JP2007500513A - 質量に基づく毒素アッセイおよびそのための基質 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)試験化合物を基質と混合する工程であって、該基質が、(i)プロテアーゼについての切断部位(ここで、該プロテアーゼは、基質を切断して生成物を形成する)、および(ii)必要に応じて、固相への生成物の結合を可能にするタグ、を含む、工程;
(b)生成物を固相に結合させる工程;および
(c)質量分析法により生成物の質量を決定する工程。
(a)試験溶液をVAMP(シナプトブレビン)および/またはSNAP−25および/またはシンタキシン(またはこれらの断片)を含む基質と混合して、混合物を形成する工程、
(b)該混合物を緩衝液中でインキュベートする工程、
(c)質量分析法用に設計された固相上に該混合物を結合させる工程、および
(d)質量分析法により1つ以上の切断生成物を検出する工程。
試験溶液を基質溶液(VAMP/シナプトブレビンおよび/またはSNAP−25および/またはシンタキシンの誘導体を含有する)と混合する工程であって、ここで該基質が改変されて、固相への結合のためにタグを有する、工程、
該混合物を、例えば、適切な緩衝系中で、インキュベートする工程、
インキュベートした混合物を、質量分析法用に設計された固相上に結合させる工程であって、ここで該混合物の成分が結合タグを介して結合される、工程、および
1つ以上の切断生成物を質量分析法により検出および特徴付けする工程。
試験溶液を基質溶液(VAMP/シナプトブレビンおよび/またはSNAP−25および/またはシンタキシンの誘導体を含む)と混合する工程であって、ここで該基質が、疎水性表面に結合するためのタグ/モチーフを含むか、またはこのようなタグ/モチーフを含むように改変されている、工程、
該混合物を適切な緩衝系中でインキュベートする工程、
該混合物を、質量分析法用に設計された疎水性固相上に結合させる工程であって、ここで該混合物の成分が、結合疎水性タグ/モチーフを介して結合される、工程、および
質量分析法により1つ以上の切断生成物を検出および特徴づけする工程。
リジン:アスパラギン:ロイシン:リジン:システイン(KNLKC)。
試験溶液を基質溶液(VAMP/シナプトブレビンおよび/またはSNAP−25および/またはシンタキシンの誘導体を含む)と混合する工程であって、ここで該基質が、ビオチン残基を含む、工程、
該混合物を適切な緩衝系中でインキュベートする工程、
質量分析法用に設計されたストレプトアビジンでコーティングした固相上に該混合物を結合させる工程であって、ここで該混合物の成分がビオチン残基を介して結合される、工程、および
質量分析法により1つ以上の切断生成物を検出および特徴付けする工程。
−試料を、毒素に対する抗体が固定化されている樹脂と混合する
−未結合の物質を洗浄により除去する
−低pH緩衝液(代表的にはpH4以下、好ましくはpH3以下)を用いて毒素を溶出させる
−本発明のアッセイを用いて、毒素の存在について溶出物を試験する。
ロイシン−アラニン−アルギニン−アルギニン−リジン−プロリン−バリン−ロイシン−プロリン(LARRKPVLP)。
試験溶液を基質と混合する工程であって、該基質が、MAPKK1もしくはMAPKK1(またはそれらの断片)を含み、そして該基質が、ビオチン残基も含む、工程、
該混合物を適切な緩衝系中でインキュベートする工程、
質量分析法用に設計されたストレプトアビジンでコーティングした固相上に該混合物を結合させる工程であって、該混合物の成分が、ビオチン残基を介して結合される、工程、および
質量分析法により1つ以上の切断生成物を検出および特徴付けする工程。
KAASSEF−n末端およびLQAGASQ−c末端。
BoNT/A
1.RIDEANQ−c末端
2.GLMKTAR−n末端
BoNT/B
1.KAASSEF−n末端
2.LQAGASQ−c末端
BoNT/C
1.IDEANQR−c末端
2.SGLMKTA−n末端
BoNT/D
1.VLERDQK−c末端
2.RDDLESL−n末端
BoNT/E
1.QNRQIDR−c末端
2.SDAKEMI−n末端
BoNT/F
1.KVLERDQ−c末端
2.DDLESLK−n末端
BoNT/G
1.SQFESSA−c末端
2.YKRKLKA−n末端
炭疽菌LF
1.RRKPVLP−c末端
試験溶液を基質と混合して混合物を形成する工程、
必要に応じて、該混合物を適切な緩衝系中でインキュベートする工程、
該混合物を、質量分析法用に設計した抗体でコーティングした固相上に結合させる工程、および
質量分析法による1つ以上の切断生成物を検出および特徴づけする工程。
試験化合物を基質と混合する工程であって、ここでプロテアーゼが該基質と反応して生成物を形成する、工程;および
生成物の質量を測定することにより該プロテアーゼの存在を検出する工程。
全ての遺伝子操作について、標準的な分子生物学プロトコルを用いた(例えば、Sambrookら、1989年、Molecular Cloning a Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York)。
VAMPアミノ酸1−96
C末端にシステイン残基付加を有するVAMPアミノ酸1−96。
SNAP−25アミノ酸1−206;
内部の4つのシステイン残基をセリンに変異させたSNAP−25アミノ酸1−206;および
内部の4つのシステイン残基をセリンに変異し、C末端に付加されたC末端システイン残基を有するSNAP−25アミノ酸1−206。
10mMのポリエチレンオキサイド−マレイミド活性化ビオチン(Pierce)をPBS中に新たに調製した。このビオチン溶液100μlに、約1mg/mlのGST−VAMP、GST−SNAP−25またはMAPキナーゼキナーゼペプチドのPBS溶液2.5mlを添加し、室温で4時間インキュベートした。全ての場合で、基質は、遊離システイン残基を含んでいた。次いで、50mM Hepes(pH7.4)緩衝液への透析またはクロマトグラフィーにより、残存する遊離ビオチンを除去した。
このアッセイは、Hepes(50mM、pH7.4)中の、GSTヒトVAMP−1(KNLKで終止)からなるVAMP構築物5mg/mlを使用した。これを、50mM DTTおよび50μM ZnCl2を含有する等容量のHepes(50mM、pH7.4)緩衝液で希釈した。上記基質溶液3μlに、緩衝液(例えば、Hepes(50mM、pH7.4))中の毒素溶液12μlを添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートする。
−BoNT/Bのペプチド生成物質量=2411.3
−BoNT/Fのペプチド生成物質量=4280.3
−BoNT/Dのペプチド生成物質量=4152.2
−BoNT/Gのペプチド生成物質量=1762.1
このアッセイは、Hepes(50mM、pH7.4)中の、GSTヒトVAMP−1(KNLKC−ビオチンで終止)からなるビオチン化VAMP構築物5mg/mlを使用した。これを、50mM DTTおよび50μM ZnCl2を含有する等容量のHepes(50mM、pH7.4)緩衝液で希釈した。上記基質溶液3μlに、緩衝液(例えば、Hepes(50mM、pH7.4))中の毒素溶液12μlを添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートした。
−BoNT/Bのペプチド生成物質量=3039.9
−BoNT/Fのペプチド生成物質量=4908.9
−BoNT/Dのペプチド生成物質量=4780.8
−BoNT/Gのペプチド生成物質量=2390.7
このアッセイは、ビオチン化SNAP−25構築物を使用した。これは、内部の4つのセリンをシステインに変異したGSTヒトSNAP−25からなり、そしてC末端にシステインが付加され、そしてビオチン化されている(すなわち、このタンパク質は、配列LGSGC−ビオチンで終止する)。溶液(50mM Hepes(pH7.4)中5mg/ml)を50mM DTTおよび50μM ZnCl2を含有する等容量のHepes(50mM、pH7.4)緩衝液で希釈した。上記基質溶液3μlに、緩衝液(例えば、Hepes(50mM、pH7.4))中の毒素溶液12μlを添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートした。
−BoNT/Aのペプチド生成物質量=1548.1
−BoNT/Cのペプチド生成物質量=1392.0
−BoNT/Eのペプチド生成物質量=3492.1
このアッセイは、合成ビオチン化ヒトMAPKK2ペプチドを使用する。これは、N末端の60残基からなり、そしてビオチン化N末端システイン残基を含む(すなわち、このタンパク質は、配列ビオチン−CLARRKPで開始する)。溶液(50mM Hepes pH7.4中0.5mg/ml)を50mM DTTおよび50μM ZnCl2を含有する等容量のHepes(50mM、pH7.4)緩衝液で希釈した。上記基質溶液3μlに、緩衝液(例えば、Hepes(50mM、pH7.4))中の毒素溶液12μlを添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートした。
炭疽菌LFのペプチド生成物質量=1678.1
このアッセイは、Hepes(50mM、pH7.4)中の、GSTヒトVAMP−1(KNLKで終止)からなるVAMP構築物5mg/mlを使用した。これを、50mM DTTおよび50μM ZnCl2を含有する等容量のHepes(50mM、pH7.4)緩衝液で希釈した。上記基質溶液3μlに、緩衝液(例えば、Hepes(50mM、pH7.4))中の毒素溶液12μlを添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートした。
BoNT/Bのペプチド生成物質量=2411.3
Claims (24)
- メタロプロテアーゼについてのアッセイであって、
試験化合物を基質と混合する工程であって、該メタロプロテアーゼが該基質と反応して生成物を形成する、工程;および
該プロテアーゼの存在を該生成物の質量を測定することにより検出する工程
を含む、アッセイ。 - 前記メタロプロテアーゼが前記基質を切断して該基質よりも低い質量を有する生成物を形成し、そして該メタロプロテアーゼの存在が、該生成物の質量を測定することにより検出される、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記アッセイが、第一のメタロプロテアーゼおよび第二のメタロプロテアーゼのいずれかまたは両方が前記試験化合物中に存在するか否かを検出するためであり、ここで該第一のメタロプロテアーゼが、前記基質を切断して第一の質量を有する第一の生成物を形成し、該第二のメタロプロテアーゼが、該基質を切断して第二の質量を有する第二の生成物を形成し、該第一の生成物の質量と該第二の生成物の質量とが異なり、そして得られた生成物のそれぞれの質量が測定されて第一の生成物、第二の生成物、または第一の生成物と第二の生成物との両方の存在を決定する、請求項1または2に記載のアッセイ。
- 請求項1から3のいずれかの項に記載のアッセイであって、
前記生成物を固相に結合させる工程、および
該固相に結合された該生成物の質量を、質量分析法を用いて決定する工程
を含む、アッセイ。 - 試験化合物が基質と混合された後に、生成物が前記固相に結合される、請求項4に記載のアッセイ。
- 基質が固相に結合された後に、試験化合物が基質と混合される、請求項1から3のいずれかの項に記載のアッセイ。
- 前記基質が、固相への前記基質および前記生成物の結合を可能にするタグを含む、請求項1から6のいずれかの項に記載のアッセイ。
- 前記タグが、疎水性表面に結合するペプチド配列を含む、請求項7に記載のアッセイ。
- 前記タグが抗体に結合する、請求項7に記載のアッセイ。
- 前記タグがビオチンまたはストレプトアビジンに結合する、請求項7に記載のアッセイ。
- 請求項1から10のいずれかの項に記載のアッセイであって、基質がプロテアーゼにより切断されて生成物を形成し、そして該アッセイが、
生成物に特異的な結合パートナーを用いて、固相に該生成物を結合させる工程
を含む、アッセイ。 - 前記結合パートナーが前記生成物に特異的な抗体である、請求項11に記載のアッセイ。
- 前記基質がボツリヌス菌毒素または炭疽菌毒素または炭疽菌致死因子によって切断される、請求項1から12のいずれかの項に記載のアッセイ。
- 請求項1から13のいずれかの項に記載のアッセイであって、生成物に結合するが基質には結合しない抗体を用いて、固相に生成物を結合させる工程を含む、アッセイ。
- 前記基質が、(a)VAMP、(b)SNAP−25、(c)シンタキシン、(d)(a)から(c)のいずれかの断片であって、メタロプロテアーゼ切断部位を含む断片、または(e)メタロプロテアーゼ切断部位、を含む、上記のいずれかの項に記載のアッセイ。
- 前記基質が、MAPKK1、MAPKK2、またはメタロプロテアーゼ切断部位を含むそれらの断片、を含む、請求項1から14のいずれかの項に記載のアッセイ。
- 上記のいずれかの項に記載のアッセイであって、生成物を固相に結合させる工程、該固相を洗浄する工程、および該固相上で生成物を検出する工程を含む、アッセイ。
- 毒素アッセイのための試薬であって、
該毒素による切断のための部位を有する基質;および
固相への該基質の結合のためのタグ
を含む、試薬。 - 前記タグが、固相に結合する疎水性領域、抗体、ビオチン、およびストレプトアビジンから選択される、請求項18に記載の試薬。
- 前記基質が、ボツリヌス菌毒素または炭疽菌致死毒素または炭疽菌致死因子による切断のための部位を含む、請求項18または19に記載の試薬。
- メタロプロテアーゼについてのアッセイの固相構成要素であって、
該メタロプロテアーゼによる切断のための部位を有する基質;および
質量分析計での質量の測定に使用するための固相
を備える、固相構成要素。 - 請求項18から20のいずれかの項に記載の試薬を備える、請求項21に記載の固相構成要素。
- 前記基質が前記固相に結合されている、請求項21または22に記載の固相構成要素。
- メタロプロテアーゼのアッセイのためのキットの製造における、(a)請求項18から20のいずれかの項に記載の試薬の(b)質量分析計で使用するための固相と組み合わせた使用。
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