KR20010103159A - Ｇｓｔ-구제역바이러스 3ｄ유전자를 함유하는 발현벡터,그 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 생산되는융합단백질을 이용한 구제역 항체의 검출방법 - Google Patents

Ｇｓｔ-구제역바이러스 3ｄ유전자를 함유하는 발현벡터,그 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 생산되는융합단백질을 이용한 구제역 항체의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 GST-구제역바이러스 3D유전자 융합단백질로서 발현벡터의 단백질인 GST와 구제역바이러스유전자 발현단백질인 3D가 융합된 형태의 단백질이며 GST항체를 이용한 구제역 항체의 검출방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 GST-구제역바이러스 3D유전자 융합단백질 발현벡터 및 구제역 혈청형 항체를 동시에 검출함으로써 안전하고 간편하며 신속하게 구제역 항체를 검출할 수 있는 새로운 진단방법을 제공함에 있다.
본 발명에 의한 진단방법은 효소면역법의 원리를 이용함으로써 대량의 시료를 신속하게 검색할 수 있고, 인공적으로 만든 단백질을 이용함으로써 진단 항원의 안전성이 확보될 수 있으며, 구제역바이러스 4가지 혈청형의 항체를 동시에 검출할 수 있게 됨으로써 혈청형별 항체검사를 수행해야 하는 번거로움을 해소할 수 있는 장점이 있다.

Description

ＧＳＴ-구제역바이러스 3Ｄ유전자를 함유하는 발현벡터, 그 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 생산되는 융합단백질을 이용한 구제역 항체의 검출방법{A GST-FMDV 3D fusion protein expression vector, Transformant thereof and a method for detection of FMD antibody using GST-FMDV 3D fusion protein and anti-GST antibody}
본 발명은 글루타치온-S-트랜스퍼라제(이하 GST라고 약칭함)와 구제역바이러스 3D유전자 산물의 융합단백질 발현벡터 및 GST-구제역바이러스유전자 융합단백질과 GST항체를 이용한 구제역 항체의 검출방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 인위적으로 합성한 유전자발현 단백질을 검출용 항원으로 사용함으로써 바이러스의 불완전한 처리로 인한 질병전파의 위험성을 제거하고 구제역 혈청형에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 안전하고 간편하며 신속한 구제역 항체의 검출방법에 관한 것이다.
구제역(foot and mouth disease, FMD)은 우제류 동물에 감염하여 주로 구강과 안면, 발굽부위의 점막에 수포를 형성하며 빠른 전파력과 높은 치사율로 인하여 일단 발생하면 엄청난 축산업의 피해를 주는 질병으로 국제수역사무국(Office Internationale des Epizooties, O.I.E.)지정 A 등급의 악성가축전염병이다.
이 질병의 진단을 위한 항체검출법으로서 현재 널리 사용되고 있는 방법은 액상 차단 효소면역법(Liquid phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay, LPB-ELISA)이다(Hamblin et al, J. Immunol. Methods 1986: 93:115-121).
하지만 상기 방법은 불활화된 구제역바이러스를 검출항원으로 사용하고 있으며, 구제역바이러스 혈청형에 대한 각각의 항혈청을 사용하여 혈청형별 항체를 검출하고 있는 방법으로서, 구제역이 발생하지 않은 나라에서 사용할 경우 구제역 혈청형별로 각각 항체검사를 실시해야 하는 번거로움이 있기 때문에, 구제역의 혈청형 항체감별 검사보다는 구제역의 모든 혈청형 항체를 동시에 검출할 수 있는 진단방법이 요구되고 있다.
본 발명자들은 혈청형별 항체검사를 수행해야 하는 번거로움을 해소하기 위하여 4가지 구제역바이러스 혈청형을 동시에 검출할 수 있는 진단방법을 연구해 온 결과, 대장균에서 인공적으로 합성한 구제역바이러스 3D 단백질과 GST단백질의 융합단백질을 사용하면 구제역바이러스 혈청형을 동시에 검출할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 GST-구제역바이러스 3D유전자 융합단백질 발현벡터를 제공함에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 구제역 혈청형 항체를 동시에 검출함으로써 안전하고 간편하며 신속하게 구제역 항체를 검출할 수 있는 새로운 진단방법을 제공함에 있다.
도 1은 GST-구제역바이러스 3D유전자 융합단백질 발현 벡터 pG3D-2의 제작과정도.
도 2는 발현 벡터 pG3D-2의 구성도.
도 3은 구제역바이러스 항체를 검출하기 위한 진단방법의 원리,
본 발명은 GST-구제역바이러스(FMDV) 3D 유전자 융합단백질 발현벡터 pG3D-2를 포함한다. 상기 본 발명의 GST-구제역바이러스 3D 유전자 융합단백질 발현벡터(이하 pG3D-2라 약칭하기로 함)는 3D 유전자와 GST유전자가 융합된 형태로 존재하는 것이 바람직하다.
상기 본 발명의 pG3D-2에 포함된 3D유전자는 구제역바이러스 A24cruzeiro주 (FMDV A24cruzeiro,Plum island Animal Disease Center, USA)로부터 분리한 것으로, 상기 3D유전자는 서열번호 1기재의 유전자 염기서열에 나타난 바와 같으며 총 1410개의 염기, 470개 아미노산으로 구성되어져 있다. 상기 3D유전자는 핵산 합성에 관여하는 폴리머라제를 코딩하고 있으며 구제역 바이러스에 대한 혈청형간의 일치율이 높으므로 이를 진단용 항원으로 이용하면 4가지의 구제역바이러스 혈청형(A, O, C, Asia 1)의 항체를 동시에 검출할 수 있는 특징을 지니고 있다.
또한 본 발명의 구제역바이러스 항체진단용 항원은 상기한 3D유전자의 산물과 GST와의 융합단백질 형태를 포함한다. 상기 GST는 구제역바이러스 항체진단을 위한 효소면역법(ELISA) 시행시 플레이트 웰 바닥에 고정되는 GST항체의 항원으로 기능하게 된다. 따라서 상기 GST와는 다른 단백질을 사용하여 본 발명에서 개시하는 융합단백질과 유사한 기능을 가지는 항체진단용 항원을 제조하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 개시에 의하여 용이하게 변형하여 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 구제역 바이러스 항체진단용 항원 제작을 위한 3D 유전자로는 구제역바이러스 A24를 랜덤프라이머(random primer)와 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하고, 상기 cDNA를 항체진단용 항원 생산을 위한 주형(template)으로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 랜덤프라이머와 역전사효소는 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용하면 되고 특별한 한정을 요하는 것은 아니며 이때 얻어지는 cDNA는 3D 유전자를 포함하는 구제역 바이러스의 전체 게놈에 해당한다.
상기 3D 유전자의 분리 및 증폭은 공지의 서열인 서열번호 2 및 서열번호 3을 이용하여 이들을 각각 포워드 프라이머와 리버스프라이머로 하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 선별증폭하는 것이 가능하고 이때 얻어진 3D cDNA를 항체진단용 항원 생산을 위한 주형(template)으로 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기 3D유전자의 증폭을 위한 중합효소연쇄반응에 사용되는 포워드 프라이머에는 5'말단에BglⅡ절단부위가 삽입되고, 리버스프라이머에는EcoR1 절단부위가 삽입되어 있으며, 중합효소로는 Taq 폴리머라제(Amplitaq, Perkin Elmer)를 사용하는 것이 본 발명의 실시에 있어 바람직하다.
다음으로 본 발명의 pG3D-2재조합벡터 제조과정을 설명하기로 한다.
도 2는 본 발명의 pG3D-2재조합벡터를 나타내며, 도 1은 상기 재조합 벡터의 제조과정을 나타내는 것으로 상기 제조과정을 도 1을 참조하여 설명하면 먼저, 랜덤프라이머와 역전사효소를 이용하여 구제역바이러스 유전자 전체에 대한 cDNA를 합성하고, 상기 cDNA를 중합효소연쇄반응에 의하여 3D 유전자만을 선별 증폭시킨 후, 증폭된 산물을EcoRⅠ과BglⅡ 절단부위를 가지고 있는 pGEM-T벡터에 삽입하여 3D 유전자가 삽입된 pGEM-T/3D를 합성하고 상기 pGEM-T/3D는 DH5α 세포에 클로닝(도면에는 미도시)하는 과정과,
상기 클로닝된 pGEM-T/3D는 다시EcoRⅠ과BglⅡ를 처리하여 3D유전자를 분리한 후, 상기 3D유전자를 대장균 발현벡터로서EcoRⅠ과BamHⅠ절단부위를 가지고 있는 pGEX-3X에 삽입하여 pGEX-3X/3D를 합성(이하 pG3D-2로 명명)하고 이를 BL21에 재클로닝하는 과정을 포함한다.
상기 pGEX-3X벡터는 도 2에 도시한 바와 같이 선별마크(selection marker)로서 앰피실린 저항성유전자와 lac Iq를 지니고 있으며, 복제개시점으로는 pBR322origin을 가진다. 또한 3D 유전자가 삽입되어질BamHⅠ절단부위의 upstream에 GST유전자가 위치하고 있어 3D 유전자의 삽입시 얻어지는 상기 pG3D-2재조합 벡터는 GST와 3D가 융합된 융합유전자를 포함하게 된다.
상기 GST와 구제역바이러스 3D의 유전자를 함유하는 상기 재조합벡터 pG3D-2는 대장균 컴피턴트 셀인 BL21에 재클로닝되어 GST와 구제역바이러스 3D가 융합된 융합단백질을 생산하는데 사용되어진다.
또한 본 발명은 상기 재조합벡터 pG3D-2로 형질전환된 형질전환체를 포함한다. 형질전환에 사용되는 세포로는 특별히 한정을 요하는 것은 아니나 대장균 BL21이 본 발명의 실시에 있어 바람직하다. 형질전환과정은 본 발명의 바람직한 실시예 2에 개시되어 있으며 이는 공지의 방법에 의한 것으로 여기서는 자세한 설명은 피하기로 한다. 상기 형질전환과정에 의하여 얻어진 형질전환체는 GST-구제역바이러스 3D 융합단백질을 생산하는데 이때 생산되는 융합단백질은 도 2에 도시한 바와 같이 GST와 3D사이에 보바인 팩터 Xa를 포함하게 되나 이는 본 발명과는 무관한 부위로 당업자라면 상기 부위를 벡터제작단계에서 삭제하여 사용하는 것이 가능하다.
상기 재조합벡터 pG3D-2로 형질전환된 pG3D-2/BL21은 사단법인 한국종균협회에 미생물기탁번호 KFCC-11150으로 2000년 2월 25일자로 기탁하였다.
또한 본 발명은 GST-구제역바이러스 3D 융합단백질과 GST항체를 이용한 구제역 항체의 검출방법을 포함한다. 도 3에 개시한 본 발명의 구제역 항체 검출방법은 일반적으로 항체검출에 사용되는 ELISA법를 이용한 것이다. 이때 플레이트에 고착되는 1차 항체로 GST항체를 사용하며, 바람직하기로는 상기 항체는 고우트 엔티-GST 항체(goat anti-GST antibody)임을 특징으로 하고, GST-구제역바이러스 3D 융합단백질과 특이적으로 반응하는 엔티-FMDV 3D 항체(anti-FDMV 3D antibody)에 특이적으로 결합하여 효소반응을 일으키는 2차 항체로는 특히 한정을 요하는 것은 아니나 대상동물 항체에 대한 2차항체인 것이 바람직하다. 검사 혈청이 소 혈청인 경우 엔티 보바인 IgG-HRP컨쥬게이트[Anti bovine IgG-HRP conjugate(Horseradish peroxidase conjugate]를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 2차 항체에 연결된 Horseradish peroxidase의 기질로 0-페닐렌디아민디하이드로클로라이드를 사용함으로써 효소반응에 의하여 구제역바이러스 항체를 검출할 수 있다.
상기 GST-구제역바이러스 3D 융합단백질과 GST항체를 이용한 구제역 항체의 검출방법에 개시된 구체적인 항체 및 기질은 본 발명을 설명하기 위한 하나의 예시에 불과한 것으로 본 발명의 권리범위를 제한 하는 것으로는 되지 않는다. 따라서 당업자에 의한 다소의 개변은 본 발명의 권리범위를 벗어나는 것으로는 되지 않으며, 검출항원 및 항체로 본 발명에 의한 GST-구제역바이러스 3D 융합단백질과 GST항체를 적용하는 한 이는 본 발명의 권리범위에 속한다.
이하 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 구제역바이러스 3D유전자의 증폭
구제역바이러스 A24(FMDV A24)배양액으로부터 핵산을 추출하여 랜덤프라이머(random primer)와 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성한 것을 3D유전자 증폭을 위한 주형(template)으로서 사용하였다.
구제역바이러스 3D유전자는 핵산증폭기(Perkin Elmer사)를 사용한 중합효소연쇄반응법(Polymerase chain reaction, PCR)을 실시하여 증폭하였다. 유전자 증폭을 위한 반응을 위하여 하기 표 1과 같은 반응액을 조성하였으며 94℃에서 5분간 미리 반응시킨후 51℃ 1분, 72℃ 2분, 94℃ 1분으로하는 과정을 30회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨 후 종료하는 방법으로 행하였다.
<표 1> 반응액 조성(100㎕).
조성 함량
포워드 프라이머 1㎕
리버스 프라이머 1㎕
게놈 cDNA 20㎕
25mM MgCl2 16㎕
Amplitaq DNA 폴리머라제* 1㎕
10×buffer 8㎕
핵산 free 증류수 53㎕
* Amplitaq DNA 폴리머라제: Perkin Elmer사 제품.
증폭된 구제역 3D유전자의 확인은 두 가지 방법으로 실시하였다. 첫째는 증폭된 유전자 산물을 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)가 첨가된 아가로스겔을 사용하여 전기영동을 실시함으로써 핵산 크기가 1.4k base pairs임을 확인하였다. 두 번째 방법으로 증폭된 유전자산물을 pGEM-T 백터(Promega사)에서 클로닝하여 염기서열을 분석함으로써 확인한 결과 서열번호 1과 같았다.
<실시예 2> 3D 유전자를 삽입시킨 pG3D-2 벡터의 제조
증폭된 3D 유전자는 pGEM-T벡터(Promega사)와 T4 DNA 연결효소(ligase)를 사용하여 4℃에서 밤새동안 반응시켜 pGEM-T벡터에 삽입하였다. 3D 유전자가 삽입된 pGEM-T벡터는 컴피턴트 세포인 DH5α세포와 혼합하여 42℃에서 90초간 처리함으로서 컴피턴트세포내에 삽입시켰으며, 그후 이 세포를 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노사이드)과 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드)가 첨가된 LB(Lauria-Bertani)배지에서 37℃에서 증식시킴으로서 3D 유전자를 클로닝하였다.
그후 3D 유전자가 삽입된 pGEM-T벡터를EcoR1과BgllI효소를 처리하여 3D유전자를 추출하였으며, 추출된 유전자는 다시 대장균 발현벡터인 pGEX-3X(Pharmacia사) 벡터와 T4 DNA 연결효소(ligase)를 사용하여 4℃에서 밤새동안 반응시켜 pGEX-3X백터내BamH1와EcoR1 부위에 삽입함으로서 도 2와 같은 pG3D-2 벡터를 제조하였다.
<실시예 3> 형질전환세포 pG3D-2/BL21의 제조
제조한 pG3D-2 벡터를 대장균 컴피턴트 세포(competent cell ; BL21)과 혼합하여 42℃에서 90초간 처리한 후 이 세포를 X-gal과 IPTG가 첨가된 LB(Lauria-Bertani) 한천 배지에 도말하여 37℃에서 증식함으로써 형질전환된 대장균 컴피턴트 세포(pG3D-2/BL21, 미생물기탁번호 KFCC-11150)를 작성하였다. 작성된 세포(pG3D-2/BL21)을 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 LB(Lauria-Bertani) 액상배지에서 37℃에서 진탕배양하여 증식함으로서 3D단백질을 발현시켰다.
<실시예 4> 구제역바이러스 단백질의 생산
실시예 3에서 작성한 형질전환된 대장균세포(pG3D-2/BL21)에서 생산되는 구제역바이러스 3D단백질은 GST(glutathion-S-transferase)단백질과 융합된 단백질형태(GST-FMDV 3D fusion protein, 이하 융합단백질)로 발현하게 하였다.
융합단백질을 생산하는 대장균 세포는 LB 액상배지에서 진탕배양하면서 대량 증식하였으며 290nm에서 0.6에서 1.0의 흡광도를 보일 때 IPTG를 첨가하여 융합단백질의 발현을 유도하였다. 그 후 대장균을 수확하여 수초간 초음파처리후 Triton X-100(최종농도 1)를 첨가함으로서 대장균내에 발현된 융합단백질을 용출시켰으며 고속도(10,000xg, 5분)로 원심하여 대장균 세포부산물을 제거함으로서 융합단백질을 추출하였다.
발현된 융합단백질은 GST 수용체(GST receptor)가 표면에 부착된 글루타치온 세파로스 4B 비드(glutathione sepharose 4B beads ; Phamarcia)에 흡착ㆍ유리시키는 방법을 이용하여 정제하였다.
<실시예 5> 구제역 항체의 검출
항-GST 항체(Pharmacia, 5mg/ml)를 0.1M 카보네이트 완충용액(pH 9.6) 또는 포스페이트 완충용액(0.01M phosphate buffered saline, pH7.2)으로 1:1,000희석한 것을 엘라이자 플레이트(ELISA plate)에 웰당 50㎕(최종농도 0.25㎍/well)씩 첨가하여 37℃에서 1시간동안 흡착시킨후 세척용 완충용액 [0.002M phosphate buffered saline(PBS),pH7.2, 0.02tween 20]으로 3회 세척하였다.
여기에 블로킹 완충용액[0.01M PBS, pH7.2, 3.0(w/v) Skimmed milk]를 웰당100㎕씩 첨가한후 37℃에서 1시간 동안 블로킹을 실시하였다.
이후 반응용액(0.01M PBS, pH7.2, 1.5(w/v) skimmed milk)으로 희석한 발현한 융합단백질(5㎍/ml)을 각 웰당 50㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 플레이트를 세척용 완충액으로 3회에 걸쳐 세척한 후 1 : 50으로 희석한 대조혈청과 검사혈청을 각각 웰당 50㎕씩 첨가하여 다시 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 세척용 완충액으로 3회 세척하였다. 그후 반응용액으로 희석한 항-축종 면역글로불린 호스레디쉬 퍼옥시다제 콘쥬게이트(Anti-species IgG-Horseradish Peroxidase conjugate, 2.5㎍/ml)을 웰당 50㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨후 3회 세척하였다.
여기에 과산화수소를 0.01되게 가한 기질액(0.04o-phenylenediamine dihydrochloride)이 함유된 싸이트레이트 포스페이트 완충용액(pH 5.2)을 즉시 각 웰당 100㎕씩 가하고 실온에서 10분간 반응시켰다.
이후 2.5M 황산(H 2 SO4)용액을 웰당 50㎕씩 가하여 반응을 정지시킨 다음, 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소반응의 결과 구제역 항체가 함유된 시료의 경우 검사한 웰의 최종반응액은 갈색으로 발색되게 된다.
결과판정은 T/P치(검사혈청 흡광도치/양성혈청 흡광도치)를 구하여 0.4이상이면 항체양성, 그 미만이면 항체음성으로 하였다.
<시험예 1> 구제역바이러스 혈청형 및 다른 바이러스 양성혈청에 대한 반응성
상기의 실시예 5에 의한 진단방법을 이용하여 구제역바이러스(FMDV) 혈청형A, O, C, Asia 1에 대한 각각의 항혈청과 구제역과 임상증상이 유사하여 의심축발견시 감별진단이 필요한 우역바이러스(rinderpest virus, RPV), 소 전염성 비기관염 바이러스(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV), 블루텅 바이러스(bluetongue virus, BTV), 소 바이러스 설사병바이러스(bovine viral diarrhea virus BVDV)의 항혈청을 대상으로 반응성을 조사한 결과를 표 2에 나타내었는데, 구제역바이러스 4가지 혈청형바이러스에 대한 양성혈청에 대하여만 특이적으로 반응함을 확인할 수 있었다.
<표 2> 구제역바이러스 혈청형 및 기타 바이러스 양성혈청에 대한 반응성
FMDV 기타 바이러스*
A22 O1 Asia 1 C3 RPV IBRV BTV BVDV
T/P 치 0.5 0.81 1.0 0.48 0.06 0.02 0.04 0.00
결 과 양성 양성 양성 양성 음성 음성 음성 음성
* RPV; rinderpest virus, IBRV; infectious bovine rhinotracheitis virus, BTV; bluetongue virus, BVDV; bovine viral diarrhea virus
<시험예 2> 구제역 항체음성인 야외 소혈청시료에의 적용
구제역 표준연구소인 영국 퍼브라이트(Pirbright)연구소의 구제역 항체진단키트에 의해 구제역 항체음성으로 판정된 국내사육소 혈청 219점을 대상으로 실시예 5와 같은 진단방법으로 효소면역법(ELISA)을 실시한 결과를 표 3에 나타내었는데, 94.5의 특이도를 보임으로써 구제역 항체진단에 적용이 가능함을 확인할 수 있었다.
<표 3> 구제역 항체음성인 야외 소혈청시료에 대한 본 진단방법의 적용결과
본 진단방법 음성(T/P치 0.0∼0.39) 207두
양성(T/P치 0.40이상) 12두
합 계 219두
* 특이도 = (음성결과두수 /전 음성두수)x 100= (207/219) x100= 94.5
본 발명에 의한 진단방법은 효소면역법의 원리를 이용함으로써 대량의 시료를 신속하게 검색할 수 있고, 인공적으로 만든 단백질을 이용함으로써 진단 항원의 안전성이 확보될 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 진단방법은 구제역바이러스 4가지 혈청형(A, O, C, Asia 1)의 항체를 동시에 검출할 수 있게 됨으로써 혈청형별 항체검사를 수행해야 하는 번거로움을 해소할 수 있는 장점이 있다.

Claims (3)

  1. GST-구제역바이러스 3D 유전자를 함유하는 발현벡터 pG3D-2
  2. GST-구제역바이러스 3D 유전자를 함유한 발현벡터 pG3D-2로 형질전환된 대장균 KFCC-11150
  3. ELISA를 이용한 구제역바이러스 항체검출방법에 있어서,
    구제역바이러스 검출용 항원으로 발현벡터 pG3D-2로 형질전환된 대장균 KFCC-11150에서 발현되는 융합단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 항체의 검출방법.
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