JP4105156B2 - 肝臓疾患用バイオマーカーおよびその使用方法 - Google Patents
肝臓疾患用バイオマーカーおよびその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4105156B2 JP4105156B2 JP2004382611A JP2004382611A JP4105156B2 JP 4105156 B2 JP4105156 B2 JP 4105156B2 JP 2004382611 A JP2004382611 A JP 2004382611A JP 2004382611 A JP2004382611 A JP 2004382611A JP 4105156 B2 JP4105156 B2 JP 4105156B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- autoantibodies
- column
- sample
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 title claims description 26
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 27
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 27
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 26
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 26
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 21
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical class OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 108700020469 14-3-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 2
- 101710168537 High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 2
- 101000979629 Homo sapiens Nucleoside diphosphate kinase A Proteins 0.000 description 2
- 101000939460 Homo sapiens Ubiquitin-associated protein 2-like Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 102100023252 Nucleoside diphosphate kinase A Human genes 0.000 description 2
- 229940122907 Phosphatase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102100028642 Prostaglandin E synthase 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100026145 Transitional endoplasmic reticulum ATPase Human genes 0.000 description 2
- 102000004271 Tryptophan 5-monooxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108090000885 Tryptophan 5-monooxygenases Proteins 0.000 description 2
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037078 Complement component 1 Q subcomponent-binding protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100039328 Endoplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100026973 Heat shock protein 75 kDa, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710130649 Heat shock protein 75 kDa, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 101000740725 Homo sapiens Complement component 1 Q subcomponent-binding protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000812663 Homo sapiens Endoplasmin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102100037924 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710126181 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 108030000436 NADPH:quinone reductases Proteins 0.000 description 1
- 102000013901 Nucleoside diphosphate kinase Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 101710103638 Prostaglandin E synthase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710106234 Protein disulfide-isomerase A5 Proteins 0.000 description 1
- 102100037061 Protein disulfide-isomerase A6 Human genes 0.000 description 1
- 102100034576 Quinone oxidoreductase Human genes 0.000 description 1
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 1
- 101710204707 Transforming growth factor-beta receptor-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 description 1
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710100179 UMP-CMP kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710119674 UMP-CMP kinase 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100029817 Ubiquitin-associated protein 2-like Human genes 0.000 description 1
- 108010027273 Valosin Containing Protein Proteins 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
- G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
Description
本発明は、肝臓疾患用バイオマーカーおよびその使用方法に関連し、そこでは、自己抗原をスクリーニングする方法を使用して、肝臓疾患を検出するために使用できる、バイオマーカーを同定する。これらの同定されたバイオマーカーは、更に肝臓疾患のスクリーニングのために、試料(検体)における自己抗体または自己抗原の存在を検出するための、検出用キットへと発展させられる。
損なわれた免疫機能を持つ人々は、免疫疾患を発症する傾向がある。多くのヒト疾患の病因学は、以下に記載する3つの状態の何れかにおいて、その原因を、我々の免疫系にまで遡ることを可能とする。その第一の状態は、低い免疫性、免疫細胞のより低い活性、または免疫細胞数の低下であり、例えばヒトの身体が、侵入してくる細菌、ウイルスまたは真菌を撃退することができず、かつ伝染性の疾患、例えば感冒、流行性感冒、肺炎、腸炎、または肝炎およびAIDSに対しても罹り易くなる。その第二の状態は、免疫不全または免疫系の過剰反応であり、そこでは該侵入する物質は微生物ではなく、些細な花粉または摂取した食物における巨大タンパクであり、それらに対して該免疫系が大量の抗体を放出する。このような攻撃および防御は、我々の細胞内で起こり、連鎖反応を生じ、これはまたアレルギーとも呼ばれる。真の病原体、例えば細菌、ウイルスまたは真菌が、この時点で人の身体を攻撃した場合には、該免疫系は最早抵抗性を高めることは不可能である。該損なわれた免疫系の第三の状態は、ヒトの身体内で免疫細胞が正常な細胞を攻撃することであり、これはリウマトイド関節炎、紅斑性狼ソウ(エリテマトーデス)およびヘルペスの場合におけるように、自己免疫疾患と呼ばれる。このような免疫疾患は、自己抗体が、ヒト身体自体の細胞に対して生成され、組織の損傷および疾病をもたらすという、識別、確認の問題を含む我々自身の免疫系に起因する。
現在では、自己抗体が自己免疫疾患だけに存在する訳ではないことは、公知である。益々多数の研究が、癌に対する免疫応答において、自己抗原(腫瘍由来)および自己抗体(身体由来)が、幾つかの場合において存在することを示している。従って、身体の応答を引出す、腫瘍自己抗原の検出は、癌のテスト、診断、または予後、および更に疾患の治療のために行い、かつこれらにおいて適用することができる。
米国特許第6,631,330号、同第5,137,807号、同第5,830,667号、同第6,264,949号および同第5,985,542号は、硬変、線維症または自己免疫性肝炎(AIH)の診断における、バイオマーカーの使用を開示しており、米国特許第4,994,374号および同第5,175,084号は、肝細胞癌の診断における、バイオマーカーの使用を開示しており、米国特許第6,410,724号は、診断手段として、肝細胞癌に関連するDNAプライマーを使用している。しかし、これらの特許に記載されているバイオマーカーは、正確さに劣り、あるいはある程度まで、干渉に影響され易い。
米国特許第6,631,330号、同第5,137,807号、同第5,830,667号、同第6,264,949号および同第5,985,542号は、硬変、線維症または自己免疫性肝炎(AIH)の診断における、バイオマーカーの使用を開示しており、米国特許第4,994,374号および同第5,175,084号は、肝細胞癌の診断における、バイオマーカーの使用を開示しており、米国特許第6,410,724号は、診断手段として、肝細胞癌に関連するDNAプライマーを使用している。しかし、これらの特許に記載されているバイオマーカーは、正確さに劣り、あるいはある程度まで、干渉に影響され易い。
米国特許第5,891,436号および公開No.20030138860は、原発性胆汁性肝硬変または肝細胞癌に対する診断手段として、ヒト血清中の自己抗体の存在を検出するために、バイオマーカーを用いることを開示している。これらの特許は、癌患者における自己抗体の存在を明らかにし、またその結果として、癌のスクリーニングにおけるバイオマーカーの使用に関する、合理性を確立している。
癌は、1982年以来、台湾における主な死因となっており、また肝癌は、男性、女性両者における第一の死因としてランク付けされている。従って、早期診断および早期治療が、その死亡率を下げるのに役立つことを期待しつつ、高い正確性を持ち、干渉に影響され難いバイオマーカーを見出すことが重要であり、またこれらのバイオマーカーを使用して、肝硬変および癌用の検出キットを開発し、肝臓疾患に罹患した患者を効率よくスクリーニングすることが重要である。
癌は、1982年以来、台湾における主な死因となっており、また肝癌は、男性、女性両者における第一の死因としてランク付けされている。従って、早期診断および早期治療が、その死亡率を下げるのに役立つことを期待しつつ、高い正確性を持ち、干渉に影響され難いバイオマーカーを見出すことが重要であり、またこれらのバイオマーカーを使用して、肝硬変および癌用の検出キットを開発し、肝臓疾患に罹患した患者を効率よくスクリーニングすることが重要である。
上記公知技術の諸欠点を処理するために、本発明は、肝臓疾患用のバイオマーカーを提供し、該マーカーは、更に発展させて、自己抗体の存在に係る知見に基いて、肝硬変および肝臓癌を診断するための、検出キットとすることができる。
本発明の目的は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型もしくはこれらの組み合わせあるいは該アミノ酸配列に対する抗体の何れかから選択される、肝硬変および肝臓癌を検出するためのバイオマーカーを提供することにある。
本発明によれば、上記変異型は、1種以上のアミノ酸を、該バイオマーカーのアミノ酸配列におけるアミノ酸と置換し、該アミノ酸配列から削除し、そこに挿入し、および/または付加することにより得られ、この変異型のアミノ酸配列と、該バイオマーカーのアミノ酸配列とは、80％を越える配列相同性を持つ。
本発明の他の目的は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型もしくはこれらの組み合わせの何れかから選択される、一組のバイオマーカーを含む、肝臓疾患用の検出キットを提供することにある。
本発明の目的は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型もしくはこれらの組み合わせあるいは該アミノ酸配列に対する抗体の何れかから選択される、肝硬変および肝臓癌を検出するためのバイオマーカーを提供することにある。
本発明によれば、上記変異型は、1種以上のアミノ酸を、該バイオマーカーのアミノ酸配列におけるアミノ酸と置換し、該アミノ酸配列から削除し、そこに挿入し、および/または付加することにより得られ、この変異型のアミノ酸配列と、該バイオマーカーのアミノ酸配列とは、80％を越える配列相同性を持つ。
本発明の他の目的は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型もしくはこれらの組み合わせの何れかから選択される、一組のバイオマーカーを含む、肝臓疾患用の検出キットを提供することにある。
本発明の一態様において、上記検出キットは、更にSEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型の何れか1種に対する抗体を認識できる、二次抗体をも含むことができる。
本発明の、更なる目的は、肝臓疾患をスクリーニングするための方法を提供することにあり、この方法は、試料(または検体)を調製する工程；SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型もしくはこれらの組み合わせの何れか1種から選択されるバイオマーカーを用いて、該試料中の自己抗体を捕獲する工程；および該自己抗体を検出する工程、を含む。
更に別の本発明の目的は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列の何れか一つに対する一連の抗体を含む、肝臓疾患用の検出キットを提供することにある。
本発明の更なる目的は、肝臓疾患をスクリーニングするために、上記検出キットを使用する方法を提供することにあり、該方法は、試料を調製する工程；SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列の何れか1種に対する抗体を使用して、該試料中の抗原を捕獲する工程；および該抗体-抗原錯体を検出する工程を含む。
本発明の、更なる目的は、肝臓疾患をスクリーニングするための方法を提供することにあり、この方法は、試料(または検体)を調製する工程；SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型もしくはこれらの組み合わせの何れか1種から選択されるバイオマーカーを用いて、該試料中の自己抗体を捕獲する工程；および該自己抗体を検出する工程、を含む。
更に別の本発明の目的は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列の何れか一つに対する一連の抗体を含む、肝臓疾患用の検出キットを提供することにある。
本発明の更なる目的は、肝臓疾患をスクリーニングするために、上記検出キットを使用する方法を提供することにあり、該方法は、試料を調製する工程；SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列の何れか1種に対する抗体を使用して、該試料中の抗原を捕獲する工程；および該抗体-抗原錯体を検出する工程を含む。
本発明は、自己抗原スクリーニング法の利用に基くものであり、この方法は、まず正常なヒト、肝硬変患者および肝癌患者由来の抗体各々を精製する工程およびこれら抗体を異なるカラム内に固定化する工程；肝臓疾患関連細胞系(HepG2 C3AおよびSNU-387)由来の細胞抽出物を、順次該正常抗体カラムおよび患者抗体カラムに通して、肝硬変および肝癌と関連する自己抗原を得る工程；これらの自己抗原を、酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)または免疫蛍光と組み合わせた、バイオマーカーキットとして使用して、該スクリーニングした試料における該自己抗原に対する自己抗体の存在を検出し、かつこの検出結果に基いて、該患者が、肝硬変または肝癌に罹患しているか否かを決定する工程を含む。これらのバイオマーカーは、既存の自己抗体に基いて同定されるので、これらを診断キットに発展させ、該バイオマーカーに対する自己抗体の存在に基いて、該患者が、このような疾患に罹っているか否かを決定することができる。このような方法は、該抗原の直接的なスクリーニングよりも著しく容易であり、かつより高い精度および感度をもたらす。
本発明は、肝臓疾患、例えば肝硬変および肝癌の検出において使用できる、バイオマーカーを同定するための、自己抗原スクリーニング法の利用に関する。図1に示すような、該自己抗原スクリーニング法は、以下のような諸工程を含む：まず正常なヒトおよび患者由来の血清サンプルを得、かつ抗体を捕獲して、該血清サンプル中に含まれる該抗体を精製することのできる、アフィニティーカラムに、該各サンプルを通す工程；次いで、得られる精製された正常抗体および患者抗体各々をカラムに充填して、正常なヒト由来の抗体を含むカラム(正常抗体カラム)および患者由来の抗体を含むカラム(患者抗体カラム)を得る工程、ここで抗体は、該抗体と該カラム内の化学的な官能基との間に形成される、化学的な結合を介して固定化される；および疾患関連細胞系または病理学的な組織からの抽出物であり得る、サンプルを得る工程。ここで、上記血清サンプルは、単一の患者のサンプルまたは複数の患者由来の血清を含む、混合サンプル何れであっても良い。
この手順を継続するために、疾患関連細胞系または病理学的な組織からの抽出物由来のサンプルが、該正常抗体カラムに通される。該カラムでは、正常抗体の特異的なアフィニティーを介して、非-特異的な抗原が捕獲され、かつ該カラム内に保持される。この工程は、該患者抗体カラムを使用して、該サンプル中の自己抗原をスクリーニングする前の、該サンプルの予備処理であると考えることができる。非-特異的な抗原を除去した後、該サンプルは、特異的な抗原のみで構成されることになる。次いで、該サンプルを、患者抗体を充填したカラムに通して、疾患関連抗原をスクリーニングする。非-特異的な抗原が、正常血清抗体によって除去されているので、患者の抗体により同定されることになる該自己抗原は、更に一層特異的なものとなる。
最後に、該患者抗体カラムから置換された自己抗原は、マススペクトル技術による測定にかけられ、この測定手順では、マススペクトル図からのシグナルと、データベースとの比較を行って、該自己抗原に関する情報を得る。
最後に、該患者抗体カラムから置換された自己抗原は、マススペクトル技術による測定にかけられ、この測定手順では、マススペクトル図からのシグナルと、データベースとの比較を行って、該自己抗原に関する情報を得る。
肝臓疾患関連細胞系内の自己抗原は、上記方法に従って精製され、かつ同定される。これらの自己抗原が、患者血清中の抗体によって同定された場合には、該自己抗原またはその誘導体またはフラグメントもしくは変異型またはそれらの組み合わせを、バイオマーカーとして利用し、かつ検出用キットへと発展させることができる。スクリーニングすべき検体における自己抗体の存在を検出することにより、該患者が肝硬変または他の肝臓疾患に罹患しているか否かを、決定することができる。バイオマーカーに加えて、該検出キットは、更に該バイオマーカーに対する自己抗体を認識して、この検出法の適用を容易にすることのできる、二次抗体を含むことができる。
図2に示したように、上記検出キットを利用するこの方法は、以下のような諸工程を含む：試料を調製する工程；およびバイオマーカーを使用して、該試料中の自己抗体を検出する工程。該バイオマーカーは、該自己抗原スクリーニング法によりスクリーニングされた自己抗原またはその誘導体またはフラグメントもしくは変異型またはそれらの組み合わせから選択される。上記試料は、全血または血清である。
図2に示したように、上記検出キットを利用するこの方法は、以下のような諸工程を含む：試料を調製する工程；およびバイオマーカーを使用して、該試料中の自己抗体を検出する工程。該バイオマーカーは、該自己抗原スクリーニング法によりスクリーニングされた自己抗原またはその誘導体またはフラグメントもしくは変異型またはそれらの組み合わせから選択される。上記試料は、全血または血清である。
この検出を容易にするために、上記のバイオマーカーは、任意の形状であり得、検出キットまたは基板上に予め固定化したものを含むが、これらに限定されず、該基板は、イムノアッセイプレートまたはバイオチップであり得る。該バイオマーカーにより捕獲された、該試料中の自己抗体を、該二次抗体によって認識し、かつ吸着でき、該二次抗体は発色反応、放射性検出または蛍光検出用の、特殊な官能基を持つ、変性された抗体である。
自己抗体を該二次抗体によって吸着した後、特別な試薬を添加して、発色反応させ、また酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)を利用して、該二次抗体の存在を決定し、その結果から、該患者が肝癌または肝硬変に罹っているか否かを決定するための基礎として、該自己抗体の存在を突き止める。該二次抗体の存在およびその結果としての該自己抗体の存在は、またラジオイムノアッセイ(RIA)または免疫蛍光法により決定することも可能である。
自己抗体を該二次抗体によって吸着した後、特別な試薬を添加して、発色反応させ、また酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)を利用して、該二次抗体の存在を決定し、その結果から、該患者が肝癌または肝硬変に罹っているか否かを決定するための基礎として、該自己抗体の存在を突き止める。該二次抗体の存在およびその結果としての該自己抗体の存在は、またラジオイムノアッセイ(RIA)または免疫蛍光法により決定することも可能である。
上記スクリーニング法が、該二次抗体を含まない場合、該試料は、該バイオマーカーと反応させる前に、蛍光マーカー(例えば、cy3またはCy5)で標識することができる。該バイオマーカーによりスクリーニングされた、この蛍光-標識を施した自己抗体は、次いで該二次抗体を使用すること無しに、蛍光スキャナーにより検出できる。
該自己抗体存在の検出に加えて、該抗原の検出も、患者が肝硬変または肝臓癌に罹っているか否かを決定するための基礎として利用することができる。この目的を達成するために、本発明は抗体を含む検出用キットをも提供し、該抗体は、肝臓疾患をスクリーニングするための、該自己抗原スクリーニング法により同定された自己抗原を認識することができる。
肝硬変または肝癌をスクリーニングするための、上記検出キットを使用する方法は、以下の工程を含む：血清試料を調製する工程；上記抗体を用いて、該血清中の該抗原を認識し、かつ捕獲する工程；および生成する抗体-抗原錯体を検出する工程。
該自己抗体存在の検出に加えて、該抗原の検出も、患者が肝硬変または肝臓癌に罹っているか否かを決定するための基礎として利用することができる。この目的を達成するために、本発明は抗体を含む検出用キットをも提供し、該抗体は、肝臓疾患をスクリーニングするための、該自己抗原スクリーニング法により同定された自己抗原を認識することができる。
肝硬変または肝癌をスクリーニングするための、上記検出キットを使用する方法は、以下の工程を含む：血清試料を調製する工程；上記抗体を用いて、該血清中の該抗原を認識し、かつ捕獲する工程；および生成する抗体-抗原錯体を検出する工程。
本発明の利点は、更に実際の例を示すことにより説明されるが、以下の実施例における説明は、本発明の実際の適用に、何等制限を加えるものではない。
実施例1：肝臓疾患に罹っている患者の血清中の自己抗体を用いた、自己抗原のスクリーニング、該血清サンプル中の自己抗体の精製
まず、肝硬変または肝癌に罹っている患者の血清を得、該血清を結合バッファー(20ｍMのPBS、ｐH 7.0)で1:10の割合にて希釈し、次いで0.45μmのメンブランフィルタを用いて、この希釈された血清を濾過し、後の段階におけるカラムの詰まりを回避し、次いでプロテインG(Protein G)アフィニティーカラムを、1ml/分なる流速で、該カラム体積の10倍量の上記結合バッファーで洗浄し、次に該濾過した血清サンプルを、0.2ml/分なる流量で該プロテインGアフィニティーカラムに通して、そのアフィニティーにより該抗体を該カラム内に保持し、再度該プロテインGアフィニティーカラムを、1ml/分なる流速で、該カラム体積の5-10倍量の上記結合バッファーで洗浄して、該血清サンプル中の、該カラムとアフィニティー結合を形成しない物質を除去する。1ml/分なる流速で、該カラム体積の2-5倍量の溶出バッファー(0.1Mグリシン-HCl、pH 2.7)を用いて、該カラムから抗体を溶出し、予め60-200μlのTris-HCl溶液(1M、pH 9.0)を加えた試験管に、該溶出された抗体を集めた。最後に、該サンプルを、結合バッファー(0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH 8.3)に移して、該血清サンプル中の自己抗体(IgG)の精製を完了する。
実施例1：肝臓疾患に罹っている患者の血清中の自己抗体を用いた、自己抗原のスクリーニング、該血清サンプル中の自己抗体の精製
まず、肝硬変または肝癌に罹っている患者の血清を得、該血清を結合バッファー(20ｍMのPBS、ｐH 7.0)で1:10の割合にて希釈し、次いで0.45μmのメンブランフィルタを用いて、この希釈された血清を濾過し、後の段階におけるカラムの詰まりを回避し、次いでプロテインG(Protein G)アフィニティーカラムを、1ml/分なる流速で、該カラム体積の10倍量の上記結合バッファーで洗浄し、次に該濾過した血清サンプルを、0.2ml/分なる流量で該プロテインGアフィニティーカラムに通して、そのアフィニティーにより該抗体を該カラム内に保持し、再度該プロテインGアフィニティーカラムを、1ml/分なる流速で、該カラム体積の5-10倍量の上記結合バッファーで洗浄して、該血清サンプル中の、該カラムとアフィニティー結合を形成しない物質を除去する。1ml/分なる流速で、該カラム体積の2-5倍量の溶出バッファー(0.1Mグリシン-HCl、pH 2.7)を用いて、該カラムから抗体を溶出し、予め60-200μlのTris-HCl溶液(1M、pH 9.0)を加えた試験管に、該溶出された抗体を集めた。最後に、該サンプルを、結合バッファー(0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH 8.3)に移して、該血清サンプル中の自己抗体(IgG)の精製を完了する。
本発明の方法は、各々1種の正常なIgGおよび患者IgGカラムを必要とする。従って、正常なヒトおよび患者由来の血清を得、これらを上記の精製段階に掛ける必要がある。
自己抗体を含むカラムの調製
酸性化溶液(1mM HCl、氷浴内)1滴を、ピペットでNHS-活性化カラムに滴下し、泡の生成を阻止する。このカラムの上端部に注射器またはポンプを接続した後、該カラムの底部におけるアダプタを取外す。該カラム体積の2倍量の該酸性化溶液で、該カラム内のイソプロパノールを洗い流す。この洗浄段階を3回繰り返した後、自己抗体を含む該サンプルを、該カラムに注入する。精製された自己抗体を含む上記結合バッファーを、該カラム体積と等価な体積および0.5-10mg/mlなる濃度を持つ溶液とした。自己抗体を含む上記サンプルを、該カラムに通した後に、このカラムを封止し、かつこの反応を25℃にて15-30分間、または4℃にて4時間に渡り行って、化学結合により、該抗体を該カラムに固定化させた。
自己抗体を含むカラムの調製
酸性化溶液(1mM HCl、氷浴内)1滴を、ピペットでNHS-活性化カラムに滴下し、泡の生成を阻止する。このカラムの上端部に注射器またはポンプを接続した後、該カラムの底部におけるアダプタを取外す。該カラム体積の2倍量の該酸性化溶液で、該カラム内のイソプロパノールを洗い流す。この洗浄段階を3回繰り返した後、自己抗体を含む該サンプルを、該カラムに注入する。精製された自己抗体を含む上記結合バッファーを、該カラム体積と等価な体積および0.5-10mg/mlなる濃度を持つ溶液とした。自己抗体を含む上記サンプルを、該カラムに通した後に、このカラムを封止し、かつこの反応を25℃にて15-30分間、または4℃にて4時間に渡り行って、化学結合により、該抗体を該カラムに固定化させた。
該自己抗体と該カラムとを結合させた後、該カラムを、その体積の2倍量の、遮断バッファー(0.5Mのエタノールアミン、0.5MのNaCl、pH 8.3)で溶出し、これら段階を3回繰り返した。次に、このカラムを、その体積の2倍量の、洗浄バッファー(0.1Mのアセテート、0.5MのNaCl、pH 4)で洗浄し、同様にこれら段階を3回繰り返した。再度、各々該カラム体積の2倍量の、上記遮断バッファーを用いて、該カラムを3回溶出し、次にこのカラムを15-30分間反応させて、自己抗体と結合しない、該カラム内の官能基を遮断し、かつ不活性化した。この遮断反応の完了後、各々該カラム体積の2倍量の、上記洗浄バッファーを用いて、該カラムを3回洗浄し、次に該カラム体積の2倍量の、上記遮断バッファーを用いて、該カラムを3回溶出して、自己抗体と結合しない全ての官能基を、確実に遮断した。再度、各々該カラム体積の2倍量の、上記洗浄バッファーを用いて、該カラムを3回洗浄した。最後に、該カラム体積の2-5倍量の、中性pHを持つバッファーで溶出して、該自己抗体を充填したカラムの調製を完了した。
肝臓疾患関連細胞系の抽出物由来の、自己抗原の同定
まず、培地を除去した、2.68mgのHepG2 C3A細胞を、氷浴で処理したTrisの塩溶液(50mM Tris、pH 7.5、150mM NaCl、1.5mM PMSF、ホスファターゼ阻害剤)で2度洗浄し、次いで1mlのトライトン(Triton)抽出液(15mM Tris、pH 7.5、120mM NaCl、25mM KCl、2mM EGTA、0.1mM DTT、0.5% Triton X-100、10μg/mlのロイペプチン、0.5mM PMSF、およびホスファターゼ阻害剤)に添加し、4℃にて30分間放置した。この時点で、細胞は分解し、かつタンパク質を遊離し始めた。この溶液を、4℃にて15分間、(テーブルトップ式遠心機で)14,000rpmにて遠心分離処理して、固形分、不溶性細胞構成物を除去した。その上澄みを集めて、イムノアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
まず、培地を除去した、2.68mgのHepG2 C3A細胞を、氷浴で処理したTrisの塩溶液(50mM Tris、pH 7.5、150mM NaCl、1.5mM PMSF、ホスファターゼ阻害剤)で2度洗浄し、次いで1mlのトライトン(Triton)抽出液(15mM Tris、pH 7.5、120mM NaCl、25mM KCl、2mM EGTA、0.1mM DTT、0.5% Triton X-100、10μg/mlのロイペプチン、0.5mM PMSF、およびホスファターゼ阻害剤)に添加し、4℃にて30分間放置した。この時点で、細胞は分解し、かつタンパク質を遊離し始めた。この溶液を、4℃にて15分間、(テーブルトップ式遠心機で)14,000rpmにて遠心分離処理して、固形分、不溶性細胞構成物を除去した。その上澄みを集めて、イムノアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
回収した細胞抽出物を、1:10の割合で、上記結合バッファーで希釈し、0.45μmのメンブランフィルタに通して、後の段階における該カラムの閉塞を防止した。該サンプルを、該IgGカラムに注入する前に、1ml/分なる流速で、該カラム体積の10倍量の上記結合バッファーで、該正常および患者抗体カラムを洗浄した。次いで、濾過した細胞抽出物を、0.2ml/分なる流速で、該正常抗体カラムに通した。該正常抗体カラムを、1ml/分なる流速で、該カラム体積の5-10倍量の結合バッファーで溶出した。この時点において、該正常抗体により同定され、かつ捕獲された、該細胞抽出物中の抗原は、該カラム内に保持されるはずである。この段階の目的は、該HepG2 C3A細胞内の非-特異的な抗原を除去することである。結果として、該カラムを通過する該細胞抽出物は、非-特異的な抗原を含まない。得られた細胞抽出物を、該患者抗体カラムに注入した。このカラムを、1ml/分なる流速で、該カラム体積の5-10倍量の結合バッファーで溶出した。この時点において、該細胞抽出物中に存在する自己抗原は、該患者由来の自己抗体により捕獲され、かつ該カラム内に保持されるであろう。該細胞抽出物を該正常抗体カラムに通した場合、該正常抗体により捕獲される抗原は、該カラム内に保持され、一方抗原を含まない細胞抽出物は、該正常抗体により同定し、かつ捕獲することができ、該患者抗体により同定し、かつ捕獲できる抗原のみが、該カラムに保持されるであろう。該患者抗体カラム内に保持された抗原を、1ml/分なる流速で、該カラム体積の2-5倍量の溶出バッファーを用いて溶出し、かつ捕集した。該カラムを通過した部分を、トリプシンを用いてタンパク加水分解にかけ、得られたペプチドをマススペクトル技術を利用して検定した。得られたスペクトル図を、データベースと比較して、該タンパクに関する情報を得た。
肝臓疾患関連細胞系を、肝硬変または肝癌に罹っている患者の血清中の自己抗体によってスクリーニングすることにより、以下の自己抗原を得た：
1. ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ(gi|1421609, SEQ ID NO:1)
2. NM23タンパク(gi|35068, SEQ ID NO:2)
3. ATPシンターゼβ-鎖、ミトコンドリア[プリカーサ] (gi|28940, SEQ ID NO:3)
4. 14-3-3ζ-タンパク(チロシン3/トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク) (gi|4507953, SEQ ID NO:4)
5. 14-3-3ε-タンパク(チロシン3/トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク) (gi|4507953, SEQ ID NO:5)
6. タンパクジスルフィドイソメラーゼ-関連タンパク5(gi|1710248, SEQ ID NO:6)
7. 命名されていないタンパク製品(gi|21750187, SEQ ID NO:7)
8. トロポミオシンα3 (gi|37403, SEQ ID NO:8)
9. トリポミオシン(trypomyosin)α4 (gi|10435300, SEQ ID NO:9)
10. カルレティキュリンプリカーサ(gi|4757900, SEQ ID NO:10)
11. ヒトプレ-mRNAスプライシング因子SF2p32 (gi|338043, SEQ ID NO:11)
1. ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ(gi|1421609, SEQ ID NO:1)
2. NM23タンパク(gi|35068, SEQ ID NO:2)
3. ATPシンターゼβ-鎖、ミトコンドリア[プリカーサ] (gi|28940, SEQ ID NO:3)
4. 14-3-3ζ-タンパク(チロシン3/トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク) (gi|4507953, SEQ ID NO:4)
5. 14-3-3ε-タンパク(チロシン3/トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク) (gi|4507953, SEQ ID NO:5)
6. タンパクジスルフィドイソメラーゼ-関連タンパク5(gi|1710248, SEQ ID NO:6)
7. 命名されていないタンパク製品(gi|21750187, SEQ ID NO:7)
8. トロポミオシンα3 (gi|37403, SEQ ID NO:8)
9. トリポミオシン(trypomyosin)α4 (gi|10435300, SEQ ID NO:9)
10. カルレティキュリンプリカーサ(gi|4757900, SEQ ID NO:10)
11. ヒトプレ-mRNAスプライシング因子SF2p32 (gi|338043, SEQ ID NO:11)
12. 腫瘍壊死因子タイプIレセプタ関連タンパクTRAP-1 (gi|1082886, SEQ ID NO:12)
13. 腫瘍拒絶抗原(gp96) 1; グルコース調節タンパク(gi|4507677, SEQ ID NO:13)
14. 熱ショックタンパク質90-β(gi|72222, SEQ ID NO:14)
15. 熱ショックタンパク質90-α (gi|123678, SEQ ID NO:15)
16. 熱ショック60kDaタンパク質 1 (gi|31542947, SEQ ID NO:16)
17. HMG-1 (gi|968888, SEQ ID NO:17)
18. KIAA0144遺伝子生成物(NICE-4タンパク質) (gi|13111995, SEQ ID NO:18)
19. バロシン(Valosin)含有タンパク質(p97); 転移性小胞体ATPアーゼ (gi|6005942, SEQ ID NO:19)
20. グリセロアルデヒド3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、肝臓(gi|30157565, SEQ ID NO:20)
21. サイトケラチン(gi|1419564, SEQ ID NO:21)
22. IGF-II mRNA-結合タンパク質 1 (gi|4191608, SEQ ID NO:22)
23. NADPH: キノンレダクターゼ(gi|13236495, SEQ ID NO:23)
24. ヒトコ-シャペロンP23の結晶構造(hsp-90コ-シャペロン) (gi|9257073, SEQ ID NO:24)
13. 腫瘍拒絶抗原(gp96) 1; グルコース調節タンパク(gi|4507677, SEQ ID NO:13)
14. 熱ショックタンパク質90-β(gi|72222, SEQ ID NO:14)
15. 熱ショックタンパク質90-α (gi|123678, SEQ ID NO:15)
16. 熱ショック60kDaタンパク質 1 (gi|31542947, SEQ ID NO:16)
17. HMG-1 (gi|968888, SEQ ID NO:17)
18. KIAA0144遺伝子生成物(NICE-4タンパク質) (gi|13111995, SEQ ID NO:18)
19. バロシン(Valosin)含有タンパク質(p97); 転移性小胞体ATPアーゼ (gi|6005942, SEQ ID NO:19)
20. グリセロアルデヒド3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、肝臓(gi|30157565, SEQ ID NO:20)
21. サイトケラチン(gi|1419564, SEQ ID NO:21)
22. IGF-II mRNA-結合タンパク質 1 (gi|4191608, SEQ ID NO:22)
23. NADPH: キノンレダクターゼ(gi|13236495, SEQ ID NO:23)
24. ヒトコ-シャペロンP23の結晶構造(hsp-90コ-シャペロン) (gi|9257073, SEQ ID NO:24)
肝臓疾患関連細胞系由来の抗体で同定した自己抗原を以下の表1に示す。表1の左側には、GI番号およびそのタンパク質名を、およびその右側には、肝硬変または肝癌に罹っている患者の血清を用いて、細胞系から同定できる自己抗原を示す。示されたように、これらの自己抗原は、単一の肝臓疾患においてのみ存在するのではなく、これらは繰返し、起源を異にする血清中の自己抗体を用いて、様々な細胞系において同定されており、このことは肝臓疾患との密接な相関関係の存在を示している。表1に掲載したタンパク質の幾つかは、2つのGI番号を持つ。これは、該タンパク質およびその変異型が、マススペクトルにおいて同様な結果を示すからである。
実施例2：上記自己抗原スクリーニング法により同定される自己抗原の入手性の測定
実施例1で同定された24種の自己抗原の入手性を立証するために、正常なヒト、肝硬変患者および肝癌患者由来の血清サンプルに関するアッセイを、イムノアッセイ(ELISA、RIAまたは免疫蛍光法)および上記24種のバイオマーカーを使用して、実施した。このアッセイ法は、図2に示すように、以下に説明する段階を含む。試料を調製する工程；SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型もしくはこれらの組み合わせの何れか1種から選択されるバイオマーカーを用いて、該試料中の自己抗体を捕獲する工程；および該自己抗体を検出する工程。
酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)の例においては、以下の段階を採用する：まず、該バイオマーカーを被覆バッファー(a. 50mMのNa2HCO3, pH=9.6;またはb. 20mMのTris-HCl, pH=8.5;またはc. 10mMのPBS, pH=7.4から選択)で、0.5〜10μg/mlなる濃度まで希釈し、ここで該被覆バッファーは、該バイオマーカーのPI値に従って選択され、好ましくはpIよりも高いpH1〜2を持つバッファーを選択する。100μl/ウエルのバイオマーカー液をELISAプレートに添加し、4℃にて一夜これを放置して、固定化させた。
実施例1で同定された24種の自己抗原の入手性を立証するために、正常なヒト、肝硬変患者および肝癌患者由来の血清サンプルに関するアッセイを、イムノアッセイ(ELISA、RIAまたは免疫蛍光法)および上記24種のバイオマーカーを使用して、実施した。このアッセイ法は、図2に示すように、以下に説明する段階を含む。試料を調製する工程；SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:24に記載されたアミノ酸配列またはその誘導体またはフラグメントまたはその変異型もしくはこれらの組み合わせの何れか1種から選択されるバイオマーカーを用いて、該試料中の自己抗体を捕獲する工程；および該自己抗体を検出する工程。
酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)の例においては、以下の段階を採用する：まず、該バイオマーカーを被覆バッファー(a. 50mMのNa2HCO3, pH=9.6;またはb. 20mMのTris-HCl, pH=8.5;またはc. 10mMのPBS, pH=7.4から選択)で、0.5〜10μg/mlなる濃度まで希釈し、ここで該被覆バッファーは、該バイオマーカーのPI値に従って選択され、好ましくはpIよりも高いpH1〜2を持つバッファーを選択する。100μl/ウエルのバイオマーカー液をELISAプレートに添加し、4℃にて一夜これを放置して、固定化させた。
手順を継続するために、該プレートを、PBSTバッファー(PBSTバッファー：PSBバッファー+0.05％Tween-20)で2回洗浄することにより、未結合のバイオマーカーを除去し、次いで200μl/ウエルの遮断バッファー(a. ゼラチン-NET: 0.5%ゼラチン、0.15MのNaCl、5mMのEDTA・2Na、0.05％のTween-20、50mMのTris塩基、またはb. 1% BSA-PBS, pH=7.4、またはc. 5%の脱脂ミルク-PBS、pH=7.4から選択)を添加し、周囲温度下で、少なくとも2時間遮断反応を行い；この反応の完了後、PBSTバッファーで3回洗浄し、100μl/ウエルの血清溶液をアッセイに供した(血清溶液は、該血清サンプルを、該遮断バッファーで1000倍に希釈することにより得た)。この時点において、該血清中の自己抗体は、固定化したバイオマーカーと反応するであろう。周囲温度での少なくとも2時間の反応の後、該プレートをPBSTバッファーで4回洗浄し、次に100μl/ウエルの二次抗体(該遮断バッファーで5000倍に稀釈)を添加した。この時点で、該二次抗体は、該自己抗体を認識し、かつ吸着するであろう。周囲温度での少なくとも1時間の反応の後、該プレートをPBSTバッファーで5回洗浄した。次いで、100μl/ウエルのTMBを添加し、30分間に渡り発色反応を誘発させた。その後、100μl/ウエルの0.5M H2SO4を添加し、また450nmにおける吸光度を測定した。
該自己抗体の発現を、肝硬変および/または肝癌の診断において、確実に使用可能とするために、ELISAを使用して、夫々の自己抗原によって同定された如き、正常なヒト、肝硬変患者および肝癌患者由来の血清中の自己抗体の吸光度値を得る。5種のタンパク質、即ちGADPH、NADPH、HMG-1、NM23およびサイトケラチンから導かれたデータを、生物統計学的解析およびウイルコクソン/マン/ホイットニーテスト(Wilcoxon-Mann-Whitney Test)に掛けた。以下の表に示すように、95％の信頼度で、以下のような結果を得た。
正常なヒト、肝硬変患者および肝癌患者におけるバイオマーカーにより検出される自己抗体の発現間には差異があるものと仮定すると、上記表は、このような仮定が、正常なヒトvs.肝硬変患者および正常なヒトvs. 肝癌患者において妥当であることを示しており、このことは、正常なヒトと肝硬変患者との間および正常なヒトと肝癌患者との間において見られる、バイオマーカーにより検出される自己抗体の発現レベルにおける差が、統計的に有意であることを意味している。
統計処理は、正常なヒトおよび肝硬変患者における、GADPH-検出自己抗体の発現レベルが、8.375倍異なっており、一方正常なヒトおよび肝癌患者におけるそれは、4.86倍異なっていることを示し、また正常なヒトおよび肝硬変患者における、HMG-1-検出自己抗体の発現レベルは、74倍異なっており、かつ正常なヒトおよび肝硬変患者における、NM23-検出自己抗体の発現レベルは、24倍異なっており、一方で正常なヒトおよび肝癌患者におけるそれは、8.545倍異なっていることを示している。これらの結果は、ここに与えられた24種の自己抗原によって検出されるような、肝硬変および肝臓癌患者の、抗体発現レベルが、正常なヒトにおけるこれらの値よりも高いことを証明している。従って、イムノアッセイと組み合わせた、これら24種の自己抗原を使用する検出キットは、スクリーニングされる検体における自己抗体の発現レベルに基いて、肝硬変および肝癌をスクリーニングすることを可能とする。
上記のような好ましい本発明の態様は、本発明を限定することを意味するものではない。本発明の精神および添付した特許請求の範囲を逸脱すること無しに、当業者によってなし得るあらゆる改良並びに変更は、本発明の保護されるべき範囲および特許請求の範囲に入るはずである。
上記のような好ましい本発明の態様は、本発明を限定することを意味するものではない。本発明の精神および添付した特許請求の範囲を逸脱すること無しに、当業者によってなし得るあらゆる改良並びに変更は、本発明の保護されるべき範囲および特許請求の範囲に入るはずである。
Claims (14)
- SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:20又はSEQ ID NO:23に記載されたアミノ酸配列に対する抗体から選択される、肝臓疾患用バイオマーカー。
- 該肝臓疾患が肝硬変または肝臓癌である、請求項１記載のバイオマーカー。
- SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:20又はSEQ ID NO:23に記載されたアミノ酸配列から選択される、抗原、及び
該抗原のいずれか１種に対する自己抗体を認識できる、二次抗体
を含むことを特徴とする、肝臓疾患用の検出キット。 - 該肝臓疾患が肝硬変または肝臓癌である、請求項３記載の検出キット。
- 肝臓疾患をスクリーニングする方法であって、
SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:20又はSEQ ID NO:23に記載されたアミノ酸配列から選択される抗原を用いて、試料中の自己抗体を同定し、かつ捕獲する工程と；
該自己抗体を認識し、かつ吸着する二次抗体を使用する工程
を含むことを特徴とする、上記スクリーニング方法。 - 該試料が、全血または血清である、請求項５記載の方法。
- 該試料が血清である、請求項５記載の方法。
- 該抗原を、検出用のキットとすることができる、請求項５記載の方法。
- 該抗原を、まず基板上に固定化する、請求項５記載の方法。
- 該基板が、イムノアッセイ用プレートまたはバイオチップである、請求項９記載の方法。
- 該試料を、まず蛍光マーカーで標識する、請求項５記載の方法。
- 該二次抗体が、発色反応、放射能または蛍光によって検出できる特別な官能基により修飾されている、請求項５記載の方法。
- 該自己抗体の検出を、蛍光スキャナーを用いて、蛍光標識された自己抗体を検出することにより達成する、請求項５記載の方法。
- 該自己抗体の検出を、酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)または免疫蛍光により、該二次自己抗体を検出することにより達成する、請求項５記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW092136309A TWI281473B (en) | 2003-12-19 | 2003-12-19 | Biomarkers for liver diseases and method for using same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005181342A JP2005181342A (ja) | 2005-07-07 |
| JP4105156B2 true JP4105156B2 (ja) | 2008-06-25 |
Family
ID=34676141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004382611A Active JP4105156B2 (ja) | 2003-12-19 | 2004-12-17 | 肝臓疾患用バイオマーカーおよびその使用方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20050136489A1 (ja) |
| JP (1) | JP4105156B2 (ja) |
| TW (1) | TWI281473B (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006232370B2 (en) * | 2005-04-01 | 2011-10-06 | Banyan Biomarkers | Biomakers of liver injury |
| US8048638B2 (en) * | 2005-04-01 | 2011-11-01 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Biomarkers of liver injury |
| GB0512401D0 (en) * | 2005-06-17 | 2005-07-27 | Randox Lab Ltd | Method |
| JP4283812B2 (ja) * | 2006-01-06 | 2009-06-24 | 財団法人工業技術研究院 | 重症筋無力症の診断方法およびそのキット |
| DE102006048249A1 (de) * | 2006-08-10 | 2008-02-14 | Wolff Prof. Dr. Schmiegel | Biomarker für Leberentzündung |
| WO2008031051A2 (en) | 2006-09-08 | 2008-03-13 | United Therapeutics Corporation | Clinical diagnosis of hepatic fibrosis using a novel panel of human serum protein biomarkers |
| JP2009114092A (ja) * | 2007-11-02 | 2009-05-28 | Mcbi:Kk | 慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のための新規バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法 |
| CN101925364B (zh) | 2007-11-27 | 2014-04-30 | 不列颠哥伦比亚大学 | 用于预防和治疗关节炎的14-3-3拮抗剂 |
| EP2406633B1 (en) * | 2009-03-11 | 2019-01-16 | Augurex Life Sciences Corp. | Compositions and methods for characterizing arthritic conditions |
| WO2010133967A1 (en) | 2009-05-14 | 2010-11-25 | University Of Oxford | Clinical diagnosis of hepatic fibrosis using a novel panel of low abundant human plasma protein biomarkers |
| EP2531224B1 (en) | 2010-01-26 | 2019-06-05 | Bioregency, Inc. | Compositions and methods relating to argininosuccinate synthetase |
| US8389684B2 (en) * | 2010-09-13 | 2013-03-05 | Tsinghua University | Tumor biomarker |
| WO2013056377A1 (en) | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Augurex Life Sciences Corporation | Antigens derived from citrullinated 14-3-3 and uses thereof in the diagnosis of rheumatoid arthritis |
| AU2013337264B2 (en) * | 2012-11-05 | 2018-03-08 | Foundation Medicine, Inc. | Novel fusion molecules and uses thereof |
| CN103901212B (zh) * | 2014-03-28 | 2015-07-22 | 西北大学 | 一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片及其应用 |
| US9885718B2 (en) | 2014-07-02 | 2018-02-06 | Dragon Victory Development Ltd. | Specific biomarker set for non-invasive diagnosis of liver cancer |
| US9506925B2 (en) | 2014-07-02 | 2016-11-29 | Dragon Victory Development Ltd. | Specific biomarker set for non-invasive diagnosis of liver cancer |
| KR101750411B1 (ko) | 2015-07-10 | 2017-06-27 | 한국생명공학연구원 | 엑소좀 단백질 eif3a 특이반응 오토항체검출용 항원 조성물 및 이를 이용한 간암진단법 |
| GB201614455D0 (en) | 2016-08-24 | 2016-10-05 | Univ Oxford Innovation Ltd | Biomarkers |
| GB201619954D0 (en) * | 2016-11-25 | 2017-01-11 | Oncimmune Ltd | Antibody assay |
| CN111370131B (zh) * | 2018-12-26 | 2023-06-09 | 陈治平 | 经由疾病轨迹筛选生物标记的方法及系统 |
| TWI719380B (zh) * | 2018-12-26 | 2021-02-21 | 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院 | 經由疾病軌跡篩選生物標記的方法及系統 |
| CN114113611B (zh) * | 2021-12-13 | 2023-07-14 | 郑州大学 | 一种用于肝癌诊断的生物标志物及检测试剂盒 |
| CN117388494A (zh) * | 2023-10-08 | 2024-01-12 | 烟台普罗吉生物科技发展有限公司 | 一种肿瘤标志物在肿瘤诊断及肿瘤治疗监测产品中的应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4487830A (en) * | 1982-05-14 | 1984-12-11 | American Hoechst Corporation | Enzyme/immunofluorescent assay for autoantibodies |
| EP0809283A3 (en) * | 1989-08-28 | 1998-02-25 | Hitachi, Ltd. | Method of treating wafers |
| ES2164634T3 (es) * | 1989-10-18 | 2002-03-01 | Us Health | Produccion y uso de proteina nm23-h2 humana y anticuerpos previstos a tal efecto. |
| JP3267893B2 (ja) | 1997-05-15 | 2002-03-25 | 鐘淵化学工業株式会社 | 自己免疫疾患の診断薬 |
| US20030153013A1 (en) * | 2002-11-07 | 2003-08-14 | Ruo-Pan Huang | Antibody-based protein array system |
-
2003
- 2003-12-19 TW TW092136309A patent/TWI281473B/zh not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-17 JP JP2004382611A patent/JP4105156B2/ja active Active
- 2004-12-17 US US11/013,684 patent/US20050136489A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-03-07 US US12/073,603 patent/US20080241863A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-04-20 US US12/763,453 patent/US8076089B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20100261209A1 (en) | 2010-10-14 |
| US8076089B2 (en) | 2011-12-13 |
| TW200521139A (en) | 2005-07-01 |
| TWI281473B (en) | 2007-05-21 |
| JP2005181342A (ja) | 2005-07-07 |
| US20080241863A1 (en) | 2008-10-02 |
| US20050136489A1 (en) | 2005-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4105156B2 (ja) | 肝臓疾患用バイオマーカーおよびその使用方法 | |
| US11199549B2 (en) | MEl'hods and means for diagnosing spondylarthritis using autoantibody markers | |
| KR20120112621A (ko) | Ｊｃ 바이러스 항체에 대한 검정법 | |
| AU2015238816B2 (en) | A method for diagnosing primary biliary cirrhosis (pbc) using novel autoantigens | |
| US20120295814A1 (en) | CA-125 Immune Complexes as Biomarkers of Ovarian Cancer | |
| WO2001088543A2 (en) | Methods and compositions for diagnosing chronic immune disease | |
| CN108948153B (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽抗原组合及其应用 | |
| WO2015119582A1 (en) | Fluorometric immunoassay for detection of anti-dsdna antibodies | |
| JP3851646B2 (ja) | 自己抗原のスクリーニング法 | |
| WO2006054806A1 (ja) | クローン病関連自己抗原 | |
| EP0107861B1 (en) | Diagnostic test for rheumatological diseases | |
| CN108948173B (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽及其应用 | |
| CN108948174B (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽及其应用 | |
| JPWO2011138955A1 (ja) | Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法 | |
| JP5605375B2 (ja) | Ｋｕ８６に対する自己抗体の免疫測定方法、それに用いるキット、及びそれを用いた原発性肝細胞癌の判定方法 | |
| KR102131860B1 (ko) | 아르기닌이 메틸화된 ggt1에 특이적으로 결합하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물 | |
| JP5876673B2 (ja) | 精神障害の診断方法および診断薬キット | |
| US20130217015A1 (en) | Hmga2 as a biomarker for diagnosis and prognosis of ovarian cancer | |
| EP1635691A2 (en) | Methods and compositions for use in diagnosing and characterizing diseases involving abnormal apoptosis | |
| JP2023542587A (ja) | 原発性胆汁性肝硬変を診断するための組成物及び方法 | |
| KR20220111630A (ko) | 폐암 혈액 바이오마커의 검출 방법 및 키트 | |
| JP2000178299A (ja) | ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む慢性関節リウマチ診断用免疫試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20061206 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061211 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070312 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070611 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070911 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070914 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20071011 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20071016 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071112 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080204 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080208 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080317 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080326 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4105156 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110404 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120404 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120404 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130404 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130404 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140404 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |