CN101035563B - 包括聚合物部分的多价vla-4拮抗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与VLA-4结合的共轭物。这些共轭物中的某些化合物还能抑制白细胞的粘附，尤其是，VLA-4介导的白细胞粘附。这种共轭物可以用于治疗哺乳动物患者(例如人)的炎性疾病，例如哮喘、阿耳茨海姆氏病、动脉粥样硬化、AIDS痴呆症、糖尿病、炎性肠病、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移和心肌缺血。这些共轭物还可以用于治疗炎型脑病，例如多发性硬化症。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2004年7月8日提交的美国临时申请第60/586,975号的优先权，该申请在此全部引入作为参考。
技术领域
本发明涉及抑制白细胞粘附、尤其是至少部分由VLA-4介导的白细胞粘附的共轭物。本发明的共轭物的特征在于含有多于一种共价连接到生物相容性聚合物(例如聚乙二醇)的VLA-4抑制性化合物(VLA-4inhibiting compound)。
背景技术
炎性白细胞相互之间、以及与其它体细胞之间的物理相互作用在调节免疫和炎症反应中扮演重要角色[Springer，T.A.Nature，346，425，(1990)；Springer，T.A.Cell 76，301，(1994)]。这些相互作用中的多种均是由统称为细胞粘附分子的特异性细胞表面分子所介导的。这些粘附分子已经根据其结构被再分为不同组别。粘附分子中被认为在调节免疫和炎症反应中扮演重要角色的一族是整合素(integrin)族。该族细胞表面糖蛋白具有典型的非共价连接的异二聚体结构。
这里所关注的具体的整合素亚类涉及阿尔法-4(α4)链，其可以与两条不同的倍他链：倍他-1(β1)和倍他-7(β7)配对[Sonnenberg，A.同上]。α4β1的配对出现在许多循环白细胞上(例如淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞)，尽管其在循环中性粒细胞上不存在或者仅以低水平存在。首先由Hemler和Takada1鉴定的VLA-4(极晚期抗原-4，也称为α4β1整合素和CD49d/CD29)是细胞表面受体β1整合素族的一员。VLA-4由α4链和β1链组成。有至少9种β1整合素，它们均具有相同的β1链，并且各自具有不同的α链。这9种受体均可以与各种细胞基质分子的不同补体(complement)相结合，例如，纤维连接蛋白、层粘蛋白和胶原。例如，VLA-4与纤维连接蛋白相结合。VLA-4也可以与内皮细胞和其它细胞所表达的非基质分子相结合。
VLA-4(α4β1整合素)可以与被称为血管细胞粘附分子(或VCAM-1)的粘附分子相结合，该粘附分子在炎症部位的内皮细胞上经常是上调(up-regulated)表达的[Osborne，L.Cell，62，3(1990)]。VCAM-1是一种作为被表达受体的非基质分子，其被认为是造成白细胞向中枢神经系统(CNS)运输的原因。α4β1也已经显示可以与基质分子纤维连接蛋白中的至少三个位点相结合[Humphries，M.J.等人，CibaFoundation Symposium，189，177，(1995)]。VLA-4的不同抗原表位对纤维连接蛋白和VCAM-1结合活性有决定作用，每一个抗原表位都已证明可以被单独抑制。2基于使用单克隆抗体在动物模型中获得的数据，有人认为在α4β1和其它细胞上的配体以及细胞外基质之间的相互作用在白细胞迁移和活化中具有重要作用[Yednock，T.A.等人，Nature，356，63，(1992)。
α4和β7配对产生的整合素已经象α4β1一样被命名为LPAM-1[Holzmann，B和Weissman，I.EMBO J.8，1735，(1989)]，其可以与VCAM-1和纤维连接蛋白相结合。另外，α4β7能够与被认为与白细胞向黏膜组织的归巢有关的粘附分子(被称为MAdCAM-1)相结合[Berlin，C.等人，Cell，74，185，(1993)]。α4β7和MAdCAM-1之间的相互作用在黏膜组织外的炎症部位可能也是重要的[Yang，X-D.等人，PNAS，91，12604(1994)]。
由VLA-4和其它细胞表面受体介导的细胞间粘附与许多炎症反应有关。在损伤或其它炎性刺激的部位，活化的血管内皮细胞表达了可粘附白细胞的分子。白细胞与内皮细胞的粘附机制部分涉及白细胞上的细胞表面受体与内皮细胞上相应的细胞表面分子的识别和结合。一旦发生结合，白细胞透过血管壁迁移进入被损伤的部位，并释放化学介质以对抗感染。关于免疫系统粘附受体的综述可见，例如，Springer3和Osborn4的文章。
炎性脑病，例如多发性硬化症(MS)、脑膜炎、脑炎和被称为实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)，是内皮细胞/白细胞粘附机制导致对其它健康脑组织的破坏的中枢神经系统疾病的例子。在患有这些炎性疾病的个体中，大量白细胞迁移透过血脑屏障(BBB)。白细胞释放的毒性介质引起大量的细胞损伤和死亡，从而导致神经传导受损和麻痹。在脑炎和脑膜炎中发生的类似情况表明，这些疾病可以使用合适的细胞粘附抑制剂治疗。
在其它器官系统中，组织损伤也会通过引起白细胞迁移或活化的粘附机制而发生。例如，炎性肠病15(包括溃疡性结肠炎和克隆氏病(Crohn’s disease))，至少部分是经由α4β7和MadCAM的相互作用、以及可能的α4β1与该组织中表达的VCAM-1的相互作用，通过跨肠内皮细胞的白细胞运输引起的。哮喘6-8、类风湿性关节炎18-21和组织移植排斥22都被认为具有基于α4β1与VCAM-1和/或纤维连接蛋白的相互作用的成分，可能两者都有。已经显示，心肌(心脏组织)缺血后的初期损伤能够由于白细胞进入已损伤的组织引起进一步的损伤而进一步并发损伤(Vedder等人5)。其它由粘附分子机制介导的炎性疾病或医学疾病的例子包括阿耳茨海姆氏病、动脉粥样硬化9-10、AIDS痴呆症11、糖尿病12-14(包括急性青少年型糖尿病、肿瘤转移23-28、中风、以及其它脑外伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮炎、银屑病和白细胞介导的急性肺损伤(例如，成人呼吸窘迫综合征中发生的肺损伤)。
一组希望用作抗炎剂的VLA-4拮抗剂是磺酰化-Pro-Phe化合物类，例如，美国专利第6,489,300号31中列出的化合物。这些化合物是VLA-4/VCAM-1结合的非常有效的拮抗剂。
由于基本上首先通过肝代谢，这些化合物口服的生物利用度很差。因为可以通过这些化合物治疗的许多疾病是慢性病，所给药的化合物的血清半衰期较长，将会使这些种类的化合物在治疗哺乳动物疾病中的有效性提高。
药物的半衰期是体内的药物量通过正常代谢和清除通路而减少一半所花费的时间的量度。VLA-4抑制剂(包括美国专利第6,489,300号中公开的那些化合物)的问题在于其半衰期很短，即使在药物制剂中经静脉给药，其半衰期为大约10到20分钟。为了使患者在其系统中将有效量的药物保持一段合理的时间，必须给予非常大量的药物和/或必须在一天内多次给药。
半衰期这么短的VLA-4抑制剂是没有商业前景的治疗候选物。因此，需要血清半衰期显著增长的VLA-4抑制剂；优选血清半衰期在几小时至几天的范围内。
发明内容
本发明提供了显示VLA-4拮抗特性的共轭物。本发明的共轭物的特征在于，含有多于一种的与聚合物共价连接的VLA-4拮抗剂。不受任何理论的限制，血清半衰期的增长被认为与活性化合物和聚合物的共价共轭(covalent conjugation)有关。另外，这些化合物的多个拷贝与聚合物的连接使生物效力的劣化最小化。
在一个方面，本发明提供了下式I的共轭物：
B是生物相容性聚合物部分，其任选地共价连接到带有支链臂的中心分子(hub molecule)；
q为大约2至大约20；
A在每次出现时均独立地是式II的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
J选自：
a)式(a)的基团：
其中R31是与任选地包括连接子(linker)的聚合物部分相连接的共价键，或者R31选自-H、R31′、-NH2、-NHR31′、-N(R31′)2、-NC3-C6环、-OR31′和-SR31′，其中每一个R31′均独立地为任选取代直链或支链C1-C6烷基、任选取代C3-C6环烷基、任选取代芳基或者任选取代杂芳基，
并且，R32是与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键，或者R32选自-H、-NO2、卤代烷基和-N(MR41)R42，其中M是共价键、-C(O)-或-SO2-，并且R41是R41′、N(R41′)2或者-OR41′，
其中，每一个R41′均独立地为氢、任选取代直链或支链C1-C6烷基、任选取代环烷基、任选取代芳基、任选取代杂环基或任选取代杂芳基，其中任选的取代基为卤素、C1-C6烷基或-OC1-C6烷基，
并且，R42是氢、R41′、炔基或取代炔基；以及
b)式(b)的基团：
其中，R选自与聚合物部分相连接的共价键、氢、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、氨基、羟基、取代氨基、烷基、取代烷基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂环氧基、巯基、芳硫基、杂芳硫基、杂环硫基和取代烷基，其中每一个氨基、取代氨基、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基任选地与聚合物部分共价连接，其中，在每种情况下，该聚合物部分均任选地包括共价连接聚合物部分的连接子；
Ar1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基，其中每一个芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基均任选地共价连接到聚合物部分，其中该聚合物部分任选地包括共价连接聚合物部分与Ar1的连接子；
Ar2选自芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、烷基、取代烷基、烷基氨基和取代烷基氨基，其中Ar2任选地共价连接到聚合物部分，其中该聚合物部分任选地包括共价连接聚合物部分与Ar2的连接子；
X选自-NR1-、-O-、-S-、-SO-、-SO2和任选取代的-CH2-，其任选地共价连接到聚合物部分，其中，在每种情况下，该聚合物部分均任选地包括共价连接聚合物部分的连接子；
在这里，R1选自氢和烷基；
T选自：
a)式(c)的基团
其中，Y选自-O-和-NR1-，其中R1选自氢和烷基；
W选自与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键和-NR2R3，其中R2和R3独立地选自氢、烷基、取代烷基，或者R2和R3与它们所连接的氮原子一起形成杂环或取代杂环，其中每一个烷基、取代烷基、杂环基和取代杂环基任选地与进一步任选地包括连接子的聚合物部分共价连接；
m是等于0、1或2的整数；
n是等于0、1或2的整数；以及
b)式(d)的基团
其中，G是任选取代的芳基或者任选取代的含有0到3个氮原子的杂芳基5元或6元环，其中所述的芳基或杂芳基任选地进一步包括与聚合物部分相连接的共价键，该聚合物部分任选地包括连接子；
R6是与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键，或者R6是-H、烷基、取代烷基或-CH2C(O)R17，其中R17是-OH、-OR18或-NHR18，其中R18是烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基；
R55是-OH或可水解的酯，或者R55与聚合物部分任选地通过连接子形成可水解的聚合物酯；
条件是：
A.Ar1、J、R55和T中的至少一个(更优选J和T中的一个)包括与聚合物部分相连接的共价键；
B.当X是-O-时，则m是2；和
C.式I的共轭物的分子量不大于大约80,000。
本发明还提供了药学组合物，该组合物包括，例如，药学可接受的载体和治疗有效量的本发明的共轭物或其混合物。
本发明还提供了患者的至少部分由VLA-4介导的疾病的治疗方法，该方法包括给予包括药学可接受的载体和治疗有效量的本发明的共轭物或其混合物的药学组合物。
本发明还包括本发明的共轭物及其药学可接受的盐在制造用于治疗患者的至少部分由VLA-4介导的疾病的药物中的应用。
共轭物和药学组合物可以用于治疗至少部分由VLA-4或白细胞粘附介导的疾病病症。这些疾病病症的例子包括哮喘、阿耳茨海姆氏病、动脉粥样硬化、AIDS痴呆症、糖尿病(包括急性青少年型糖尿病)、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆氏病)、多发性硬化症、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移、脑膜炎、脑炎、中风、以及其它脑外伤、肾炎、视网膜炎、修格连氏干燥症(sjogren’s disease)、异位性皮炎、银屑病、心肌缺血和白细胞介导的急性肺损伤(例如，发生在成人呼吸窘迫综合征中的肺损伤)。
可以使用本发明的共轭物和组合物治疗的其它疾病包括但不限于，炎性疾病，例如结节性红斑、变应性结膜炎、视神经炎、眼葡萄膜炎、变应性鼻炎、强制性脊柱炎、银屑病性关节炎、血管炎、莱特尔氏综合征、系统性红斑狼疮、进行性全身性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎、Wegner氏肉芽肿、主动脉炎、类肉瘤病、淋巴细胞减少症、颞动脉炎、心包炎、心肌炎、充血性心力衰竭、结节性多动脉炎、高敏反应综合征、变态反应、嗜酸细胞过多综合征、变应性肉芽肿性血管炎、慢性阻塞性肺病、过敏性肺炎、慢性活动性肝炎、间质性膀胱炎、自身免疫性内分泌功能障碍、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性再生障碍性贫血、慢性迁延性肝炎和甲状腺炎。
优选本发明的共轭物和药学组合物用于治疗哮喘、类风湿性关节炎和多发性硬化症的方法。对于后面的这些疾病，本发明的共轭物不仅在体内给药时供抗炎作用，而且还发现在治疗与脱髓鞘相关的病症和疾病中的用途。
本发明还提供了制备本发明的共轭物的方法和这些方法中使用的中间体。
具体实施方式
如上所述，本发明涉及抑制白细胞粘附、尤其是至少部分由VLA-4介导的白细胞粘附的共轭物。
在一个优选实施方式中，Ar1、J、Ar2和T中仅有一个包含与聚合物部分相连接的共价键。
在另一个优选实施方式中，聚合物部分连接到-NR2R3基团。
在又一个优选实施方式中，当本发明的共轭物中的X是NR1时，则m是2。
在再又一个优选实施方式中，q是2至大约20的整数，更优选2至大约8。
优选的式I的共轭物包括下式Ia的化合物或其药学可接受的盐：
其中：
B是二价、三价、四价或更高价的生物相容性聚合物部分或者任选地多于一个的生物相容性聚合物通过官能团连接和/或通过带有分支臂的中心分子共价连接而形成的二价、三价、四价或更高价的聚合物部分；
q为2至大约20；
A在每次出现时均独立地是式IIa的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
R选自与聚合物部分相连接的共价键、氨基、取代氨基、烷基和取代烷基，其中每一个氨基、取代氨基、烷基和取代烷基均任选地连接到聚合物部分，其中，在每种情况下，聚合物部分都任选地包括与聚合物部分共价连接的连接子；
Ar1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
Ar2选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基，其中每一个芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基均任选地共价连接到聚合物部分，其中该聚合物部分任选地包括将聚合物部分与Ar2共价连接的连接子；
X选自-NR1-、-O-、-S-、-SO-、-SO2和任选取代的-CH2-，其中R1选自氢和烷基；
Y选自-O-和-NR1-，其中R1选自氢和烷基；
W选自与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键和-NR2R3，其中R2和R3独立地选自氢、烷基、取代烷基，或者R2和R3与它们所连接的氮原子一起形成杂环或取代杂环，其中每一个烷基、取代烷基、杂环基和取代杂环基任选地通过连接子与聚合物部分任选地共价连接；
m是等于0、1或2的整数；
n是等于0、1或2的整数；
条件是：
A.R、Ar2、W和-NR2R3中的至少一个包含与聚合物部分相连接的共价键；
B.当R与聚合物部分共价连接时，n是1且X不是-O-、-S-、-SO-或-SO2-；
C.当X是-O-或-NR1-时，则m是2；以及
D.式Ia的共轭物的分子量不大于60,000。
优选的式I的共轭物包括下式Ib的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
每一个A均独立地是下式IIb的化合物：
其中，q为2至大约20；
B如上所定义；
Ar1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
Ar2选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基，其中每一个芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基均任选地与聚合物部分共价连接，其中该聚合物部分任选地包括将聚合物部分与Ar2共价连接的连接子；
Y选自-O-和-NR1-，其中R1选自氢和烷基；
W选自与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键和-NR2R3，其中R2和R3独立地选自氢、烷基、取代烷基，或者R2和R3与它们所连接的氮原子一起形成杂环或取代杂环，其中每一个烷基、取代烷基、杂环基和取代杂环基均任选地与聚合物部分共价连接，该聚合物部分还任选地包括连接子；
条件是：
Ar2、W和-NR2R3中的至少一个与任选地包括连接子的聚合物部分共价连接；
并且进一步的条件是：式Ib的共轭物的分子量不大于60,000。
优选的式I的共轭物包括下式Ic的化合物：
其中，
每一个A都独立地是下式IIc的化合物或其药学可接受的盐：
且其中q为2至大约20；
B如上所定义；
R选自与聚合物部分相连接的共价键、氨基、取代氨基、烷基和取代烷基，其中每一个氨基、取代氨基、烷基和取代烷基均任选地与聚合物部分共价连接，其中，在每种情况下，聚合物部分都任选地包括共价连接聚合物部分的连接子；
Ar1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
Ar2选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基，其中每一个芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基均任选地共价连接到聚合物部分，其中该聚合物部分任选地包括将聚合物部分与Ar2共价连接的连接子；
Y选自-O-和-NR1-，其中R1选自氢和烷基；
W选自与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键和-NR2R3，其中R2和R3独立地选自氢、烷基、取代烷基，或者R2和R3与它们所连接的氮原子一起形成杂环或取代杂环，其中每一个烷基、取代烷基、杂环基和取代杂环基均任选地与聚合物部分共价连接，该聚合物部分进一步任选地包括连接子；
n是等于0、1或2的整数；
条件是：
R、Ar2、W和-NR2R3中的至少一个与聚合物部分共价连接，该聚合物部分任选地包括连接子；
并且进一步的条件是：式Ic的共轭物的分子量不大于60,000。
优选的式I的共轭物包括下式Id的化合物：
其中，
每一个A都独立地是下式IId的化合物或其药学可接受的盐：
且其中q为2至大约20；
B如上所定义；
R选自与聚合物部分相连接的共价键、氨基、取代氨基、烷基和取代烷基，其中每一个氨基、取代氨基、烷基和取代烷基均任选地与聚合物部分共价连接，其中，在每种情况下，聚合物部分都任选地包括共价连接聚合物部分的连接子；
Ar1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
Ar2选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基，其中每一个芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基均任选地共价连接到聚合物部分，其中该聚合物部分任选地包括将聚合物部分与Ar2共价连接的连接子；
R2和R3独立地选自氢、烷基、取代烷基，或者R2和R3与它们所连接的氮原子一起形成杂环或取代杂环，其中每一个烷基、取代烷基、杂环基和取代杂环基均任选地与聚合物部分共价连接，该聚合物部分进一步任选地包括连接子；
n是等于0、1或2的整数；
条件是：
R、Ar2和-NR2R3中的至少一个与聚合物共价连接，该聚合物任选地包括连接子；
并且进一步的条件是：式Id的共轭物的分子量不大于80,000。
优选的式I的共轭物包括下式Ie的化合物或其药学可接受的盐：
其中，每一个A都独立地是下式IIe的化合物：
且其中q为2至大约20；
B如上所定义；
Ar1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
Ar2选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基，其中每一个芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基均任选地共价连接到聚合物部分，其中该聚合物部分任选地包括将聚合物部分与Ar2共价连接的连接子；
R2和R3独立地选自氢、烷基、取代烷基，或者R2和R3与它们所连接的氮原子一起形成杂环或取代杂环，其中每一个烷基、取代烷基、杂环基和取代杂环基均任选地与聚合物部分共价连接，该聚合物部分进一步任选地包括连接子；
条件是：
Ar2和-NR2R3中的至少一个与聚合物部分共价连接，该聚合物部分任选地包括连接子；
并且进一步的条件是：式Ie的共轭物的分子量不大于60,000。
优选的式I的共轭物包括下式If的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
每一个A都独立地是下式IIf的化合物：
且其中q为2至大约20；
B如上所定义；
R4与任选地包括连接子的聚合物部分共价连接；
R5选自烷基和取代烷基；
Ar3选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
X选自-NR1-、-O-、-S-、-SO-、-SO2和任选取代的-CH2-，其中R1选自氢和烷基；
m是等于0、1或2的整数；
n是等于0、1或2的整数；
条件是：
A.当R与聚合物部分共价连接时，n是1且X不是-O-、-S-、-SO-或-SO2-；
B.当X是-O-或-NR1-时，则m是2；以及
C.式If的共轭物的分子量不大于60,000。
优选的式I的共轭物包括下式Ig的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
每一个A都独立地是下式IIg的化合物：
且其中q为2至大约20；
B如上所定义；
R4与任选地包括连接子的聚合物部分共价连接；
R5选自烷基和取代烷基；
Ar3选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
n是等于0、1或2的整数；
条件是：
式Ig的共轭物的分子量不大于60,000。
优选的式I的共轭物包括下式Ih的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
每一个A都独立地是下式IIh的化合物：
且其中q为2至大约20；
R4与聚合物部分共价连接，该聚合物部分任选地包括连接子；
Ar3选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
条件是：
Ih的共轭物的分子量不大于60,000。
优选的式I的共轭物包括下式Ii的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
每一个A都独立地是下式IIi的化合物：
且其中q为2至大约20；
条件是：
式Ii的共轭物的分子量不大于60,000。
优选的式I的共轭物包括下式Ij的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
每一个A都独立地是下式IIj的化合物：
且其中q为2至大约20；
条件是：式Ij的共轭物的分子量不大于80,000。
优选的式I的共轭物包括下式Ik的化合物或其药学可接受的盐：
其中，每一个A都独立地是下式IIk的化合物：
优选的式I的共轭物包括下式IL的化合物或其药学可接受的盐：
其中，每一个A都独立地是下式IIL的化合物：
其中
R4与聚合物部分共价连接，该聚合物部分任选地包括连接子。
优选，式IIa-IIe中的Ar1和式IIf-IIh中的Ar3均单独地选自：
苯基、
4-甲基苯基、
4-叔丁基苯基、
2，4，6-三甲基苯基、
2-氟苯基、
3-氟苯基、
4-氟苯基、
2，4-二氟苯基、
3，4-二氟苯基、
3，5-二氟苯基、
2-氯苯基、
3-氯苯基、
4-氯苯基、
3，4-二氯苯基、
3，5-二氯苯基、
3-氯-4-氟苯基、
4-溴苯基、
2-甲氧基苯基、
3-甲氧基苯基、
4-甲氧基苯基、
3，4-二甲氧基苯基、
4-叔丁氧基苯基、
4-(3′-二甲基氨基-正丙氧基)-苯基、
2-羧基苯基、
2-(甲氧基羰基)苯基、
4-(H2NC(O)-)苯基、
4-(H2NC(S)-)苯基、
4-氰基苯基、
4-三氟甲基苯基、
4-三氟甲氧基苯基、
3，5-二-(三氟甲基)苯基、
4-硝基苯基、
4-氨基苯基、
4-(CH3C(O)NH-)苯基、
4-(苯基NHC(O)NH-)苯基、
4-脒基苯基、
4-甲基脒基苯基、
4-[CH3SC(＝NH)-]苯基、
4-氯-3-[H2NS(O)2-]苯基、
1-萘基、
2-萘基、
吡啶-2-基、
吡啶-3-基、
吡啶-4-基、
嘧啶-2-基、
喹啉-8-基、
2-(三氟乙酰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-7-基、
2-噻吩基、
5-氯-2-噻吩基、
2，5-二氯-4-噻吩基、
1-N-甲基咪唑-4-基、
1-N-甲基吡唑-3-基、
1-N-甲基吡唑-4-基、
1-N-丁基吡唑-4-基、
1-N-甲基-3-甲基-5-氯吡唑-4-基、
1-N-甲基-5-甲基-3-氯吡唑-4-基、
2-噻唑基、以及
5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基。
优选当A是式IIa、IIb、IIc、IId和IIe，且Ar1与聚合物部分相结合时，则Ar1为下式：
-Ar1-Z-(CH2CHR7O)pR8
其中
Ar1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基，
Z选自共价键、1至40个原子的连接基团、-O-和-NR9-，其中R9选自氢和烷基，
R7选自氢和甲基；
R8选自-(L)w-A(当p大于大约300时)和(L)-B-(A)q-1，其中A代表上式IIa至IIh中的任何一个，L是1至40个原子的连接基团，且w是0或1；并且
p是大约200至1360的整数。
当A是式IIa或IIf，且R不与聚合物部分相连接时，下式的取代基：
(其中R5、X、m和n如上所定义)优选自氮杂环丁烷基(azetidinyl)、噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基、4-羟基吡咯烷基、4-氧代吡咯烷基、4-氟代吡咯烷基、4，4-二氟代吡咯烷基、4-(硫代吗啉-4-基C(O)O-)吡咯烷基、4-[CH3S(O)2O-]吡咯烷基、3-苯基吡咯烷基、3-硫代苯基吡咯烷基、4-氨基-吡咯烷基、3-甲氧基吡咯烷基、4，4-二甲基吡咯烷基、4-N-Cbz-哌嗪基、4-[CH3S(O)2-]哌嗪基、5，5-二甲基噻唑啉-4-基、1，1-二氧代-噻唑烷基、1，1-二氧代-5，5-二甲基噻唑烷-2-基和1，1-二氧代硫代吗啉基。
优选，当A是式IIa，且下式的取代基与聚合物部分相连接时，
则优选取代基是下式：
其中，
m是等于0、1或2的整数；
Z选自共价键、1至40个原子的连接基团、-O-、-NR9-，其中R9选自氢和烷基，
R7选自氢和甲基；
p是0至大约1360的整数
R8选自-B-(A)q-1和A(当p大于大约300时)，且A代表上式IIa至IIh中的任何一个。
当A是式IIa、IIb、IIc、IId、IIe且当Ar2不与聚合物部分相连接时，则优选Ar2选自苯基、取代苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基和4-吡啶-2-酮基(4-pyridin-2-onyl)。
当A是式IIa、IIb、IIc、IId、IIe且当Ar2不与聚合物部分相连接时，则Ar2优选表示为下式：
其中，Ar2选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
Z选自共价键、1至40个原子的连接基团、-O-、-NR9-、酰胺、氨基甲酸酯和脲，其中R9选自氢和烷基；
R7选自氢和甲基；
p是0至大约1360的整数
R8选自-B-(A)q-1和A(当p大于大约300时)，且A代表上式IIa至IIh中的任何一个。
在一个优选实施方式中，-YC(O)W是-OC(O)NR2R3。
当A是式IIa、IIb或IIc，-YC(O)W是-OC(O)NR2R3且R2或R3都不与聚合物部分相连接时，则优选-OC(O)NR2R3选自：
(CH3)2NC(O)O-、
(哌啶-1-基)-C(O)O-、
(哌啶-4-基)-C(O)O-、
(1-甲基哌啶-4-基)-C(O)O-、
(4-羟基哌啶-1-基)-C(O)O-、
(4-甲酰氧基哌啶-1-基)-C(O)O-、
(4-乙氧基羰基哌啶-1-基)-C(O)O-、
(4-羧基哌啶-1-基)-C(O)O-、
(3-羟甲基哌啶-1-基)-C(O)O-、
(4-羟甲基哌啶-1-基)-C(O)O-、
(4-苯基-1-Boc-哌啶-4-基)-C(O)O-、
(4-哌啶酮-1-基乙烯缩酮)-C(O)O-、
(哌嗪-4-基)-C(O)O-、
(1-Boc-哌嗪-4-基)-C(O)O-、
(4-甲基哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-甲基高哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-苯基哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-(4-三氟甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-乙酰基哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-(苯基-C(O)-)哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-(吡啶-4′-基-C(O)-)哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-(苯基-NHC(O)-)哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-(苯基-NHC(S)-)哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-甲磺酰基哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(4-三氟甲磺酰基哌嗪-1-基)-C(O)O-、
(吗啉-4-基)-C(O)O-、
(硫代吗啉-4-基)-C(O)O-、
(硫代吗啉-4′-基砜)-C(O)O-、
(吡咯烷-1-基)-C(O)O-、
(2-甲基吡咯烷-1-基)-C(O)O-、
(2-(甲氧基羰基)吡咯烷-1-基)-C(O)O-、
(2-(羟甲基)吡咯烷-1-基)-C(O)O-、
(2-(N，N-二甲基氨基)乙基)(CH3)NC(O)O-、
(2-(N-甲基-N-甲苯-4-磺酰基氨基)乙基)(CH3)N-C(O)O-、
(2-(吗啉-4-基)乙基)(CH3)NC(O)O-、
(2-(羟基)乙基)(CH3)NC(O)O-、
双(2-(羟基)乙基)NC(O)O-、
(2-(甲酰氧基)乙基)(CH3)NC(O)O-、
(CH3OC(O)CH2)HNC(O)O-、以及
2-(苯基NHC(O)O-)乙基-]HNC(O)O-。
当A是式IIa、IIb或IIc，-YC(O)W是-OC(O)NR2R3，且R2和/或R3与聚合物部分相连接时，聚合物部分优选表示为下式：
-Z′-(CH2CHR7O)pR8
Z选自共价键、1至40个原子的连接基团、-O-、-NR9-、酰胺、氨基甲酸酯和脲，其中R9选自氢和烷基，
R7选自氢和甲基；
p是0至大约1360的整数
R8选自-B-(A)q-1和A(当p大于大约300时)，且A代表上式IIa至IIh中的任何一个。
在式IIi和IIj的化合物中，优选
为下式：
其中R66是与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键，或者R66是氢或者直链或支链C1-C6烷基；R77是与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键，或者R77是氢、卤素或者直链或支链C1-C6烷氧基；并且R88是与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键，或者R88是氢或者直链或支链C1-C6烷基。优选R66、R77和R88中的一个是与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键。
优选式IIi的化合物也是式IIi-a的化合物及其药学可接受的盐：
其中，
Ar1选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基、取代杂环基、杂芳基和取代杂芳基；并且
R6是与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键。
优选的式IIi-a的化合物包括下述化合物：在该化合物中，Ar1是苯基或者具有至少一个氮原子的5或6元杂芳基，它们中的每一个都任选地被下列基团取代：卤素、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、硝基、三氟甲基、氨基、单或双(C1-C6)烷基氨基、氨基(C1-C6)烷基、C2-C6酰基、C2-C6酰氨基、或者氨基(C1-C6)酰基。Ar1是任选地被下列基团所取代的吡啶基：卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、硝基、三氟甲基、氨基、单或双(C1-C6)烷基氨基、氨基(C1-C6)烷基、C2-C6酰基、C2-C6酰氨基、或氨基(C1-C6)酰基。特别优选的式IIi-a的化合物包括其中的Ar1是任选地被下述基团所取代的吡啶基的化合物：C1-C6烷基、羟基、卤素、C1-C6烷氧基、硝基、三氟甲基、氨基、或者单或双(C1-C6)烷基氨基。
优选的式IIj的化合物也是式IIj-a的化合物及其药学可接受的盐：
其中，
R6是与任选地包括连接子的聚合物部分(polymer moiety)相连接的共价键。
优选的式IIj-a的化合物包括下述化合物：在该化合物中，R31是氨基或者单或双(C1-C6)烷基氨基；且R32是-H、-NO2或卤代烷基，更优选三氟甲基甲基。
另一种优选的式IIj-a的化合物包括下述化合物：在该化合物中，
R31是氨基或者单或双(C1-C6)烷基氨基；并且
R32是-N(MR41)R42；其中M是-SO2-或-CO-；
R41是任选地被下列基团所取代的(C1-C6)烷基：卤素、羟基、C1-C6烷氧基、氨基或者单或双(C1-C6)烷基氨基；或者苯基或含有至少一个氮原子的5或6元杂芳基，它们中的每一个都任选地被下述基团所取代：卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C7环烷基、氨基、硝基、三氟甲基、或者单或双(C1-C6)烷基氨基；并且
R42是卤素、C1-C6烷基或C3-C7环烷基。
进一步优选的式IIj-a的化合物包括下述化合物：在该化合物中结构式IIj-a中的R41基团是任选地被下列基团所取代的C1-C4烷基：卤素、羟基、C1-C6烷氧基、氨基、或者单或双(C1-C6)烷基氨基；或者
吡啶基或嘧啶基，它们中的每一个都任选地被下述基团所取代：卤素、羟基、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、氨基或者单或双(C1-C4)烷基氨基；并且
R42是卤素、C1-C4烷基或C3-C7环烷基。
在一个实施例中，本发明的共轭物是二价的，并且由式III所表示：
其中，每一个A都独立地如上所定义，且B′是-Z′-(CH2CHR7O)p-Z′-，其中每一个Z′都独立地是共价键或连接基团，R7是氢或甲基，并且p是大约100至1360的整数。
在另一个实施例中，本发明的共轭物是三价的，且优选由式IV所表示：
其中，每一个A都独立地如上所定义，且t是3至10的整数。
定义
如本文所使用的，“烷基”指的是具有1至5个碳原子的一价饱和脂肪烃基，更优选具有1至3个碳原子。该术语所代表的基团例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等。
“取代烷基”指的是具有1至3个取代基的烷基，优选具有1至2个取代基，该取代基选自烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨基酰基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧基酯、环烷基、取代环烷基、螺环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基。
“任选取代的烷基”包括如上所定义的“烷基”和“取代烷基”。
“任选取代的-CH2-”指的是未取代的、或者被1或2个取代基取代的基团，该取代基选自烷氧基、取代烷氧基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨基酰基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、氰基、卤素、羟基、巯基、硝基、羧基、羧基酯、环烷基、取代环烷基、螺环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基。“任选取代的-CH2-”上的优选的取代基是羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、巯基、硫代烷氧基和卤素(优选F)。优选当“任选取代的-CH2-”被取代时，其被一个基团所取代。
“亚烷基”指的是优选具有1至5个碳原子的直链或支链二价饱和脂肪烃基，更优选具有1至3个碳原子。该术语所代表的例子例如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚正丙基(-CH2CH2CH2-)、亚异丙基(-CH2CH(CH3)-)等。
“烷氧基”指的是“烷基-O-”基团，其例子包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基等。
“取代烷氧基”指的是“取代烷基-O-”基团。
“酰基”指的是下述基团：H-C(O)-、烷基-C(O)-、取代烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、取代烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、取代炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、取代环烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、取代芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、取代杂芳基-C(O)-、杂环基-C(O)-和取代杂环基-C(O)-，其中的烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基如本文所定义。
“氨基酰基”指的是下述基团：-C(O)NR10R10，其中的每一个R10均独立地选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基，或者各个R10与氮原子连接在一起形成杂环或取代杂环，其中烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基如本文所定义。
“酰氧基”指的是下述基团：-C(O)O-、取代烷基-C(O)O-、烯基-C(O)O-、取代烯基-C(O)O-、炔基-C(O)O-、取代炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、取代芳基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、取代环烷基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、取代杂芳基-C(O)O-、杂环基-C(O)O-和取代杂环基-C(O)O-，其中的烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基如本文所定义。
“烯基”指的是具有2至6个碳原子(优选2至4个碳原子)且具有至少1个(优选1至2个)烯基不饱和位点(site of alkenylunsaturation)的烯基。这些基团的例子是乙烯基、烯丙基、丁-3-烯-1-基等。
“取代烯基”指的是具有1至3个取代基的烯基，优选具有1至2个取代基，该取代基选自烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨基酰基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧基酯、环烷基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基，条件是任何羟基取代不与乙烯基(不饱和)碳原子相连接。
“炔基”指的是具有2至6个碳原子(优选2至3个碳原子)且具有至少1个(优选1至2个)炔基不饱和位点的炔基。
“取代炔基”指的是具有1至3个取代基的炔基，优选1至2个取代基，该取代基选自烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨基酰基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧基酯、环烷基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基。
“氨基”指的是基团-NH2。
“氰基”指的是基团-CN。
“取代氨基”指的是基团-NR′R″，其中的R′和R″均独立地选自下述基团：氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基，或者R′和R″与它们所连接的氮连接在一起形成杂环基或取代杂环基，条件是：R′和R″不都是氢。当R′是氢，R″是烷基时，在本文中取代氨基有时称之为烷基氨基。当R′和R″是烷基时，在本文中取代氨基有时称之为二烷基氨基。当提到单取代氨基时，表示R′或R″是氢但不同时是氢。当提到双取代氨基时，表示R′或R″都不是氢。
“硝基”指的是基团-NO2。
“芳基”或“Ar”指的是具有6至14个碳原子且具有单环(例如，苯基)或多元稠环(例如，萘基或蒽基)的一价芳香族碳环基，其中的稠环可以是芳香族的或者不是芳香族的(例如，2-苯并噁唑酮、2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)，条件是连接点是在芳香族碳原子处。优选的芳基包括苯基和萘基。
“取代芳基”指的是具有1至3个取代基的芳基，优选1至2个取代基，该取代基选自羟基、酰基、酰氨基、酰氧基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、氨基、取代氨基、氨基酰基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、羧基、羧基酯、氰基、巯基、烷硫基、取代烷硫基、芳硫基、取代芳硫基、杂芳硫基、取代杂芳硫基、环烷硫基、取代环烷硫基、杂环硫基、取代杂环硫基、环烷基、取代环烷基、卤素、硝基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氨基磺酰基(NH2-SO2-)和取代氨基磺酰基。
“芳氧基”指的是下述基团：芳基-O-，其例子包括苯氧基、萘氧基等。
“取代芳氧基”指的是取代的芳基-O-基团。
“羧基”指的是-COOH或其盐。
“羧基酯”指的是-C(O)O-烷基、-C(O)O-取代烷基、-C(O)-芳基和-C(O)O-取代芳基，其中的烷基、取代烷基、芳基和取代芳基如本文所定义。
“环烷基”指的是3至10个碳原子的具有单环或多环的环状烷基，其例子包括金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基和环辛基等。
“环烯基”指的是4至10个碳原子的具有单环或多环且具有至少1个(优选1至2个)烯键或乙烯基(＞C＝C＜)不饱和内部位点的环状烯基。
“取代环烷基”和“取代环烯基”指的是具有1至5个取代基的环烷基或环烯基，该取代基选自氧代(＝O)、硫代(＝S)、烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨基酰基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧基酯、环烷基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基。
“环烷氧基”指的是-O-环烷基。
“取代环烷氧基”指的是-O-取代环烷基。
“卤代”或“卤素”指的是氟、氯、溴和碘，优选氟或氯。
“羟基”指的是-OH基团。
“杂芳基”指的是具有1至10个碳原子且在环内具有1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香性基团。这种杂芳基可以具有单环(例如，吡啶基或呋喃基)或者多元稠环(例如，氮茚基(indolizinyl)或苯并噻吩基)，其中的稠环可以是或者不是芳香族的和/或含有杂原子，条件是连接点在芳香性杂芳基的原子上。优选的杂芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、苯硫基和呋喃基。
“取代杂芳基”指的是被1至3个取代基所取代的杂芳基，该取代基选自与取代芳基所定义的相同取代基。
“杂芳氧基”指的是-O-杂芳基，且“取代杂芳氧基”指的是-O-取代杂芳基。
“杂环”或“杂环的”或“杂环烷基”或“杂环基”指的是具有1至10个碳原子且在环内具有1至4个选自氮、硫或氧的杂原子的具有单环或多元稠环的饱和或不饱和基团，其中在稠环系统中，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点在杂环上。
“取代杂环的”或“取代杂环烷基”或“取代杂环基”指的是被1至3个取代基所取代的杂环基，该取代基的定义与取代环烷基中相同。
杂环基和杂芳基的例子包括但不限于，氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶(phenanthridine)、氮蒽、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1，2，3，4-四氢-异喹啉、4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(也称为硫吗啉基)、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
“巯基”指的是基团-SH。
“烷硫基”或“烷基硫醚”或“硫代烷氧基”指的是基团-S-烷基。
“取代烷硫基”或“取代烷基硫醚”或“取代硫代烷氧基”指的是基团-S-取代烷基。
“芳硫基”指的是基团-S-芳基，其中芳基如上所定义。
“取代芳硫基”指的是-S-取代芳基，其中取代芳基如上所定义。
“杂芳硫基”指的是-S-杂芳基，其中杂芳基如上所定义。
“取代杂芳硫基”指的是-S-取代杂芳基，其中取代杂芳硫基如上所定义。
“杂环硫基”指的是-S-杂环基，“取代杂环硫基”指的是-S-取代杂环基，其中杂环基和取代杂环基如上所定义。
“杂环氧基”指的是杂环基-O-，“取代杂环基-O-”指的是取代杂环基-O-，其中杂环基和取代杂环基如上所定义。
“环烷硫基”指的是-S-环烷基，“取代环烷硫基”指的是-S-取代环烷基，其中环烷基和取代环烷基如上所定义。
“可水解的酯”指的是在活的有机体内(in vivo)水解产生母体酸(parent acid)的基团。这种基团的例子包括烷氧基、取代烷氧基、环烷氧基、取代环烷氧基、芳氧基和取代芳氧基。优选的可水解的酯是烷氧基。
“可水解的聚合物酯”指的是在活的有机体内水解产生母体酸的生物相容性聚合物。优选的可水解的聚合物酯是PEG。
术语“化合物”和“活性化合物”用于指本发明的共轭物的VLA-4拮抗剂部分或者在与聚合物共轭(conjugation)之前存在的VLA-4拮抗剂。
术语“连接子”、“连接基团”或“1至40个原子的连接子”指的是一个或多个下述基团：(1)其将聚合物共价连接到活性化合物，和/或(2)其将包括聚合物部分的聚合物、低聚物和/或单体部分彼此共价连接；对于后者，其非限制性的说明包括聚合物-连接子-聚合物、低聚物-连接子-低聚物、单体-连接子-单体，低聚物-连接子-低聚物-连接子等。在任何特殊的共轭物内，将聚合物、低聚物和/或聚合物的单体部分连接在一起的连接子，以及将聚合物部分与活性化合物连接的连接子可以是相同或不同的(即，可能具有相同或不同的化学结构)。
将聚合物、低聚物和/或聚合物部分的单体部分(例如，聚氧化烯部分)彼此共价连接的连接子也称为“带有分支臂的中心(hub)”或“带有分支臂的中心分子”。带有分支臂的中心是将三个或更多个聚合物、低聚物和/或单体部分共价连接到其上、从而为与活性化合物的共轭(conjugation)提供三价或更高价的聚合物部分。这种中心分子的非限制性例子是甘油(1，2，3-丙三醇)、季戊四醇、赖氨酸、1，2，4-苯三酚、葡萄糖(以其吡喃糖形式)、乙二胺四乙酸、氨基酸、3-或4-氨基水杨酸、1，3-二氨基-2-羟基丙烷、葡糖胺和唾液酸。
代表性的官能团连接(一个连接基团可能具有一个或多个这样的官能团连接)是酰胺(-C(O)NR3-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、氨基甲酸酯(-OC(O)NR3-)、硫代氨基甲酸酯(-OC(S)NR3-)、脲(-NR3C(O)NR3-)、硫脲(-NR3C(S)NR3-)、氨基(-NR3-)、羰基(-C(O)-)、烷氧基(-O-烯基-)等。连接子在其所含有的原子方面可能是同源的或异源的(例如，仅含有碳原子的连接子或者含有碳原子和一个或多个存在于该连接子上的杂原子的连接子)。优选，连接子含有1至25个碳原子和0至15个选自氧、NR3、硫、-S(O)-和-S(O)2-的杂原子，其中R3是氢、烷基或取代烷基。连接子也可以是手性的或非手性的、直链的、支链的或环状的。
为插入进官能团连接之间或连接子内的键中，连接子可以进一步包含间隔基团(spacer linker)，该间隔基团包括但不限于选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基及其组合的间隔子(spacer)。间隔子在其所含有的原子方面可以是同源的或异源的(例如，仅含有碳原子的间隔子或者含有碳原子和一个或多个存在于该间隔子上的杂原子的间隔子)。优选，间隔子含有1至25个碳原子和0至15个选自氧、NR3、硫、-S(O)-和-S(O)2-的杂原子，其中R3如上所定义。间隔子也可以是手性的或非手性的、直链的、支链的或环状的。
间隔子的非限制性例子是直链或支链亚烷基链、亚苯基、联苯撑及其它环，它们所有都能携带一个以上能够与活性化合物和一个或多个聚氧化烯部分形成连接的官能团。多官能性连接子-间隔子的一个特殊例子是赖氨酸，其可以经由C4亚烷基链上取代的两个氨基将任何活性化合物与两个聚合物部分相连接。其它非限制性例子包括对氨基苯甲酸和3，5-二氨基苯甲酸，它们分别具有2和3个可用于形成连接的官能团。本领域专业技术人员很容易想到其它这样的多官能性连接加间隔子。
术语“聚合物”和“聚合物部分”指的是生物相容的、水溶性的、基本上无免疫原性的、能够与多于一个式II的VLA-4拮抗剂偶联的聚合物。优选该聚合物是非离子的和生物相容的，且在所使用的分子量和用量下测量是没有毒性的。该术语还包括其中有三个或更多个聚合物与如上所讨论的带有分支臂的中心分子相连接的分子。该术语进一步包括其中聚合物、低聚物和/或其单体部分被一个或多个连接子连接的分子。
合适的聚合物的例子包括但不限于：聚氧化烯聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚二甲基丙烯酰胺(PDAAm)、聚乙烯醇(PVA)、葡聚糖、聚(L-谷氨酸)(PGA)、苯乙烯马来酸酐(SMA)、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚二乙烯醚马来酸酐(DIVEMA)(Kameda，Y.等人，Biomaterials 25：3259-3266，2004；Thanou，M.等人，Current Opinion inInvestigational Drugs 4(6)：701-709，2003；Veronese，F.M.等人，IIFarmaco 54：497-516，1999)。
优选的聚合物是聚氧化烯。“聚氧化烯”指的是包括至少一个任选地与一个或多个另外的聚氧化烯共价连接的聚氧化烯部分的大分子，其中的聚氧化烯是相同或不同的。非限制性例子包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚异丙二醇(PIPG)、PEG-PEG、PEG-PPG、PPG-PIPG等。聚氧化烯定义中还包括的聚合物是其中聚氧化烯部分任选地通过连接子相互连接的大分子。说明性的例子是：PEG-连接子-PEG、PEG-连接子-PIPG等。更具体的例子包括市售的聚[二(乙二醇)己二酸酯]、聚[二(乙二醇)邻苯二甲酸酯二醇]等。其它例子是氧化烯、聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧乙烯化的多元醇单元的嵌段共聚物。
在其至少一个末端，使用常规化学技术将聚合物任选地通过连接子共价连接到非聚合物取代的式II的化合物上，为聚合物与非聚合物取代的式II的化合物提供共价连接。
当使用连接子时，连接子共价连接到至少一个聚合物末端上，其另一端则共价连接到非聚合物取代的式II的化合物上。导致这种连接的反应化学在本领域中是公知的。这种反应化学涉及在连接子、非聚合物取代的式II的化合物和聚合物上使用互补官能团(complementaryfunctional group)。优选，连接子上的互补官能团相对于聚合物上可用的官能团来进行选择以便连接，或者相对于可以被导入至聚合物上的官能团来进行选择以便连接。同样，这种互补官能团在本领域也是公知的。例如，在适当的、公知的活化剂的存在下，连接子或聚合物的羧酸与聚合物或连接子的伯胺或仲胺之间的反应导致形成将聚合物部分与连接子共价连接的酰胺键；连接子或聚合物基团的氨基与聚合物或连接子的磺酰卤之间的反应导致形成将聚合物部分与连接子共价连接的磺酰胺键；连接子或聚合物的醇基或酚基与聚合物或连接子的烷基卤或芳基卤之间的反应导致形成将聚合物基团与连接子共价连接的醚键。
当然要理解的是，如果在非聚合物取代的式II的化合物上发现适当的取代基，则可能不需要任选的连接子，因为聚合物可以与非聚合物取代的式II的化合物直接连接。
下表I描述了大量互补反应基团、以及其间反应得到的键。本领域普通技术人员能够选择适当的溶剂和反应条件完成这些连接。
表I代表性的互补结合化学
| 第一反应基团 | 第二反应基团 | 连接 |
| 羟基 | 异氰酸酯 | 氨基甲酸乙酯 |
| 胺 | 环氧化物 | B-羟基胺 |
| 磺酰卤 | 胺 | 磺酰胺 |
| 羧基 | 胺 | 酰胺 |
| 羟基 | 烷基卤/芳基卤 | 醚 |
| 醛(在还原胺化条件下) | 胺 | 胺 |
优选连接子的例子包括下述基团：-O-、-NR3-、-NR3C(O)O-、-OC(O)NR3-、-NR3C(O)-、-C(O)NR3-、-NR3C(O)NR3-、-亚烷基-NR3C(O)O-、-亚烷基-NR3C(O)NR3-、-亚烷基-OC(O)NR3-、-亚烷基-NR3-、-亚烷基-O-、-亚烷基-NR3C(O)-、-亚烷基-C(O)NR3-、-NR3C(O)O-亚烷基-、-NR3C(O)NR3-亚烷基-、-OC(O)NR3-亚烷基、-NR3-亚烷基-、-O-亚烷基-、-NR3C(O)-亚烷基-、-C(O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(O)O-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-OC(O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3-亚烷基-、亚烷基-O-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(O)-亚烷基-、-C(O)NR3-亚烷基-、-NR3C(O)O-亚烷氧基-、-NR3C(O)NR3-亚烷氧基-、-OC(O)NR3-亚烷氧基、-NR3-亚烷氧基-、-O-亚烷氧基-、-NR3C(O)-亚烷氧基-、-C(O)NR3-亚烷氧基-、-亚烷氧基-NR3C(O)O-亚烷氧基-，其中R3如上所定义，以及
其中，
选自芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基，且D和E独立地选自化学键、-O-、CO、-NR3-、-NR3C(O)O-、-OC(O)NR3-、-NR3C(O)-、-C(O)NR3-、-NR3C(O)NR3-、-亚烷基-NR3C(O)O-、-亚烷基-NR3C(O)NR3-、-亚烷基-OC(O)NR3-、-亚烷基-NR3-、-亚烷基-O-、-亚烷基-NR3C(O)-、亚烷基-C(O)NR3-、-NR3C(O)O-亚烷基-、-NR3C(O)NR3-亚烷基-、-OC(O)NR3-亚烷基-、-NR3-亚烷基-、-O-亚烷基-、-NR3C(O)-亚烷基-、-NR3C(O)O-亚烷氧基-、-NR3C(O)NR3-亚烷氧基-、-OC(O)NR3-亚烷氧基、-NR3-亚烷氧基-、-O-亚烷氧基-、-NR3C(O)-亚烷氧基-、-C(O)NR3-亚烷氧基-、-亚烷氧基-NR3C(O)O-亚烷氧基-、-C(O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(O)O-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-OC(O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3-亚烷基-、亚烷基-O-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(O)-亚烷基-和-C(O)NR3-亚烷基-，其中R3如上所定义。
上述连接子中优选的亚烷基包括C1-C15亚烷基，更优选C1-C6亚烷基，最优选C1-C3亚烷基。优选的杂环基包括哌嗪基、哌啶基、高哌嗪基、高哌啶基、吡咯烷基和咪唑烷基。优选的烷氧基是-(CH2-CH2-O)1-15。
术语“氧化烯”指的是-OCH2CHRd-，其中Rd是烷基。聚合的氧化烯指的是聚氧化烯、聚链烷烯氧化物或聚烷撑二醇，其非限制性的例子包括PEG、聚丙二醇、聚丁二醇、聚异丙二醇等。
这些聚合物任选地用取代基单封端，如上所述该取代基优选自烷基、芳基、取代烷基、取代芳基和带有分支臂的中心分子。这些聚合物还包括二氨基封端的聚氧化烯聚合物，其在本领域称为Jeffamines
。通常，Jeffamines
(得自Huntsman Performance Products，The Woodlands，Texas)含有连接到聚醚主链末端的伯胺基团。因此它们是“聚醚胺”。聚醚主链基于氧化丙烯(PO)、氧化乙烯(EO)或混合的EO/PO，或者其它主链链段。Jeffamines可以是一元胺类、二胺和三胺，并且其分子量范围可以达到大约5,000。
此外，聚合的氧化烯可以任选地含有一个或多个非氧化烯单位，例如市售的聚[二(乙二醇)己二酸酯]、聚[二(乙二醇)邻苯二甲酸酯二醇]等。还包括氧化烯、聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧乙烯化的多元醇单元的嵌段共聚物。
聚氧化烯，例如PEG，通常为水溶性的蜡状固体。通常，当聚合物的分子量增大时，其粘度和凝固点也增加。市售制剂通常的特征在于聚合物组分的“平均分子量”。
来自本发明的共轭物中单个或多个聚合物部分的聚合物总量的平均分子量一般在大约100至100,00之间；优选大约20,000至60,000；更优选大约30,000至大约50,000。对于本领域专业技术人员来说显而易见的是，这种类型的聚合物是多分散性的。多分散性指的是对于聚合物分子来说，即使分子类型相同，其尺寸(直链或多臂聚合物的链长度)仍有不同。因此，平均分子量将取决于平均的方法。多分散性指数(测量分子量可变性(variability)的一种常用指标)是重均分子量与数均分子量的比例。它表示了一批聚合物中个体分子量的分布。数均分子量是确定聚合物分子量的一种方式。数均分子量是单个聚合物分子量的普通平均数。它是通过下述方法而确定的：测量n个聚合物分子的分子量，计算分子量的总和，然后除以n。聚合物的数均分子量可以通过渗透压力测定法、端基滴定法和依数性来测定。
重均分子量可以通过光散射、小角度中子散射(SANS)、X-射线散射和沉降速度来进行测定。重均分子量和数均分子量的比率称为多分散性指数。不具有分散性的理论聚合物样品的多分散性指数为1。对本发明来说，多分散性指数的优选范围是大约1.10至大约1.05。更优选的范围是大约1.05至商业可行的合成法的上限(目前为大约1.02)。
其它合适的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚二甲基丙烯酰胺(PDAAm)、聚乙烯醇(PVA)、葡聚糖、聚(L-谷氨酸)(PGA)、苯乙烯马来酸酐(SMA)、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚二乙烯醚马来酸酐(DIVEMA)在本领域中是公知的，其分子量为大约100至100,000；优选大约10,000至80,000；更优选大约20,000至大约70,000。
本发明中可以使用的PEG的非限制性例子包括下述化合物：
| HO(亚烷基-O)ppRbb | 单封端(mono-capped)的单羟基PEG(mPEG) |
| H2N(亚烷基-O)ppRbb | 单封端的单氨基PEG |
| HO(亚烷基-O)ppR-OH | 未封端的二羟基PEG |
| H2N(亚烷基-O)ppR-OH | 未封端的单氨基PEG |
| HO(亚烷基-O)ppRbb | 带有支链的单羟基PEG |
| HO(亚烷基-O)ppRbb | 树枝状单羟基PEG |
其中，pp和亚烷基如本文所定义，Rbb优选自烷基、取代烷基、芳基和取代芳基。
各种PEG例子如下所示：
带支链的PEG：
得自NOF的PEG试剂(20kDa 4-臂)
20kDa 4-臂PEG四胺
双甘油核心
Cat # Sunbright DG-200PA
得自Nektar的PEG试剂(40kDa 8-臂)
40kDa 8-臂PEG
六甘油核心
Cat # 0J000T08
树枝状PEG：
得自NOF的PEG试剂(40kDa 4-臂)
40kDa 4-臂PEG醇 40kDa 4-臂PEG四胺
季戊四醇核心 季戊四醇核心
cat.# Sunbright PTE-40000 cat.# Sunbright PTE-400PA
得自NOF的PEG试剂(40kDa 3-臂)
40kDa 3-臂PEG 40kDa 3-臂PEG三胺
甘油核心 甘油核心
cat # Sunbright GL-40000 cat # Sunbright GL-400PA
得自SunBio的PEG试剂(40和20kDa)
Y-PEG系列(天冬氨酸核心)
Y-PEG胺(40kDa) Y-PEG氨基甲酸硝基苯酯(40kDa)
Cat# PYAM-40 Cat# PYNPC-40
6-臂系列(山梨糖醇核心)
这些PEG聚合物可以通过下述方法进一步修饰：用PEG二胺，通过适当的连接子将链延长，例如通过氨基甲酸酯(氨基甲酸乙酯)或者脲。
PEG二胺
“药学可接受的盐”指的是保留了本发明化合物的生物学效力和特性、且不具有生物学或其它方面不希望出现的特性的盐。在许多情况下，本发明的化合物由于存在氨基和/或羧基或类似基团，能够形成酸性和/或碱性的盐。
药学可接受的碱加成盐可以从无机碱和有机碱而制备。衍生自无机碱的盐包括(仅作为例子)：钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺盐，该伯胺、仲胺或叔胺例如烷胺、二烷胺、三烷胺、取代烷胺、二(取代烷基)胺、三(取代烷基)胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、取代烯基胺、二(取代烯基)胺、三(取代烯基)胺、环烷胺、二(环烷基)胺、三(环烷基)胺、取代环烷胺、二取代环烷胺、三取代环烷胺、环烯基胺、二(环烯基)胺、三(环烯基)胺、取代环烯基胺、二取代环烯基胺、三取代环烯基胺、芳胺、二芳胺、三芳胺、杂芳胺、二杂芳胺、三杂芳胺、杂环胺、二杂环胺、三杂环胺、混合的二和三胺，其中胺上的取代基中至少两个是相同的，并且选自烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、杂芳基、杂环基等。还包括其中两个或三个取代基与氨基氮一起形成杂环或杂芳基的胺。
合适的胺的例子包括(仅作为例子)异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨基丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。要理解的是，在实施本发明过程中也可以使用其它羧酸衍生物，例如羧酸酰胺，包括甲酰胺(carboxamide)、低级烷基甲酰胺、二烷基甲酰胺等。
药学可接受的酸加成盐可以从无机酸和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐等。衍生自有机酸的盐包括乙酸盐、丙酸盐、羟乙酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐等。
术语“药学可接受的阳离子”指的是药学可接受的盐的阳离子。
要理解的是，本文所定义的所有取代基中，并不包括用本身进一步取代取代基而定义的取代基(例如，具有取代芳基作为取代基的取代芳基，即芳基本身用取代芳基取代，等等)而获得的聚合物。在这种情况下，这种取代基的最大数目为3。即，上述每一个定义都受到一定的限制，例如，取代芳基被限定为-取代芳基-(取代芳基)-(取代芳基)。
同样要理解的是，上述定义并不包括不允许的取代方式(例如，甲基用5个氟基或羟基α取代而成为烯属或炔属不饱和烃)。这种不允许的取代方式对于专业技术人员是公知的。
化合物的制备
本发明的共轭物能够使用下述常用方法和步骤从容易获得的起始原料制备。要理解的是，虽然给定了典型的或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)，除非另外说明，也可以使用其它工艺条件。最佳反应条件可以根据所使用的特殊反应物或溶剂而变化，但是这些条件可以由本领域专业技术人员通过常规优化方法来确定。
另外，对于本领域专业技术人员显而易见的是，可能必须使用一些常规保护基团以保护某些官能团免受不希望的反应。各种官能团的合适保护基团以及对特殊官能团保护和去保护的合适条件在本领域中是公知的。例如，T.W.Greene和G.M.Wuts的Protecting Groups inOrganic Synthesis(有机合成中的保护基团)，第二版，Wiley，New York，1991及其中引用的参考文献中描述了大量保护基团。
而且，本发明的化合物典型地含有一个或多个手性中心。因此，如果需要，这些化合物可以制备或分离为纯的立体异构体，即，单独的对映体或非对映体、或者立体异构体过量的混合物(stereoisomer-enriched mixtures)。除非另外说明，所有这些立体异构体(以及立体异构体过量的混合物)都包括在本发明的范围内。纯的立体异构体(或立体异构体过量的混合物)可以使用，例如，本领域公知的任选活性起始原料或立体选择性试剂制备。或者，可以使用，例如，手性柱色谱、手性溶剂等对这些化合物的消旋混合物进行拆分。
本发明的共轭物优选包括含有2至大约20个式II的取代基的聚合物部分/任选带有分支臂的中心分子：
具体的说，聚合物部分可以通过共价键与Ar1取代基、J取代基、Ar2取代基相连接和/或在T取代基中，其中聚合物部分直接地或者经由连接子而连接。接着，聚合物部分可以任选地连接到带有分支臂的中心分子。
在其最简单的形式中，本发明的化合物是包括具有与两个末端相连接的两个式II的取代基的单个聚合物部分的二价结构。在代表性的情况中，使用衍生自PEG的聚合物部分，该聚合物部分通过羰基连接基团与式II的化合物相连接，其中式II的化合物由下式表示：
所得到的共轭物可以表示为下式：
其中，p优选为大约100至1360的整数。
在四价形式的一个例子中，共轭物包括4个聚合物部分。在代表性的情况中，每一个聚合物部分的一个末端连接到一个共用的(common)带有分支臂的中心分子，而另一个末端任选地通过连接子连接到式II的化合物。为了进一步和再次进行说明，每一个聚合物部分均衍生自PEG，共用的带有分支臂的中心分子是季戊四醇。在此例子中，PEG部分的另一个末端与式II的化合物通过羰基连接基团相连接，其中式II的化合物由下式表示：
所得到的共轭物可以由下式所表示：
其中，4个p的总和优选为大约100至1360。
形成式I的共轭物的合成方案是使聚合物部分上的官能团通过连接基团或直接与式II的化合物反应，从而使聚合物部分与式II的化合物共价连接。
首先，非PEG取代的式IIb-IIh的化合物在本领域中是公知的，其例子可见许多已公布的专利，包括但不限于，美国专利第6,489,300号和第6,436,904号，两者均全部引入作为参考。式II的化合物的非聚合物变体包括在Ar1、R、Ar2和T部分中的一个或多个上具有互补官能团或者可以衍生为互补官能团的基团的化合物。为说明的目的，下面陈述了在Ar2部分(例如，酪氨酸)上具有互补官能团(-OH)的化合物作为直接或通过连接子向分子中加入聚合物部分的合适起始点。
这些化合物可以通过下述方式制备：首先，用适当的芳基磺酰氯连接杂环氨基酸1，如下述方案1所示：
方案1
其中，R、Ar1、X、m和n如上所定义。
具体的说，在上述方案1中，杂环氨基酸1，与化学计量等量或过量(优选大约1.1至大约2当量)的芳基磺酰卤2，在合适的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷等)中结合。通常，反应在大约-70℃至大约40℃的温度范围内进行，直至反应基本完成，反应时间一般在1至24小时内。优选，在合适的碱存在下反应以清除反应过程中生成的酸。合适的碱的例子包括叔胺，例如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基-吗啉等。或者，反应可以在Schotten-Baumann-型条件下使用碱性水溶液进行，例如氢氧化钠水溶液、缓冲至7.4的磷酸盐水溶液等。所得到的产物3，可以通过常规方法回收，如色谱、过滤、蒸发、结晶和类似方法，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
上述反应中使用的杂环氨基酸1，是已知的化合物或者可以通过常规合成方法从已知的化合物制备的化合物。用于该反应的合适的氨基酸的例子包括但不限于L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、反式-3-苯基-L-脯氨酸、顺式-3-苯基-L-脯氨酸、L-(2-甲基)脯氨酸、L-哌啶酸、L-氮杂环丁烷-2-羧酸、L-噻唑烷-4-羧酸、L-(5，5-二甲基)噻唑烷-4-羧酸、L-硫吗啉-3-羧酸。如果需要，氨基酸1的相应的羧酸酯(例如，甲酯、乙酯、叔丁酯等)可以与芳基磺酰氯一起用于上述反应中。随后，使用常规试剂和条件将酯基水解为羧酸，即，用碱金属氢氧化物在惰性稀释剂(例如，甲醇/水)中水解，然后得到N-磺酰氨基酸3。
同样，上述反应中使用的芳基磺酰氯2是已知的化合物或者可以通过常规合成方法从已知的化合物制备的化合物。这种化合物典型地是从相应的磺酸，即式Ar1SO3H的化合物(其中Ar1如上所定义)，使用三氯化磷和五氯化磷制备的。该反应一般是通过下述条件下进行的：将磺酸与大约2至5摩尔当量的三氯化磷和五氯化磷，在无溶剂的条件下或在惰性溶剂(例如，二氯甲烷)中，在大约0℃至大约80℃的温度范围内，反应大约1至大约48小时，得到磺酰氯。或者，芳基磺酰氯2可以通过下述条件从相应的巯基化合物，即Ar1-SH化合物(其中Ar1如本文所定义)制备：在常规反应条件下用氯(Cl2)和水处理巯基化合物。
或者，上述反应中使用的芳基磺酰氯2可以通过使用Cl-SO3H对取代苯或杂环烷基进行氯磺酰化而制备。
适用于本发明的芳基磺酰氯的例子包括但不限于苯磺酰氯、1-萘磺酰氯、2-萘磺酰氯、对甲苯磺酰氯、邻甲苯磺酰氯、4-乙酰基苯磺酰氯、4-叔丁基苯磺酰氯、4-溴苯磺酰氯、2-羧基苯磺酰氯、4-氰基苯磺酰氯、3，4-二氯苯磺酰氯、3，5-二氯苯磺酰氯、3，4-二甲氧基苯磺酰氯、3，5-三氟甲基苯磺酰氯、4-氟苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、2-甲氧基羰基苯磺酰氯、4-甲基氨基-苯磺酰氯、4-硝基苯磺酰氯、4-三氟甲基-苯磺酰氯、4-三氟甲氧基苯磺酰氯、2，4，6-三甲基苯磺酰氯、2-噻吩磺酰氯、5-氯-2-噻吩磺酰氯、2，5-二氯-4-噻吩磺酰氯、2-噻唑磺酰氯、2-甲基-4-噻唑磺酰氯、1-甲基-4-咪唑磺酰氯、1-甲基-4-吡唑磺酰氯、5-氯-1，3-二甲基-4-吡唑磺酰氯、3-吡啶磺酰氯、2-嘧啶磺酰氯等。如果需要，磺酰氟、磺酰溴或磺酸酐可以替代磺酰氯用于上述反应中形成N-磺酰氨基酸3。
然后，如下述方案2所示，N-芳基磺酰氨基酸3与市售的酪氨酸酯进行偶联：
方案2
其中R、Ar1、X、m和n如上所定义，Ra是氢或烷基，但优选烷基(例如叔丁基)，Z代表芳环上的任选取代，o是0、1或2。
这种偶联反应一般使用公知的偶联剂进行，例如碳二酰亚胺、BOP试剂(苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)-磷六氟膦酸酯)等。合适的碳二酰亚胺的例子包括二环己基碳二酰亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二酰亚胺(EDC)等。如果需要，也可以使用碳二酰亚胺偶联剂的聚合物负载形式，包括例如在Tetrahedron Letters，34(48)，7685(1993)中描述的那些。另外，例如N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑等的公知的偶联助催化剂可以用于加速偶联反应。
这种偶联反应一般是通过下述方式进行的：将N-磺酰氨基酸3与大约1至大约2当量的偶联剂和至少1当量(优选大约1至大约1.2当量)的酪氨酸衍生物在惰性稀释剂(例如二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺等)中进行接触。通常，这种反应在大约0℃至大约37℃的温度范围内，进行大约12至大约24小时。在反应完成后，通过化合物5通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等。
或者，N-磺酰氨基酸3可以转化为酸性卤化物，然后与化合物4偶联，得到化合物5。酸性卤化物可以通过下述方法制备：将化合物3与无机酸性卤化物(例如，亚硫酰氯、三氯化磷、三溴化磷或五氯化磷)或者优选与草酰氯在常规条件下接触而制备。这种反应一般是使用大约1至5摩尔当量的无机酸性卤化物或草酰氯，在无溶剂的条件下或在惰性溶剂(例如二氯甲烷或四氯化碳)中，在大约0℃至大约80℃的温度范围内，进行大约1至大约48小时。在该反应中，也可以使用催化剂，例如DMF。
然后，N-磺酰氨基酸3的酸性卤化物与至少1当量、优选大约1.1至大约1.5当量的酪氨酸衍生物4，在惰性稀释剂例如二氯甲烷中，在大约-70℃至大约40℃的温度范围内接触大约1至大约24小时。优选，该反应在合适的碱的存在下进行以清除反应过程中生成的酸。合适的碱的例子包括叔胺，例如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉等。或者，反应可以在Schotten-Baumann型条件下使用例如氢氧化钠等的碱的水溶液进行。反应完成后，化合物5通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等。
或者，化合物5可以通过下述方式制备：如下述方案3所述，首先形成二氨基酸衍生物，然后将二氨基酸与芳基磺酰卤化物2偶联：
方案3
其中R、Ra、Ar1、X、Z、m、n和o如上所定义。
二氨基酸6可以容易地通过下述方法制备：使用上述常规氨基酸偶联技术和试剂(例如碳二酰亚胺、BOP试剂等)将氨基酸1与氨基酸4进行偶联。然后，可以使用磺酰氯2并且使用上述合成步骤，将二氨基酸6磺化，得到化合物7。
上述反应中使用的酪氨酸衍生物4是已知化合物，或者是可以通过常规合成方法从已知化合物制备的化合物。例如，适用于上述反应的酪氨酸衍生物4包括但不限于L-酪氨酸甲酯、L-酪氨酸叔丁酯、L-3，5-二碘酪氨酸甲酯、L-3-碘酪氨酸甲酯、β-(4-羟基-1-萘基)-L-丙氨酸甲酯、β-(6-羟基-2-萘基)-L-丙氨酸甲酯等。如果需要，当然也可以使用上述化合物的其它酯或酰胺。
N-芳基磺酰基-杂环氨基酸-酪氨酸衍生物7可以用作通过下述方案4-14所示的偶联反应而将聚合物部分与Ar2基团连接的起始点，这些偶联反应仅用于说明以证明如何导入聚合物部分。在这些方案中，PEG用作聚合物部分，仅仅是为了说明。要理解的是，可以使用其它合适的聚合物替代PEG，本领域普通技术人员很容易对下述反应方案进行修改以加入其它聚合物。在某些情况下，PEG部分可以被直接地导入苯氧基上，在其它情况下，PEG部分可以经由通过连接子部分的连接而导入。
具体的说，方案4如下所示：
方案4
其中Ar1、R、Ra、m、n、o、X和Z如上所定义；Pg是胺保护基团，例如CBZ、Boc等，与Ra羧基保护基团相比，其优选可以被正交去除，且p是优选大约100至1360的整数。
具体的说，在方案4中，如上制备的化合物7与至少等量、优选过量的氯甲酸4-硝基苯酯8在合适的溶剂例如二氯甲烷、氯仿等中结合，优选在惰性气氛下进行。该反应优选在大约-40℃至0℃的温度范围内，在合适的碱的存在下进行以清除生成的酸。合适的碱的例子包括三乙胺、二异丙基乙胺等。在形成中间体混合碳酸酯(未显示)后，将至少近似等摩尔量的N-Pg哌嗪8a加入至反应溶液中。使该反应在室温下继续进行大约1至24小时。反应完成后，化合物9可以通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤和类似方法，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一反应中。
常规地除去保护基团，得到游离的哌嗪衍生物10。根据所使用的保护基完成去除步骤。例如，三氟甲基羰基保护基团经由碳酸钾水溶液而被容易地去除。此外，各种官能团的合适保护基团和对特殊官能团进行保护和去保护的合适条件在本领域中是公知的。例如，参见T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Chemistry(有机化学中的保护基团)，第二版，Wiley，New York，1991，以及其中所引用的参考文献。
然后，游离的哌嗪衍生物10与α，ω-聚氧乙烯二氯甲酸酯(α，ω-dichloroformate polyoxyethylene)(化合物11)在合适的惰性稀释剂如二氯甲烷、氯仿等中，优选在惰性气氛中化合。一般在与化合物11的结合中，使用每氯甲酸酯实体(entity)至少2当量且优选大约2.5至10当量的化合物10。反应任选地在催化量的DMAP和碱的存在下进行以清除反应中生成的酸。在环境条件下继续进行反应，直至反应基本完成，一般在4至24小时内。当Ra是烷基时，随后的酯衍生物水解得到游离的羧基或其盐。所得到的二聚体12通过常规方法回收，该常规方法例如中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等。
α，ω-聚氧乙烯二氯甲酸酯(化合物11)可以通过与过量的碳酰氯(一般为至少2至大约20当量)在合适的惰性溶剂如二氯甲烷、氯仿等中的反应而容易地从市售聚氧乙烯制备。反应优选在环境条件下在惰性气氛中进行，直至反应基本完成，一般为大约2至24小时。之后，得到的α，ω-聚氧乙烯二氯甲酸酯(化合物11)通过常规方法回收，该常规方法例如中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等。
直至形成哌嗪衍生物28的反应方案的具体例子见下述方案5：
方案5
具体的说，市售的3-吡啶磺酸21在常规条件下通过与POCl3/PCl5接触，使用本领域公知的条件，被转化为相应的磺酰氯22。磺酰氯22与市售的S-5，5-二甲基噻唑烷-4-羧酸23的偶联在下述条件下完成：在常规条件下，优选在磷酸盐缓冲液(pH7.4)的存在下使用过量的磺酰氯。该反应优选在大约-10℃至20℃的温度下进行直至反应基本完成，一般在0.5至5小时内。得到的产物24可以通过常规方法回收，该常规方法例如色谱、过滤、蒸发、结晶等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
接下来，N-吡啶基磺酰基-5，5-二甲基噻唑烷-4-羧酸化合物23与酪氨酸叔丁酯使用常规氨基酸偶联条件进行偶联。具体的说，该偶联反应使用公知的偶联剂如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二酰亚胺(EDC)、1-羟基-苯并三唑(HOBt)和N-甲基吗啉进行，以加速偶联反应。
该偶联反应一般是通过将N-磺酰氨基酸23与大约1至大约2当量的偶联剂和至少1当量、优选1至大约1.2当量的酪氨酸叔丁酯在惰性稀释剂如二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺等中接触而进行的。该反应一般在大约0℃至大约22℃的温度范围内，进行大约12至大约24小时。反应完成后，化合物24通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
单-N-Boc-哌嗪25通过下述方法被单独地转化为对应的氨基甲酰氯26：以上述方式与碳酰氯反应。反应完成后，化合物26通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
化合物24与化合物26偶联以得到化合物27是在常规条件下在惰性稀释剂如二氯甲烷中使用催化量的DMAP而进行的，优选在碱的存在下进行以清除生成的酸。反应在大约-20至22℃的温度下进行大约2至大约24小时。反应完成后，化合物27通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
在三氟乙酸的存在下去除氨基Boc保护基团和叔丁基酯以得到化合物28，该化合物可以通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等。
下述方案6说明了哌嗪化合物的制备，相对于在苯丙氨酸化合物上发现的羧基保护基团，该化合物在胺基之一上被正交保护，这样在偶联后，哌嗪保护基团可以与羧基保护基团以不同方式去除。如果在所得到的化合物上的后续反应需要羧基保护基团以避免不需要的副反应，则这种正交保护是必要的。
方案6
具体的说，在方案6中，化合物24以上述方式制备。N-t-Boc-哌嗪25通过下述方式被转化为N-t-Boc-N′-三氟甲基-羰基哌嗪29：使其与过量的三氟乙酸酐在合适的溶剂例如二氯甲烷中接触，在该过程中存在合适的胺例如三乙胺以清除反应中生成的酸。该反应通常在大约-20℃至大约22℃的温度范围内，进行大约1至大约24小时。反应完成后，化合物29通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
接着，在常规条件下，使用通过惰性溶剂如二氯甲烷、EtOAc、EtO2等鼓泡的气态HCl，在环境条件下去除N-t-Boc-N′-三氟甲基-羰基哌嗪29上的t-Boc保护基团，得到N′-三氟甲基羰基哌嗪的盐酸盐30。该反应通常是在大约-20℃至大约22℃的温度范围内，进行大约0.5至大约4小时。反应完成后，化合物30通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
N′-三氟甲基羰基哌嗪30向N-氨基甲酰氯衍生物31的转化通常是通过与碳酰氯以上述方式接触而进行的。反应完成后，化合物31可以通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择和优选不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
化合物31和24在与上述相似的条件下偶联，得到化合物32，该化合物在哌嗪基团的氨基部分和苯丙氨酸基团的羧基部分被正交保护。在常规条件下，使用碳酸钾水溶液选择性地去除三氟甲基羰基氨基保护基团，得到化合物33。
下述方案7说明了在与式II的化合物共价连接之前对聚合物部分的修饰。仅仅为了说明的目的，聚合物部分是与季戊四醇相结合的四价PEG。方案7显示，聚合物部分的长度可以通过常规化学容易地进行调整以得到最佳的长度。
方案7
其中四个r和s的总和为优选大约100至1360的整数。
具体的说，市售的四-聚乙二醇化的季戊四醇(化合物34)(例如，总分子量为大约20kD的化合物，得自Sun Bio，Orinda，CA，USA，目录号P40H-20)与过量的碳酰氯(一般为至少4至大约40当量)在合适的溶剂如二氯甲烷、氯仿等中进行反应。反应优选在惰性气氛中在环境条件下进行，直至反应基本完成，一般进行大约2至24小时。之后，所得到的聚氧乙烯四氯甲酸酯(化合物35)通过常规方法回收，该常规方法例如中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者不纯化和/或分离就用于下一反应步骤中。
然后，四氯甲酸酯(化合物35)与过量(一般为每氯甲酸酯实体2.5至10当量)的α，ω-二氨基聚氧乙烯化合物(例如，分子量为大约6kD的化合物，得自Sun Bio，目录号P2AM-6)在常规条件下在惰性稀释剂如二氯甲烷中化合，任选地存在催化量的DMAP和碱以清除生成的酸。该反应一般在大约-20至大约22℃的温度下，进行大约2至大约4小时或者直至反应基本完成。反应完成后，化合物36通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
当具体使用得自Sun Bio的四聚乙二醇化的季戊四醇和得自SunBio的二胺时，所得到的产物(化合物36)的分子量为大约45kD。α，ω-二氨基聚氧乙烯可以从市场上获得，商标为Jeffamines，一般其分子量可以达到10,000或更局。
要理解的是，在方案7中可以使用单氨基保护的α，ω-二氨基聚氧乙烯以尽量减小交联和环化。反应完成后，单氨基保护基团通过本领域中公知的常规手段去除。
方案8说明了提供聚合物取代衍生作用的第二种途径。在该方案中，哌嗪基团的氨基部分用作原位形成的α，ω-二羧酸聚合物活化羧基的互补官能团。再次仅为说明的目的，α，ω-二羧酸聚合物是一种α，ω-二羧酸聚氧乙烯。在本实施方式中，二羧基-PEG化合物由结构式HOOCCH2(OCH2CH2)pOCH2COOH所表示，其中p如上所定义，且所得到的与PEG基团相连接的连接子由-C(O)CH2-表示。
方案8
具体的说，在方案8中，过量的如上所制备的化合物33(例如每个羧基2.5至10当量的化合物33)加入至二羧基-PEG化合物中，该二羧基-PEG化合物通过与至少2当量、优选过量的HATU[O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基uronium六氟磷酸盐]在合适的胺如三乙胺的存在下接触而原位转化为活化的酯(未显示)。二羧基-PEG化合物与化合物33的偶联优选在大约0至大约22℃的温度下，进行大约2至大约24小时。反应完成后，化合物39通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
用过量的甲酸常规去除叔丁基羧基保护基团，得到本发明的式IA的化合物。
方案9描述了将聚合物添加至化合物A上的衍生作用的另一种途径。在此方案中，哌嗪基团的氨基部分用作原位形成的包括α，ω-二醇的聚合物的氯甲酸酯的互补官能团。再次为了说明的目的，包括α，ω-二醇的聚合物是由下式表示的PEG：HOCH2CH2(OCH2CH2)pOH，其中p如上所定义，且所得到的连接子由-C(O)-表示。
方案9
具体的说，在方案9中，市售的二羟基PEG 42的羟基通过与碳酰氯在甲苯(Fluka)中、在二氯甲烷中被转化为相应的氯甲酸酯37。该产物通过蒸发分离，并且不需进一步纯化而用于下一步骤中。
过量的化合物33(例如，每氯甲酸酯实体2.5至10当量的化合物33)与如上制备的二氯甲酸酯(化合物43)在合适的碱如三乙胺的存在下(以清除生成的酸)进行接触。二氯甲酸酯-PEG化合物与化合物33的偶联优选在大约0至大约22℃的温度下，进行大约2至大约4小时。反应完成后，化合物44通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
用过量的甲酸常规去除叔丁基羧基保护基团，得到本发明的式I的化合物。
方案8和9中说明的反应可以在二羧酸(方案8)或二氯甲酸酯(方案9)的任一端同时进行，从而提供了同二价或更高价的同多价共轭物的一锅合成法。然而，要理解的是，这些反应可以通过使用保护基团而顺序进行。
在二羧酸的情况下，羧基之一可以被保护，同时另一个基团与哌嗪的氨基进行偶联。完成后，保护基团可以被去除，然后与相同或优选不同的化合物A反应，得到异二价结构。此外，还可以使用羧基官能团上的正交保护基团来制备异三价、异四价和更高的异多价结构。在二醇(方案9)的情况下，羟基之一可以被保护，同时另一个羟基与碳酰氯反应，形成氯甲酸酯，随后添加至哌嗪的氨基上。完成后，保护基团可以被去除，然后与碳酰氯反应，随后与相同或优选不同的化合物A反应，得到异二价结构。而且，还可以通过使用醇官能团上的正交保护基团来制备异三价、异四价和更高的异多价结构。
方案10说明了用于随后的聚合物加成的N-氨基甲酰氯和异氰酸酯中间体的合成。在此方案中，哌嗪基团的氨基部分被衍生以进行随后的聚合物加成。
方案10
具体的说，在方案10中，化合物33的哌嗪基团的氨基部分转化为相应的N-氨基甲酰氯(化合物33a)，这种转化是通过是化合物33与过量的碳酰氯在合适的碱如碳酸氢钠的存在下(为清除反应中生成的酸)接触而进行的。反应结束后，化合物33a可以通过常规方法回收，例如中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择和优选不纯化和/或分离就用于下一步骤(在方案11中说明)中。
或者，化合物33的哌嗪基团的氨基部分可以通过与至少等量、优选过量的4-硝基苯甲酰氯在碱例如吡啶(也可以用作溶剂)的存在下(以清除反应过程中生成的酸)反应而转化为相应的酰胺(化合物45)。反应优选在大约0至大约22℃的温度下，进行大约1至大约24小时。反应完成后，化合物45通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择和优选不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
随后还原苯基的对硝基取代基，得到了化合物46中的胺取代基。还原作用通常是使用钯/碳在氢气氛中、通常在加压的条件下在合适的稀释剂如甲醇中进行的。反应一直进行到反应基本完成，一般在大约24至大约72小时内。在反应过程中，如需要，则另外加入催化剂以影响反应的完成。反应完成后，化合物46通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择和优选不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
化合物46的苯基的对氨基取代基转化为相应的异氰酸酯47，这种转化是通过与过量的碳酰氯在合适的碱如碳酸氢钠的存在下(以清除生成的酸)反应而发生的。反应一直进行到反应基本完成，一般在大约0℃至大约22℃下，进行大约0.5至大约5小时。反应完成后，化合物47通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
方案11进一步说明了提供聚合物取代衍生作用的另一种路线。在此方案中，化合物33a的哌嗪基团的氨基甲酰氯部分用作互补官能团，以形成氨基甲酸酯或脲键。仅为了说明的目的，所使用的聚合物是PEG的α，ω-二醇或二胺，且由下式表示：HQCH2CH2(OCH2CH2)pQH，其中Q是NH或O。
方案11
具体的说，在方案11中，过量(例如，每HQ部分2.5至10当量的氨基甲酰氯)的化合物33a在惰性溶剂如二氯甲烷中与合适的二羟基-或二氨基-PEG化合物相接触，优选存在合适的碱如三乙胺和/或催化量的4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)。反应一直进行至反应基本完成，一般在大约4至大约48小时内。反应完成后，化合物48通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
当Q是羟基时，产物含有将PEG基团与VLA-4拮抗剂通过由-C(O)-表示的连接子共价连接的氨基甲酸酯官能团。当Q是氨基时，产物含有将PEG与VLA-4拮抗剂通过由-C(O)-表示的连接子共价连接的脲官能团。用过量的甲酸常规去除叔丁基羧基保护基团，得到本发明的化合物。
方案12说明了提供聚合物取代衍生作用的另一种途径。在此方案中，化合物47的异氰酸酯用作互补官能团，以形成氨基甲酸酯或脲键。仅仅为了说明的目的，所使用的聚合物是PEG的α，ω-二醇或二胺，且可以由下式表示：HQCH2CH2(OCH2CH2)pQH，其中Q是NH或O。
方案12
具体的说，在方案12中，过量的异氰酸酯47(例如，每HQ部分2.5至10当量的异氰酸酯47)与合适的二羟基-或二氨基-PEG化合物在合适的惰性稀释剂如二氯甲烷或甲苯中接触。反应优选保持在大约0°至大约105℃的温度下，直至反应基本完成，时间一般在大约1至大约24小时内。反应完成后，化合物49通过常规方法回收，该常规方法包括中和、蒸发、萃取、沉淀、色谱、过滤等，或者可以选择不纯化和/或分离就用于下一步骤中。
当Q是羟基时，所得到的产物含有将PEG基团与VLA-4拮抗剂通过-C(O)-连接基团共价连接的氨基甲酸酯官能团。当Q是氨基时，所得到的产物含有将PEG基团与VLA-4拮抗剂通过-C(O)-连接基团共价连接的脲官能团。
用过量的甲酸常规去除叔丁基羧基保护基团，得到本发明的式I的单-PEG化合物47。
在方案11和12中描绘的反应可以在聚合物的两端同时进行(形成二聚体)，从而提供了同二价或更高价的同多价共轭物的一锅合成法。然而，要理解的是，这些反应可以通过使用保护基团而顺序进行。
在二胺的情况下，胺基之一被保护，而另一个基团与化合物33a的氨基甲酰氯或化合物47的异氰酸酯偶联。反应完成后，保护基团可以被去除，然后与相同或优选不同的化合物A反应，得到异二价结构。此外，还可以通过使用一个或多个胺官能团上的正交保护基团而制备异三价、异四价和更高的异多价结构。
在二醇的情况下，羟基之一可以被保护，而另一个基团与化合物33a的氨基甲酰氯或化合物47的异氰酸酯偶联。反应完成后，保护基团可以被去除，然后与相同的或优选不同的化合物A反应得到异二价结构。而且，还可以通过使用一个或多个羟基官能团上的正交保护基团而制备异三价、异四价和更高的异多价结构。
在上述方案中，可以上述方式使用位于分子其它部分上的胺部分来共价连接聚合物基团与分子。例如，位于Ar1上、杂环氨基酸上或Ar2上的胺同样可以被衍生以提供PEG取代。在合成中，胺部分可包含在这些取代基中，如果需要，适当地进行保护。或者，可以使用胺前体。例如，如方案10中所示，还原硝基从而得到相应的胺。同样，还原氰基从而得到H2NCH2-基团。作为氨基取代的Ar1基团，美国专利第6,489,300号中提供了硝基和氰基取代的Ar1基团。
而且，氨基取代可以被并入杂环氨基酸官能团中，然后被衍生以包含聚合物部分。例如，美国专利第6,489,300中描述了杂环氨基酸官能团可以是2-羧基哌嗪。或者，市售的3-或4-羟脯氨酸可以被氧化为相应的酮，然后在氰基硼氢化钠的存在下用氨水还原氨化形成相应的胺部分。此外，4-氰基脯氨酸可以被还原得到结构式为-CH2NH2的取代烷基，其可以通过胺被衍生。
此外，胺部分可以被并入Ar2官能团中。优选，胺部分以胺前体(例如与Ar2连接的硝基或氰基)而存在。
在上述方案中，胺与互补官能团的反应可以被逆转，因此羧基或羟基位于式II的VLA-4拮抗剂(没有任何聚合物取代基)上，且胺基可以是聚合物部分的一部分。在这种情况下，胺基(优选是将聚合物部分封端的胺基)，可以使用碳酰氯和Et3N转化为异氰酸酯，并与羟基反应形成氨基甲酸酯，如下述方案13所示：
方案13
具体的说，过量的化合物50(如美国专利第6,489,300号所述)以上述方式相接触，得到相应的氨基甲酸酯51。优选每异氰酸酯部分使用大约2.5至10当量的化合物50。然后，如上所述地去保护，得到相应的二酸(未显示)。
或者，在方案13中，羟基官能团可以与碳酰氯反应得到氯羰氧基衍生物，它可以与二胺化合物的胺基反应得到氨基甲酸酯。
例如Ar1部分上的羧基官能团可以通过与二氨基聚合物或更多氨基聚合物以上述方案8中所述的方式反应而转化为相应的酰胺。或者，下述方案14说明了从Ar1部分上的相应氰基产生胺官能团的一种方法。
方案14
具体的说，在方案14中，美国专利第6,489,300号中所述的已知化合物52在常规条件下用叔丁基保护，得到氰基化合物53，该化合物在常规条件下氢化，得到氨甲基化合物54。化合物54的氨甲基可以在上述任何一个方案中用于与聚合物部分偶联。
下述方案15说明了可以在上述任何一个方案中用于与聚合物部分偶联的3-氨基吡咯烷基衍生物的可选合成方法。
方案15
使用常规方法，将市售的顺式-4-羟基L-脯氨酸57用氯化氢甲醇回流处理几小时，然后蒸发，将由此得到的甲酯盐酸化物用过量的甲苯磺酰氯/吡啶在室温下处理两天，得到产物58。用弱酸水溶液中和吡啶，并且用有机溶剂如EtOAc萃取产物，以分离化合物58。产物58可以通过结晶、快速色谱而纯化，或者更优选不纯化用于随后的步骤中。
58与过量叠氮化钠在DMF中的饱和溶液，在室温下反应15天，得到化合物59。反应混合物用水稀释，然后用有机溶剂如EtOAc萃取，分离化合物59。产物59可以通过结晶、快速色谱而纯化，更优选不纯化用于随后的步骤中。
化合物59用氢氧化钠在水和甲醇的混合物中处理，从而将甲酯水解并产生羧酸；羧酸通过酸化分离，用有机溶剂如EtOAc萃取。羧酸用L-酪氨酸叔丁酯[H-Tyr(H)-OtBu]、EDAC、HOBt和Et3N/DMF处理，得到二肽，jiang二肽用水稀释并且用有机溶剂如EtOAc萃取。二肽用ClCONMe2、Et3N和DMAP/DCM回流处理24小时，得到氨基甲酸酯60；该氨基甲酸酯用下述方式分离：用EtOAc稀释，然后用弱酸和弱碱水溶液冲洗，然后蒸发。化合物60通过快速色谱严格纯化。
最后，将60的甲醇溶液与Pd/C催化剂在氢气中振荡，制备化合物61。过滤并蒸发以去除催化剂分离产物61。
将式II的化合物与聚合物偶联(任选地与带有分支臂的中心分子相连接)的其它方法在本领域中是公知的。
适用于与式II的化合物共轭的其它聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚二甲基丙烯酰胺(PDAAm)、聚乙烯醇(PVA)、葡聚糖、聚(L-谷氨酸)(PGA)、苯乙烯马来酸酐(SMA)、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚二乙烯醚马来酸酐(DIVEMA)。作为例子，PVP、PAAm和PDAAm可以通过在自由基聚合过程中引入共聚单体而被官能化。PVA和葡聚糖都含有适合共轭的伯醇羟基(OH)。这些生物聚合物的合成方法和将其与生物材料共轭的方法在本领域中是公知的(参见，例如，已公开的美国专利申请第20040043030号；美国专利第5,177,059号；美国专利第6,716,821号；美国专利第5,824,701号；美国专利第6,664,331号；美国专利第5,880,131号；Kameda，Y.等人，Biomaterials 25：3259-3266，2004；Thanou，M.等人，Current Opinion in Investigational Drugs 4(6)：701-709，2003；Veronese，F.M.等人，II Farmaco 54：497-516，1999，所有文献均在此整体引入作为参考文献)。
药学制剂
当用作药品时，本发明的共轭物通常以药学组合物的形式给药。这些共轭物可以通过多种途径给药，包括口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内、舌下、眼部或吸入给药(包括鼻或口吸入)。优选的给药途径包括皮下、静脉内和吸入。这些组合物可以通过制药领域中公知的方式制备，并且包括至少一种共轭物。
本发明也提供了包括根据本发明的共轭物的药学组合物，例如，式I的共轭物与一种作为α4β7抑制剂的独立化合物组合在一起。这些组合物还包括药学可接受的载体或赋形剂，并且可以如本文所讨论地给药。
本发明还包括含有一种或多种作为活性成分的式I的共轭物和药学可接受的载体的药学组合物。在制备本发明的组合物的过程中，活性成分通常与赋形剂相混合、用赋形剂稀释或封入载体内(该载体可以是在无菌注射溶液和无菌包装的粉末中)。对于皮下给药，简单的载体可以包括水、Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl的无菌水溶液，各种成分的比例提供了等渗条件和生理学可接受的pH，其被称为PBS或磷酸盐缓冲盐水。另一种选择是将化合物在无菌等渗盐水中给药，如果需要可以将盐水调节至生理pH。其它选择对于本领域技术人员是公知的，包括能够影响吸收速率和接触总量的混合溶剂系统。这些选择包括含有甘油、聚乙二醇400和棉籽油的混合溶剂系统。有可能使用的还有乙醇、N，N′-二甲基乙酰胺、丙二醇和苯甲醇，它们都可以用于提高通透性和高渗性。
在制备制剂的过程中，可能需要将活性化合物磨碎，以便使其在与其它成分混合之前得到合适的粒度。如果活性化合物基本上是不溶的，通常被磨碎至小于200目的粒度。如果活性化合物基本上是水溶性的，粒度通常通过研磨而被调节至例如大约40目，以便使其在制剂中基本上均匀分布。
合适的赋形剂的一些例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂还可以包括：润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，例如甲基苯甲酸盐和丙基羟基苯甲酸盐；甜味剂；以及调味剂。本发明的组合物可以调制为，通过使用本领域已知的方法对患者给药后，活性成分快速地、持续地或缓慢地释放的剂型。
通过皮下或静脉给予治疗剂的制剂在制药工业中是公知的。除了组合物中的治疗剂是可溶性的之外，皮下或静脉制剂还应该具有某些特性。例如，该剂型应该能促进活性成分的总体稳定性，制剂的制造还应该在成本上是经济的。所有这些因素最终决定了静脉制剂的总体上的成功和实用性。
可以包含在本发明化合物的药学制剂中的其它辅助添加剂如下：溶剂：乙醇、甘油、丙二醇；稳定剂：EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸；抗菌性防腐剂：苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯；缓冲剂：柠檬酸/柠檬酸钠、酒石酸氢钾、酒石酸氢钠、乙酸/乙酸钠、马来酸/马来酸钠、邻苯二甲酸氢钠、磷酸/磷酸二氢钾、磷酸/磷酸氢二钠；以及渗透压调节剂：氯化钠、甘露醇、右旋糖。
需要缓冲液的存在以便将水溶液的pH保持在大约4至大约8的范围内，更优选在大约4至大约6的范围内。缓冲系统通常是弱酸及其可溶性盐的混合物，例如柠檬酸钠/柠檬酸；或者二元酸的单阳离子或双阳离子盐，例如，酒石酸氢钾、酒石酸氢钠、磷酸/磷酸二氢钾和磷酸/磷酸氢二钠。
所使用的缓冲系统的量取决于(1)所需的pH；和(2)药物的量。通常使用的缓冲液量为，制剂中缓冲液：阿伦膦酸盐(alendronate)(其中缓冲液的摩尔数取自合并的缓冲液成分的摩尔数，例如柠檬酸钠和柠檬酸)的摩尔比例为0.5∶1至50∶1，以便将pH保持在4至8的范围内，通常所使用的缓冲液(合并的)与存在的药物的摩尔比例为1∶1至10∶1。
在本发明中，有用的缓冲液是柠檬酸钠/柠檬酸，其含量范围为每毫升5-50毫克柠檬酸钠/每毫升1-15毫克柠檬酸，这样的含量足以将组合物水溶液的pH保持在4-6。
缓冲剂的存在也可以防止药物与可溶性金属离子(例如，Ca、Mg、Fe、Al、Ba)形成可溶性金属复合体而沉淀，这些可溶性金属离子可能是从玻璃容器中或橡皮塞中析出来的，或者存在于普通的自来水中。这种试剂的作用可能是药物的竞争络合剂并且产生可溶性金属复合体，由此生成不需要的微粒。
另外，可能需要试剂(例如，量为大约1-8mg/ml的氯化钠)以便将紧张性(tonicity)调整至与人血液相同的数值，以避免在静脉制剂给药过程中发生红细胞肿胀或皱缩，从而避免产生不良反应如恶心或腹泻以及可能发生的相关血液疾病。通常制剂的紧张性与人血液相匹配，其范围是282至288mOsm/kg，通常为285mOsm/kg，这相当于0.9％氯化钠溶液的渗透压。
静脉制剂可以通过直接静脉内注射、静脉快速滴注来给药，或者通过加入到合适的输注溶液中而通过输注给药，例如0.9％氯化钠注射液或其它相容的输注溶液。
组合物可以单位剂型而配制，每单位剂量含有大约5至100mg活性成分，更普遍的是大约10至大约30mg活性成分。术语“单位剂量形式”指的是适合用作人类受试者和其它哺乳动物的单位剂量的物理上的单独单位，每单位含有预定数量的计算能产生所需治疗效应的活性原料以及合适的药学赋形剂。
共轭物在宽的剂量范围内都是有效的，并且通常以药学有效量给药。但要理解的是，实际给予的共轭物的数量将由医生根据有关情况来确定，这些情况包括所处理的病情、选择的给药途径、给予的实际化合物、每一个患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重性等。
为制备固体组合物如片剂，主要的活性成分与药学赋形剂混合形成固体预制剂组合物(solid preformalation composition)，该组合物含有本发明化合物的均匀混合物。当提到这些预制剂组合物是均匀的时，其含义是活性成分均匀地分散在组合物中，这样组合物可以容易地再分为同样有效的单位剂量形式如片剂、丸剂和胶囊。然后，该固体预制剂被再分成上述类型的单位剂量形式，该剂型含有例如0.1至大约500毫克的本发明的活性成分。
本发明的片剂或丸剂可以包上糖衣或者制成复合药物以获得具有长效优势的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内用和外用组分，后者的形式是在前者上包上糖衣。两种组分可以用肠溶层分隔，其作用是抵抗在胃内的崩解，从而使内用组分完整地进入十二指肠或延缓释放。多种材料可以用作这种肠溶层或包衣，这些材料包括多种聚合酸、以及聚合酸与例如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的混合物。
可掺入本发明的新型组合物以口服给药或注射给药的液体剂型包括具有合适口味的糖浆水溶液、水性或油性悬液、以及具有食用油如棉籽油、椰子油或花生油的已调味乳剂、以及酏剂和类似的药学载体。
吸入或吹入的组合物包括在药学可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬液、以及粉末。液体或固体组合物可以含有前述合适的药学可接受的赋形剂。优选，组合物经口或鼻吸入途径给药发挥局部或全身效应。优选在药学可接受的溶剂中的组合物可以通过使用惰性气氛喷雾给药。喷雾溶液可以从喷雾装置直接吸入，或者喷雾装置可以被接在面罩通气口或间歇正压呼吸机上。溶液、悬液或粉末组合物可以从装置给药，优选经口或经鼻，该装置以适当方式对制剂进行传递。为进行吸入或吹入给药，优选共轭物的总分子量在大约10,000道尔顿至70,000道尔顿之间，更优选大约20,000道尔顿至45,000道尔顿之间。
聚合物共轭物
如上配制和给药的本发明的化合物是聚合物共轭物。加入的聚合物共轭物相对于非共轭的聚合物具有很多优势，例如溶解性和体内稳定性提高。正是如此，可以使用单个聚合物分子与本发明的化合物共轭，尽管也考虑到通常通过载体还可以连接一个以上的聚合物分子。本发明的共轭化合物发现可以在体内以及非体内中的应用。另外，要认识到共轭聚合物可以使用其它基团、部分或共轭物种，如适合于终端应用。其例子是，在一些应用中使聚合物官能化以使其具有反应性，使其能够与式II的化合物共轭，以增强被共轭的总物质的多种特性或特征，这样是有好处的。因此，聚合物可以含有任何官能团、重复基团、连接或其它成分结构，它们不会影响本发明的共轭化合物的预期效力。
可用于达到这些所需特征的示例性的聚合物如前所述和PCT WO01/54690(Zheng等人)中所述，该专利在此全部引入作为参考文献。聚合物可以与本发明的化合物相连接(优选经过连接子部分)形成稳定的键，该键明显不会被人类的酶切断。通常对于“明显”不会被切断的键来说，需要将聚合物和该聚合物所连接的本发明化合物相连接的键在24小时内被切断的比例不超过20％，可以通过本领域中标准的技术测定，这些技术包括但不限于高压液相色谱(HPLC)。
通常，本发明的化合物含有至少两种与聚合物相连接的式II的化合物。最终的数量是在反应程度最大、同时产物的非特异性修饰最小之间达到平衡，规定化学实体要保持最佳的活性，同时优化本发明的化合物的半衰期。优选，保留了本发明化合物至少大约50％的生物学活性，更优选保留100％的活性。
如上所述，在本发明的优选实施方式中，在所关注的聚合物系统中有利地加入C2-C4烷基聚烷撑二醇的聚烷撑二醇残基，优选聚乙二醇(PEG)或这些二醇的聚(氧)烷撑二醇残基。因此，本发明化合物所连接的聚合物可以是聚乙二醇(PEG)的均聚物或是聚氧乙烯多元醇，条件是所有情况下聚合物在室温中都可溶解在水中。这些聚合物的非限制性例子包括聚氧化烯均聚物，例如PEG或聚丙二醇、聚氧乙烯二醇、其共聚物和嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。
聚氧乙烯多元醇的例子包括但不限于聚氧乙烯丙三醇、聚氧乙烯山梨糖醇、聚氧乙烯葡萄糖或类似物。聚氧乙烯丙三醇的甘油主链与天然的主链是相同的，例如动物和人类的甘油单酯、双酯和三酯中的主链。因此，这种分支在体内不一定会被认为是外源物质。
本领域普通技术人员要理解的是，前面的列举仅是说明性的，并且可以考虑具有本文所述性质的所有聚合物材料。聚合物不需要具有特殊的分子量，但优选分子量在大约100至100,000之间，优选大约10,000至80,000之间；更优选大约20,000至大约70,000之间。尤其是，大小为20,000或更大的化合物在防止由于肾脏过滤而引起的产物损失方面是最有效的。
PEG衍生物指的是其中聚乙二醇本身上的一个或两个末端羟基被修饰的聚乙二醇聚合物。合适的修饰的例子包括用可选的官能团替换一个或两个羟基，该官能团可以用低分子量的配基或其它大分子或聚合物来保护或不保护。通过将聚乙二醇与包括互补反应性官能团的化合物反应，可以完成聚乙二醇末端羟基的修饰，该互补反应性官能团包括能与聚乙二醇羟基发生反应的官能团。本发明的化合物的PEG衍生物可以含有一个或多个通过连接基团与其共价连接的聚乙二醇(PEG)取代基。
下述制剂实施方式举例说明了本发明的药学组合物。
制剂实施例1
制备含有下列成分的硬明胶胶囊：
成分 质量(mg/胶囊)
活性成分 30.0
淀粉 305.0
硬脂酸镁 5.0
上述成分混合在一起，质量为340mg，装入硬明胶胶囊中。
制剂实施例2
使用下述成分制备片剂：
成分 质量(mg/片)
活性成分 25.0
微晶纤维素 200.0
胶体二氧化硅 10.0
硬脂酸 5.0
这些成分混合、压片成为片剂，每片重240mg。
制剂实施例3
制备含有下列成分的干粉吸入剂：
成分 重量％
活性成分 5
乳糖 95
将活性成分与乳糖混合，混合物加入至干粉吸入装置中。
制剂实施例4
如下制备每片含有30mg活性成分的片剂：
成分 质量(mg/片)
活性成分 30.0mg
淀粉 45.0mg
微晶纤维素 35.0mg
聚乙烯吡咯烷酮 4.0mg
(10％无菌水溶液)
羧甲基淀粉钠 4.5mg
硬脂酸镁 0.5mg
滑石 1.0mg
总计 120mg
活性成分、淀粉和纤维素通过20目U.S.筛并充分混合。聚乙烯吡咯烷酮的溶液与所得到的粉末混合，然后通过16目U.S.筛。得到的颗粒在50℃至60℃进行干燥，并通过16目U.S.筛。然后，将前面已通过30目U.S.筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石加入至颗粒中，混合后，在压片机上压片，得到每片重120mg的片剂。
制剂实施例5
如下制备每粒含有40mg药物的胶囊：
成分 质量(mg/胶囊)
活性成分 40.0mg
淀粉 109.0mg
硬脂酸镁 1.0mg
总计 150.0mg
将活性成分、淀粉和硬脂酸镁混合，通过20目U.S.筛，质量为150mg，装入硬明胶胶囊中。
制剂实施例6
如下制备每粒含25mg活性成分的栓剂：
成分 数量
活性成分 25mg
饱和的脂肪酸甘油酯 达到2,000mg
活性成分通过60目U.S.筛，悬浮在饱和的脂肪酸甘油酯(之前需要少量的热量将其融化)中。然后混合物倒入至标称2.0g容量的栓剂模中冷却。
制剂实施例7
如下制备每剂含有50mg药物/5.0ml剂量的悬液：
成分 数量
活性成分 50.0mg
黄原胶 4.0mg
羧甲基纤维素钠(11％)
微晶纤维素钠(89％) 50.0mg
蔗糖 1.75g
苯甲酸钠 10.0mg
调味剂和颜料 适量
纯水 至5.0ml
将活性成分、蔗糖和黄原胶混合，通过10目U.S.筛，然后与之前在水中制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的溶液混合。苯甲酸钠、调味剂和颜料用一些水稀释并搅拌。然后加入足够的水，得到需要的容量。
制剂实施例8
成分 质量(mg/胶囊)
活性成分 15.0mg
淀粉 407.0mg
硬脂酸镁 3.0mg
总计 425.0mg
将活性成分、淀粉和硬脂酸镁混合，通过20目U.S.筛，以425.0mg的质量装入硬明胶胶囊中。
制剂实施例9
如下制备皮下制剂：
成分 质量
活性成分 50mg.mL mg
磷酸盐缓冲盐水 1.0ml
制剂实施例10
如下制备局部制剂：
成分 质量
活性成分 1-10g
乳化蜡 30g
液体石蜡 20g
白凡士林 100g
将白凡士林加热至熔化。加入液体石蜡和乳化蜡，搅拌至溶解。加入活性成分并继续搅拌直至完全分散。然后混合物冷却至成为固体。
制剂实施例11
如下制备静脉内制剂：
成分 质量
活性成分 250mg
等渗盐水 100ml
本发明的方法中使用的另一种优选制剂使用了透皮给药装置(“贴片”)。这种透皮贴片可用来将本发明的化合物以可控的数量连续或非连续地输入。用于递送药剂的透皮贴片的构造和应用在本领域中是公知的。参见，例如，1991年7月11日公开的美国专利第5,023,252号，该专利在此引入作为参考文献。这种贴片的构造可以被制成连续、脉冲式或根据需要的递送药剂。
经常需要或必须将药物组合物直接或间接地导入进脑中。直接技术通常涉及将药物递送导管放置进接受者的脑室系统中以绕过血脑屏障。这类用于将生物学因子转运至机体的特殊解剖部位的可植入递送系统的其中一种如美国专利第5,011,472号所述，该专利在此引入作为参考文献。
间接技术，通常优选涉及通过将亲水性药物转化为脂溶性药物对组合物进行配制，从而提供药物潜伏化。潜伏化通常是通过下述方法来达到的：阻塞药物上存在的羟基、羰基、硫酸根和伯胺基团，从而使药物具有更大的脂溶性，使其能够通过血脑屏障进行转运。或者，可以通过动脉内输注高渗溶液来增强亲水性药物的递送，这种方法可暂时地使血脑屏障开放。
适用于本发明的其它剂型可见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)。
如上所述，本文所述的化合物适用于上述多种药物递送系统中。另外，为延长给药的化合物在体内的血清半衰期，化合物可以包上糖衣、导入脂质体腔内、制备为胶体、或者可以使用其它常规技术使化合物的血清半衰期延长。有多种方法可以制备脂质体，如Szoka等人的美国专利第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中所述，这些专利均在此引入作为参考文献。
工业应用性
本发明的共轭物是α4β1(VLA-4)拮抗剂。一些共轭物也可以具有对α4β7整合素的部分亲和性，使它们成为α4整合素的混合抑制剂。与非共轭的化合物相比，共轭物在体内的保留时间延长。共轭物在体内保留时间的延长使需要的药物量降低，不良反应更少，并且发生毒性的可能性更小。另外，药物制剂对患者给药的次数较少，而达到相似或更大的治疗效应。
通过抑制α4β1或α4β7与细胞受体如VCAM-1、纤维连接蛋白和MadCAM的结合，本发明的共轭物在体内对所介导的白细胞与内皮细胞粘附的抑制作用增强。优选，本发明的共轭物可以通过，例如输注或皮下注射或口服给药，治疗由α4β1和/或α4β7介导的疾病(通常称为白细胞粘附)。本发明的共轭物可以用来治疗多种炎性脑病，尤其是其中内皮细胞/白细胞粘附机制引起健康脑组织破坏的中枢神经系统疾病。因此，本发明的共轭物可以用于，例如，治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、多发性硬化症(MS)、脑膜炎和脑炎。
本发明的共轭物也可以用于治疗其它器官系统中因组织损伤引起的功能障碍和疾病，其中组织损伤也是经粘附机制导致白细胞迁移或活化而引起的。在哺乳动物患者中这些疾病的例子是炎性疾病如哮喘、阿耳茨海姆氏病、动脉粥样硬化、AIDS痴呆症、糖尿病(包括急性青少年型糖尿病)、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆氏病)、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移、中风、以及其它脑外伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮炎、银屑病、心肌缺血和白细胞介导的急性肺损伤(如发生在成人呼吸窘迫综合征中的急性肺损伤)。
使用本发明的共轭物可治疗的其它疾病还包括结节性红斑、变应性结膜炎、视神经炎、眼葡萄膜炎、变应性鼻炎、强制性脊柱炎、银屑病性关节炎、血管炎、莱特尔氏综合征、系统性红斑狼疮、进行性全身性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎、Wegner氏肉芽肿、主动脉炎、类肉瘤病、淋巴细胞减少症、颞动脉炎、心包炎、心肌炎、充血性心力衰竭、结节性多动脉炎、高敏反应综合征、变态反应、嗜酸细胞过多综合征、变应性肉芽肿性血管炎、慢性阻塞性肺病、过敏性肺炎、慢性活动性肝炎、间质性膀胱炎、自身免疫性内分泌功能障碍、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性再生障碍性贫血、慢性迁延性肝炎和甲状腺炎。
本发明也提供了治疗患者的至少部分由α4整合素介导的白细胞粘附引起或加重的疾病的方法，该方法包括将有效量的本发明共轭物例如式I的共轭物与有效量的作为α4β7抑制剂的独立化合物共同给药。共同给药可同时进行或依次进行。例如，本发明的共轭物的给药可以比α4β7抑制剂的给药提前几分钟或几小时。或者，α4β7抑制剂在本发明的共轭物之前给药。
证明有效治疗炎性反应的合适体内模型包括EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)的小鼠、大鼠、豚鼠或灵长类动物模型以及其它依赖于α4整合素的炎症模型。
炎性肠病是两种类似的疾病克隆氏病和溃疡性结肠炎的总称。克隆氏病是一种原发性的慢性溃疡性缩窄性炎性疾病，其特征是边界非常明确，一般累及肠壁所有层次的透壁肉芽肿性炎性反应。从口至肛门胃肠道的所有节段都可能被累及，尽管该病最常见的是侵犯回肠末端和/或结肠。溃疡性结肠炎是主要局限在结肠粘膜和粘膜下层的炎性反应。在炎性肠病病变内有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，这些细胞可引起炎性损伤。
哮喘的特征是气管支气管树对多种刺激的反应性增加，引起支气管气道的发作性收缩。刺激物引起多种炎症介质从IgE包被的肥大细胞中释放，这些介质包括组织胺、嗜酸性和嗜中性细胞化学趋化因子、白三烯、前列腺素和血小板活化因子。这些因子的释放使嗜酸性粒细胞和中性粒细胞归巢，引起炎性损伤。
动脉粥样硬化是一种动脉疾病(例如，冠状动脉、颈动脉、主动脉和髂动脉)。基本病变，粥样斑是由内膜内隆起的局灶斑块组成的，该斑块有一个脂质核心和外被的纤维帽。粥样斑会阻断动脉血流，使受累的动脉血流减少。心肌和脑梗塞是这种疾病的主要结局。巨噬细胞和白细胞被吸引至粥样斑，并引起炎性损伤。
类风湿性关节炎是一种慢性、复发性炎性疾病，主要引起关节损害和破坏。类风湿性关节炎通常首先影响四肢的小关节，但然后可累及腕关节、皱关节、跺关节和膝关节。关节炎是由滑膜细胞与从循环中浸润至关节滑膜衬里中的白细胞相互作用引起的。参见，例如，Paul，Immunology(3d ed.，Raven Press，1993)。
本发明的共轭物的另一适应症是治疗由VLA-4介导的器官或移植物排斥。最近几年，对于组织和器官如皮肤、肾脏、肝脏、肺、胰腺和骨髓移植的外科手术技术效率已经得到了相当大的提高。可能主要的突出问题是缺少满意的药物诱导受者对移植的同种异体移植物或器官的免疫耐受。当同种异体细胞或器官被移植进宿主体内(即，供体和受体是相同种属的不同个体)时，宿主免疫系统可能会对移植物中的外来抗原发动免疫反应(宿主抗移植物病)，从而引起移植组织的破坏。CD8+细胞、CD4细胞和单核细胞都参与了移植组织的排斥反应。本发明的共轭物能与α4整合素结合，尤其可以用于阻断同种异体抗原诱发的受体体内的免疫反应，因而阻止了这些细胞参与破坏移植组织或器官。参见，例如Paul等人，Transplant International 9，420-425(1996)；Georczynski等人，Immunology 87，573-580(1996)；Georcyznski等人，Transplant.Immunol.3，55-61(1995)；Yang等人，Transplantation 60，71-76(1995)；Anderson等人，APMIS 102，23-27(1994)。
本发明的可以与VLA-4结合的共轭物的一种相关用途是调节参与“移植物抗宿主”病的免疫反应。参见，例如Schlegel等人，J.Immunol.155，3856-3865(1995)。GVHD是一种当免疫活性细胞转移至同种异体的受体体内时发生的有可能致死的疾病。在这种情况下，供体的免疫活性细胞可能会攻击受体内的组织。皮肤组织、肠上皮和肝脏都是经常被攻击的靶标，在GVHD过程中可能被破坏。当免疫组织被移植时，如骨髓移植，该疾病表现出尤其严重的问题；但也有报道在其它情况下，包括心脏和肝脏移植物中，GVHD不太严重。本发明的治疗药物尤其可以用于阻断供体T细胞的活化，因而干扰了它们溶解宿主靶细胞的能力。
本发明的制剂尤其可以用于治疗多发性硬化症、类风湿性关节炎和哮喘。
本发明的共轭物的进一步用途是抑制肿瘤转移。已有报道几种肿瘤细胞可表达VLA-4，与VLA-4结合的化合物可阻断这些细胞与内皮细胞的粘附。Steinback等人，Urol.Res.23，175-83(1995)；Orosz等人，Int.J.Cancer 60，867-71(1995)；Freedman等人，Leuk.Lymphoma13，47-52(1994)；Okahara等人，Cancer Res.54，3233-6(1994)。
具有所需生物学活性的化合物可以根据需要被修饰以提供所需的特性，如药学特性提高(例如，体内稳定性，生物利用度)，或在诊断学应用中被检测到的能力。稳定性可以多种方式进行测定，如通过测定在与肽酶或人血浆或血清孵育过程中蛋白的半衰期。许多这种蛋白稳定性测定法都已有描述(见，例如Verhoef等人，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet，1990，15(2)：83-93)。
本发明的共轭物的另一种用途是治疗多发性硬化症。多发性硬化症是一种进行性神经自身免疫性疾病，估计在美国有250,000至350,000个患者。多发性硬化症被认为是特异性自身免疫反应的结果，其中某些白细胞攻击和引起覆盖在神经纤维外面的绝缘鞘，髓鞘的破坏。在多发性硬化症的动物模型中，针对VLA-4的鼠单克隆抗体已经显示能阻断白细胞与内皮细胞的粘附，并因此阻止中枢神经系统的炎症和随后动物的瘫痪16。
本发明的药学组合物适用于多种药物递送系统中。用于本发明中的合适剂型可见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace PublishingCompany，Philadelphia，PA，第17版，(1985)。
给予患者的数量将取决于给药的物质、给药的目的(例如预防或治疗)、患者的状态、给药的方式等。在治疗性应用中，组合物可以以足以治愈或至少部分解除疾病及其并发症的症状的量给予已经患有疾病的患者。足以达到此目的的量称为“治疗有效剂量”。有效用于此用途的量取决于所治疗的病情以及主治医生根据一些因素所做的判断，这些因素例如炎症的严重性、患者的年龄、体重和一般状况和类似因素。
给予患者的组合物可以是以上述药学组合物的形式。这些组合物可以通过常规灭菌技术进行灭菌，或者可以被无菌过滤。得到的水溶液可以被包装备用；或被冻干，并且在给药之前将冻干制剂与无菌水性载体混合。
本发明的共轭物的治疗剂量将根据，例如，所治疗的特殊用途、共轭物的给药方式、患者的健康状况和病情以及处方医生的判断进行变化。例如，对于静脉内给药，剂量的范围一般在大约20μg至大约2000μg/kg体重，优选大约20μg至大约500μg/kg体重，更优选大约100μg至大约300μg/kg体重。鼻内给药的合适剂量范围通常在大约0.1pg至1mg/kg体重。有效剂量可以从来自体外或动物模型检测系统的剂量反应曲线中推知。
本发明的共轭物也能结合或拮抗α6β1、α9β1、α4β7、αdβ2、αeβ7整合素的作用(尽管α4β1和α9β1在本发明中是优选的)。因此，本发明的共轭物也可以用于预防或逆转由这些整合素与其相应配体结合诱发的症状、功能紊乱或疾病。
例如，1998年12月3日公开的国际申请第WO 98/53817号(该申请的公开内容在此全部引入作为参考文献)和本文所引用的参考文献描述了由α4β7介导的疾病。该参考文献也描述了测定拮抗α4β7依赖性结合VCAM-1g融合蛋白的测定方法。
另外，与αdβ2、αeβ7整合素结合的化合物可特别用于治疗哮喘和相关的肺部疾病。参见，例如M.H.Grayson等人，J.Exp.Med.1998，788(11)2187-2191。与αeβ7整合素结合的化合物也可以用于治疗系统性红斑狼疮(参见，例如，M.Pang等人，Arthritis Rheum.1998，41(8)，1456-1463)；克隆氏病、溃疡性结肠炎和炎性肠病(IBD)(参见，例如，D.Elewaut等人，Scand J.Gastroenterol 1998，33(7)743-748)；干燥综合征(见，例如U.Kroneld等人，Scand J.Gastroenterol 1998，27(3)，215-218)；以及类风湿性关节炎(见，例如Scand J.Gastroenterol1996，44(3)，293-298)。而且，与α6β1结合的化合物可用于防止受精(参见，例如H.Chen等人，Chem.Biol.1999，6，1-10)。
在本发明另一方面，在例如多发性硬化症的情况下，本文所述的共轭物和组合物可以用于抑制免疫细胞从血流中迁移至中枢神经系统，或者迁移至引起炎症诱发破坏髓鞘的区域。优选这些试剂抑制免疫细胞迁移的方式是抑制脱髓鞘作用，并可进一步促进髓鞘再生。对于先天性代谢疾病，这些试剂也可防止中枢神经系统的脱髓鞘和促进髓鞘再生，在这些疾病中，浸润的免疫细胞主要在CNS中影响髓鞘的发育。当这些试剂给予由脱髓鞘疾病或病患诱发瘫痪的受者时，优选也可使瘫痪复原。
包括由本文所公开的组合物、共轭物和方法治疗的疾病中的炎性疾病通常包括与脱髓鞘相关的疾病。在组织学上，髓鞘异常是脱髓鞘或髓鞘形成障碍。脱髓鞘表示髓鞘的破坏。髓鞘形成障碍指的是由于少突胶质细胞功能障碍引起的髓鞘形成或维持缺陷。优选本文所公开的组合物和方法被考虑用来治疗与脱髓鞘有关的疾病和病患，并辅助髓鞘再生。考虑治疗的其它疾病或病患包括脑膜炎、脑炎和脊髓损伤以及通常由于炎性反应诱发脱髓鞘的病患。本文所公开的共轭物、组合物和方法并不针对其中，例如是遗传缺陷引起的不正常的髓鞘形成，例如髓鞘形成障碍的疾病和病患。
本文所公开的组合物、共轭物和鸡尾酒化合物可考虑用于治疗与脱髓鞘有关的病患和疾病。涉及脱髓鞘的疾病和病患包括但不限于多发性硬化症、先天性代谢性疾病(例如，苯丙酮尿症、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、高歇氏病(Gaucher′s disease)、赫尔勒氏综合征(Hurler′s syndrome)、克腊比氏病(Krabbe′s disease)和其它脑白质营养不良)、具有异常髓鞘形成的神经病变(例如，Guillain Barre、慢性免疫性脱髓鞘性多神经病(CIDP)、多灶性CIDP、抗-MAG综合征、GALOP综合征、抗硫脂抗体综合征、抗-GM2抗体综合征、POEMS综合征、神经束膜炎、IgM抗-GD1b抗体综合征)、药物相关性脱髓鞘(例如，由氯喹、FK506、哌克昔林、普鲁卡因胺和齐美定给药引起)、其它遗传性脱髓鞘疾病(例如，糖类缺陷性糖蛋白、科凯恩综合征(Cockayne′s syndrome)、先天性髓鞘发育不良、先天性肌营养不良症、法勃氏病(Farber′s disease)、
综合征、异染性脑白质不良、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、雷夫叙姆病(Refsum disease)、朊病毒相关疾病和Salla病)和其它脱髓鞘病患(例如，脑膜炎、脑炎或脊髓损伤)或疾病。
有许多疾病模型可用来在体内研究这些疾病。例如，动物模型包括但不限于：
表III
| 疾病模型 | 种属 |
| EAE | 小鼠、大鼠、豚鼠 |
| 髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的EAE | 大鼠 |
| 脱髓鞘的TNF-α转基因模型 | 小鼠 |
多发性硬化症
最常见的脱髓鞘疾病是多发性硬化症，但许多其它代谢性和炎性疾病能引起缺陷性或异常的髓鞘形成。MS是一种慢性神经疾病，出现在早期成年期，在大多数病例会进展成为明显的残疾。单在美国就有大约350,000名MS病例。除了创伤以外，MS是成人早期至中期神经残疾的最常见病因。
MS的原因仍然需要进一步被确定。MS的特征是慢性炎症、脱髓鞘和神经胶质增生(瘢痕形成)。脱髓鞘可引起轴突传导的负性或正性作用。正性传导异常包括轴突传导延缓、可变的传导阻滞(在有高频但非低频冲动序列存在时出现)或完全传导阻滞。正性传导异常包括自发性或在机械应激后产生异位性冲动和在脱髓鞘的轴突之间产生异常的“通话”。
已经观察到T细胞对髓磷脂蛋白(髓磷脂碱性蛋白(MBP)或髓鞘蛋白脂蛋白(PLP))的反应性介导了实验性变应性脑脊髓炎中的CNS炎症。也已经观察到患者CNS免疫球蛋白(Ig)的水平升高。进一步有可能在MS中观察到的一些组织损伤是由活化T细胞、巨噬细胞或星形胶质细胞的细胞因子产物介导的。
目前，诊断有MS的患者80％在疾病发作后可生存20年。MS的治疗包括：(1)针对疾病病程的变化进行治疗，包括治疗急性恶化和针对长期抑制疾病进行治疗；(2)治疗MS的症状；(3)预防和治疗医疗并发症；和(4)处理继发的人际和社会问题，
MS的发作可能很剧烈或很缓和以至于不引起患者注意去看医生。最常见的症状包括一个或多个肢体虚弱、由于视神经炎引起的视力模糊、感觉障碍、复视和共济失调。疾病的病程可分成三大类：(1)复发性MS，(2)慢性进行性MS，和(3)不活动性MS。复发性MS的特征是神经功能障碍反复发作。MS的发作通常进行几天至几周，紧接着可能完全、部分或不复原。发作后从症状的高峰期复原通常在几周至几月内发生，尽管持续2年或2年以上的复原很少见。
慢性进行性MS可引起逐渐地进行性恶化，没有稳定期或缓解期。这种形式发生在有复发性MS既往史的患者中，尽管20％的患者回忆没有复发。在进行性过程中也可发生急性复发。
第三种形式是不活动性MS。不活动性MS的特征是程度不同的稳定不变的神经缺陷。大多数不活动性MS患者都有较早的复发性MS既往史。
疾病的病程也取决于患者的年龄。例如，较佳的预后因素包括早发(儿童期除外)、发作后5年复发和很少的残疾。相反，不良预后与发作年龄较晚(即40岁的年龄或更老)和进行性的病程有关。这些变量是相互独立的，因为慢性进行性MS开始的年龄有比复发性MS晚的趋势。慢性进行性MS患者的残疾通常是进行性截瘫或四肢瘫痪(瘫痪)引起的。在本发明的一个方面，优选当患者在缓解期时而不是在疾病的复发阶段进行治疗。
短期使用促肾上腺皮质激素或口服皮质激素(例如，口服的强的松或静脉给药的甲基强的松龙)仅是治疗MS急性恶化患者的特殊治疗措施。对于MS较新的治疗方法包括用干扰素β-1b、干扰素β-1a和Copaxone
(以前称为共聚物1)对患者进行治疗。这三种药物已经显示能显著地降低疾病的复发率。这些药物可经肌肉内或皮下自行给药。
但，目前没有一种治疗方式能抑制脱髓鞘，能单独促进或使自发髓鞘再生发生或使瘫痪复原。本发明的一个方面考虑了用在此公开的药剂单独或与其它标准的治疗方式联合治疗MS。
先天性代谢性疾病
先天性代谢性疾病包括苯丙酮尿症(PKU)和其它氨基酸尿症、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、高歇氏病(Gaucher′s disease)、赫尔勒氏综合征(Hurler′s syndrome)、克腊比氏病(Krabbe′s disease)和其它脑白质营养不良，这些疾病可影响髓鞘的发育，下面将详细进行描述。
PKU是由苯丙氨酸羟化酶缺陷引起的一种遗传性代谢错误。该酶的丢失引起智力迟钝、器官损害、不正常的姿势，在孕妇发生PKU时，严重者可中止妊娠。已经发现了研究PKU的小鼠模型。被鉴定有PKU的婴儿要保持无或低苯丙氨酸饮食。本发明的一个方面将这种饮食与在此公开的共轭物和组合物联合在一起应用以防止脱髓鞘和由于PKU而被损害的髓鞘再生细胞。
典型的泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)出现在大约6个月的受试者中，最后将引起受试者在5岁时死亡。该疾病是由于缺少己糖胺酶A(hex A)，该酶是在脑和神经细胞中降解某种脂肪酸物质所必需的。在缺少酶时，这些物质积累，引起神经细胞破坏。另一种形式的hex A酶缺陷在生命中发生的较晚，被称为青少年慢性和成人发作型hex A缺陷。症状类似于典型泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)的特征。也有酶缺陷的成人发作形式。目前对于该疾病/缺陷没有治愈的病例或治疗方法，仅有在子宫内检测胎儿预防疾病的措施。因此，在此公开的共轭物和组合物可以用于改善或阻止这种患者中神经细胞的破坏。
尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)分为三种类型：急性婴儿型、B型是一种较少见的慢性、非神经型，C型是该疾病的一种生物化学和遗传独特型。在正常的个体中，细胞胆固醇输送至溶酶体进行加工，之后被释放。从患尼曼-皮克病受试者采集的细胞显示在从溶酶体中释放胆固醇的过程是有缺陷的。这引起胆固醇在溶酶体内部的过量积聚，引起加工障碍。NPC1发现具有与其它蛋白类似的已知甾醇敏感区，该区被认为在调节胆固醇运输中具有重要地位。对于尼曼-皮克病的A型和C型还没有建立成功的治疗方法。对于C型，推荐患者进低胆固醇饮食。因此，在此公开的共轭物和组合物可以用于改善或组织细胞的破坏。
高歇氏病(Gaucher′s disease)是一种由于基因突变引起的遗传性疾病。正常该基因是编码称为葡萄糖脑苷脂酶的一种酶，机体需要该酶来分解脂肪，葡萄糖脑苷脂。在患有高歇氏病(Gaucher′s disease)的患者中，身体不能正常地产生该酶，该脂肪不能被分解。象泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)一样，高歇氏病在来自东欧犹太人(德系犹太人)的后代中非常常见，尽管任何种属的个体均可能被累及。在德系犹太人群体中，高歇氏病是最常见的遗传病，发生率大约为1/450人。在公众当中，高歇氏病发病率大约为1/100,000人。
1991年，酶替代治疗成为高歇氏病的首个有效治疗方法。该治疗方法包括静脉给予葡萄糖脑苷脂酶的修饰形式。要理解的是在此公开的组合物和共轭物可单独使用或更优选与葡萄糖脑苷脂酶联合使用以治疗患病的受试者。
赫尔勒氏综合征(Hurler′s syndrome)也称为I型粘多糖增多症，是一种重叠性疾病。这些遗传疾病的共同点是在粘多糖积聚在成纤维细胞中。这些疾病从遗传学上是可区分的。成纤维细胞和骨髓移植似乎没有什么帮助，因此需要改善疾病严重程度和延缓进展的共轭物和组合物。在此公开的共轭物和组合物可给予受试者以延缓疾病的进展和/或改善其严重性。
克腊比氏病(Krabbe′s disease)(也称为球形细胞脑白质不良)是一种由半乳糖神经酰胺酶(或半乳糖脑苷脂酶)缺陷引起的常染色体隐性遗传疾病，该溶酶体酶能分解髓磷脂的主要脂质成分。在法国病的发生率估计为1∶150,000出生儿。该病引起中枢和外周神经系统的脱髓鞘。通常该病在出生的第一年内就可发生，并迅速进展，但也有报道少年、青年或成人发作型，其进展的速度变化更大。从酶测定(半乳糖神经酰胺酶)来建立诊断。有几种天然的动物模型(鼠、狗、猴)。克腊比氏病，象所有脑白质营养不良一样，尚没有治愈的病例或有效的治疗方法。本发明的一个实施例是使用在此公开的组合物和共轭物来治疗或改善克腊比氏病和其它脑白质营养不良。
脑白质营养不良是一组遗传上确定的进行性疾病，累及脑、脊髓和外周神经。这些疾病包括脑白质肾上腺萎缩症(ALD)、肾上腺髓质神经病变(AMN)、Aicardi-Goutiers综合征、亚历山大病(Alexander′sdisease)、CACH(即，伴有中枢神经系统髓磷脂形成减少或白质消失的婴幼儿共济失调)、CADASIL(即，伴皮质下梗死及白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病)、Canavan氏病(脑白质海绵状变性)、脑腱性黄瘤病(CTX)、克腊比氏病(Krabbe′s disease)(如上所述)、异染性脑白质营养不良(MLD)、新生儿脑白质肾上腺萎缩症、卵巢脑白质营养不良综合征(ovarioleukodystrophy syndrome)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)(X-连锁的痉挛性截瘫)、雷夫叙姆病(Refsum disease)、van der Knaap综合征(伴皮层下囊肿的空泡脑白质营养不良)和泽尔韦格氏综合征(Zellweger syndrome)。这些疾病没有有效的治疗方法，更不用说治愈的病例了。因此，需要治疗或改善这些疾病症状的方法，如通过使用在此公开的组合物和共轭物。
伴有异常髓鞘形成的神经病
有多种慢性免疫多发性神经病变可引起患者的脱髓鞘。这些疾病的发作年龄根据病情而变化。这些疾病有标准的治疗方法，可以与在此公开的组合物和共轭物联合使用。可选的是，在此公开的组合物和共轭物可单独使用。现有的标准治疗方法包括下列的方法：
表IV
| 神经病变 | 临床特点 | 治疗方法 |
| 慢性免疫脱髓鞘性多发性神经病(CIDP) | 在1-80岁之间发作，特征是虚弱无力、感觉缺失和神经过度增生。 | 用强的松、环孢素A或氨甲喋呤、HIG、血浆置换进行T-细胞免疫抑制 |
| 多灶性CIDP | 在28至58岁之间发作，特征是非对称性虚弱无力、感觉缺失，病程是缓慢进行性或复发-缓解型的。 | 用强的松、人免疫球蛋白(HIG)进行T细胞免疫抑制 |
| 多灶性运动神经病(MMN) | 发作的年龄范围从25至70岁，男性为女性的两倍。特点包括虚弱无力、肌肉萎缩、肌束颤动和抽筋，在1-30年期间是进行性的。 | HIG用血浆置换、环磷酰胺、B细胞单克隆抗体进行B细胞免疫抑制 |
| 伴有IgM与髓磷脂相关糖蛋白(MAG)结合的神经病 | 通常在50岁以上发作，特征是感觉缺失(100％)、虚弱无力、体重增加紊乱、震颤，都是缓慢进行性的。 | B细胞免疫抑制血浆置换环磷酰胺B细胞单克隆抗体α-干扰素克拉屈滨或氟达拉滨强的松 |
| GALOP综合征(步态异常、自身抗体、较大的 | 伴有多发性神经病的步态异常 | HIG血浆置换 |
| 年龄、发作型多发性神经病Gait disorder，Autoantibody，Late-age，Onset，Polyneuropathy) | 环磷酰胺 | |
| POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、M-蛋白和皮肤改变Polyneuropathy，Organomegaly，Endocrinopathy，M-Protein and Skinchanges) | 在27至80岁之间发作，伴有虚弱无力、感觉缺失、腱反射减弱或缺失，皮肤疾病和其它表现。 | 骨硬化病变使用放射线治疗。广泛病变使用化疗(苯丙氨酸氮芥和强的松) |
药物和放射线诱发的脱髓鞘
某些药物和放射线可诱发受试者发生脱髓鞘作用。引起脱髓鞘的药物包括但不限于氯喹、FK506、哌克西林、普鲁卡因胺和齐美定。
放射线也可诱发脱髓鞘。由放射线引起的中枢神经系统(CNS)毒性被认为是由下列原因引起的：(1)对血管结构的损害，(2)去除了少突胶质细胞-2星形胶质细胞的祖细胞和成熟的少突胶质细胞，(3)去除了海马、小脑和皮质中的神经干细胞群，广泛地改变细胞因子的表达。大多数放射线损害是由在治疗某些癌症中进行的放疗所引起的。见Belka等人的综述，2001 Br.J.Cancer 85：1233-9。但对于航天员，接触放射线可能也是病因之一(Hopewell，1994 Adv.Space Res.14：433-42)，在接触放射性物质的情况下也是如此。
对于已经接受了药物或偶尔接触或有意接触放射线的患者，通过给予在此公开的共轭物或组合物之一可能对于防止脱髓鞘或促进髓鞘再生是有益处的。
涉及脱髓鞘的疾病
其它引起脱髓鞘的遗传性综合征/疾病包括科凯恩综合征(Cockayne′s syndrome)、先天性髓鞘发育不良、法勃氏病(Farber′sdisease)、异染性脑白质不良、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、雷夫叙姆病(Refsum disease)、朊病毒相关疾病和Salla病。
科凯恩综合征(Cockayne′s syndrome，CS)是一种很少见的遗传性疾病，此病患者对阳光很敏感，身材矮小，外表过早衰老。在典型形式的科凯恩综合征(Cockayne′s syndrome)(I型)中，症状是进行性的，通常在1岁后出现明显的症状。科凯恩综合征(Cockayne′ssyndrome)的早期发作型或先天型(II型)在出生时就很明显。有意思的是，不象其它DNA修复疾病，科凯恩综合征与癌症没有关系。CS是一种多系统的疾病，该病引起躯体和脑完全的生长障碍，以及进行性的恶病质，视网膜、耳蜗和神经变性，伴有脑白质营养不良和脱髓鞘性神经病，但不增加癌症发生率。在与UV接触后(例如，阳光)，科凯恩综合征患者不再发生转录耦合修复。现在已经鉴定出来在科凯恩综合征中有两种基因缺陷，CSA和CSB。CSA基因在第5号染色体上发现。两种基因都编码与转录结构组件和DNA修复蛋白相互作用的蛋白。
目前，还没有发现该病患者的有效治疗方法或治愈病例。因此，本发明的一个方面是用在此公开的共轭物和组合物治疗该病。
先天性髓鞘发育不良有几种名称包括先天性髓鞘形成障碍性神经病、先天性髓鞘发育不良性多发性神经病、先天性髓鞘发育不良(洋葱球样)多发性神经病、先天性髓鞘发育不良神经病、由髓鞘发育不良引起的神经病、髓鞘发育不良神经病和CHN。在人类最常见的遗传性疾病中，遗传性外周神经病是一组复杂的，临床上和遗传学上不同类的疾病，可产生外周神经的进行性恶化。先天性髓鞘发育不良是该组疾病中之一。该组疾病包括易发生压迫性麻痹的遗传性神经病、夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Tooth disease)、进行性肥大性间质性神经病(代-索二氏综合征，Dejerine-Sottas syndrome)和先天性髓鞘发育不良性神经病。对于这些疾病还没有已知的治愈病例或有效的治疗方法。
法勃氏病(Farber′s disease)有几种名称包括：Farber脂肪肉芽肿病、神经酰胺酶缺陷、酸性神经酰胺酶缺陷、AC缺陷、N-月桂基神经鞘氨醇(Laurylsphingosine)脱酰基酶缺陷和N-脂酰基神经鞘氨醇酰胺水解酶。如某些名称所揭示的那样，该疾病是由于酸性神经酰胺酶(也称为N-脂酰基神经鞘氨醇酰胺水解酶，ASAH)缺陷引起的。酶缺乏引起未磺化的酸性粘多糖在神经元和神经胶质细胞中积聚。患有该疾病的患者通常在2岁之前死亡。
异染性脑白质营养不良(MLD)是由酰基硫酸脂酶A缺陷引起的遗传性疾病。它是影响髓鞘生长的称为脑白质营养不良的一组遗传性疾病中的一种。MLD有三种形式：晚期婴儿型、青少年型、和成人型。在最常见的晚期婴儿型中，在6个月之2年之间症状开始发作。婴儿通常在出生时是正常的，但最终丧失以前获得的能力。症状包括张力减退(肌张力低)、说话异常、心智能力丧失、失明、强直(即，不受控制的肌紧张)、惊厥、吞咽损害、瘫痪和痴呆。青少年型的症状从4至14岁之间开始出现，包括学校表现不佳、精神颓废、共济失调、癫痫发作和痴呆。在成人型中，症状在16岁以后开始发生，症状克包括注意力不集中、抑郁、精神病学障碍、共济失调、震颤和痴呆。癫痫发作可出现在成人型中，但不如其它型多见。在所有三种形式中，精神颓废通常是首先出现的体征。
佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)(也称为围产期嗜苏丹性脑白质营养不良)是一种引起蛋白脂质蛋白异常的X连锁遗传疾病。该异常通常在1岁前引起婴儿死亡。对该疾病尚没有已知的治疗方法或治愈病例。
雷夫叙姆病(Refsum disease)(也称为植烷酸氧化酶缺陷，多神经炎型遗传性运动失调或IV型遗传性运动与感觉神经病，HMSN IV)是由于基因突变引起的，该基因编码植烷酸辅酶A羟化酶(PAHX或PHYH)。主要的临床表现是色素性视网膜炎、慢性多发性神经病和小脑体征。植烷酸，一种罕见的支链脂肪酸(3，7，11，15-四甲基-十六烷酸)积累在该种疾病患者的组织液和体液中，由于缺乏PAHX不能被代谢。每月进行一次或两次血浆置换能有效地从体内将该酸去除，并允许放宽对限制植烷酸摄取的饮食限制。
朊病毒相关疾病包括Gerstmann-Straussler病(GSD)、克洛伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、家族性致命性失明，朊病毒蛋白异常亚型在这些疾病以及库鲁病和绵羊瘙痒病(在绵羊中发现的疾病)可作为传染原。术语朊病毒来自“蛋白传染因子”(Prusiner，Science 216：136-44，1982)。朊病毒相关蛋白(PRP)蛋白水解裂解生成淀粉样肽(amyloidogenic peptide)，该肽聚合成为不能溶解的纤维。
Salla病和其它类型的唾液酸尿症(sialurias)是涉及唾液酸贮存问题的疾病。它们是常染色体隐性遗传的神经变性疾病，可以严重的婴儿型(即，ISSD)或缓慢进行性的成人型(在芬兰较常见)存在(即，Salla病)。主要的症状是张力减退、小脑性共济失调和智力迟钝。这些病患和疾病也要考虑姑息性或改善性治疗方法。
引起脱髓鞘的其它病患包括传染后脑炎(也称为急性播散性脑脊髓炎，ADEM)、脑膜炎和对脊髓的损伤。在此公开的组合物和共轭物也考虑用于治疗这些其它脱髓鞘疾患。下面提供了合成和生物学实施例来说明本发明，但这些实施例并不能被解释为限制本发明的范围。除非另外说明，所有温度均是摄氏度。
实施例
在下述实施例中，下述缩写具有下述含义。如果缩写没有规定，则它具有普遍接受的含义。
ACN ＝ 乙腈
bs ＝ 宽峰
d ＝ 双重峰
dd ＝ 双组双重峰
Et3N ＝ 三乙胺
g ＝ 克
h和hr ＝ 小时
HPLC ＝ 高效(或高压)液相色谱
kg ＝ 千克
kDa ＝ 千道尔顿
L ＝ 升
m ＝ 多重峰
M ＝ 摩尔
mg ＝ 毫克
min ＝ 分钟
mL ＝ 毫升
mm ＝ 毫米
mM ＝ 毫摩尔
mmol ＝ 毫摩尔
s ＝ 单峰
sat. ＝ 饱和的
t ＝ 三重峰
TFA ＝ 三氟乙酸
TLC或tic ＝ 薄层色谱
Ts ＝ 甲苯磺酰基
μL ＝ 微升
μg ＝ 微克
μm ＝ 微米
一般方法：使用Gemini 2000或Bruker Avance 300光谱仪获得质子(1H)和碳(13C)核磁共振谱(NMR)。通过在3.6ppm处宽峰检测到聚乙二醇(PEG)的存在。该信号的积累(integration)可以根据PEG部分的大小而变化。共轭的VLA-4拮抗剂的存在也可以在共轭物的1H NMR谱上检测到。在硅石60F254(EMD 15341-1)预包被的板或预包被的MKC18F硅石
(Whatman 4803-110)上进行薄层色谱。在Agilent质谱仪(LC/MSD VL)上以阳离子单四级模式(single quadmode)进行质谱测定。
PEG产物和PEG共轭物的HPLC方法：
使用带有Varian UV检测器的Varian Prep Star(SD-1型)组件设定在210nm进行制备性反相HPLC。方法A：在Vydac C18，
孔径柱(250mm×21.2mm)上使用反相HPLC纯化PEG产物和PEG共轭物样品，一般使用35-50％CAN+0.1％TFA的梯度，在100min内以20mL/min的速度进行。方法B：在Vydac C18，
孔径柱(250mm×50mm)上使用反相HPLC纯化PEG产物和PEG共轭物样品，一般使用35-50％CAN+0.1％TFA的梯度，在100min内以60mL/min的速度进行。
方法C：经反相分析性HPLC确认PEG产物和共轭物的纯度，使用装有Waters Symmtry
孔径，3.5μC18柱(150mm×4.6mm)的Agilent Series 1100四元系统，使用40-50％ACN w/0.1％TFA的梯度，以1.5mL/min的流速进行，该系统与设定在210nm的Agilent1100可变波长检测器和Sedex 75蒸发光散射检测器(40℃，增益＝5)连接。
PEG试剂：通过NOF Corporation(Yebisu Garden Place Tower，20-3Ebisu 4-chome，Shibuya-ku，Tokyo 150-6019)或Nektar Therapeutics(150Industrial Road，San Carlos，CA 94070)获得如下的PEG起始材料：30kDa PEG二胺(NOF Cat.Sunbright DE-300PA)；5kDa Boc-NH-PEG-NHS酯(Nektar Cat.4M530H02)；20kDa四胺(NOF Cat.SunbrightPTE-200PA)；
40kDa 4-臂PEG醇(NOF Cat.Sunbright PTE-40000)；40kDa 3-臂PEG醇(NOF Cat.Sunbright GL-400)。
实施例1
氢氧化钠(10g，0.25m)溶解在水中(300ml)。向此溶液中加入4-硝基苯丙氨酸(50.3g，0.22m)，搅拌至完全溶解。向得到的溶液中加入碳酸钠(28.8g，0.26m)，在冰浴中将搅拌的悬液冷却至+8℃。逐滴加入氯甲酸苄酯(44.7g，0.26m)，剧烈搅拌，将内部温度保持在+6℃至+9℃的范围内。混合物在+6℃另外搅拌1hr，并转移至分液漏斗，用醚冲洗(2×150ml)。将水相置于大锥形瓶(2L)中，小心地用HCl稀水溶液酸化至pH＝2，用乙酸乙酯萃取(4×500ml)。合并的萃取物用水冲洗，用MgSO4干燥。过滤溶液，蒸发过滤液，残渣溶解在乙酸乙酯(150ml)中，并用己烷稀释(500ml)。滤出晶体物质，用冷溶剂漂洗，空气干燥，得到Cbz-4-硝基苯丙氨酸，75g(99.5％产率)。1H-NMR，DMSO-d6，(δ)：12.85(bs，1H)，8.12(d，2H，J＝9Hz)，7.52(d，2H，J＝9Hz)，7.30(m，5H)，4.95(s，2H)，4.28(m，1H)，3.32(bs，1H)，3.10(m，2H)。13C-NMR(δ)：173.1，156.3，146.6，137.3，130.8，128.5，128.0，127.8，123.5，65.6，55.1，36.6。MS(m/z)：367.1[M+23]。
Cbz-4-硝基苯丙氨酸(75g，0.22m)溶解在二噁烷(300ml)中。得到的搅拌溶液在干冰浴中冷却至-20℃(内部)。加入液化的异丁烯(大约290ml)，然后分别间隔30min加入三等分的浓硫酸(35ml)。酸的加入是一个很强烈的放热过程，伴随着主要的聚合作用。在此阶段，有效的机械搅拌是很重要的。将得到的混合物搅拌20hr，然后加热至室温，小心地倒入进饱和的碳酸钠水溶液(2L)中，并用乙酸乙酯(600ml)稀释。分离有机层，用乙酸乙酯萃取水层(2×200ml)。合并的萃取物用水冲洗，用硫酸钠干燥。过滤溶液，蒸发至干燥。残渣投入乙酸乙酯/己烷混合物(500ml；1∶1)中，用硅胶填料(ca.2×2in)过滤。另外，用一定量的相同溶剂(总计2L)漂洗硅石，蒸发过滤液，得到粘稠油状的完全保护的4-硝基苯丙氨酸73g(两步后为83％)。1H-NMR，CDCl3，(δ)：8.12(d，2H，J＝8.4Hz)，7.36(m，7H)，5.35(m，1H)，5.10(m，2H)，4.57(m，1H)，3.31(m，2H)，1.43(s，9H)。13C-NMR，CDCl3，(δ)：169.7，155.3，146.9，143.9，136.0，130.2，128.4，128.2，128.0，123.3，82.9，66.9，54.7，38.2，31.4，27.8，13.9。MS(m/z)：423.1[M+23]。
保护的4-硝基苯丙氨酸(73g，0.18m)溶解在乙醇(500ml)中，加入氧化铂催化剂(1.5g)。得到的溶液在氢气(50-60psi)中在室温下剧烈搅拌，直至氢吸附停止(3hr)。将催化剂滤出，滤液蒸发至干燥，残渣投入乙酸乙酯(200ml)中，通过硅胶填料(2×2in)过滤，使用乙酸乙酯-己烷混合物(3∶2，2L)漂洗硅石。滤液浓缩至大约200ml，加入己烷(500ml)。过滤出结晶产物，用冷溶剂漂洗，风干。产率-56g，84％。1H-NMR，CDCl3，(δ)：7.30(bs，5H)，6.92(d，2H，J＝8.1Hz)，6.58(d，2H，J＝8.1Hz)，5.21(m，1H)，5.10(d，2H，J＝2.1Hz)，4.46(m，1H)，3.59(bs，2H)，2.97(s，2H，J＝5.4Hz)，1.42(s，9H)。13C-NMR，CDCl3，(δ)：170.6，145.1，136.3，130.2，128.3，127.9，125.6，115.0，81.9，66.6，55.2，37.4，27.8MS(m/z)：393.1[M+23]。
实施例2
将实施例1的产物，4-氨基苯丙氨酸(20g，0.054m)，溶解在乙醇(200ml)中，用Hunig’s碱(21g，0.162m，3当量)和2-氯-3-硝基吡啶(10.3g，0.65m，1.2当量)处理。得到的溶液在氮气中搅拌，加热回流24hr。LC分析表明，有少量未反应的胺存在。另外加入少量氯硝基吡啶(1.1g，0.13当量)，并继续回流24hr。冷却反应混合物，蒸发至干燥。残渣溶解在乙酸乙酯(600ml)中，获得的溶液用水(1×200ml)、柠檬酸稀水溶液(0.2N，2×200ml)、盐水(1×200ml)冲洗，用硫酸钠干燥。滤出固体，蒸发滤液，得到37g深红色油状、含有被过量的氯硝基吡啶污染的预期产物的物质。不纯的产物通过快速色谱(Biotage 75L系统)纯化，用乙酸乙酯∶己烷(3∶17)混合物洗脱。合并含有纯产物的馏分，蒸发得到深红色粘稠油状的产物26g(99％)。1H-NMR，CDCl3，(δ)：10.10(s，1H)，8.49(m，2H)，7.57(d，2H，J＝9Hz)，7.35(bs，5H)，7.19(d，2H，J＝9Hz)，6.84(m，1H)，5.30(m，1H)，5.13(d，2H，J＝3Hz)，4.57(m，1H)，3.11(m，2H)，1.45(s，9H)。13C-NMR，CDCl3，(δ)：170.4，155.5，155.1，150.0，136.7，136.3，135.4，132.4，129.9，128.5，128.3，128.0，127.9，122.2，113.7，82.2，66.7，55.1，37.7，27.8，20.9。MS(m/z)：493.1[M+1]，515.1[M+23]。
红色的硝基化合物(26g，0.054m)溶解在THF(350ml)中，加入氧化铂催化剂(1.35g)。得到的混合物在氢气(50-60psi)下剧烈搅拌，直至氢吸附停止(2hr)。滤出催化剂，滤液蒸发至干燥。残渣溶解在乙酸乙酯(100ml)中，用己烷(50ml)稀释，直至开始结晶。混合物进一步用乙酸乙酯/己烷(1∶1)混合物(300ml)稀释，在冰箱中静置3hr。滤出结晶固体，用冷溶剂漂洗，风干，得到产物，23g，94％。1H-NMR，CDCl3，(δ)：7.81(dd，1H，J1＝1.5Hz，J2＝4.8Hz)，7.33(bs，5H)，7.17(d，2H，J＝8.4Hz)，7.03(d，2H，J＝8.4Hz)，6.96(dd，1H，J1＝1.5Hz，J2＝7.5Hz)，6.75(dd，1H，J1＝5.0Hz，J2＝7.7Hz)，6.22(s，1H)，5.31(m，1H)，5.09(bs，2H)，4.50(m，1H)，3.41(bs，2H)，3.02(m，2H)，1.43(s，9H)。13C-NMR，CDCl3，(δ)：170.6，155.6，145.5，140.21，138.8，136.3，130.8，129.9，128.5，128.3，127.9，123.4，118.2，117.0，82.0，66.6，55.2，37.4，27.9。MS(m/z)：407.1[M-56]，463.1[M+1]，485.1[M+23]。
氨基吡啶(19g，0.041m)悬浮在二氯甲烷(200ml)中，并且加入CDI(12g，0.074m，1.8当量)。得到的混合物在室温下搅拌20hr。反应混合物用饱和碳酸氢盐水溶液(2×100ml)、盐水(1×100ml)冲洗，用硫酸钠干燥。滤出固体，滤液蒸发至干燥。残渣溶解在乙酸乙酯(热，300ml)中结晶。滤出结晶产物，用冷乙酸乙酯漂洗，风干，得到19.9g 81％的咪唑酮。1H-NMR，CDCl3，(δ)：10.63(s，1H)，8.06(d，1H，J＝3Hz)，7.66(d，2H，J＝9Hz)，7.32(m，8H)，7.05(m，1H)，5.36(m，1H)，5.13(s，2H)，4.59(m，1H)，3.17(m，2H)，1.45(s，9H)。13C-NMR，CDCl3，(δ)：170.4，155.6，154.3，143.8，141.0，136.2，135.8，131.8，130.2，128.3，128.0，125.9，122.2，118.3，116.0，82.4，66.8，55.0，37.7，27.8。MS(m/z)：433.1[M-56]，489.2[M+1]，511.2[M+23]。
实施例3
向实施例2的产物(4.0g，8.19mmol)/DMF(40ml)溶液中加入碳酸钾粉(1.58g，11.47mmol)，然后加入溴乙酸甲酯(1.0ml，11.47mmol)。反应混合物在氮气氛中在室温搅拌过夜。反应混合物真空浓缩，残渣投入至乙酸乙酯(100ml)中。用H2O、盐水冲洗有机相，在Na2SO4上干燥，过滤，真空浓缩。粗原料通过柱色谱(100％乙酸乙酯)纯化，得到4.5g(100％)白色泡沫状的题述化合物。Rf＝0.42(5％MeOH/CH2Cl2)。MS m/z＝561，(M+H)+。1H NMR(CDCl3)δ8.10-8.08(d，1H)，δ7.67-7.65(d，2H)，δ7.37-7.30(m，7H)，δ7.20-7.17(m，1H)，δ7.10-7.05(m，1H)，δ5.30-5.27(d，1H)，δ5.11(s，2H)，δ4.58-4.55(q，1H)，δ3.81(s，3H)，δ3.16-3.14(d，2H)1δ1.42(s，9H)。
实施例4
将实施例3的产物(2.25g，4.01mmol)/MeOH(20ml)溶液与Degussa Pd/C催化剂(113mg)置于H2(55psi)中过夜。反应混合物通过Celite过滤，真空浓缩，得到1.65g(97％)褐色油状的题述化合物。Rf＝0.32(5％MeOH/CH2Cl2)。MS m/z＝449，(M+Na)+。1H NMR(CDCl3)δ8.11-8.09(d，1H)，δ7.68-7.65(d，2H)，δ7.41-7.38(d，2H)，δ7.20-7.17(m，1H)，δ7.10-7.06(m，1H)，δ4.73(s，2H)，δ3.81(s，3H)，δ3.67-3.62(m，1H)，δ3.16-3.09(m，1H)，δ2.91-2.84(m，1H)，δ1.46(s，9H)。
实施例5
将吡啶-3-磺酸(125g，0.78m)置于1L装有机械搅拌器、回流冷凝器、热电偶和氮气进气口的3颈烧瓶中。接下来，加入五氯化磷(250g，1.19m，1.5当量)，然后立即加入三氯氧磷(330ml，3.8m，4.5当量)。首先，将烧瓶的内容物在室温下搅拌30min，然后缓慢地进行温和回流(内部温度大约为110℃)1小时，在此温度保持大约3.5hr，随后用12hr将其冷却至室温。在此期间，观察到有气体放出。在减压条件(12mmHg/40℃)下脱除挥发物，黄色的半固体残渣用DCM(1L)稀释。浆料缓慢地倒入搅拌的冰冷却的饱和碳酸氢盐水溶液中，保持pH＝7。观察到有气体放出。分离有机层，水层用DCM反相萃取。合并的萃取物用冷的饱和碳酸氢盐水溶液、盐水冲洗，用硫酸镁干燥。滤出固体，蒸发滤液，得到淡黄色油状液体，吡啶-3-磺酰氯，123g(93％纯度；理论值的88％)。1H-NMR，CDCl3，(δ)：9.26(d，1H)8.98(dd，1H)，8.34(m，1H)，7.62(m，1H)。13C-NMR，CDCl3，(δ)：155.3，147.4，140.9，134.6，124.2。
MS(m/z)：178.0[M+1]。
L-青霉胺(150g，1.0m)溶解在DI水(1500ml)中搅拌，在冰浴中冷却至+8℃，用福尔马林(150ml，37％水溶液)处理。反应混合物在+8℃搅拌2hr，然后去掉冷却浴，继续搅拌12hr。在减压条件(14mmHg/50°)下将清亮的溶液浓缩，得到白色残渣。使固体重新悬浮，然后溶解在热的MeOH(2500ml)中，并在室温下静置12hr。滤出白色的蓬松沉淀物，用冷甲醇漂洗。浓缩滤液，再次进行结晶。收集的沉淀物与首次收获的产物合并，在真空干燥箱中，在55℃和45mmHg下干燥24hr。(R)-5，5-二甲基噻唑烷-4-羧酸的产量为138g(纯度＞99％；理论值的86％)。1H-NMR，DMSO-d6，(δ)：4.25(d，1H)，4.05(d，1H)，3.33(s，1H)，1.57(s，3H)，1.19(s，3H)。13C-NMR，DMSO-d6，(δ)：170.8，74.4，57.6，51.8，28.9，27.9。MS(m/z)：162.3[M+1]。
在装有机械搅拌器和热电偶的4L反应器中，用磷酸二氢钾(43g，0.31m)和磷酸氢二钾(188.7g，1.08m)在DI水(2L)中制备缓冲溶液。加入(R)-5，5-二甲基噻唑烷-4-羧酸(107g，0.675m)，搅拌至完全溶解。在冰浴中将溶液冷却至+8℃。将单独制备的吡啶-3-磺酰氯(124g，0.695m)/DCM(125ml)溶液逐滴加入至反应器中，剧烈搅拌1hr。监测反应混合物的pH，4hr后发现pH＝5，加入固体碳酸氢盐调整至pH＝6。将混合物加热至室温，持续18hr。用硫酸稀水溶液将pH调整至2，搅拌1hr，将沉淀的黄色固体滤出，用水漂洗至中性。固体滤饼转移至2L Erlenmayer烧瓶中，悬浮在DCM(500ml)中，偶尔振荡5min，再次过滤。滤饼用DCM冲洗并风干。题述化合物(R)-5，5-二甲基-3-(吡啶-3-基磺酰基)噻唑烷-4-羧酸的产量为148.9g(98％纯度；理论值的73％)。1H-NMR，DMSO-d6，(δ)：9.05(d，1H)，8.89(m，1H)，8.32(m，1H)，7.69(m，1H)，4.68(q，2H)，4.14(s，1H)，1.35(s，3H)，1.29(s，3H)。13C-NMR，DMSO-d6，(δ)：170.0，154.3，147.9，135.8，134.1，124.8，72.6，54.3，50.2，29.4，25.0。MS(m/z)：303.2[M+1]。
实施例6
向实施例4的产物(1.65g，3.88mmol)/乙腈(35ml)溶液中加入实施例5的产物(1.06g，3.53mmol)、HATU(1.75g，3.88mmol)和三乙胺(5.3ml)。均匀的褐色溶液在氮气中搅拌72小时。有机反应混合物在真空中浓缩，投入至乙酸乙酯(40ml)中，用1N HCl、饱和的NaHCO3水溶液和盐水冲洗。有机层在Na2SO4上干燥，过滤，真空浓缩得到横黄色泡沫的2.67g(97％)3。Rf＝0.36(5％MeOH/CH2Cl2)。MS m/z＝711，(M+H)+。1H NMR(CDCl3)δ9.09-9.08(d，1H)，δ8.86-8.84(m，1H)，δ8.18-8.15(m，1H)，δ8.07-8.05(m，1H)，δ7.66-7.63(d，2H)，δ7.52-7.48(m，1H)，δ7.41-7.38(d，2H)，δ7.19-7.16(m，1H)，δ7.08-7.04(m，1H)，δ6.93-6.90(d，1H)，δ4.83-4.76(q，1H)，δ4.71(s，2H)，δ4.62-4.59(d，1H)，δ4.49-4.46(d，1H)，δ3.91(s，1H)，δ3.80(s，3H)，δ3.22-3.08(m，2H)，δ1.46(s，9H)，δ1.20-1.17(d，6H)。
实施例7
向实施例6的产物(2.67g的3.75mmol)/THF(12ml)溶液中加入LiOH H2O(245mg，5.97mmol)/H2O(3ml)溶液。将反应混合物在氮气中在室温搅拌过夜。反应结束后，反应混合物真空浓缩，在H2O(100ml)中溶解，用1M HCl溶液酸化至pH 4。所需的产物沉淀为白色的固体，将其过滤，用H2O漂洗得到1.87g(72％)的题述化合物。MS m/z＝697，(M+H)+。1H NMR(CD3OD)δ9.02(s，1H)，δ9.80(s，1H)，δ8.47-8.44(d，1H)，δ8.21-8.19(d，1H)，δ7.98-7.96(d，1H)，δ7.63-7.59(m，3H)，δ7.52-7.48(m，3H)，δ7.17-7.13(m，1H)，δ4.75(s，2H)，δ4.72-4.61(m，3H)，δ4.14(s，1H)，δ3.22-3.16(m，2H)，δ1.45(s，9H)，δ1.25-1.19(d，6H)。13C NMR(CD3OD)δ169.9，169.5，168.9，153.1，152.8，147.5，142.8，140.2，136.6，135.8，134.0，131.7，129.9，126.0，124.2，123.9，117.8，114.9，81.8，72.6，54.1，49.9，41.3，36.4，28.5，26.6，23.4。
实施例8
实施例2的产物(52g，0.106m)在MeOH(450ml)中混合，加入氢化催化剂(8.7g，5％Pd/C，Degussa)，混合物在氢气(60psi)中搅拌，直至不再进一步吸附(大约2hr)。加入THF(150ml)，溶解沉淀的固体，溶液通过Celite填料过滤，使用DCM清洗滤器。滤液蒸发至干燥，再次溶解在DCM(300ml)中，并再次汽提(stripped)。该操作重复2次。泡沫状的固体在高度真空中保持3hr。题述化合物的产量为38.3g(理论值的101％)。1H-NMR，CDCl3，(δ)：8.08(m，1H)，7.56(AB q，4H)，7.37(m，1H)，7.06(m，1H)，3.68(m，1H)，2.03(m，2H)，1.49(s，9H)。13C-NMR，CDCl3，(δ)：173.8，154.6，143.9，141.0，137.4，131.5，130.2，126.1，122.3，118.0，116.1，81.4，56.0，40.6，27.9。MS(m/z)：299.3[M-56]，355.4[M+1]，377.4[M+23]。
实施例9
实施例8的产物(38.3g，假设0.106m)溶解在DCM(500ml)中，并依次用下列的化合物处理：N-甲基吗啉(27g，30ml，0.266m；2.5当量)、HOBt(17.3g，0.128m；1.2当量)和实施例5的产物(33.8g，0.112m；1.06当量)。得到的不均匀溶液在冰浴中冷却至+4℃，一次性加入EDC(22.5g，0.117m；1.1当量)进行处理。搅拌反应混合物，使其在其后的4hr内升温至室温，然后继续保持18hr。将溶剂汽提，残渣溶解在乙酸乙酯(1.2L)中，用饱和的碳酸氢盐水溶液(2×250ml)、水(250ml)、盐水(300ml)冲洗，用硫酸镁干燥。溶液过滤，蒸发至干燥，得到淡橙黄色的粘稠油状产物，76g(＞＞100％)。粗产物通过快速色谱在硅胶(Biotage 75L，在乙酸乙酯/甲醇(3％)混合物中)上进行纯化。含有纯产物的馏分合并，蒸发得到54g题述化合物(产率83％)。1H-NMR，CDCl3，(δ)：10.37(s，1H)，9.11(s，1H)，8.87(m，1H)，8.19(m，1H)，8.05(m，1H)，7.56(AB q，4H)，7.52(m，1H)，7.36(m，1H)，7.06(m，2H)，4.83(m，1H)，4.58(AB a，2H)，3.96(s，1H)，3.19(m，2H)，1.49(s，9H)，1.22(s，3H)，1.18(s，3H)。13C-NMR，CDCl3，(δ)：169.7，167.6，153.9，148.4，143.8，140.9，135.8，135.6，132.9，131.9，130.2，125.9，123.8，122.1，118.0，115.9，82.8，73.6，60.3，54.8，53.7，50.6，37.8，29.1，27.8，23.9，14.1。MS(m/z)：583.3[M-5β]，639.4[M+1]，661.3[M+23]。
实施例10
向冰冷却的三氟丁酸乙酯(15g，89mmol)和甲酸乙酯(36mL，444mmol)的THF(200mL)溶液中，在N2气氛中在25分钟内加入1MKOtBu/THF(107mmol，107mL)。15分钟后，去除冰浴，反应混合物在室温下搅拌1小时。然后另外加入甲酸乙酯(18mL，222mmol)，反应混合物搅拌过夜。浓缩反应混合物，残渣在冷乙醚(100mL)和冷水(300mL)之间萃取。水相的pH用浓HCl调整至2。产物用二氯甲烷(1×100mL，45×75mL)萃取，合并的有机萃取物用盐水(1×100mL)冲洗，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩得到稠厚的油状题述化合物，静置固化，10.2g(58.5％)。MS(m/z)＝198(M+H)+。
实施例11
向实施例10的产物(10g，51mmol)和二乙胍硫酸盐(8.3g，25.2mmol)的EtOH(60mL)溶液中，在N2气氛中在10分钟内加入NaOEt的21％EtOH(20.7mL，55.5mmol)溶液。然后反应混合物加热回流5小时。均匀的溶液冷却，倒入冷水(100mL)中，得到均匀的溶液。溶液的pH用浓HCl和1N的HCl调整至大约3.5。从溶液中沉淀的固体通过过滤收集。淡褐色固体用水冲洗，风干，得到2.9g(23％)题述化合物。MS(m/z)＝250(M+H)+。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ7.65(br s，1H)，3.55(q，4H)，3.30(q，2H)，1.25(t，6H)。
实施例12
实施例11的产物(2.0g，8.02mmol)、DIEA(1.5mL，8.83mmol)、DMAP(.98g，0.8mmol)和二氯甲烷(30mL)投入烧瓶中。混合物冷却至0℃，加入三氟乙酸酐(1.5mL，8.83mmol)。反应至均相(homogeneous)，在0℃搅拌3小时。混合物用饱和的NaHCO3淬灭，用二氯甲烷萃取。有机相用0.2N柠檬酸冲洗，在Na2SO4上干燥，过滤，真空浓缩得到2.87g(94％)褐色固体的题述化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.28(s，1H)，3.65-3.52(m，4H)，3.29-3.19(q，2H)，1.22-1.17(t，6H)。
实施例13
实施例12的产物(1.3g，3.5mmol)、H-Phe(p-NO2)OtBu(1.1g，4.2mmol)和DIEA(0.9mL，5.3mmol)的CH3CN(14mL)溶液在N2中加热回流过夜。第二天，另外加入H-Phe(p-NO2)OtBu(0.8g，3mmol)，继续回流3天。然后，将反应混合物冷却和浓缩。残渣投入至EtOAc(50mL)中，有机部分用0.5N KHSO4(3×50mL)、水(1×50mL)、盐水(1×10mL)冲洗，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩为褐色的胶。粗原料通过快速色谱(5∶1己烷/EtOAc)纯化，得到640mg(38％)金色胶状的题述化合物。TLC：3∶1己烷/EtOAc，Rf＝0.30，MS(m/z)＝498(M+H)+，1H NMR，(300MHz，CDCl3)δ8.19(d，2H)，7.80(s，1H)，7.25(d，2H)，5.19(br d，1H)，4.95(q，1H)，3.70-3.50(m，4H)，3.45-3.25(m，2H)，3.10(q，2H)，1.40(S19H)，1.05(t，6H)。
实施例14
实施例13的产物(635mg，1.27mmol)溶解在纯EtOH(5mL)中，向其中加入35mg Pd/C，10wt％。反应氢化(45psi H2)2.5小时，期间加入50mg Pd/C，10wt％，反应混合物再次氢化(45psi H2)过夜。反应混合物通过Celite填料过滤，浓缩滤液得到452mg(76％)题述化合物。MS(m/z)＝468(M+H)+，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.75(s，1H)，6.90(d，2H)，6.60(d，2H)，5.05(br d，1H)，4.80(q，1H)，3.70-3.45(m，6H)，3.10-2.90(m，4H)，1.40(s，9H)，1.15(t，6H)。
实施例15
实施例14的产物(598mg，1.28mmol)、2-氯-3-硝基吡啶(243mg，1.53mmol)和DIEA(0.67mL，3.83mmol)的EtOH(5mL)溶液在N2中加热回流。第二天，反应冷却，另外加入2-氯-3-硝基吡啶(40mg，0.25mmol)和DIEA(0.11mL，0.60mmol)，反应加热回流1天。然后浓缩反应混合物，残渣投入至EtOAc(20mL)中。有机相用水(2×20mL)冲洗。合并的洗涤水溶液用EtOAc(2×10mL)反萃取。合并的有机萃取物用0.2N柠檬酸(3×20mL)、水(1×10mL)、饱和的NaHCO3(3×20mL)、盐水(1×10mL)冲洗，干燥(MgSO4)，过滤，汽提为橙黄色的胶。粗产物通过快速色谱纯化，用4∶1己烷/EtOAc(Rf＝0.14)洗脱得到610mg(81％)红色油状的题述化合物。MS(m/z)＝590(M+H)+，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.10(s，1H)，8.55(d，1H)，8.50(m，1H)，7.79(s，1H)，7.75(d，2H)，7.15(d，2H)，6.80(q，1H)，5.10(br d，1H)，4.90(m，1H)，3.70-3.45(m，4H)，3.25(m，2H)，3.10(q，2H)，1.40(s，9H)，1.10(t，6H)。
实施例16
向实施例15的产物(610mg，1.03mmol)/纯EtOH(5mL)溶液中加入60mg Pd/C，10wt％。混合物氢化(45psi H2)过夜。第二天，反应混合物通过Celite过滤，滤液浓缩得到500mg(87％)题述化合物。MS(m/z)＝560(M+H)+，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.85(d，2H)，7.80(s，1H)，7.20(d，2H)，7.05(d，2H)，7.00(d，1H)，7.75(m，1H)，6.20(br s 1H)，5.15(br s，1H)，4.85(m，1H)，3.75-3.45(m，4H)，3.40(br s，2H)，3.15(m，2H)，3.05(q，2H)，1.40(s，9H)，1.15(t，6H)。
实施例17
实施例16的产物(141mg，0.250mmol)和CDI(62mg，0.378mmol)的CH2Cl2(3mL)溶液搅拌过夜。第二天，另外加入CDI(30mg，0.185mmol)，反应另外搅拌1天。然后将反应混合物浓缩，投入至EtOAc(10mL)中，有机部分用0.2N柠檬酸(3×5mL)、水(1×5mL)、饱和NaHCO3(3×5mL)、盐水(1×5mL)冲洗，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到69mg(47％)泡沫状的题述化合物，该化合物不需进一步纯化就可以使用。MS(m/z)＝586(M+H)+，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.20(br s，1H)，8.05(d，1H)，7.80(s，1H)，7.65(d，2H)，7.90(m，3H)，7.05(m，1H)，5.15(br d，1H)，4.95(m，1H)，3.70-3.45(m，4H)，3.25(app d，2H)，3.10(q，2H)，1.40(s，9H)，1.15(t，6H)。
实施例18
向4，6-二氯-5-氨基嘧啶(5.0g，30.7mmol)/DMSO(30mL)溶液中加入Na2S·9H2O(7.4g，30.8mmol)。混合物在室温下搅拌过夜。然后向混合物中加入水(40mL)，溶液减压蒸发至大约6mL。向此溶液中加入浓HCl(0.5mL)和水以沉淀产物。过滤溶液，用水冲洗橙黄色固体，干燥得到4.3g(86％)题述化合物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ5.84(2H，s)，7.79(1H，s)，14.37(1H，br s)；MS(m/z)：MH+＝162。
实施例19
向溶解在浓NH4OH(4mL)中的实施例18的产物(4.3g，26mmol)中加入EtOH(40mL)。向此溶液中逐部分地(in portions)加入雷尼镍(过量)。反应在室温下搅拌过夜，然后在80℃加热2hr。混合物通过Celite过滤，浓缩滤液。粗产物通过快速色谱在硅石上使用EtOAc/己烷纯化，得到1.6g(47％)的黄色固体题述化合物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ5.90(2H，s)，8.20(2H，s)；MS(m/z)MH+＝130。
实施例20
向MeOH(20mL)和HOAc(0.5mL)中的实施例19的产物(0.51g，3.9mmol)中加入CH3CHO(0.52mL，9.2mmol)。然后一次性加入NaBH3CN(590mg，9.2mmol)。反应在室温下搅拌过夜，另外加入HOAc、CH3CHO和NaBH3CN。反应搅拌过夜，浓缩，残渣投入进EtOAc和饱和的NaHCO3中。分离的水层用EtOAc反萃取。合并的有机层干燥，浓缩成残渣。残渣溶解在MeOH中，如上所述用HOAc、CH3CHO和NaBH3CN处理。在上述步骤之后，粗产物通过快速色谱在硅石上使用EtOAc/己烷纯化，得到0.35g(57％)黄色油状的题述化合物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.35(3H，q，J＝12Hz)，3.29(2H，m)，4.21(1H，bs)，8.04(1H，s)，8.36(1H，s)；MS(m/z)：MH+＝158。
实施例21
向溶解在DMF(1mL)中的实施例20的产物(70mg，0.45mmol)中加入TEA(93μL)和异烟酰氯(0.12g，0.67mmol)。反应混合物在室温下搅拌2天，然后在EtOAc和饱和的NaHCO3之间萃取。分离的水层用EtOAc反萃取。合并的有机层干燥，浓缩得到67mg(57％)的题述化合物，该化合物不需进一步纯化就可以使用。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.26(3H)，3.65-3.69(1H)，4.21(1H)，7.17(2H)，8.43(1H)，8.54(2H)，8.86(1H)注意：1H NMR显示，所有峰都很宽大证明有旋转异构体存在的证据；MS(m/z)：MH+＝263。
实施例22
向含有实施例21的产物(0.11g，0.42mmol)和实施例8的产物(0.135g，0.38mmol)的IPA(2.5ml)中加入DIEA(0.35ml，1.9mmol)。反应混合物在密封管中在130℃搅拌2天。粗混合物浓缩，油通过快速柱色谱使用0-10％MeOH/CH2Cl2的溶剂梯度纯化，得到油状的题述化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.16(1.2H，m)，1.26-1.31(1.8H，m)，1.50-1.53(9H，d，J＝9Hz)，3.0(1H，m)，3.2(0.8H，m)，3.36(1.2H，m)，4.12-4.18(1.2H，m)，4.96-5.10(.8H，m)，5.80-5.95(1H，m)，6.93-6.96(1H，m)，7.07(1H，m)，7.31-7.45(5H，m)，7.66-7.75(3H，m)，8.06(1H，m)，8.44-8.51(2H，m)；HPLC/MS：在1.29min的单峰，MH+＝581。
实施例23
在0℃下在N2中向2，4-二氯-5-硝基嘧啶(2.0g，10.3mmol)/MeOH(7mL)中逐滴加入NaOMe/MeOH(0.5M，25mL)。添加结束后，反应混合物在0℃搅拌15min。然后加入二乙胺(5mL)，混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物浓缩，残渣在EtOAc和H2O之间萃取(partition)。干燥有机层，并浓缩成残渣，通过快速色谱在硅石上使用EtOAc/己烷纯化，得到米白色固体的题述化合物(1.1g，4.9mmol，47％产率)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.26(6H，t，J＝6.6Hz)，3.70(4H，m)，4.08(3H，s)，9.01(1H，s)；HPLC/MS：MH+＝227。
实施例24
实施例23的产物(1.1g，4.9mmol)/MeOH/EtOAc(1∶1，20mL)用Pd/C(5％degussa，0.5g)和H2(50psi)在Parr振荡器中还原过夜。过滤反应混合物，滤液减压浓缩，得到固体的题述化合物(0.85g，4.3mmol，88.5％产率)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.18(6H，t，J＝6.9Hz)，3.03(2H，br)，3.57(6H，t，J＝6.9Hz)，3.96(3H1s)，7.71(1H，s)；HPLC/MS：MH+＝197。
实施例25
向含有实施例24的产物(0.85g，4.3mmol)的CH2Cl2(15mL)和TEA(1.4mL，10mmol)中加入异烟酰氯盐酸化物(1.13g，6.3mmol)。15min后，TLC显示没有起始原料。混合物在EtOAc和饱和的NaHCO3之间进行萃取。水层用EtOAc冲洗两次。合并的有机层用饱和的NaHCO3和盐水冲洗。在MgSO4上干燥并过滤。滤液浓缩，得到褐色固体的题述化合物(1.3g，4.3mmol，100％产率)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.20(6H，t，J＝6.9Hz)，3.60(4H，q，J＝6.9Hz)，3.96(3H，s)，7.72(2H，d，J＝6.0Hz)，7.75(1H，bs)，8.80(2H，d，J＝6.0Hz)，8.89(1H，s)；HPLC/MS：MH+＝302。
实施例26
向实施例25的产物(100mg，0.33mmol)/THF(1mL)中加入KOtBu/THF(1M，0.5mL)，然后缓慢地加入EtI(40μL，0.5mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示起始原料消失。混合物在EtOAc和H2O之间进行萃取。水层用EtOAc冲洗。合并的有机层用饱和的NaHCO3和盐水冲洗。干燥浓缩，得到题述化合物(90mg，0.27mmol，83％)，该化合物不需进一步纯化就可以使用。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.10(9H，m)，3.47(5H，m)，3.92(1H，m)，7.14(2H，d，J＝6.0Hz)，7.78(1H，bs)，8.44(2H，d，J＝6.0Hz)；HPLC/MS：MH+＝330。
实施例27
向实施例26的产物(200mg，0.61mmol)/DMF(4mL)中加入EtSNa(66mg，0.79mmol)，反应混合物在100℃加热1hr。LC/MS显示仍有起始原料存在。加入另一部分NaSEt(66mg，0.79mmol)，反应继续加热2hr。LC/MS显示仅有产物。减压去除DMF，加入水(10mL)，然后加入浓HCl(0.132mL)。蒸发溶剂，得到残渣。该残渣溶解在EtOH中，并过滤。浓缩滤液，得到题述化合物(190mg，100％)，该化合物不需进一步纯化就可以使用。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.24(9H，m)，3.60(4H，m)，3.60-4.00(2H，br)，8.12(3H，d，J＝5.7Hz)，8.92(2H，d，J＝5.7Hz)；HPLC/MS：MH+＝316。
实施例28
向实施例27的产物(70mg，0.22mmol)/POCl3(3mL)中在室温下加入二乙酰胺(30μL)。反应混合物加热至100℃，持续30min。然后浓缩。残渣在EtOAc和H2O之间进行萃取。有机层用H2O冲洗两次，然后干燥，浓缩得到，题述化合物(50mg，0.15mmol，68％)，该化合物不需进一步纯化就可以用于下一反应中。HPLC/MS：MH+＝334。
实施例29
向含有实施例28的产物(50mg，0.15mmol)和实施例8的产物(60mg，0.17mmol)的IPA(0.75mL)溶液中加入DIEA(0.15mL，0.8mmol)。反应混合物在密封管中在130℃搅拌7天。将粗混合物浓缩，残渣通过制备性HPLC和硅胶快速色谱纯化，得到米白色的固体(10mg)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.10-1.30(9H，m)，1.48(4.5H，s)，1.51(4.5H，s)，2.80-3.38(3H，m)，3.53(4H，m)，4.05-4.30(1H，m)，4.83(0.5H，m)，4.96(0.5H，m)，5.15-5.50(1H，m)，6.95-7.10(2H，m)，7.25-7.50(5H，m)，7.69(0.5H，d，J＝8.4Hz)，7.76(0.5H，d，J＝8.4Hz)，8.08(1H，d，J＝5.1Hz)，8.51(2H，m)，8.83(0.5H，br)，8.95(0.5H，br)；
HPLC/MS：MH+＝652。
实施例30
化合物25(20g，0.11mol)在N2中溶解在CH2Cl2(500mL)中。反应混合物冷却至0℃。加入三乙胺(18.12mL，0.13mol)，然后逐部分加入三氟乙酸酐(18.14mL，0.13mol)。反应加热至室温过夜。反应混合物真空浓缩，残渣投入进乙酸乙酯(200mL)中。有机相用H2O、饱和的NaHCO3、盐水冲洗，在Na2SO4上干燥、过滤，真空浓缩，得到29.7g(96％)黄色固体的29。1H NMR(CDCl3)δ3.64-3.60(m，2H)，3.55-3.53(m，2H)，3.49-3.45(m，4H)，1.44(s，9H)。13C NMR(CDCl3)δ155.7(JC-F＝36Hz)，154.3，116.4(JC-F＝288HZ)，80.8，45.7，43.3，28.3。
在0℃将化合物29(29.26g，0.10mol)逐部分地加入进500mL含有4N HCL/二噁烷(200mL)溶液的烧瓶中。反应在冰浴中搅拌4小时，直至TLC(3∶1的己烷∶乙酸乙酯)显示100％转化为产物。反应混合物真空浓缩，用乙醚(500mL)处理。过滤产物，干燥，得到22.5g(99％)的化合物30(白色单盐酸盐)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.82-3.79(m，4H)，3.53(s，1H)，3.18-3.16(m，4H)。13C NMR(DMSOd6)δ154.3(JC-F＝35Hz)，115.9(JC-F＝289HZ)，66.1，42.0，41.9，41.5。
向250mL烧瓶中投入化合物30(1.0g，4.6mmol)、CH2Cl2(40mL)和饱和的NaHCO3(40mL)。反应混合物在0℃剧烈搅拌15分钟。停止搅拌，使各层分离。2.0M碳酰氯/甲苯(9mL，18mmol)加入至反应混合物中，剧烈搅拌30分钟，将温度保持在0℃。分离各层，水相用CH2Cl2(15mL)冲洗。合并的有机层用盐水冲洗，在Na2SO4上干燥，过滤，真空浓缩。残渣投入CH2Cl2中，再次真空浓缩，得到1.0g(92％)白色固体的化合物31。MS(m/z)245，(M+H)+。1H NMR(CDCl3)δ3.80-3.68(m，8H)。13C NMR(CDCl3)δ155.9(JC-F＝37HZ)，148.7(JC-F＝12HZ)，116.3(JC-F＝289Hz)，48.3，47.8，45.7，45.3，45.1，42.9，42.7。
向25mL烧瓶中投入化合物24(5.97g，0.011mol)、DMAP(1.34g，0.011mol)和CH2Cl2(22mL)。加入三乙胺(2.4mL，0.017mol)，然后加入31(4.2g，0.017mol)。反应混合物加热回流20小时。反应混合物真空浓缩，残渣投入至乙酸乙酯中。有机相用饱和的NaHCO3、H2O、盐水冲洗，在Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，得到9.3g粉红色泡沫。粗原料通过快速色谱(50％乙酸乙酯/己烷至75％乙酸乙酯/己烷的梯度)纯化，得到6.1g(76％)淡粉红色泡沫的化合物32。Rf＝0.14(1∶1己烷∶乙酸乙酯)。MS(m/z)730，(M+H)+。1H NMR(CDCl3)δ9.08-9.07(m，1H)，8.87-8.85(m，1H)，8.16-8.14(m，1H)，7.52-7.48(m，1H)，7.25-7.22(d，2H)，7.03-7.00(d，2H)，6.91-6.88(d，1H)，4.78-4.70(q，1H)，4.60-4.44(dd，2H)，3.88(s，1H)，3.75-3.60(m，8H)，3.09-3.06(m，2H)，1.42(s，9H)，1.18(s，3H)，1.16(s，3H)。
向溶解在MeOH(90mL)中的32(6.11g，8.4mmol)溶液中加入碳酸钾(5.79g，42mmol)/H2O(10mL)溶液。反应在室温下搅拌15分钟，然后真空浓缩。过滤残渣，用大量的水冲洗，得到4.65g(88％)白色固体的化合物33。Rf＝0.08(5％MeOH/CH2Cl2)。MS(m/z)634，(M+H)+。1H NMR(CDCl3)δ9.09-9.08(m，1H)，8.87-8.85(m，1H)，8.16-8.14(m，1H)，7.52-7.48(m，1H)，7.23-7.20(d，2H)，7.03-7.00(d，2H)，6.91-6.88(d，1H)，4.78-4.70(q，1H)，4.59-4.46(dd，2H)，3.89(s，1H)，3.65-3.50(m，4H)，3.09-3.06(m，2H)，2.92-2.88(m，4H)，1.43(s，9H)，1.19(s，3H)，1.17(s，3H)。13C NMR(CDCl3)δ170.1，167.9，154.5，153.9，150.7，148.8，136.0，133.4，133.2，130.6，124.1，121.9，83.0，73.9，55.0，53.7，50.7，46.0，45.7，45.0，37.9，29.3，28.0，24.0。
向250mL烧瓶中投入化合物33(2.5g，3.9mmol)、CH2Cl2(40mL)和饱和的NaHCO3(40mL)。反应混合物在0℃剧烈搅拌15分钟。停止搅拌，使各层分离。2.0M碳酰氯/甲苯(7.9mL，16mmol)溶液迅速加入至反应混合物中，剧烈搅拌60分钟，将温度保持在0℃。分离各层，用CH2Cl2(30mL)冲洗水相。合并的有机层用0.2N柠檬酸、盐水冲洗，在Na2SO4上干燥，过滤，真空浓缩得到2.8g(100％)白色泡沫。粗原料通过硅石填料纯化，用100％乙酸乙酯洗脱，得到2.2g(78％)白色泡沫的化合物40。Rf＝0.43(3∶1乙酸乙酯∶己烷)。1H NMR(CDCl3)δ9.09-9.08(m，1H)，8.87-8.85(m，1H)，8.16-8.14(d，1H)，7.52-7.48(m，1H)，7.25-7.22(d，2H)，7.03-7.01(d，2H)，6.90-6.88(d，1H)，4.78-4.70(q，1H)，4.60-4.45(dd，2H)，3.88(s，1H)，3.79-3.65(m，8H)，3.10-3.07(m，2H)，1.43(s，9H)，1.18(s，3H)，1.17(s，3H)。13C NMR(CDCl3)δ169.9，167.9，154.1，153.6，150.2，148.5，136.1，133.8，130.6，124.2，121.7，82.9，73.7，54.8，53.8，50.6，48.3，45.8，37.7，29.2，27.9，23.9。
实施例31
A.氨基甲酸酯连接的双-PEG共轭物叔丁酯的合成
方案16
根据由WO 92/16555改良的方法制备氨基甲酸酯连接的共轭物，该专利申请在此引入作为参考文献。因此，将6kDa PEG二醇(500mg，0.083mmol)溶解在最少量的CH2Cl2(0.1mL)中。向其中加入2.0M碳酰氯/甲苯(0.6mL，1.2mmol)溶液。反应混合物在室温下搅拌18小时，然后真空浓缩，得到500mg(100％)白色固体6kDa PEG二氯甲酸酯。33(211mg，0.33mmol)/CH2Cl2(3mL)(参见实施例30)溶液加入至溶解在CH2Cl2(2mL)中的6kDa PEG二氯甲酸酯(500mg，0.08mmol)中。加入三乙胺(11μL，0.08mmol)，反应混合物在室温下搅拌18小时。反应混合物真空浓缩，残渣溶解在MeOH(10mL)中。加入2％交联的聚苯乙烯磺酸树脂(410mg)，反应容器涡流旋转2小时。过滤混合物，滤液真空浓缩，得到500mg(87％)的白色固体。一部分原料(246mg)通过HPLC纯化，得到156mg白色固体的6kDaPEG双-共轭物叔丁酯。HPLC测定共轭物的纯度＞99％(保留时间＝9.655min)。1H NMR(CDCl3)δ9.07(bs，2H)，8.86-8.84(m，2H)，8.18-8.15(d，2H)，7.53-7.48(m，2H)，7.22-7.19(d，4H)，7.03-6.99(d，4H)，6.86-6.83(d，2H)，4.73-4.70(m，2H)4.58-4.44(dd，4H)，4.27-4.24(m，4H)，3.62(bs，621H)，3.40-3.37(m，6H)，3.07-3.05(m，4H)，1.41(s，18H)，1.20-1.16(d，12H)。
B.氨基甲酸酯连接的双-PEG共轭物的合成
纯化的6kDa氨基甲酸酯连接的双-PEG共轭物叔丁酯(100mg，0.01mmol)溶解在甲酸(5mL)中，在40℃加热24小时。反应物真空浓缩。残渣溶解在水中，真空浓缩，再次溶解在水中，冻干，得到100mg(100％)白色粉末的6kDa的氨基甲酸酯连接的双-PEG共轭物羧酸。HPLC测定共轭物的纯度＞99％(保留时间＝7.63min)。1H NMR(CDCl3)δ9.06(bs，2H)，8.84-8.83(m，2H)，8.17-8.14(d，2H)，7.53-7.49(m，2H)，7.24-7.21(d，4H)，7.02-6.99(d，4H)，6.94-6.92(d，2H)，4.81-4.79(m，2H)，4.57-4.48(dd，4H)，4.28-4.25(m，4H)3.64(bs，621H)，3.41-3.38(m，6H)，3.23-3.08(m，4H)，1.23-1.18(d，12H)。
实施例32
A.氨基甲酸酯连接的8-PEG共轭物叔丁酯的合成
Nektar cat.no.0J00T08 8-臂PEG：MW 40kDa
方案17
使用上述实施例31中使用的方法，并使用8PEG化的中心分子制备题述化合物。
实施例33
硝基苯酯(101)
含有化合物100(100mg，0.14mmol)和4-硝基酚(24mg，0.17mmol)的THF(0.7mL)溶液在冰浴中冷却。加入EDC(33mg，0.17mmol)在CH2Cl2(0.7mL)中的悬液，反应在0℃搅拌4小时。反应用乙酸乙酯(100mL)稀释，用0.2N柠檬酸冲洗。有机层用10％K2CO3、盐水冲洗，在Na2SO4上干燥，过滤，真空浓缩，得到90mg(96％)的化合物101，该化合物可立即使用。1H NMR(CDCl3)δ9.07(bs，1H)，8.84-8.83(d，1H)，8.28-8.25(d，2H)，8.16-8.14(d，1H)，8.09-8.07(d，1H)，7.65-7.63(d，2H)，7.51-7.47(dd，1H)，7.41-7.39(d，2H)，7.36-7.35(d，2H)，7.12-7.07(m，1H)，6.95-6.92(d，1H)，5.00(s，2H)，4.82-4.76(m，1H)，4.62-4.45(dd，2H)，3.91(s，1H)，3.18-3.12(m，2H)，1.44(s，9H)，1.18-1.16(d，6H)。
40kDa Boc-保护的PEG二胺
30kDa PEG二胺(1g，0.033mmol)和5kDa Boc-NH-PEG-NHS酯(0.67g，0.13mmol)溶解在CH2Cl2(10mL)中。加入二异丙基乙胺(0.116mL，0.67mmol)，反应在室温下搅拌8小时。反应物真空浓缩，得到粗产物。残渣根据HPLC B法纯化，得到0.46g白色固体的40kDa Boc-保护的PEG二胺。HPLC C法测定产物纯度＞96％(保留时间＝7.6分钟)。1H NMR(CDCl3)δ6.75(bs，2H)，5.15(bs，2H)3.64(s，2940H，PEG)，3.33-3.31(m，10H)，2.47-2.43(m，4H)，1.44(s，18H)。
40kDa PEG二胺
40kDa Boc-保护的PEG二胺(0.2g，0.005mmol)溶解在TFA(4mL)中，并在室温下搅拌2小时。反应物真空浓缩，得到200mg(100％)米色的粗40kDa PEG二胺残渣。HPLC C法测定产物的纯度＞96％(保留时间＝6.5分钟)。1H NMR(CDCl3)δ7.85(bs，1H)，6.75(bs，1H)，3.64(s，2432H，PEG)，3.34-3.32(m，10H)，2.47-2.45(m，4H)。
叔丁酯(102)
40kDa PEG二胺(0.2g，0.005mmol)溶解在CH2Cl2(4mL)中。加入二异丙基乙胺(17μL，0.1mmol)，然后加入化合物101(0.082g，0.1mmol)。加入另一部分二异丙基乙胺(17μL)，反应在室温下搅拌18小时。反应物真空浓缩，得到300mg(150％)白色固体的粗化合物102。HPLC C法测定产物的纯度＞70％(保留时间＝8.9分钟)。粗产物就可以使用。
共轭物103
化合物102(0.3g，0.007mmol)溶解在甲酸(5mL)中，在40℃加热24小时。反应物真空浓缩，根据HPLC A法纯化，得到0.14g(68％)白色固体的化合物103。HPLC C法测定共轭物的纯度＞99％(保留时间＝7.3分钟)。1H NMR(CDCl3)δ9.05(bs，2H)，8.82-8.81(m，2H)，8.17-8.14(d，2H)，8.05-8.04(d，2H)，7.65-7.58(m，4H)，7.54-7.48(m，2H)，7.41-7.34(d，4H)，7.10-7.05(m，2H)6.95-6.93(d，2H)，4.90(m，2H)，4.63-4.49(m，6H)，3.64(bs，3042H，PEG)，3.35-3.29(m，6H)，3.22(m，5H)，2.45-2.41(t，4H)，1.79-1.74(m，4H)11.29-1.27(d，12H)。
实施例34
聚合物的合成：
40kDa Boc-保护的PEG四胺
20kDa PEG四胺(0.5g，0.025mmol)和5kDa Boc-NH-PEG-NHS酯(1g，0.2mmol)溶解在CH2Cl2(5mL)。加入二异丙基乙胺(0.087mL，0.5mmol)，反应在室温下搅拌18小时。反应物真空浓缩，投入MeOH(10mL)中。加入2％交联的苯乙烯磺酸树脂(1.17g)，反应容器涡流旋转2小时。混合物过滤，真空浓缩，得到1.4g米色固体的粗产物。残渣根据HPLC B法纯化，得到0.44g(44％)白色固体的40kDa Boc-保护的PEG四胺。HPLC C法测定产物的纯度＞96％(保留时间＝8.4分钟)。1H NMR(CDCl3)δ6.75(bs，1H)，5.15(bs，1H)，3.64(s，2970H，PEG)，3.33-3.29(m，15H)，2.46-2.42(t，8H)，1.79-1.75(m，8H)，1.44(s，36H)。
40kDa PEG四胺
40kDa Boc-保护的PEG四胺(0.1g，0.0025mmol)溶解在TFA(4mL)中，在室温下搅拌1.5小时。反应物真空浓缩，得到120mg 40kDa透明的PEG四胺残渣。HPLC C法测定产物的纯度＞96％(保留时间＝6.2分钟)。1H NMR(CDCl3)δ7.39(bs，1H)，6.75(bs，1H)，4.49-4.48(m，4H)，3.64(s，3253H，PEG)，3.35-3.33(m，15H)，2.49-2.46(m，8H)，1.80-1.75(m，8H)。
叔丁酯(104)
40kDa PEG四胺(0.1g，0.0025mmol)溶解在CH2Cl2(2mL)中。加入二异丙基乙胺(9μL，0.05mmol)，然后加入化合物101(82mg，0.1mmol)。加入另一部分二异丙基乙胺(9μL)，反应在室温下搅拌48小时。反应物真空浓缩，得到110mg白色固体的粗化合物104。HPLC C法测定产物的纯度＞80％(保留时间＝10.9分钟)。
共轭物105
化合物104(0.1g，0.0024mmol)溶解在甲酸(5mL)中，在40℃加热24小时。反应物真空浓缩，根据HPLC A法纯化，得到0.05g(48％)白色固体的化合物105。HPLC C法测定共轭物的纯度＞99％(保留时间＝7.6分钟)。1H NMR(CDCl3)δ9.06(bs，4H)，8.83-8.82(m，4H)，8.20-8.17(d，4H)，8.05-8.03(d，4H)，7.63-7.61(m，8H)，7.53-7.49(m，4H)，7.42-7.33(m，8H)，7.09-7.05(m，4H)6.70(m，4H)，4.84(m，4H)，4.62-4.50(m，12H)，3.64(bs，2357H，PEG)，3.36-3.29(m，12H)，2.46-2.42(t，8H)，1.79-1.74(m，8H)，1.30-1.25(m，24H)。
实施例35
叔丁酯(106)
40kDa PEG四胺(37mg，0.000925mmol)和DMAP(0.5mg，0.0037mmol)溶解在CH2Cl2(0.5mL)中。加入三乙胺(3μL，0.019mmol)，然后加入化合物40(26mg，0.037mmol)。加入另一部分三乙胺(3μL)，反应在室温下搅拌18小时。反应物真空浓缩，得到34mg白色固体的粗化合物106。HPLC C法测定产物的纯度＞80％(保留时间＝10.9分钟)。
共轭物107
化合物106(34mg，0.0008mmol)溶解在甲酸(4mL)中，在40℃加热24小时。反应物真空浓缩，根据HPLC A法纯化，得到17mg(50％)白色固体的化合物107。HPLC C法测定共轭物的纯度＞99％(保留时间＝7.6分钟)。1H NMR(CDCl3)δ9.06(bs，4H)，8.86(bs，4H)，8.17-8.15(d，4H)，7.52(d，4H)，7.26-7.23(d，8H)，7.02-6.99(d，8H)，6.72(m，4H)，5.69(m，4H)14.80(m，4H)，4.60-4.47(dd，8H)，3.64(bs，1602H，PEG)，3.36-3.30(dd，8H)，3.16(m，8H)，2.46-2.42(t，8H)，1.24(bs 24H)。
实施例36
40kDa PEG四氯甲酸酯
40kDa 4-臂PEG醇(0.2g，0.005mmol)溶解在CH2Cl2(1mL)中。向其中加入2.0M碳酰氯/甲苯(0.15mL，0.3mmol)溶液。反应在室温下搅拌18小时。反应物真空浓缩，得到200mg 40kDa白色固体的PEG四氯甲酸酯。
叔丁酯(108)
40kDa PEG四氯甲酸酯(0.2g，0.005mmol)溶解在CH2Cl2(2mL)中。向其中加入化合物33(63mg，0.1mmol)，然后加入三乙胺(3.5μL，0.025mmol)。反应在室温下搅拌72小时。反应物真空浓缩，得到270mg白色固体的化合物108。
共轭物109
化合物108(0.26g，0.006mmol)溶解在甲酸(5mL)中，在40℃加热24小时。反应物真空浓缩，根据HPLC A法纯化，得到0.105g(42％)白色固体的化合物109。HPLC C法测定共轭物的纯度＞99％(保留时间＝8.3分钟)。1H NMR(CDCl3)δ9.06(bs，4H)，8.85-8.84(m，4H)，8.17-8.14(d，4H)，7.53-7.49(m，4H)，7.26-7.22(d，8H)，7.01-6.98(d，8H)，4.81-4.78(m，4H)，4.59-4.46(dd，8H)，4.28-4.35(m，8H)，3.64(bs，3872H，PEG)，3.15-3.13(m，8H)，1.24-1.19(m，24H)。
实施例37
叔丁酯(111)
40kDa 3-臂PEG醇(0.25g，0.00625mmol)、化合物110(0.04g，0.056mmol)和三苯基膦(0.025g，0.094mmol)通过共沸蒸馏从甲苯(5mL)中干燥。一半体积被蒸馏掉(2.5mL)，混合物冷却至室温。加入CH2Cl2(0.5mL)使反应物成为均相的混合物。逐滴加入偶氮二甲酸二乙酯(Diethylazodicarboxylate)(0.015mL，0.094mmol)，反应搅拌48小时。HPLC C法显示初始PEG醇完全消失。反应物真空浓缩得到白色固体的叔丁酯111。
共轭物112
化合物111(0.2g，0.005mmol)溶解在甲酸(3mL)中，在40℃加热24小时。反应物真空浓缩，根据HPLC A法纯化，得到0.1g(48％)白色固体的化合物112。HPLC C法测定共轭物的纯度＞99％(保留时间＝8.1分钟)。1H NMR(CDCl3)δ9.08(bs，3H)，8.84(bs，3H)，8.18-8.16(d，3H)，8.02-8.00(d，3H)，7.67-7.61(m，6H)，7.47-7.38(m，9H)，7.08-7.04(m，3H)，6.91(m，3H)，4.88(m，3H)，4.62-4.49(dd，6H)，4.13(m，6H)，3.64(bs，5919H PEG)，3.23(m，6H)，1.25-1.24(d，18H)。
类似的方法用于合成下述共轭物：
实施例38
40kDa 4-臂PEG醇与化合物110偶联，并使用与化合物112相似的方法去保护成为终产物。根据HPLC A法纯化产物。HPLC C法测定共轭物的纯度＞95％(保留时间＝7.5-8.1分钟)。1H NMR(CDCl3)δ9.08(bs，4H)，8.84(bs，4H)，8.18-8.16(d，4H)，8.02-8.00(d，4H)，7.67-7.61(m，8H)，7.47-7.38(m，12H)，7.08-7.04(m，4H)，6.91(m，4H)，4.88(m，4H)，4.62-4.49(dd，8H)，4.13(m，8H)，3.64(bs，10101H PEG)，3.23(m，8H)，1.25-1.24(d，24H)。
实施例39
40kDa 3-臂PEG醇与叔丁酯114(如下所示)偶联，使用与化合物112相似的方法去保护成为终产物。根据HPLC A法纯化产物。HPLCC法测定共轭物的纯度＞95％(保留时间＝7.3分钟)。1H NMR(CDCl3)δ8.66(bs，3H)，8.44(bs，3H)，8.04-8.02(d，3H)，7.75-7.30(m，24H)，7.10-7.06(m，3H)，6.93(s，3H)，5.60-5.50(m，3H)，4.15(m，6H)，3.66(bs，4270H PEG)，3.00(m，3H)，3.40-3.20(m，6H)，1.27(d，9H)。
实施例40
叔丁酯(117)
40kDa 3-臂PEG醇(0.00625mmol)、化合物116(0.056mmol)和三苯基膦(0.094mmol)通过共沸蒸馏从甲苯(5mL)中干燥。一半体积被蒸馏掉(2.5mL)，混合物冷却至室温。加入CH2Cl2(0.5mL)，使反应物成为均相的混合物。逐滴加入偶氮二甲酸二乙酯(0.094mmol)，反应搅拌48小时。反应物真空浓缩得到叔丁酯111。
共轭物118
化合物118(0.005mmol)溶解在甲酸(3mL)中，在40℃加热24小时。反应物真空浓缩，根据HPLC A法纯化得到化合物112。
实施例41
使用实施例的29产物和在实施例38和39中使用的PEG聚合物，制备下述共轭物：
下表V和VI中的共轭物是根据本文所述的实施例和制备方案制备的。
表V
其中，在每一个结构中，所有p的总和为200至1360。
表VI
生物学实施例
实施例A
测定候选化合物效力的体外测定：
在Jurkat TM(15/7LIBS)上的15/7抗原表位
对数生长期的Jurkat TM细胞在下述条件下在96孔Flexiplate板中孵育(incubate)：105个细胞/100μl/孔，在含有10μg/ml的15/7(Elan)和一定浓度范围的化合物的测定缓冲液(20mM Hepes、140mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2和0.3％BSA)中。孵育在室温下进行30分钟。然后将细胞用测量缓冲液冲洗2次，并与1∶200的羊Fab′2抗Ms IgG(Fc)-PE(Immunotech cat#PN IM0551)在测定缓冲液中在暗处冰上孵育30分钟。然后将细胞冲洗一次，重新悬浮在300μl的冷测定缓冲液中，进行FACS分析(Becton-Dickinson)。
多价配体竞争测定(MVCOMP)
方法：
整合素受体通过与其特异配体的多价作用介导细胞粘附——多重整合素受体与粘附性基质内的多个配体分子同时结合。为在高度敏感的定量测定中模拟这种生理学作用，开发了多价配体探针，该探针可以与淋巴细胞上的a4整合素特异地结合。该探针由a4整合素的小分子配体、化合物200(结构如下所示)组成，以6-10倍的过量摩尔数与鼠IgG共轭结合(6-10小分子：1IgG)。这种结合可以被21/6和a4抗体抑制。一旦与细胞表面结合，通过FACS分析可以通过荧光素标记的鼠IgG二抗测定到共轭物。在本测定中，使用了两种不同的鼠单克隆IgG载体分子，TM2a和27/1，除非与a4配体共轭结合，否则这两种抗体都不与人淋巴细胞结合。
小分子-抗体试剂的共轭作用
大约1mg TM2a或27/1(Elan)抗体与1∶6或1∶10过量摩尔数的化合物200在50倍过量摩尔数的[双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯](Pierce)的存在下以总体积1.0ml在室温下孵育60分钟，并搅拌。然后用含胺缓冲液TRIS-Cl(pH 7.5)中止反应20分钟。产物在4,000体积的PBS中在4℃下在10KD截断MW(cutoff)膜盒透析2次以去除未结合的小分子和连接试剂。
竞争结合测定
Jurkat细胞(亚系TM，亚克隆#15，Elan)与滴定的多种检测化合物在以1∶100在测定缓冲液中稀释的TM2a或27/1共轭物的存在下室温孵育30分钟。然后通过几次冲洗步骤去除未结合的试剂，其中在Beckman台式离心机中以300×g将细胞沉淀5分钟，然后重新悬浮在新鲜的缓冲液中。将细胞与羊F(ab)′2抗鼠IgG(Fc)-藻红蛋白(BeckmanCoulter)在4℃孵育30分钟检测剩余的结合抗体，然后冲洗，进行FACS分析。
在8866细胞上的2G3抗原表位诱导(2G3配体诱导的结合位点)
对数生长期的8866细胞在下列条件下在96孔Flexiplate板中孵育105个细胞/100μl/孔，在含有10μg/ml 2G3(Elan)和一定浓度化合物的测定缓冲液(PBS、1mM CaCl2、1mM MgCl2和5％FBS)中。在室温下孵育30分钟。然后细胞用测定缓冲液冲洗2次，与1∶200测定缓冲液稀释的羊Fab′2抗Ms IgG(Fc)-PE(Immunotech cat#PNIM0551)在暗处冰上孵育30分钟。然后冲洗细胞1次，重新悬浮在300μl冷测定缓冲液中以进行FACS分析(Becton-Dickinson)。
Claims (41)
1.一种式I的共轭物：
B是生物相容性聚合物部分，其任选地共价连接到带有支链臂的中心分子；
q为2至100；
A在每次出现时均独立地为式II的化合物或其药学可接受的盐：
其中，
Ar2选自下述基团：芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、烷基、取代烷基、烷基氨基和取代烷基氨基，其中Ar2任选地共价连接到聚合物部分，其中所述的聚合物部分任选地包括将该聚合物部分与Ar2共价连接的连接子；
J是式(b)的基团：
其中R选自下述基团：氢、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基；
Ar1选自下述基团：芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基，其中每一个芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基任选地共价连接到聚合物部分，其中所述的聚合物部分任选地包括将该聚
合物部分与Ar1共价连接的连接子；
X选自下述基团：-S-和任选取代的-CH2-，其任选地共价连接到聚合物部分，其中，在每种情况下，所述的聚合物部分均任选地包括共价连接该聚合物部分的连接子；
其中R1选自氢和烷基；
m是1；
n是等于0、1或2的整数；且
T是式(d)的基团
其中G是任选取代的芳基或任选取代的含有0至3个氮原子的杂芳基5或6元环，其中所述的芳基或杂芳基任选地进一步包括与聚合物部分相连接的共价键，该聚合物部分任选地包括连接子；
R6是与任选地包括连接子的聚合物部分相连接的共价键，或者R6是-H、烷基、取代烷基或-CH2C(O)R17，其中R17是-OH、-OR18或-NHR18，其中R18是烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基；
R55是-OH或可水解的酯，或者R55与聚合物部分任选地通过连接子形成可水解的聚合物酯；
条件是：
A.J、Ar2和T中的至少一个包含与聚合物部分相连接的共价键；和
B.
式I的共轭物的分子量不大于80,000。
2.根据权利要求1所述的共轭物，其中J、Ar2和T中仅有一个包含与聚合物部分相连接的共价键。
3.根据权利要求1所述的共轭物，其中n是2，R在每次出现时都是C1-C3烷基，且两个R基团都在相同的碳原子上。
4.根据权利要求1所述的共轭物，其中q是2至20的整数。
5.根据权利要求1所述的共轭物，其中q是2至8的整数。
6.根据权利要求1所述的共轭物，其中所述带有支链臂的中心分子是选自山梨醇、甘油、双甘油、六甘油、季戊四醇、赖氨酸、1，2，4-苯三酚、葡萄糖、乙二胺四乙酸、4-氨基水杨酸、1，3-二氨基-2-羟基丙烷和葡糖胺唾液酸。
7.根据权利要求1所述的共轭物，其中B选自：
其中Z是
其中所有p或所有n的总和为100到1360。
8.根据权利要求1所述的共轭物，其中A在每次出现时都独立地是式IIi的化合物或其药学可接受的盐：
9.根据权利要求8所述的共轭物，其中m是1，X是S，且R在每次出现时都独立地选自羟基、烷氧基、烷基或与聚合物部分相连接的共价键。
10.根据权利要求9所述的共轭物，其中n是2，且R在两次出现时都是甲基。
11.根据权利要求8所述的共轭物，其中G是吡啶基。
12.根据权利要求1所述的共轭物，其中A和B如下所示：
其中，ZZ是
其中，所有n的总和为100至1360。
13.根据权利要求1所述的共轭物，其选自下述化合物及其药学可接受的盐：
其中所有n的总和是100到1360。
14.一种药学组合物，其包括药学可接受的载体和治疗有效量的根据权利要求1所述的共轭物或其混合物。
15.根据权利要求14所述的药学组合物，其中所述的药学可接受的载体适用于胃肠外给药。
16.根据权利要求14所述的药学组合物，其中所述的药学可接受载体适用于皮下给药。
17.根据权利要求14所述的药学组合物，其中所述的药学可接受的载体适用于输注给药。
18.根据权利要求14所述的药学组合物，其中所述的药学可接受的载体适用于注射给药。
19.根据权利要求14所述的药学组合物，其中所述的药学可接受的载体适用于口服给药。
20.根据权利要求14所述的药学组合物，其中所述的药学可接受的载体适用于直肠给药。
21.根据权利要求14所述的药学组合物，其中所述的药学可接受的载体适用于使用贴片给药。
22.根据权利要求14所述的药学组合物，其中所述的药学可接受的载体适用于通过吸入给药。
23.有效量的根据权利要求1所述的共轭物在制备治疗患者由于α4整合素-介导的白细胞粘附而引起或者至少部分由于上述原因而加重的疾病状态的药物中的应用。
24.根据权利要求23所述的应用，其中所述的被抑制的a4-结合作用是与VCAM-1的结合作用。
25.根据权利要求23所述的应用，其中所述的被抑制的a4结合作用是与纤维连接蛋白的结合作用。
26.根据权利要求23所述的应用，其中所述的被抑制的a4结合作用是与MadCAM的结合作用。
27.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是自体免疫性疾病状态。
28.根据权利要求27的应用，其中所述的通过权利要求1的共轭物进行的治疗，减轻了自体免疫反应引起的炎症和随之发生的组织损害。
29.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是多发性硬化症、脑膜炎、脑炎、中风或其它脑外伤。
30.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是多发性硬化症。
31.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态选自哮喘、成人呼吸窘迫综合征和白细胞介导的急性肺损伤。
32.根据权利要求31所述的应用，其中所述的疾病状态是哮喘。
33.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是类风湿性关节炎。
34.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是选自下述疾病的炎性疾病状态：结节性红斑、变应性结膜炎、视神经炎、眼葡萄膜炎、变应性鼻炎、强制性脊柱炎、银屑病性关节炎、血管炎、莱特尔氏综合征、系统性红斑狼疮、进行性全身性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎、Wegner氏肉芽肿、主动脉炎、类肉瘤病、淋巴细胞减少症、颞动脉炎、心包炎、心肌炎、充血性心力衰竭、结节性多动脉炎、高敏反应综合征、变态反应、嗜酸细胞过多综合征、变应性肉芽肿性血管炎、慢性阻塞性肺病、过敏性肺炎、慢性活动性肝炎、间质性膀胱炎、自身免疫性内分泌功能障碍、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性再生障碍性贫血、慢性迁延性肝炎和甲状腺炎、AIDS痴呆症、糖尿病、阿耳茨海姆氏病、痴呆症、动脉粥样硬化、肿瘤转移和移植排斥。
35.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是干燥综合征。
36.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是克隆氏病。
37.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是炎性肠病。
38.根据权利要求23所述的应用，其中所述的疾病状态是溃疡性结肠炎。
39.根据权利要求23所述的应用，其中所述的共轭物是α4β1和α4β7抑制剂。
40.一种药学组合物，其包括根据权利要求1所述的共轭物和α4β7抑制剂。
41.有效量的根据权利要求1所述的共轭物和有效量的α4β7抑制剂在制备治疗患者由于α4整合素-介导的白细胞粘附而引起或至少部分由于上述原因而加重的疾病状态的药物中的应用。
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