KR102245638B1 - 구제역바이러스 유전자의 특정 변이 부위를 이용한 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물 - Google Patents

구제역바이러스 유전자의 특정 변이 부위를 이용한 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구제역바이러스 유전자의 특정 변이 부위를 이용한 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물에 대한 것으로서, 우리나라에서 최근 10년 동안 발생한 FMDV 바이러스 유전자 서열을 분석하고 이 중에서 CRE 유전자 서열의 변이를 비교한 결과, 소에 감염된 FMDV와 돼지에서 감염된 FMDV 바이러스 CRE의 RNA 서열의 특이적인 변이 특성을 규명하였다. 소와 돼지 특이적인 CRE 유전자 변이는 RNA 분자의 2차구조의 특이성을 만들어내고 있으며, 이 특이적인 CRE RNA 2차구조에 결합하는 소와 돼지의 숙주인자가 다르기 때문에 FMDV 바이러스 감염의 종특이성이 결정되는 원인으로 분석되었다. 본 발명에 따른 FMDV CRE의 특이적인 RNA 2차구조에 변화를 유도하는 특정 RNA 염기변이 정보는 소와 돼지의 종특이성 감염의 조기진단을 가능하게 하는 기술로서, 간편하게 현장 적용이 가능하다.

Description

구제역바이러스 유전자의 특정 변이 부위를 이용한 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for identifying host infection species of foot-and-mouth disease virus using specific gene variation site of foot-and-mouth disease virus}
본 발명은 구제역바이러스 유전자의 특정 변이 부위를 이용한 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물에 대한 것이다.
구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus; FMDV)는 우리나라에서 거의 매년 소 또는 돼지에서 감염이 발생하여 살처분 등 막대한 경제적 피해를 입히고 있다. 구제역바이러스는 주로 소와 돼지에 감염되지만, 감염의 용이성과 바이러스의 전파 능력 등에 있어서 큰 차이를 보이고 있는데, 소에서의 감염이 더 잘 발생되지만, 바이러스의 복제와 전파능력은 돼지에서 훨씬 크다.
FMDV 바이러스 유전자는 전체 8500여개의 RNA 염기로 구성되어 있고, 이 전체 바이러스 유전자는 몇 개의 기능적 단위로 구분될 수 있다. 이 유전자 구성 중에서 시스-작용 복제 인자(cis-Acting Replication Element; CRE) 이라고 불리는 55개 RNA 염기로 이루어진 영역이 FMDV 바이러스의 전체 게놈 유전자 복제를 조절하는 것으로 알려져 있다.
현재 우리나라에서 구제역이 발생되면 방역정책으로서 감염장소 주변의 모든 동물들의 살처분이나 백신 접종을 통한 전염 방지 대응을 행하고 있다. 백신 접종의 경우 감염대상 동물에 대한 정보를 감염 초기에 알 수 있다면 그 동물에 대한 효율적이고 빠른 방역 대응이 가능해질 수 있다. 이와 같은 배경으로서, 신종 구제역바이러스가 출현할 시, 바이러스 전파가 일어나기 전에 바이러스 유전자의 분석으로 숙주감염 종특이성을 조기진단할 수 있다면 국가적인 방역정책의 효율성을 제고할 수 있다. 하지만, 지금까지의 구제역바이러스와 관련된 기술들은 대부분 백신 개발과 감염진단 기술에 관한 내용이며, 아직 국내외에서 구제역바이러스의 감염 종특이성에 관한 기술의 제안이나 연구논문은 전무한 실정이다.
한국공개특허 제10-2019-0092821호 (2019.08.08. 공개)
본 발명의 목적은 구제역바이러스 유전자의 특정 변이 부위를 이용한 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시스-작용 복제 인자(cis-Acting Replication Element; CRE)를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus; FMDV) 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CRE에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 CRE를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 시료로부터 구제역바이러스를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 구제역바이러스로부터 RNA를 추출하는 단계; 및 (3) 상기 추출된 구제역바이러스 RNA로부터 CRE의 RNA 2차 구조를 분석하는 단계를 포함하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법을 제공한다.
본 발명은 구제역바이러스 유전자의 특정 변이 부위를 이용한 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물에 대한 것으로서, 우리나라에서 최근 10년 동안 발생한 FMDV 바이러스 유전자 서열을 분석하고 이 중에서 CRE 유전자 서열의 변이를 비교한 결과, 소에 감염된 FMDV와 돼지에서 감염된 FMDV 바이러스 CRE의 RNA 서열의 특이적인 변이 특성을 규명하였다. 소와 돼지 특이적인 CRE 유전자 변이는 RNA 분자의 2차구조의 특이성을 만들어내고 있으며, 이 특이적인 CRE RNA 2차구조에 결합하는 소와 돼지의 숙주인자가 다르기 때문에 FMDV 바이러스 감염의 종특이성이 결정되는 원인으로 분석되었다. 본 발명에 따른 FMDV CRE의 특이적인 RNA 2차구조에 변화를 유도하는 특정 RNA 염기변이 정보는 소와 돼지의 종특이성 감염의 조기진단을 가능하게 하는 기술로서, 간편하게 현장 적용이 가능하다.
도 1은 FMDV 전체 유전자 구성를 나타내는데, 단백질 코딩영역과 복제조절영역을 나타낸다.
도 2는 11개 국내발생 FMDV CRE 유전자 변이 분석 결과를 나타낸다. (A),(B) FMDV 유전형에 따른 CRE 변이 분석. (C),(D) 소(C)와 돼지(D) 감염 FMDV CRE 변이 분석.
도 3은 11개 국내발생 FMDV 계통수(phylogenetic tree) 분석 결과를 나타낸다. (왼쪽) 전체 유전자 대상, (오른쪽) CRE 유전자 대상 분석.
도 4는 11개 국내발생 FMDV CRE 영역의 RNA 2차구조 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 FMDV CRE에 차별적으로 반응하는 소와 돼지 숙주세포 복제조절인자의 상호작용 모델을 나타낸다.
본 발명은 시스-작용 복제 인자(cis-Acting Replication Element; CRE)를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus; FMDV) 감염숙주 종판별용 바이오마커 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 바이오마커 조성물은 구제역바이러스 감염숙주가 소 또는 돼지인지 판별할 수 있다.
본 발명에 있어서, “바이오마커(biomarker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
또한, 본 발명은 CRE에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 CRE를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 상기 CRE의 RNA 2차 구조를 분석하기 위한 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 조성물은 구제역바이러스 감염숙주가 소 또는 돼지인지 판별할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2+와 같은 조인자 등일 수 있다.
본 발명은 (1) 시료로부터 구제역바이러스를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 구제역바이러스로부터 RNA를 추출하는 단계; 및 (3) 상기 추출된 구제역바이러스 RNA로부터 CRE의 RNA 2차 구조를 분석하는 단계를 포함하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 CRE의 RNA 2차 구조를 분석하는 단계는 CRE의 RNA 2차 구조 내 루프(loop) 구조 아래에 형성된 스템(stem)의 염기 길이 또는 상기 스템(stem) 아래 형성된 다각형의 도형 구조를 분석할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 CRE의 RNA 2차 구조 내 루프(loop) 구조 아래에 형성된 스템(stem)의 염기 길이가 7개의 염기로 구성되는 경우, 구제역바이러스의 감염숙주는 돼지인 것으로 판단할 수 있고, 상기 CRE의 RNA 2차 구조 내 루프(loop) 구조 아래에 형성된 스템(stem)의 염기 길이가 6개 또는 8개의 염기로 구성되는 경우, 구제역바이러스의 감염숙주는 소인 것으로 판단할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 CRE의 RNA 2차 구조 내 상기 스템(stem) 아래 형성된 다각형의 도형 구조가 7각형(heptagon)인 경우, 구제역바이러스의 감염숙주는 돼지인 것으로 판단할 수 있고, 상기 CRE의 RNA 2차 구조 내 상기 스템(stem) 아래 형성된 다각형의 도형 구조가 5각형(pentagon)인 경우, 구제역바이러스의 감염숙주는 소인 것으로 판단할 수 있다.
시료로부터 구제역바이러스를 분리하고, 분리된 구제역바이러스로부터 RNA를 추출하여 RNA 2차 구조를 분석하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실시예 >
1. 실험방법
국내에서 구제역은 2000년부터 시작하여 올해 2019년까지 발생하고 있다. 현재 농림축산검역본부에서 2000년부터 2018년까지 발생한 구제역에서 추출한 구제역바이러스(FMDV)의 전장 유전자 서열을 확보하고 있는데, 이들 유전자 정보를 공동연구를 통하여 확보하고 각 FMDV 간의 유전자 변이 내용을 분석 진행하였다.
전체 54개 FMDV 중에서 2010년부터 2017년까지 발생연도와 발생장소를 대표하는 11개 FMDV의 유전자 서열을 분석하였다.
No. Isolate Serotype Topotype& Genotype Host
species		 Collected
year		 Accession no.
1 O/AD/SKR/2010/C O SEA/Mya-98 Swine 2010 KF112887
2 O/GH/SKR/2010/C O SEA/Mya-98 Swine 2010 KF002886
3 A/PC/SKR/2010/C A Asia/Sea-97 Swine 2010 KC588943
4 O/08/SKR/2011/C O SEA/Mya-98 Cattle 2011 KR401160.1
5 O/JC/SKR/2014/P O SEA/Mya-98 Swine 2014 KX162590
6 O/US/SKR/2014/P O SEA/Mya-98 Swine 2014 KY322674.1
7 O/GJ/SKR/2016/P O SEA/Mya-98 Swine 2016 KY086465
8 O/GC/SKR/2016/P O SEA/Mya-98 Swine 2016 KY086466
9 O/BE/SKR/2017/C O ME-SA/Ind2001e Cattle 2017 *APQA
10 O/JE/SKR/2017/C O ME-SA/Ind2001e Cattle 2017 *APQA
11 A/YC/SKR/2017/C A Asia/Sea-97 Cattle 2017 *APQA
* Unpublished sequence by APQA
표 1에 제시된 것과 같이 2010년부터 2017년까지 국내에서 발생한 구제역 감염 소와 돼지에서 추출한 구제역바이러스(FMDV)을 감염조직에서 분리하였다.
분리한 11종 FMDV 유전자 서열을 분석하고 각 바이러스 유전자들의 변이 내용을 비교하였다. 특히 FMDV 복제조절영역인 CRE 부위의 유전자 변이에 초점을 맞추고 분석을 진행하였. CRE 부위 55개의 RNA 염기서열을 Fold Web Server (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Fold/Fold.html) 프로그램을 이용하여 가장 낮은 자유에너지를 가지는 조건에서 최적의 RNA 2차구조를 분석하였다.
2. 실험결과
FMDV는 약 8500개의 RNA 염기서열로 이루어져 있으며, 5'과 3' 말단에 FMDV 복제 조절 영역이 위치하고 있다(도 1). 특히 FMDV 게놈 복제 조절에 중요한 CRE와 단백질 번역에 필요한 IRES가 전체 FMDV 유전자 발현과 복제에 필수적인 것이 알려져 있다.
CRE는 전체 55개의 RNA 염기서열로 구성되어있으며, 도 1에서 보듯이 AAACA의 잘 보존된 서열을 중심으로 stem-loop 2차구조를 형성하고 있다.
FMDV 감염의 숙주종 특이성 결정은 크게 2가지 요인으로 해석된다. 하나는 FMDV이 세포접촉시 숙주세포들의 다른 세포막 수용체의 차이이고, 또 다른 하나는 숙주세포 내에서의 FMDV 복제 효율성에 있다. CRE는 FMDV 복제에 필수적인 조절영역으로서 CRE에 숙주세포 복제인자들이 결합하여 FMDV 복제를 유도하게 되는데, 숙주세포 복제인자가 효율적으로 결합하기 위해서는 이에 맞는 CRE의 2차구조 형성이 필요하다.
앞에서 언급한 국내 구제역 발생에서 추출한 FMDV 전체 유전자 중에서 CRE 부위에 대한 11개 FMDV의 유전자 변이를 비교분석하였다(도 2).
도 2C는 소에서 감염된 FMDV CRE 염기서열이며, 도 2D는 돼지 감염에서 추출한 CRE 서열을 나타낸다. 소와 돼지 바이러스 간에 유전자 변이 패턴을 찾을 수 있었다. 이들 11개 FMDV 전체 유전자 서열과 CRE 서열을 구분하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다(도 3).
도 3 왼쪽이 FMDV 전체 유전자 서열을 이용한 계통수(phylogenetic tree)이고, 오른쪽이 CRE 유전자 서열로 작성한 계통수(phylogenetic tree)이다. 2010년과 2014년 그리고 2016년 FMDV에서 상호관련성을 보이고 있다. 하지만 유전자 서열 비교만으로는 2010년 FMDV의 소 감염과 2014년과 2016년 돼지 감염 FMDV 차이를 볼 수 없다. 이에 CRE 유전자 서열 정보를 다른 측면에서 분석하였다.
RNA는 DNA처럼 염기서열 자체가 아니라 2차구조 형성이 중요하기 때문에 11개의 FMDV CRE 55개 염기서열의 RNA 2차구조를 분석하였다(도 4).
도 4 왼쪽에 표시된 4개의 돼지 감염 FMDV CRE와 나머지 7개 소 감염 FMDV CRE의 RNA 2차구조를 비교하면 크게 2가지의 다른 구조를 관찰할 수 있다. 첫째는 stem 밑쪽에 위치한 도형 구조가 돼지는 7각형을 형성하지만, 소에서는 5각형을 이루고 있다. 둘째는 loop 구조 밑에 형성된 stem의 길이인데, 돼지 FMDV CRE는 7개이지만, 소 FMDV는 8개와 6개 염기로 구성되어있다(도 4).
이런 특이 RNA 2차구조는 종이 다른 숙주세포의 특정 복제인자가 결합하는 차이를 가능하게 한다. 도 5의 모델에서 보듯이, FMDV 복제를 위해서는 2개의 FMDV 단백질인 3B와 3D가 필요하다. 3B는 FMDV 게놈 복제개시를 위한 프라이머 형성에 필요하며, 3D는 게놈복제효소로 기능을 수행한다. 도 5의 모델처럼 FMDV 3B/3D가 CRE에 결합하기 위해서는 숙주세포의 특정 복제인자의 선택적 결합이 필요로 할 수 있다.
결과적으로, 구제역 발생시 소나 돼지 감염조직에서 추출한 FMDV의 CRE 영역 55개의 염기서열을 분석하고 이에 대한 RNA 2차구조를 해석한 결과로, 신규 FMDV가 소나 돼지 중에서 어떤 동물종을 숙주로 잘 감염되는지를 5시간 이내에 판별이 가능하게 된다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (1) 분리된 시료로부터 구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus; FMDV)를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 구제역바이러스로부터 RNA를 추출하는 단계; 및
    (3) 상기 추출된 구제역바이러스 RNA로부터 시스-작용 복제 인자(cis-Acting Replication Element; CRE)의 RNA 2차 구조를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 구제역바이러스의 감염숙주가 소 또는 돼지인지 판별하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CRE의 RNA 2차 구조를 분석하는 단계는 CRE의 RNA 2차 구조 내 루프(loop) 구조 아래에 형성된 스템(stem)의 염기 길이 또는 상기 스템(stem) 아래 형성된 다각형의 도형 구조를 분석하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CRE의 RNA 2차 구조 내 루프(loop) 구조 아래에 형성된 스템(stem)의 염기 길이가 7개의 염기로 구성되는 경우, 구제역바이러스의 감염숙주는 돼지인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 CRE의 RNA 2차 구조 내 루프(loop) 구조 아래에 형성된 스템(stem)의 염기 길이가 6개 또는 8개의 염기로 구성되는 경우, 구제역바이러스의 감염숙주는 소인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 CRE의 RNA 2차 구조 내 상기 스템(stem) 아래 형성된 다각형의 도형 구조가 7각형(heptagon)인 경우, 구제역바이러스의 감염숙주는 돼지인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 CRE의 RNA 2차 구조 내 상기 스템(stem) 아래 형성된 다각형의 도형 구조가 5각형(pentagon)인 경우, 구제역바이러스의 감염숙주는 소인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 감염숙주 종판별 방법.
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