BR102021025770A2 - Antígeno quimérico de sars-cov-2 para diagnóstico sorológico de sars-cov-2 - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um ensaio imunoabsorvente (ELISA) para detecção de anticorpos IgG, IgM ou IgA anti-SARS-Cov-2, para fins de diagnóstico clínico, estudos epidemiológicos e monitoramento vacinal da COVID-19. A presente invenção difere de outros testes sorológicos comerciais que utilizam as proteínas de SARS-Cov-2, por utilizar como antígeno regiões imunogênicas das proteínas S e N fusionadas, para a produção e uso em imunodiagnóstico, na forma de uma quimera recombinante, conferindo elevada sensibilidade e especificidade ao teste. A quimera é produzida em grandes quantidades usando a bactéria Escherichia coli com boa estabilidade. A otimização de todas as etapas e insumos usados no ELISA com um painel de soros obtidos de pacientes brasileiros possibilitou o desenvolvimento de um teste de elevada acurácia e reprodutibilidade.

Description

ANTÍGENO QUIMÉRICO DE SARS-COV-2 PARA DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DE SARS-COV-2 Campo da invenção

[001] A presente invenção é categorizada dentro do campo das necessidades humanas (IPC: Seção A), mais precisamente para diagnóstico (A61B) e é tratado como um imunobiológico. Mais especificamente, a invenção refere-se à aplicação do produto da expressão do gene de uma proteína quimérica, conforme SEQ ID Nº 1, obtida via tecnologia do DNA recombinante, como insumo principal para kits de diagnóstico para detecção de anticorpos IgG, IgM ou IgA humanos anti-SARS-CoV-2, que podem ser aplicados para fins de diagnóstico clínico, pesquisa ou estudos epidemiológicos da COVID-19.

Fundamentos da invenção

[002] A pandemia causada pelo novo coronavírus (SARS-CoV-2) levou pesquisadores do mundo todo a uma corrida contra o tempo na busca de soluções tecnológicas capazes de diagnosticar rapidamente esta doença e de prevenir da infecção àqueles que ainda não tiveram contato com o vírus. O sequenciamento do genoma deste vírus identificou grande semelhança com o de outros vírus da mesma família, com um genoma de aproximadamente 30 kb que codifica até 14 quadros de leitura (Orfs), sendo que a Orf1 é subdividida em a e b e codifica poliproteínas que são proteoliticamente processadas em 16 proteínas não estruturais conhecida com Nsp (Nsp1-16) responsáveis pela formação do complexo replicase-transcriptase (RTC). Na extremidade 3 'do genoma viral, são expressos 13 Orfs a partir de nove previstos RNAs sub-genômicos. Estes incluem quatro proteínas estruturais: Spike (S), Envelope (E), Membrana (M) e Nucleocápsideo (N) e nove fatores acessórios putativos (1, 2, 3,4).

[003] O diagnóstico precoce requer um teste altamente sensível, capaz de detectar baixos níveis das macromoléculas virais presentes nos primeiros dias após o início da doença. Um considerado número de ensaios moleculares já estão disponíveis e foram projetados para fornecer um diagnóstico no início dos sintomas, com base na detecção de sequências específicas de RNA por PCR. (5). Os testes moleculares baseados em PCR requerem também um conjunto de instalações e instrumentos, com medidas de biossegurança adequada, técnicos de laboratório qualificados em tem um custo significativo elevado (6). A maioria dos centros de triagem de pacientes enfrenta limitação para executar os testes por este método, seja na mão de obra ou nos recursos. Além disso, é preciso lembrar que questões de segurança durante a coleta, armazenamento e transporte das amostras podem ser críticas para o pessoal de laboratório que manuseia e processa as amostras potencialmente infecciosas (7,8,9).

[004] Os testes de sorologia são comparativamente mais fáceis de executar, exigindo menos experiência técnica e equipamento em comparação com a análise de ácido nucleico. As amostras são coletadas em tubos, que representam menos risco potencial para a equipe durante a manipulação das amostras. Pode ser realizado em um laboratório clínico básico com menor complexidade de equipamentos, alcançando, portanto, uma aplicação mais ampla da população (6).

[005] Desta forma, o desenvolvimento de ensaios diagnósticos sorológicos mais confiáveis, que podem ser prontamente aplicáveis a uma maior gama da população, é crucial para o entendimento da pandemia e para a tomada de decisão das autoridades sanitárias. A utilização em massa destes ensaios pode fornecer informações sobre a soroprevalência de anticorpos contra a Covid-19 em nível individual e comunitário, identificar pessoas supostamente protegidas imunologicamente que podem servir como potenciais doadores de plasma (10). Além disso, espera-se que os testes de sorologia desempenhem um papel crítico no teste de eficiência das vacinas, medindo o nível de anticorpos produzidos, determinando sua durabilidade e identificando limites de proteção (11,12). Ainda não se sabe quanto tempo dura a imunidade contra a SARS-CoV-2 após a vacinação (11). Embora a RT-PCR continue sendo o método de referência para identificar a infecção aguda, à medida que a pandemia de SARS-CoV-2 continua a se espalhar, os testes sorológicos se tornaram fundamentais para compreender o curso da pandemia e prever seu futuro (13).

[006] A detecção de IgA, IgM e IgG específicas no soro é usada rotineiramente em laboratórios clínicos para fornecer informações sobre o curso da infecção. IgM e IgA são anticorpos produzidos como a primeira linha de defesa contra a infecção e podem ser usados para avaliar a fase aguda da doença, pois indicam uma exposição recente. Em contraste, anticorpos IgG são gerados posteriormente para fornecer imunidade de longo prazo e memória imunológica (14). Como foi demonstrado em vários estudos, a soroconversão de IgA, IgG e IgM ocorre cerca de uma a duas semanas após o início da doença, e os níveis de IgM caem significativamente enquanto IgG persiste por um período mais longo (15, 16). Portanto, os anticorpos IgA, IgM e IgG, quando detectados dentro do prazo correto após o início da doença, podem agregar valor ao diagnóstico e tratamento de COVID-19. Compreender a cinética do anticorpo ao longo do tempo é essencial para distinguir os limiares de imunidade, especialmente porque ainda não se sabe por quanto tempo a imunidade a este novo coronavírus pode durar (10, 12).

[007] Além disso, como a coleta da amostra por swab da orofaringe, tanto no estágio inicial quanto no final da infecção, nem sempre obtém quantidades suficientes de vírus e lembrando que problemas na extração do RNA são comuns, é possível que a eficiência da técnica seja comprometida (14; 15; 17), ou seja, a proporção de resultados falsonegativos é considerável. Assim, a execução de testes complementares a qRT-PCR para obtenção de um diagnóstico mais eficiente e rápido é estratégica no combate a COVID19.

Breve descrição dos desenhos

[008] Figura 1. Representação gráfica da construção quimérica com fragmentos da proteína S e N do vírus Sars-Cov-2 selecionados após análise de bioinformática.

[009] Figura 2. Representação do vetor de expressão contendo a sequência codificadora (CDS) SEQ ID Nº 2 utilizada para produção da proteína SEQ ID Nº 1 em Escherichia coli;

[0010] Figura 3. Representação da eletroforese em Gel de Poliacrilamida – SDS (SDSPAGE) (A) e Western blot (B) de SEQ ID Nº 1 (59,48 kDa) expressa em E. coli. Na ordem: (A e B) 1: Proteína SEQ ID Nº 1 purificada; 2: Sobrenadante da lise (Fração solúvel) de SEQ ID Nº 1; 3: Extrato de E. coli expressando SEQ ID Nº 1 após indução com IPTG 0,5 M por 3h; 4: Extrato de E. coli BL21 (DE3) Star não induzido.

[0011] Figura 4. Resultado da purificação da proteína SEQ ID Nº 1 expressa em Escherichia coli e purificada em sistema de cromatografia de alta eficiência AKTA purifier.

[0012] Figura 5 - Resultados das análises de sensibilidade e especificidade do teste sorológico para detecção de IgG, IgM e IgA em pacientes com COVID-19. (A) Frequência de distribuição da absorbância no ELISA IgG, IgM e IgA-SARS-CoV-2 obtida de soros de pacientes hospitalizados positivos para COVID-19 (RT-PCR) e amostras pré-pandemia (negativos). A borderline foi definida por um intervalo de ±10% acima ou abaixo do cutoff. (B) Curva ROC do ELISA IgG, IgM, IgA e IgG-SARS-CoV-2 utilizando soros positivos (RT-PCR) de pacientes sintomáticos (1 a 21 dias de sintomas leves), pacientes hospitalizados e soros negativos (pré-pandemia). (C) Valores preditivos do ELISA IgG, IgM e IgA-SARS-CoV-2 utilizando soros positivos (RT-PCR) de pacientes sintomáticos (1 a 21 dias de sintomas leves), pacientes hospitalizados e soros negativos (pré-pandemia).

[0013] Figura 6 - Sensibilidade e especificidade dos testes de ELISA-IgG e IgA-SARSCoV-2 considerando os dias do início dos sintomas de pacientes hospitalizados.

Descrição da invenção

[0014] A presente invenção trata da aplicação do produto da expressão do gene de uma proteína quimérica produzida pela junção de fragmentos das proteínas estruturais do vírus SARS-CoV-2 como parte da formulação de testes diagnósticos para a Covid-19. Em particular, esta invenção trata da construção de vetor recombinante contendo o gene codificador para a proteína visando a expressão em sistemas de expressão procarioto, mas não limitado a este, já que o produto da expressão desta quimera pode ser obtido em outros sistemas, como células de mamíferos, insetos e plantas, possibilitando a obtenção de maiores quantidades da proteína ou para permitindo sua aplicação com maior eficiência.

[0015] Os testes sorológicos têm se concentrado na detecção de anticorpos IgM antiSARS-CoV-2 no início da infecção, mas IgA também vem apresentando um papel importante cujos níveis não reduzem a níveis indetectáveis tão precocemente quanto IgM, apesar de sua detecção mais tardia. Quando associados, IgG, IgM e IgA fornecem uma estratégia robusta no controle a pandemia, principalmente no período inicial da doença constituindo-se numa importante ferramenta para combater a pandemia. Em alguns estudos a detecção de IgM anti-SARS-CoV-2 foi mais eficiente que a qRT-PCR (51,9%) após 5,5 dias do início dos sintomas e quando o resultado dos testes foi associado, a sensibilidade foi de 98,6% (17).

[0016] Como já comentado, as proteínas estruturais virais compreendem glicoproteínas de pico (S), glicoproteínas de membrana (M), proteínas de envelope (E) e fosfoproteínas do nucleocapsídeo (N) (18). A proteína S trimérica (monômero de aproximadamente 180 kDa) é postulada como a primeira fração viral a se ligar aos receptores da célula hospedeira através do domínio de ligação do receptor (RBD) da subunidade S1 e ajuda na fusão do vírus e das membranas hospedeiras através do S2 subunidade. A proteína M desempenha um papel na morfogênese viral e brotamento por meio de seu domínio Nterminal glicosilado, três domínios transmembrana e um domínio C-terminal longo. A proteína E é a menor proteína estrutural que constitui a montagem, liberação e patogênese viral. A proteína N é a proteína viral mais abundante e, portanto, pode ser uma candidata ideal para o diagnóstico (19). Uma forte resposta imunológica foi demonstrada contra esta proteína detectada em amostras de sangue e urina. Apesar de sua abundância, as proteínas S também têm sido utilizadas no diagnóstico de COVID‐19 devido à sua especificidade (20). Krishnamurthy et al . (21) demonstraram a resposta do anticorpo contra quatro regiões proteicas de SARS‐CoV‐2, S1, RBD, S2 e N, com amostras de soro infectadas e encontraram 98,1% de sensibilidade. Wang et al . (22) identificaram anticorpos específicos para as proteínas M, N e S do vírus. Mais de 80% dos pacientes com COVID‐19 apresentaram anticorpos contra quatro epítopos imunodominantes de resíduo N, S e Orf3a (proteína acessória). Em outro estudo de microarray de proteoma, com 29 amostras de soro convalescente de COVID-19 foram usadas para demonstrar a resposta IgM/IgG contra 18 construções de proteínas de SARS‐CoV‐2. O resultado mostrou 100% de resposta de anticorpos principalmente contra as proteínas N e S1, onde S1 provou ser a melhor na diferenciação de pacientes com COVID‐19 em relação aos não infectados. (23). Vários estudos para o desenvolvimento de testes de diagnóstico têm focado principalmente nas proteínas N e S, que são também os principais alvos de pesquisa para às abordagens terapêuticas. Estas proteínas parecem ser ideais para um kit de diagnóstico precoce e sensível à SARSCoV. A proteína S é o principal antígeno neutralizante de vários CoVs conhecidos. A proteína S desempenha papel importante para a ligação ao receptor alvo na superfície celular, porém, a proteína S é fortemente glicosilada e sua expressão integral tem sido realizada em células de mamífero, encarecendo o sistema de produção. Outro alvo que tem sido amplamente utilizado no desenvolvimento de abordagens terapêuticas ou para diagnóstico é o uso da proteína N, que é produzida em níveis muito altos nas células infectadas pelo SARS‐COV‐2 e é considerado um bom candidato para o diagnóstico clínico. A combinação dessas duas proteínas tem um elevado potencial para confirmar a especificidade dos anticorpos para SARS e oferecer um diagnóstico sorológico sensível, mas a maioria dos testes não utiliza estas proteínas combinadas (7).

[0017] Os principais imunoensaios para o diagnóstico de COVID‐19 são o ensaio imunoenzimático ELISA e o teste imunocromatográfico de fluxo lateral. O primeiro tem tempo médio de execução de 3 h, elevada sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade, além de possibilidade de automação, disponibilidade de reagentes quimicamente estáveis, facilidade de implementação laboratorial. O segundo, conhecido também como teste realizado próximo ao paciente ou do tipo POC, do inglês Point-ofCare, destina-se a dar uma resposta rápida da confirmação da doença e apresenta operação simples, com obtenção de resultados imediatos (cerca de 15 5/22 min), baixo custo e o não requerimento de técnicos especializados ou equipamentos sofisticados e de alto custo (24).

[0018] Pesquisa com objetivo de estudar a resposta imune e avaliar o desempenho de quatro novos kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) IgM e cinco IgG para a detecção de anticorpos anti- SARS-CoV-2 em pacientes com coronavírus confirmados por RTPCR, mostrou que em um total de 291 amostras coletadas de pacientes sintomáticos e assintomáticos houve diferenças nos resultados entre 4 kits comerciais. A sensibilidade foi medida em três intervalos de tempo diferentes após o início dos sintomas ou teste positivos de RT-PCR para SARS-CoV-2 (≤14, 14-30,> 30 dias). A especificidade foi investigada usando 119 amostras de soro pré-pandêmica. A sensibilidade de todos os kits de IgM diminuiu gradualmente com o tempo, variando de 48,7% a 66. 4% em ≤14 dias, 29,1% a 61,8% no período entre 14 e 30 dias e 6,0% a 47,9% após 30 dias. A sensibilidade dos kits de IgG aumentou com o tempo, atingindo o pico no intervalo mais recente (> 30 dias) em 96,6%. A especificidade da IgM variou de 88,2%–99,2%, enquanto a IgG variou de 75,6% a 98,3%. Porém, entre todos os pacientes positivos para RT-PCR, 7,9% das amostras foram soronegativas para todos os kits de IgG e para IgM os resultados foram piores. (25) Um estudo na França comparou dois ELISAs com as proteínas N e S de SARS‐CoV‐2 e encontrou uma maior sensibilidade para a proteína N no início da infecção do que para a proteína S. (26). Resultado de estudo semelhante na China mostrou melhor sensibilidade da proteína N para detecção de IgM e IgG em comparação com a proteína S (27). Okba et al . (28) relataram variação de especificidade de um teste ELISA sorológico comercial contra amostras de coronavírus coletadas em diferentes países. Esta variação é esperada já que a população testada não é igual e os antígenos usados para o desenvolvimento dos testes também (29,30,31,32).

[0019] No Brasil, a grande maioria dos testes sorológicos para COVID-19 são importados, sendo apenas dois com tecnologia nacional, o que eleva o custo, dificuldades na importação e demora na distribuição. Portanto, o desenvolvimento de tecnologias de diagnóstico sorológicos nacionais para a COVID-19 que estimulem a testagem em massa e que sejam validados com amostras de pacientes brasileiros é estratégico no combate à pandemia. Todos os testes sorológicos importados são validados com amostras de outros países, o que não leva em conta as variações genéticas, socioeconômicos e ambientais da população brasileira. É sabido que estas características podem afetar diretamente o desempenho (sensibilidade e especificidade) dos mesmos e a qualidade dos estudos epidemiológicos obtidos.

[0020] Segundo Jonathan e colaboradores (33) os testes sorológicos para SARS-CoV-2 apresentam baixa especificidade na primeira semana de exposição e aumentam na segunda e terceira semanas. Os dados atuais sobre testes de anticorpos têm várias limitações de qualidade e a presença de viés. Especificamente, muitos testes de anticorpos têm uma alta taxa de falsos negativos e um alto risco de viés para seleção de participantes, aplicação de testes de índice, padrão de referência usados e fluxo e tempo para testes de anticorpos que podem relatar incorretamente a precisão dos testes de anticorpos COVID-19. Cabe lembrar que alguns destes testes foram aprovados de forma urgente devido à pandemia, levantando dúvidas se foram validados adequadamente. Além disso, a maioria deles é montado com base em uma ou outra proteína estrutural do vírus, o que pode fazer com que estes testes falhem quando confrontados com as novas variantes. O uso de quimeras recombinantes engenheiradas, que são constituídas por frações proteicas altamente antigênicas, ligadas por linkers que possibilitem sua captura por anticorpos circulantes nos fluidos corporais de pacientes contaminados, é um grande avanço nesta invenção.

[0021] Desta forma, o desenvolvimento de testes sorológicos mais precisos e adaptados ao perfil sorológico da população brasileira, promove segurança aos gestores de saúde pública para tomada de decisão junto ao enfrentamento da crise e fortalece a soberania nacional, reduzindo a dependência de produtos biotecnológicos estratégicos importados.

[0022] As experiências conduzidas durante o curso do desenvolvimento da presente invenção demonstraram que a construção da quimera proteica definida em SEQ ID N°1 propicia sua utilização no desenvolvimento de testes diagnósticos mais baratos.

[0023] Por conseguinte, em algumas modalidades, a presente invenção fornece a possibilidade do uso do produto originado a partir da sequência de nucleotídeo otimizada para expressão heteróloga, definida em SEQ ID N°2.

[0024] Em alguma modalidade, a presente invenção fornece a possibilidade de uso do produto da expressão recombinante de uma sequência de nucleotídeo compreendendo um fragmento de no mínimo 50% da sequência otimizada, definida em SEQ ID N°2. Além disso, a presente invenção prevê o uso de uma sequência de nucleotídeo compreendendo um fragmento da sequência definida em SEQ ID N°1, na qual a referida sequência inicia a transcrição em um sistema de expressão de DNA recombinante e em células eucarióticas ou procarióticas.

[0025] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece polipeptídios variantes onde uma sequência de nucleotídeo compreendendo uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade com a sequência definida em SEQ ID N°2, na qual a referida sequência inicia a transcrição em um sistema de expressão de DNA recombinante.

[0026] Em algumas modalidades, a presente invenção prevê a construção de DNA, caracterizada por compreender uma sequência de nucleotídeo que expresse toda ou parcialmente a quimera definida em SEQ ID N°1, operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse.

[0027] Em algumas modalidades, a presente invenção prevê a utilização de qualquer célula caracterizada por ter sido transformada com a sequência de DNA da reivindicação 2; e o uso de qualquer organismo transgênico, caracterizado por ter estavelmente incorporada em seu genoma a sequência de DNA das reivindicações 2;

[0028] Também, a presente invenção prevê o uso de sistemas de expressão de DNA recombinante, tais como bactérias, leveduras, células de insetos, células animais ou plantas, caracterizado por ter sido transformadas com a sequência de DNA da reivindicação 2, bem como método de expressão da lectina caracterizada pelo fato de ser efetuada dentro do organismo a partir de sequência sintética.

[0029] Em alguma modalidade, a presente invenção prevê o uso da proteína heteróloga de interesse caracterizada por ter sido produzida através da sequência de DNA da reivindicação 2.

[0030] Em algumas modalidades, o produto da expressão do gene da quimera (definida na SEQ ID N°1) é usada como um componente de testes sorológicos. Por exemplo, em algumas modalidades, a quimera e mutantes obtidos a partir da engenharia genética desta, estão incluídos em formulações para ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, caracterizado por compreender o uso da proteína SEQ ID Nº 1 compreendendo as seguintes etapas: a. Exposição de espécime clínico à proteína SEQ ID Nº 1 ligado a um suporte sólido ou carreador. b. Adição de um anticorpo secundário ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a); c. Detecção dos anticorpos específicos para SARSCoV-2 na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citado na etapa (b).

[0031] Em algumas modalidades, a presente invenção prevê o uso de ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, caracterizado pelos espécimes clínicos serem sangue total, soro, plasma e/ou fluidos corpóreos.

[0032] A presente invenção prevê o desenvolvimento e uso de ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, de acordo com a reivindicação 3, item “b”, caracterizado pelo conjugado enzimático ser um anticorpo selecionado dos isotipos IgG, IgM, IgA, IgE e/ou respectivas subclasses ou uma proteína preferencialmente a Proteína A e/ou Proteína G; pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase; e pelo marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

[0033] Em algumas modalidades, o produto da expressão do gene da quimera (SEQ ID N°2) é usado como um componente para o desenvolvimento de teste tipo ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, de acordo com a reivindicação 3, etapa “c”, caracterizado pela detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados aos anticorpos anti-SARS-CoV-2 dos espécimes clínicos ser feita utilizando reagentes selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma enzima, tais como peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase; e pelo marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

[0034] Em algumas modalidades, a presente invenção prevê um teste do tipo ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, caracterizado por compreender: a. Suporte sólido ou carreadores associados à proteína SEQ ID Nº 1, utilizado para detecção e quantificação de anticorpos IgG, IgA e IgM humanos anti-SARS-CoV2; b. Anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador; c. Reagente para detectar a enzima ou marcador.

[0035] Também, em algumas modalidades, a proteína quimérica (SEQ ID N°1) é usada como um componente da composição de ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno, poliestireno, ouro, prata, platina, mercúrio e/ou grafite.

[0036] Em algumas modalidades, as composições e formulações contendo a quimera (SEQ ID N°1), para uso em testes diagnósticos, podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados.

[0037] Por fim, a presente invenção prevê o uso da proteína recombinante SEQ ID Nº 1, caracterizado por ser para o diagnóstico e/ou em kits de diagnóstico da COVID-19.

Exemplos de concretizações da invenção

[0038] As pesquisas para o desenvolvimento de testes de diagnóstico para a COVID-19 usam preferencialmente as proteínas N e S, que são também os principais alvos de pesquisa para às abordagens terapêuticas. Porém, estas são na maioria das vezes utilizadas de forma individual e a produção destas proteínas recombinantes é feita em sistemas eucariontes de expressão, aumentando o custo e a complexidade de produção. A combinação dessas duas proteínas tem um elevado potencial para confirmar a especificidade dos anticorpos para SARS e oferecer um diagnóstico sorológico sensível e específico. A estratégia de ligar as porções mais antigênicas dessas duas proteínas é inovadora e resultado da pesquisa com diversas construções quiméricas, o que possibilitou a construção de uma sequência capaz de detectar de forma sensível e específica pacientes com Covid-19, mesmo em casos mais leves. Abaixo segue a descrição dos principais passos utilizados nesta investigação e os exemplos da concretização da invenção.

Escolha das sequências proteicas alvos

[0039] Na presente invenção, a prospecção do antígeno SEQ ID Nº 1 foi baseada na avaliação criteriosa de trabalhos científicos e análise de imunoinfomática, levando em consideração aspectos antigênicos, funcionais, bioquímicos e estruturais. Para isso, após a análise dos genomas disponíveis no National Center for Biotechnological Information (NCBI), as sequências de aminoácidos das proteínas de SARS‐COV‐2 foram obtidas. Posteriormente foram identificados epítopos de célula B, MHCI e MHCII (34, 35, 36), utilizando como parâmetros a acessibilidade, hidrofilicidade, antigenicidade e exposição na superfície. A antigenicidade de todos os epítopos identificados foi confirmada usando VaxiJen 2.0 (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) e realizamos uma extensa revisão bibliográfica para confirmar as previsões dos softwares utilizados e confrontar os resultados (21, 23, 32, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43). Por fim, foi feito um consenso de todas as análises para filtrar as melhores regiões e então proceder as etapas seguintes, sendo que apenas as proteínas S e N foram selecionadas para compor as montagens nesta etapa, utilizadas para diferentes construções quiméricas e análises subsequentes.

Seleção final das sequências alvos e construção de genes quiméricos

[0040] Nesta fase, as sequencias proteicas selecionadas para a avaliação de epítopos foram usadas para formarem diferentes construções e a escolha da melhor combinação foi baseada na análise das características físico-químicas, incluindo a composição de aminoácidos, ponto isoelétrico teórico, peso molecular (MW), coeficiente de extinção molar e hidropaticidade. Para avaliar a meia vida in vitro e in vivo, índice alifático, índice de instabilidade e o número total de resíduos positivos e negativos foi utilizado o servidor online ProtParam ( http: // us . Expasy.org/tools/ protparam). A propensão à solubilidade das proteínas foi prevista pelo servidor SOLpro em http: //scratch.proteomics .ics.uci.edu/. O SOLpro prevê a propensão de uma proteína a ser solúvel após a superexpressão em E. coli usando uma arquitetura SVM de dois estágios com base em múltiplas representações da sequência primária.

[0041] Após a escolha dos melhores arranjos quiméricos, foi realizada a previsão da estrutura secundária do mRNA de cada sequência construída (~10). Os softwares Mfold e RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/) foram empregados para esta predição (44). Assim a melhor sequência, conforme mostrado na SEQ ID Nº 1, foi confirmada usando servidores online para obter a sequência de DNA da proteína projetada por tradução reversa e sua adaptação ao uso do códon de E. coli (45). A combinação mais estável foi usada para a construção de um gene sintético e ligada no vetor pET28a.

Produção da proteína recombinante

[0042] Para a expressão da proteína recombinante, o vetor pET28a contendo a SEQ ID Nº 2 foi utilizado para transformar E. coli BL21 (DE3) Star por eletroporação. A bactéria foi cultivada em meio Luria Bertani (LB) líquido contendo 100 µg.mL-1 de canamicina, a 200 rpm de agitação, 37 °C, de 12 - 14 h. Posteriormente, 50 mL do cultivo foi utilizado como pré-inóculo em 450 mL de meio LB líquido, contendo antibiótico e a cultura foi incubada sob agitação (37 °C, 200 rpm) até atingirem a densidade ótica a 600 nm (D.O.600nm) de 0,6 - 0,8. A expressão da proteína recombinante foi induzida com 0,5 M de isopropil β-Dtiogalactosídeo (IPTG) e incubada durante 3-4 h nas mesmas condições anteriores. Ao final do cultivo, uma alíquota de 1 mL da amostra foi coletada, centrifugada 10.000 × g por 1 min e o pellet utilizado para confirmação da expressão da proteína recombinante através de SDS-PAGE 12%. O restante do cultivo foi utilizado para a purificação da proteína recombinante e avaliação da solubilidade da proteína.

[0043] Assim, para a purificação da proteína, após a expressão de SEQ ID Nº 1, o cultivo foi centrifugado a 7.000 × g por 10 min a 4 °C, o meio de cultura descartado e o precipitado, solubilizado em tampão de lise (200 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl, 5 mM de imidazol, 100 μg/mL Lisozima, pH 8,0), sonicado (6 ciclos de 30 s, 60 kHz) e centrifugado (10.000 × g por 30 min a 4 °C). O sobrenadante resultante, contendo a fração solúvel da proteína recombinante, foi armazenado a -20 °C até a purificação. O pellet foi solubilizado em tampão de lavagem (200 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl e 30 mM de imidazol, pH 8,0) acrescido de 0,2% N-Lauroylsarcosine (NLS) e incubado por 16 h a 4 °C. Após nova centrifugação, o sobrenadante foi armazenado a -20°C e o precipitado solubilizado com tampão de lavagem acrescido de 8M de ureia. Após as etapas de solubilização, as amostras foram submetidas à análise por SDS-PAGE 12% para determinação da fração contendo a proteína recombinante. As frações da proteína (solúvel e insolúvel) foram submetidas a purificação através de cromatografia de afinidade utilizando colunas Ni2+ Sepharose HisTrap. A proteína foi eluída da coluna com gradiente de imidazol. As frações contendo a proteína eluída foram identificadas por SDS-PAGE 12% e dialisadas de forma lenta, utilizando membrana de celulose (25 mm x 16 mm) para diálise (Sigma, EUA) e tampão fosfato salino (PBS) 1X, pH 7,4, em sistema de fluxo contínuo (24-48 h a 4°C). A concentração de SEQ ID Nº 1 purificada foi determinada usando BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). A proteína recombinante também foi analisada por Western blotting (WB) utilizando anticorpo monoclonal (mAb) anti-HIS6x conjugado com peroxidase (Sigma, EUA) na diluição de 1:10.000.

Padronização do teste de ELISA indireto

[0044] A validação dos protótipos foi realizada com soros de pacientes positivos para a COVID-19 (RT-PCR) cedidos por Universidades e Hospitais (Parecer CONEP 4.100.378). O ELISA indireto foi padronizado para o diagnóstico da COVID-19 através da detecção de anticorpos específicos IgA, IgG e IgM anti-SARS-CoV-2. Para isso, placas de 96 poços (Nunc-Immuno Micro Well MaxiSorp) foram sensibilizadas com diferentes concentrações de proteína (25, 50, 100 e 200 ng/poço) em tampão carbonato-bicarbonato (TCB) pH 9,6 (18 h, 4 ° C). As placas foram avaliadas com e sem uma etapa de bloqueio (PBS- T [PBS + 0,05% Tween20] +5% de leite em pó desnatado). Os soros foram avaliados em diferentes diluições (1:25; 1:50; 1:100; 1:200 e 1:400) e em diferentes tampões de amostra (PBS- T + 2,5% de leite em pó; PBS-T + Albumina sérica bovina (BSA); PBS-T + NaCl 30 mM; PBS-T + caseína 0,1%). O anticorpo secundário anti-IgM humana conjugado (peroxidase e biotina) foi testado nas concentrações de 1:4000; 1:6000; 1:8000; 1:10000 e as incubações realizadas em diferentes tempos (30 min e 1 h), sempre a 37 °C e em um volume final de 100 μL/poço. A reação foi revelada usando ortofenilenodiamina - OPD (Sigma-Aldrich) em tampão de citrato-fosfato 0,2 M, pH 4,0 e H2O2 a 0,02%. Após 15 minutos, a reação foi parada com a adição de 50μL H2SO4 (3% v/v) e a leitura foi realizada em leitor de microplacas (Biochrom EZ Read 400) no comprimento de onda a 492 nm.

Resultados da concretização da invenção

[0045] Para compreensão da invenção, nesta seção iremos apresentar os principais resultados, indicando a performance de SEQ ID Nº 1 para o diagnóstico da Covid-19. Para isso, é preciso destacar o trabalho exploratório das melhores regiões alvos e das melhores montagens quiméricas usando estratégias de imunoinfomática. Após a análise dos resultados dos principais epítopos usando bioinformática, estes foram comparados com aqueles já identificados na bibliografia corrente e usados para a montagem da sequência consenso de cada região. A proteína S apresentou mais de 50 epítopos lineares, somadas todas as análises, antes da filtragem de redundância, já a proteína N apresentou 23. Após a filtragem de redundância o número de epítopos da proteína S passou para 15 e da N para 5. As regiões contendo estes epítopos foram selecionadas S (449-711) e N(160-406).

[0046] Desta forma, após esta seleção foram feitas duas montagens, sendo a primeira construção quimérica com o fragmento da proteína S na porção N-terminal da quimera e a da N na porção C-terminal (S+N), ambas construções ligadas por um linker de glicina. A outra construção foi montada com as proteínas nas posições contrárias da primeira construção (N+S). Estas duas construções foram submetidas às análises subsequentes para avaliar os parâmetros físico-químicos e estabilidade da construção. Além disso, a análise de antigenicidade foi realizada novamente. Após estas análises, foi selecionada a proteína SEQ ID Nº 1, sendo o modelo esquemático da construção apresentado na figura 1. A análise dos parâmetros físico-químicos da proteína SEQ ID Nº 1 estão detalhados na Tabela 01.

[0047] Tabela 01 – Avaliação dos parâmetros físico-quimicos das quimeras de SARSCoV-2 utilizando ferramentas do ExPASy.

[0048] A proteína SEQ ID Nº 1 foi expressa na fração insolúvel em cepa E. coli BL21 (DE3) Star. Após a lise celular a proteína foi purificada por coluna de afinidade ao níquel com rendimento estimado em 100 mg/L de cultivo. A proteína se manteve estável por pelo menos 30 dias sob congelamento com os diferentes tampões avaliados.

[0049] Os resultados dos ensaios do tipo ELISA para detecção de anticorpos humanos do tipo IgG, IgA e IgM anti-SARS-CoV-2 estão descritos a seguir:

[0050] Tabela 2 - Painel de soros positivos (RT-PCR) e negativos (pré-pandêmicos) utilizados na análise ROC nos testes ELISA para IgG, IgM e IgA.

* As amostras foram consideradas positivas quando os valores de absorbância (D.O.492nm) no ELISA foram maior/igual ao cutoff. O cut-off foi definido pela média da absorbância (D.O.492nm) das amostras negativas mais dois desvios padrões.

[0051] Ensaio Imunoabsorvente (ELISA) para detecção de anticorpos IgG, IgM e IgA em pacientes positivos para COVID-19.

[0052] IgG - Das quatro concentrações de proteína SEQ ID Nº 1 utilizadas (25, 50, 100 e 200 ng), a que apresentou o melhor resultado foi 200 ng/cavidade (Tabela 2). Nesta concentração a diluição de soro 1:200 foi a escolhida. Quanto a diluição de conjugado, 1:4000 e 1:6000 foram as mais promissoras. O tampão de amostra PBS-t + LP 2,5% apresentou o melhor efeito sobre a diminuição da reação de fundo dos soros negativos. Foi avaliado o efeito do bloqueio das microplacas com leite em pó 5%, que foi comprovado como necessário para o ELISA-IgG-COVID-19. Com relação aos tempos de incubação em cada etapa, uma hora nas incubações com bloqueio, soro e anticorpo secundário (conjugado) apresentou as melhores absorbâncias. Das quatro microplacas avaliadas (Costar, Maxisorp, polysorp e Cral), apenas a Cral apresentou resultados insatisfatórios. A avaliação da ROC do ELISA-IgG-SARS-CoV-2 utilizando 30 soros positivos (RT-PCR) de pacientes sintomáticos (1 a 21 dias de sintomas leves), 68 soros de pacientes hospitalizados e 60 soros de soros negativos (pré-pandemia), revelou que as amostras positivas apresentavam valores de absorbâncias maior/igual a D.O.492nm = 0,486. Área abaixo da curva = 0,808; O intervalo de confiança de 95% entre 0,731 a 0,885 (Tabela 2, Figura 5). A sensibilidade e especificidade do teste em relação aos dias de sintomas estão demonstrados na figura 6.

[0053] IgM - Das quatro concentrações da proteína quimérica SEQ ID Nº 1 utilizadas (25, 50, 100 e 200 ng), a que apresentou o melhor resultado foi 200 ng/cavidade (Tabela 4). Nesta concentração de antígeno a diluição de soro 1:50 foi a escolhida. Quanto a diluição de conjugado, 1:4000 e 1:6000 foram as mais promissoras. O tampão de amostra PBS-t + LP 2,5% apresentou o melhor efeito sobre a diminuição da reação de fundo dos soros negativos. Foi avaliado o efeito do bloqueio das microplacas com leite em pó 5%, que foi comprovado como não necessário para o ELISA-IgM-COVID-19. Com relação aos tempos de incubação em cada etapa, uma hora nas incubações com bloqueio, soro e anticorpo secundário (conjugado) apresentou as melhores absorbâncias. Das quatro microplacas avaliadas (Costar, Maxisorp, polysorp e Cral), apenas a Cral apresentou resultados insatisfatórios. A avaliação da ROC do ELISA-IgM-SARS-CoV-2 utilizando 15 soros positivos (RT-PCR) e 15 soros negativos (pré-pandemia) revelou que as amostras positivas apresentavam valores de absorbâncias maior/igual a D.O.492nm = 0,430. Área abaixo da curva = 0,948; O intervalo de confiança de 95% entre 0,860 a 1,035 (Tabela 2, Figura 5).

[0054] IgA - Das quatro concentrações da proteína quimérica SEQ ID Nº 1 utilizadas (25, 50, 100 e 200 ng), a que apresentou o melhor resultado foi 200 ng/cavidade (Tabela 5). Nesta concentração de antígeno a diluição de soro 1:100 foi a escolhida. Quanto a diluição de conjugado, 1:4000 e 1:6000 foram as mais promissoras. O tampão de amostra PBS-t + LP 2,5% apresentou o melhor efeito sobre a diminuição da reação de fundo dos soros negativos. Foi avaliado o efeito do bloqueio das microplacas com leite em pó 5%, que foi comprovado como necessário para o ELISA-IgA-COVID-19. Com relação aos tempos de incubação em cada etapa, uma hora nas incubações com bloqueio, soro e anticorpo secundário (conjugado) apresentou as melhores absorbâncias. Das quatro microplacas avaliadas (Costar, Maxisorp, polysorp e Cral), apenas a Cral apresentou resultados insatisfatórios. A avaliação da ROC do ELISA-IgG-SARS-CoV-2 utilizando 100 soros positivos (RT-PCR) e 100 soros negativos (pré-pandemia) revelou que as amostras positivas apresentavam valores de absorbâncias maior/igual a D.O.492nm = 0,373. Área abaixo da curva = 0,887; O intervalo de confiança de 95% entre 0,860 a 1,035 (Tabela 2, Figura 5). A sensibilidade e especificidade do teste em relação aos dias de sintomas estão demonstrados na figura 6.

[0055] Referências Bibliográficas

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Claims (9)

1. Proteína SEQ ID Nº 1, caracterizada por conter a fusão do domínio com maior número de epítopos com alto score antigênico da região RBD da proteína Spyke e domínio da proteína N contendo o maior número de epítopos antigênicos de SARS-CoV-2, fusionadas por um linker, obtida via tecnologia do DNA recombinante utilizando vetor recombinante e sistema de expressão heteróloga Escherichia coli.
2. Sequência de DNA codificante SEQ ID Nº 2, caracterizada por conter códons otimizados para expressão em Escherichia coli.
3. ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender o uso da proteína SEQ ID Nº 1 compreendendo as seguintes etapas: a- Exposição de espécime clínico à proteína SEQ ID Nº 1 ligado a um suporte sólido ou carreador; b- Adição de um anticorpo secundário ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a); c- Detecção dos anticorpos específicos para SARS-CoV-2 na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citado na etapa (b).
4. ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, de acordo com a reivindicação 3, item “a”, caracterizado pelos espécimes clínicos serem sangue total, soro, plasma e/ou fluidos corpóreos.
5. ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, de acordo com a reivindicação 3, item “b”, caracterizado pelo conjugado enzimático ser um anticorpo selecionado dos isotipos IgG, IgM, IgA, IgE e/ou respectivas subclasses ou uma proteína preferencialmente a Proteína A e/ou Proteína G; pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase; e pelo marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
6. ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, de acordo com a reivindicação 3, etapa “c”, caracterizado pela detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados aos anticorpos anti-SARS-CoV-2 dos espécimes clínicos ser feita utilizando reagentes selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas ou algum dos marcadores da reivindicação 5.
7. ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender: a- Suporte sólido ou carreadores associados à proteína SEQ ID Nº 1, conforme reivindicação 1, utilizado para detecção e quantificação de anticorpos IgG, IgA e IgM humanos anti-SARS-CoV2; b- Anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador; c- Reagente para detectar a enzima ou marcador.
8. ELISA indireto para o diagnóstico imunológico da COVID-19, de acordo com a reivindicação 7, item “a”, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno, poliestireno, ouro, prata, platina, mercúrio e/ou grafite.
9. Uso da proteína recombinante SEQ ID Nº 1, de acordo com a reivindicação 1 a 8, caracterizado por ser para o diagnóstico e/ou em kits de diagnóstico da COVID-19.

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