BR112012017014B1 - Métodos para detecção de anticorpos de vírus jc - Google Patents

Abstract

métodos para detecção de anticorpos de vírus jc, para preparação de uma solução de partículas de vp1, para identificação de risco de desenvolver leucoencefalopatia multifocal progressiva, para fazer uma preparação, bem como kit, solução e preparação compreendendo partículas tipo virais altamente purificadas (hpvlps). a descrição refere-se a métodos e reagentes para analisar amostras quanto à presença de anticorpos de vírus jc. é divulgado um método que inclui obter uma amostra biológica de um indivíduo (por exemplo, plasma, soro, sangue, urina ou fluido cerebrospinal), contatar a amostra com partículas tipo virais altamente purificadas (hpvlp s) sob condições adequadas para a ligação de um anticorpo de jcv na amostra a uma hpvlp e detectar o nível de ligação do anticorpo de jcv na amostra a hpvlp. em uma modalidade, a determinação do nível de anticorpos de jcv na amostra do indivíduo fornece um método de identificação de risco de pml em um indivíduo.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

Este Pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/294.048, depositado em 11 de janeiro de 2010, e Pedido Provisório US 61/316.193, de 22 de março de 2010, ambos as quais sendo aqui incorporados por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a métodos e reagentes para a análise de amostras para a presença de anticorpos de vírus JC.

ANTECEDENTES

A Leucoencefalopatia Multifocal Progressiva (PML) é uma infecção oportunista do sistema nervoso central (SNC) que está associada com a exposição ao vírus JC (JCV), um vírus polioma que se acredita ser patogênico em humanos apenas sob condições de supressão imune persistente ou modulação imune. Embora a presença de JCV seja necessária para o desenvolvimento de PML, o risco de PML é considerado, de uma forma não bem compreendida, como sendo associado com a convergência de múltiplos fatores virais e relacionado a hospedeiro que faz com que o vírus torne-se patogênico (Major, "Progressive Multifocal Leukoencephalopathy in Patients on Immunomodulatory Therapies" Annu. Rev. Med. 61:35-47 (2010) [31 de Agosto de 2009., Epub antesda publicação])). Estudos publicados sobre a prevalência de infecção por JCV na população humana são variados. Esta informação é baseada em vários tipos de estudos incluindo análise de PCR para o DNA viral e detecção de anticorpos para JCV. Apesar da prevalência de JCV na população, a infecção com JCV raramente resulta em PML, mesmo em indivíduos com imunossupressão documentada.

Relatos publicados sobre a detecção de DNA de JCV sugerem que o método seja insensível e de uso limitado para avaliar a exposição a JCV porque o DNA de JCV tem sido raramente e inconsistentemente detectado no plasma, soro ou células sanguíneas mononucleares periféricas de pacientes com PML infectados por JCV. A detecção de anticorpos anti-JCV parece ser um marcador mais sensível da infecção por JCV, no entanto os resultados relatados são variáveis. Em 1973, Padgett e Walker publicaram um estudo relatando uma soroprevalência de JCV de 65-84% usando um ensaio de inibição da hemaglutinação (HI) (Padgett and Walker, "Prevalence5 of antibodies in human sera agains JC virus, an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy" J. Infect. Dis. 127:467-70, 1973). Relatórios posteriores das taxas de soroprevalências de JCV usando o ensaio HI ou ELISA variaram entre 33-91%. As taxas de soroprevalência variáveis entre esses estudos são provavelmente devido a diferenças marcantes 10 no tamanho e na demografia dos estudos, e, talvez mais importantemente, as diferenças de métodos de ensaio.\ Por conseguinte, é desejável implementar um ensaio confiável esensível para a determinação da presença de anticorpos de JCV que podem » ser usados, por exemplo, para avaliar se um indivíduo foi exposto à JCV

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se ao desenvolvimento de um ensaio sensível, analiticamente validado, para detectar a presença de anticorpos de JCV em um fluido biológico, por exemplo, soro ou plasma.

Assim, a invenção refere-se a um método que incluí a obtenção 20 de uma amostra biológica de um indivíduo (por exemplo, plasma, soro, sangue, urina ou fluido cerebroespinhal (CSF)); o contato da amostra com partículas tipo vírus altamente purificadas (HPVLPs) sob condições adequadas para a ligação de um anticorpo contra JCV na amostra para uma HPVLP; detecção do nível de ligação do anticorpo contra JCV na amostra para HP-VLP; e correlação do nível detectado com uma referência, de tal forma que a referência seja selecionada para indicar uma taxa de falso negativo não maior do que 3% e reatividade cruzada mínima para outros componentes da amostra, tais como anticorpos contra outros vírus polioma, por exemplo, vírus BK (BKV). Em algumas modalidades, a referência, derivada de uma a-mostra de controle ou um conjunto de amostras, é processada com a amostra a partir do indivíduo. Em algumas modalidades, a referência é selecionada de tal modo que a taxa de falsos negativos do ensaio não é maior do que 1%.

Em uma modalidade, pelo menos cerca de 10% dos HPVLPs em uma preparação de HPVLPs purificadas contêm mais do que cinco polipep- tídeos de VP1 por HPVLP. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% das HPVLPs em uma preparação de HPVLPs purificadas contêm mais do que cinco polipeptídeos de VPL por HPVLP.

O ensaio pode ser realizado de tal modo que a HPVLP é imobilizada sobre um substrato sólido, tal como uma placa ou lâmina de microtitu- lação. Em algumas modalidades, a HPVLP consiste essencialmente em proteína viral VP1. A HPVLP pode ainda incluir outras proteínas virais, por e- xemplo, pelo menos um de um VP2 ou um VP3. A(s) proteína(s) viral(is) na HPVLP pode(m) ser derivada(s) de forma recombinante (por exemplo, uma cepa VP1 MAD1) ou pode ser uma proteína viral de ocorrência natural (por exemplo, derivada de uma fonte de ocorrência natural). O método pode ser realizado usando, por exemplo, uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo sendo atualmente tratado com uma fármaco imunomoduladora, um indivíduo considerando o início do tratamento com uma fármaco imunomoduladora, ou um indivíduo suspeito de ter Leucoencefalopatia Multifocal Progressiva (PML).

Em alguns aspectos, o método de ensaio é um ensaio de duas etapas que inclui ainda um processo de ensaio de confirmação secundário que inclui o contato de uma porção da amostra biológica a partir do indivíduo com HPVLP em solução (antes da incubação da amostra com a HPVLP ligada a um substrato sólido), fornecendo, assim, uma amostra secundária; contato da amostra secundária com HPVLP sob as mesmas condições usadas para o ensaio primário; detecção do nível de ligação de anticorpo contra JCV para HPVLP na amostra secundária; e comparação do nível detectado de anticorpo contra JCV na amostra secundária com o nível de anticorpo contra JCV na amostra que não foi pré-incubada com HPVLP solúvel, de tal modo que uma diminuição do nível detectado na amostra de ensaio secun- dário em comparação com a amostra que não foi pré-incubada indica que a amostra é positiva para o anticorpo contra JCV, e uma mudança no nível detectado abaixo de uma porcentagem especificada indica que não há anticorpo específico para JCV presente na amostra.

Um ensaio descrito aqui pode ser usado para ensaiar a presença de anticorpos de JCV em um indivíduo que nunca recebeu tratamento com um imunomodulador, ou em um indivíduo que tenha recebido anterior- mente um imunomodulador, mas que já não está recebendo o tratamento com o imunomodulador, ou em um indivíduo que está presentemente sendo submetido a tratamento com um imunomodulador.

A detecção de ligações de anticorpos de JCV para HPVLPs em um ensaio apresentado na invenção pode indicar que um indivíduo está em um risco aumentado de PML. A detecção de anticorpos de JCV também pode indicar que o indivíduo está um risco aumentado para os sintomas adversos, tais como o desenvolvimento de PML, mediante a administração de certos agentes terapêuticos, tais como determinados imunomoduladores e, portanto, o indivíduo não é um candidato para o tratamento com estes agentes. Por exemplo, a detecção de anticorpos de JCV em uma amostra de um indivíduo pode indicar que o indivíduo não é um candidato para tratamento com um terapêutico anti-VLA-4, tal como natal izumab. Em certas modalidades, a detecção de anticorpos de JCV em uma amostra biológica pode indicar que o indivíduo é um candidato para o tratamento com um imunomodulador, tal como natalizumab, exceto que o indivíduo vai passar por um monitoramento mais intensificado durante o tratamento do que um indivíduo que não possui anticorpos contra JVC detectáveis. Por exemplo, o monitoramento intensificado pode incluir a observação para os sintomas adversos, tais como sintomas que podem indicar o desenvolvimento de PML.

A falha na detecção de ligação de anticorpos de JCV a HPVLPs em um ensaio apresentado na invenção pode indicar que o indivíduo é um candidato para receber tratamento com um imunomodulador, tal como natalizumab, e em uma modalidade, o indivíduo é ainda administrado com um imunomodulador. Um indivíduo determinado como não tendo anticorpos de JCV pode ser re-testado pelo menos anualmente (por exemplo, pelo menos a cada 3 meses, a cada 6 meses, a cada 9 meses, ou a cada 12 meses) para determinar se o indivíduo desenvolveu anticorpos de JCV, o que pode indicar que o indivíduo foi infectado com JCV. Um indivíduo que anterior- mente não teve anticorpos de JCV detectáveis de em uma amostra biológica, e que posteriormente desenvolve anticorpos de JCV em uma amostra biológica, podem deixar de receber o tratamento com um imunomodulador.

Em algumas modalidades, um indivíduo que foi previamente i- dentificado como tendo anticorpos de JCV, pode ser subsequentemente testado em uma data posterior e determinado como não tendo anticorpos de JCV. Estes indivíduos podem ser determinados como candidatos a receberem tratamento com um imunomodulador, como natalizumab. Em uma modalidade, um indivíduo que anteriormente teve teste positivo para a presença de anticorpos de JCV e que subsequentemente teve teste negativo para anticorpos de JCV pode ser administrado com um imunomodulador, e ser submetido a um monitoramento intensificado, em comparação com um indivíduo que nunca teve teste positivo para anticorpos de JCV, tais como para monitorar sintomas que podem indicar o desenvolvimento de PML

Um ensaio apresentado na invenção é útil para o tratamento de um indivíduo que tem um distúrbio ou doença imunológica, tais como a es- clerose múltipla (MS) ou Doença de Crohn (CD). Em uma modalidade, um ensaio descrito aqui foi validado para uso em pacientes com MS e CD, tal como, mostrando que o ensaio é eficaz para detectar anticorpos de JCV em pacientes com MS e CD em um ambiente de teste controlado, tal como em um ensaio clínico.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um kit compreendendo uma HPVLP e pelo menos um reagente para a realização de um ensaio para identificar um nível de anticorpo contra JCV em uma amostra, tal como uma amostra biológica.

Em outros aspectos, a invenção se refere a uma solução compreendendo partículas HPVLP consistindo essencialmente em partículas contendo VP1 que são maiores em tamanho do que um pentâmero de VP1, por exemplo, contendo cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ou 72 pentâme- ros ou contendo cerca de 25 moléculas de VP1, cerca de 50 moléculas de VP1, cerca de 100 moléculas de VP1, cerca de 150 moléculas de VP1, cerca de 200 moléculas de VP1, cerca de 300 moléculas de VP1, cerca de 350 moléculas de VP1 ou cerca de 360 moléculas de VP1.

Outro aspecto apresentado na presente invenção é um método de preparação de uma solução de HPVLPs, o método compreendendo a remoção partículas contendo VP1 a partir da solução que são do tamanho de um pentâmero de VP1 ou menores. Em um método os polipeptídeos de VP1 são expressos em células, por exemplo, em células de inseto ou células de mamíferos. As células são lisadas e, em seguida, as células são tratadas com uma nuclease, tal como benzonase. Os debris celulares são removidos por precipitação, tal como por precipitação com sal (por exemplo, sulfato de amónio) e, em seguida, o sobrenadante contendo VP1 é concentrado e ainda purificado usando diafiltração, tal como por uma ou duas passagens através de uma membrana, por exemplo, uma membrana de filtração de fluxo tangencial (TFF). A solução contendo as partículas contendo VP1, por e- xemplo, HPVLPs é, então, adicionalmente purificada através de uma etapa de troca iônica, e a eluição das HPVLPs é realizada, por exemplo, com um tampão. A pureza de VP1 pode ser avaliada, por exemplo, por eletroforese, (por exemplo, SDS-PAGE) ou espectrometria de massa. A presença de HPVLPs pode ser confirmada por microscopia, por exemplo, microscopia eletrônica. A porcentagem de proteína total na forma de HPVLPs pode ser determinada por ultracentrifugação analítica e velocidade de sedimentação.

Em um aspecto, a invenção apresenta um método de identificação de um indivíduo em risco de desenvolver PML, tal como pela obtenção de uma amostra biológica a partir do indivíduo; contacto da amostra biológica com HPVLPs sob condições adequadas para ligação de um anticorpo de vírus JC (JCV) na amostra para uma HPVLP; detecção do nível de ligação do anticorpo contra JCV na amostra para HPVLPs; e correlação do nível detectado com um conjunto de referência, em que o indivíduo está em risco aumentado de PML se a ligação do anticorpo contra JCV é detectada. O conjunto de referência é selecionado para indicar uma taxa de falsos negativos de cerca de 5%, cerca de 3%, cerca de 1% ou menos.

Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de identificação do risco de PML em um indivíduo pela determinação do nível de anticorpos anti-JCV em uma amostra a partir do indivíduo, tal como a partir de uma amostra de plasma, de sangue ou de soro, e atribuição de um nível de risco para o indivíduo de acordo com o nível de anticorpos anti-JCV presentes na amostra. O indivíduo pode estar recebendo uma terapia imunomodu- ladora, tal como um tratamento anti-VLA4, por exemplo, natalizumab, ou po-de ser um candidato para o recebimento de uma terapia imunomoduladora. Em algumas modalidades, o indivíduo foi diagnosticado com uma doença ou distúrbio imunológico, tais como a esclerose múltipla ou doença de Crohn. Em uma modalidade, o nível de anticorpos anti-JCV é determinado usando um ensaio de uma etapa, e em outra modalidade, o nível de anticorpos anti- JCV é determinado usando um ensaio de duas etapas. Tanto o ensaio de uma etapa quanto o ensaio de duas etapas podem incluir um ensaio ELISA.

Em uma modalidade, o método de identificação de risco PML em um indivíduo inclui ainda determinar o nível de anticorpos anti-JCV no indivíduo em uma amostra a partir de uma data posterior à da amostra inicial; comparar o nível de anticorpos anti-JCV na amostra de data posterior com o nível da amostra a partir da amostra inicial; e determinar se o indivíduo está em risco aumentado de PML em uma data posterior em comparação com o tempo da amostra inicial.

Em um aspecto, a invenção apresenta um método de monitoramento do risco de PML em um indivíduo, o método compreendendo determinar o nível de anticorpos anti-JCV em um indivíduo, usando uma amostra de uma primeira data; atribuir um risco de PML (por exemplo, risco alto, ou moderado ou baixo) com base no nível de anticorpos anti-JCV no indivíduo na primeira data; determinar o nível de anticorpos anti-JCV no indivíduo, u- sando uma amostra a partir de uma segunda data; e atribuir um risco de PML (por exemplo, risco alto, ou moderado ou baixo) com base no nível de anticorpos anti-JCV no indivíduo na segunda data.

Como usado aqui, uma "HPVLP" é uma VLP altamente purificada ("partícula tipo virai") que consiste predominantemente na proteína VP1. Uma "HPVLP" caracterizada na invenção é composta principalmente da proteína de capsídeo maior "VP1", que pode ser uma VP1 de ocorrência natural ou uma VP1 recombinante, a partir do poliomavírus, vírus JC (JCV). Uma HPVLP pode ser composta de, por exemplo, mais do que uma subunidade pentamérica, pelo menos 10 subunidades pentaméricas, pelo menos 20 su- bunidades pentaméricas, pelo menos 30 subunidades pentaméricas, pelo menos 50 subunidades pentaméricas, pelo menos setenta e duas subunidades pentaméricas ou mais de VP1. Uma HPVLP pode conter polipeptídeos de VP1 em uma configuração indeterminada (por exemplo, os polipeptídeos podem ou não ser organizados em pentâmeros), caso em que uma HPVLP pode ser composta por mais de 5 polipeptídeos de VP1, pelo menos 50 polipeptídeos de VP1, pelo menos 150 polipeptídeos de VP1, pelo menos 360 polipeptídeos de VP1 ou mais. As HPVLPs incluem capsômeros, que contêm cerca de 10 a 24 pentâmeros. Uma HPVLP caracterizada na invenção pode se ligar a anticorpos contra vírus JC de ocorrência natural intactos. Em algumas modalidades, uma HPVLP inclui um segundo e, opcionalmente, um terceiro tipo de polipeptídeo que é uma proteína de capsídeo menor de vírus JC, por exemplo, pelo menos um polipeptídeo de VP2 ou VP3. O VP2 ou VP3 pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente ou recombinante.

Tais partículas "altamente purificadas" contêm mais do que um pentâmero de VP1, por exemplo, pelo menos, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 72 pentâmeros de VP1, ou menos de 100 pentâmerosde VP1. Tais partículas altamente purificadas podem ser obtidas, por exemplo, por um método que envolve dupla filtração. Por exemplo, em uma modalidade, uma preparação altamente purificada de VLPs é obtida por purificação das partículas, pelo menos, duas vezes por centrifugação, por exemplo, através de uma almofada de sacarose. Em geral, uma preparação de HPVLP pode ser identificada pela sua atividade em um ensaio de ELISA usando amostras de controle definidas. Em alguns casos, as amostras de controle são controles negativos e/ou amostras de controle contendo níveis baixos de anticorpos de JCV.

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que normalmente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório, incluindo as definições, irá prevalecer. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a serem limitantes.

Os detalhes de um ou mais modalidades da invenção estão estabelecidos nos desenhos anexos e descrição a seguir. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um gráfico que representa os resultados de um ELISA HPVLP em amostras de indivíduos positivos para DNA de JCV na sua urina (Uropositivos) e negativos para DNA de JCV na sua urina (Uronegati- vos). A caixa representa a faixa interquartil (IQR) com a linha mediana no centro; os parênteses representam observações dentro de 1,5 vezes o IQR. Os sinais "+" representam observações além de 1,5 vezes o IQR (estranhos). * teste U de Mann-Whitney.

A figura 2 é um gráfico que representa os níveis de anticorpos anti-JCV como medido por ELISA contra o nível de DNA de JCV urinário como medido por qPCR (n = 204). Círculos abertos representam amostras de urina e de soro coletadas em momentos de STRATA coincidentes. Círculos fechados representam amostras coletadas em momentos diferentes. Para 17 amostras, com resultados de teste de DNA abaixo do nível de quantificação (< 500 cópias/ml) o nível foi definido como o limite de detecção.

A figura 3 é um gráfico que representa dados de reatividade cruzada de BKV-JCV a partir de um coelho imunizado com BKV. Os antissoros de coelho imunizado com BKV ligaram VLPs BKV com elevada afinidade (EC50 = 1:100.000) e reatividade cruzada com JCV VLPs (EC50 = 1:5.000).

As figuras 4A e 4B apresentam a reatividade do ensaio anti-JCV de amostras de soro de pacientes uronegativos (n = 311) (figura 4A) e uro- positivos (n = 204) (figura 4B) no rastreio e confirmação por ELISAs. A distribuição de reatividade serológica das amostras no rastreio por ELISA é mostrada, com os pontos de corte inferioes (nOD4so = 0,10) e superiores (nOD450 = 0,25) destacados (painéis da esquerda). No ELISA de confirmação suplementar (painéis da direita), um ponto de corte de inibição de 40% é destacado (linha vertical) com as regiões sombreadas denotando amostras que não confirmaram ter anticorpos anti-JCV específicos (nOD45o <0,25 e porcentagem de inibição £ 40%).

As figuras 5A e 5B são histogramas que representam a frequência das observações dentro de cada faixa de inibição de 10% para todos os pacientes (n = 515) (figura 5 A) e pacientes uropositivos (n = 204) (figura 5B). A distribuição consistiu em dois picos bem definidos, mais otimamente separados na inibição de 40%. Um nível de inibição de 40% correspondeu a aproximadamente o quinto percentil inferior da distribuição de resposta das amostras uropositivas.

As figuras 6A e 6B são plotagens de valores de nOD45o do rastreio por ELISA (figura 6A) versus os valores percentuais de inibição da confirmação por ELISA (figura 5B) para as 11 amostras pré-PML. As linhas horizontais representam valores de nOD45odeO,10 e 0,25, a linha vertical representa a porcentagem de inibição de 40%.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um ensaio sensível para anticorpos de JCV que minimiza falsos negativos e minimiza a detecção de anticorpos de reação cruzada é útil para a identificação de indivíduos que tenham sido expostos a JCV. A implantação de um tal teste pode ser útil na identificação de indivíduos que têm uma infecção por JCV atual ou tiveram exposição no passado suficiente para JCV desenvolver anticorpos contra o vírus. Tal ensaio também pode fornecer uma ferramenta para auxiliar os médicos com a vigilância clínica de PML e estratificação de risco. Por exemplo, tal teste pode ser útil para praticantes e pacientes, como parte de uma avaliação do risco de um paciente desenvolver PML pela avaliação com precisão de se um indivíduo foi exposto a JCV. Em alguns casos, a análise pode incluir a determinação dos níveis de anticorpos de JCV em uma amostra biológica a partir do paciente.

Certas dificuldades recaem no desenvolvimento de um ensaio ú- til para anticorpos de JCV, por exemplo, o estabelecimento de pontos de corte validados. Os requerentes resolveram este problema usando dados derivados de ensaios de amostras de urina e de plasma de pacientes que são uropositivos ou uronegativos para o DNA de JCV. Outro problema é o desenvolvimento de um ensaio com especificidade e reprodutibílidade. Os requerentes resolveram este problema usando uma partícula contendo proteína virai altamente purificada em um ensaio de anticorpo. Além disso, os requerentes verificaram que o uso de um ensaio secundário para resolver as amostras com resultados ambíguos no ensaio primário melhora a utilidade do ensaio para fornecer um resultado útil para estas amostras.

Por conseguinte, um ensaio analiticamente validado que usa uma partícula tipo virai contendo VP1 altamente purificada (VLP) foi desenvolvido para detectar a presença do anticorpo contra JCV em um fluido corporal, tal como soro, plasma, urina, CSF, ou outros fluidos corporais que contém os anticorpos. Em experimentos para validar o novo ensaio, uma prevalência de aproximadamente 54% de anticorpos de JCV em uma população de pacientes com MS inscritos em um estudo clínico foi identificada. Uma característica fundamental do ensaio aqui descrito é o uso de uma partícula tipo virai altamente purificada (HPVLP).

Uma vantagem do ensaio aqui descrito é que ele tem uma taxa de falsos negativos relativamente baixa, por exemplo, uma taxa de falsos negativos de cerca de 10%, cerca de 8%, cerca de 6%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 1% ou menos para a detecção de anticorpos para JCV. Em geral, o ensaio tem uma taxa de falsos negativos de apenas cerca de 3% ou menos para a detecção de anticorpos para JCV. Tal como descrito aqui o novo ensaio pode ser usado para monitorar a taxa de soroconversão para JCV. Por exemplo, o ensaio tem sido usado para identificar uma taxa de so- roconversão anual de não mais do que cerca de 2% em uma coorte de indivíduos testados que eram inicialmente negativos para o anticorpo contra JCV. Isto demonstra que o ensaio pode ser útil para monitorar o estado de exposição a JCV de um indivíduo ao longo do tempo.

O ensaio pode ser usado para a detecção de anticorpos de JCV em qualquer indivíduo humano, incluindo um indivíduo considerando o tratamento com um imunomodulador, por exemplo, uma terapia anti-VLA-4 (por exemplo, natalizumab), uma terapia anti-CD20 (por exemplo, rituximab), uma terapia anti-CDHa (por exemplo, efalizumab), ou micofenolato de mofetila; em um indivíduo sendo tratado atualmente com um imunomodulador, ou um indivíduo que tenha cessado o tratamento com um imunomodulador. O ensaio pode ser útil para outros que podem ser suscetíveis a PML, tais como indivíduos com distúrbios linfoproliferativos, tais como mieloma múltiplo ou um linfoma, indivíduos infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), ou com síndrome de deficiência imune adquirida (AIDS), malignidades hematológicas, ou uma doença autoimune, tais como lúpus eritematoso sistêmico (SLE), uma doença inflamatória do intestino, como a doença de Crohn (CD) ou colite ulcerativa, esclerose múltipla (MS) ou artrite, por exemplo, artrite reumatóide (RA). O ensaio também pode ser útil para indivíduos que receberam terapias imunossupressoras ou imunomoduladoras, tais como pacientes com transplantes. Terapias imunossupressoras ou imunomo-duladoras exemplares incluem o rituximab, natalizumab, efalizumab, e micofenolato de mofetila. O ensaio pode ser útil para a detecção de anticorpos de JCV em um indivíduo que tem um distúrbio, ou que está sendo tratado com uma fármaco, divulgada em Piccinni et al. "Stronger association of drug- induced progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) with biological immunomodulating agents" Eur. J Clin. Pharmacol. 66:199-206, 2010, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.VP1

Foi verificado que o uso de HPVLPs em um ensaio para anticorpos de JCV pode melhorar a precisão do ensaio e é útil em um ensaio ade- quado para fins de análise e de diagnóstico. VP1 para uso em HPVLPs produtoras pode ser gerado usando métodos conhecidos na técnica e pode ser VP1 de ocorrência natural ou VP1 produzido de forma recombinante, por exemplo, um VP1 de um vírus JCV. Em geral, o VP1 usado é VP1 de cepa MAD1 de JCV. Em algumas modalidades, o VP1 usado no ensaio compreende VP1 de mais de uma cepa de JCV, por exemplo, de uma ou mais cepas de 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4 e 7. Após a preparação de VP1, por exemplo, VP1 sintetizado recombinantemente, o VP1 para uso nos ensaios descritos aqui é então adicionalmente purificado através de métodos bioquímicos padrões, incluindo os métodos de ultracentrifugação/densidade-gradiente, ou uma série de etapas de precipitação química, concentração/diafiltração e cromatografia de troca iônica. Os métodos de purificação incluem, tipicamente, uma etapa para remover as proteínas menores, incluindo polipeptídeos de VP1 monoméricos, ou pentâmero VP1. A remoção destas partículas menores pode ser feita, por exemplo, em uma etapa ou em duas etapas (por exemplo, uma primeira etapa de filtração para remover monômeros de VP1 e, em seguida, uma segunda etapa de filtração para remover partículas de pentâmero de VL1). Tais métodos bioquímicos de purificação são conhecidos por aqueles versados na técnica.

Os Exemplos 1 e 7 fornecem dois métodos diferentes de purificação de JCVVP1-VLP.

Uma preparação de HPVLP (HPVLPs) de acordo com um aspecto da presente invenção não contêm quantidades significativas de mo- nômero de VP1 (por exemplo, foi purificada para remover monômeros). Uma preparação de HPVLP de acordo com outro aspecto da presente invenção não contêm quantidades significativas de moléculas de VP1 em configurações do tamanho de um pentâmero de VP1, ou menores (incluindo o monô- mero). A HPVLP pode ser preparada a partir de VP1 recombinante ou VP1 de ocorrência natural (por exemplo, isolada do vírus ou do capsídeo do vírus). Em algumas modalidades, os componentes de JCV adicionais, tais como uma ou ambas as proteínas de revestimento menores do vírus JC, por exemplo, VP2 ou VP3, são incluídas na partícula de HPVLP ou estão asso- ciadas com o substrato.

Em alguns casos, a VP1 expressa de forma recombinante não pode se conformar em pentâmeros ou HPVLPs que se assemelham a cap- sídeos virais de ocorrência natural, por exemplo, VP1 expressa de forma recombinante pode se conformar em tubos ou outras geometrias não esféricas. Por conseguinte, a invenção se refere a métodos de produção de HPVLPs que têm geometrias substancialmente esféricas. A invenção inclui preparações de HPVLP onde, pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95 %, ou cerca de 99% das HPVLPs na preparação se assemelham ao capsídeo de JCV de ocorrência natural (por exemplo, estão em uma configuração substancialmente esférica ou icosaédrica). Em algumas modalidades, uma preparação de HPVLP contém pelo menos 10%, 15%, 20%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99% das HPVLPs na preparação se assemelham ao capsídeo de JCV de ocorrência natural. Tais métodos podem incluir a expressão de proteínas virais sob condições que resultam em uma tal preparação e/ou isolamento e purificação das proteínas virais expressas como descrito aqui para produção de uma tal preparação.

Métodos para preparação de HPVLP

As HPVLPs podem ser feitas, por exemplo, pela transformação de um baculovírus com um vetor que expressa um gene de VP1, tal como um gene de VP1 a partir de um vírus JC. O baculovírus é usado para infectar uma cultura de células, tais como uma cultura de células de insetos (por e- xemplo, células SF9) ou uma cultura de células de mamíferos, e as células expressam a proteína VP1. As HPVLPs são isoladas pela lise das células, e purificação das partículas através de uma série de etapas de centrifugação e ultrafiltração. Em geral, a purificação é realizada usando métodos tais como sedimentação em almofada de sacarose, ultracentrifugação isopícnica e ul-trafiltração extensa ou outros métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Em certas modalidades, a purificação irá incluir a centrifugação por duas vezes das partículas através de uma almofada de sacarose. Em um método de purificação alternativo, as células são lisadas, e as partículas são isoladas por uma série de precipitação e etapas de concentração/diafiltração com uma etapa de troca iônica final.

A pureza pode ser avaliada usando quaisquer técnicas adequadas conhecidas na técnica, por exemplo, ultracentrifugação analítica, mi- croscopia eletrônica, análise de PAGE, espectrometria de massa, concentração de proteína, ou atividade de uma ELISA com soros de controle. As VLPs insuficientemente purificadas resultam em uma alta base que rende níveis de anticorpos de JCV falsamente altos ou taxas de exposição calcula-das.

Em algumas modalidades, as HPVLPs contêm VP1 como a proteína de vírus JC única.

Em algumas modalidades, as HPVLPs são partículas heterogêneas e, portanto, incluem a proteína VP1, e pelo menos uma das proteínas de revestimento menores de vírus JC, por exemplo, VP2 ou VP3. Em uma outra modalidade, a HPVLP inclui proteínas VP1, VP2 e VP3. Uma HPVLP que inclui VP1 e VP2 pode ser produzida usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, pela transformação de um baculovírus com um ácido nucleico, incluindo um gene de VP1 e VP2, tal como sob o controle de promotores iguais ou diferentes. Uma cultura de células é infectada com o baculovírus, e as células expressam VP1 e VP2 e HPVLPs se formam as quais incluem ambos os tipos de proteínas. Em uma modalidade, os genes de VP1 e VP2 estão em moléculas de DNA diferentes, as moléculas de DNA são transformadas em diferentes baculovírus e os baculovírus são usados para transfectar células na mesma cultura. As células expressam as proteínas VPL e VP2, e forma HPVLPs que incluem ambos os tipos de proteínas. Em alguns casos, uma HPVLP heterogênea irá incluir, por exemplo, um ou dois poiipeptídeos de VP2 para cada cinco polipeptídeos de VP1. Em geral, uma HPVLP irá conter mais polipeptídeos VP1 do que polipeptídeos VP2, como é o caso em vírus JC de ocorrência natural.

Uma HPVLP que inclui tanto moléculas de VP1 quanto de VP3 ou tanto moléculas de VP1 quanto de VP2 pode ser produzida, por exemplo, por transformação de um baculovírus com um ácido nucleico, incluindo um gene de VP1 e VP3 ou um gene de VP1 e VP2, respectivamente, sob o controle de promotores iguais ou diferentes. Uma cultura de células é infectada com o baculovírus, e as células expressam VP1 e VP3 ou VP1 e VP2 e as HPVLPs se formam as quais incluem ambos os tipos de proteínas. Em algumas modalidades, os genes de VP1 e VP3 ou VP1 e VP2 estão em moléculas de D NA diferentes, as moléculas de DNA são transformadas em diferentes baculovírus, e os baculovírus são usados para transfectar células na mesma cultura. As células expressam as proteínas VP1 e VP3 ou VP1 e VP2 genes, respectivamente, e as HPVLPs se formam as quais incluem ambos os tipos de proteínas. As partículas HPVLP podem ser isoladas a partir de tais preparações, usando métodos conhecidos na técnica, tais como os usados para isolar capsídeos de JCV.

Tipicamente, um pentâmero de VP1 que está em uma HPVLP heterogênea irá incluir, por exemplo, cinco polipeptídeos de VP1 e um polipeptídeo de VP3 e/ou um polipeptídeo de VP2, dependendo se um gene de VP3 ou gene de VP2 foi usado para fazer os construtos. Haverá tipicamente mais polipeptídeos de VP1 do que polipeptídeos de VP3 ou VP2 em uma HPVLP. Em algumas modalidades, o VP2 ou VP3 é a partir de um vírus po- lioma, que não é um vírus JC, por exemplo, um polipeptídeo de vírus BK.

Uma HPVLP que inclui todas as três moléculas VP1 e VP2 e VP3 pode ser produzida por transformação de um baculovírus com um ácido nucleico (por exemplo, um DNA circular, por exemplo, < 5,5 kb), incluindo um gene de VP1, VP2 e VP3, tal como sob o controle de promotores iguais ou diferentes. Uma cultura de células, tal como uma cultura de células de mamífero, é infectada com o baculovírus, e as células expressam proteínas VP1, VP2 e VP3. As HPVLPs consequentemente se formam as quais incluem todos os três tipos de proteínas. Em uma modalidade, a VP1, e um ou ambos os genes de VP2 e VP3 estão em moléculas de DNA diferentes, as moléculas de DNA são transformadas em baculovírus iguais ou diferentes, e os baculovírus são usados para infectar as células nas mesmas culturas ou em culturas separadas. As células expressam as proteínas VP1, VP2 e VP3, e as HPVLPs se formam as quais incluem ambos os tipos de proteínas. Uma HPVLP heterogênea pode incluir, por exemplo, cinco polipeptídeos de VP1 e um de cada dos polipeptídeos de VP2 e VP3, embora as razões possam variar dentro de uma preparação. Haverá tipicamente mais polipeptídeos VP1 do que polipeptídeos VP2 e VP3 em uma HPVLP.

Em algumas modalidades, a HPVLP terá tamanho maior do que um pentâmero de VP1. Por tamanho maior, entende-se que a massa de proteína contida em uma partícula HPVLP é maior do que um pentâmero contendo unicamente VP1.

Em outras modalidades, o método de preparação de uma solução de HPVLP pode incluir a remoção das partículas de solução (por exemplo, monômeros de VP1 ou partículas contendo VP1 pequenas) que são do tamanho de um pentâmero de VP1 ou menores. Métodos tais como centrifugação e cromatografia de exclusão por tamanho, podem ser usados para executar esta etapa de purificação. Em algumas modalidades, outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia de troca iônica po-dem ser usados na preparação de HPVLPs que são maiores do que um pentâmero de VP1. Em geral, uma preparação de HPVLP adequada para uso em um ensaio irá conter pelo menos 20% de HPVLPs, pelo menos 25% de HPVLPs, pelo menos 40% de HPVLPs, pelo menos 60% de HPVLPs, pelo menos 65% de HPVLPs, pelo menos 70% de HPVLPs e pelo menos 80% de HPVLPs, pelo menos 85% de HPVLPs, pelo menos 90% de HPVLPs, pelo menos 95% de HPVLPs, ou pelo menos 99% HPVPLs em comparação com partículas não HLVLP (por exemplo, pelo percentual de pentâmeros em comparação com monômeros e agregados de VP1 contendo menos do que cinco moléculas de VP1).

Ponto de corte

A invenção fornece métodos de análise que empregam "pontos de corte" para reduzir taxas de falsos negativos e falsos positivos. Os pontos de corte são estabelecidos com base nos dados dos ensaios de HPVLP (por exemplo, para detectar anticorpos de JCV em uma amostra biológica), em média, por exemplo, entre as amostras de teste em duplicata e múltiplas re- petições (por exemplo, pelo menos duas, pelo menos quatro, ou pelo menos oito repetições de amostras de controle).

Em uma versão de um ensaio de acordo com a presente invenção, os resultados de ensaios de rastreio de HPVLP inicial, por exemplo, ensaios de ELISA, farão com que uma amostra de teste seja classificada como tendo ou não tendo anticorpos de JCV específicos, ou, se a amostra não cai sob uma destas duas classificações, em seguida, a amostra irá ser submetida a um ensaio de confirmação suplementar. Por exemplo, as amostras que produzem um resultado em um ensaio de ELISA para HPVLP caracterizadas na invenção com menos que um nível estabelecido (por exemplo, um nOD45o <0,1) serão classificadas como não apresentando anticorpos contra JVC específicos, e as amostras que fornecem um resultado no ELISA maior do que um nível estabelecido (por exemplo, um nOD450 > 0,25) serão classificadas como positivas para anticorpos contra JVC específicos. As a- mostras que não se enquadram claramente uma destas classificações (por exemplo, 0,1 < OD450 < 0,25) podem ser testadas em um ensaio de confirmação.

Em uma modalidade, o ensaio de confirmação requer uma etapa de pré-incubação, onde a amostra de teste é pré-incubada com controle de tampão (ou qualquer outra solução apropriada) ou com HPVLPs (em tampão ou qualquer outra solução apropriada) para pré-adsorver anticorpos de JCV específicos antes da análise em um ELISA para HPVLP, como descrito em detalhe mais abaixo. Depois da pré-incubação com HPVLP, se a reação no ensaio primário diminuir menos de 40% em comparação ao controle de tampão, então, a amostra é interpretada como sendo negativa para a presença de anticorpos de JCV específicos. Se os resultados mostram uma redução £ 40% na reação em comparação com controle de tampão no ensaio primário após a pré-incubação com HPVLP, então a amostra é interpretada como contendo anticorpos contra JVC específicos. Em algumas modalidades, a- penas o ensaio de confirmação é realizado.

Um exemplo de um método para a seleção e verificação de pontos de corte adequados é fornecido no Exemplo 4.

Substrato.

Qualquer substrato sólido adequado pode ser usado para o formato de ensaio de HPVLP. Em algumas modalidades, o substrato é uma placa de microtitulação (por exemplo, uma placa de 96 poços), uma lâmina, um grânulo, ou uma coluna. O substrato pode ser adequado para métodos de detecção cromogênicos ou quimioluminescentes.

Ensaio

Os ensaios são conduzidos por adição de uma amostra biológica a um substrato que tenha sido revestido com uma HPVLP e detectado usando métodos conhecidos na técnica. Em geral, uma plataforma de base sólida é usada tal como uma placa de microtitulação (por exemplo, uma placa de 96 poços); embora outros formatos conhecidos na técnica possam ser usados. Em algumas modalidades, a amostra biológica é diluída antes do uso, em um ensaio.

Em certas modalidades, o formato de ensaio é um imunoensaio ligado à enzima (ELISA). Em termos gerais, o método tipicamente inclui o revestimento do substrato com antígeno de captura, tais como HPVLP, incubando a amostra contendo anticorpos de ligação dirigidos para reagente de captura, lavagem para remover espécies ligadas não especificamente, e detecção dos complexos imunes ligados, por exemplo, por um ensaio cromo- gênico ou quimioluminescente. Os substratos cromogênicos produzem um produto final colorido, que pode ser detectado e medido visualmente ou com o uso de um espectrofotômetro. Substratos quimioluminescentes produzem luz, que pode ser medida usando um luminômetro.

O revestimento de uma placa com uma HPVLP inclui geralmente incubação do substrato sólido (tais como poços de uma placa de microtitulação) com uma solução de HPVLP a uma concentração adequada (por e- xemplo, 1 μg/ml), quer durante a noite ou durante um número de horas determinado. A HPVLP pode incluir VP1 como o único componente virai JCV, ou a HPVLP pode ser uma partícula heteróloga, que contém pelo menos um de VP2 ou VP3 por partícula, ou pelo menos um de cada de VP2 e VP3 por partícula. Após o revestimento com a HPVLP, os poços das placas são lava- dos. O substrato é então "revestido" com uma proteína não específica que é antigenicamente neutra em relação às amostras a serem testadas. Os materiais de revestimento adequados são conhecidos na técnica e incluem albumina de soro bovino (BSA), caseína ou soluções de leite em pó.

A amostra ou referência é incubada sobre o substrato preparado sob condições eficazes para permitir a formação do complexo (HP- VLP/anticorpo JCV), formando assim um complexo ligado. A detecção do complexo ligado é realizada usando um anticorpo marcado que pode se ligar ao anticorpo humano. Em geral, o anticorpo marcado pode detectar IgG humana ou IgG e IgM humanas. Em alguns casos, o ensaio pode ser realizado usando métodos de detecção secundários ou terciários.

Uma amostra de referência pode ser do mesmo material biológico (por exemplo, plasma, soro, urina, ou CSF) isolado a partir de um indivíduo conhecido por ser infectado com o vírus JC com base na presença de DNA de JCV na urina do indivíduo (uropositivo). Uma amostra de referência é usada para estabelecer o ponto de corte de ensaio tal que a taxa de falsos negativos do ensaio não seja maior do que 1 % -3%."Sob condições eficazes para permitir a formação do complexo" significa, geralmente, as condições em que os reagentes foram diluídos para reduzir a obscuridade e fornecer leituras dos resultados que se encontram dentro de uma faixa especificada. Os diluentes podem incluir, em exemplos não limitativos, soluções que incluem BSA, salina tamponada com fosfato (PBS), ou Tween contendo PBS.

Condições "adequadas" incluem também as condições que estão a uma temperatura e/ou por um período de tempo suficiente para permitir a ligação eficaz. As incubações são tipicamente de cerca de uma a duas horas ou de uma a quatro horas, em temperaturas de cerca de 25°C a 27°C, ou podem ser durante a noite a cerca em 4°C. No entanto, aqueles versados na técnica compreenderão que outras condições podem ser adequadas.

Em geral, uma ou mais lavagens são conduzidas entre as incubações do ensaio. As soluções de lavagem apropriadas incluem tampão di- luente (por exemplo, PBS ou PBS/Tween) ou tampão de borato.

Em geral, a detecção de anticorpo ligado a HPVLP é realizada usando métodos bem conhecidos na técnica. Em geral, estes métodos são baseados na detecção de uma marcação ou marcador, tal como um tag radioativo, fluorescente, biológico ou enzimático. Patentes US relativas ao uso de tais marcações incluem, por exemplo, as Patentes US 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241. Em geral, a detecção de ligação de anticorpo contra JCV é detectada usando um anticorpo secundário que é marcado. Em geral, o anticorpo secundário é específico para a detecção de IgG humana. A quantificação é conseguida pela medição do grau de cor gerada, por exemplo, usando um espectrofotô- metro de espectros visíveis.

O Exemplo 2 ilustra um método para realização do ensaio e a- queles versados na técnica compreenderão que modificações adequadas podem ser feitas.

Em uma modalidade, o ensaio é realizado em um consultório médico, tal como por um profissional de cuidados de saúde, por exemplo, um médico, uma enfermeira ou um técnico, trabalhando em uma instalação onde a amostra biológica é obtida a partir de um paciente. Em uma outra modalidade, a amostra biológica obtida de um paciente é transportada para outra instalação, por exemplo, para uma instalação de terceira parte, em que o ensaio é realizado. Neste último caso, os resultados do ensaio podem ser comunicados ao profissional de cuidados de saúde, tais como através de uma forma, que pode ser apresentada por correio ou eletronicamente (por exemplo, através de facsimile ou de e-mail) ou através de um banco de dados on-line. Em uma modalidade, os resultados do ensaio (incluindo o ensaio de rastreio e, opcionalmente, um ensaio de confirmação) podem ser armazenados em uma base de dados e podem ser acessados por um profissional de cuidados de saúde, tais como através da rede mundial.

Teste Secundário

Em alguns casos, por exemplo, quando o nível de anticorpo contra JCV em uma amostra cai em uma designada "zona equívoca" ou "zona indeterminada", por exemplo, onde é determinado que existe certeza limita- da em relação à presença ou ausência de anticorpo contra JCV, um teste secundário (também aqui referido como um "ensaio de confirmação") da amostra é empregado. Para o teste secundário, duas alíquotas de uma a- mostra biológica são usadas. A primeira é preparada antes de seu uso no ensaio por pré-incubação da amostra, na presença de tampão de ensaio em solução por um período de tempo (por exemplo, por 30 minutos, uma hora ou mais, tal como durante a noite a 4°C). A segunda alíquota é preparada antes de seu uso no ensaio por pré-incubação da amostra, na presença de HPVLP em solução por um período de tempo (por exemplo, por 30 minutos, ou uma hora ou mais). As duas alíquotas são, em seguida, usadas no ensaio de HPVLP como aqui descrito, e a atribuição da amostra para anticorpo contra JCV positivo ou anticorpo negativo é feita. Se os resultados do ensaio para a alíquota incubada com HPVLP em solução são os mesmos que para a primeira alíquota incubada com tampão no ensaio primário (isto é, aproximadamente o mesmo OD), então a amostra é interpretada como sendo negativa para a presença de anticorpos de JCV específicos. Se os resultados do ensaio são mais baixos após a pré-incubação (isto é, no ensaio secundário), então a amostra é interpretada como contendo anticorpos de JCV específicos.

Um ensaio apresentado na invenção que usa um teste secundário é também referido aqui como um "teste de duas etapas" ou "ensaio de duas etapas".

Relato dos Resultados do Ensaio

Em algumas modalidades, o ensaio inclui uma leitura que pode ser um nível (por exemplo, OD) em relação a uma referência, ou uma leitura que é uma avaliação de se a amostra é positiva, negativa ou indeterminada para a presença de anticorpos de JCV. Em algumas modalidades, um é fornecido um kit é que inclui pelo menos HPVLP e, opcionalmente, outros componentes para um ensaio. Por exemplo, o kit pode incluir controles positivos e negativos de ensaio, tampões e substratos (por exemplo, placas de micro- titulação) para a preparação das ferramentas para realizar o ensaio de ELISA primário, e o ensaio de confirmação secundário. O kit pode incluir, por exemplo, solventes ou tampões, controles, um estabilizador, um conservante, um anticorpo secundário, por exemplo, um anticorpo anti-HRP (IgG) e um reagente de detecção.

A HPVLP pode ser fornecida em qualquer forma, por exemplo, forma líquida, seca, semisseco, ou liofilizada, ou em uma forma para o armazenamento em um estado congelado. Em algumas modalidades, as HPVLPs preparadas são peletizadas e armazenado em uma forma semissólida.

Tipicamente, as HPVLPs são fornecidas em uma forma que é estéril. Quando a HPVLP é fornecida em uma solução líquida, a solução líquida geralmente é uma solução aquosa, por exemplo, uma solução aquosa estéril. Quando a HPVLP é fornecida como uma forma seca, a reconstituição geralmente é realizada pela adição de um solvente adequado. O solvente, por exemplo, tampão estéril, opcionalmente, pode ser fornecido com o kit.

O kit pode incluir um ou mais recipientes para a composição contendo as HPVLPs em uma concentração adequada para uso no ensaio ou com instruções para a diluição para uso no ensaio. Em algumas modalidades, o kit contém recipientes separados, divisores ou compartimentos para a HPVLP e componentes de ensaio, e o material informativo. Por exemplo, as HPVLPs podem estar contidas em uma garrafa ou frasco, e o material informativo pode estar contido em um pacote ou cobertura de plástico. Em outras modalidades, os elementos separados do kit estão contidos dentro de um único recipiente, não dividido. Por exemplo, uma composição de HPVLP está contida em uma garrafa ou frasco que tem fixo no mesmo o material informativo na forma de um rótulo. Em algumas modalidades, o kit inclui uma pluralidade (por exemplo, um pacote) de recipientes individuais, cada um contendo uma ou mais formas unitárias (por exemplo, para uso com um ensaio) de HPVLP. Por exemplo, o kit inclui uma pluralidade de ampolas, embalagens tipo lâminas, ou embalagens tipo blister, contendo, cada, uma única unidade de HPVLP para uso em um ensaio de rastreio ou confirmação. Os recipientes que contêm os kits podem ser estanques ao ar e/ou à prova de água. O recipiente pode ser rotulado para uso.

Em uma modalidade, o kit pode incluir material informativo para realizar e interpretar o ensaio. Em uma outra modalidade, o kit pode fornecer uma orientação quanto ao local onde a reportar os resultados do ensaio, por exemplo, para um centro de tratamento ou profissional de cuidados de saúde. O kit pode incluir formas para reportar os resultados de um ensaio de HPVLP descrita aqui, e informações de endereço e contato sobre para onde enviar essas formas ou outras informações relacionadas; ou um endereço URL (Uniform Resource Locator) para relatar os resultados em um banco de dados on-line ou uma aplicação on-line (por exemplo, um aplicativo). Em outra modalidade, o material informativo pode incluir orientação em relação se um paciente deve receber tratamento com um fármaco imunomodulador, dependendo dos resultados do ensaio.

O material informativo dos kits não está limitado a sua forma. Em muitos casos, o material informativo, por exemplo, instruções, é fornecido no material impresso, por exemplo, um texto desenho e/ou fotografia impressos, por exemplo, um rótulo ou folha impressa. No entanto, o material informativo também pode ser fornecido em outros formatos, tais como material legível por computador, gravação de vídeo ou gravação de áudio. Em outra modalidade, o material informativo do kit é a informação de contato, por exemplo, um endereço físico, endereço de e-mail, website, ou número de telefone, em que um usuário do kit pode obter informações substantivas sobre o ensaio de HPVP e/ou o seu uso nos métodos descritos aqui. Naturalmente, o material informativo pode também ser fornecido em qualquer combinação de formatos.

Em algumas modalidades, uma amostra biológica é fornecida a um fornecedor de ensaio, por exemplo, um fornecedor de serviços (tal como uma instalação de terceiros) ou um profissional de cuidados de saúde, que avalia a amostra em um ensaio e fornece uma leitura. Por exemplo, em uma modalidade, um fornecedor de ensaio recebe uma amostra biológica a partir de um indivíduo, tal como um plasma, sangue ou amostra de soro, e avalia a amostra usando um ensaio descrito aqui, e determina se a amostra contém anticorpos de JCV. O fornecedor de ensaio, por exemplo, um fornecedor de serviços ou profissional de cuidados de saúde, pode então concluir se o indi- víduo está com risco aumentado de PML. O fornecedor de ensaio pode ainda determinar que o indivíduo não é um candidato para receber o tratamento com um imunomodulador, tal como uma terapia anti-VLA, como natalizumab, ou que o indivíduo é um candidato para receber o tratamento com um imunomodulador, mas o candidato terá um monitoramento intensificado em relação a um indivíduo que é determinado como não tendo anticorpos de JCV. Por exemplo, o candidato será examinado com mais frequência quanto ao desenvolvimento de sintomas adversos, tais como sintomas que podem indicar o desenvolvimento de PML.

Em uma modalidade, o fornecedor de ensaio realiza um ensaio descrito aqui e determina que um indivíduo não tem anticorpos de JCV de- tectáveis. O fornecedor de ensaio determina ainda que o indivíduo é candidato a receber o tratamento com um imunomodulador, tal como natalizumab. Em uma modalidade, o fornecedor de ensaio informa a um profissional de cuidados de saúde que o indivíduo é um candidato para o tratamento com o imunomodulador, e o candidato é administrado com o imunomodulador.

O fornecedor de ensaio pode fornecer os resultados da avaliação e, opcionalmente, as conclusões relativas a um ou mais dos diagnósticos, prognósticos ou opções terapêuticas apropriadas para, por exemplo, um profissional de saúde, ou paciente, ou uma companhia de seguros, em qualquer formato adequado, tal como por correio ou por via eletrônica, ou através de um banco de dados on-line. A informação coletada e fornecida pelo fornecedor de ensaio pode ser armazenada em uma base de dados.

A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como limitantes adicionais.

EXEMPLOS Exemplo 1: Síntese e Purificação de Partículas de VP1 Altamente Purificadas

As HPVLPs consistindo na proteína VP1 do capsídeo BKV ou JCV foram produzidas em células de inseto SF9 transfectadas com um baculovírus recombinante. No caso de partículas contendo VP1 JCV, o baculovírus recombinante foi transformado com um ácido nucleico expressando VP1 da cepa Mad-1 de JCV. A VLP recombinante foi coletada antes da lise celular e foi purificada por ultracentrifugação diferencial, lavagem com detergente e ultrafiltração.

Resumidamente, as células infectadas com baculovírus foram colhidas em cerca de três dias após a infecção por centrifugação a 3000 x G e armazenadas congeladas até purificação de HPVLPs. A purificação foi realizada usando-se cerca de 100 gramas de péletes celulares congelados. As células descongeladas foram lisadas em 500 ml de PBS suplementado com CaCl2 0,1 mM (PBS-C). As células foram rompidas pela passagem da suspensão de células duas vezes através de um microfluidizador tipo Microflui- dizer® Microfluidics. Os debris celulares foram removidos por peletização a 8000 x G durante 15 minutos. O volume do sobrenadante foi ajustado para 720 ml com PBS-C e carregado sobre 5 ml de almofadas de sacarose a 40%. As HPVLPs foram peletizadas duas vezes através das almofadas de sacarose em um rotor SW28 a 100.000 x G durante 5 horas. Os péletes de HPVLP foram ressuspensos em PBS-CaCI2 e, em seguida, tratados com desoxicolato a 0,25% durante 1 hora a 37°C seguido pela adição de NaCl 4 M suplementado com CaCl2 0,1 mM durante 1 hora a 4°C. Material precipitado foi removido por centrifugação a 8000 x G durante 15 minutos. O sobrenadante resultante foi concentrado e o tampão foi trocado por ultrafiltração através de uma membrana tipo Pelicon-2 500.000 MWCO (Millipore). As VLPs concentradas foram aplicadas ao centro de um gradiente de etapa de 25-40% de Optiprep™ (Sigma, St Louis, MO) e em faixas de 190.000 g, durante 17 horas em um rotor 50.2. As bandas de VLP foram coletadas e depois concentradas e o tampão foi trocado em uma célula agitada Amicon (Millipore) com uma membrana de MWCO (peso molecular corte) de 300.000. O material concentrado foi filtrado através de um filtro de PES (Po- lietersulfona) de 0,22 μ e armazenado a 4°C. As VLPs preparadas desta maneira são denominadas aqui HPVLPs. A qualidade de VLP é geralmente determinada por eletroforese em gel e microscopia eletrônica.

Para desnaturar as VLPs para determinação de proteína, EDTA, DTT e SDS foram adicionados até concentrações finais de 2 mM, 2 mM e 2%, respectivamente. A concentração da proteína completamente desnaturada foi determinada usando o ensaio de BCA de Pierce (ácido bicinconíni- co).

Para a análise por eletroforese em gel, um volume suficiente para dar 2 μg a 5 μg de proteína total foi carregado nos géis de poliacrilamida de 4% a 20% pré-moldado (NOVEX, San Diego, CA) usando um sistema de tampão SDS-ácido morfolinoetanossulfônico NuPAGE® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os géis foram submetidos à eletroforese a uma corrente constante de 70 mA/gel a 80 mA/geldurante 30 minutos. As bandas de proteína foram fixas com metanol a 50% e ácido acético a 10% em água destilada e visualizadas com um reagente comercial coloidal azul de Coomassie (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante.

As VLPs foram avaliadas por microscopia eletrônica. As amostras de VLP foram colocadas em grelhas de carbono, brevemente lavadas com água e coradas negativamente com acetato de uranila e deixadas secar. As grelhas foram vistas e imageadas em um Tecnai® G2 Spirit BioTWIN TEM.

Um método de purificação alternativo de JCV VP1-VLP é apresentado a seguir, no Exemplo 7.

Exemplo 2: Ensaio de Anticorpos contra HPVLP

Um ensaio sensível para anticorpos anti-JCV foi desenvolvido usando as HPVLPs descritas aqui e é referido aqui nas suas várias modalidades como um ensaio de HPVLP. Em um exemplo do ensaio, placas de microtitulação de 96 poços foram preparadas por adição de uma solução contendo HPVLP a uma concentração de 1 μg/ml e incubação da placa durante a noite a 4°C. Os poços foram lavados com tampão diluente e, em seguida, bloqueados durante uma hora a temperatura ambiente com tampão de bloqueio de Caseína e lavados com tampão diluente. Os controles de ensaio e as amostras de soro ou plasma foram diluídos 1:200 em diluente de ensaio. As amostras e controles diluídos foram adicionados aos poços e incubados durante uma hora à temperatura ambiente e lavados com tampão diluente. A detecção foi realizada usando anticorpo anti-humano-HRP de burro (IgG), o qual foi adicionado aos poços e incubado a temperatura ambiente durante uma hora. As placas foram então lavadas e tampão TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) (Chromagen, Inc., San Diego, CA) foi adicionado. Depois de um desenvolvimento por um tempo adequado para permitir desenvolver a cor (cerca de 20 minutos), a reação foi parada com H2SO4 1N, e a absorvância a 450 nm foi lida. Os níveis de anticorpos anti-JCV nas a- mostras foram expressos como unidades de OD.

O ensaio foi interpretado como descrito abaixo, usando as unidades de OD para determinar os níveis.

Em testes secundários, se amostras desconhecidas produziram mais que 40% de inibição competitiva da ligação com HPVLP em solução, a amostra foi considerada JCV+ (JCV positivo), com < 40% de inibição sendo pontuada como JCV- (JCV negativo).

Inicialmente, as amostras com valores de OD maiores que o OD do ponto de corte (Controle Negativo médio de OD x 1,23) foram definidas como positivas para a presença de anticorpos de JCV, enquanto que as a- mostras com valores de OD iguais ou inferiores ao OD do ponto de corte foram definidas como negativas.

Os controles usados no ensaio foram selecionados com base no OD alvo e especificidade (tal como determinado no ensaio de confirmação secundário para a especificidade (descrito infra) e incluíram um Controle Positivo 1, que foi de soros de doadores agrupado (pooled) com alta reatividade no ensaio definido como tendo valor OD alvo de cerca de 1,0 e para especificidade, competiu com JCV > 80%; Controle Positivo 2, que continha soros de doadores agrupados (pooled) com menor reatividade no ensaio definido como tendo um valor OD alvo de cerca de 0,25 no ensaio; e para a especificidade competiu com JCV > 80%, e Controle Negativo, que foi de soros de doadores agupados com uma reatividade semelhante ao controle de tampão no ensaio tendo um valor OD alvo de aproximadamente 0,07 (note que o tampão de ensaio tem um valor de OD de aproximadamente 0,045).

Em alguns casos, um ensaio de titulação foi realizado em que as amostras positivas foram testadas em diluições múltiplas, e a maior diluição dando um valor de OD maior do que o OD do ponto de corte foi definido como a titulação de IgG JCV.

Os ensaios foram validados a partir da perspectiva de especificidade, precisão, interferência da matriz, robustez e estabilidade dos reagentes.

Exemplo 3: Ensaio de Confirmação Secundário

Em alguns casos, um ensaio de confirmação secundário (ensaio secundário) foi realizado em adição ao teste descrito supra. No ensaio de confirmação, as amostras (plasma ou soro) foram incubadas com HPVLP (concentração final de VLP = 1 μg/mL; diluição final da amostra = 1: 200) durante uma hora a temperatura ambiente antes do uso no ensaio. As amostras de controle foram incubadas em tampão de ensaio, e não na presença de HPVLP. O ensaio foi, em seguida, conduzido como descrito acima. Uma porcentagem de inibição nOD450 foi calculada como: % de inibição = 100 x [1 - (nOD45o médio) (amostras pré-incubadas de JCV MAD-1 VLP) / (nOD450 médio) (amostras incubadas com tampão)].

Se os resultados do ensaio foram os mesmos após a pré- incubação com tampão tal como no ensaio primário (isto é, aproximadamente o mesmo OD), então a amostra foi interpretada como sendo negativa para a presença de anticorpos de JCV específicos. Se os resultados do ensaio foram mais baixos após a pré-incubação com HPVLPs (isto é, no ensaio secundário), então a amostra foi interpretada como contendo anticorpos contra JVC específicos.

Exemplo 4: Rastreio/Ensaio de Confirmação de Algoritmo de Ponto de Corte

O teste sorológico (teste de anticorpos de JCV) foi configurado como um ensaio de duas etapas: um ELISA de rastreio e um ELISA de confirmação suplementar (ensaio secundário).

Para a comparação dos resultados entre as placas de ensaio, corridas de ensaio, e analistas, os resultados da amostra foram normalizados para o valor de densidade ótica (OD450) do controle positivo sobre a placa e relatados como OD450 normalizado, tal como descrito abaixo.Para implementar a utilidade do ensaio de HPVP, pontos de cor- te foram derivados usando um modelo de distribuição de mistura de três componentes de Weibull. Nessas determinações, as seguintes definições foram usadas:

No ELISA de confirmação suplementar, a HPVLP solúvel foi u- sada para pré-adsorver anticorpos de JCV de alta afinidade ém amostras antes da avaliação das amostras no ELISA de rastreio. Os resultados foram calculados como porcentagem de inibição para determinar diminuições na reatividade em ELISA de rastreio depois que as amostras foram pré- adsorvidas com HPVLP[% de inibição = 100 x [1 - (nOD45o médio de amostras pré- incubadas HPVLP) / (nOD45o médio de amostras incubadas com tampão)].

As taxas de falsos positivos e falsos negativos foram definidas da seguinte forma. A taxa de falso negativo é a proporção de amostras positivas de vírus JC verdadeiras que são determinadas como sendo negativas para o anticorpo pelo do ensaio. A taxa soro-positiva é a proporção de amostras determinadas como sendo soro-positivas (isto é, têm anticorpos de JCV como determinado usando o algoritmo de ponto de corte para rastrei- o/confirmação anti-JCV).

Os dados foram analisados usando SAS v9. Os dados que não demonstram uma distribuição normal foram analisados pelo teste U de Mann-Whitney. Os dados categóricos foram analisados usando o teste exato de Fisher ou teste X2 de Pearson ou, dependendo do tamanho da amostra. O coeficiente de correlação de Pearson foi usado para avaliar a relação entre os níveis de DNA de JCV de nOD45o θ urinário. Todos os testes foram de modelo alternativo (two-side) em um nível alfa de 0,05. Os limites de confiança para as taxas de soroprevalência e falsos negativos foram obtidos pelo método de percentil de autoelevação (6) com autoelevação de 10.000.

Exemplo 4(a): Reatividade Sorológica para JCV

Foi realizado um estudo para estabelecer um ensaio para detectar anticorpos anti-JCV em pacientes com MS e realizar uma avaliação preliminar da utilidade clínica potencial do ensaio para estratificação do risco de PML. Para caracterizar as respostas de anticorpos contra agentes infecciosos em seres humanos, foi fundamental ter soros de referência de indivíduos infectados e não infectados. Embora a natureza assintomática da infecção pelo JCV torne impossível a identificação de indivíduos negativos "verdadei-ros", os Requerentes foram capazes de identificar uma população de indivíduos positivos "verdadeiros" medindo DNA de JCV na urina de indivíduos "uropositivos".

Os níveis de DNA de JCV urinário (coletadas nos STRATA (reinicio de dosagem com natalizumab) protocolo de ensaio clínico) foram determinados por um ensaio de reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (q-PCR) (ViraCor Laboratories, Summit de Lee, MO) com um limite de quantificação de 500 cópias/ml e um limite de detecção de 50 cópias/ml.

O estado do anticorpo anti-JCV de 831 amostras de soro de pacientes com MS, que incluíam as amostras de 204 pacientes uropositivos para JCV, foi inicialmente avaliado para anticorpos anti-JCV em um rastreio por ELISA para determinar a distribuição das respostas sorológicas. Os resultados do ensaio pelo estado de DNA urinário mostraram a presença de duas populações distintas sobreponíveis de reatividade de IgG JCV (figura 1). O nível médio de reatividade para pacientes com MS de DNA de JCV uropositivo (nOD450 = 0,895) foi significativamente maior do que para pacientes com MS de DNA de JCV uronegativo (nOD450 = 0,131; p< 0,001), e nenhum paciente uropositivo apresentou reatividade de ensaio abaixo de um nOD45o de 0,10. Portanto, um ponto de corte de ensaio inferior foi estabelecido em nOD45o de 0,10, em que a taxa empírica de falsos negativos na zona negativa foi de 0%.

Muitos pacientes com nenhum DNA de JCV detectável na urina (uronegativos) tiveram reatividade sorológica semelhante a dos pacientes uropositivos. Estes resultados são consistentes com a hipótese de que um teste de DNA de JCV na urina é suscetível de falhar na detecção de todos os indivíduos infectados com JCV.

Exemplo 4 (b): Carga de DNA de JCV urinário e Atividade Sorológica

Para abordar questão potencial de que os pacientes infectados com JCV com baixos níveis de replicação virai podem ter baixos níveis de anticorpos séricos que não são detectados no ensaio sorológico (potenciais falsos negativos) a correlação entre os níveis virais e a reatividade do anticorpo foi examinada. A figura 2 mostra os dados de 204 pacientes de S- TRATA uropositivos de DNA de JCV, e ilustra que não existe uma relação detectável entre os níveis de DNA de JCV urinário e os níveis de anticorpos anti-JCV em amostras de com nOD45o abaixo de 0,60 (coeficiente de correlação de Pearson = 0,048, p = 0,751) . Este resultado é válido mesmo se a urina e o soro foram coletados no mesmo momento do estudo STRATA (coeficiente de correlação de Pearson = 0,002, p = 0,993). Em nOD450> 0,60, uma correlação mais forte foi observada com uma proporção mais elevada de amostras de soro de indivíduos com elevados cópias de DNA de JCV/mL exibindo valores mais elevados de nOD450, consistentes com os relatos na literatura (por exemplo, Egli et al., J. Infect Dis 199:837-846, 2009). Estes dados sugerem que os resultados soronegativos são provavelmente devido a uma ausência de infecção por JCV, em vez de muitos níveis virais baixos.

Exemplo 4 (c): Avaliação da Reatividade Cruzada de BKV-JCV A atribuição de um único ponto de corte conservative que controla a taxa de falsos negativos a 0% é improvável para excluir a detecção de anticorpos que reagem de forma cruzada com outros vírus poliomas comuns (falsos positivos), tais como anticorpos anti-BKV, que compartilham alta i- dentidade para JCV na proteína da capsídeo de VP1. Além disso, tal reatividade cruzada do anticorpo pode ocorrer através da exposição de epítopos virais conservados quando a HPVLP é diretamente revestida na placa de ELISA. Devido a infecções duplas com BKV e JCV poderem ocorrer em humanos e não ser possível identificar com segurança as pacientes que foram infectados com BKV e não com JCV, a questão da reatividade cruzada foi examinada em coelhos, uma espécie em que a infecção natural com BKV ou JCV não pode ocorrer.

Os coelhos foram imunizados com BKV por injecção subcutânea de proteínas em salina tamponada com fosfato sem adjuvante, seguido de três injeções de reforço ao longo de um período de três meses. As amostras de soro foram testadas para a ligação direta a JCV ou BKV por ELISA. Os antissoros de coelhos imunizados com BKV se ligaram a BKV VLPs com alta afinidade (EC50 = 1:100.000) e reagiram de forma cruzada com HPVLPs com menor afinidade (EC50 = 1:5000). Os soros pré-imunes não mostrou nenhuma reatividade. Os dados representativos de um coelho são mostrados na figura 3.

Como os anticorpos BKV reagiram de forma cruzada com JCV, produzindo assim um sinal falso positivo no ensaio anti-JCV (figura 3), o baixo nível de reatividade contra JCV em humanos pode representar baixa afinidade de anticorpos anti-BKV que reagem de forma cruzada com JCV para produzir sinais falso-positivos.

Exemplo 4 (d): Medição da Resposta de Anticorpo contra JCV Específico (ELISA de Confirmação Suplementar)

Para distinguir os pacientes com anticorpos contra JVC específicos daqueles com anticorpos que reagem de forma cruzada, com afinidade potencialmente baixa, uma competição de ELISA foi desenvolvida usando HPVLP solúvel (ensaio secundário). Esperava-se que os anticorpos contra JVC específicos com afinidades mais altas seriam mais eficazmente competidos pelo antígeno solúvel, enquanto que os anticorpos com menor afinidade podem se separar dos complexos formados com o antígeno JCV em so-lução e se ligam à VLP JCV revestido sobre a placa de ELISA. Um subconjunto de 515 amostras de soro de pacientes uropositivos (n = 204) e urone- gativos (n = 311) foi sistematicamente e não proporcionalmente amostrado

para avaliação no ELISA após a pré-adsorção quer com VLP JCV solúvel ou tampão de ensaio. Nas Figs. 4A e 4B, a reatividade de amostras de soros de pacientes uronegativos ou uropositivos nos ensaios de rastreio e confirmação são mostrados lado a lado. As amostras com forte reatividade de JCV foram altamente inibidas pela pré-adsorção de anticorpos com JCV solúvel, enquanto que as amostras com níveis baixos de anticorpos de JCV mostraram competição diferencial. As respostas de anticorpos na maioria dos pacientes uropositivos foram fortemente competitivas (figura 4B). Estes resultados suportam a idéia de que uma proporção significativa da baixa reatividade do soro para JCV pode ser devido à reatividade cruzada de anticorpos não específicos para JCV.

A distribuição das respostas de soro na confirmação ELISA consistiu em dois picos definidos, mais otimamente separados em 40% de inibição (figura 5A) correspondendo aproximadamente ao 5o percentil inferior da distribuição de resposta das amostras uropositivas (figura 5B). Portanto, o nível de inibição de 40% foi selecionado como o ponto de corte para a confirmação por ELISA.

Exemplo 4 (e): Ensaio Sorológico Anti-JCV de Duas Etapas Finalizado

Ao combinar os ensaios de rastreio e de confirmação, a chance de detectar amostras com anticorpos contra JVC específicos "verdadeiros" é bastante intensificada. Em última análise, as amostras com valores de nOD45o < 0,10 no ratreio de ELISA são consideradas negativas para anticorpos de JCV, e aquelas com valores de nOD450 > 0,25 no rastreio por ELISA são consideradas positivos para anticorpos de JCV. As amostras com reatividade entre os valores de nOD de 0,10 a 0,25 foram testadas adicionalmente para ELISA de confirmação. No ELISA de confirmação, todas as amostras que apresentam > 40% de inibição são classificadas como positivas (figura 4). Em valores de nOD450 > 0,25 a probabilidade de observar > 40% de inibição foi aproximadamente 95%.

Exemplo 4 (f): Soropositividade de JCV na Coorte STRATA e Taxa Falso-Negativa

Com base no algoritmo acima, a taxa de soroprevalência na po-pulação STRATA foi estimada como sendo de 53,6% com auto-elevação determinado com 95% de limite de confiança, variando de 49,9% a 57,3% [0,536 = 0,451 (probabilidade de rastreio por ELISA de nOD450 > 0,25) + 0,085 (probabilidade de rastreio por ELISA de nOD45o compreendido entre 0,10 e 0,25, e a % de inibição de ELISA de confirmação suplementar > 40%)]. Este cálculo de soroprevalência assumiu a confirmação de anticorpos anti-JCV em proporções iguais de amostras de indivíduos uropositivos e u- ronegativos na região de nOD entre 0,10 e 0,25. (porcentagem de inibição > 40%); esta hipótese foi apoiada por um teste exato de Fisher de modelo alternativo com um valor-p de 0,702.

Dos 204 pacientes uropositivos, cinco tiveram nOD450 entre 0,10 e 0,25 e não confirmaram ter antianticorpos contra JVC específicos (porcen-tagem de inibição £ 40%,. figura 4B).

Exemplo 5: Validação de Ensaio

A validação ensaio foi realizada por Focus Diagnostics, Inc. (Cypress, CA), onde os parâmetros de desempenho, incluindo precisão, especificidade, sensibilidade, e estabilidade inter- e intraensaio dos reagentes de ensaio e dos controles foram demonstrados. Os parâmetros de desempenho do ensaio, incluindo precisão, especificidade, sensibilidade e a estabilidade inter- e intra-ensaio de reagentes e controles foram demonstrados. Os parâmetros de precisão foram avaliados por três analistas independentes no plasma e soro em quatro dias diferentes, usando preparações independentes de controles do ensaio. Para demonstração da especificidade do ensaio, 10 amostras de soro e de plasma individuais de voluntários saudáveis ou de pacientes com MS (TYSABRI® (natalizumab) naive) foram pré-incubadas com tampão de ensaio, ou uma concentração definida de HPVLP ou BKV VLP em solução. A robustez foi avaliada através da variação dos limites superior e inferior dos tempos de incubação para as etapas de adição da a- mostra, do conjugado, e do substrato e muitos reagentes de revestimento diferentes de HPVLP foram avaliados para demonstrar o desempenho con-trole de ensaio consistente. A interferência da matriz foi avaliada pela deter- minação da recuperação percentual em amostras dopadas com concentrações predefinidas de anticorpos anti-JCV e por dopagem de amostras contendo anticorpos contra JVC específicos com concentrações variáveis de anticorpos monoclonais humanos irrelevantes.

Exemplo 6: Determinação do Estado de Anticorpos de JCV em Pacientes com PML

Amostras de plasma e de soro (tempos únicos selecionados aleatoriamente a partir de coleções seriais) foram obtidas de um total de 831 pacientes de Segurança do estudo de Redosagem e Tratamento de TYSABRI (STRATA). STRATA é um estudo multinacional, em aberto (open-label), de braço único, (América do Norte, Europa, Austrália e Nova Zelândia) em que todos os pacientes recebem 300 mg de natalizumab por infusão intravenosa a cada 4 semanas durante 48 semanas. As amostras de urina coletadas de acordo com o protocolo de STRATA foram analisadas para a presença de DNA de JCV.

A partir da aprovação para comercialização do TYSABRI® em junho de 2006 a 09 de fevereiro de 2010, houve 35 casos reportados de PML no tratamento com natalizumab. Além disso, houve três casos de PML nos ensaios clínicos de pré-aprovação de natalizumab (10, 13, 25). Amostras armazenadas foram obtidas como muitos casos de PML como possível de tempos antes do diagnóstico de PML (pré-PML). As amostras de plasma ou de soro foram apenas disponíveis a partir de 11 pacientes com PML tratados com natalizumab (10 pacientes com MS e 1 paciente com doença de Crohn: Tabela 1). As amostras de soro que foram obtidas um a três anos antes do diagnóstico de PML foram testadas. Quase todas essas amostras foram coletadas de pacientes participantes nos registros ou estudos clínicos e foram armazenadas a -70°C até a análise. Notavelmente, os anticorpos anti-JCV foram detectados em todos os 11 pacientes (100%) através da combinação do estado sorológico do ELISA de rastreio e ELISA de confirmação suplementar (Figs. 6A e 6B) descrito acima. Usando um teste exato de Fisher de uma amostra, este resultado foi significativamente diferente da proporção esperada (53,6%) com um valor-p de 0,002.

Estes dados indicam que o ensaio da presente invenção pode ser usado para determinar a presença ou ausência de anticorpo contra JCV em indivíduos, como parte de uma avaliação global do risco de contrair PML.Tabela 1. Amostras de 11 pacientes com PML tratados com na- 5 talizumab que tiveram amostras de sangue disponíveis antes do diagnóstico

*doença de Crohn; SENTINEL = Segurança e Eficácia de Natali- zumab em Combinação com Interferon Beta-la em Pacientes com esclerose múltipla recorrente reincidente; STRATA = Segurança de Re-dosagem e Tratamento com TYSABRI; qd = 4 x dia; qwk = 1 x semana.

SENTINEL = Segurança e Eficácia de Natalizumab em Combinação com Interferon Beta-la em Pacientes com Esclerose Múltipla Recorrente Reincidente: STRATA = Segurança de Re-dosagem e Tratamento com TYSABRI®; ROW = Resto do Mundo; qd = 4 x dia; qwk ~ 1 x semana; * Ambos os tratamentos antes e concomitante com Natalizumab.

Os dados longitudinais de outros indivíduos tendo um imunomo- dulador também foram avaliados (isto é, múltiplas amostras recolhidas em diferentes momentos de um único indivíduo). Os dados longitudinais indicaram que, ao contrário do teste de derramamento de DNA urinário intermitente, o ensaio de HPVLP pode ser usado com segurança para avaliar o estado do anticorpo anti-JCV, e que o estado do anticorpo contra JCV permanece relativamente estável (na ausência de nova infecção).

Exemplo 7: Método de Purificação de JCV VP1-VLP Alternativo

Este método é um exemplo de uma alternativa ao método de densidade-gradiente/ultracentrifugação descrito acima para a purificação de JCV VP1-VLP de células de insetos. As etapas gerais do protocolo são lise, tratamento com benzonase, precipitação com desoxicolato, precipitação com sulfato de amónio e concentração/diafiltração, com uma etapa de troca iôni- ca final, usando TMAE Fractogel.

As células Sf9 infectadas com baculovírus JCV-VP1 foram lisa- das em PBS, CaCI2 0,1 mM, pela passagem duas vezes através de um disruptor de células de microflu id izador a 5.000 psi. Os debris celulares foram removidos por centrifugação a baixa velocidade e o sobrenadante tratado com 40 unidades/ml de Benzonase (EMD Biosciences 71.206-3) durante 1 hora à temperatura ambiente. Para a etapa de precipitação com desoxicolato, um décimo volume de desoxicolato 2,5% foi adicionado ao lisado (desoxicolato final a 0,25%), e o lisado foi incubado a 37°C durante 1 hora com agitação suave. Um volume igual de NaCI 4 M, NaCI 0,1 mM foi adicionado ao lisado e o lisado foi incubado em gelo durante 1 hora. O precipitado foi removido por centrifugação de baixa velocidade. O sobrenadante foi então precipitado com sulfato de amónio 40% para remover as proteínas contami- nantes. Os 40% finais foram conseguidos usando 232 g de sulfato de amónio sólido por litro de solução. Enquanto se mistura a solução suavemente a 4 °C, sulfato de amónio foi adicionado a 1/5 de cada vez, permitindo que cada adição se dissolva durante 10 a 15 minutos antes da adição da fração seguinte. A solução foi agitada suavemente durante a noite a 4°C. O precipitado de sulfato de amónio foi removido por centrifugação de baixa velocidade e o sobrenadante contendo VP1 foi filtrado usando um filtro de 0,45 μm e carregado para a etapa seguinte. A solução foi concentrada de 5 a 10 vezes usando uma membrana NMWL TFF de 100 kDa (Pellicon 2 Mini UF Mod Biomax-100 C 0,1m2, P2B100C01) e trocada por montagem de tampão (Tris 25 mM, NaC1150 mM, CaCfe 1 M, pH 7,5) por diluição de 5 vezes e concentrando novamente para duas vezes o volume de partida. A solução foi armazenada a 4°C durante >/= 36 horas. A solução foi então diafiltrada usando uma membrana NMWL TFF de 500 kDa (Pellicon 2 Mini UF Mod Biomax- 500 V, Millipore parte # P2B500V01) usando tampão de cromatografia TMA de 40 volumes (Tris 25 mM, NaCI 150 mM, CaCh 0,1 mM, pH 8,0) . Para a cromatografia, aproximadamente 1 ml de resina é requerido por 2 g de massa de células de partida. A proteína foi carregada na coluna TMAE dimensionada apropriadamente (Fractogel® EMD TMAE HiCap (M) -. EMD Biosci- ences cat. 1.10316) e lavada com 3 volumes de tampão de cromatografia de coluna. As VLPs foram eluídas com Tris 25 mM, NaCI 600 mM, CaCfe 0,1 mM, pH 8,0. A pureza de VP1 foi avaliada por SDS-PAGE e espectrometria de massa, a presença de VLPs foi confirmada por microscopia de elétrons, e a porcentagem de proteína total na forma de VLPs foi determinada por ultra- centrifugação analítica e velocidade de sedimentação. Este método resultou em preparações de HPVLP de cerca de 80% de HPVLPs.

OUTRAS MODALIDADES

Inúmeras modalidades da invenção foram descritas. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Assim, outras modalidades estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (14)

1. Método, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) contatar uma amostra biológica de um indivíduo com partículas tipo vírus altamente purificadas (HPVLPs), consistindo predominantemente na proteína VP1 do vírus JC (JCV), em solução sob condições adequadas para ligação de um anticorpo anti-JCV na amostra a uma HPVLP, fornecendo assim uma amostra pré-incubada;(b) contatar a amostra pré-incubada com HPVLPs, consistindo predominantemente na proteína VP1 do JCV, imobilizada sobre um substrato sólido sob condições adequadas para ligação de um anticorpo de JCV na amostra a uma HPVLP;(c) detectar o nível de anticorpo anti-JCV na amostra pré- incubada que se liga às HPVLPs imobilizadas; e(d) comparar o nível detectado de anticorpo anti-JCV na amostra biológica pré-incubada com o nível de anticorpo anti-JCV detectado em uma amostra biológica obtida do indivíduo que foi pré-incubada em uma solução sem HPVLPs, e foi contatada com HPVLP imobilizada sobre um substrato sólido sob condições adequadas para ligação de um anticorpo anti-JCV na amostra a uma HPVLP,em que as HPVLPs são compostas por mais de 5 polipeptídeos de VP1,em que uma diminuição acima de uma percentagem especificada no nível detectado de anticorpo anti-JCV na amostra biológica pré-incubada em comparação com a amostra biológica obtida do indivíduo que foi pré- incubada em uma solução sem HPVLPs indica que a amostra é positiva para anticorpo anti-JCV, e uma alteração no nível detectado de anticorpo anti-JCV abaixo de uma percentagem especificada indica que não existe anticorpo específico para JCV presente na amostra.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato da amostra biológica com HPVLPs em solução é por um período de tempo selecionado de 30 minutos, uma hora ou durante a noite.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a percentagem especificada é de 40%.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica obtida do indivíduo é classificada como negativa para anticorpo anti-JCV, quando o nível de anticorpo anti-JCV na amostra biológica pré-incubada que se liga às HPVLPs imobilizadas é aproximadamente o mesmo que o nível de anticorpo anti-JCV detectado na amostra biológica obtida do indivíduo que foi pré-incubada em uma solução sem HPVLPs.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é soro.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é de um indivíduo que recebeu prescrição de um imunomodulador, um indivíduo considerando tomar um imunomodulador ou um indivíduo suspeito de ter Leucoencefalopatia Multifocal Progressiva (PML), em que o imunomodulador é selecionado a partir de uma terapia anti-VLA-4, uma terapia anti-CD2, uma terapia anti-CD11a ou micofenolato de mofetila.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo que recebeu prescrição de um imunomodulador, ou considerando tomar um imunomodulador, não foi previamente administrado com o imunomodulador.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu previamente uma ou mais doses do imunomodulador.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção de ligação de anticorpo anti-JCV às HPVLPs indica que o indivíduo:(i) está com um risco aumentado de PML se a amostra biológica for positiva para um anticorpo anti-JCV;(ii) não é um candidato para receber tratamento com um imunomodulador se a amostra biológica for positiva para um anticorpo anti- JCV; ou(iii) é um candidato para receber tratamento com um imunomodulador e monitoramento intensificado dos sintomas adversos mediante tratamento com o imunomodulador, opcionalmente em que os sintomas adversos indicam o desenvolvimento de PML.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a falha na detecção da ligação de anticorpo anti-JCV às HPVLPs indica que o indivíduo é um candidato para receber tratamento com um imunomodulador.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um indivíduo tendo uma amostra biológica determinada como não tendo anticorpos anti-JCV em um teste inicial é re-testada pelo menos anualmente para a presença de anticorpos anti-JCV após o teste inicial.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um indivíduo que em uma primeira data foi determinado pelo método, como definido na reivindicação 1, como tendo anticorpos anti-JCV, é re-testado em uma data posterior para determinar se o indivíduo não tem anticorpos anti-JCV.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que o imunomodulador é natalizumab.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem esclerose múltipla (MS) ou Doença de Crohn (CD).

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