CN101226193B

CN101226193B - 鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的elisa试剂盒

Info

Publication number: CN101226193B
Application number: CN2007101648149A
Authority: CN
Inventors: 方维焕; 徐程; 江玲丽
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-12-24
Filing date: 2007-12-24
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2027-12-24
Also published as: CN101226193A

Abstract

鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA试剂盒，两块96孔板其一包被FMDV非结构蛋白3ABC所有线性抗原表位的蛋白NS-AGD纯化产物，其二包被具有较广抗原谱的结构蛋白VP1突变蛋白CHA/99纯化产物。结果以cut-off判定：当进行感染动物非结构蛋白检测时，待测样品OD₄₉₂≥0.443判为阳性，＜0.443则判为阴性；当进行免疫动物结构蛋白检测时，待测样品OD₄₉₂≥0.450判为阳性，＜0.450则判为阴性。试剂盒可同时快速鉴别检测猪口蹄疫疫苗抗体与野毒感染，同时也可依据结果进行免疫效果的评价。

Description

鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及动物疫病快速诊断及疫苗免疫水平的监测。通过ELISA方法建立鉴别猪口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)疫苗免疫动物与野毒感染动物的同时检测技术，并确定该疫苗免疫后血清中特异性抗体的水平。

背景技术

FMD是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一种偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病。该病在世界各地分布范围广，传播迅速，发病率极高。该病的爆发与流行不仅直接危害动物生产，而且引致的国际贸易屏障造成的损失更是不可估量。口蹄疫病毒有7个血清型，即O、A、C、SAT 1、SAT2、SAT 3与Asia 1，各型间无交叉保护作用，我国以O型为主。口蹄疫在临床上难以与猪水疱病、水疱性口炎、水疱疹区分。因此，口蹄疫的实验室诊断十分重要。

由于担心疫苗毒株的扩散，现在基本上不采用口蹄疫弱毒疫苗进行群体免疫，而是采用灭活苗。由于疫苗免疫原性和动物个体差异等因素，即使是免疫动物在接触新病毒后，也可形成隐性感染而持续带毒。发达国家往往通过扑杀感染动物和可疑畜群来控制和消灭本病，而大多数发展中国家主要通过注射灭活疫苗来控制该病流行。在采取扑杀政策的国家如何检测隐性感染动物、在注射疫苗国家如何区分自然感染动物和免疫动物一直是控制和消灭口蹄疫的重要论题。因此，建立一种区分免疫动物和感染动物，或检测隐性感染动物的诊断方法就成为口蹄疫防制技术的关键。

免疫动物与感染动物均能产生针对结构蛋白抗体。因此单独检测结构蛋白抗体不能区分免疫动物与感染动物。病毒感染后复制时能产生一些具有免疫原性的非结构蛋白，而传统的口蹄疫疫苗由纯化的灭活病毒粒子组成，只存在微量的非结构蛋白。因此，检测非结构蛋白抗体能够区分感染与免疫动物。近年来，国内外有学者利用这一特征，建立了针对FMD病毒非结构蛋白抗体的ELISA检测方法。

但到目前为止，未见本研究中选用的以FMDV非结构蛋白3ABC线性抗原表位的重组蛋白及结构蛋白VP1抗原串联表位的突变蛋白表达产物为抗原进行ELISA检测的方法，也未见用结构蛋白和非结构蛋白同时快速鉴别检测猪口蹄疫疫苗抗体与野毒感染的ELISA试剂盒。

发明内容

本发明的目的是通过ELISA方法建立鉴别猪口蹄疫(FMDV)疫苗免疫动物与野毒感染动物的同时检测技术，同时可检测该疫苗免疫后血清中特异性抗体的水平。

本发明通过对FMDV非结构蛋白3ABC和O型与Asia1型VP1序列分析，确定包含所有3ABC线性抗原表位的片段139-924nt序列(47-308aa)及VP1截短、串联和定点突变的目的基因克隆入原核表达载体pET32c，得到重组质粒，转化宿主菌并经IPTG诱导蛋白表达，表达产物经提取和纯化后作为诊断抗原。

本发明鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA检测试剂盒包括两块96孔板，标号为A、B、C、D、E、F、G的7瓶溶液，48个Eppordorf管和加样及检测步骤说明书，其中溶液A为猪口蹄疫(FMDV)标准阳性血清，即一抗25μL；溶液B为阴性血清25μL；溶液C为HRP标记的兔抗猪IgG血清，即二抗12μL；溶液D为一抗及二抗的稀释液45mL；溶液E为显色液25mL；溶液F为终止液12mL；溶液G为洗涤缓冲液500mL；两块96孔板其一包被FMDV非结构蛋白3ABC所有线性抗原表位的蛋白NS-AGD纯化产物，其二包被具有较广抗原谱的结构蛋白VP1突变蛋白CHA/99纯化产物。可同时检测46份血清样品。

以上所述鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA试剂盒其检测方法为如下步骤：

(1)将10μL待检血清加入到900μL溶液D中进行100倍稀释，阳性血清和阴性血清分别取20μL，加入到800μL溶液D中进行100倍稀释，稀释在Eppordorf管中进行，充分混匀；

(2)两个96孔板中相应位置分别加入稀释的待检血清、阳性对照和阴性对照各100μL，置于湿盒中37℃作用1h；

(3)每孔加200μL溶液G进行洗涤，每次洗涤5分钟，共洗涤6次，在微量振荡器中进行；

(4)将10μL溶液C加入25mL溶液D中进行2500倍稀释，充分混匀后取100μL加入96孔板各孔中，置于湿盒中37℃温育45min；

(5)重复步骤3；

(6)每孔避光加入溶液E 100μL，37℃湿盒作用10min；

(7)每孔加入溶液F 50μL终止反应，测定OD492；

(8)结果判定：结果以cut-off判定。当进行非结构蛋白检测时，待测样品OD₄₉₂≥0.443判为阳性，＜0.443则判为阴性；当进行结构蛋白检测时，即待测样品OD₄₉₂≥0.450判为阳性，＜0.450则判为阴性。同一血清样品当非结构蛋白OD₄₉₂的cut-off≥0.443，或非结构蛋白和结构蛋白均大于相应的cut-off值，表示猪只有过口蹄疫病毒感染，这些猪来自口蹄疫流行的猪场。

附图说明

图1为非结构蛋白NS-AgD的western blot免疫反应性分析

M.预染蛋白分子量Marker，1.pET32c-NS-AgD诱导产物，2.空对照.

A.豚鼠A型FMDV标准阳性血清为一抗；B.豚鼠O型FMDV标准阳性血清为一抗；

C.豚鼠C型FMDV标准阳性血清为一抗；D.豚鼠Asia1型FMDV标准阳性血清为一抗；E.O型口蹄疫感染猪血清I-1为一抗；F.O型FMDV感染猪血清I-2为一抗；G.FMDV感染牛血清为一抗。

图2为5份疫苗血清与结构蛋白VP1不同突变体的免疫反应性比较。

图3为CHA/99和串联表位蛋白O-Asia1与感染血清的免疫反应性比较。

图4为CHA/99与串联表位蛋白O-Asia1与灭活苗免疫猪血清的免疫反应性比较。

具体实施方式

猪口蹄疫ELISA快速鉴别试剂盒的检测步骤如下：

(1)将10μL待检血清加入到900μL溶液D中进行100倍稀释(阳性血清和阴性血清则取20μL，因为其1∶1稀释于甘油中)，稀释在Eppordorf管中进行，并充分混匀；

(2)两个96孔板中相应位置加入待检血清(包括阳性对照和阴性对照)100μL，置于湿盒中37℃作用1h；

(4)将10μL溶液C加入25mL溶液D中(2500倍稀释)，充分混匀后取100μL加入96孔板各孔中，置于湿盒中37℃温育45min；

(5)重复步骤3；

(6)每孔避光加入溶液E 100μL，37℃湿盒作用10min；

(7)每孔加入溶液F 50μL终止反应，测定OD492。

以下通过试验对本发明的使用效果进行论证和描述。

1)FMDV非结构蛋白3ABC线性抗原表位的片段克隆及免疫反应性分析

人工合成FMDV非结构蛋白3ABC基因，选取了包含非结构蛋白3ABC所有线性抗原表位的片段(47-308aa)，将其克隆到表达载体pET32c，在IPTG诱导下该蛋白获得大量表达，命名为NS-AgD。经Western blot分析显示，NS-AgD与豚鼠A型、O型、C型、Asia1型FMDV标准阳性血清，O型FMDV感染猪血清以及FMDV感染牛血清均能反应，具有良好的免疫反应性(图1，A-G)。

2)FMDV结构蛋白VP1的突变蛋白表达及表达产物的免疫反应性分析

FMDV结构蛋白VP1蛋白的G-H环与C末端是诱导产生中和抗体的重要抗原位点，其中G-H环(134-158aa)高度变异，为各血清型与亚型间缺乏交叉保护性的主要原因。研究通过FMDV VP1的截短、O型与Asia1型VP1抗原表位141-160aa的串联表达和G-H环序列进行定点突变。构建了pET32c-mutant-VP1，并进行了突变蛋白CHA/99表达，经与豚鼠O型FMDV标准阳性血清和O型FMDV感染猪血清、部分O型FMDV灭活苗免疫猪血清的免疫反应性良好(图2-4)。

3)基于非结构蛋白NS-AgD区分口蹄疫野毒感染与疫苗免疫的ELISA方法的建立

以重组蛋白NS-AgD作为诊断抗原建立的ELISA方法用于检测感染猪血清中的FMDV非结构蛋白抗体，与UBI NS ELISA诊断试剂盒的阴性符合率为93.0％(179/193)，阳性符合率为91.8％(45/49)(表1)，且具有显著的线性相关性(r＝0.716，p＜0.01)(图5)，可用于区分FMDV感染猪与灭活苗免疫猪的鉴别。选取其中23份FMD阳性或阴性血清进行稳定性试验，结果表明基于NS-AgD的ELISA检测体系较稳定，其变异系数CV为3.62％-24.68％。选取其中具有代表性的11份FMD阳性血清分别进行不同板间的ELISA检测，结果表明基于NS-AgD的检测体系重复性较好，板间变异系数CV为4.50％-21.05％。

表1本试验建立的I-ELISA与UBI NS ELISA的比较

3)基于VP1抗原位点突变蛋白CHA/99检测疫苗抗体的ELISA方法的建立

以CHA/99蛋白作为诊断抗原建立的ELISA检测方法，与UBI VP1ELISA诊断试剂盒的阴性和阳性符合率相对偏低，分别为86.5％(167/193)和76.0％(184/242)，其中对疫苗阳性血清的检测符合率为75.1％(145/193)(表2)，具有显著的线性相关性(r＝0.728，p＜0.01)(图6)。以I-ELISA的cutoff值作为判定免疫合格与否的临界值与正向间接血凝试验(IHA)判定法的符合率为76.8％(96/125)(表3)，可以用该ELISA方法作为参考，用于判定口蹄疫疫苗免疫合格与否。选取其中27份FMD阳性或阴性血清进行稳定性试验，结果表明基于CHA/99的ELISA检测体系基本稳定，其变异系数CV为8.74％-38.51％。选取16份代表性的FMD阳性血清分别进行不同板间的ELISA检测，结果表明基于CHA/99的检测体系重复性较好，板间变异系数CV为4.34％-13.85％。

表2本试验建立的I-ELISA与UBI VP1 ELISA的比较

表3本研究建立的I-ELISA与IHA试验判断免疫合格的比较

a：代表本试验的I-ELISA与UBI VP1ELISA相符合

5)非结构蛋白NS-AgD和结构蛋白CHA/99的ELISA方法稳定性试验

选取其中20份FMD阳性或阴性血清进行为期8个月的稳定性试验，结果表明基于NS-AgD的ELISA检测体系较稳定，其变异系数CV为5.7％-13％(表4)。选取其中20份FMD阳性或阴性血清进行稳定性试验，结果表明基于CHA/99的ELISA检测体系稳定，其变异系数CV为7.3％-13.9％(表5)。

表4非结构蛋白预包被板保存不同时间的ELISA检测20份血清的OD值比较

选取份代表性的FMDV结构蛋白和非结构蛋白阳性血清分别进行不同板间的ELISA检测(7块预先包被ELISA板)，结果表明基于NS-AgD的ELISA检测体系重复性较好，板间变异系数CV为4.50％-12.2％；基于CHA/99的检测体系重复性较好，板间变异系数CV为4.3％-13.8％(表6)。

选取份代表性的FMDV结构蛋白和非结构蛋白阳性血清分别进行了三个批次表达蛋白的ELISA检测结构比较，结果表明三个批次的非结构蛋白NS-AgD的ELISA检测体系重复性较好，板间变异系数CV为1.6％-13.1％；基于CHA/99的检测体系重复性较好，板间变异系数CV为1.5％-10.9％(表7)。

表5结构蛋白预包被板保存不同时间的ELISA检测20份血清的OD值比较

表6FMDV结构蛋白和非结构蛋白7块预包被板的重复性试验

表7不同时间表达的三批FMDV结构蛋白和非结构蛋白的重复性

6)鉴别检测口蹄疫疫苗与感染动物抗体的ELISA检测体系建立及其应用

我们将非结构蛋白NS-AgD和结构蛋白CHA/99预包被于同一块ELISA板，每隔一列分别平行包被两种不同蛋白后用于检测屠宰猪和部分育成猪的血清样品中的结构蛋白抗体和非结构蛋白抗体，770份检测样品中，非结构蛋白抗体阳性83份(10.8％)，结构蛋白抗体阳性207份(26.9％)，表明来自一些地区的屠宰猪曾经感染过FMDV，而这些猪在宰前的结构蛋白抗体水平很低或均一性差，有感染FMDV的风险。

说明书核苷酸和氨基酸序列表

<110>浙江大学

<120>鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA试剂盒

<160>4

<210>1

<211>786

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FMDV非结构蛋白的核苷酸序列

<400>1

atgatccgtg agactcgcaa gaggcagaaa atggtggatg atgcagtgaa tgagtacatt 60

gagaaagcaa acatcaccac agatgacaag actcttgacg aggcggagaa gagccctcta 120

gagaccagcg gcgccagcac cgttggcttt agagagagaa ctctcccagg tcaaaaggca 180

tgcgatgacg tgaactccga gcctgcccaa cctgttgagg agcaaccaca agctgaagga 240

ccctacgccg gaccactcga gcgtcagaaa cctctgaaag tgagagccaa gctcccacag 300

caggaggggc cttacgctgg tccgacggag agacagaaac cgctaaaagt gaaagcaaaa 360

gccccggtcg tgaaggaagg accttacgag ggaccggtga agaagcctgt cgctttgaaa 420

gtgaaagcta agaacctgat tgtcactgag agtggtgccc caccgaccga cttgcaaaag 480

atggtcatgg gcaacacaaa gcctgttgag ctcatcctcg acgggaagac agtagccatc 540

tgctgcgcta ctggagtgtt tagcactgct tgcctcgtgc ctcgtcacct cttcgcagag 600

aagtacgaca agatcatgtt ggacggcaga gccatgacag acagtgacta cagagtgttt 660

gagtttgaga tcaaagtaaa aggacaggac atgctctcag acgccgcgct catggtgctc 720

caccgtggga accgcgtgag ggacatcacg aagcactttc gtgacacagc aagaatgaag 780

aaaggc 786

<210>2

<211>262

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>FMDV非结构蛋白编码的氨基酸序列

<400>2

Met Ile Arg Glu Thr Arg Lys Arg Gln Lys Met Val Asp Asp Ala

1 5 10 15

Val Asn Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Asn Ile Thr Thr Asp Asp Lys

20 25 30

Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys Ser Pro Leu Glu Thr Ser Gly Ala

35 40 45

Ser Thr Val Gly Phe Arg Glu Arg Thr Leu Pro Gly Gln Lys Ala

50 55 60

Cys Asp Asp Val Asn Ser Glu Pro Ala Gln Pro Val Glu Glu Gln

65 70 75

Pro Gln Ala Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys

80 85 90

Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr

95 100 105

Ala Gly Pro Thr Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys

110 115 120

Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys

125 130 135

Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu

140 145 150

Ser Gly Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn

155 160 165

Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile

170 175 180

Cys Cys Ala Thr Gly Val Phe Ser Thr Ala Cys Leu Val Pro Arg

185 190 195

His Leu Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg

200 205 210

Ala Met Thr Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys

215 220 225

Val Lys Gly Gln Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu

230 235 240

His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp

245 250 255

Thr Ala Arg Met Lys Lys Gly

260

<210>3

<211>639

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FMDV结构蛋白VP1突变体的核苷酸序列

<400>3

accacctcta caggtgagtc ggctgacccc gtgactgcca ccgttgagaa ctacggtggt 60

gagacacagg tccagagacg ccagcacacg gatgtctcgt tcatactgga cagatttgtg 120

aaagtaacac caaaagacca aattaatgtg ttggatctaa tgcaaacccc cgcacacact 180

ttggtaggcg cgctcctccg taccgccact tactactttg cagatctaga agtggcagta 240

aaacacgagg ggaaccttac ctgggtccca aacggggcgc ccgaggcagc actggacaac 300

accaccaacc caacggccta ccacaaggcg ccgctcaccc ggcttgcact gccttacacg 360

gcaccacacc gtgtcttggc tactgtttac aacgggaact gcaagtacgg cgaatcacct 420

gtaactaacg tgagaggtga tctacaggtg ttggctcaga aggcagcgag aacactgcct 480

acctccttca actacggcgc catcaaagcc actcgggtga ctgaactgct ttaccgcatg 540

aagagggccg aaacatactg cccccggcct cttttggcta ttcacccgag cgaaaccaga 600

cacaaacaaa agattgtggc gcctgtaaag cagtctttg 639

<210>4

<211>213

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>FMDV结构蛋白VP1突变体编码的氨基酸序列

<400>4

Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr

20 25 30

Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys

35 40 45

Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr pro Ala His Thr

50 55 60

Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp

65 70 75

Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro

80 85 90

Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr

95 100 105

Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Lau Ala Leu Pro Tyr Thr

110 115 120

Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys

125 130 135

Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val

140 145 150

Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr

155 160 165

Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met

170 175 180

Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile His

185 190 195

Pro Ser Glu Thr Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys

200 205 210

Gln Ser Leu

Claims

1.鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA试剂盒，包括两块96孔板，标号为A、B、C、D、E、F、G 的7瓶溶液，48个Eppordorf管和加样及检测步骤说明书组成，其特征在于：溶液A为猪口蹄疫(FMDV)阳性血清即一抗25μL；溶液B为阴性血清25μL；溶液C为HRP标记的兔抗猪IgG血清，即二抗12μL；溶液D为一抗及二抗稀释液45mL；溶液E为显色液25mL；溶液F为终止液12mL；溶液G为洗涤缓冲液500mL；两块96孔板其一包被FMDV非结构蛋白3ABC所有线性抗原表位的片段139-924nt序列的47-308aa的蛋白NS-AGD纯化产物，其二包被具有较广抗原谱的结构蛋白VP1突变蛋白CHA/99纯化产物。

2.如权利要求1所述鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于为如下步骤：

(1)将10μL待检血清加入到900μL溶液D中进行100倍稀释，阳性血清(A)和阴性血清分(B)别取20μL，加入到800μL溶液D中进行100倍稀释，稀释在Eppordorf管中进行，充分混匀；

(4)将10μL溶液C加入25mL溶液D中进行2500倍稀释，充分混匀后取100μL加入96孔板各孔中，置于湿盒中37℃温育45min，甩干；

(5)每孔加200μL溶液G后于微量振荡器中洗涤，每次洗涤5分钟后甩干，共洗涤6次；

(6)每孔避光加入溶液E 100μL，37℃湿盒作用10min；

(7)每孔加入溶液F 50μL终止反应，测定OD492；

(8)结果以cut-off判定：当进行感染动物非结构蛋白检测时，待测样品OD₄₉₂≥0.443判为阳性，＜0.443则判为阴性；当进行免疫动物结构蛋白检测时，待测样品OD₄₉₂≥0.450判为阳性，＜0.450则判为阴性。