정법에서의 HPVLP의 이용이 검정법의 정확성을 개선시킬 수 있으며, 분석 및 진단 목적에 적절한 검정법에 유용한 것으로 관찰되었다. HPVLP를 생성하는데 사용하기 위한 VP1은 해당 분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 생성할 수 있으며, 자연-발생 VP1 또는 재조합으로 생성된 VP1 중 어느 하나, 예를 들어, JCV 바이러스로부터의 VP1일 수 있다. 일반적으로, 사용되는 VP1은 JCV의 MAD1 스트레인으로부터의 VP1이다. 몇몇 실시형태에서, 검정법에서 사용되는 VP1은 1개 초과의 JCV 스트레인으로부터의, 예를 들어, 스트레인 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4 및 7 중 하나 이상으로부터의 VP1을 포함한다. 그 다음, VP1, 예를 들어, 재조합으로 합성된 VP1의 제조 후에, 본 명세서에 기재된 검정법에 사용하기 위한 VP1을 밀도-구배/초원심분리 방법 또는 일련의 화학 침전 단계, 농축/정용여과 및 이온-교환 크로마토그래피를 비롯한 표준 생화학적 방법을 통해 추가로 정제한다. 정제 방법은 전형적으로 단량체 VP1 폴리펩티드 또는 펜타머 VP1을 비롯한 더 작은 단백질을 제거하는 하나의 단계를 포함한다. 이들 더 작은 입자의 제거는 예를 들어, 1 단계 또는 2 단계(예를 들어, VP1 단량체를 제거하는 제1 여과 단계에 이어서, 펜타머 VP1 입자를 제거하는 제2 여과 단계)로 행해질 수 있다. 이러한 생화학적 정제 방법이 해당 분야에 공지되어 있다. 실시예 1 및 7은 2개의 상이한 JCV VP1-VLP 정제의 방법을 제공한다.

본 발명의 일 태양에 따른 HPVLP 제제(HPVLP)는 유의미한 양의 VP1 단량체를 함유하지 않는다(예를 들어, 단량체를 제거하기 위해 정제). 본 발명의 다른 태양에 따른 HPVLP 제제는 VP1 펜타머의 크기 또는 그보다 작은 크기(단량체 포함)의 구성의 VP1 분자를 유의미한 양으로 함유하지 않는다. HPVLP는 재조합 VP1 또는 자연-발생 VP1(예를 들어, 바이러스 또는 바이러스 캡시드로부터 분리)으로부터 제조될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 추가의 JCV 구성성분, 예컨대 JC 바이러스로부터의 마이너 코트 단백질 중 하나 또는 둘 모두, 예를 들어, VP2 또는 VP3은 HPVLP 입자에 포함되거나 지지체와 회합한다.

몇몇 경우에, 재조합으로 발현된 VP1은 자연-발생 바이러스 캡시드와 유사한 HPVLP 또는 펜타머로 어셈블되지 않을 수 있고, 예를 들어, 재조합으로 발현된 VP1은 튜브형 또는 다른 비-구형 기하학적 구조로 어셈블될 수 있다. 따라서, 본 발명은 기하학적 구조가 실질적으로 구형인 HPVLP를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 제제 내의 HPVLP의 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%가 자연-발생 JCV 캡시드와 유사한 HPVLP 제제(예를 들어, 20면체 또는 실질적으로 구형의 구조)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, HPVLP 제제는 자연-발생 JCV 캡시드와 유사한 제제 내의 HPVLP를 적어도 10%, 15%, 20%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%로 함유한다. 이러한 방법은 이러한 제제를 야기하는 조건 하에서 바이러스 단백질을 발현시키고/거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 발현된 바이러스 단백질을 분리하고 정제하여 이러한 제제를 생성하는 것을 포함할 수 있다.

HPVLP 의 생성 방법

HPVLP는 예를 들어, 배큘로바이러스를 JC 바이러스로부터의 VP1 유전자와 같은 VP1 유전자를 발현하는 벡터로 형질전환시킴으로써 생성될 수 있다. 배큘로바이러스를 사용하여 세포 배양물, 예컨대 곤충 세포 배양물(예를 들어, SF9 세포) 또는 포유동물 세포 배양물을 감염시키고, 세포는 VP1 단백질을 발현한다. HPVLP는 세포를 용해시키고, 일련의 원심분리 및 한외여과 단계를 통해 입자를 정제함으로써 분리된다. 일반적으로, 정제는 수크로스 쿠션(cushion) 침강, 등밀도 초원심분리 및 다양한 한외여과 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 방법을 사용하여 수행한다. 특정 실시형태에서, 정제는 입자를 수크로스 쿠션을 통해 2회 원심분리하는 것을 포함할 것이다. 대안적인 정제 방법에서는, 세포를 용해시키고, 입자를 마지막 이온-교환 단계와 함께 일련의 침전 및 원심분리/정용여과 단계에 의해 분리한다.

순도는 당업계에 공지되어 있는 임의의 적절한 기술, 예를 들어, 분석적 초원심분리, 전자 현미경, PAGE 분석, 질량 분석법, 대조군 혈청을 사용한 ELISA에서의 단백질 농도 또는 활성을 사용하여 평가할 수 있다. 불충분하게 정제된 VLP는 부정하게 높은 JCV 항체 수준 또는 계산된 노출률을 생성하는 높은 백그라운드(background)를 야기한다.

몇몇 실시형태에서, HPVLP는 단독의 JC 바이러스 단백질로서 VP1을 함유한다.

몇몇 실시형태에서, HPVLP는 이종 입자이며, 이에 따라, VP1 단백질 및 JC 바이러스의 마이너 코트 단백질 중 적어도 하나, 예를 들어, VP2 또는 VP3을 포함한다. 다른 실시형태에서, HPVLP는 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 포함한다. VP1 및 VP2를 포함하는 HPVLP는 예를 들어, 배큘로바이러스를 예를 들어, 동일하거나 상이한 프로모터의 제어 하의 VP1 및 VP2 유전자를 포함하는 핵산으로 형질전환시킴으로써, 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 세포 배양물을 배큘로바이러스로 감염시키고, 세포는 VP1 및 VP2를 발현하고, 둘 모두의 단백질 유형을 포함하는 HPVLP가 형성된다. VP1 및 VP2 유전자가 상이한 DNA 분자 상에 있는 일 실시형태에서는, DNA 분자를 상이한 배큘로바이러스로 형질전환시키고, 배큘로바이러스를 사용하여 동일한 배양물 내에서 세포를 트랜스펙션시킨다. 세포는 VP1 및 VP2 단백질을 발현하며, 둘 모두의 단백질 유형을 포함하는 HPVLP가 형성된다. 몇몇 경우에, 이종 HPVLP는 예를 들어, 매 5개의 VP1 폴리펩티드에 대하여 1개 또는 2개의 VP2 폴리펩티드를 포함할 것이다. 일반적으로, HPVLP는 자연-발생 JC 바이러스의 경우처럼, VP2 폴리펩티드보다는 VP1 폴리펩티드를 더 함유할 것이다.

VP1 및 VP3 둘 모두, 또는 VP1 및 VP2 분자 둘 모두를 포함하는 HPVLP는 예를 들어, 동일하거나 상이한 프로모터의 제어 하의 각각 VP1 및 VP3 유전자, 또는 VP1 및 VP2 유전자를 포함하는 핵산으로 배큘로바이러스를 형질전환시킴으로써, 생성할 수 있다. 세포 배양물을 배큘로바이러스로 감염시키고, 세포는 VP1 및 VP3 또는 VP1 및 VP2를 발현하며, 둘 모두의 유형의 단백질을 포함하는 HPVLP가 형성된다. VP1 및 VP3 또는 VP1 및 VP2 유전자가 상이한 DNA 분자 상에 있는 몇몇 실시형태에서는, DNA 분자를 상이한 배큘로바이러스 내로 형질전환시키고, 배큘로바이러스를 사용하여, 세포를 동일한 배양물에서 트랜스펙션시킨다. 세포는 각각 VP1 및 VP3 단백질 또는 VP1 및 VP2 유전자를 발현하며, 둘 모두의 유형의 단백질을 포함하는 HPVLP가 형성된다. HPVLP 입자는 JCV 캡시드를 분리하기 위하여 사용되는 것과 같은 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 이러한 제제로부터 분리할 수 있다.

전형적으로, 이종 HPVLP에 있는 VP1 펜타머는 예를 들어, 작제물을 제조하기 위해 VP3 유전자가 사용되었는지 VP2 유전자가 사용되었는지에 따라, 5개의 VP1 폴리펩티드 및 1개의 VP3 폴리펩티드 및/또는 VP2 폴리펩티드를 포함할 것이다. 전형적으로, HPVLP에는 VP3 또는 VP2 폴리펩티드보다 더 많은 VP1 폴리펩티드가 있을 것이다. 몇몇 실시형태에서, VP2 또는 VP3은 JC 바이러스가 아닌 폴리오마 바이러스로부터의 것, 예를 들어, BK 바이러스 폴리펩티드이다.

모든 3가지 VP1 및 VP2 및 VP3 분자를 포함하는 HPVLP는 배큘로바이러스를 예를 들어, 동일하거나 상이한 프로모터의 제어 하의 VP1, VP2 및 VP3 유전자를 포함하는 핵산(예를 들어, 원형 DNA, 예를 들어, 5.5 kb 미만)으로 형질전환시킴으로써 생성할 수 있다. 세포 배양물, 예컨대 포유동물 세포 배양물을 배큘로바이러스로 감염시키고, 세포는 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 발현한다. 결과적으로 모든 3가지 유형의 단백질을 포함하는 HPVLP가 형성된다. VP1, 및 VP2 및 VP3 유전자 중 어느 하나 또는 둘 모두가 상이한 DNA 분자 상에 있는 일 실시형태에서는, DNA 분자를 동일하거나 상이한 배큘로바이러스 내로 형질전환시키고, 배큘로바이러스를 사용하여 동일하거나 별개의 배양물 내에서 세포를 감염시킨다. 세포는 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 발현하며, 둘 모두의 유형의 단백질을 포함하는 HPVLP가 형성된다. 이종 HPVLP는 예를 들어, 5개의 VP1 폴리펩티드 및 1개의 각각의 VP2 및 VP3 폴리펩티드를 포함할 수 있지만, 제제 내에서 비율은 달라질 수 있다. 전형적으로, HPVLP에는 VP2 및 VP3 폴리펩티드보다 더 많은 VP1 폴리펩티드가 있을 것이다.

몇몇 실시형태에서, HPVLP는 VP1 펜타머보다 크기가 더 클 것이다. 크기가 더 크다는 것은 HPVLP 입자에 함유된 단백질의 질량이 단지 VP1 만을 함유하는 펜타머보다 더 크다는 것을 의미한다.

다른 실시형태에서, HPVLP의 용액을 제조하는 방법은 용액으로부터 VP1 펜타머의 크기이거나 그보다 더 작은 입자(예를 들어, VP1 단량체 또는 작은 VP1 함유 입자)를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 원심분리 및 크기-배제 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 이러한 정제 단계를 수행할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 당업계에 공지되어 있는 다른 방법, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피를 VP1 펜타머보다 더 큰 HPVLP의 제조에 사용할 수 있다. 일반적으로, 검정법에 사용하기에 적절한 HPVLP 제제는 비-HLVLP 입자에 비해(예를 들어, VP1 단량체, 및 5개 미만의 VP1 분자를 함유하는 응집체에 비한 펜타머의 백분율), 적어도 20%의 HPVLP, 적어도 25%의 HPVLP, 적어도 40%의 HPVLP, 적어도 60%의 HPVLP, 적어도 65%의 HPVLP, 적어도 70%의 HPVLP, 적어도 80%의 HPVLP, 적어도 85%의 HPVLP, 적어도 90%의 HPVLP, 적어도 95%의 HPVLP 또는 적어도 99%의 HPVLP를 함유할 것이다.

컷 포인트

본 발명은 "컷 포인트"를 사용하여, 위음성률 및 위양성률을 감소시키는 분석 방법을 제공한다. 컷 포인트는 예를 들어, 2벌의 시험 샘플 및 다중의 반복(replicate)(예를 들어, 대조군 샘플의 적어도 2, 적어도 4, 또는 적어도 8회의 반복)을 평균화한 HPVLP 검정법으로부터의 데이터를 기초로 확인한다.

본 발명에 따른 검정법의 1가지 형태에서, 초기 HPVLP 스크리닝 검정법, 예를 들어, ELISA 검정법으로부터의 결과는 시험 샘플이 JCV-특이적 항체를 갖거나 갖지 않는 것으로 분류되게 하거나, 샘플이 이들 2가지 분류 중 하나로 분류되지 않는다면, 샘플을 추보의 확인 검정법으로 처리할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 특징이 되는 HPVLP ELISA 검정법에서 지정된 수준 미만(예를 들어, nOD₄₅₀ < 0.1)의 결과를 생성하는 샘플은 JCV-특이적 항체가 결여된 것으로 분류될 것이며, ELISA에서 지정된 수준(예를 들어, nOD₄₅₀ > 0.25)보다 큰 결과를 제공하는 샘플은 JCV-특이적 항체에 대하여 양성으로 분류될 것이다. 명백하게 이들 분류 중 하나로 분류되지 않는 샘플(예를 들어, 0.1 < OD₄₅₀ < 0.25)을 확인 검정법에서 시험할 수 있다.

일 실시형태에서, 확인 검정법은 사전-인큐베이션 단계를 필요로 하며, 사전-인큐베이션 단계에서, 시험 샘플을 완충액(또는 다른 적절한 용액) 대조군 또는 HPVLP(완충액 또는 다른 적절한 용액 중의)와 사전-인큐베이션시켜, 하기에 추가로 상세히 지지체되는 바와 같이, HPVLP ELISA에서의 분석 전에 JCV-특이적 항체를 사전-흡수시킨다. HPVLP와의 사전-인큐베이션 후에, 일차 검정법에서 반응이 완충액 대조군에 비해 40% 미만으로 감소되면, 샘플을 JCV-특이적 항체의 존재에 대하여 음성인 것으로 해석한다. HPVLP와의 사전-인큐베이션 후에 결과가 일차 검정법에서 완충액 대조군에 비해 40% 이상의 감소를 보여준다면, 샘플을 JCV-특이적 항체를 함유하는 것으로 해석한다. 몇몇 실시형태에서는, 오직 확인 검정법만을 수행한다.

적절한 컷 포인트를 선택하고 입증하기 위한 방법의 일례는 실시예 4에 제공된다.

지지체

임의의 적절한 고체 지지체를 HPVLP 검정법 형식에서 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 지지체는 마이크로타이터 플레이트(예를 들어, 96-웰 플레이트), 슬라이드, 비드(bead), 또는 컬럼이다. 지지체는 발색 또는 화학발광 검출 방법에 적절할 수 있다.

검정법

검정법을 생물학적 샘플을 HPVLP로 코팅된 지지체에 첨가함으로써 행하고, 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 검출한다. 일반적으로, 고체 기반의 플랫폼, 예컨대, 마이크로타이터 플레이트(예를 들어, 96 웰 플레이트)를 사용하지만; 당업계에 공지되어 있는 다른 형식을 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플을 검정법에서 사용하기 전에 희석한다.

특정 실시형태에서, 검정법 형식은 효소-연결된 면역검정법(ELISA)이다. 대략적으로, 상기 방법은 전형적으로 지지체를 포획(capture) 항체, 예컨대 HPVLP로 코팅하고, 포획 시약에 지시되는 결합 항체를 함유하는 샘플을 인큐베이션시키고, 세정하여, 비특이적으로 결합된 종을 제거하고, 결합 면역 복합체를 예를 들어, 발색 또는 화학발광 검정법에 의해 검출하는 것을 포함한다. 발색 기질은 착색된 최종 생성물을 생성하며, 이는 가시적으로 또는 분광광도계의 사용으로 검출 및 측정할 수 있다. 화학발광 기질은 광을 생성하며, 이를 광도계를 사용하여 측정할 수 있다.

플레이트를 HPVLP로 코팅하는 것은 일반적으로 고체 지지체(예컨대, 마이크로타이터 플레이트의 웰)를 적절한 농도(예를 들어, 1㎍/㎖)의 HPVLP의 용액과 함께 하룻밤 또는 특정 시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. HPVLP는 유일한 JCV 바이러스 구성원으로서 VP1을 포함하거나, HPVLP는 입자당 VP2 또는 VP3 중 적어도 하나, 또는 입자당 적어도 하나의 각각의 VP2 및 VP3을 함유하는 이종 입자일 수 있다. HPVLP로 코팅한 후에, 플레이트의 웰을 세정한다. 그 다음, 지지체를 시험할 샘플에 대하여 항원에 관해 중립적인 비특이적 단백질로 "코팅"한다. 적절한 코팅 물질이 당업계에 공지되어 있으며, 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 밀크 분말의 용액을 포함한다.

샘플 또는 기준물질을 복합체 형성(HPVLP/JCV 항체)을 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 준비된 지지체 상에서 인큐베이션시켜, 결합 복합체를 형성한다. 결합 복합체의 검출은 인간 항체에 결합할 수 있는 표지된 항체를 사용하여 수행한다. 일반적으로, 표지된 항체는 인간 IgG 또는 인간 IgG 및 IgM을 검출할 수 있다. 몇몇 경우에, 2차 또는 3차 검출 방법을 사용하여 검정법을 수행할 수 있다.

기준 샘플은 개체(소변양성)의 소변 중의 JCV DNA의 존재를 기초로 JC 바이러스로 감염된 것으로 알려져 있는 개체로부터 분리된 동일한 생물학적 물질(예를 들어, 혈장, 혈청, 소변 또는 CSF)의 것일 수 있다. 기준 샘플을 사용하여, 검정법의 위음성률이 1% 내지 3%를 넘지 않도록 검정법 컷 포인트를 확인한다.

"복합체 형성을 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서"는 일반적으로 시약을 희석시켜, 백그라운드를 감소시키고, 특정 범위 내에 놓여 있는 결과의 판독치를 제공하는 조건을 의미한다. 희석제는 비-제한적인 예에서 BSA를 포함하는 용액, 인산염 완충된 염수(PBS) 또는 Tween을 함유하는 PBS를 포함할 수 있다.

"적절한" 조건은 또한 효율적인 결합을 가능하게 하는데 충분한 온도 및/또는 기간 동안의 조건을 포함한다. 인큐베이션은 전형적으로 대략 25℃ 내지 27℃의 온도에서 약 1 내지 2시간 또는 1 내지 4시간이거나, 또는 약 4℃에서 하룻밤일 수 있다. 그러나, 당업자는 다른 조건이 적절할 수 있음을 이해할 것이다.

일반적으로, 검정법의 인큐베이션 사이에 1회 이상의 세정을 행한다. 적절한 세정 용액은 희석 완충액(예를 들어, PBS 또는 PBS/Tween) 또는 붕산염 완충액을 포함한다.

일반적으로, HPVLP에 결합한 항체의 검출은 당업계에 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 수행한다. 일반적으로, 이러한 방법은 표지 또는 마커(marker), 예컨대 방사성, 형광, 생물학적 또는 효소 태그(tag)의 검출을 기초로 한다. 이러한 표지의 사용에 관한 미국 특허에는 예를 들어, 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 포함된다. 일반적으로, JCV 항체 결합의 검출은 표지된 2차 항체를 사용하여 검출한다. 일반적으로, 2차 항체는 인간 IgG를 검출하는데 특이적이다. 정량화는 예를 들어, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여, 발색 정도를 측정함으로써 달성한다.

실시예 2는 검정법을 수행하는 방법을 예시하며, 당업자는 적절한 변형이 만들어질 수 있음을 이해할 것이다.

일 실시형태에서, 검정법을 진료소에서, 예컨대 생물학적 샘플을 환자로부터 수득하는 시설에서 근무하는 의료인, 예를 들어, 의사, 간호사 또는 기술자가 수행한다. 다른 실시형태에서, 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 다른 시설, 예를 들어, 검정법이 수행되는 제3의 시설에 이송한다. 이러한 후자의 경우에, 검정법의 결과는 의료인에게, 예를 들어, 우편 또는 전자적으로(예를 들어, 팩스 또는 이-메일을 통해) 또는 온-라인 데이터베이스를 통해 제공될 수 있는 형식을 통해 다시 보고될 수 있다. 일 실시형태에서, 검정법의 결과(스크리닝 검정법 및 임의로 확인 검정법 포함)를 데이터베이스에 보관할 수 있으며, 의료인이 예를 들어, 범세계통신망을 통하여 접근할 수 있다.

2차 시험

몇몇 경우에, 예를 들어, 샘플 중의 JCV 항체 수준이 지정된 "모호한 구역" 또는 "애매한 구역"으로 분류되는 경우, 예를 들어, JCV 항체의 존재 또는 부재에 관하여 확실히 정해지지 않는 경우에, 샘플의 2차 시험(본 명세서에서 "확인 검정법"으로도 지칭)을 사용한다. 2차 시험에 대하여, 생물학적 샘플의 2개의 분취물을 사용한다. 제1 분취물은 샘플을 소정의 기간(예를 들어, 30분, 1시간 또는 4℃에서 하룻밤과 같은 더 긴 기간) 동안 용액 중의 검정법 완충액의 존재 하에서 사전인큐베이션시킴으로써, 검정법에서 사용하기 전에 준비한다. 제2 분취물은 샘플을 소정의 기간(예를 들어, 30분, 또는 1시간 또는 더 긴 기간) 동안 용액 중의 HPVLP의 존재 하에서 사전인큐베이션시킴으로써, 검정법에서 사용하기 전에 준비한다. 그 다음, 2개의 분취물을 본 명세서에 기재된 바와 같은 HPVLP 검정법에서 사용하고, 샘플을 JCV 항체 양성 또는 항체 음성으로 지정한다. 용액 중의 HPVLP와 인큐베이션시킨 분취물에 대한 검정법 결과가 일차 검정법에서 완충액과 인큐베이션시킨 제1 분취물에 대한 결과와 동일하다면(즉 대략 동일한 OD), 샘플이 JCV-특이적 항체의 존재에 대하여 음성인 것으로 해석한다. 검정법 결과가 사전-인큐베이션 후에(즉, 2차 검정법에서) 더 낮다면, 샘플이 JCV 특이적 항체를 함유하는 것으로 해석한다.

또한, 2차 시험을 사용하는 본 발명의 특징이 되는 검정법을 본 명세서에서 "2-단계 시험" 또는 "2-단계 검정법"으로 지칭한다.

검정법 결과의 보고

몇몇 실시형태에서, 검정법은 기준에 비한 수준(예를 들어, OD)일 수 있는 판독치 또는 샘플이 JCV 항체에 대하여 양성, 음성이거나, 애매하다는 평가의 판독치를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 HPVLP 및 임의로 검정법을 위한 다른 구성성분을 포함하는 키트가 제공된다. 예를 들어, 키트는 일차 ELISA 검정법 및 2차 확인 검정법을 수행하기 위한 도구를 제조하기 위한 검정법 양성 및 음성 대조군, 완충액 및 지지체(예를 들어, 마이크로타이터 플레이트)를 포함할 수 있다. 키트는 예를 들어, 용매 또는 완충액, 대조군, 안정화제, 보존제, 2차 항체, 예컨대 항-HRP 항체(IgG) 및 검출 시약을 포함할 수 있다.

HPVLP는 임의의 형태, 예컨대 액체, 건조, 반-건조 또는 동결건조 형태 또는 동결 조건에서 보관하기 위한 형태로 제공할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제조된 HPVLP를 펠렛화하고, 반-고체 형태로 보관한다.

전형적으로, HPVLP는 멸균된 형태로 제공한다. HPVLP가 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 일반적으로 수용액, 예컨대 멸균 수용액이다. HPVLP가 건조 형태로 제공되는 경우, 일반적으로 재구성을 적절한 용매의 첨가에 의해 달성한다. 용매, 예를 들어, 멸균 완충액을 임의로 키트에 제공할 수 있다.

키트는 검정법에 사용하기에 적절한 농도로 HPVLP를 함유하는 조성물을 위한 하나 이상의 용기를 포함하거나 검정법에 사용하기 위한 희석에 대한 설명서를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 키트는 별개의 용기, HPVLP를 위한 칸막이 또는 칸 및 검정법 구성성분 및 정보 자료를 포함한다. 예를 들어, HPVLP는 병 또는 바이얼에 함유될 수 있으며, 정보 자료는 플라스틱 슬리브(plastic sleeve) 또는 패킷(packet)에 함유될 수 있다. 다른 실시형태에서, 키트의 별개의 요소는 단일의 분리되지 않은 용기 내에 포함된다. 예를 들어, HPVLP 조성물은 라벨 형식의 정보 자료가 부착된 병 또는 바이얼에 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 키트는 다수(예를 들어, 한 다발)의 개별 용기를 포함하여, 각각은 하나 이상의 단위 형태(예를 들어, 하나의 검정법에서 사용하기 위한)의 HPVLP를 함유한다. 예를 들어, 키트는 다수의 앰플, 포일 패킷(foil packet) 또는 블리스터 팩(blister pack)을 포함하며, 각각은 스크리닝 또는 확인 검정법에서 사용하기 위한 단일 단위의 HPVLP를 함유한다. 키트의 용기는 밀폐 및/또는 방수일 수 있다. 용기는 사용하기 위해 표지될 수 있다.

일 실시형태에서, 키트는 검정법을 수행하고 해석하기 위한 정보 자료를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 키트는 예를 들어, 치료 센터 또는 의료인에게, 검정법의 결과를 보고하는 장소에 관한 지침을 제공할 수 있다. 키트는 본 명세서에 기재된 HPVLP 검정법의 결과를 보고하기 위한 형태 및 이러한 형태 또는 다른 관련 정보를 발송하는 장소에 관한 연락 정보 및 주소; 또는 온라인 데이터베이스 또는 온라인 어플리케이션(예를 들어, app)에서 결과를 보고하기 위한 URL (Uniform Resource Locator) 주소를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 정보 자료는 환자가 검정법의 결과에 따라 면역조절 약물로의 치료를 받아야 하는지에 관한 지침을 포함할 수 있다.

키트의 정보 자료는 그 형태가 제한되지 않는다. 많은 경우에, 정보 자료, 예를 들어, 설명서는 인쇄된 물질, 예를 들어, 인쇄된 문서, 도면 및/또는 사진, 예를 들어, 표지 또는 인쇄된 시트로 제공된다. 그러나, 정보 자료는 또한, 다른 형식, 예를 들어, 컴퓨터 판독가능한 자료, 비디오 리코딩 또는 오디오 리코딩으로도 제공될 수 있다. 다른 실시형태에서, 키트의 정보 자료는 연락 정보, 예를 들어, 물리적 주소, 이메일 주소, 웹사이트 또는 전화 번호이며, 여기서, 키트의 사용자는 본 명세서에 기재된 방법에서의 이의 용도 및/또는 HPVP 검정법에 관한 실질적인 정보를 수득할 수 있다. 물론, 정보 자료는 또한 임의의 형식의 조합으로 제공될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 검정법 제공자, 예를 들어, 서비스 제공자(예컨대, 제3의 시설) 또는 의료인에게 제공하며, 이들은 검정법에서 샘플을 평가하고, 판독치를 제공한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 검정법 제공자는 대상체로부터의 생물학적 샘플, 예컨대 혈장, 혈액 또는 혈청 샘플을 받고, 본 명세서에 기재된 검정법을 사용하여 샘플을 평가하고, 샘플이 JCV 항체를 함유하는지를 결정한다. 그 다음, 검정법 제공자, 예컨대, 서비스 제공자 또는 의료인은 대상체가 증가된 PML 위험 상태에 있는 것으로 결론지을 수 있다. 검정법 제공자는 추가로 대상체가 면역조절제, 예컨대 항-VLA 치료법, 예컨대 나탈리주마브로의 치료를 받기 위한 후보가 아니거나, 대상체가 면역조절제로의 치료를 받기 위한 후보임을 결정할 수 있으나, 후보는 JCV 항체를 갖지 않는 것으로 결정된 대상체와 비교하여 증강된 모니터링을 가질 것이다. 예를 들어, 후보는 해로운 징후, 예를 들어, PML의 발병을 나타낼 수 있는 징후의 발생에 대하여 더욱 자주 시험할 것이다.

일 실시형태에서, 검정법 제공자는 본 명세서에 기재된 검정법을 수행하며, 대상체가 검출가능한 JCV 항체를 갖지 않는 것을 결정한다. 검정법 제공자는 추가로, 대상체가 면역조절제, 예컨대 나탈리주마브로 치료를 받기 위한 후보임을 결정한다. 일 실시형태에서, 검정법 제공자는 의료인에게 대상체가 면역조절제로의 치료에 대한 후보임을 알리며, 후보에게 면역조절제를 투여한다.

검정법 제공자는 평가의 결과 및 임의로 하나 이상의 진단, 예후 또는 적절한 치료법 옵션에 관한 결과를 예를 들어, 의료인 또는 환자 또는 보험 회사에게 임의의 적절한 형식, 예컨대 우편, 또는 전자로, 또는 온라인 데이터베이스를 통하여 제공할 수 있다. 검정법 제공자가 제공하고 수집한 정보를 데이터베이스에 보관할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이것이 추가로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예

실시예 1: 고도로 정제된 VP1 입자의 합성 및 정제

JCV 또는 BKV 캡시드 단백질 VP1으로 이루어진 HPVLP를 재조합 배큘로바이러스로 트랜스펙션된 SF9 곤충 세포에서 생성하였다. JCV VP1 함유 입자의 경우에, 재조합 배큘로바이러스를 JCV의 Mad-1 스트레인으로부터 VP1을 발현하는 핵산으로 형질전환시켰다. 재조합 VLP를 세포 용해 전에 수집하고, 분별 초원심분리, 세제 세정 및 한외여과에 의해 정제하였다.

간단히, 배큘로바이러스 감염된 세포를 감염 약 3일 후에 3000×G에서의 원심분리에 의해 수집하고, HPVLP의 정제 시까지 동결 보관하였다. 약 100g의 동결된 세포 펠렛을 사용하여 정제를 수행하였다. 해동된 세포를 0.1mM CaCl₂가 보충된 500㎖의 PBS(PBS-C)에서 용해시켰다. 세포 현탁액을 마이크로플루이딕스 마이크로플루이다이저(Microfluidics Microfluidizer)(등록상표)를 통해 2회 통과시킴으로써, 세포를 파괴하였다. 세포 데브리스를 8000×G에서 15분 동안의 펠렛화에 의해 제거하였다. PBS-C를 사용하여 상층액 부피를 720㎖로 조정하고, 5㎖의 40% 수크로스 쿠션에 로딩하였다. HPVLP를 SW28 로터에서 100,000×G에서 5시간 동안 수크로스 쿠션을 통해 2회 펠렛화하였다. HPVLP 펠렛을 PBS-CaCl₂에 재현탁화시킨 다음, 37℃에서 1시간 동안 0.25% 데옥시콜레이트로 처리하고, 이어서 4℃에서 1시간 동안 0.1mM CaCl₂가 보충된 4M NaCl을 첨가하였다. 침전된 물질을 8000×G에서 15분 동안의 원심분리에 의해 제거하였다. 생성된 현탁액을 농축시키고, 펠리콘(Pelicon)-2 500,000 MWCO 멤브레인(밀리포어(Millipore))을 통한 한외여과에 의해 완충액을 교환하였다. 농축된 VLP를 옵티프렙(Optiprep)(상표명)(시그마(Sigma), 미조리주의 샌디에이고시에 소재)의 25-40%의 단계 기울기의 중심에 적용하고, 50.2형 로터에서, 17시간 동안 190,000g에서 밴드를 형성시켰다. VLP 밴드를 수집한 다음, 농축시키고, 300,000 MWCO(분자량 컷-오프) 멤브레인이 있는 아미콘 스티어드 셀(Amicon stirred cell)(밀리포어)에서 완충액을 교환하였다. 농축된 물질을 0.22 μ PES(폴리에테르설폰) 필터를 통해 여과시키고, 4℃에서 보관하였다. 이러한 방식으로 제조한 VLP를 본 명세서에서 HPVLP로 명명한다. VLP의 질은 일반적으로 겔 전기영동 및 전자 현미경으로 결정한다.

단백질 결정을 위해 VLP를 변성시키기 위하여, EDTA, DTT 및 SDS를 각각 2mM, 2mM 및 2%의 최종 농도로 첨가하였다. 완전히 변성된 단백질의 농도를 피어스(Pierce) BCA(바이신코닌산) 검정법을 사용하여 결정하였다.

겔 전기영동에 의한 분석을 위하여, 2㎍ 내지 5㎍의 전체 단백질을 제공하기에 충분한 부피를 NuPAGE(등록상표) 모르폴린에탄설폰산-SDS 완충액 시스템(캘리포니아주 칼즈배드시에 소재한 인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여, 사전캐스팅한 4% 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔(캘리포니아주 샌디에고시에 소재한 노벡스(NOVEX)) 상에 로딩하였다. 겔을 70 mA/겔 내지 80 mA/겔의 정전류에서 30분 동안 전기영동하였다. 단백질 밴드를 증류수 중의 50% 메탄올 및 10% 아세트산으로 고정하고, 상용의 콜로이드성 쿠마시 블루 시약(인비트로겐)을 제조처의 권고에 따라 사용하여 가시화하였다.

VLP를 전자 현미경을 사용하여 평가하였다. VLP 샘플을 탄소 그리드(carbon grid)에 두고, 간단히 물로 세정하고, 우라닐 아세테이트로 음성 염색하고, 건조되게 하였다. 그리드를 관찰하고, 텍나이(Tecnai)(상표명) G2 스피릿(Spirit) BioTWIN TEM 상에서 이미지화하였다.

대안적인 JCV VP1-VLP 정제 방법이 하기 실시예 7에 제시되어 있다.

실시예 2: HPVLP 항체 검정법

항-JCV 항체에 대한 민감한 검정법을 본 명세서에 기재된 HPVLP를 사용하여 개발하고, 본 명세서에서 그의 다양한 실시형태를 HPVLP 검정법으로 지칭하였다. 검정법의 일례에서, 96 웰 마이크로타이터 플레이트를 1㎍/㎖의 농도로 HPVLP를 함유하는 용액을 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시킴으로써 준비하였다. 웰을 희석 완충액으로 헹군 다음, 카제인 블로킹 완충액으로 실온에서 1시간 동안 블로킹하고, 희석 완충액으로 헹구었다. 검정법 대조군 및 혈청 또는 혈장 샘플을 검정법 희석에서 1:200으로 희석하였다. 희석된 샘플 및 대조군을 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 희석 완충액으로 세정하였다. 검출을 당나귀 항-인간 HRP 항체 (IgG)를 사용하여 수행하였는데, 이를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 플레이트를 세정하고, TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 완충액(캘리포니아주 샌디에고시에 소재한 크로마겐 인코포레이티드(Chromagen, Inc.))을 첨가하였다. 발색을 가능하게 하기에 적절한 시간(약 20분) 동안의 발색 후에, 반응을 1 N H₂S0₄를 사용하여 중단시키고, 450㎚에서의 흡광도를 판독하였다. 샘플 중의 항-JCV 항체 수준을 OD 단위로 표현하였다.

검정법을 OD 단위를 사용하여 하기에 기재된 바와 같이 해석하여, 수준을 결정하였다.

2차 시험에서, 알려져 있지 않은 샘플이 용액 중의 HPVLP와의 결합의 40% 초과의 경쟁적 억제를 생성한다면, 샘플이 JCV+(JCV 양성)인 것으로 간주하고, 40% 미만의 억제는 JCV-(JCV 음성)로 평가하였다.

먼저, 컷 포인트 OD(음성 대조군 OD 평균×1.23)보다 더 큰 OD 값을 갖는 샘플을 JCV 항체의 존재에 대하여 양성인 것으로 정하는 한편, 컷 포인트 OD 이하의 OD 값을 갖는 샘플을 음성으로 정하였다.

검정법에서 사용되는 대조군을 표적 OD 및 특이성(특이성에 대하여 2차 확인 검정법에서 결정된 바와 같은(상기 기재))을 기초로 선택하고, 양성 대조군 1(양성 대조군 1은 약 1.0의 표적 OD 값을 갖고 특이성에 대하여 80% 초과로 JCV와 경쟁하는 것으로 정해진 검정법에서 높은 반응성을 갖는 풀링된 공여자 혈청이었다); 양성 대조군 2(양성 대조군 2는 약 0.25의 표적 OD 값을 갖고 특이성에 대하여 80% 초과로 JCV와 경쟁하는 것으로 정해진 검정법에서 더 낮은 반응성을 갖는 풀링된 공여자 혈청이었다); 및 음성 대조군(음성 대조군은 약 0.07의 표적 OD 값을 갖는 검정법에서 완충액 대조군과 유사한 반응성을 갖는 풀링된 공여자 혈청이었다(주석: 검정법 완충액은 O.D. 값이 대략 0.045임))으로 포함시켰다.

몇몇 경우에, 적정 검정법을 행하였으며, 여기서, 양성 샘플을 다중의 희석에서 시험하고, 컷 포인트 OD보다 더 큰 OD 값을 제공하는 가장 높은 희석을 JCV IgG 역가로 결정하였다.

특이성, 정밀성, 매트릭스 간섭, 견고성 및 시약 안정성의 예측으로부터 검정법을 입증하였다.

실시예 3: 2차 확인 검정법

몇몇 경우에, 상술된 시험 외에 2차 확인 검정법(2차 검정법)을 수행하였다. 확인 검정법에서, 샘플(혈장 또는 혈청)을 검정법에서 사용하기 전에 실온에서 1시간 동안 HPVLP(최종 VLP 농도 = 1㎍/㎖; 최종 샘플 희석 = 1:200)와 인큐베이션시켰다. 대조군 샘플을 검정법 완충액에서, HPVLP의 부재 하에 인큐베이션시켰다. 그 다음, 검정법을 상술된 바와 같이 행하였다. nOD₄₅₀ 억제 백분율을 다음과 같이 계산하였다: 억제% = 100 × [1-(nOD₄₅₀ 평균)(JCV MAD-1 VLP 사전-인큐베이션시킨 샘플) ÷ (nOD₄₅₀ 평균)(완충액 인큐베이션시킨 샘플)].

검정법 결과가 일차 검정법에서와 같이 완충액과의 사전-인큐베이션 후에 동일하였다면(즉 대략 동일한 O.D.), 샘플을 JCV-특이적 항체의 존재에 대하여 음성인 것으로 해석하였다. 검정법 결과가 HPVLP와의 사전-인큐베이션 후에(즉, 2차 검정법) 더 낮았다면, 샘플을 JCV-특이적 항체를 함유하는 것으로 해석하였다.

실시예 4: 스크리닝/확인 검정법 컷 포인트 알고리즘

혈청학적 시험(JCV 항체 시험)을 2-단계 검정법으로 구성하였다: 스크리닝 ELISA 및 추보의 확인 ELISA(2차 검정법).

검정법 플레이트, 검정법 수행 및 분석전문가 간의 결과의 비교를 위해, 샘플 결과를 플레이트 상에서 양성 대조군의 광학 밀도(OD₄₅₀) 값에 대하여 정규화시키고, 후술되는 바와 같이 정규화된 OD₄₅₀으로 보고하였다.

HPVP 검정법의 유틸리티를 이행하기 위하여, 컷 포인트를 와이블(Weibull) 3 구성요소 혼합-분포 모델을 사용하여 유도하였다. 이들 결정에서, 하기의 정의를 사용하였다:

예를 들어:

평균(샘플_OD_이중) = 0.60

평균 (양성 대조군 1 OD_반복) = 1.20

정규화된 OD=0.60/1.20=0.50.

확인 검정법용

추보의 확인 ELISA에서, 용해성 HPVLP를 사용하여, 스크리닝 ELISA에서의 샘플의 평가 전에 JCV에 대한 높은 친화성 항체를 사전 흡수시켰다. 결과를 억제 백분율로 계산하여, 샘플을 HPVLP와 함께 사전 흡수시킨 후에 스크리닝 ELISA에서 반응성의 감소를 결정하였다[억제% = 100 × [1-(nOD₄₅₀ HPVLP 사전 인큐베이션시킨 샘플 평균) ÷ (nOD₄₅₀ 완충액 인큐베이션시킨 샘플 평균)].

위양성 및 위음성률을 하기와 같이 정의하였다. 위음성률은 검정법에 의해 항체 음성인 것으로 결정된 실제 JC 바이러스 양성의 샘플의 비율이다. 혈청-양성률은 혈청-양성(즉, 항-JCV 스크리닝/확인 컷 포인트 알고리즘을 사용하여 결정시 JCV 항체를 갖는)인 것으로 결정된 샘플의 비율이다.

데이터를 SAS v9를 사용하여 분석하였다. 정상의 분포를 나타내지 않는 데이터를 만-휘트니 U 시험으로 분석하였다. 유목 데이터(Categorical data)를 샘플 크기에 따라 피어슨(Pearson)의 χ2 시험 또는 피셔(Fisher)의 정밀 시험(exact test)을 사용하여 분석하였다. 피어슨의 보정 계수를 사용하여 nOD₄₅₀과 소변 JCV DNA 수준 간의 관계를 평가하였다. 모든 시험은 0.05의 알파 수준에서 양쪽 검정법이었다(two-sided). 혈청학적 유병률 및 위음성률에 대한 신뢰 한계를 10,000 부트스트랩(bootstrap)을 사용하는 부트스트랩 백분위수 방법(6)에 의해 수득하였다.

실시예 4(a): JCV 에 대한 혈청학적 반응성

MS 환자에서 항-JCV 항체를 검출하기 위한 검정법을 확립하고, PML 위험 계층화를 위한 검정법의 유력한 임상학적 유용성의 예비 평가를 수행하기 위하여 연구를 행하였다. 인간에서 감염제에 대한 항체 반응을 특성화하기 위하여, 감염된 개체 및 비-감염된 개체 둘 모두로부터의 기준 혈청을 갖는 것이 중요하였다. JCV 감염의 무증상 특성이 "실제" 음성 개체를 확인하기 불가능하게 하지만, 출원인은 "소변양성" 개체의 소변에서 JCV DNA를 측정함으로써, "실제" 양성 개체의 집단을 확인할 수 있었다.

소변 JCV DNA 수준(STRATA(나탈리주마브 투여의 재개시) 임상 시험 프로토콜에서 수집)을 500 카피/㎖의 정량 한계 및 50 카피/㎖의 검출 한계와 함께, 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(q-PCR) 검정법(ViraCor Laboratories, 미조리주의 리즈 서밋시에 소재)으로 결정하였다.

204명의 JCV 소변양성 환자로부터의 샘플을 포함하는 831명의 MS 환자 혈청 샘플의 항-JCV 항체 상태를 먼저 스크리닝 ELISA에서 항-JCV 항체에 대하여 평가하여, 혈청학적 반응의 분포를 결정하였다. 소변 DNA 상태에 의한 검정법 결과는 2가지 중첩되지만 별개의 JCV IgG 반응성의 집단의 존재를 보여주었다(도 1). JCV DNA 소변양성 MS 환자에 대한 반응성의 중간 수준(nOD₄₅₀ = 0.895)은 JCV DNA 소변음성 MS 환자에 대한 것(nOD₄₅₀ = 0.131; p <0.001) 보다 유의하게 더 높았으며, 소변양성 환자는 nOD₄₅₀ 0.10 미만의 검정법 반응성을 보이지 않았다. 따라서, 더 낮은 검정법 컷 포인트를 nOD₄₅₀ 0.10에서 확립하고, 여기서, 음성 구역에서의 실험적 위음성률은 0%였다.

소변 내에 검출가능한 JCV DNA가 없는 많은 환자(소변음성)는 소변양성 환자의 혈청학적 반응성과 유사한 혈청학적 반응성을 가졌다. 이들 결과는 소변 JCV DNA 시험으로, 아마도 모든 JCV 감염된 개체를 검출할 수 없을 것이라는 가정과 일치한다.

실시예 4(b): 소변 JCV DNA 로드 및 혈청학적 활성

낮은 수준의 바이러스 복제를 갖는 JCV 감염된 환자가 혈청학적 검정법에서 검출되지 않은 낮은 혈청 항체 수준을 가질 수 있다는 잠재적인 염려(잠재적인 위음성)를 다루기 위하여, 바이러스 수준과 항체 반응성 간의 상호관계를 시험하였다. 도 2는 204명의 JCV DNA 소변양성 STRATA 환자로부터의 데이터를 보여주며, 0.60 미만의 nOD₄₅₀(피어슨의 보정 계수 = 0.048, p=0.75l)을 갖는 샘플에서 소변 JCV DNA 수준 및 항-JCV 항체 수준 간의 검출가능한 관계가 없음을 나타낸다. 이러한 결과는 심지어 소변과 혈청을 동일한 STRATA 연구 시점에서 수집할지라도, 참을 유지한다(피어슨의 보정 계수 = 0.002, p=0.993). 0.60 초과의 nOD₄₅₀에서, 문헌 기록과 일치하게, 더 높은 nOD450 값을 나타내는 높은 JCV DNA 카피/㎖을 갖는 개체로부터의 더 높은 비율의 혈청 샘플과 함께 더 강한 상호관계가 관찰되었다(예를 들어, 문헌[Egli et al, J. Infect. Dis. 199:837-846, 2009]). 이들 데이터는 혈청 음성 결과가 아마도 매우 낮은 바이러스 수준보다는 JCV 감염의 부재 때문인 것 같음을 시사한다.

실시예 4(c): BKV - JCV 교차 반응성의 평가

0%로 위음성률을 조절하는 단일의 보존적 컷-포인트의 지정은 VP1 캡시드 단백질에서 JCV에 대하여 높은 동일성을 공유하는 다른 통상의 폴리오마 바이러스(위양성), 예컨대 항-BKV 항체에 대해 교차 반응하는 항체의 검출을 배제하지 않을 것 같다. 또한, 이러한 항체 교차-반응성은 HPVLP를 ELISA 플레이트 상으로 직접 코팅하는 경우에, 보존된 바이러스 에피토프의 노출을 통하여 발생할 수 있다. BKV와 JCV로의 이중 감염이 인간에서 발생할 수 있고, JCV가 아닌 BKV로 감염된 환자를 신뢰성있게 확인하는 것이 가능하지 않기 때문에, 교차-반응성의 문제를 BKV 또는 JCV 중 어느 하나로의 천연의 감염이 발생할 수 없는 종인 토끼에서 시험하였다.

토끼를 애쥬번트(adjuvant) 없이, 인산염 완충된 염수 중의 단백질의 피하 주사에 이어서, 3개월 기간에 걸친 3회의 부스터(booster) 주사에 의해 BKV로 면역화시켰다. 혈청 샘플을 ELISA에 의해 JCV 또는 BKV에 대한 직접적인 결합에 대하여 검정법하였다. BKV-면역화된 토끼로부터의 항혈청은 BKV VLP에 높은 친화성(EC50 = 1:100,000)으로 결합하며, HPVLP와 낮은 친화성(EC50 = 1:5,000)으로 교차 반응한다. 사전-면역 혈청은 반응성을 보이지 않았다. 1마리의 토끼로부터의 대표적인 데이터를 도 3에 나타내었다.

BKV 항체가 JCV와 교차-반응하여, 항-JCV 검정법에서 위양성의 신호를 생성하는 것 때문에(도 3), 인간에서 JCV에 대한 낮은 수준의 반응성은 JCV와 교차 반응하는 낮은 친화성의 항-BKV 항체를 나타내어, 위양성 신호를 생성할 수 있다.

실시예 4(d): JCV -특이적 항체 반응의 측정( 추보의 확인 ELISA )

잠재적으로 낮은 친화성, 교차 반응성 항체를 갖는 환자로부터 JCV-특이적 항체를 갖는 환자를 구별하기 위하여, 경쟁 ELISA를 용해성 HPVLP(2차 검정법)를 사용하여 개발하였다. JCV-특이적인 더 높은 친화성의 항체는 용해성 항원에 의해 더욱 효율적으로 경쟁하는 것으로 예상되는 반면, 더 낮은 친화성의 항체는 용액 중의 JCV 항원과 함께 형성되는 복합체로부터 분리되고, ELISA 플레이트 상에 코팅된 JCV VLP에 결합할 수 있다. 소변양성(n=204) 및 소변음성(n=311) 환자로부터의 515개의 혈청 샘플의 하위집단을 용해성 JCV VLP 또는 검정법 완충액 중 어느 하나로의 사전-흡수 후에 ELISA에서의 평가를 위해 계통적으로 그리고 비례하지 않게 샘플링하였다. 도 4A 및 4B에서, 스크리닝 및 확인 검정법에서 소변음성 또는 소변양성 환자로부터의 혈청 샘플의 반응성을 나란히 나타내었다. 강력한 JCV 반응성이 있는 샘플은 항체의 용해성 JCV로의 사전-흡수에 의해 매우 억제되었으나, 낮은 수준의 JCV 항체를 갖는 샘플은 차등적 경쟁을 보여주었다. 대부분의 소변양성 환자에서의 항체 반응은 강력하게 경쟁하였다(도 4B). 이들 결과는 JCV에 대한 상당한 비율의 낮은 혈청 반응성이 JCV에 대해 특이적이지 않은 항체의 교차-반응성 때문일 수 있다는 생각을 지지한다.

확인 ELISA에서 혈청 반응의 분포는 2개의 명확한 피크로 이루어지며, 이는 대략 소변양성 샘플의 반응 분포의 5번째로 낮은 백분위수에 상응하는(도 5B) 40% 억제에서 가장 최적으로 분리된다(도 5A). 따라서, 40% 억제 수준을 확인 ELISA를 위한 컷 포인트로 선택하였다.

실시예 4(e): 종결화된 2-단계 항- JCV 혈청학적 검정법

스크리닝 및 확인 검정법을 합함으로써, "실제" JCV-특이적 항체를 갖는 샘플을 검출할 기회를 크게 향상시켰다. 마지막 분석에서, 스크리닝 ELISA에서 0.10 미만의 nOD₄₅₀ 값을 갖는 샘플을 JCV 항체에 대하여 음성으로 간주하고, 스크리닝 ELISA에서 0.25 초과의 nOD₄₅₀ 값을 갖는 샘플을 JCV 항체에 대하여 양성으로 간주하였다. nOD 값 0.10 내지 0.25의 반응성을 갖는 샘플을 확인 ELISA에서 추가로 시험하였다. 확인 ELISA에서, 40% 초과의 억제를 나타내는 모든 샘플을 양성으로 분류하였다(도 4). 0.25 초과의 nOD₄₅₀ 값에서, 40% 초과의 억제가 관찰되는 가능성은 대략 95%였다.

실시예 4(f): STRATA 코호트에서의 혈청 양성( Seropositivity ) 및 위음성률

상기 알고리즘을 기초로, STRATA 집단에서 혈청학적 유병률은 53.6%인 것으로 추정되었으며, 부트스트랩 결정된 95% 신뢰 한계는 49.9% 내지 57.3% 범위였다[0.536 = 0.451 (스크리닝 ELISA nOD₄₅₀이 0.25 초과일 가능성) + 0.085 (스크리닝 ELISA nOD₄₅₀이 0.10 내지 0.25에 속하고, 추보의 확인 ELSIA 억제%가 40% 초과일 가능성]. 이러한 혈청학적 유병률 계산으로 0.10 내지 0.25의 nOD 영역에서 소변양성 및 소변음성 대상체로부터의 샘플의 같은 비율의 항-JCV 항체의 확인이 추정되었고(40% 초과의 억제 백분율); 이러한 추정은 0.702의 p-값을 갖는 양쪽 검정법의 피셔의 정밀 시험에 의해 지지된다.

204명의 소변양성 환자 중에, 5명은 nOD₄₅₀이 0.10 내지 0.25였고, 항-JCV 특이적 항체를 갖는 것으로 확인되지 않았다(40% 이하의 억제 백분율, 도 4B).

실시예 5: 검정법 입증

검정법 입증을 포커스 다이아그노스틱스 인코포레이티드(Focus Diagnostics, Inc. (캘리포니아주 사이프러스시에 소재))에 의해 수행하였으며, 검정법-사이 및 검정법-내 정밀성, 특이성, 검정법 시약의 민감성 및 안정성 및 대조군을 비롯한 성능 파라미터가 나타나 있다. 검정법-사이 및 검정법-내 정밀성, 특이성, 검정법 시약의 민감성 및 안정성 및 대조군을 비롯한 성능 파라미터가 나타나 있다. 정밀성 파라미터는 검정법 대조군의 독립적인 제제를 사용한 4가지의 상이한 날에 혈장 및 혈청 둘 모두에서 3명의 독립적인 분석전문가가 평가하였다. 검정법 특이성의 설명을 위하여, 건강한 지원자 또는 MS 환자(TYSABRI(등록상표)(나탈리주마브) 나이브(naive))로부터의 10개의 개별 혈청 및 혈장 샘플을 검정법 완충액 또는 용액 중의 정해진 농도의 HPVLP 또는 BKV VLP 중 어느 하나와 함께 사전-인큐베이션시켰다. 견고성을 샘플, 컨쥬게이트 및 기질 첨가 단계에 대한 인큐베이션 기간의 상한 및 하한을 변경시킴으로써 평가하고, 상이한 롯트(lot)의 HPVLP 코팅 시약을 평가하여, 일치하는 검정법 대조군 성능을 나타내었다. 사전-결정된 농도의 항-JCV 항체로 스파이킹된(spiked) 샘플 중의 회수 백분율을 결정하고, 무관한 인간 모노클로널 항체의 농도를 다르게 하면서, JCV-특이적 항체를 함유하는 샘플을 스파이킹시킴으로써, 매트릭스 간섭을 평가하였다.

실시예 6: PML 환자에서 JCV 항체 상태의 결정

혈장 및 혈청 샘플(연속 수집으로부터 무작위로 선택된 단일 시점)을 TYSABRI 재-투여 및 치료(STRATA) 안정성 연구로부터의 총 831명의 환자로부터 수득하였다. STRATA는 공개-실험(open-label), 단일 부문(single-arm), 다국적 연구(북아메리카, 유럽, 오스트레일리아 및 뉴질랜드)이며, 여기서, 모든 환자에 48주 동안 4주 마다 정맥내 주사에 의해 나탈리주마브 300㎎을 제공하였다. STRATA 프로토콜에 따라 수집한 소변 샘플을 JCV DNA의 존재에 대하여 분석하였다.

2006년 6월에의 TYSABRI(등록상표)의 시판 승인으로부터 2010년 2월 9일까지, 나탈리주마브 치료에서 35가지 경우의 보고된 PML이 있었다. 또한, 나탈리주마브의 사전-승인 임상 시험에서 3가지 경우의 PML이 있었다(10, 13, 25). 보관된 샘플을 PML 진단 전의 시점(사전-PML)으로부터 가능한 한 많은 PML 경우로부터 수득하였다. 혈장 또는 혈청 샘플은 오직 11명의 나탈리주마브-치료된 PML 환자로부터만 입수할 수 있었다(10명의 MS 환자 및 1명의 크론병 환자: 표 1). PML 진단 1 내지 3년 전에 수득하였던 혈청 샘플을 시험하였다. 거의 모든 이들 샘플을 등록 또는 임상 연구에 참여한 환자로부터 수집하고, 분석 시까지 -70℃에서 보관하였다. 특히, 항-JCV 항체가 상술된 혈청학적 상태 스크리닝 ELISA 및 추보의 확인 ELISA(도 6A 및 6B)의 병용을 통하여 모든 11명의 환자에서 검출되었다(100%). 1-샘플 피셔의 정밀 시험을 사용하여, 이러한 결과는 기대된 비율(53.6%)과 유의하게 상이하였으며, p-값은 0.002였다.

이들 데이터는 본 발명의 검정법을 사용하여 PML에 걸릴 위험의 전반적인 평가의 일부로서 대상체에서 JCV 항체의 존재 또는 부재를 결정할 수 있음을 나타낸다.

진단 전에 이용가능한 혈액 샘플을 갖는 11명의 나탈리주마브-치료된 PML 환자로부터의 샘플
대상체	출처	기하학적 위치	PML 진단 (날짜)	나탈리주마브 노출		면역억제제 사용
대상체	출처	기하학적 위치	PML 진단 (날짜)	투여 횟수 또는 개월	최종 투여	유형	기간
1	임상 연구^*	벨기에	2005년 3월	5회 투여	2003년 6월	인플릭시마브 아자티오프린	32개월 73개월
2	임상 연구 (SENTINEL)	미국	2005년 2월	28회 투여	2004년 12월	없음
3	임상 연구 (SENTINEL)	미국	2005년 2월	37회 투여	2005년 1월	없음
4	시판-후	스웨덴	2008년 7월	17개월	2008년 6월	없음
5	임상 연구 (STRATA)	독일	2009년 6월	34회 투여	2009년 4월	미톡산트론	11개월
6	임상 연구 (STRATA)	프랑스	2009년 6월	35회 투여	2009년 5월	미톡산트론	10개월
7	시판-후	스웨덴	2009년 6월	29개월	2009년 6월	없음
8	시판-후	스위스	2009년 8월	28회 투여/25개월	2009년 6월	미톡산트론 아자티오프린	18개월 21개월
9	시판-후	스위스	2009년 10월	36개월	2009년 9월	미톡산트론	4년
10	임상 연구 (STRATA)	체코	2009년 10월	44회 투여	2009년 9월	아자티오프린	3개월
11	시판-후	미국	2009년 10월	33회 투여	2009년 9월	미토트렉세이트	알려지지 않음
^*크론병; SENTINEL = 재발 완화형 다발성 경화증 환자에서 인터페론 베타-1a와 병용한 나타리주마브의 안정성 및 효능; STRATA = TYSABRI 재투여 및 치료의 안정성; qd = 4×일; qwk = 1×주
SENTINEL = 재발 완화형 다발성 경화증 환자에서 인터페론 베타-1a와 병용한 나타리주마브의 안정성 및 효능; STRATA = TYSABRI(등록상표) 재투여 및 치료의 안정성; ROW = 나머지 국가; qd = 4×일; qwk = 1×주; ^*나탈리주마브로의 이전 및 현재의 치료 둘 모두.

또한, 면역조절제를 취한 다른 대상체로부터의 종단 데이터를 평가하였다(즉, 단일의 개체로부터 상이한 시간에서 수집한 다중의 샘플). 종단 데이터는 간헐적인 소변 DNA 쉐딩(shedding)을 시험하는 것과 달리, HPVLP 검정법을 사용하여, 신뢰성 있게 항-JCV 항체 상태를 평가할 수 있으며, JCV 항체 상태는 (드 노보(de novo) 감염의 부재 하에서) 상대적으로 안정적으로 남아있는 것을 나타낸다.

실시예 7: 대안적 JCV VP1 - VLP 정제 방법

이 방법은 곤충 세포로부터의 JCV VP1-VLP의 정제를 위해 상술된 밀도-구배/초원심분리 방법에 대한 대안의 일례이다. 프로토콜에서의 일반적인 단계는 TMAE 프락토겔을 사용한 최종 이온-교환 단계와 함께, 용해, 벤조나제 처리, 데옥시콜레이트 침전, 황산암모늄 침전 및 농축/정용여과이다.

JCV-VP1 배큘로바이러스로 감염된 Sf9 세포를 5,000 psi에서 마이크로플루이다이저 세포 디스럽터(disrupter)를 통해 2회 통과시킴으로써, PBS, 0.1mM CaCl₂에서 용해시켰다. 세포 데브리스를 저속 원심분리에 의해 제거하고, 상층액을 40 유닛/㎖ 벤조나제(이엠디 바이오사이언스즈(EMD Biosciences) 71206-3)로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 데옥시콜레이트 침전 단계에서, 10분의 1 부피의 2.5 % 데옥시콜레이트를 용해물에 첨가하고(최종 0.25%의 데옥시콜레이트), 용해물을 온건하게 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 동 부피의 4M NaCl, 0.1mM NaCl을 용해물에 첨가하고, 용해물을 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 침전물을 저속 원심분리에 의해 제거하였다. 그 다음, 상층액을 40% 황산암모늄을 사용하여 침전시켜, 오염 단백질을 제거하였다. 용액 리터당 232g의 고체 황산암모늄을 사용함으로써, 최종 40%를 달성하였다. 용액을 4℃에서 온건하게 혼합하면서, 황산암모늄 5분의 1을 한꺼번에 첨가하여, 각 첨가가 다음 분획의 첨가 전에 10 내지 15분 동안 용해되게 하였다. 용액을 4℃에서 하룻밤 온건하게 교반하였다. 황산암모늄 침전물을 저속 원심분리에 의해 제거하고, VP1-함유 상층액을 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 다음 단계에서 수행하였다. 용액을 100 kDa NMWL TFF 멤브레인(펠리콘 2 미니 UF 모드(Mod) 바이오맥스-100 C 0.1㎡, P2B100C01)을 사용하여 5 내지 10배로 농축시키고, 5배 희석시키고, 출발 부피로 다시 2회 농축시킴으로써, 어셈블리 완충액(25mM 트리스, 150mM NaCl, 1mM CaCl₂, pH 7.5)으로 교환하였다. 용액을 36시간 이상 동안 4℃에서 보관하였다. 그 다음, 용액을 40 부피의 TMA 크로마토그래피 완충액(25mM 트리스, 150mM NaCl, 0.1mM CaCl₂, pH 8.0)을 사용하여 500 kDa NMWL TFF 멤브레인(펠리콘 2 미니 UF 모드 Biomax-500 V, 밀리포어 part # P2B500V01)을 사용하여 정용여과하였다. 크로마토그래피를 위하여, 2g의 출발 세포 질량당 대략 1 ㎖의 수지가 필요하다. 단백질을 적절한 크기의 TMAE 컬럼(프락토겔(등록상표) EMD TMAE HiCap (M) - 이엠디 바이오사이언스즈 카달로그 번호 1.10316)에 로딩하고, 3배 컬럼 부피의 크로마토그래피 완충액으로 세정하였다. VLP를 25mM 트리스, 600mM NaCl, 0.1mM CaCl₂, pH 8.0로 용리시켰다. VP1 순도를 SDS-PAGE 및 질량분석법으로 평가하고, VLP의 존재를 전자 현미경으로 확인하고, VLP 형태의 전체 단백질의 백분율을 침강 속도 분석 초원심분리로 결정하였다. 이러한 방법은 약 80% HPVLP의 HPVLP 제제로 이어졌다.

다른 실시형태

본 발명의 많은 실시형태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 사상과 범주로부터 벗어남 없이 만들어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시형태는 하기의 특허청구범위의 범주 내에 있다.

Claims

a. 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
b. 샘플 중의 JC 바이러스(JCV) 항체와 HPVLP의 결합에 적절한 조건 하에서 해당 샘플을 고도로 정제된 VP1 입자(HPVLP)와 접촉시키는 단계;
c. HPVLP에 대한 해당 샘플 중의 JCV 항체 결합 수준을 검출하는 단계; 및
d. 검출된 수준을 기준 세트(reference set)와 상호관련시키는 단계로서, 상기 기준 세트가 3% 이하의 위음성률(false negative rate)을 나타내도록 선택되는 것인 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 위음성률이 1% 이하인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP의 적어도 20%가 HPVLP 내에 5개 초과의 VP1 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP의 적어도 70%가 HPVLP 내에 5개 초과의 VP1 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP가 고체 지지체에 고정화되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP가 본질적으로 VP1 폴리펩티드로 이루어진 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP가 VP2 또는 VP3 중 적어도 하나를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP 내의 VP1은 재조합 VP1인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP 내의 적어도 하나의 VP1은 돌연변이 VP1인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈청인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플은 면역조절제가 처방된 대상체, 면역조절제를 취하는 것을 고려 중인 대상체, 또는 진행성다병소성백질뇌증(PML)을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP에 대한 JCV 항체 결합의 검출은 상기 대상체가 증가된 PML의 위험 상태에 있는 것을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP에 대한 JCV 항체 결합의 검출은 상기 대상체가 면역조절제로 치료받기 위한 후보가 아님을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP에 대한 JCV 항체 검출의 실패는 상기 대상체가 면역조절제로 치료받기 위한 후보임을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPVLP에 대한 JCV 항체 결합의 검출은 상기 대상체가 면역조절제로의 치료와, 면역조절제로의 치료 시에 해로운 징후에 대한 증강된 모니터링을 받기 위한 후보임을 나타내는 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 해로운 징후가 PML의 발병을 나타내는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 면역조절제로 치료받는 것으로 확인된 대상체에 면역조절제를 더 투여하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 초기 시험에서 JCV 항체를 갖지 않는 것으로 결정된 생물학적 샘플을 갖는 대상체를 초기 시험 후에 JCV 항체의 존재에 대하여 적어도 매년 재시험하는 것인 방법.
제1항에 있어서, JCV 항체를 갖는 것으로 결정된 생물학적 샘플을 갖는 대상체가 이어서, 이후 날짜에 JCV 항체를 갖지 않는 것으로 결정되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 대상체가 면역조절제로 치료받기 위한 후보인 것으로 결정되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 대상체가 면역조절제로의 치료 시에 해로운 징후에 대한 증강된 모니터링을 받는 것인 방법.
제11항 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제가 나탈리주마브인 것인 방법.
제11항에 있어서, 면역조절제가 처방되었거나, 면역조절제를 취하는 것을 고려 중인 상기 대상체는 이전에 면역조절제가 투여된 적이 없는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 대상체는 이전에 1회 이상의 면역조절제의 투여를 받은 적이 있는 것인 방법.
제1항에 있어서,
e. 단계 (b) 전에, 상기 대상체로부터의 일부의 생물학적 샘플을 용액 중의 HPVLP와 접촉시키는 단계로서, 단계 (b)의 HPVLP를 고체 지지체에 부착시켜, 2차 샘플을 제공하는 단계;
f. 2차 샘플을 (b)와 동일한 조건 하에서 HPVLP와 접촉시키는 단계;
g. 2차 샘플에서 HPVLP에 대한 JCV 항체 결합 수준을 검출하는 단계; 및
h. 2차 샘플에서 JCV 항체의 검출된 수준을 HPVLP 없이 용액과 인큐베이션시킨 경우의 생물학적 샘플 중의 결합 수준과 비교하는 단계로서, 용액-인큐베이션시킨 샘플에 비한 HPVLP와 사전-인큐베이션시킨 샘플 중의 검출된 수준의 감소는 샘플이 JCV 항체에 대하여 양성임을 나타내며, 검출된 수준의 변화 없음은 샘플에 존재하는 JCV 항체가 없음을 나타내는 것인 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, MS 및 CD 환자에서의 사용에 대해 입증된 것인 방법.
HPVLP 및 JCV 항체 수준을 확인하기 위한 검정법을 수행하기 위한 적어도 하나의 시약을 포함하는 키트.
VP1 펜타머보다 크기가 더 큰 VP1-함유 입자로 본질적으로 이루어진 VP1 입자를 포함하는 용액.
VP1 펜타머 이하의 크기의 용액으로부터의 VP1 입자를 제거하는 단계를 포함하는, VP1 입자 용액의 제조 방법.
a. 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
b. 샘플 중의 JC 바이러스(JCV) 항체와 HPVLP의 결합에 적절한 조건 하에서 해당 생물학적 샘플을 고도로 정제된 VP1 입자(HPVLP)와 접촉시키는 단계;
c. HPVLP에 대한 해당 샘플 중의 JCV 항체 결합 수준을 검출하는 단계; 및
d. 검출된 수준과 기준 세트를 상호관련시키는 단계로서, JCV 항체 결합이 검출되면 상기 대상체가 증가된 PML 위험 상태에 있는 것인 단계를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 기준 세트가 3% 이하의 위음성률을 나타내도록 선택되는 것인 방법.
a. 대상체로부터의 샘플에서 항-JCV 항체 수준을 결정하는 단계; 및
b. 샘플 중의 항-JCV 항체 수준에 따라 상기 대상체에게 위험 수준을 지정하는 단계를 포함하는 대상체에서의 PML 위험의 확인 방법.
제32항에 있어서, 상기 대상체가 항-VLA4 치료를 받고 있거나, 항-VLA4 치료를 받기 위한 후보인 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 항-VLA4 치료는 나탈리주마브인 것인 방법.
제32항에 있어서, 상기 대상체가 다발성 경화증 또는 크론병으로 진단된 것인 방법.
제32항에 있어서, 상기 항-JCV 항체 수준을 1-단계 검정법 또는 2-단계 검정법을 사용하여 결정하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 1-단계 검정법 또는 2-단계 검정법이 ELISA 검정법을 포함하는 것인 방법.
제32항에 있어서,
c. 단계 (a)의 초기 샘플 이후의 날짜로부터의 샘플에서 대상체 내의 항-JCV 항체 수준을 결정하는 단계;
d. 이후의 날짜로부터의 샘플 중의 항-JCV 항체 수준을 단계 (a)의 초기 샘플로부터의 샘플 중의 수준와 비교하는 단계; 및
e. 상기 대상체가 단계 (a)의 초기 샘플 시기에 비해, 이후의 날짜에서 증가된 PML 위험 상태에 있는지를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
a. 제1 날짜로부터의 샘플을 사용하여 대상체에서 항-JCV 항체 수준을 결정하는 단계;
b. 제1 날짜의 대상체에서의 항-JCV 항체 수준을 기준으로 PML의 위험을 지정하는 단계;
c. 제2 날짜로부터의 샘플을 사용하여 대상체에서 항-JCV 항체 수준을 결정하는 단계; 및
d. 제2 날짜의 대상체에서의 항-JCV 항체 수준을 기준으로 PML의 위험을 지정하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 PML 위험의 모니터링 방법.
a. VP1 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계;
b. VP1을 발현하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계;
c. 세포를 용해시키는 단계;
d. 세포 용해물을 뉴클레아제로 처리하는 단계;
e. 용해물로부터 세포 데브리스(debris)를 침전시키는 단계;
f. 염 침전에 의해 오염 단백질을 제거하는 단계;
g. VP1-함유 상층액을 농축시키는 단계;
h. 농축된 VP1-함유 상층액을 정용여과시키는 단계; 및
i. 이온-교환 정제를 통하여 VP1-함유 용액을 정제하여, HPVLP를 포함하는 제제를 제조하는 단계를 포함하는, HPVLP를 포함하는 제제의 제조 방법.