JP2013516633A - Ｊｃウイルス抗体に対するアッセイ - Google Patents

Abstract

本開示は、ＪＣウイルス抗体の存在について試料を分析するための方法及び試薬に関する。対象から生体試料（例えば、血漿、血清、血液、尿又は脳脊髄液）を得ることと、ＨＰＶＬＰと試料中のＪＣＶ抗体の結合に適切な条件下で、高純度のウイルス様粒子（ＨＰＶＬＰ）とこの試料を接触させることと、ＨＰＶＬＰとの試料中のＪＣＶ抗体結合のレベルを検出することと、を含む方法が開示される。ある実施態様において、対象試料中の抗ＪＣＶ抗体のレベルを測定することにより、対象におけるＰＭＬのリスクを特定する方法が得られる。

Description

関連出願
本願は、２０１０年１月１１日出願の米国仮出願第６１／２９４，０４８号及び２０１０年３月２２日出願の米国仮出願第６１／３１６，１９３号（両者とも、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）の優先権を主張する。

本発明は、ＪＣウイルス抗体の存在について試料を分析するための方法及び試薬に関する。

進行性多巣性白室脳症（ＰＭＬ）は、持続的な免疫抑制又は免疫調節の状態下でのみヒトにおいて病原性があると考えられているポリオーマウイルスであるＪＣウイルス（ＪＣＶ）への曝露が関連する中枢神経系（ＣＮＳ）の日和見感染症である。ＪＣＶの存在はＰＭＬの発現に必要である一方、ＰＭＬリスクは、経路はよく分わからないが、ウイルスを病原性にする、複数のウイルス性因子及び宿主関連因子の収束に関連があると考えられている（非特許文献１）。ヒト集団におけるＪＣＶ感染罹患率を報告している既に発表済みの研究は多様である。この情報は、ウイルス性ＤＮＡに関するＰＣＲ分析及びＪＣＶに対する抗体の検出を含む様々なタイプの研究に基づく。集団におけるＪＣＶの蔓延にもかかわらず、ＪＣＶによる感染の結果、ＰＭＬが発現することは、免疫抑制が確認されている者においても稀である。

ＪＣＶ ＤＮＡ検出に関する報告書から、この方法は感度が低く、ＪＣＶ−感染ＰＭＬ患者の血漿、血清又は末梢血単核細胞ににおいてＪＣＶ ＤＮＡが検出されることは稀であり、一貫性がないので、ＪＣＶへの曝露を評価するための用途には制限があることが示唆される。抗ＪＣＶ抗体の検出は、より感度の高いＪＣＶ感染のマーカーであると思われるが、報告されている結果は変動しやすい。１９７３年、Ｐａｄｇｅｔｔ及びＷａｌｋｅｒは、赤血球凝集抑制反応（ＨＩ）アッセイを用いて６５−８４％というＪＣＶ血清陽性を報告する研究を発表した（非特許文献２）。ＨＩアッセイ又はＥＬＩＳＡを用いたＪＣＶ血清陽性率の最近の報告は、３３から９１％まで様々である。これらの研究間の血清陽性率の変動は、これらの研究の規模及び場所の顕著な違い及び、おそらく最も重要なものとして、アッセイ方法の違いによるものと思われる。

Ｍａｊｏｒ，「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ Ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６１：３５−４７（２０１０）［２００９ Ａｕｇ．３１，Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］ Ｐａｄｇｅｔｔ及びＷａｌｋｅｒ，「Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ ａｇａｉｎｓ ＪＣ ｖｉｒｕｓ，ａｎ ｉｓｏｌａｔｅ ｆｒｏｍ ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２７：４６７−７０，１９７３

従って、例えば個人がＪＣＶに曝露されているか否かを評価するために使用することができる、ＪＣＶ抗体の存在を判定するのに信頼性が高く感度が高いアッセイを実施することが望まれる。

本発明は、体液、例えば血清又は血漿中のＪＣＶ抗体の存在を検出するための、分析的に検証され、感度が高いアッセイの開発に関する。

従って、本発明は、対象からの生体試料（例えば、血漿、血清、血液、尿又は脳脊髄液（ＣＳＦ））を得ることと；試料中のＪＣＶ抗体のＨＰＶＬＰへの結合に適切な条件下で、高純度ウイルス様粒子（ＨＰＶＬＰ）と試料を接触させることと；ＨＰＶＬＰに対する試料中のＪＣＶ抗体結合レベルを検出することと；偽陰性率が３％以下になり、他のポリオーマウイルス、例えばＢＫウイルス（ＢＫＶ）に対する抗体など、試料の他の成分との交差反応性が最小となるように選択される参照物と、検出レベルを相関させることと、を含む方法に関する。いくつかの実施態様において、対照試料又は一連の試料由来の参照物質を、対象由来の試料とともに処理する。いくつかの実施態様において、本参照物質は、アッセイの偽陰性率が１％以下となるように選択される。

ある実施態様において、精製ＨＰＶＬＰ標品中のＨＰＶＬＰの少なくとも約１０％が、ＨＰＶＬＰ１個あたり５個を超えるＶＰ１ポリペプチドを含有する。その他の実施態様において、精製ＨＰＶＬＰ標品中のＨＰＶＬＰの少なくとも約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％又は約９０％が、ＨＰＶＬＰ１個あたり５個を超えるＶＰ１ポリペプチドを含有する。

本アッセイは、ＨＰＶＬＰがマイクロタイタープレート又はスライドなどの固体基質上に固定化されるように行うことができる。いくつかの実施態様において、本ＨＰＶＬＰは、基本的にＶＰ１ウイルスタンパク質からなる。本ＨＰＶＬＰは、他のウイルスタンパク質、例えばＶＰ２又はＶＰ３のうち少なくとも１つをさらに含み得る。ＨＰＶＬＰ中のウイルスタンパク質は、組み換え由来のものであってもよいし（例えばＭＡＤ１株ＶＰ１）、天然のウイルスタンパク質（例えば天然源由来）であってもよい。本方法は、例えば、免疫調整薬で現在治療中の対象、免疫調整薬で治療を開始することを検討している対象又は進行性多巣性白室脳症（ＰＭＬ）に罹患している疑いのある対象から得られる生体試料を用いて行うことができる。

いくつかの局面において、本アッセイ方法は、（固体基質に結合されたＨＰＶＬＰと試料のインキュベーション前に）、対象からの生体試料の一部を溶液中でＨＰＶＬＰと接触させ、段階（ｂ）のＨＰＶＬＰが固体基質に結合され、それにより二次試料が得られ；第一のアッセイで使用されたものと同じ条件下でＨＰＶＬＰと該二次試料を接触させ；該二次試料中でのＨＰＶＬＰへのＪＣＶ抗体結合のレベルを検出し；該二次試料中のＪＣＶ抗体の検出レベルを、可溶性ＨＰＶＬＰと予めインキュベーションしなかった試料中のＪＣＶ抗体レベルと比較することを含み、予めインキュベーションしなかった試料と比較して、二次アッセイ試料中の検出レベルが低下していることが、試料がＪＣＶ抗体陽性であることを示し、検出レベルの変化が指定の％を下回る場合、試料中にＪＣＶ特異的抗体が存在しないことを示す、二次確認アッセイ過程をさらに含む２段階アッセイである。

本明細書中に記載のアッセイは、免疫調節物質による治療を受けたことがない対象において；又は免疫調節物質を以前投与されたことがあるが、その免疫調節物質による治療を現在は受けていない対象において；又は免疫調節物質による治療を現在受けている対象において、ＪＣＶ抗体の存在についてアッセイするために使用することができる。

本発明で取り上げるアッセイにおけるＨＰＶＬＰへのＪＣＶ抗体結合の検出は、対象においてＰＭＬに対するリスクが上昇していることを示し得る。ＪＣＶ抗体の検出はまた、対象において、ある種の免疫調節物質など、ある種の治療剤の投与時に、ＰＭＬ発現などの有害症状のリスクが高く、従ってその対象が、これらの薬剤による治療に対する候補ではないことも示し得る。例えば、対象からの試料中でのＪＣＶ抗体の検出は、その対象が、ナタリズマブなどの抗ＶＬＡ−４治療剤での治療に対する候補ではないことを示し得る。ある種の実施態様において、生体試料中でのＪＣＶ抗体の検出は、その対象が、ナタリズマブなどの免疫調節物質での治療に対する候補であるが、治療中、ＪＶＣ抗体が検出可能ではない対象よりも監視が強化されることを示し得る。例えば、監視の強化には、ＰＭＬ発現を示唆し得る症状などの有害症状に対する観察が含まれ得る。

本発明で取り上げられるアッセイにおいてＨＰＶＬＰに対するＪＣＶ抗体結合を検出できないということは、その対象が、ナタリズマブなどの免疫調節物質による治療を受ける候補であることを示し得、ある実施態様において、その対象に免疫調節物質がさらに投与される。ＪＣＶ抗体がないと判定された対象に対して、その対象がＪＣＶ抗体を発現しているか否かを判定するために、少なくとも年に１回（例えば少なくとも３ヶ月ごと、６ヶ月ごと、９ヶ月ごと又は１２ヶ月ごと）、再試験を行うことができ、この再試験から、その対象がＪＣＶに感染していることが示され得る。以前、生体試料中でＪＣＶ抗体が検出可能ではなく、その後、生体試料中でＪＣＶ抗体が発現されるようになった対象は、免疫調節物質による治療の受容を中止することができる。

いくつかの実施態様において、以前、ＪＣＶ抗体を有することが確認された対象に対して、それ以降、後日試験を行い、ＪＣＶ抗体がないと判定され得る。これらの対象は、ナタリズマブなどの免疫調節物質での治療を受容する候補であると判定することができる。ある実施態様において、以前、試験においてＪＣＶ抗体の存在について陽性となり、その後、試験によりＪＣＶ抗体陰性であるとされた対象は、免疫調節物質を投与することができ、ＰＭＬ発現を示し得る症状について監視するためなど、試験においてＪＣＶ抗体陽性と判定されたことがない対象と比較して、監視が強化され得る。

本発明で取り上げられるアッセイは、多発性硬化症（ＭＳ）又はクローン病（ＣＤ）などの免疫性疾患又は障害に罹患している対象を治療するために有用である。ある実施態様において、本明細書中に記載のアッセイは、このアッセイが、臨床治験などにおいて、対照を置いた試験環境でＭＳ及びＣＤ患者におけるＪＣＶ抗体の検出に有効であるということを示すことなどによって、ＭＳ及びＣＤ患者における使用に関して検証されている。

別の局面において、本発明は、ＨＰＶＬＰと、生体試料などの試料中のＪＣＶ抗体レベルを特定するためにアッセイを行うための少なくとも１つの試薬と、を含むキットに関する。

他の局面において、本発明は、基本的に、例えば、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０又は７２個の五量体を含有するか又は約２５個のＶＰ１分子、約５０個のＶＰ１分子、約１００個のＶＰ１分子、約１５０個のＶＰ１分子、約２００個のＶＰ１分子、約３００個のＶＰ１分子、約３５０個のＶＰ１分子又は約３６０個のＶＰ１分子を含有する、ＶＰ１五量体よりもサイズが大きいＶＰ１含有粒子からなるＨＰＶＬＰ粒子を含む溶液に関する。

本発明で取り上げられる別の局面は、ＶＰ１五量体以下のサイズであるＶＰ１含有粒子を溶液から除去することを含む、ＨＰＶＬＰの溶液を調製する方法である。ある方法において、ＶＰ１ポリペプチドは、細胞中、例えば昆虫細胞又は哺乳動物細胞中で発現される。これらの細胞を溶解し、次いでこれらの細胞をベンゾナーゼなどのヌクレアーゼで処理する。塩析沈殿（例えば硫酸アンモニウム）などによる沈殿によって細胞残屑を除去し、次いでＶＰ１含有上清を濃縮し、膜、例えば接線流ろ過（ＴＦＦ）膜に１回又は２回通すことなどによって、ダイアフィルトレーションを用いてさらに精製する。次いで、イオン交換段階を通じて、ＶＰ１含有粒子、例えばＨＰＶＬＰを含有する溶液をさらに精製し、例えば緩衝液によりＨＰＶＬＰの溶出を行う。例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）又は質量分析によって、ＶＰ１の純度を評価することができる。顕微鏡、例えば電子顕微鏡によってＨＰＶＬＰの存在を確認することができる。沈降速度超遠心分析法によって、ＨＰＶＬＰ形態の総タンパク質の％を調べることができる。

ある局面において、本発明は、対象から生体試料を得て；試料中のＪＣウイルス（ＪＣＶ）抗体のＨＰＶＬＰへの結合に適切な条件下で生体試料をＨＰＶＬＰと接触させ；試料中のＪＣＶ抗体のＨＰＶＬＰへの結合レベルを検出し；参照用セットで検出レベルを補正し、ＪＣＶ抗体結合が検出される場合、その対象においてＰＭＬリスクが上昇しているとすることなどによって、ＰＭＬを発現するリスクがある対象を特定する方法を取り上げる。参照用セットは、偽陰性率が約５％、約３％、約１％以下となるように選択される。

別の局面において、本発明は、血漿、血液又は血清試料由来など、対象由来の試料中の抗ＪＣＶ抗体レベルを測定し；試料中の抗ＪＣＶ抗体レベルに従い対象に対するリスクレベルを判定することによる、対象におけるＰＭＬリスクを特定する方法を取り上げる。対象は、抗ＶＬＡ４治療、例えばナタリズマブなど、免疫調節療法を受けている状態であり得るか又は免疫調節療法を受ける候補であり得る。いくつかの実施態様において、対象は、多発性硬化症又はクローン病など、免疫性疾患又は障害の診断が下りている。ある実施態様において、抗ＪＣＶ抗体レベルは１段階アッセイを用いて測定され、別の実施態様において抗ＪＣＶ抗体レベルは２段階アッセイを用いて測定される。１段階アッセイであれ２段階アッセイであれ、ＥＬＩＳＡアッセイが含まれ得る。

ある実施態様において、対象においてＰＭＬリスクを特定する方法は、初回試料よりも後の日付からの試料中でその対象における抗ＪＣＶ抗体レベルを測定することと；初回試料からの試料における抗ＪＣＶ抗体レベルと、後の日付からの試料中の抗ＪＣＶ抗体レベルを比較することと；その対象が、初回試料の時間よりも後の日付でＰＭＬリスクが上昇しているか否かを判定することと、をさらに含む。

ある局面において、本発明は、第一の日付からの試料を用いて対象における抗ＪＣＶ抗体レベルを測定することと；第一の日付の対象における抗ＪＣＶ抗体レベルに基づいてＰＭＬリスク（例えば高又は中又は低リスク）を判定することと；第二の日付からの試料を用いて対象における抗ＪＣＶ抗体レベルを測定することと；第二の日付の対象における抗ＪＣＶ抗体レベルに基づき、ＰＭＬリスク（例えば高又は中又は低リスク）を判定することと、を含む、対象においてＰＭＬリスクを監視する方法を取り上げる。

本明細書中で使用される場合、「ＨＰＶＬＰ」とは、主にＶＰ１タンパク質からなる高純度ＶＬＰ（「ウイルス様粒子」）である。本発明で取り上げられる「ＨＰＶＬＰ」は、主に、ポリオーマウイルス、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）由来の、天然のＶＰ１又は組み換えＶＰ１であり得る、主カプシドタンパク質「ＶＰ１」から構成される。ＨＰＶＬＰは、例えば複数の五量体サブユニット、少なくとも１０個の五量体サブユニット、少なくとも２０個の五量体サブユニット、少なくとも３０個の五量体サブユニット、少なくとも５０個の五量体サブユニット、少なくとも７２個の五量体サブユニット以上のＶＰ１から構成され得る。ＨＰＶＬＰは、立体構造が定められていないＶＰ１ポリペプチド（例えばこのポリペプチドは五量体に会合していても会合していなくてもよい。）を含有し得、この場合、ＨＰＶＬＰは、５個を超えるＶＰ１ポリペプチド、少なくとも５０個のＶＰ１ポリペプチド、少なくとも１５０個のＶＰ１ポリペプチド、少なくとも３６０個以上のＶＰ１ポリペプチドから構成され得る。ＨＰＶＬＰはカプソメアを含み、これには、約１０から２４個の五量体が含有される。本発明で取り上げられるＨＰＶＬＰは、天然の無処理のＪＣウイルスに対する抗体に結合し得る。いくつかの実施態様において、ＨＰＶＬＰは、ＪＣウイルスのマイナーカプシドタンパク質である第二の及び場合によっては第三のタイプのポリペプチド、例えばＶＰ２又はＶＰ３ポリペプチドのうち少なくとも１つを含む。このＶＰ２又はＶＰ３は、組み換え又は天然又は天然由来ポリペプチドであり得る。

このような「高純度」粒子は、複数のＶＰ１五量体、例えば少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７２個のＶＰ１五量体、１００個以下のＶＰ１五量体を含有する。このような高純度粒子は、例えば二重ろ過を含む方法によって得ることができる。例えば、ある実施態様において、ＶＬＰの高純度標品は、例えばスクロースクッション法を通じて、遠心によって少なくとも２回粒子を精製することによって得られる。一般に、ＨＰＶＬＰ標品は、指定の対照試料を用いてＥＬＩＳＡアッセイにおいてその活性により同定することができる。ある場合においては、このような対照試料は、陰性対照及び／又は低レベルのＪＣＶ抗体を含有する対照試料である。

別段の定めがない限り、本明細書中で使用される技術及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の通常の技術者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験に際して本明細書中に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができるが、適切な方法及び材料を以下で記す。本明細書中で言及される刊行物、特許出願書類、特許及びその他の参考文献は全て、それらの全体において参照により組み込まれる。対立がある場合、定義を含め本明細書が優先する。さらに、材料、方法及び実施例は単なる例示であり、限定するものではない。

本発明の１以上の実施態様の詳細を添付の図面及び以下の説明で示す。説明及び図面から、ならびに特許請求の範囲から、本発明の他の特徴、目的及び長所が明らかとなろう。

図１は、尿中ＪＣＶ ＤＮＡ陽性（尿陽性）である対象及び尿中ＪＣＶ ＤＮＡ陰性（尿陰性）である対象由来の試料におけるＨＰＶＬＰ ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。箱は四分位（ＩＱＲ）範囲を表し、中央に中線を付し；角括弧はＩＱＲの１．５倍内であることを表す。「＋」印は、ＩＱＲの１．５倍を超える観測値（外れ値）を表す。^＊マン−ホイットニーＵ検定。 図２は、ｑＰＣＲにより測定した場合の尿中ＪＣＶ ＤＮＡレベルに対する、ＥＬＩＳＡにより測定した場合の抗ＪＣＶ抗体レベルを示すグラフである（ｎ＝２０４）。白丸は、ＳＴＲＡＴＡにおける対応する時間点で回収した尿及び血清試料を表す。黒丸は、様々な時間点で回収した試料を表す。ＤＮＡ試験結果が定量レベルを下回る（＜５００コピー／ｍＬ）１７検体の試料に対して、そのレベルを検出限界であるとした。 図３は、ＢＫＶで免疫付与した１匹のウサギからのＢＫＶ−ＪＣＶ交差反応性データを示すグラフである。ＢＫＶ免疫付与ウサギ由来の抗血清結合はＢＫＶ ＶＬＰに高親和性（ＥＣ５０＝１：１００，０００）で結合し、ＪＣＶ ＶＬＰと交差反応した（ＥＣ５０＝１：５，０００）。 図４Ａ及び４Ｂは、スクリーニング及び確認ＥＬＩＳＡにおける、尿陰性（ｎ＝３１１）（図４Ａ）及び尿陽性（ｎ＝２０４）（図４Ｂ）患者からの血清試料の抗ＪＣＶアッセイ反応性を示す。下部（ｎＯＤ_４５０＝０．１０）及び上部（ｎＯＤ_４５０＝０．２５）カットポイントを強調し（左パネル）、スクリーニングＥＬＩＳＡにおける試料の血清反応性の分布を示す。補足的な確認ＥＬＩＳＡ（右パネル）において、４０％阻害カットポイントを強調し（縦線）、影付きの領域は、試料が抗ＪＣＶ特異的抗体を有することが確認されなかったことを示す（ｎＯＤ_４５０≦０．２５及び％阻害≦４０％）。 図５Ａ及び５Ｂは、全患者（ｎ＝５１５）（図５Ａ）及び尿陽性患者（ｎ＝２０４）（図５Ｂ）に対する各１０％阻害範囲内の観察頻度を示すヒストグラムである。この分布は、最適には４０％阻害で分けられる、明確な２つのピークからなる。４０％阻害レベルは、尿陽性試料の反応分布の概ね下位５パーセンタイルに対応した。 図６Ａ及び６Ｂは、１１検体のＰＭＬ前の試料に対する確認ＥＬＩＳＡからの％阻害値（図５Ｂ）に対する、スクリーニングＥＬＩＳＡからのｎＯＤ_4５０値のプロットである（図６Ａ）。水平線は、ｎＯＤ_４５０値０．１０及び０．２５を表し、垂直線は４０％の％阻害を示す。

偽陰性を最小限に抑え、交差反応する抗体の検出が最小限である、ＪＣＶ抗体に対する高感度アッセイは、ＪＣＶに曝露されている個体の特定に有用である。このような試験の展開は、現在ＪＣＶに感染しているか又は過去にウイルスに対する抗体を発現するのに十分なＪＶＣへの曝露があった個体の特定に有用であり得る。このようなアッセイはまた、ＰＭＬの臨床における警戒及びリスク層別化において臨床医を支援するためのツールも提供する。例えば、このような試験は、対象がＪＣＶに曝露されたことがあるか否かを正確に評価することにより、患者のＰＭＬ発現リスク評価の一助として、医師及び患者に有用なものとなり得る。ある場合においては、本分析は、患者からの生体試料においてＪＣＶ抗体レベルを測定することを含み得る。

ＪＣＶ抗体に対する有用なアッセイの開発には、例えば有効なカットポイントの確立など、ある種の難しさがある。出願者らは、ＪＣＶ ＤＮＡについて尿が陽性又は尿が陰性である患者からの尿及び血漿試料のアッセイから得られたデータを用いることによって、この問題を解決した。別の問題は、特異性及び再現性があるアッセイを開発することである。出願者らは、抗体アッセイにおいて高純度ウイルスタンパク質含有粒子を使用することによって、この問題を解決した。さらに、出願者らは、第一のアッセイでの結果が曖昧である試料に対処するための二次的アッセイの使用によって、このような試料に対して有用な結果を与えるという点に関してこのアッセイの有用性が向上することを発見した。

従って、体液、例えば血清、血漿、尿、ＣＳＦ又は抗体を含有するその他の体液中でＪＣＶ抗体の存在を検出するために、高純度ＶＰ１含有ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用する、分析的に有効なアッセイを開発した。本新規アッセイを検証するための研究において、臨床試験に登録されたＭＳ患者母集団においておよそ５４％でＪＣＶ抗体が認められることが分かった。本明細書中に記載のアッセイの重要な特性は、高純度ウイルス様粒子（ＨＰＶＬＰ）の使用である。

本明細書中に記載のアッセイのある１つの長所は、ＪＣＶに対する抗体の検出に対して、偽陰性率が比較的低い、例えば偽陰性率が約１０％、約８％、約６％、約４％、約３％、約１％以下であることである。一般に、本アッセイの偽陰性率は、ＪＣＶに対する抗体の検出に対しては僅か約３％以下である。本明細書中で記載のように、ＪＣＶに対する抗体陽転率を監視するために本新規アッセイ使用することができる。例えば、本アッセイは、最初にＪＣＶ抗体陰性であった対象の被験コホートにおいて、約２％以下の年間抗体陽転率を探索するために使用されたことがある。このことから、長期間にわたる個体のＪＣＶ曝露状態を監視するために本アッセイが有用であり得ることが明らかとなる。

免疫調節物質、例えば抗ＶＬＡ−４療法（例えばナタリズマブ）、抗ＣＤ２０療法（例えばリツキシマブ）、抗ＣＤ１１ａ療法（例えばエファリズマブ）又はミコフェノール酸モフェチルでの治療が検討される対象を含む何れかのヒト対象における；免疫調節物質で現在治療が行われている対象における；又は免疫調節物質での治療を中止した対象における、ＪＣＶ抗体検出のために本アッセイを使用することができる。本アッセイは、ＰＭＬを起こし易い可能性があるその他の個体、例えば、多発性骨髄腫又はリンパ腫などのリンパ増殖性疾患に罹患している個体；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しているか又は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、血液悪性腫瘍又は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患、クローン病（ＣＤ）もしくは潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、多発性硬化症（ＭＳ）又は関節炎、例えば関節リウマチ（ＲＡ）に罹患している個体に対して有用であり得る。本アッセイはまた、移植患者など、免疫抑制又は免疫調節療法を受けている対象に対しても有用であり得る。代表的な免疫抑制又は免疫調節療法には、ナタリズマブ、リツキシマブ、エファリズマブ及びミコフェノール酸モフェチルが含まれる。本アッセイは、障害を有するか又は、Ｐｉｃｃｉｎｎｉら、「Ｓｔｒｏｎｇｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ（ＰＭＬ）ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ」Ｅｕｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６６：１９９−２０６，２０１０（この内容は参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示される薬物での治療を受けている対象のＪＣＶ抗体検出に有用であり得る。

ＶＰ１
ＪＣＶ抗体に対するアッセイにおいてＨＰＶＬＰを使用することは、アッセイ精度を向上させ得、分析的及び診断的目的に適切なアッセイにおいて有用であることが分かった。ＨＰＶＬＰ作製で使用するためのＶＰ１は、当技術分野で公知の方法を用いて生成させることができ、天然ＶＰ１又は組み換え生成ＶＰ１の何れでもよく、例えばＪＣＶウイルス由来のＶＰ１である。一般に、使用されるＶＰ１は、ＪＣＶのＭＡＤ１株由来のＶＰ１である。いくつかの実施態様において、本アッセイで使用されるＶＰ１は、複数のＪＣＶ株由来、例えば、１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３、４及び７の株のうち１以上の株由来のＶＰ１を含む。ＶＰ１、例えば組み換え合成ＶＰ１の調製後、次いで、密度勾配／超遠心法又は一連の化学沈殿段階、濃縮／ダイアフィルトレーション及びイオン交換クロマトグラフィーを含む標準的な生化学の方法を通じて、本明細書中に記載のアッセイで使用するためのＶＰ１をさらに精製する。この精製法には、一般に、単量体ＶＰ１ポリペプチド又は五量体ＶＰ１を含むより小さいタンパク質を除去するための段階が含まれる。例えば１段階で又は２段階で（例えば、第一のろ過段階でＶＰ１単量体を除去し、次いで第二のろ過段階で五量体ＶＰ１粒子を除去する。）、これらのより小さい粒子を除去することができる。このような生化学的精製法は当業者にとって公知である。実施例１及び７は、ＪＣＶ ＶＰ１−ＶＬＰ精製の２種類の異なる方法を提供する。

本発明のある局面によるＨＰＶＬＰ標品（ＨＰＶＬＰ）は、ＶＰ１単量体を大量に含有しない（例えば単量体を除去するために精製されている。）。本発明の別の局面によるＨＰＶＬＰ標品は、ＶＰ１五量体のサイズ以下の（単量体を含む。）形態のＶＰ１分子を大量に含有しない。組み換えＶＰ１又は（例えばウイルス又はウイルスカプシドから単離された）天然ＶＰ１から、本ＨＰＶＬＰを調製することができる。いくつかの実施態様において、ＪＣウイルス由来のマイナーコートタンパク質、例えば、ＶＰ２又はＶＰ３の一方又は両方など、さらなるＪＣＶ成分がＨＰＶＬＰ粒子中に含まれるか又は基質に結合させられる。

あるいくつかの場合において、組み換え発現ＶＰ１は、天然のウイルスカプシドに類似した五量体又はＨＰＶＬＰになるように会合し得ず、例えば、組み換え発現ＶＰ１は、チューブ状又は他の非球形の形状になるように会合し得る。従って、本発明は、形状が実質的に球形であるＨＰＶＬＰを作製する方法に関する。本発明は、標品中のＨＰＶＬＰの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％が天然のＪＣＶカプシドと類似している（例えば正二十面体又は実質的に球形の形状である）ＨＰＶＬＰ標品を含む。いくつかの実施態様において、ＨＰＶＬＰ標品は、標品中、天然のＪＣＶカプシドに類似している少なくとも１０％、１５％、２０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％のＨＰＶＬＰを含有する。このような方法は、このような標品が得られる条件下でウイルスタンパク質を発現させることと、及び／又はこのような標品を作製するために本明細書中で記載のように発現ウイルスタンパク質を単離及び精製することと、を含み得る。

ＨＰＶＬＰを作製する方法
例えば、ＪＣウイルス由来のＶＰ１遺伝子などのＶＰ１遺伝子を発現するベクターでバキュロウイルスを形質転換することによって、ＨＰＶＬＰを作製することができる。バキュロウイルスは、昆虫細胞培養物（例えばＳＦ９細胞）又は哺乳動物細胞培養物及びＶＰ１タンパク質を発現する細胞などの細胞培養物に感染させるために使用される。細胞を溶解し、一連の遠心及び限外濾過段階を通じて粒子を精製することによって、ＨＰＶＬＰを単離する。一般に、スクロースクッション沈殿法、等密度超遠心及び大規模（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）限外濾過又は当業者にとって公知であるその他の方法などの方法を用いて精製を行う。ある種の実施態様において、精製には、スクロースクッションを通じて粒子を２回遠心することが含まれよう。代替的な精製法において、細胞を溶解し、一連の沈殿及び濃縮／ダイアフィルトレーション段階を行い、最後にイオン交換段階を行うことによって、粒子を単離する。

当技術分野で公知の何らかの適切な技術、例えば分析的超遠心、電子顕微鏡、ＰＡＧＥ分析、質量分析、タンパク質濃度又は対照血清を用いたＥＬＩＳＡにおける活性を用いて純度を評価することができる。

ＶＬＰの精製が不十分である場合、バックグラウンドが高くなり、ＪＣＶ抗体レベル又は曝露率の計算値が不当に高くなる。

いくつかの実施態様において、ＨＰＶＬＰは唯一のＪＣウイルスタンパク質としてＶＰ１を含有する。

いくつかの実施態様において、本ＨＰＶＬＰは異成分からなる粒子であり、従って、ＶＰ１タンパク質及び少なくとも１つのＪＣウイルスのマイナーコートタンパク質、例えばＶＰ２又はＶＰ３を含む。別の実施態様において、本ＨＰＶＬＰは、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を含む。ＶＰ１及びＶＰ２を含むＨＰＶＬＰは、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、同じ又は異なるプロモーターの制御下などで、ＶＰ１及びＶＰ２遺伝子を含む核酸でバキュロウイルスを形質転換することによって作製することができる。細胞培養物にバキュロウイルスを感染させ、その細胞がＶＰ１及びＶＰ２を発現し、両方のタイプのタンパク質を含むＨＰＶＬＰが生じる。ある実施態様において、ＶＰ１及びＶＰ２遺伝子は異なるＤＮＡ分子上にあり、これらのＤＮＡ分子で異なるバキュロウイルスを形質転換し、これらのバキュロウイルスを使用して同じ培養において細胞に形質移入する。この細胞はＶＰ１及びＶＰ２タンパク質を発現し、両方のタイプのタンパク質を含むＨＰＶＬＰが生じる。いくつかの場合において、異成分からなるＨＰＶＬＰは、例えば５個のＶＰ１ポリペプチドにつき１又は２個のＶＰ２ポリペプチドを含む。一般に、ＨＰＶＬＰは、天然のＪＣウイルスの場合のように、ＶＰ２ポリペプチドよりも多くのＶＰ１ポリペプチドを含有する。

例えば、同じ又は異なるプロモーターの制御下で、ＶＰ１及びＶＰ３遺伝子又はＶＰ１及びＶＰ２遺伝子をそれぞれ含む核酸によりバキュロウイルスを形質転換することによって、ＶＰ１及びＶＰ３の両方又はＶＰ１及びＶＰ２分子の両方を含むＨＰＶＬＰを作製することができる。このバキュロウイルスを細胞培養物に感染させ、細胞がＶＰ１及びＶＰ３又はＶＰ１及びＶＰ２を発現し、両方のタイプのタンパク質を含むＨＰＶＬＰが生じる。いくつかの実施態様において、ＶＰ１及びＶＰ３又はＶＰ１及びＶＰ２遺伝子は異なるＤＮＡ分子上にあり、これらのＤＮＡ分子を異なるバキュロウイルスへと形質転換し、このバキュロウイルスを使用して同じ培養において細胞に形質移入する。この細胞は、それぞれＶＰ１及びＶＰ３タンパク質又はＶＰ１及びＶＰ２遺伝子をそれぞれ発現し、両方のタイプのタンパク質を含むＨＰＶＬＰが生じる。ＨＰＶＬＰ粒子は、ＪＣＶカプシドを単離するために使用される方法など、当技術分野で公知の方法を用いてこのような標品から単離することができる。

一般に、異成分からなるＨＰＶＬＰ中にあるＶＰ１五量体は、コンストラクトを作製するためにＶＰ３遺伝子又はＶＰ２遺伝子が使用されたか否かにより、例えば５個のＶＰ１ポリペプチド及び１個のＶＰ３ポリペプチド及び／又は１個のＶＰ２ポリペプチドを含む。一般に、ＨＰＶＬＰ中には、ＶＰ３又はＶＰ２ポリペプチドよりも多くのＶＰ１ポリペプチドがある。いくつかの実施態様において、ＶＰ２又はＶＰ３は、ＪＣウイルスではないポリオーマウイルス由来、例えばＢＫウイルスポリペプチドである。

同じ又は異なるプロモーターの制御下などで、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３遺伝子を含む核酸（例えば環状ＤＮＡ、例えば＜５．５ｋｂ）でバキュロウイルスを形質転換することによって、３つ全てのＶＰ１及びＶＰ２及びＶＰ３分子を含むＨＰＶＬＰを作製することができる。哺乳動物細胞培養物などの細胞培養物にバキュロウイルスを感染させ、この細胞はＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を発現する。結果として３種類全てのタイプのタンパク質を含むＨＰＶＬＰが生じる。ある実施態様において、ＶＰ１遺伝子及び、ＶＰ２及びＶＰ３遺伝子の何れか又は両方は、異なるＤＮＡ分子上にあり、これらのＤＮＡ分子で同じ又は異なるバキュロウイルスを形質転換し、同じ又は別の培養でこれらのバキュロウイルスを細胞に感染させる。この細胞はＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を発現し、両方のタイプのタンパク質を含むＨＰＶＬＰが生じる。異成分からなるＨＰＶＬＰは、例えば５個のＶＰ１ポリペプチドならびにＶＰ２及びＶＰ３ポリペプチド各１個を含み得るが、その比率は標品内でばらつきがあり得る。一般に、ＨＰＶＬＰ中にはＶＰ２及びＶＰ３ポリペプチドよりも多くのＶＰ１ポリペプチドがある。

いくつかの実施態様において、本ＨＰＶＬＰはＶＰ１五量体よりもサイズが大きい。サイズがより大きいとは、ＨＰＶＬＰ粒子に含有されるタンパク質の質量が、ＶＰ１のみを含有する五量体よりも大きいことを意味する。

他の実施態様において、ＨＰＶＬＰの溶液を調製する方法には、ＶＰ１五量体のサイズ以下の粒子（例えばＶＰ１単量体又は小型のＶＰ１含有粒子）を溶液から除去することが含まれ得る。遠心及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの方法を使用して、この精製段階を行うことができる。いくつかの実施態様において、ＶＰ１五量体よりも大きいＨＰＶＬＰの調製において、当技術分野で公知の他の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーを使用することができる。一般に、アッセイでの使用に適切なＨＰＶＬＰ標品は、非ＨＬＶＬＰ粒子に対して、少なくとも２０％のＨＰＶＬＰ、少なくとも２５％のＨＰＶＬＰ、少なくとも４０％のＨＰＶＬＰ、少なくとも６０％のＨＰＶＬＰ、少なくとも６５％のＨＰＶＬＰ、少なくとも７０％のＨＰＶＬＰ、少なくとも８０％のＨＰＶＬＰ、少なくとも８５％のＨＰＶＬＰ、少なくとも９０％のＨＰＶＬＰ、少なくとも９５％のＨＰＶＬＰ又は少なくとも９９％のＨＰＶＰＬを含有する（例えば、ＶＰ１単量体及び５個未満のＶＰ１分子を含有する凝集体に対する五量体の％）。

カットポイント
本発明は、偽陰性及び偽陽性率を低下させるために「カットポイント」を使用する分析方法を提供する。カットポイントは、（例えば生体試料中のＪＣＶ抗体検出のための）ＨＰＶＬＰアッセイから得られるデータ、例えば２つ組みの試験試料及び複数回反復間（例えば、対照試料の少なくとも２回、少なくとも４回又は少なくとも８回の反復）の平均化データに基づき決定される。

本発明によるアッセイの一方法において、第一のＨＰＶＬＰスクリーニングアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイからの結果により、ＪＣＶ特異的抗体を有するか否かについて試験試料が分類されるか又は、その試料がこれらの２つの分類の何れにも入らない場合は、試料に補足的な確認アッセイを課す。例えば、本発明で取り上げられるＨＰＶＬＰ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて定められたレベル未満（例えばｎＯＤ_４５０＜０．１）の結果となる試料は、ＪＣＶ特異的抗体を欠くものとして分類され、ＥＬＩＳＡにおいて定められたレベルを超える結果（例えばｎＯＤ_４５０＞０．２５）を与える試料は、ＪＣＶ特異的抗体について陽性であるものとして分類される。これらの分類（例えば０．１＜ＯＤ４５０＜０．２５）の何れに入るか不明瞭である試料を確認アッセイで試験することができる。

ある実施態様において、以下でさらに詳細に記載するように、この確認アッセイは、プレインキュベーション段階を必要とし、緩衝液（又はその他の適切な溶液）対照と又は（緩衝液又はその他の適切な溶液中で）ＨＰＶＬＰとこの試験試料を予めインキュベーションし、ＨＰＶＬＰ ＥＬＩＳＡでの分析前にＪＣＶ特異的抗体を予め吸着させる。ＨＰＶＬＰと予めインキュベーションした後、緩衝液対照と比較して、第一のアッセイ中の反応低下が４０％未満である場合、その試料は、ＪＣＶ特異的抗体の存在について陰性であると解釈される。ＨＰＶＬＰと予めインキュベーションした後、第一のアッセイの緩衝液対照と比較して、反応の結果が≧４０％の低下を示す場合、その試料はＪＣＶ特異的抗体を含有すると解釈される。いくつかの実施態様においては確認アッセイのみが行われる。

適切なカットポイントを選択し、検証するための方法の例を実施例４で与える。

基質
ＨＰＶＬＰアッセイ方式に対して何らかの適切な固体基質を使用することができる。いくつかの実施態様において、基質はマイクロタイタープレート（例えば９６ウェルプレート）スライド、ビーズ又はカラムである。基質は発色又は化学発光検出法に適切であり得る。

アッセイ
ＨＰＶＬＰで被覆されている基質に生体試料を添加することによってアッセイを行い、当技術分野で公知の方法を用いて検出する。一般に、マイクロタイタープレート（例えば９６ウェルプレート）などの固体ベースのプラットフォームを使用するが；当技術分野で公知の他の方式を使用することができる。いくつかの実施態様において、アッセイで使用する前に生体試料を希釈する。

ある種の実施態様において、本アッセイ方式は酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。概して、本方法は、通常、ＨＰＶＬＰなどの捕捉抗原で基質を被覆することと、捕捉試薬に対する結合抗体を含有する試料をインキュベーションすることと、非特異的結合種を除去するために洗浄することと、例えば発色又は化学発光アッセイにより、結合した免疫複合体を検出することと、を含む。発色性の基質は有色の最終生成物を生じさせ、目視で又は分光光度計を使用して、これを検出又は測定することができる。化学発光基質は光を生じさせ、この光は照度計を用いて測定することができる。

ＨＰＶＬＰでプレートを被覆することは、一般に、一晩又は指定の時間の何れかで、適切な濃度（例えば１μｇ／ｍＬ）のＨＰＶＬＰ溶液とともに固体基質（マイクロタイタープレートのウェルなど）をインキュベーションすることを含む。本ＨＰＶＬＰは、唯一のＪＣＶウイルス成分としてＶＰ１を含み得るか又は本ＨＰＶＬＰは、１粒子あたりＶＰ２又はＶＰ３のうち少なくとも１つ又は１粒子あたりＶＰ２及びＶＰ３を少なくともそれぞれ１つ含有する異成分からなる粒子であり得る。ＨＰＶＬＰで被覆した後、プレートのウェルを洗浄する。次に、試験しようとする試料に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質で基質を被覆する。適切な被覆材料は当技術分野で公知であり、これにはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又は粉乳の溶液が含まれる。

複合体形成（ＨＰＶＬＰ／ＪＣＶ抗体）を可能にするのに有効な条件下で、準備した基質上で試料又は参照物質をインキュベーションし、結合複合体を形成させる。ヒト抗体に結合し得る標識抗体を用いて、結合複合体の検出を行う。一般に、この標識抗体はヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧ及びＩｇＭを検出し得る。いくつかの場合において、二次又は三次検出法を用いて、本アッセイを行うことができる。

参照試料は、その個体の尿中にＪＣＶ ＤＮＡが存在すること（尿陽性）に基づきＪＣウイルスに感染していることが分かっている個体から分離される同じ生体物質（例えば、血漿、血清、尿又はＣＳＦ）の試料であり得る。参照試料を使用して、アッセイの偽陰性率がｌ％−３％よりも大きくならないようにアッセイカットポイントを定める。

「複合体形成を可能にするのに有効な条件下」とは、一般に、バックグラウンドを低下させ、特定の範囲内にある結果の読み出しが可能となるように試薬が希釈されている条件を意味する。希釈液に対しては、非限定例として、ＢＳＡ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はＴｗｅｅｎ含有ＰＢＳを含む溶液が挙げられ得る。

「適切な」条件にはまた、効果的な結合を可能にするのに十分な温度及び／又は時間である条件も含まれる。インキュベーションは、一般に、およそ２５℃から２７℃の温度で約１時間から２時間もしくは１から４時間、又は約４℃で一晩であり得る。しかし、当技術分野の者にとって当然のことながら、他の条件が適切な場合もある。

一般に、本アッセイのインキュベーション間に１回以上の洗浄が行われる。適切な洗浄溶液としては、希釈緩衝液（例えば、ＰＢＳ又はＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）又はホウ酸緩衝液が挙げられる。

一般に、ＨＰＶＬＰに結合した抗体の検出は、当技術分野で周知の方法を用いて行われる。一般に、このような方法は、放射性、蛍光、生物学的又は酵素タグなどの標識又はマーカーの検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許としては、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号及び同第４，３６６，２４１号が挙げられる。一般に、ＪＣＶ抗体結合の検出は、標識されている二次抗体を用いて検出される。一般に、この二次抗体は、ヒトＩｇＧの検出に特異的である。例えば可視スペクトル分光光度計を用いてなど、発色の度合いを測定することによって、定量を遂行する。

実施例２は、本アッセイを行う方法を例示するが、当技術分野の者は、適切な改変が行われ得ることを理解するであろう。

ある実施態様において、本アッセイは、生体試料を患者から得る施設で働いている、医療サービス提供者、例えば医師、看護師又は技術者などにより、診療所で行われる。別の実施態様において、患者から得られる生体試料をアッセイが行われる別の機関に、例えば第三者機関に運ぶ。後者の場合、郵送によるか又は電子媒体（例えばファクシミリ又はｅ−メールを通じて）によるか又はオンラインデータベースを通じて提示できる形態などを通じて、アッセイ結果を医療サービス提供者に報告することができる。ある実施態様において、（スクリーニングアッセイ及び場合によっては確認アッセイを含む）本アッセイの結果をデータベースに保存することができ、医療サービス提供者はワールドワイドウェブなどを通じてアクセスすることができる。

二次的試験
いくつかの場合において、例えば、試料中のＪＣＶ抗体レベルが、指定の「曖昧な範囲」又は「不確定範囲」に入るとき、例えばＪＣＶ抗体の有無に関して確信度が限定的であると判断される場合、その試料の二次的試験（本明細書中で「確認アッセイ」とも呼ぶ。）が使用される。この二次的試験の場合、生体試料の２つの分注液を使用する。一定時間（例えば、３０分間、１時間又は４℃で一晩など、より長く）、溶液中、アッセイ緩衝液の存在下で試料を予めインキュベーションすることによって、本アッセイでの使用前に第一の分注液を調製する。一定時間（例えば、３０分間又は１時間以上）、溶液中、ＨＰＶＬＰの存在下で試料を予めインキュベーションすることによって、本アッセイでの使用前に第二の分注液を調製する。次に、本明細書中で記載のようなＨＰＶＬＰアッセイにおいてこの２つの分注液を使用し、その試料がＪＣＶ抗体陽性であるか又は抗体陰性であるかの判定を行う。溶液中でＨＰＶＬＰとともにインキュベーションした分注液に対するアッセイ結果が、第一のアッセイで緩衝液とともにインキュベーションした第一の分注液に対する結果と同じである場合（即ちほぼ同じＯＤ）、その試料は、ＪＣＶ特異的抗体の存在に関して陰性であると解釈される。予めインキュベーションした後（即ち二次的アッセイおいて）、アッセイ結果がより低い場合、その試料はＪＣＶ特異的抗体を含有すると解釈される。

二次的試験を使用する、本発明で取り上げられるアッセイはまた、本明細書中で「２段階試験」又は「２段階アッセイ」とも呼ばれる。

アッセイ結果の報告
いくつかの実施態様において、本アッセイには、参照物質に対するレベル（例えばＯＤ）であり得る読み取り又はＪＣＶ抗体の存在に関して試料が陽性であるか陰性であるか又は不確定であるかの評価である読み取りが含まれる。いくつかの実施態様において、少なくともＨＰＶＬＰと、場合によってはアッセイのためのその他の成分と、を含むキットが提供される。例えば、本キットには、第一のＥＬＩＳＡアッセイ及び二次的確認アッセイを行うためのツールを準備するための、アッセイ陽性及び陰性対照、緩衝液及び基質（例えばマイクロタイタープレート）が含まれ得る。本キットには、例えば、溶媒又は緩衝液、対照、安定化剤、防腐剤、二次抗体、例えば抗ＨＲＰ抗体（ＩｇＧ）及び検出試薬が含まれ得る。

本ＨＰＶＬＰは、あらゆる形態、例えば、液体、乾燥形態、半乾燥形態又は凍結乾燥形態で、又は凍結状態での保管のための形態で、提供され得る。いくつかの実施態様において、調製されたＨＰＶＬＰは、ペレット化され、半固体形態で保管される。

一般に、ＨＰＶＬＰは無菌的な形態で提供される。ＨＰＶＬＰが溶液として提供される場合、この溶液は一般に水溶液、例えば滅菌水溶液である。本ＨＰＶＬＰが乾燥形態で提供される場合、一般に、適切な溶媒の添加によって再構成を行う。この溶媒は、例えば滅菌緩衝液であり、場合によっては本キット中で提供され得る。

本キットは、本アッセイでの使用に適切な濃度でＨＰＶＬＰを含有するか又は本アッセイで使用するための希釈に関する説明書付きでＨＰＶＬＰを含有する組成物に対して１以上の容器を含み得る。いくつかの実施態様において、本キットは、ＨＰＶＬＰ及びアッセイ成分用の別個の容器、仕切り又は区画及び取扱説明書を含有する。例えば、本ＨＰＶＬＰは、瓶又はバイアル中に含有され得、取扱説明書はプラスチック製の保護ケース又は小型包装中に含有され得る。その他の実施態様において、本キットの個々の要素は、単一の仕切りのない容器中に含有される。例えばＨＰＶＬＰ組成物は、ラベルの形態で取扱説明書が添付されている瓶又はバイアル中に含有される。いくつかの実施態様において、本キットは複数の（例えばパック）個別容器を含み、各容器には、ＨＰＶＬＰの１以上の単位形態（例えば１回のアッセイで使用するためのもの）が含有される。例えば、本キットには、複数のアンプル、ホイル袋又はブリスター包装が含まれ、これらのそれぞれには、スクリーニング又は確認アッセイで使用するための１回単位のＨＰＶＬＰが含有される。本キットの容器は、気密性及び／又は防水性があり得る。この容器には使用のためにラベルが付され得る。

ある実施態様において、本キットは、本アッセイを行い、解釈するための取扱説明書を含み得る。別の実施態様において、本キットは、例えば治療センター又は医療サービス提供者に本アッセイの結果を報告する場合に関する手引書を提供し得る。本キットには、本明細書中に記載のＨＰＶＬＰアッセイの結果を報告するためのフォームならびにこのようなフォームの送付先に関する宛先及び連絡先の情報又はその他の情報；又はオンラインデータベース又はオンライン申請（例えばａｐｐ）で結果を報告するためのＵＲＬ（統一資源位置指定子、Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌｏｃａｔｏｒ）アドレスが含まれ得る。別の実施態様において、本取扱説明書は、本アッセイの結果に応じて患者が免疫調整薬による治療を受けるべきか否かに関する手引きを含み得る。

本キットの取扱説明書の形態は限定されない。多くの場合、本取扱説明書、例えば取り扱い説明書は、印刷物として、例えば文字情報、図面及び／又は写真、例えばラベル又は刷本として提供される。しかし、本取扱説明書はまた、コンピュータ可読物、ビデオ記録又は音響記録など、他の方式で提供することもできる。別の実施態様において、本キットの取扱説明書は、連絡先、例えば実際の宛先、ｅ−メールアドレス、ウェブサイト又は電話番号であり、本キットの使用者は、この取扱説明書において、ＨＰＶＰアッセイ及び／又は本明細書中に記載の方法におけるその使用に関する実質的情報を得ることができる。当然のことながら、本取扱説明書は、何らかの方式を組み合わせて提供され得る。

いくつかの実施態様において、アッセイにおいて試料を評価し、読み取り値を提供する、アッセイ提供者、例えばサービス提供者（第三者機関など）又は医療サービス提供者に生体試料が提供される。例えば、ある実施態様において、アッセイ提供者は、血漿、血液又は血清試料などの対象からの生体試料を受け取り、本明細書中に記載のアッセイを用いてその試料を評価し、その試料がＪＣＶ抗体を含有することを判定する。次に、このアッセイ提供者、例えばサービス提供者又は医療サービス提供者は、その対象においてＰＭＬに対するリスクが上昇していると結論付けることができる。本アッセイ提供者は、その対象が、抗ＶＬＡ療法など、例えばナタリズマブなどの免疫調節物質での治療を受ける候補とならないこと又はその対象が、免疫調節物質での治療を受ける候補となるが、その候補が、ＪＣＶ抗体がないと判定される対象と比較して、より厳しい監視を受けるということをさらに判断することができる。例えば、この候補は、ＰＭＬの発現を示し得る症状など、有害症状の発現についてより頻繁に検査を受けることとなろう。

ある実施態様において、アッセイ提供者は、本明細書中に記載のアッセイを行い、対象が検出可能なＪＣＶ抗体を持たないことを判定する。アッセイ提供者は、対象が、ナタリズマブなどの免疫調節物質で治療を受ける候補であることをさらに判定する。ある実施態様において、アッセイ提供者は、医療サービス提供者に、対象が免疫調節物質による治療に対する候補であり、その候補に免疫調節物質を投与するという情報を提供する。

アッセイ提供者は、郵送又は電子媒体により又はオンラインデータベースなどを通じて、何らかの適切な方式で、例えば医療サービス提供者又は患者又は保険会社に、評価の結果及び場合によっては診断、予後診断又は適切な療法選択肢の１以上に関する結論を提供することができる。アッセイ提供者により回収され、提供される情報はデータベースに保存することができる。

本発明を次の実施例によりさらに例示するが、これはさらなる限定とみなすべきものではない。

実施例１：高純度ＶＰ１粒子の合成及び精製
組み換えバキュロウイルスで形質移入したＳＦ９昆虫細胞において、ＪＣＶ又はＢＫＶカプシドタンパク質ＶＰ１からなるＨＰＶＬＰを作製した。ＪＣＶ ＶＰ１含有粒子の場合、ＪＣＶのＭａｄ−１株由来のＶＰ１を発現させる核酸で組み換えバキュロウイルスを形質転換した。この組み換えＶＬＰを回収した後、細胞溶解し、様々な超遠心、界面活性剤での洗浄、限外濾過により精製した。

簡潔に述べると、感染から約３日後に、３０００ｘＧで遠心することによってバキュロウイルス感染細胞を回収し、ＨＰＶＬＰの精製まで凍結保存した。約１００グラムの凍結細胞ペレットを用いて精製を行った。０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２（ＰＢＳ−Ｃ）を補給した５００ｍｌのＰＢＳ中で凍結融解細胞を溶解させた。細胞懸濁液をＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）に２回通すことによってこの細胞を破砕した。８０００ｘＧで１５分間、沈降させることによって、細胞残屑を除去した。上清の体積をＰＢＳ−Ｃで７２０ｍＬに調整し、５ｍＬの４０％スクロースクッション上に添加した。ＳＷ２８ローターで１００，０００ｘＧにて５時間、スクロースクッションを通じてＨＰＶＬＰを２回沈降させた。ＨＰＶＬＰペレットをＰＢＳ−ＣａＣｌ_２中で再縣濁し、次いで０．２５％デオキシコール酸塩で３７℃にて１時間処理し、続いて０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２を補給した４Ｍ ＮａＣｌを４℃で１時間添加した。８０００ｘＧで１５分間遠心することによって沈殿物を除去した。得られた上清を濃縮し、Ｐｅｌｉｃｏｎ−２ ５００，０００Ｍ ＷＣＯ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して限外濾過により緩衝液を交換した。濃縮したＶＬＰをＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）の２５−４０％段階勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、ＭＯ）の中央に添加し、Ｔｙｐｅ ５０．２ローター中、１９０，０００ｇで１７時間にわたりバンドを形成させた。ＶＬＰバンドを回収し、次いで濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ ｓｔｉｒｒｅｄ ｃｅｌｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて、３００，０００ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）膜を用いて、緩衝液を交換した。０．２２μＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルターに通して濃縮物をろ過し、４℃で保存した。この方法で調製したＶＬＰを、本明細書中でＨＰＶＬＰと呼ぶ。ＶＬＰの品質は、全般的にはゲル電気泳動及び電子顕微鏡により判定した。

タンパク質測定のためにＶＬＰを変性させるため、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ及びＳＤＳを最終濃度がそれぞれ２ｍＭ、２ｍＭ及び２％になるように添加した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイを使用することによって、完全に変性したタンパク質の濃度を測定した。

ゲル電気泳動による分析の場合、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）モルホリンエタンスルホン酸−ＳＤＳ緩衝液系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いることによって、２μｇから５μｇの総タンパク質量とするのに十分な体積をプレキャスト４％−２０％ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に添加した。７０ｍＡ／ゲルから８０ｍＡ／ゲルの一定電流で３０分間、このゲルを電気泳動した。蒸留水中の５０％メタノール及び１０％酢酸でタンパク質バンドを固定し、製造者の推奨に従い、市販のコロイド、クマシーブルー試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により可視化した。

電子顕微鏡を用いてＶＬＰを評価した。ＶＬＰ試料をカーボングリッド上に置き、簡潔に述べると、水中で洗浄し、酢酸ウラシルで陰性染色し、乾燥させた。グリッドが見えるようにしてＴｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ ＴＥＭで撮像した。

代替的ＪＶＣ ＶＰ１−ＶＬＰ精製方法は下記の実施例７で与える。

実施例２：ＨＰＶＬＰ抗体アッセイ
本明細書中に記載のＨＰＶＬＰを用いて抗ＪＣＶ抗体に対する高感度アッセイを開発したが、本明細書中でこのアッセイをその様々な実施態様においてＨＰＶＬＰアッセイと呼ぶ。本アッセイの例において、１μｇ／ｍＬの濃度でＨＰＶＬＰを含有する溶液を添加し、プレートを４℃で一晩インキュベーションすることによって、９６ウェルマイクロタイタープレートを準備した。このウェルを希釈緩衝液ですすぎ、次いで室温で１時間、カゼインブロッキング緩衝液によりブロッキング処理し、希釈緩衝液ですすいだ。アッセイ対照及び血清又は血漿試料をアッセイ希釈液中で１：２００希釈した。希釈した試料及び対照をウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションし、希釈緩衝液で洗浄した。ロバ抗ヒト−ＨＲＰ抗体（ＩｇＧ）を用いて検出を行ったが、このロバ抗体をウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。次に、プレートを洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）緩衝液（Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加した。発色を可能にするのに適切な時間にわたり発色させた後（約２０分間）、１Ｎ Ｈ_２Ｓ０_４により反応を停止させ、４５０ｎｍの吸収を読み取った。試料中の抗ＪＣＶ抗体レベルをＯＤ単位として表した。

ＯＤ単位を用いて下記のように本アッセイを解釈し、レベルを判定した。

二次的試験において、未知試料において溶液中でのＨＰＶＬＰとの結合の競合阻害が４０％よりも大きくなった場合、その試料はＪＣＶ＋（ＪＣＶ陽性）であるとみなし、阻害が＜４０％である場合はＪＣＶ−（ＪＣＶ陰性）であると評価した。

最初に、ＯＤ値がカットポイントＯＤ（平均陰性対照ＯＤｘ１．２３）よりも大きい試料をＪＣＶ抗体の存在について陽性であるとし、一方で、ＯＤ値がカットポイントＯＤ以下である試料を陰性とした。

本アッセイで使用した対照は、目標ＯＤ及び特異性（特異性（上述）については二次的確認アッセイで決定）に基づき選択し、これには、本アッセイにおいて反応性が高く（目標ＯＤ値が約１．０であるものとして定義される。）、特異性については、ＪＣＶ＞８０％で競合した、プールドナー血清であった陽性対照１と；アッセイにおいて反応性が低く（本アッセイにおいて目標ＯＤ値が約０．２５であるものとして定義される。）、特異性については、ＪＣＶ＞８０％で競合したプールドナー血清を含有した陽性対照２と；アッセイにおいて緩衝液対照と同等の反応性を有し、目標ＯＤ値がおよそ０．０７（アッセイ緩衝液はおよそ０．０４５のＯ．Ｄ．値を有することに注意）であるプールドナー血清であった陰性対照と、が含まれた。

いくつかの場合において、滴定アッセイを行い、複数の希釈率で陽性試料を試験し、カットポイントＯＤよりも大きい値を与える最大希釈率をＪＣＶ ＩｇＧ力価として定義した。

特異性、精度、マトリックス干渉、ロバスト性及び試薬安定性の観点から本アッセイを検証した。

実施例３：二次的確認アッセイ
いくつかの場合において、上述の試験に加えて二次的確認アッセイ（二次的アッセイ）を行った。確認アッセイにおいて、このアッセイでの使用前に、室温で１時間、ＨＰＶＬＰとともに試料（血漿又は血清）をインキュベーションした（最終ＶＬＰ濃度＝１μｇ／ｍＬ；最終試料希釈率＝１：２００）。アッセイ緩衝液中で及びＨＰＶＬＰ不含状態で対照試料をインキュベーションした。次に上述のようにこのアッセイを行った。％ｎＯＤ_４５０阻害を％阻害＝１００ｘ［１−（平均ｎＯＤ_４５０）（ＪＣＶ ＭＡＤ−１ ＶＬＰプレインキュベーション試料）÷（平均ｎＯＤ_４５０）（緩衝液とのインキュベーション試料）］として計算した。

このアッセイの結果が、緩衝液とのプレインキュベーション後、第一のアッセイでの結果と同じであった場合（即ちほぼ同じＯ．Ｄ．）、その試料は、ＪＣＶ特異的抗体の存在に関して陰性であると解釈した。このアッセイの結果が、ＨＰＶＬＰとのプレインキュベーション後（即ち二次的アッセイにおいて）、より低かった場合、その試料はＪＣＶ特異的抗体を含有すると解釈した。

実施例４：スクリーニング／確認アッセイカットポイントアルゴリズム
血清学的検査（ＪＣＶ抗体試験）を、２段階アッセイ：スクリーニングＥＬＩＳＡ及び補足的な確認ＥＬＩＳＡ（二次的アッセイ）として構成した。

アッセイプレート、アッセイ実行、分析者間の結果を比較するために、そのプレート上の陽性対照の光学密度（ＯＤ_４５０）値に対して試料結果を正規化し、正規化したＯＤ_４５０を下記のように報告した。

ＨＰＶＰアッセイを有用性なものとするために、ワイブル３母数混合分布モデルを用いてカットポイントを得た。これらの決定において、次の定義を用いた。
スクリーニングアッセイ正規化ＯＤ（ｎＯＤ）＝ａｖｇ（試料＿ＯＤ＿２つ組）／ａｖｇ（ＰＣ１＿ＯＤ＿反復）；
例えば：
平均（試料＿ＯＤ＿２つ組）＝０．６０
平均（陽性対照１ＯＤ＿反復）＝１．２０
正規化ＯＤ＝０．６０／１．２０＝０．５０。
確認アッセイの場合、
確認アッセイ％阻害＝１００％ｘ（１−（競合＿試料＿ＯＤ／非競合＿試料＿ＯＤ））

補足的な確認ＥＬＩＳＡにおいて、スクリーニングＥＬＩＳＡで試料を評価する前に、可溶性ＨＰＶＬＰを使用して、試料中のＪＣＶに対する高親和性抗体を予め吸着させた。ＨＰＶＬＰで試料を予め吸着させた後、スクリーニングＥＬＩＳＡでの反応性の低下を調べるために、％阻害として結果を計算した。
［％阻害＝１００ｘ［１−（平均ｎＯＤ_４５０ＨＰＶＬＰ予インキュベーション試料）÷（平均ｎＯＤ_４５０緩衝液とのインキュベーション試料）］。

偽陽性及び偽陰性率を次のように定義した。偽陰性率は、本アッセイによって抗体陰性であると判定される真のＪＣウイルス陽性試料の割合である。血清陽性率は、血清陽性であると判定される試料の割合である（即ち、抗ＪＣＶスクリーニング／確認カットポイントアルゴリズムを用いて判定した場合、ＪＣＶ抗体を有する。）。

ＳＡＳｖ９を用いてデータを分析した。正規分布を示さないデータは、マン−ホイットニーＵ検定により分析した。試料サイズに応じて、ピアソンのχ２検定又はフィッシャーの直接確率検定を用いて、カテゴリーデータを分析した。ピアソンの相関係数を使用して、ｎＯＤ_４５０と尿中ＪＣＶ ＤＮＡレベルとの間の関係を評価した。検定は全て、０．０５のαレベルの両側検定であった。血清陽性率及び偽陰性率に対する信頼限界は、１０，０００ブーストラップを用いて、ブーストラップパーセンタイル法（６）により得た。

実施例４（ａ）：ＪＣＶに対する血清反応性
ＭＳ患者において抗ＪＣＶ抗体を検出するための及びＰＭＬリスク層別化のための本アッセイの潜在的な臨床的有用性の予備評価を行うためのアッセイを確立するために、試験を行った。ヒトにおける感染性病原体に対する抗体反応の特徴を調べるために、感染及び非感染個体の両方由来の参照血清を有することは重大であった。ＪＣＶ感染は無症候性の性質があるために「真の」陰性個体を同定するのが不可能となっているが、一方で出願者らは、「尿陽性」個体の尿中ＪＣＶ ＤＮＡを測定することによって、「真の」陽性個体の集団を同定することができた。

定量限界５００コピー／ｍＬ及び検出限界５０コピー／ｍＬで、尿中ＪＣＶ ＤＮＡレベル（ＳＴＲＡＴＡ（ナタリズマブ投与再開）臨床治験プロトコールにおいて回収）を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＰＣＲ）アッセイ（ＶｉｒａＣｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ、Ｌｅｅ’ｓ Ｓｕｍｍｉｔ、ＭＯ）により測定した。

血清学的反応の分布を調べるために、２０４名のＪＣＶ尿陽性患者由来の試料を含む８３１名のＭＳ患者血清試料の抗ＪＣＶ抗体状態をスクリーニングＥＬＩＳＡにおいて抗ＪＣＶ抗体に対して最初に評価した。尿ＤＮＡ状態によるアッセイ結果から、ＪＣＶ ＩｇＧ反応性の、重複するが確かに区別できる２つの集団の存在が示された（図１）。ＪＣＶ ＤＮＡ尿陽性ＭＳ患者に対する反応性の中央値レベル（ｎＯＤ_4５０＝０．８９５）は、ＪＣＶ ＤＮＡ尿陰性ＭＳ患者に対するものよりも有意に高く（ｎＯＤ_４５０＝０．１３１；ｐ＜０．００１）、アッセイ反応性が０．１０のｎＯＤ_４５０を下回った尿陽性患者はいなかった。従って、下部アッセイカットポイントをｎＯＤ_４５０ ０．１０としたところ、陰性範囲において実験的な偽陰性率は０％であった。

尿中に検出可能なＪＣＶ ＤＮＡがない（尿陰性）患者の多くは、尿陽性患者と同じ血清反応性があった。これらの結果は、尿中ＪＣＶ ＤＮＡ試験によって全てのＪＣＶ感染個体を検出することはできないであろうという仮説と一致する。

実施例４（ｂ）：尿中ＪＣＶ ＤＮＡの負荷及び血清学的活性
ウイルス複製が低レベルであるＪＣＶ感染患者では血清抗体レベルが低く、血清学的アッセイで検出されない可能性（偽陰性の可能性）があるという潜在的な懸念に対処するために、ウイルスレベルと抗体反応性との相関関係を調べた。図２は、２０４名のＪＣＶ ＤＮＡ尿陽性ＳＴＲＡＴＡ患者からのデータを示し、ｎＯＤ_４５０が０．６０を下回る試料において尿中ＪＣＶ ＤＮＡレベルと抗ＪＣＶ抗体レベルとの間に検出可能な関係がないことを示す（ピアソンの相関係数＝０．０４８、ｐ＝０．７５ｌ）。この結果は、尿及び血清が同じＳＴＲＡＴＡ試験の時間点で回収されたとしても当てはまる（ピアソンの相関係数＝０．００２、ｐ＝０．９９３）。ｎＯＤ_４５０＞０．６０では、ＪＣＶ ＤＮＡコピー／ｍＬが大きい個体由来の血清試料の割合が高いほど、高いｎＯＤ_４５０値を示すという、より強い相関関係が観察され、これは文献での報告と一致する（例えば、Ｅｇｌｉら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９：８３７−８４６、２００９）。これらのデータから、血清陰性という結果は、ウイルスレベルが非常に低いためではなく、ＪＣＶ感染がないためであると考えられることが示唆される。

実施例４（ｃ）：ＢＫＶ−ＪＣＶ交差反応性の評価
偽陰性率を０％に調節する、単一で控えめなカットポイントを設定すると、ＶＰ１カプシドタンパク質においてＪＣＶと高い同一性を共有する、抗ＢＫＶ抗体など、他のよくあるポリオーマウイルスと交差反応する抗体の検出（偽陽性）が排除されないと思われる。さらに、このような抗体交差反応性は、ＨＰＶＬＰでＥＬＩＳＡプレート上を直接被覆する場合、保存的ウイルスエピトープの曝露を通じて起こり得る。ＢＫＶ及びＪＣＶとの二重感染がヒトにおいて起こり得、ＢＫＶに感染しているがＪＣＶに感染していない患者を確実に同定することはできないので、ＢＫＶ又はＪＣＶの何れの天然感染も起こり得ない種であるウサギにおいて交差反応性の問題を調べた。

アジュバントなしでリン酸緩衝食塩水中のタンパク質を皮下注射することによって、ＢＫＶでウサギに免疫付与し、続いて３ヶ月間、３回の免疫促進注射を行った。ＪＣＶ又はＢＫＶへの直接結合に関してＥＬＩＳＡによって血清試料をアッセイした。ＢＫＶ免疫付与ウサギ由来の抗血清は、高親和性（ＥＣ５０＝１：１００，０００）でＢＫＶ ＶＬＰに結合し、低親和性でＨＰＶＬＰと交差反応した（ＥＣ５０＝１：５，０００）。免疫前の血清は反応性を示さなかった。あるウサギからの代表的データを図３で示す。

ＢＫＶ抗体はＪＣＶと交差反応し、従って抗ＪＣＶアッセイにおいて偽陽性シグナルを生じさせたので（図３）、ヒトにおいてＪＣＶに対して反応性が低レベルであることは、ＪＣＶと交差反応して偽陽性シグナルを生じさせる、低親和性抗ＢＫＶ抗体に相当し得る。

実施例４（ｄ）：ＪＣＶ特異的抗体反応の測定（補足的確認ＥＬＩＳＡ）
低親和性である可能性がある交差反応性抗体を有する者とＪＣＶ特異的抗体を有する患者を区別するために、可溶性ＨＰＶＬＰ（二次的アッセイ）を用いて競合ＥＬＩＳＡを開発した。ＪＣＶ特異的高親和性抗体は、より効率的に可溶性抗原が競合すると予想されたが、その一方、低親和性抗体は、溶液中でＪＣＶ抗原とともに形成される複合体から分離し得、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するＪＣＶ ＶＬＰと結合し得る。尿陽性（ｎ＝２０４）及び尿陰性（ｎ＝３１１）患者由来の５１５検体の血清試料のサブセットは、可溶性ＪＣＶ ＶＬＰ又はアッセイ緩衝液の何れかにより予め吸着させた後、ＥＬＩＳＡにおける評価のために、系統的にかつ非比例的に抽出した。図４Ａ及び４Ｂにおいて、スクリーニング及び確認アッセイにおける尿陰性又は尿陽性患者由来の血清試料の反応性を並べて示す。ＪＣＶ反応性が強い試料は、可溶性ＪＣＶによる抗体の吸着を予め行うことにより大きく阻害されたが、一方、ＪＣＶ抗体レベルが低い試料は、異なる競合を示した。殆どの尿陽性患者における抗体反応で強い競合が起こった（図４Ｂ）。これらの結果により、かなりの割合のＪＣＶに対する低血清反応性が、ＪＣＶに非特異的な抗体の交差反応性によるものであり得るという考え方が支持される。

確認ＥＬＩＳＡにおける血清反応の分布は、２つの別個のピークから構成され、これは最適に４０％阻害で分けられ（図５Ａ）、これは尿陽性試料の反応分布の下から５パーセンタイルにほぼ対応する（図５Ｂ）。従って確認ＥＬＩＳＡに対するカットポイントとして４０％阻害レベルを選択した。

実施例４（ｅ）：最終的な２段階抗ＪＣＶ血清学的アッセイ
スクリーニング及び確認アッセイを組み合わせることによって、「真の」ＪＣＶ特異的抗体を有する試料を検出する可能性が大きく上昇する。最終分析において、スクリーニングＥＬＩＳＡでｎＯＤ_４５０値が＜０．１０である試料は、ＪＣＶ抗体に対して陰性とみなされ、スクリーニングＥＬＩＳＡでｎＯＤ_４５０値が＞０．２５である試料は、ＪＣＶ抗体に対して陽性とみなされる。０．１０から０．２５の間のｎＯＤ値の反応性がある試料を確認ＥＬＩＳＡでさらに試験した。確認ＥＬＩＳＡにおいて、＞４０％阻害を示す全試料が陽性として分類される（図４）。ｎＯＤ_４５０値＞０．２５において、＞４０％阻害が観察される確率はおよそ９５％であった。

実施例４（ｆ）：ＳＴＲＡＴＡコホートにおけるＪＣＶ血清陽性及び偽陰性率
上記アルゴリズムに基づき、ＳＴＲＡＴＡ母集団における血清陽性率は５３．６％と推定され、ブートストラップにより定められた９５％信頼限界で４９．９％から５７．３％の範囲であった［０．５３６＝０．４５１（スクリーニングＥＬＩＳＡ ｎＯＤ_４５０＞０．２５の確率）＋０．０８５（スクリーニングＥＬＩＳＡ ｎＯＤ_４５０が０．１０から０．２５の間に入り、補足的な確認ＥＬＩＳＡ％−阻害が＞４０％となる確率）］。この血清陽性率の計算から、０．１０から０．２５のｎＯＤ領域において、等しい割合の尿陽性及び尿陰性対象由来試料で抗ＪＣＶ抗体が確認されると推測され（パーセント阻害＞４０％）；この推測は、両側のフィッシャーの直接確率検定により支持された（ｐ値は０．７０２）。

２０４名の尿陽性患者のうち、５名のｎＯＤ_４５０が０．１０から０．２５となり、抗ＪＣＶ特異的抗体を有することが確認されなかった（％阻害≦４０％；図４Ｂ）。

実施例５：アッセイ検証
アッセイ検証は、Ｆｏｃｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｃ．（Ｃｙｐｒｅｓ、ＣＡ）が行い、アッセイ間及びアッセイ内の精度、特異性、感度及びアッセイ試薬及び対照の安定性を含む性能パラメータが明らかになった。アッセイ間及びアッセイ内の精度、特異性、感度及びアッセイ試薬及び対照の安定性を含む性能パラメータが明らかになった。精度パラメータは、アッセイ対照の独立標品を用いて、４つの異なる日付で、血漿及び血清の両方において３名の独立した分析者により評価した。アッセイ特異性を明らかにするために、健康なボランティア又はＭＳ患者（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）（ナタリズマブ）未摂取）由来の１０検体の個別の血清及び血漿試料をアッセイ緩衝液又は溶液中の定められた濃度のＨＰＶＬＰ又はＢＫＶ ＶＬＰの何れかとともに予めインキュベーションした。ロバスト性は、試料、複合物に対するインキュベーション時間の上限及び下限を変化させることによって評価し、一貫性のあるアッセイ対照特性を明らかにするために、基質添加段階及び異なるロットのＨＰＶＬＰ被覆試薬を評価した。マトリックス干渉は、予め定められた濃度の抗ＪＣＶ抗体を添加した試料における％回収率を調べることにより、及びＪＣＶ特異的抗体を含有する試料に様々な濃度の無関係のヒトモノクローナル抗体を添加することにより、評価した。

実施例６：ＰＭＬ患者におけるＪＣＶ抗体状態の判定
血漿及び血清試料（一連の回収から無作為に１つ選択した時間点）は、Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ＴＹＳＡＢＲＩ Ｒｅ−ｄｏｓｉｎｇ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（チサブリ再投与及び治療の安全性）（ＳＴＲＡＴＡ）試験の全部で８３１名の患者から得た。ＳＴＲＡＴＡは、オープンラベル、単一群、多国間試験（北アメリカ、ヨーロッパ、オーストラリア及びニュージーランド）であり、この試験では、４８週間にわたり４週間ごとに、静脈内点滴でナタリズマブ３００ｍｇを全患者に投与する。ＳＴＲＡＴＡプロトコールに従い回収した尿試料をＪＣＶ ＤＮＡの存在について分析した。

２００６年６月のチサブリ（登録商標）の製造販売承認から２０１０年２月９日まで、ナタリズマブ治療において３５件のＰＭＬ例が報告された。さらに、ナタリズマブの承認前臨床治験において３件のＰＭＬ例があった（１０、１３、２５）。できる限り多くのＰＭＬ例から、ＰＭＬ診断前の時間点（プレＰＭＬ）の保管試料を得た。血漿又は血清試料が入手できたのは、僅か１１名のナタリズマブ治療ＰＭＬ患者（ＭＳ患者１０名及びクローン病患者１名：表１）からであった。ＰＭＬ診断の１年から３年前に得た血清試料を試験した。登録又は臨床試験に参加した患者からこれらの試料のほぼ全てを回収し、分析まで−７０℃で保管した。とりわけ、上述の血清学的状態スクリーニングＥＬＩＳＡ及び補足的確認ＥＬＩＳＡ（図６Ａ及び６Ｂ）の組み合わせによって、１１名全ての患者（１００％）において抗ＪＣＶ抗体が検出された。フィッシャーの１標本直接確率検定を用いると、この結果は、０．００２のｐ値で、予想された割合（５３．６％）と有意に異なっていた。

これらのデータは、ＰＭＬに罹患するリスクの全体的評価の一部として本発明のアッセイを使用して、対象においてＪＣＶ抗体の有無を判定できることを示す。
表１．入手可能な診断前の血液試料がある１１名のナタリズマブ治療ＰＭＬ患者由来の試料
^＊クローン病；ＳＥＮＴＩＮＥＬ＝Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｂｅｔａ−１ａ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｌａｐｓｉｎｇ Ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（再発寛解型多発性硬化症の患者におけるインターフェロンβ１ａとの併用におけるナタリズマブの安全性及び有効性）；ＳＴＲＡＴＡ＝Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ＴＹＳＡＢＲＩ Ｒｅ−ｄｏｓｉｎｇ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（チサブリ再投与及び治療の安全性）；ｑｄ＝４ｘ日；ｑｗｋ＝１ｘ週間
ＳＥＮＴＩＮＥＬ＝Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｂｅｔａ−１ａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｌａｐｓｉｎｇ Ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（再発寛解型多発性硬化症の患者におけるインターフェロンβ１ａとの併用におけるナタリズマブの安全性及び有効性）；ＳＴＲＡＴＡ＝Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）Ｒｅ−ｄｏｓｉｎｇａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（チサブリ（登録商標）再投与及び治療の安全性）；ＲＯＷ＝世界のその他地域（Ｒｅｓｔ ｏｆ Ｗｏｒｌｄ）；ｑｄ＝４ｘ日；ｑｗｋ＝１ｘ週；^＊ナタリズマブによる前治療及び同時治療の両方。

免疫調節物質を摂取している他の対象からの対数データも評価した（即ち１名から様々な時間に回収した複数の試料）。対数データから、断続的な尿ＤＮＡの排出を試験することとは異なり、抗ＪＣＶ抗体状態を評価するために本ＨＰＶＬＰアッセイを確実に使用できること及び（新規感染なしで）ＪＣＶ抗体状態が比較的安定なままであることが示される。

実施例７：代替的ＪＣＶ ＶＰ１−ＶＬＰ精製法
この方法は、昆虫細胞からのＪＣＶ ＶＰ１−ＶＬＰの精製のための、上述の密度勾配／超遠心方法に対する代替法の例である。このプロトコールの全般的な道筋は、溶解、ベンゾナーゼ処理、デオキシコール酸塩沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及び濃縮／ダイアフィルトレーションであり、ＴＭＡＥフラクトゲルを用いて最終イオン交換段階を行う。

５，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザー細胞破砕器に２回通すことによって、ＪＣＶ−ＶＰ１バキュロウイルスを感染させたＳｆ９細胞をＰＢＳ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２中で溶解させた。低速遠心により細胞残屑を除去し、上清を４０単位／ｍＬベンゾナーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ７１２０６−３）で室温にて１時間処理した。デオキシコール酸塩沈殿段階に対して、１０分の１体積の２．５％デオキシコール酸塩を溶解液に添加し（０．２５％最終デオキシコール酸塩）、溶解液を３７℃で１時間穏やかに撹拌しながらインキュベーションした。同体積の４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＮａＣｌを溶解液に添加し、この溶解液を氷上で１時間インキュベーションした。低速遠心により沈殿物を除去した。次に、４０％硫酸アンモニウムにより上清から沈殿させて夾雑タンパク質を除去した。溶液１Ｌあたり２３２ｇの固体硫酸アンモニウムを用いることによって、最終的に４０％に達した。４℃でこの溶液を穏やかに混合しながら、１回に５分の１量の硫酸アンモニウムを添加し、次の分を添加する前に、１０分から１５分間、各添加物を溶解させた。溶液を４℃で一晩穏やかに撹拌した。低速遠心によって硫酸アンモニウム沈殿物を除去し、０．４５μｍフィルターを用いてＶＰ１含有上清をろ過し、次の段階に持ち込んだ。１００ｋＤａ ＮＭＷＬ ＴＦＦ膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｍｉｎｉ ＵＦ Ｍｏｄ Ｂｉｏｍａｘ−１００Ｃ ０．１ｍ^２、Ｐ２Ｂ１００Ｃ０１）を用いてこの溶液を５倍から１０倍濃縮し、５倍希釈し、出発体積まで２回濃縮することによって、アセンブリー緩衝液（２５ｍＭ ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５）に交換した。＞／＝３６時間、この溶液を４℃で保管した。次に、４０体積のＴＭＡクロマトグラフィー緩衝液（２５ｍＭ ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ８．０）を使用し、５００ｋＤａ ＮＭＷＬ ＴＦＦ膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｍｉｎｉ ＵＦ Ｍｏｄ Ｂｉｏｍａｘ−５００Ｖ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐａｒｔ＃Ｐ２Ｂ５００Ｖ０１）を用いて、この溶液をダイアフィルトレーション処理した。クロマトグラフィーのために、２ｇの出発細胞質量あたりおよそ１ｍＬのレジンが必要である。適切な大きさのＴＭＡＥカラム（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ（Ｍ）−ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔ．１．１０３１６）にタンパク質を添加し、３カラム体積のクロマトグラフィー緩衝液で洗浄した。２５ｍＭ ｔｒｉｓ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ８．０でＶＬＰを溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によりＶＰ１の純度を評価し、電子顕微鏡によりＶＬＰの存在を確認し、沈降速度超遠心分析法によりＶＬＰ形態の総タンパク質の％を調べた。この方法により、約８０％がＨＰＶＬＰであるＨＰＶＬＰ標品であることが分かった。

その他の実施態様
本発明の多くの実施態様を記載してきた。とはいえ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修飾がなされ得ることを理解されたい。従って、他の実施態様が次の特許請求の範囲内に入る。

Claims (40)

1. ａ．対象から生体試料を得ることと；
   ｂ．高純度ＶＰ１粒子（ＨＰＶＬＰ）と該試料中のＪＣウイルス（ＪＣＶ）抗体の結合に適切な条件下で、ＨＰＶＬＰと該試料を接触させることと；
   ｃ．ＨＰＶＬＰに対する該試料中のＪＣＶ抗体の結合レベルを検出することと；
   ｄ．参照用セットと検出レベルを相関させることと、
   を含み、該参照用セットが、偽陰性率が３％以下となるように選択される、
   方法。
2. 前記偽陰性率が１％以下である、請求項１に記載の方法。
3. ＨＰＶＬＰの少なくとも２０％が、ＨＰＶＬＰ中に５個を超えるＶＰ１ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
4. ＨＰＶＬＰの少なくとも７０％が、ＨＰＶＬＰ中に５個を超えるＶＰ１ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＨＰＶＬＰが固体基質上に固定化される、請求項１に記載の方法。
6. ＨＰＶＬＰが基本的にＶＰ１ポリペプチドからなる、請求項１に記載の方法。
7. ＨＰＶＬＰが、ＶＰ２又はＶＰ３のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記ＨＰＶＬＰ中のＶＰ１が組み換えＶＰ１である、請求項１に記載の方法。
9. 前記ＨＰＶＬＰ中の少なくとも１つのＶＰ１が突然変異体ＶＰ１である、請求項１に記載の方法。
10. 前記生体試料が血清である、請求項１に記載の方法。
11. 前記試料が、免疫調節物質を処方されている対象、免疫調節物質を摂取することを検討している対象又は進行性多巣性白室脳症（ＰＭＬ）に罹患している疑いのある対象由来である、請求項１に記載の方法。
12. 前記ＨＰＶＬＰへのＪＣＶ抗体結合の検出が、前記対象においてＰＭＬのリスクが上昇していることを示す、請求項１に記載の方法。
13. 前記ＨＰＶＬＰへのＪＣＶ抗体結合の検出が、前記対象が免疫調節物質での治療を受ける候補ではないことを示す、請求項１に記載の方法。
14. ＨＰＶＬＰへのＪＣＶ抗体結合を検出できないことが、前記対象が免疫調節物質での治療を受ける候補であることを示す、請求項１に記載の方法。
15. ＨＰＶＬＰへのＪＣＶ抗体結合の検出が、前記対象が免疫調節物質での治療を受ける候補であり、免疫調節物質による治療時に有害症状について監視が強化されることを示す、請求項１に記載の方法。
16. 前記有害症状がＰＭＬの発現を示す、請求項１５に記載の方法。
17. 前記免疫調節物質による治療を受けるものと認定された対象が、前記免疫調節物質をさらに投与される、請求項１４に記載の方法。
18. 初回の検査で生体試料がＪＣＶ抗体を有しないと判定された対象が、該初回の検査後、ＪＣＶ抗体の存在について少なくとも年に１回再検査を受ける、請求項１に記載の方法。
19. 生体試料がＪＣＶ抗体を有すると判定された対象が、続いて、後日、ＪＣＶ抗体を有さないと判定される、請求項１に記載の方法。
20. 前記対象が免疫調節物質での治療を受ける候補であると判定される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記対象が、免疫調節物質による治療時に有害症状について監視強化を受ける、請求項２０に記載の方法。
22. 前記免疫調節物質がナタリズマブである、請求項１１又は１３から１５に記載の方法。
23. 免疫調節物質を処方されているか又は免疫調節物質を摂取することを検討している対象が、前記免疫調節物質を以前投与されたことがない、請求項１１に記載の方法。
24. 前記対象が、前記免疫調節物質の投与を以前に１回以上受けている、請求項１１に記載の方法。
25. ｅ．段階（ｂ）の前に、前記対象からの生体試料の一部を溶液中でＨＰＶＬＰと接触させ、段階（ｂ）のＨＰＶＬＰが固体基質に結合され、それにより二次試料が得られ；
    ｆ．（ｂ）と同じ条件下でＨＰＶＬＰと該二次試料を接触させ；
    ｇ．該二次試料中でのＨＰＶＬＰへのＪＣＶ抗体結合レベルを検出し；
    ｈ．該二次試料中のＪＣＶ抗体の検出レベルを、ＨＰＶＬＰなしで該溶液とインキュベーションした場合の該生体試料中の結合レベルと比較することをさらに含み、
    溶液インキュベーション試料と比較して、ＨＰＶＬＰとともに予めインキュベーションした試料における検出レベルが低下していることが、該試料がＪＣＶ抗体陽性であることを示し、検出レベルが不変であることが、該試料中にＪＣＶ抗体がないことを示す、請求項１に記載の方法。
26. ＭＳ及びＣＤ患者における使用について検証された、請求項２５に記載の方法。
27. ＨＰＶＬＰと、ＪＣＶ抗体レベルを特定するためにアッセイを行うための少なくとも１つの試薬と、を含む、キット。
28. 基本的にＶＰ１五量体よりもサイズが大きいＶＰ１含有粒子からなる、ＶＰ１粒子を含む溶液。
29. ＶＰ１五量体以下のサイズであるＶＰ１粒子を溶液から除去する方法を含む、ＶＰ１粒子の溶液を調製する方法。
30. ａ．対象から生体試料を得ることと；
    ｂ．ＨＰＶＬＰへの該試料中のＪＣウイルス（ＪＣＶ）抗体の結合に対して適切な条件下で、高純度ＶＰ１粒子（ＨＰＶＬＰ）と該生体試料を接触させることと；
    ｃ．ＨＰＶＬＰへの該試料中のＪＣＶ抗体の結合レベルを検出することと；
    ｄ．参照用セットと検出レベルを相関させることと、を含み、ＪＣＶ抗体結合が検出される場合は該対象のＰＭＬのリスクが高い、
    ＰＭＬを発現するリスクのある対象を特定する方法。
31. 前記参照用セットが、偽陰性率が３％以下となるように選択される、請求項２９に記載の方法。
32. ａ．対象由来の試料中の抗ＪＣＶ抗体レベルを測定することと；
    ｂ．該試料中の抗ＪＣＶ抗体レベルに従い、該対象に対するリスクレベルを判定することと、を含む、対象においてＰＭＬリスクを特定する方法。
33. 前記対象が、抗ＶＬＡ４治療を受けているか又は抗ＶＬＡ４治療を受けるための候補である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記抗ＶＬＡ４治療がナタリズマブである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記対象が多発性硬化症又はクローン病と診断されている、請求項３２に記載の方法。
36. 前記抗ＪＣＶ抗体レベルが、１段階アッセイ又は２段階アッセイを用いて測定される、請求項３２に記載の方法。
37. 前記１段階アッセイ又は前記２段階アッセイがＥＬＩＳＡアッセイを含む、請求項３６に記載の方法。
38. ｃ．段階（ａ）の初回試料の後の日付からの試料において、前記対象における抗ＪＣＶ抗体レベルを測定することと；
    ｄ．段階（ａ）の初回試料からの試料中のレベルと後日からの試料中の抗ＪＣＶ抗体レベルを比較することと；
    ｅ．段階（ａ）の初回試料の時間と比較して後の日付で該対象のＰＭＬのリスクが上昇しているか否かを判定することと、をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
39. ａ．第一の日付からの試料を用いて対象における抗ＪＣＶ抗体レベルを測定することと；
    ｂ．第一の日付の対象の抗ＪＣＶ抗体レベルに基づきＰＭＬのリスクを判定することと；
    ｃ．第二の日付からの試料を用いて該対象における抗ＪＣＶ抗体レベルを測定することと；
    ｄ．第二の日付の対象における抗ＪＣＶ抗体レベルに基づきＰＭＬのリスクを判定することと、を含む、対象においてＰＭＬリスクを監視する方法。
40. ａ．ＶＰ１核酸を含む細胞を提供することと；
    ｂ．ＶＰ１を発現するための条件下で該細胞を培養することと；
    ｃ．該細胞を溶解することと；
    ｄ．該細胞溶解液をヌクレアーゼで処理することと；
    ｅ．該溶解液から細胞残屑を沈殿させることと；
    ｆ．塩析沈殿によって夾雑タンパク質を除去することと；
    ｇ．ＶＰ１含有上清を濃縮することと；
    ｈ．濃縮したＶＰ１含有上清をダイアフィルトレーション処理することと；
    ｉイオン交換精製によりＶＰ１含有溶液を精製し、それによりＨＰＶＬＰを含む標品を調製することと、
    を含む、ＨＰＶＬＰを含む標品を調製する方法。