CN101509923A - 用于检测抗原/或抗体的诊断片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

用于检测抗原/或抗体的诊断片及其制备方法，属血清学检测抗原/或抗体技术领域。其目的是提供一种能够简便、敏感、快速检测抗原/或抗体的诊断片及其制备方法，以适应血清学检测的应用需要。其技术要点：将纸质吸水材料、玻璃纤维、吸附有抗原/或抗体标记的琼脂糖凝胶、吸附有酶标记抗体/或抗原的玻璃纤维载体、吸附有酶催化反应的相应底物的玻璃纤维载体，以及纸质吸水材料，自上而下依次固定在条形塑料底衬上，经真空干燥，即得用于检测抗原/或抗体的诊断片。其综合了血清学中特异性抗原抗体反应，层析中蛋白分子可迁移和固定以及酶促反应敏感显见的特点，具有特异、简便、敏感和快速的优点。

Description

用于检测抗原/或抗体的诊断片及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种用于检测抗原/或抗体的诊断片及其制备方法，属血清学检测抗原/或抗体技术领域。

背景技术：

血清学反应是抗原抗体的特异性反应。经典血清学反应的凝聚性反应，是通过抗原抗体在介质中以不同形式的扩散和迁移，在特定部位结合，最终形成肉眼可见的抗原抗体复合物：沉淀带或凝集片。在现代标记技术中，通过检测被标记的酶(酶促反应)、同位素或荧光素等发现抗原抗体反应的存在，所以可以检测极微量的抗体或抗原。比较两类反应，前者简便，不需要特殊仪器设备而敏感性差；后者敏感性高却需要特殊仪器检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够简便、敏感、快速检测抗原/或抗体的诊断片，以适应血清学检测的应用需要。

本发明的另一目的是提供一种用于检测抗原/或抗体诊断片的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术措施和步骤实现的：

一种用于检测抗原/或抗体的诊断片，其特征在于：在条形塑料底衬上，自上而下依次固定有纸质吸水材料、玻璃纤维、吸附有抗原/或抗体标记的琼脂糖凝胶、吸附有酶标记抗体/或抗原的玻璃纤维载体、吸附有酶催化反应的相应底物的玻璃纤维载体，以及纸质吸水材料。

其制备方法是：

1)将纯化的抗原/或抗体标记在琼脂糖载体上，干燥成型，得抗原/或抗体标记的琼脂糖凝胶：

2)将相应的纯化抗体/或抗原用酶进行标记，吸附于玻璃纤维载体，干燥，得酶标记抗体/或抗原的玻璃纤维载体：

3)取与上述2)酶所催化的相应底物，溶解吸附于玻璃纤维载体，干燥，得酶催化反应的底物的玻璃纤维载体：

4)将纸质吸水材料和吸附有抗原/或抗体标记的琼脂糖凝胶、吸附有酶标记抗体/或抗原的玻璃纤维载体、吸附有酶催化反应的相应底物的玻璃纤维载体，以及纸质吸水材料，自上而下依次固定在条形塑料底衬上，经真空干燥，即得用于检测抗原/或抗体的诊断片。

其技术效果是：与传统血清学沉淀反应和标记技术相比较，本发明的用于检测抗原/或抗体的诊断片由于根据凝聚性反应原理，把抗原/或抗体结合在琼脂糖分子上(即抗原/或抗体被固定在凝胶中)，并结合了现代酶标记技术，改进了传统沉淀反应中需大量抗原抗体才能形成肉眼可见的沉淀带，提高了敏感性，使少量或极少量抗原抗体的结合就能因酶标抗体/或抗原的存在而被显色发现；同时，本发明依据亲和层析和血清学沉淀反应原理，将相关材料固定于条形塑料底衬上，使用时只要将条形片一端放置于样品中，不需要仪器设备，也无需其他操作，就能简便、快速的检测出抗原/或抗体的结果。

附图说明

图1是本发明的诊断片结构示意图；

图2是采用诊断片检测抗原/或抗体的操作与判读示意图；其中，图2A是将诊断片浸入样品内示意图，图2B是检测呈阳性反应示意图，图2C是检测呈阴性反应示意图；

图3是诊断片中抗原抗体反应与显色示意图。

具体实施方式

实施例1。制备用于检测抗原的诊断片。

1)制备抗原标记的琼脂糖凝胶

1.1溴化氰活化琼脂糖

直接购买的商品溴化氰活化琼脂糖(CNBr-activated Sepharose 4B)。

1.2标记

1.2.1取3.7g干胶置50ml 1mM HCl加予以膨胀，膨胀后，用800ml1mMHCl分4次，每次约用15min.进行清洗。

1.2.2取110～200mg(6～7ml，15～30mg/ml)需标记的抗原，经用0.1M NaHCO₃(pH 8.3，含0.5M NaCl)透析(4℃，隔夜)，离心(10000rpm，10min.)和经0.2或0.4μm孔径的滤膜过滤。清洗后的凝胶浆再用0.1M NaHCO₃作最后一次处理，滤干后加入已处理过的标记物，在4℃旋转混合16h，或室温1～2h。

1.2.3用5倍体积(约100ml)0.1M NaHCO₃(同上)清洗未结合的标记物；转至30ml的Tris-HCl液(0.1M，pH 8.0)中，放置2h；用两种不同pH缓冲液(0.1M醋酸盐，pH 4.0，含0.5NaCl；0.1M Tris-HCl，pH 8，含0.5M NaCl)，交替清洗三个循环，每次不少于5倍体积。

1.3干燥成型

将琼脂糖-抗原脱水干燥成型(约0.2mm厚)。

2)制备酶标记抗体

2.1抗体制备与纯化

2.1.1抗体制备  按常规用纯化抗原免疫青年健康家兔(1mg抗原/kg体重，四次免疫注射：首免加氟氏完全佐剂，14天和21天加氟氏不完全佐剂，均经乳化；28天根据血清抗体效价，直接静脉免疫)。抗体效价为沉淀反应(琼脂糖双扩散1∶64)以上最佳)。

2.1.2抗体纯化  采血分离血清，经50％、33％、33％饱和硫酸铵盐析和透析去除血清白蛋白。

2.2酶标记(以过碘酸钠一步法标记辣根过氧化物酶为例)

2.2.1称取2mg(HRP)溶于2mL蒸溜水，置10mL烧杯内在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。加入配制好的0.06mol/L NaIO₄ 2mL，混匀4℃放置30min。加入0.16mol/L乙二醇溶液2mL，混匀室温放置30min。

2.2.2与含20mg蛋白质抗原(或抗体)的溶液4mL混匀，装如透析袋，用1mol/L pH9.5碳酸缓冲液4℃透析6h。在透析物中加入NaBH₄溶液0.8mL，4℃放置2h。

2.2.3用50％饱和硫酸铵盐析(30分钟，离心)溶于0.02mol/L Ph 7.4PBS。然后将盐析沉淀物溶于5mL生理盐水，盛于透析袋内，扎紧两端，置装有1000mL生理盐水的烧杯内，于4℃冰箱内透析3天。期间换液至少8次。

2.2.4将玻璃纤维浸入标定后的酶标抗体液，冷冻真空干燥。

3)制备酶催化反应的底物(以辣根过氧化物酶为例)。

3.1联苯二胺配制0.4％溶液。先溶于少量甲醇，再加柠檬酸-磷酸缓冲液(pH5.0)溶液混匀，立即用玻璃纤维吸取。

3.2过氧化氢配制10％H₂O₂溶液。浸入玻璃纤维。

3.3立即分别真空干燥。干燥后用薄层塑料相隔并固定。

4)制备条形诊断片

4.1将纸质吸水材料1、玻璃纤维7、吸附有抗原/或抗体标记的琼脂糖凝胶2、吸附有酶标记抗体/或抗原的玻璃纤维载体3、吸附有酶催化反应的相应底物的玻璃纤维载体4，以及纸质吸水材料5，自上而下依次固定在条形塑料底衬6上，经真空干燥，即得用于检测抗原的诊断片。

本诊断片用于检测抗原的原理：将底物下端的纸质吸水材料部分置于经处理的样品液中(图2)。液体进入吸水材料后，向上扩散移动。在此过程中，水分子先到达干胶，使之膨胀；同时带动酶标抗体和底物随液体(流动相)迁移。如果样品中不存在抗原(见图3a-1)，迁移中的酶标抗体，其前端部分与凝胶中固定抗原结合(图3a-2)，其后续部分则因固定抗原的表位被饱和而不能结合，越过琼脂糖凝胶进入纸质上端，与底物反应，其产生的颜色范围在琼脂糖凝胶的上部和下部(图3a-3)。由于凝胶中酶标抗体较多，故颜色较深。如果样品中存在相应抗原(图3b-1)，迁移的酶标抗体与凝胶中固定抗原结合，尽管迁移而至的酶标抗体增加，但是由于样品中抗原也迁移而至，提供了新的抗原表位与酶标抗体结合(图3b-2)。酶标抗体既与凝胶中的固定抗原结合，同时又与迁移而至的样品抗原结合，在凝胶中形成类似网络状的抗原抗体复合物，使之阻留在凝胶中，由于酶标抗体被阻截在琼脂糖凝胶内，迁移而至的底物所被催化的颜色反应只局限于琼脂糖凝胶及其以下部位(图3b-3)。

实施例2。用于快速检测抗体的诊断片，其制备方法与实施例1相同，只要将实施例1中制备抗原标记的琼脂糖凝胶，改为制备抗体标记的琼脂糖凝胶；并将制备酶标记抗体，改为制备酶标记抗原，即得检测抗体的诊断片。

其用于检测抗体的原理也与实施例1相同。

Claims (4)

1、一种用于检测抗原/或抗体的诊断片，其特征在于：在条形塑料底衬(6)上，自上而下依次固定有纸质吸水材料(1)、玻璃纤维(7)、吸附有抗原/或抗体标记的琼脂糖凝胶(2)、吸附有酶标记抗体/或抗原的载体(3)、吸附有酶催化反应的相应底物(4)，以及纸质吸水材料(5)。

2、根据权利要求1所述的一种用于检测抗原/或抗体的诊断片，其特征在于：所述的载体(3、4)，为玻璃纤维。

3、根据权利要求1所述的一种用于检测抗原/或抗体的诊断片，其特征在于：所述的吸附有酶催化反应的相应底物，为有色产物。

4、根据权利要求1所述的一种用于检测抗原/或抗体的诊断片，其特征在于其制备方法：

1)将纯化的抗原/或抗体标记在琼脂糖载体上，干燥成型，得抗原/或抗体标记的琼脂糖凝胶：

2)将相应的纯化抗体/或抗原用酶进行标记，吸附于玻璃纤维载体，干燥，得酶标记抗体/或抗原的玻璃纤维载体：

3)取与上述酶所催化的相应底物，溶解吸附于玻璃纤维载体，干燥，得酶催化反应的相应底物的玻璃纤维载体：

4)将纸质吸水材料和吸附有抗原/或抗体标记的琼脂糖凝胶、吸附有酶标记抗体/或抗原的玻璃纤维载体、吸附有酶催化反应的相应底物的玻璃纤维载体，以及纸质吸水材料，自上而下依次固定在条形塑料底衬上，经真空干燥，即得用于检测抗原/或抗体的诊断片。

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